BRPI0511782B1 - anticorpos anti-cd3, uso e método de produção dos mesmos, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico isolada e vetor - Google Patents

Abstract

anticorpos anti-cd3 e métodos de uso dos mesmos. a presente invenção é relacionada a anticorpos dirigidos ao antígeno cd3 e a usos de tais anticorpos. em particular, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais totalmente humanos dirigidos à cd3. seqüências de nucleotídeo de codificação e seqüências de aminoácidos compreendendo moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente seqüências compreendendo moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e leve, particularmente seqüências correspondendo à seqüências contínuas de cadeia pesada e leve abrangendo as regiões de framework e/ou regiões de determinação de complementaridade (cdr<39>s) especificamente de fr1 a fr4 ou cdr1 a cdr3, são proporcionadas. hibridomas ou outras linhagens de células expressando tais moléculas de imunoglobulina e anticorpos monoclonais são também proporcionados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS ANTI-CD3, USO E MÉTODO DE PRODUÇÃO DOS MESMOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA E VETOR.

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se, de modo geral, a anticorpos anti-CD3 totalmente humanos bem como a métodos para uso dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] O sistema imune do corpo serve como uma defesa contra uma variedade de condições incluindo, por exemplo, lesão, infecção e neoplasia, e é mediado por dois sistemas distintos, mas interrelacionados, os sistemas imunes celular e humoral. De modo geral, o sistema humoral é mediado por produtos solúveis, denominados anticorpos ou imunoglobulinas, as quais têm a capacidade de se combinar com e neutralizar produtos reconhecidos pelo sistema como sendo estranhos ao corpo. Em contraste, o sistema imune celular envolve a mobilização de determinadas células, denominadas células T, que servem a uma variedade de papéis terapêuticos.

[003] O sistema imune de seres humanos e animais inclui duas classes principais de linfócitos: as células derivadas do timo (células T) e as células derivadas da medula óssea (células B). Células T maduras emergem do timo e circulam entre os tecidos, linfáticos e a corrente sanguínea. Células T exibem especificidade imunológica e estão diretamente envolvidas em respostas imunes célula-mediadas (tal como rejeição a enxerto). As células T atuam contra ou em resposta a uma variedade de estruturas estranhas (antígenos). Em muitos casos, esses antígenos estranhos são expressos sobre células hospedeiras como um resultado de infecção. Contudo, antígenos estranhos também podem se originar do hospedeiro tendo sido alterado por neopla

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2/81 sia ou infecção. Embora as células T em si não secretem anticorpos, elas usualmente são requeridas para secreção de anticorpo pela segunda classe de linfócitos, células B.

[004] Existem vários subconjuntos de células T os quais são, de modo geral, definidos por determinantes antigênicos encontrados sobre suas superfícies celulares, bem como atividade funcional e reconhecimento de antígeno estranho. Alguns subconjuntos de células T, tais como células CD8⁺, são células assassinas/supressoras que exercem uma função de regulação no sistema imune, enquanto que outras, tais como células CD4⁺, servem para promover respostas inflamatórias e humorais.

[005] Linfócitos T periféricos humanos podem ser estimulados a sofrer mitose por uma variedade de agentes, incluindo antígenos estranhos, anticorpos monoclonais e lecitinas, tais como fitoemaglutinina e concanavalina. Embora a ativação presumivelmente ocorra através de ligação dos mitógenos a sítios específicos sobre as membranas celulares, a natureza desses receptores e seu mecanismo de ativação não estão completamente elucidados. A indução de proliferação é apenas uma indicação de ativação de células T. Outras indicações de ativação, definidas como alterações no estado basal ou de repouso da célula, incluem produção aumentada de linfocina e atividade de células citotóxicas.

[006] A ativação de células T é um fenômeno complexo que depende da participação de uma variedade de moléculas da superfície celular expressas sobre a população de células T respondedoras. Por exemplo, o receptor de células T antígeno-específico (TcR) é composto de um heterodímero dissulfeto-ligado, contendo duas cadeias de glicoproteína membrana-integrais clonalmente distribuídas, alfa e beta (« e β) ou gama e delta (γ e δ) não-covalentemente associadas a um complexo de proteínas invariáveis de baixo peso molecular, comumenPetição 870190084596, de 29/08/2019, pág. 6/97

3/81 te designadas como CD3 (uma vez referidas como T3).

[007] As cadeias alfa e beta do TcR determinam as especificidades antigênicas. As estruturas de CD3 representam moléculas acessórias que são os elementos de transdução de sinais de ativação iniciados quando de ligação do TcR alfa beta (TcR «β) a seu ligante. Existem regiões constantes das cadeias de glicoproteína do TcR e regiões variáveis (polimorfismos). Regiões variáveis polimórficas do TcR definem subconjuntos de células T, como especificidades distintas. Diferentes dos anticorpos que reconhecem fragmentos inteiros ou menores de proteínas estranhas como antígenos, o complexo do TcR interage apenas com pequenos peptídeos do antígeno, os quais devem ser apresentados no contexto de moléculas do principal complexo de histocompatibilidade (MHC). Essas proteínas do MHC representam outro conjunto altamente polimórfico de moléculas aleatoriamente dispersas através das espécies. Assim, a ativação usualmente requer a interação tripartida do TcR e antígeno peptídico estranho ligado a grandes proteínas do MHC.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [008] A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais totalmente humanos especificamente dirigidos contra CD3. anticorpos monoclonais exemplificativos incluem 28F11, 27H5,23F10 e 15C3 descritos aqui. Alternativamente, o anticorpo monoclonal é um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que 28F11, 27H5, 23F10 ou 15C3. Os anticorpos são, respectivamente, referidos aqui como anticorpos huCD3. O anticorpo huCD3 tem uma ou mais das seguintes características: o anticorpo se liga a células CD3 positivas (CD3+), mas não a células CD3 negativas (CD3-); o anticorpo huCD3 induz à modulação antigênica a qual envolve alteração (por exemplo, diminuição) da atividade ou nível de expressão na superfície celular de CD3 ou do receptor de células T (TcR); o anticorpo huCD3 inibe a ligação do anticorpo

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4/81 monoclonal anti-humano OKT3 de murino a linfócitos T; ou o anticorpo huCD3 se liga a um epitopo de CD3 que inclui, total ou parcialmente, a sequência de aminoácidos EMGGITQTPYKVSISGT (SEQ ID NO: 21). Os anticorpos huCD3 da invenção competem com o anticorpo antiCD3 OKT3 de murino pela ligação a CD3 e expõem o anticorpo huCD3 a remover ou disfarçar a CD3 e/ou TcR sem afetar a expressão na superfície celular de CD2, CD4 ou CD8. O disfarce de CD3 e/ou TcR resulta na perda ou redução de ativação de células T, o que é desejável em doenças auto-imunes onde ativação descontrolada de células T ocorre. A sub-regulação de CD3 resulta em um efeito prolongado de ativação reduzida de células T, por exemplo, durante um período de pelo menos vários meses, quando comparado com a supressão transitória que é observada quando de uso de um agente imunossupressor tradicional, por exemplo, ciclosporina.

[009] Modulação antigênica se refere à redistribuição e eliminação do complexo de receptor de células T-CD3 sobre a superfície de uma célula, por exemplo, um linfócito. Diminuição no nível de expressão ou atividade, na superfície celular, do TcR sobre a célula significa que a quantidade ou função do TcR é reduzida. Modulação do nível de expressão ou atividade, na superfície celular, de CD3 significa que a quantidade de CD3 ou função de CD3 sobre a superfície celular é alterada, por exemplo, reduzida. A quantidade de CD3 ou do TcR expresso na membrana plasmática da célula é reduzida, por exemplo, através de internalização de CD3 ou do TcR quando de contato da célula com o anticorpo huCD3. Alternativamente, quando de contato de uma célula com o anticorpo huCD3, CD3 ou o TcR é disfarçado.

[0010] Inibição da ligação de anticorpo monoclonal anti-humano

OKT3 de murino a um linfócito T é definida como uma diminuição na capacidade do anticorpo OKT3 de murino de formar um complexo com a CD3 sobre a superfície celular de um linfócito T.

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5/81 [0011] Um anticorpo huCD3 contém uma cadeia pesada variável tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 6, 10 ou 22 e uma cadeia leve variável tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 8, 16-20 ou 25-26. De preferência, as três CDRs de cadeia pesada incluem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à uma sequência selecionada do grupo consistindo em GYGMH (SEQ ID NO: 27); VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 28); QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 29); SYGMH (SEQ ID NO: 33); IIWYDGSKKNYADSVKG (SEQ ID NO: 34); GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 35); e AIWYNGRKQDYADSVKG (SEQ ID NO: 44) e uma cadeia leve com três CDRs que incluem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% ou mais idêntica à uma sequência selecionada do grupo consistindo na sequência de aminoácidos de RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30); DASNRAT (SEQ ID NO: 31); QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 32); RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 36); GASSRAT (SEQ ID NO: 37); QQYGSSPIT (SEQ ID NO: 38); RASQGISSALA (SEQ ID NO: 39); YASSLQS (SEQ ID NO: 40); QQYYSTLT (SEQ ID NO: 41); DASSLGS (SEQ ID NO: 42); WASQGISSYLA (SEQ ID NO: 43); QQRSNWPWT (SEQ ID NO: 45); DASSLES (SEQ ID NO: 46); e QQFNSYPIT (SEQ ID NO: 47). O anticorpo se liga a CD3.

[0012] Um anticorpo huCD3 da invenção exibe pelo menos duas ou mais (isto é, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais) das seguintes características: o anticorpo contém uma região variável de cadeia pesada (VH) codificada por uma sequência do gene da linhagem germinativa de VH DP50 humana ou uma sequência de ácido nucléico que é homóloga à sequência do gene da linhagem germinativa de VH DP50 humana; o anticorpo contém uma região variável de cadeia leve (VL) codificada por uma sequência

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6/81 do gene da linhagem germinativa de Vl L6 ou uma sequência de ácido nucléico homóloga à sequência do gene da linhagem germinativa de Vl L6; o anticorpo contém uma Vl codificada por uma sequência do gene da linhagem germinativa de Vl L4/18a humana ou uma sequência de ácido nucléico homóloga à sequência do gene da linhagem germinativa de Vl L4/18a humana; o anticorpo inclui uma região CDR1 de Vh compreendendo a sequência de aminoácidos YGMH (SEQ ID NO: 58); o anticorpo inclui uma região CDR2 de Vh compreendendo a sequência de aminoácidos DSVKG (SEQ ID NO: 59); o anticorpo inclui uma região CDR2 de Vh compreendendo a sequência de aminoácidos IWYX1GX2X3X4X5Y X6DSVKG (SEQ ID NO: 60); o anticorpo inclui uma região CDR3 de Vh compreendendo a sequência de aminoácidos XaXbGYXcXdFDXe (SEQ ID NO: 61); o anticorpo inclui uma região CDR3 de VH compreendendo a sequência de aminoácidos GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 62) ou a sequência de aminoácidos QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 63); o anticorpo inclui a sequência de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO: 64) em uma posição que é Cterminal à região cDR3, em que a posição está em uma região variável C-terminal à região CDR3; o anticorpo inclui a sequência de aminoácidos GTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) em uma posição que é Cterminal à região CDR3, em que a posição está em uma região variável C-terminal à região CDR3; o anticorpo inclui a sequência de aminoácidos WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66) em uma posição que é Cterminal à região CDR3, em que a posição está em uma região variável C-terminal à região CDR3; o anticorpo se liga a um epitopo que inclui, total ou parcialmente, a sequência de aminoácidos EMGGITQTPYKVSISGT (SEQ ID NO: 67); e o anticorpo inclui uma mutação na cadeia pesada em um resíduo de aminoácido na posição 234, 235, 265 ou 297 ou combinações dos mesmos e em que a liberação de citocinas de uma célula T na presença do referido anticorpo é reduzida

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7/81 quando comparado com a liberação de citocinas de uma célula T na presença de um anticorpo que não inclui uma mutação na cadeia pesada na posição 234, 235, 265 ou 297 ou combinações dos mesmos. A numeração dos resíduos da cadeia pesada descrita aqui é aquela do índice norte americano (veja Kabat et al, Proteins of Immunological Interest, US Dept. of Health & Human Services (1983)), conforme mostrado, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.624.821 e 5.648.260, os conteúdos das quais são aqui incorporados em sua totalidade por referência.

[0013] Em alguns aspectos, o anticorpo huCD3 contém uma mutação de aminoácido. A mutação é na região constante. A mutação resulta em um anticorpo que tem uma função ativadora alterada. Uma função ativadora de um anticorpo é alterada por alteração, isto é, intensificação ou redução, da afinidade do anticorpo por uma molécula ativadora, tal como um receptor de Fc ou um componente complementar. Através de alteração de uma função ativadora de um anticorpo, é possível controlar vários aspectos da resposta imune, por exemplo, intensificação ou supressão de várias reações do sistema imune. Por exemplo, a mutação resulta em um anticorpo que é capaz de reduzir a liberação de citocina de uma célula T. Por exemplo, a mutação é na cadeia pesada no resíduo de aminoácido 234, 235, 265 ou 297 ou combinações dos mesmos. De preferência, a mutação resulta em um resíduo de alanina na posição 234, 235, 265 ou 297 ou um resíduo de glutamato na posição 235 ou uma combinação dos mesmos. O termo citocina se refere a todas as citocinas humanas conhecidas na técnica que se ligam a receptores extracelulares expressos sobre a superfície celular e, desse modo, modulam a função celular incluindo, mas não limitado a, IL-2, IFN-gama, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-

13.

[0014] A liberação de citocinas pode levar a uma condição tóxica

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8/81 conhecida como síndrome de liberação de citocina (CRS), uma complicação clínica comum que ocorre, por exemplo, com o uso de um anticorpo anti-células T, tal como ATG (globulina antitimócito) e OKT3 (um anticorpo anti-CD3 humana de murino). Essa síndrome é caracterizada pela liberação excessiva de citocinas, tais como TNF, IFN-gama e IL-2 na circulação. A CRS ocorre como um resultado da ligação simultânea dos anticorpos a CD3 (via a região variável do anticorpo) e dos receptores de Fc e/ou receptor de complemento (via a região constante do anticorpo) à outras células, desse modo, ativando as células T para liberar citocinas que produzem uma resposta inflamatória sistêmica caracterizada por hipotensão, pirexia e rigores. Sintomas da CRS incluem febre, calafrios, náusea, vômito, hipotensão e dispnéia. Assim, o anticorpo huCD3 da invenção contém uma ou mais mutações que impedem a liberação de uma ou mais citocina(s) in vivo, mediada pela constante região de cadeia pesada.

[0015] Os anticorpos de CD3 totalmente humanos da invenção incluem, por exemplo, uma mutação L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ E²³⁵ na região Fc, de modo que a liberação de citocina quando de exposição ao anticorpo huCD3 é significativamente reduzida ou eliminada (veja por exemplo, figuras 11A, 11B). Conforme descrito abaixo no Exemplo 4, a mutação L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ E²³⁵ na região Fc dos anticorpos huCD3 da invenção reduz ou elimina a liberação de citocina quando os anticorpos huCD3 são expostos a leucócitos humanos, ao mesmo tempo em que as mutações descritas abaixo mantêm capacidade significativa de liberação de citocina. Por exemplo, uma redução significativa na liberação de citocina é definida comparando-se a liberação de citocinas quando de exposição ao anticorpo huCD3 tendo uma mutação L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ E²³⁵ na região Fc com o nível de liberação de citocina quando de exposição a outro anticorpo anti-CD3 tendo uma ou mais das mutações descritas abaixo. Outras mutações na região Fc incluem, por exemplo,

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9/81 |_234 |_235 > ^234 ^235 ^²³⁵ > E²³⁵ N²9⁷ > A²9⁷ e D²⁶⁵ > A²⁶⁵ [0016] Alternativamente, o anticorpo huCD3 é codificado por um ácido nucléico que inclui uma ou mais mutações que substituem um resíduo de ácido nucléico por um resíduo de ácido nucléico de linhagem germinativa. Por resíduo de ácido nucléico de linhagem germinativa entenda-se o resíduo de ácido nucléico que ocorre naturalmente em um gene de linhagem germinativa que codifica uma região constante ou variável. Gene de linhagem germinativa é o DNA encontrado em uma célula germinativa (isto é, uma célula destinada a se tornar um óvulo ou no esperma). Uma mutação de linhagem germinativa se refere a uma alteração hereditária em um DNA em particular que ocorreu em uma célula germinativa ou o zigoto no estágio de uma única célula e, quando transmitida para a prole, tal mutação é incorporada em cada célula do corpo. Uma mutação de linhagem germinativa está em contraste com uma mutação somática a qual é adquirida em uma única célula do corpo. Em alguns casos, os nucleotídeos em uma sequência de DNA de linhagem germinativa que codifica uma região variável sofreram mutação (isto é, uma mutação somática) e foram substituídos por um nucleotídeo diferente. Assim, os anticorpos da invenção incluem uma ou mais mutações que substituem um ácido nucléico por um resíduo de ácido nucléico de linhagem germinativa. Genes de anticorpo de linhagem germinativa incluem, por exemplo, DP50 (Número de acesso: IMGT/EMBL/GenBank/ DDBJ: L06618), L6 (Número de acesso: IMGT/EMBL/GenBank/DDBJ: X01668) e L4/18a (Número de acesso: EMBL/GenBank/DDBJ: Z00006).

[0017] A cadeia pesada de um anticorpo huCD3 é derivada de um gene de linhagem germinativa V (variável) tal como, por exemplo, o gene de linhagem germinativa DP50. As sequências de ácido nucléico e aminoácidos para o gene de linhagem germinativa DP50 incluem, por exemplo, as sequências de ácido nucléico e aminoácidos mostraPetição 870190084596, de 29/08/2019, pág. 13/97

10/81 das abaixo:

tgattcatgg agaaatagag agactgagtg tgagtgaaca tgagtgagaa aaactggatt tgtgtggcat tttctgataa cggtgtcctt ctgtttgcag gtgtccagtg tcaggtgcag ctggtggagt ctgggggagg cgtggtccag cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca gcgtctggat tcaccttcag tagctatggc atgcactggg tccgccaggc tccaggcaag gggctggagt gggtggcagt tatatggtat gatggaagta ataaatacta tgcagactcc gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggctgtg tattactgtg cgagagacac ag (SEQ ID NO: 68)

VQCQVQLVES GGGVVQPGRS LRLSCAASGF TFSSYGMHWV RQAPGKGLEW VAVIWYDGSN KYYADSVKGR FTISRDNSKN TLYLQMN SLR AEDTAVYYCA R (SEQ ID NO: 69) [0018] Os anticorpos huCD3 da invenção incluem uma região variável de cadeia pesada (Vh) codificada por uma sequência do gene da linhagem germinativa de Vh humana DP50. A sequência do gene da linhagem germinativa de Vh DP50 é mostrada, por exemplo, em SEQ ID NO: 48 na figura 5. Os anticorpos huCD3 da invenção incluem uma região Vh que é codificada por uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos 80% homóloga à sequência do gene da linhagem germinativa de Vh DP50. De preferência, a sequência de ácido nucléico é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à sequência do gene da linhagem germinativa de Vh DP50 e, mais preferivelmente, pelo menos 98%, 99% homóloga à sequência do gene da linhagem germinativa de Vh DP50. A região Vh do anticorpo huCD3 é pelo menos 80% homóloga à sequência de aminoácidos da região Vh codificada pela sequência do gene da linhagem germinativa de Vh DP50. De preferência, a sequência de aminoácidos da região Vh do anticorpo huCD3 é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à sequência de aminoácidos codificada pela sequência do gene da linhagem germinativa de Vh DP50 e, mais preferivelmente, pelo menos 98%, 99% homóloga à se

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11/81 quência codificada pela sequência do gene da linhagem germinativa de Vh DP50.

[0019] Os anticorpos huCD3 da invenção também incluem uma região variável de cadeia leve (VL) codificada por uma sequência do gene de linhagem germinativa de Vl humana L6 ou L4/18a. Uma sequência do gene da linhagem germinativa de VL L6 é mostrada, por exemplo em SEQ ID NO: 74 na figura 6 e uma sequência do gene da linhagem germinativa de VL L4/18a humana é mostrada, por exemplo em SEQ ID NO: 53 na figura 7. Alternativamente, os anticorpos huCD3 incluem uma região VL que é codificada por uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos 80% homóloga à sequência do gene de linhagem germinativa de Vl L6 ou L4/18a. De preferência, a sequência de ácido nucléico é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à sequência do gene de linhagem germinativa de Vl L6 ou L4/18a sequência e, mais preferivelmente, pelo menos 98%, 99% homóloga à sequência do gene de linhagem germinativa de VL L6 ou L4/18a. A região VL do anticorpo huCD3 é pelo menos 80% homóloga à sequência de aminoácidos da região VL codificada pela sequência do gene de linhagem germinativa de VL L6 ou L4/18a. De preferência, a sequência de aminoácidos da região VL do anticorpo huCD3 é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à sequência de aminoácidos codificada pela sequência do gene de linhagem germinativa de VL L6 ou L4/18a e, mais preferivelmente, pelo menos 98%, 99% homóloga à sequência codificada pela sequência do gene de linhagem germinativa de VL L6 ou L4/18a.

[0020] Os anticorpos huCD3 da invenção têm, por exemplo, sequências de aminoácidos parcialmente conservadas que são derivadas da linhagem germinativa DP50. Por exemplo, a região CDR1 de anticorpos huCD3 da invenção têm pelo menos as sequência de aminoácidos contínua YGMH (SEQ ID NO: 58).

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12/81 [0021] A CDR2 dos anticorpos huCD3 inclui, por exemplo, pelo menos a sequência de aminoácidos contínua DSVKG (SEQ ID NO: 59). Por exemplo, a região CDR2 inclui a sequência de aminoácidos contínua IWYX1GX2X3X4X5YX6DSVKG (SEQ ID NO: 60), onde X1, X2, X3, X4, X5 e X6 representam qualquer aminoácido. Por exemplo, X1, X2, X3 e X4 são aminoácidos hidrofílicos. Em alguns anticorpos huCD3 da invenção, X1 é asparagina ou aspartato, X2 é arginina ou serina, X3 é lisina ou asparagina, X4 é lisina ou glutamina, X5 é aspartato, asparagina ou tirosina e/ou X6 é valina ou alanina. Por exemplo, a região CDR2 da Vh inclui uma sequências de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em AIWYNGRKQDYADSVKG (SEQ ID NO: 69), IIWYDGSKKNYADSVKG (SEQ ID. NO: 70), VIWYDGSKKYYVDSV KG (SEQ ID NO: 71) e VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 72).

[0022] A região CDR3 de anticorpos huCD3 contém, por exemplo, pelo menos a sequência de aminoácidos contínua XAXBGYXCXDFDXE (SEQ ID NO: 61), onde Xa, Xb, Xc, Xd e Xe representam qualquer aminoácido. Em alguns anticorpos huCD3 da invenção, XA e XB são aminoácidos neutros, XD é um aminoácido aromático e/ou em que XE é um aminoácido hidrofóbico. Por exemplo, XA é glicina ou glutamina, XB é treonina ou metionina, XC é asparagina ou triptofano, XD é triptofano ou histidina e/ou XE é prolina ou leucina. Por exemplo, a região CDR3 inclui a sequência de aminoácidos contínua GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 62) ou a sequência de aminoácidos contínua QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 63).

[0023] Os anticorpos huCD3 incluem uma região estrutura 2 (FRW2) que contém a sequência de aminoácidos WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 73). Anticorpos huCD3 da invenção incluem uma região estrutura 3 (FRW3) que contém a sequência de aminoácidos RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 74).

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13/81 [0024] Alguns anticorpos huCD3 incluem a sequência de aminoácidos contínua VTVSS (SEQ ID NO: 64) em uma posição que é Cterminal à região CDR3. Por exemplo, o anticorpo contém a sequência de aminoácidos contínua GTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) em uma posição que é C-terminal à região CDR3. Outros anticorpos huCD3 incluem a sequência de aminoácidos contínua WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66) em uma posição que é C-terminal à região CDR3. O resíduo de arginina em SEQ ID NO: 66 é mostrado, por exemplo, nas sequências da Vh para o anticorpo huCD3 28F11 (SEQ ID NO: 2) e o anticorpo huCD3 23F10 (SEQ ID NO: 6).

[0025] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos de tratamento, prevenção ou alívio de um sintoma de um distúrbio imunerelacionado através de administração de um anticorpo huCD3 a um indivíduo. Opcionalmente, o indivíduo é ainda administrado com um segundo agente tal como, mas não limitado a, compostos antiinflamatórios ou compostos imunossupressores. Por exemplo, a indivíduos com diabetes do Tipo I ou Diabetes Auto-imune Latente no Adulto (LADA), é também administrado um segundo agente tal como, por exemplo, GLP-1 ou um composto de interrupção de células beta (isto é, um composto que reduz ou, de outro modo, inibe a liberação de insulina, tal como agentes que abrem o canal de potássio).

[0026] Compostos adequados incluem, mas não estão limitados a, metotrexato, ciclosporina A (incluindo, por exemplo, microemulsão de ciclosporina), tacrolimus, corticosteróides, estatinas, interferon beta, Remicade (Infliximab), Enbrel (Etanercept) e Humira (Adalimumab).

[0027] O indivíduo está sofrendo de ou está predisposto a desenvolver um distúrbio imune-relacionado tal como, por exemplo, uma doença auto-imune ou um distúrbio inflamatório.

[0028] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos de administração do anticorpo huCD3 da invenção a um indivíduo antes de,

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14/81 durante e/ou após transplante de órgão ou tecido. Por exemplo, o anticorpo huCD3 da invenção é usado para tratar ou impedir rejeição após transplante de órgão ou tecido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0029] A figura 1 é uma série de representações da sequência de nucleotídeos e sequência de aminoácidos para as regiões variável leve e variável pesada do anticorpo huCD3 28F11. A figura 1A representa a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada e a figura 1B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na figura 1A, em que as CDRs estão destacadas com entre retângulos. A figura 1C representa a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia leve e a figura 1D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na figura 1C, em que as CDRs são indicadas entre retângulos.

[0030] A figura 2 é uma série de representações da sequência de nucleotídeos e das sequências de aminoácidos para as regiões variável leve e variável pesada do anticorpo huCD3 23F10, com a figura 2A representando a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada, a figura 2B representando a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na figura 2A, a figura 2C representando a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia leve e a figura 2D representando a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na figura 2C.

[0031] A figura 3 é uma série de representações da sequência de nucleotídeos e das sequências de aminoácidos para as regiões variável leve e variável pesada do anticorpo huCD3 27H5. A figura 3A representa a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada; a figura 3B representa a sequência de aminoácidos

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15/81 codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na figura 3A; a figura 3C representa as cinco sequências de nucleotídeo que codificam a região variável da cadeia leve para o clone 27H5; a figura 3D representa as cinco sequências de aminoácidos codificadas pela sequência de nucleotídeos conforme mostrado na figura 3C; e figura 3E é um alinhamento das cinco cadeias leves do clone 27H5, em que um asterisco (*) na última fileira (denominada KEY) representa um aminoácido conservado nessa coluna; dois pontos (:) na fileira KEY representa uma mutação conservativa; e um ponto (.) na fileira KEY representa uma mutação semiconservativa.

[0032] A figura 4 é uma série de representações da sequência de nucleotídeos e sequências de aminoácidos para as regiões variável leve e variável pesada do anticorpo huCD3 15C3, com a figura 4A representando a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada, a figura 4B representando a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na figura 4A, a figura 4C representando as duas sequências de nucleotídeos que codificam a região variável da cadeia leve para o clone 15C3 e a figura 4D representando as duas sequências de aminoácidos codificadas pela sequência de nucleotídeos conforme mostrado na figura 4C.

[0033] A figura 5 é um alinhamento representando as regiões variáveis de cadeia pesada dos anticorpos huCD3 15C3, 27H5 e 28F11, bem como a sequência da linhagem germinativa DP-50, a sequência de união 5-02 pesada humana e a sequência de união 2 pesada humana. As regiões CDR são indicadas para cada sequência.

[0034] A figura 6 é um alinhamento representando as regiões variáveis VkIII dos anticorpos huCD3 15C3 (cadeia leve variável 1, isto é, VL1) e 28F1, bem como a sequência da linhagem germinativa L6, a sequência de união 4 capa humana e a sequência de união 1 capa humana. As regiões CDR são indicadas para cada sequência.

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16/81 [0035] A figura 7 é um alinhamento representando as regiões variáveis VkI dos anticorpos huCD3 VL2 15C3 (cadeia leve variável 2, isto é, VL2) e 27H5, bem como a sequência da linhagem germinativa L4/18a, a sequência de união 4 capa humana e a sequência de união 5 capa humana. As regiões CDR são indicadas para cada sequência.

[0036] A figura 8 é um alinhamento representando as regiões variáveis VkII dos anticorpos huCD3 de VL1 27H5 e DPK22, bem como a sequência de união 5 capa humana. As regiões CDR são indicadas para cada sequência.

[0037] A figura 9A é um gráfico representando a ligação de anticorpo a moléculas de CD3 na superfície de células Jurkat usando uma variedade de anticorpos anti-CD3, incluindo os anticorpos huCD3 28F11, 27H5VLl, 27HSVL2, 15C3VL1 e 15C3VL2 da invenção. A figura 9B é um gráfico representando a capacidade de uma variedade de anticorpos anti-CD3, incluindo os anticorpos huCD3 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 e 15C3VL2 da invenção, de inibir a ligação do anticorpo anti-CD3 OKT3 de murino a células CD3-positivas. A figura 9C é um gráfico representando a modulação antigênica de CD3 e TcR da superfície de células T de sangue periférico humano por uma variedade de anticorpos anti-CD3, incluindo os anticorpos huCD3 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 e 15C3VL2 da invenção. A figura 9D é um gráfico representando o efeito de uma variedade de anticorpos anti-CD3, incluindo os anticorpos huCD3 28F11, 27H5VLl, 27H5VL2, 15C3VL1 e 15C3VL2 da invenção, sobre a proliferação de células T.

[0038] A figura 10 é uma ilustração representando o padrão de ligação do anticorpo monoclonal 28F11 totalmente humano sobre um arranjo de peptídeo derivado da sequência de aminoácidos da cadeia epsilon da CD3.

[0039] A figura 11 é uma série de gráficos representando o nível de liberação de citocina quando de exposição a um anticorpo huCD3

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28F11 do tipo silvestre (28F11WT), um anticorpo huCD3 28F11 com mutação tendo uma mutação L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ A²³⁵ (28F11AA) e um anticorpo huCD3 28F11 com mutação tendo uma mutação L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ E²³⁵ (28F11AE). A figura 11A representa o nível de liberação de TNF-alfa quando de exposição a esses anticorpos e a figura 11B representa o nível de liberação de interferon gama.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0040] A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais totalmente humanos específicos contra a cadeia epsilon da CD3 (CD3s). Os anticorpos respectivamente referidos aqui são anticorpos huCD3.

[0041] A CD3 é um complexo de pelo menos cinco polipeptídeos membrana-ligados em linfócitos T maduros que são nãocovalentemente associados uns com os outros e com o receptor de células T. O complexo da CD3 inclui as cadeias gama, delta, epsilon, zeta e eta (também referidas como subunidades). Anticorpos monoclonais não-humanos foram desenvolvidos contra algumas dessas cadeias, conforme exemplificado pelos anticorpos de murino OKT3, SP34, UCHTI ou 64.1 (veja, por exemplo, June et al, J. Immunol. 136: 3945-3952 (1986); Yang et al, J. Immunol. 137: 1097-1100 (1986); e Hayward et al, Immunol. 64: 87-92 (1988)).

[0042] Os anticorpos huCD3 da invenção foram produzidos através de imunização de duas linhagens de camundongos transgênicos, os camundongos HuMAb® e os camundongos KM® (Medarex, Princeton NJ).

[0043] Os anticorpos huCD3 da invenção têm uma ou mais das seguintes características: o anticorpo huCD3 se liga a células CD3 positivas (CD3+), mas não a células CD3 negativas (CD3-); o anticorpo huCD3 induz à modulação antigênica a qual envolve alterações dos níveis de expressão, na superfície celular, de CD3 e do receptor de

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18/81 células T (TcR); ou o anticorpo huCD3 inibe ligação do anticorpo monoclonal anti-humano OKT3 de murino a linfócitos T. Os anticorpos huCD3 da invenção competem com o anticorpo anti-CD3 OKT3 de murino pela ligação a CD3 e, quando de exposição ao anticorpo huCD3, removem ou disfarçam a CD3 e/ou TcR sem afetar a expressão na superfície celular de CD2, CD4 ou CD8. O disfarce de CD3 e/ou TcR resulta na perda ou redução de ativação de células T.

[0044] Os anticorpos huCD3 da invenção se ligam à CD3 que inclui, total ou parcialmente, os resíduos de aminoácido da posição 27 à posição 43 da subunidade epsilon de CD3 humana processada (isto é, sem a sequência líder). A sequência de aminoácidos da subunidade epsilon de CD3 humana é mostrada, por exemplo, nos Nos. de Acesso ao GenBank NP_000724; AAA52295; P07766; A32069; CAA27516; e AAH49847. Por exemplo, o anticorpo huCD3 se liga um epitopo de CD3 que inclui, total ou parcialmente, a sequência de aminoácidos de EMGGITQTPYKVSISGT (SEQ ID NO: 67). Um anticorpo monoclonal huCD3 exemplificativo que se liga a esse epitopo é o anticorpo 28F11 descrito aqui. O anticorpo 28F11 inclui uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 2) codificada pela sequência de ácido nucléico mostrada abaixo em SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 4) codificada pela sequência de ácido nucléico mostrada em SEQ ID NO: 3 (Figuras 1A-1D).

[0045] Os aminoácidos abrangendo as regiões de determinação de complementaridade (CDR), conforme definido por Chothia et al, 1989, E.A. Kabat et al, 1991, estão destacadas entre retângulos abaixo (veja também figuras 1B e 1D e figuras 5 e 6). (Veja Chothia, C. et al, Nature 342: 877-883 (1989); Kabat E.A. et al, Sequences of Protein of Immunological Interest, Quinta Edição, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)). As CDRs de cadeia pesada do anticorpo 28F11 têm as seguintes sequências: GYGMH (SEQ ID

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NO: 27), VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 28) e QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 29). As CDRs de cadeia leve do anticorpo 28F11 têm as seguintes sequências: RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30), DASNRAT (SEQ ID NO: 31) e QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 32).

> Sequência de nucleotídeos da VH do 28F11: (SEQ ID NO: 1)

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCAAGTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAAGAAATAC TATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAC AAATGGGCTACTGGCACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA > Sequências de aminoácidos da VH do 28F11: (SEQ ID NO: 2)

Ovqlvesgggwqpgrslrlscaasgfkfs|gygmh|wvrqapgkglewva|viwydgskky| |yvdsvkg|rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycar|qmgywhfdl[wgrgtlvtvss > Sequência de nucleotídeos da VL do 28F11: (SEQ ID NO: 3) gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccac cctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaac ctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatccca gccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctaga gcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctccgctcactt tcggcggagggaccaaggtggagatcaaa >Sequências de aminoácidos da VL do 28F11: (SEQ ID NO: 4)

EIVLTQS PATLSLS PGERATLS c|RASQSVSSYLÃ|w YQQKPGQAPRLLI Y|DASNRAT|G IP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYClQQRSNWPPLTlFGGGTKVEIK [0046] O anticorpo 23F10 inclui uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID N0: 6) codificada pela sequência de ácido nucléico mostrada abaixo em SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 8) codificada pela sequência de ácido nucléico mostrada em SEQ ID NO: 7.

[0047] Os aminoácidos abrangendo a CDR conforme definido por

Chothia et al, 1989, E.A. Kabat et al, 1991, estão destacados entre retângulos abaixo. (Veja também figuras 2B, 2D). As CDRs de cadeia pesada do anticorpo 23F10 têm as seguintes sequências: GYGMH (SEQ ID NO: 27), VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 28) e

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QMGYWHFDL(SEQ ID NO: 29). As CDRs de cadeia leve do anticorpo 23F10 têm as seguintes sequências: RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30), DASNRAT (SEQ ID NO: 31) e QQRSNWPPLT(SEQ ID N0: 32).

> Sequência de nucleotídeos da VH do 23F10: (SEQ ID NO: 5)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGGGGAGGCGTGGTCCAGTCTGGGAGGTCCCTGAGACT CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCAAGTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAAGAAATAC TATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGGCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAC AAATGGGCTACTGGCACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA >Sequências de aminoácidos da VH do 23F10: (SEQ ID NO: 6)

QVQLVQSGGGVVQSGRSLRLSCAASGFKFS|GYGMH|WVRQAPGKGLEWVAV|IWYDGSKKY| |yvdsvkg|rfti srdnskntlylqmnslrgedtavyycar|qmgywhfdl|wgrgtlvtvs s > Sequência de nucleotídeos da VL do 23F10: (SEQ ID NO: 7)

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC CCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAAC CTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCA GCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA

GCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTT TCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA > Sequência de aminoácidos da VL do 23F10: (SEQ ID NO: 8)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC|RASQSVSSYIjjWYQQKPGQAPRLLIY^ÃSNRAT|GIP arfsgsgsgtdftltisslepedfavyycIqqrsnwppltIfgggtkveik [0048] O anticorpo 27H5 inclui uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 10) codificada pela sequência de ácido nucléico mostrada abaixo em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos mostradas abaixo em SEQ ID NOS: 16-20 e codificada pelas sequências de ácido nucléico mostradas em SEQ ID NO: 11-15. Conforme descrito aqui no Exemplo 2, um único hibridoma clonal derivado dos camundongos transgênicos HuMAb® pode produzir múltiplas cadeias leves para uma única cadeia pesada. Cada combinação de cadeias pesada e leve produzida é testada com relação ao funcionamento ótimo, conforme descrito aqui no Exemplo 2.

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21/81 [0049] Os aminoácidos abrangendo a CDR conforme definido por

Chothia et al 1989, E.A. Kabat et al, 1991, estão destacados entre retângulos abaixo. (Veja também figuras 3B, 3D, 5 e 7-8). As CDRs de cadeia pesada do anticorpo 27H5 têm as seguintes sequências: SYGMH (SEQ ID NO: 33), IIWYDGSKKNYADSVKG (SEQ ID NO: 34) e GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 35). As CDRs de cadeia leve do anticorpo 27H5 têm as seguintes sequências: RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 36); GASSRAT(SEQ ID NO: 37); QQYGSSPIT (SEQ ID NO: 38); RASQGISSALA (SEQ ID NO: 39); YASSLQS (SEQ ID NO: 40); QQYYSTLT (SEQ ID NO: 41); DASSLGS (SEQ ID NO: 42); e WASQGISSYLA (SEQ ID NO: 43).

> Sequência de nucleotídeos da VH do 27H5: (SEQ ID NO: 9)

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGAAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATATGGTATGATGGAAGTAAAAAAAAC TATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAG GAACTGGGTACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA > Sequências de aminoácidos da VH do 27H5: (SEQ ID NO: 10)

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFR|SYGMÍ^WVRQAPGKGLEWVA(lIWYDGSK^ ^MSyK^RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR^TG^^FDP|WGQGTLVTVSS > Sequência de nucleotídeos da VL1 do 27H5: (SEQ ID NO: 11)

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCACGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC CCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGA AACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATC CCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGACCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGATCACCT TCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA .

> Sequência de nucleotídeos da VL2 do 27H5: (SEQ ID NO: 12)

GACATCCTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC

CATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCA TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACGGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTACCCTCACTTTCGGCG GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

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22/81 > Sequência de nucleotídeos da VL3 do 27H5: (SEQ ID NO: 13)

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC CATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGGAAGTGGGGTCCCA TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACÀGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTACCCTCACTTTCGGCG GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA > Sequência de nucleotídeos da VL4 do 27H5: (SEQ ID NO: 14)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATTCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC CATCACTTGCTGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAAC CAGCAAAAGCCCCTAAGCTCTTCATCTATTATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCA TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACGGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTACCCTCACTTTCGGCG GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA > Sequência de nucleotídeos da VL5 do 27H5: (SEQ ID NO: 15)

GACATCGAGATGACCCAGTCTCCATTCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC CATCACTTGCTGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAAC CAGCAAAAGCCCCTAAGCTCTTCATCTATTATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCA TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACGGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTACCCTCACTTTCGGCG GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA > Sequência de aminoácidos da VL1 do 27H5: (SEQ ID NO: 16)

EI^TQSPRTLSLSPGERATLSC^ÃSQSVSSSYlAjWYQQKPGQAPRLLIY^ÃSSRATjGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLDPEDFAVYYCjQQYGSSPIT|FGQGTRLEIK > Sequência de aminoácidos da VL2 do 27H5: (SEQ ID NO: 17)

DILMTQS PSSLSAS VGDRVTI TC(RASQGISSALA|WYQQKPGKAPKLLI Y[YASS'lQS|GVP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYClQQYYSTLljFGGGTKVEIK > Sequência de aminoácidos da VL3 do 27H5: (SEQ ID NO: 18)

DIVMTQS PS SLSASVGDRVTI TCjRASQG IS SAIA|WYQQKPGKAPKLLI YjPAS SLGS|GVP

SRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYC|QQYYSTLTF|GGGTKVE IK > Sequência de aminoácidos da VL4 do 27H5: (SEQ ID NO: 19)

DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITC|WASQGISSYLÃ|WYQQKPAKAPKLFIY|YASSLQS|GVP

SRFSGSGSGTDYTLTI SSLQPEDFATYYCjQQYYSTLTFlGGGTKVEIK > Sequência de aminoácidos da VL5 do 27H5: (SEQ ID NO: 20) diemtqspfslsasvgdrvtitc|wasqgissyíã|wyqqkpakapklfiy|yasslqs|gvp srfsgsgsgtdytltisslqpedfatyyc|qqyystltf)gggtkveik [0050] O anticorpo 15C3 inclui uma região variável de cadeia pe sada (SEQ ID NO: 22) codificada pela sequência de ácido nucléico

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23/81 mostrada abaixo em SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve selecionada das sequências de aminoácido mostradas abaixo em SEQ ID NOS: 25-26 e codificada pelas sequências de ácido nucléicos mostradas em SEQ ID NO: 23-24. Conforme descrito aqui no Exemplo 2, um único hibridoma clonal derivado dos camundongos transgênicos HuMAb® pode produzir múltiplas cadeias leves para uma única cadeia pesada. Cada combinação de cadeias pesada e leve produzida é testada com relação ao funcionamento ótimo, conforme descrito aqui no Exemplo 2.

[0051] Os aminoácidos abrangendo a CDR conforme definido por

Chothia et al, 1989, E.A. Kabat et al, 1991, estão destacados entre retângulos abaixo. (Veja também figuras 4B, 4D e 5-7). As CDRs de cadeia pesada do anticorpo 15C3 têm as seguintes sequências: SYGMH (SEQ ID NO: 33), AIWYNGRKQDYADSVKG (SEQ ID NO: 44) e GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 35). As CDRs de cadeia leve do anticorpo 15C3 têm as seguintes sequências: RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30); DASNRAT (SEQ ID NO: 31); QQRSNWPWT (SEQ ID NO: 45); RASQGISSALA (SEQ ID NO: 39); DASSLES (SEQ ID NO: 46); QQFNSYPIT (SEQ ID NO: 47).

> Sequência de nucleotídeos da VH do 15C3: (SEQ ID NO: 21) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCCGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGTAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGCTATATGGTATAATGGAAGAAAACAAGAC TATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGGG GAACTGGGTACAATTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA > Sequência de aminoácidos da VH do 15C3: (SEQ ID NO: 22) qvqlvqsgggwqpgrslrlscvasgftfs|sygmh|wvrqapgkglewa|aiwyngrkqd| |YADSVKG|RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRjGTGYNWFDP|WGQGTLVTVSS > Sequência de nucleotídeos da VL1 do 15C3: (SEQ ID NO: 23)

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GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCAC ICCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAAC CTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCA GCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA GCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCGTGGACGTTCG GCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA > Sequência de nucleotídeos da VL2 do 15C3: (SEQ ID NO: 24)

GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTATGAGACAGAGTCAC ICATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCA TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCTATCACCTTCG GCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA > Sequência de aminoácidos da VL1 do 15C3: (SEQ ID NO: 25) eivltqspatlslspgeratlsc^asqsvssyla]wyqqkpgqaprlliy1dasnrat|gip ARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCjQQRSNWPWT|FGQGTKVE IK > Sequência de aminoácidos da VL2 do 15C3: (SEQ ID NO: 26)

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTlTC^ÃSQGISSALAlWYQQKPGKAPKLLIYjDASSLES|GVP SRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYC|QQFNSYPIT|FGQGTRLEIK [0052] Os anticorpos huCD3 da invenção também incluem anticorpos que incluem uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada variável que é pelo menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 6, 10 ou 22 e/ou uma sequência de aminoácidos de cadeia leve variável que é pelo menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 8, 16-20 ou 25-26.

[0053] Alternativamente, o anticorpo monoclonal é um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que 28F11,27H5, 23F10 ou 15C3.

[0054] A menos que de outro modo definido, os termos técnicos e científicos usados com relação à presente invenção têm os significados que são comumente compreendidos por aqueles versados na técnica. Ainda, a menos que de outro modo requerido pelo contexto, termos no singular incluirão pluralidades e termos no plural incluirão o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas com relação a e as técnicas de cultura de células e tecido, biologia molecular e química de

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25/81 proteína e oligo- ou polinucleotídeo e hibridização descritas aqui são aquelas bem-conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnica padrão são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo e cultura tecidual e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou conforme comumente realizado na técnica ou conforme descrito aqui. As técnicas e procedimentos precedentes são, geralmente, realizados de acordo com métodos convencionais bem-conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e específicas que são citadas e discutidas no decorrer do presente relatório descritivo. Veja, por exemplo, Sambrook et al Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). As nomenclaturas utilizadas com relação a e os procedimentos e técnicas de laboratório de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritas aqui são aquelas bem-conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnica padrão são usadas para síntese química, análises químicas, preparados farmacêuticos, formulação e distribuição e tratamento de pacientes.

[0055] Conforme utilizado de acordo com a presente descrição, os termos a seguir, a menos que de outro modo indicado, serão compreendidos como tendo os seguintes significados:

[0056] Conforme usado aqui, o termo anticorpo se refere a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina (Ig), isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente (imunorreage com) um antígeno. Tais anticorpos incluem, mas não estão limitados a, policlonal, monoclonal, quimérico, com cadeia simples, Fab, Fab' e F(ab')2 e uma biblioteca de expressão de Fab. Por se liga especificamente ou imunorreage com entenda-se que o anticorpo reage com um ou mais de

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26/81 terminantes antigênicos do antígeno desejado e não reage (isto é, se liga) a outros polipeptídeos ou se liga em uma afinidade muito menor (Kd >10^-6) a outros polipeptídeos.

[0057] A unidade estruturas básica do anticorpo é conhecida por compreender um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e uma pesada (cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsável pelo reconhecimento de antígeno. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função ativadora. Cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves capa e lambda. Cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou epsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leve e pesada, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região J de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região D de cerca de 10 mais aminoácidos. Veja, de modo geral, Fundamental Immunology, Capítulo 7 (Paul, W., ea., 2^a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). As regiões variáveis do par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo.

[0058] O termo anticorpo monoclonal (MAb) ou composição de anticorpo monoclonal, conforme usado aqui, se refere a uma população de moléculas de anticorpo que contêm apenas uma espécie molecular de molécula de anticorpo consistindo em um único produto genético de cadeia leve e um único produto genético de cadeia pesada. Em particular, as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) do anticorpo monoclonal são idênticas em todas as moléculas da população. MAbs contêm um sítio de ligação a antígeno capaz de imunorreação com um epitopo em particular do antígeno caracterizado

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27/81 pela afinidade única de ligação pelo mesmo.

[0059] Em geral, moléculas de anticorpo obtidas de seres humanos se referem a qualquer uma das classes IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, as quais diferem umas das outras pela natureza da cadeia pesada presente na molécula. Determinadas classes têm subclasses também, tais como IgG1, IgG2 e outros. Além disso, em seres humanos, a cadeia leve pode ser uma cadeia capa ou lambda.

[0060] O termo sítio de ligação a antígeno ou porção de ligação se refere à parte da molécula de imunoglobulina que participa da ligação ao antígeno. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelos resíduos de aminoácidos das regiões variáveis (V) N-terminais das cadeias pesada (H) e leve (L). Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesada e leve, referidos como regiões hipervariáveis), são interpostos entre trechos de flanqueamento mais conservados conhecidos como regiões estrutura ou FRs. Assim, o termo FR se refere a sequências de aminoácidos as quais são encontradas naturalmente entre e adjacentes a regiões hipervariáveis em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada estão dispostas umas com relação às outras em um espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação a antígeno. A superfície de ligação a antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesada e leve são referidas como regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. A atribuição de aminoácidos a cada domínio é de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991) ) ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chothia et al Nature 342: 878-883 (1989).

[0061] Conforme usado aqui, o termo epitopo inclui qualquer de

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28/81 terminante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina, uma scFv ou um receptor de célula T. O termo epitopo inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Determinantes epitópicos usualmente consistem em agrupamentos na superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características específicas de carga. Um anticorpo é dito como se ligando especificamente a um antígeno quando a constante de dissociação é < 1 pM; de preferência < 100 nM e, mais preferivelmente, < 10 nM.

[0062] Conforme usado aqui, os termos ligação imunológica e propriedades de ligação imunológica se referem às interações nãocovalentes do tipo o qual ocorre entre uma molécula de imunoglobulina e um antígeno para o qual a imunoglobulina é específica. A resistência ou afinidade de interações de ligação imunológica pode ser expressa em termos da constante de dissociação (Kd) da interação, em que uma menor Kd representa uma maior afinidade. Propriedades de ligação imunológica de polipeptídeos selecionados são quantificadas usando métodos bem-conhecidos na técnica. Um de tais métodos requer medição das taxas de formação do complexo antígeno/sítio de ligação a antígeno e a dissociação nessas taxas depende das concentrações dos parceiros no complexo, da afinidade da interação e parâmetros geométricos que influenciam igualmente a taxa em ambas as direções. Assim, a constante da taxa de associação (Kon) e a constante da taxa de dissociação (Koff) podem ser determinadas através de cálculo das concentrações e das taxas reais de associação e dissociação. (Veja Nature 361: 186-87 (1993)). A proporção de Koff/Kon permite o cancelamento de todos os parâmetros não relacionados à afinidade e é igual à constante de dissociação, Kd. (Veja, de modo ge

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29/81 ral, Davies et al (1990) Annual Rev Biochem 59: 439-473). Um anticorpo da presente invenção é dito como se ligando especificamente a um epitopo de CD3 quando a constante de ligação em equilíbrio (Kd) é < 1 μM; de preferência < 100 nM, mais preferivelmente < 10 nM e ainda mais preferivelmente < 100 pm a cerca de 1 pm, conforme medido através de ensaios, tais como ensaios de radioligante ou ensaios similares conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0063] Aqueles versados na técnica reconhecerão que é possível determinar, sem experimentação indevida, se um anticorpo monoclonal humano tem a mesma especificidade que um anticorpo monoclonal humano da invenção (por exemplo, anticorpo monoclonal 28F11, 27H5, 23F10 ou 15C3) determinando se o primeiro impede o último de ligação a um polipeptídeo antigênico de CD3. Se o anticorpo monoclonal humano que está sendo testado compete com um anticorpo monoclonal humano da invenção, conforme mostrado por uma diminuição na ligação pelo anticorpo monoclonal humano da invenção, então, os dois anticorpos monoclonais se ligam ao mesmo ou a um epitopo intimamente relacionado. Outra forma de determinar se um anticorpo monoclonal humano tem a especificidade de um anticorpo monoclonal humano da invenção é pré-incubar o anticorpo monoclonal humano da invenção com o polipeptídeo antigênico de CD3 com o qual ele é normalmente reativo e, então, adicionar o anticorpo monoclonal humano que está sendo testado para determinar se o anticorpo monoclonal humano que está sendo testado é inibido em sua capacidade de se ligar ao polipeptídeo antigênico de CD3. Se o anticorpo monoclonal humano que está sendo testado é inibido, então, provavelmente, ele tem a mesma ou uma especificidade epitópica funcionalmente equivalente ao anticorpo monoclonal da invenção.

[0064] Vários procedimentos conhecidos na técnica são usados para a produção dos anticorpos monoclonais dirigidos contra uma pro

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30/81 teína, tal como uma proteína CD3 ou contra derivados, fragmentos, análogos homólogos ou ortólogos dos mesmos. (Veja, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E e Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, incorporada aqui por referência). Anticorpos totalmente humanos são moléculas de anticorpo nas quais a sequência toda da cadeia leve e da cadeia pesada, incluindo as CDRs, se originam de genes humanos. Tais anticorpos são determinados anticorpos humanos ou anticorpos totalmente humanos aqui. Anticorpos monoclonais humanos são preparados, por exemplo, usando os procedimentos descritos abaixo no Exemplo 1. Anticorpos monoclonais humanos podem ser também preparados através de uso da técnica de trioma; a técnica com hibridoma de células B humanas (Veja Kozbor et al, 1983 Immunol Today 4: 72); e a técnica com hibridoma de EBV produzem anticorpos monoclonais humanos (Veja Cole et al, 1985 Em: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Anticorpos monoclonais humanos podem ser utilizados e podem ser produzidos usando hibridomas humanos (Veja Cote et al, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) ou através de transformação de células B humanas com o vírus de Epstein Barr in vitro (Veja Cole et al, 1985 Em: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96).

[0065] Anticorpos são purificados através de técnicas bemconhecidas, tal como cromatografia por afinidade usando proteína A ou proteína G, a qual proporciona primariamente a fração de IgG de soro imune. Subsequente ou alternativamente, o antígeno específico o qual é o alvo da imunoglobulina ou um epitopo do mesmo pode ser imobilizado sobre uma coluna para purificar o anticorpo específico imune através de cromatografia por imunoafinidade. A purificação de imunoglobulinas é discutida, por exemplo, pelo D. Wilkinson (The Sci

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31/81 entist, publicado pela The Scientist, Inc., Filadélfia PA, Vol. 14, No. 8 (17 de Abril de 2000), páginas 25-28).

[0066] É desejável modificar o anticorpo da invenção com relação à função ativadora, de modo a intensificar, por exemplo, a eficácia do anticorpo no tratamento de doenças imune-relacionadas. Por exemplo, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, desse modo, permitindo a formação de ligação de dissulfeto intercadeia nessa região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade aperfeiçoada de internalização e/ou morte celular complementomediada e citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) aumentadas (Veja Caron et al, J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente, um anticorpo pode ser manipulado o qual tem regiões Fcs duplas e podem, desse modo, ter capacidade de lise de complemento e ADCC intensificadas. (Veja Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219230 (1989)).

[0067] A invenção também inclui fragmentos de huCD3 Fv, Fab, Fab' e F(ab')2, anticorpos huCD3 biespecíficos e anticorpos huCD3 heteroconjugados. Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação por pelo menos dois antígenos diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é pela CD3. O segundo alvo de ligação é qualquer outro antígeno e, vantajosamente, é uma proteína da superfície celular ou receptor ou subunidade de receptor.

[0068] Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Em virtude da seleção aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma

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32/81 mistura potencial de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta usualmente é realizada através de etapas de cromatografia por afinidade. Procedimentos similares são descritos no WO 93/08829, publicado em 13 de Maio de 1993 e em Traunecker et al, EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

[0069] Domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpo-antígeno) podem ser fundidos às sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é, de preferência, com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo pelo menos parte da dobradiça, das regiões CH2 e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão distintos e são co-transfectados em um organismo hospedeiro adequado. Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos veja, por exemplo, Suresh et al, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

[0070] De acordo com outra abordagem descrita no WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar o percentual de heterodímeros os quais são recuperados da cultura de células recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte da região CH3 de um domínio constante de anticorpo. Nesse método, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácido da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) maior(es) são criadas sobre a inter

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33/81 face da segunda molécula de anticorpo substituindo grandes cadeias laterais de aminoácido por aquelas menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso proporciona um mecanismo para aumento do rendimento do heterodímero sobre outros subprodutos indesejados, tais como homodímeros.

[0071] Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos F(ab')2). Técnicas para a geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al, Science 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de formação de complexo de ditiol arsenita de sódio para estabilizar os ditióis vizinhos e impedir formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são, então, convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'TNB é, então, reconvertido ao Fab'-tiol através de redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[0072] Adicionalmente, fragmentos Fab' podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo F(ab')2 biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células superexpressando o receptor

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ErbB2 e células T humanas normais, bem como disparar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de câncer de mama humano.

[0073] Várias técnicas para a fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente de culturas de células recombinantes também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al, J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos do zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão de gene. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região da dobradiça para formar monômeros e, então, reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Esse método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de diacorpo descrita por Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos de anticorpo biespecífico. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) através de um ligante o qual é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares do outro fragmento, desse modo, formando dois sítios de ligação de antígeno. Outra estratégia para fabricação de fragmentos de anticorpo biespecífico através do uso de dímeros de Fv com cadeia simples (sFv) também foi reportada. Veja Gruber et al, J. Immunol. 152: 5368 (1994).

[0074] Anticorpos com mais de duas valências são considerados.

Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al, J. Immunol. 147: 60 (1991).

[0075] Anticorpos biespecíficos exemplificativos podem se ligar a

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35/81 dois epitopos diferentes, pelo menos um dos quais se origina do antígeno de proteína da invenção. Alternativamente, um braço antiantigênico de uma molécula de imunoglobulina pode ser combinado com um braço o qual se liga a uma molécula de disparo sobre um leucócito, tal como uma molécula do receptor de células T (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7) ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD 16), de modo a focalizar os mecanismos de defesa celular a célula expressando o antígeno em particular. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para dirigir agentes citotóxicos a células as quais expressam um antígeno em particular. Esses anticorpos possuem um braço de ligação a antígeno e um braço o qual se liga a um agente citotóxico ou um quelador de radionuclídeo, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA. Outro anticorpo biespecífico de interesse se liga ao antígeno de proteína descrito aqui e ainda se liga ao fator tecidual (TF).

[0076] Anticorpos heteroconjugados também estão dentro do escopo da presente invenção. Anticorpos heteroconjugados foram propostos, por exemplo, para objetivar células do sistema imune à células indesejadas (Patente U.S. N° 4.676.980) e para o tratamento de infecção pelo HIV (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Considera-se que os anticorpos podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos em química de proteína sintética, incluindo aqueles envolvendo agentes de ligação reticulada. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de dissulfeto ou através de formação de uma ligação de tioéter. Exemplos de reagentes adequados para essa finalidade incluem iminotiolato e metil-4mercapto butirimidato e aqueles descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 4.676.980.

[0077] A invenção também se refere a imunoconjugados compreendendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico, tal como

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36/81 uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou fragmentos da mesma) ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

[0078] Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser usados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação da cadeia A de exotoxina de difteria (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sacarina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos estão disponíveis para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y e ¹⁸⁶Re.

[0079] Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento à proteína bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCl de dimetil adipimidato), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolieno) e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapentaacético carbono-14-rotulado (MX-DTPA) é um agente de quelação exemplificativo para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. (Veja W094/11026).

[0080] Aqueles versados na técnica reconhecerão que uma gran

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37/81 de variedade de possíveis porções pode ser acoplada aos anticorpos resultantes ou outras moléculas da invenção. (Veja, por exemplo, Conjugate Vaccines, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse e R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989), cujos conteúdos totais são incorporados aqui por referência).

[0081] Acoplamento é realizado através de qualquer reação química que ligará as duas moléculas, contanto em que o anticorpo e a outra porção retenham suas respectivas atividades. Essa ligação pode incluir muitos mecanismos químicos, por exemplo, ligação covalente, ligação por afinidade, intercalação, ligação coordenada e formação de complexo. A ligação preferida é, contudo, ligação covalente. Ligação covalente é obtida através de condensação direta de cadeias laterais existentes ou através de incorporação de moléculas de ligação em ponte externas. Muitos agentes de ligação bivalentes ou polivalentes são úteis no acoplamento de moléculas de proteína, tais como os anticorpos da presente invenção, a outras moléculas. Por exemplo, agentes de acoplamento representativos podem incluir compostos orgânicos, tais como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldeído, diazobenzenos e hexametileno diaminas. Essa listagem não se destina a ser exaustiva das várias classes de agentes de acoplamento conhecidas na técnica mas, ao contrário, é exemplificativa dos agentes de acoplamento mais comuns. (Veja Killen e Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al, Immunological Reviews 62: 185-216 (1982); e Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ligantes preferidos são descritos na literatura. (Veja, por exemplo, Ramakrishnan, S. et al, Cancer Res. 44: 201-208 (1984) descrevendo o uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidróxisuccinimida). Veja também Patente U.S. N° 5.030.719 descrevendo o uso de derivado de acetil hidrazida halogenado acoplado a um anticorpo por meio de um ligante de oligopeptídeo. Ligantes particularPetição 870190084596, de 29/08/2019, pág. 41/97

38/81 mente preferidos incluem: (i) EDC cloridrato de (1-etil-3-(3dimetilamino-propil)carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonilalfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat.

(21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6-[3-(2-piridilditio) propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat N° 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfo-succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propianamida]hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. N° 2165-G); e (v) sulfo-NHS (N-hidróxi-sulfosuccinimida: Pierce Chem. Co., Cat. N° 24510) conjugado a EDC.

[0082] Os ligantes descritos acima contêm componentes que têm diferentes atributos, assim, levando a conjugados com diferentes propriedades físico-químicas. Por exemplo, sulfo-NHS ésteres de alquil carboxilatos são mais estáveis do que sulfo-NHS ésteres de carboxilatos aromáticos. Ligantes contendo NHS-éster são menos solúveis do que sulfo-NHS ésteres. Ainda, o ligante SMPT contém uma ligação de dissulfeto estericamente impedida e pode formar conjugados com estabilidade aumentada. Ligações de dissulfeto são, em geral, menos estáveis do que outras ligações porque a ligação de dissulfeto é clivada in vitro, resultando em menos conjugado disponível. Sulfo-NHS em particular pode intensificar a estabilidade dos acoplamentos de carbodiimida. Acoplamentos de carbodiimida (tal como EDC), quando usados em conjunto com sulfo-NHS, formam ésteres que são mais resistentes à hidrólise do que a reação de acoplamento com carbodiimida apenas.

[0083] O termo polinucleotídeo isolado, conforme usado aqui, significará um polinucleotídeo de origem genômica, de cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos o qual, em virtude de sua origem, o polinucleotídeo isolado (1) não está associado a toda ou uma parte de um polinucleotídeo no qual o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, (2) é operavelmente ligado a um polinucleotídeo o qual não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como

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39/81 parte de uma sequência maior.

[0084] O termo proteína isolada, referido aqui, significa uma proteína de cDNA, RNA recombinante ou origem sintética ou alguma combinação dos mesmos a qual, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, a proteína isolada (1) não está associada com proteínas encontradas na natureza, (2) é isenta de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, isenta de proteínas marinhas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza.

[0085] O termo polipeptídeo é usado aqui como um termo genérico para se referir a uma proteína nativa, fragmentos ou análogos de uma sequência de polipeptídeo. Consequentemente, fragmentos e análogos de proteína nativa são espécies do gênero polipeptídeo. Polipeptídeos preferidos de acordo com a invenção compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada humana representadas pelas figuras 1B, 2B, 3B e 4B e as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve humana representadas pelas figuras 1D, 2D, 3D e 4D, bem como moléculas de anticorpo formadas por combinações compreendendo as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada com moléculas de imunoglobulina de cadeia leve, tais como moléculas de imunoglobulina de cadeia leve capa e vice-versa, bem como fragmentos e análogos dos mesmos.

[0086] O termo que ocorre naturalmente, conforme usado aqui quando aplicado a um objeto, se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e a qual não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem no laboratório ou de outro modo ocorre naturalmente.

[0087] O termo operavelmente ligado, conforme usado aqui, se refere a posições de componentes assim descritos que estão em uma

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40/81 relação que permite que os mesmos funcionem de sua maneira pretendida. Uma sequência de controle operavelmente ligada a uma sequência de codificação é ligada de uma forma tal que a expressão da sequência de codificação é obtida sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0088] O termo sequência de controle, conforme usado aqui, se refere a sequências de polinucleotídeo as quais são necessárias para realizar expressão e processamento de sequências de codificação às quais elas estão ligadas. A natureza de tais sequências de controle difere, dependendo do organismo hospedeiro. Em procariotas, tais sequências de controle incluem, geralmente, promotores, sítios de ligação ribossômica e sequências de término de transcrição. Em eucariotas, geralmente, tais sequências de controle incluem promotores e sequências de término de transcrição. O termo sequências de controle se destina a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para expressão e processamento e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líderes e sequências parceiras de fusão. O termo polinucleotídeo, conforme referido aqui, significa um grupo polimérico de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de filamento simples e duplo de DNA.

[0089] O termo oligonucleotídeo, referido aqui, inclui nucleotídeos que ocorrem naturalmente e modificados ligados juntos por ligações de oligonucleotídeo que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente. Oligonucleotídeos são um subconjunto de polinucleotídeo compreendendo geralmente um comprimento de 200 bases ou menos. De preferência, oligonucleotídeos têm 10 a 60 bases de comprimento e, mais preferivelmente, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases

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41/81 de comprimento. Oligonucleotídeos são, usualmente, de filamento simples, por exemplo, para sondas, embora oligonucleotídeos possam ser de filamento duplo, por exemplo, para uso na construção de um mutante genético. Os oligonucleotídeos da invenção são oligonucleotídeos sentido ou anti-sentido.

[0090] O termo nucleotídeos que ocorrem naturalmente, referido aqui, inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo nucleotídeos modificados, referido aqui, inclui nucleotídeos com grupos açúcar modificados e substituídos e semelhantes. O termo ligações de oligonucleotídeo, referido aqui, inclui ligações de oligonucleotídeo, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fósforosselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e semelhantes. Veja, por exemplo, LaPlanche et al Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984), Stein et al Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988), Zon et al Anti Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, páginas 87-108 (F. Eckstein ed., Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec et al Patente U.S. N° 5.151.510; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990). Um oligonucleotídeo pode incluir um rótulo para detecção, se desejado.

[0091] O termo se hibridiza seletivamente, referido aqui, significa se liga detectável e especificamente. Polinucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos dos mesmos de acordo com a invenção se hibridizam seletivamente a filamentos de ácido nucléico sob condições de hibridização e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucléicos não específicos. Condições de elevada estringência podem ser usadas para obter condições de hibridização seletiva conforme conhecido na técnica e discutido aqui. De modo geral, a homologia da sequência de ácido nucléico entre os polinucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos da invenção e uma se

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42/81 quência de ácido nucléico de interesse será de pelo menos 80% e, mais tipicamente, de preferência com homologias crescentes de pelo menos 85%, 90%, 95%, 99% e 100%. Duas sequências de aminoácidos são homólogas se existe uma identidade parcial ou completa entre suas sequências. Por exemplo, homologia de 85% significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências são alinhadas para combinação máxima. Falhas (em qualquer uma das duas sequências que estão sendo combinadas) são permitidas para maximizar a combinação de extensões de falhas de 5 ou menos são preferidas, com 2 ou menos sendo ainda mais preferido. Alternativamente e de preferência, duas sequências de proteína (ou sequências de polipeptídeo derivadas das mesmas com pelo menos 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, conforme esse termo é usado aqui, se elas têm um escore de alinhamento de mais do que 5 (em unidades de desvio padrão) usando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalidade por falha de 6 ou mais. Veja Dayhoff, M. O. em Atlas of Protein Sequence and Structure, páginas 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) e Suplemento 2 desse volume, páginas 1-10. As duas sequências ou partes das mesmas são, mais preferivelmente, homólogas se seus aminoácidos são mais do que iguais a 50% idênticos quando otimamente alinhadas usando o programa ALIGN. O termo corresponde a é usado aqui para significar que uma sequência de polinucleotídeo é homóloga (isto é, idêntica, não estritamente relacionada à evolução) a toda ou parte de uma sequência de polinucleotídeo de referência ou que a sequência de polipeptídeo é idêntica a uma sequência de polipeptídeo de referência. Em contra-partida, o termo complementar a é usado aqui para significar que a sequência complementar é homóloga a toda ou uma parte de uma sequência de polinucleotídeo de referência. Para ilustração, a sequência de nucleotídeos TATAC corresponde a uma se

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43/81 quência de referência TATAC e é complementar a uma sequência de referência GTATA.

[0092] Os termos a seguir são usados para descrever as relações de sequência entre duas ou mais sequências de polinucleotídeo ou aminoácido: sequência de referência, janela de comparação, identidade de sequência, percentual de identidade de sequência e identidade substancial. Uma sequência de referência é uma sequência definida usada como uma base para uma comparação de sequência. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento de uma sequência genética ou de cDNA de comprimento total fornecida em uma listagem de sequência ou pode compreender uma sequência genética ou de cDNA completa. De modo geral, a sequência de referência tem pelo menos 18 nucleotídeos ou 6 aminoácidos de comprimento, frequentemente pelo menos 24 nucleotídeos ou 8 aminoácidos de comprimento e frequentemente pelo menos 48 nucleotídeos ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vez que duas sequências de polinucleotídeo ou aminoácido pode, cada uma (1) compreender uma sequência (isto é, uma porção da sequência de polinucleotídeo ou aminoácido completa) que é similar entre as duas moléculas e (2) pode ainda compreender uma sequência que é divergente entre as duas sequências de polinucleotídeo ou aminoácido, comparações de sequência entre duas (ou mais) moléculas são, tipicamente, realizadas através de comparação das sequências das duas moléculas sobre uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma janela de comparação, conforme usado aqui, se refere a um segmento conceitual de pelo menos 18 posições contínuas de nucleptídeo ou 6 aminoácidos onde uma sequência de polinucleotídeos ou sequência de aminoácidos pode ser comparada a uma sequência referência de pelo menos 18 nucleotídeos contínuos ou 6 se

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44/81 quências de aminoácidos e onde a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições, deleções, substituições e semelhantes (isto é, falhas) de 20 por cento ou menos quando comparado com a sequência de referência (a qual não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. Alinhamento ótimo de sequências para alinhamento com uma janela de comparação pode ser conduzido através do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Adv. Appl: Math. 2: 482 (1981), através do algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), através de busca pelo método de similaridade de Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S.A.) 85: 2444 (1988), através de implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de Software Wisconsin Genetics, Versão 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), os pacotes de software Geneworks ou MacVector) ou através de inspeção e melhor alinhamento (isto é, resultando no maior percentual de homologia sobre a janela de comparação) gerado através de vários métodos.

[0093] O termo identidade de sequência significa que duas sequências de polinucleotídeo ou aminoácido são idênticas (isto é, em uma base nucleotídeo-a-nucleotídeo ou resíduo-a-resíduo) sobre a janela de comparação. O termo percentual de identidade de sequência é calculado através de comparação de duas sequências otimamente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucléico ou resíduo idêntico (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) ocorre em ambas as sequências para proporcionar o número de posições combinadas, dividindo-se o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando-se o resultado por 100 a fim de proporcionar o percentual de identidade de

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45/81 sequência. O termo identidade substancial, conforme usado aqui, denota uma característica de uma sequência de polinucleotídeo ou aminoácido, em que o polinucleotídeo ou aminoácido compreende uma sequência que tem pelo menos 85 por cento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 a 95 por cento de identidade de sequência mais usualmente pelo menos 99 por cento de identidade de sequência quando comparado com uma sequência de referência sobre uma janela de comparação de pelo menos 18 posições de nucleotídeos (6 aminoácidos), frequentemente sobre uma janela de pelo menos 24-48 posições de nucleotídeo (8-16 aminoácidos), em que o percentual de identidade de sequência é calculado através de comparação da sequência de referência com a sequência a qual pode incluir deleções ou adições as quais totalizam 20 por cento ou menos da sequência de referência sobre a janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior.

[0094] Conforme usado aqui, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações acompanham o uso convencional. Veja Immunology - A Synthesis (2^a Edição e. S. Golub e D. R. Gren eds., Sinauer Associates, Sunderland 7 Mass. (1991)). Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos «,«-dissubstituídos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para os polipeptídeos da presente invenção. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N, N,N-trimetillisina, ε-Nacetillisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-N-metilarginina e outros aminoácidos similares e imino ácidos (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação do polipeptídeo usada aqui, a direção a partir da esquerda é a direção amino terminal e a direção a partir da direita é a direção carbóxiPetição 870190084596, de 29/08/2019, pág. 49/97

46/81 terminal de acordo com o uso e convenção padrão.

[0095] Similarmente, a menos que de outro modo especificado, a extremidade a partir da esquerda das sequências de polinucleotídeo de filamento simples é a extremidade 5' e a direção a partir da esquerda de sequências de polinucleotídeo fita dupla é referida como a direção 5'. A direção de adição 5' para 3' dos transcritos de RNA nascentes é referida como as regiões de sequência na direção de transcrição sobre o filamento de DNA tendo a mesma sequência que o RNA e as quais são 5' à extremidade 5' do transcrito de RNA são referidas como sequências a montante, regiões da sequência sobre a fita de DNA tendo a mesma sequência que o RNA e as quais são 3' à extremidade 3' do transcrito de RNA são referidas como sequências a jusante.

[0096] Quando aplicado a polipeptídeos, o termo identidade substancial significa que duas sequências de polipeptídeo, quando otimamente alinhadas, tal como através dos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de falha de default, compartilham pelo menos 80 por cento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 por cento de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos 95 por cento de identidade de sequência e ainda mais preferivelmente pelo menos 99 por cento de identidade de sequência.

[0097] De preferência, as posições de resíduo as quais não são idênticas diferem por substituições conservativas de aminoácido.

[0098] Substituições conservativas de aminoácidos se referem a capacidade de permutação de resíduos tendo cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas de hidroxila é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo

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47/81 de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalaninatirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido glutâmico-ácido aspártico e asparagina-glutamina.

[0099] Conforme discutido aqui, variações mínimas nas sequências de aminoácido de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina são consideradas como sendo abrangidas pela presente invenção, contanto que as variações na sequência de aminoácido mantenham pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, 90%, 95% e ainda mais preferivelmente 99%. Em particular, substituições conservativas de aminoácidos são consideradas. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que são relacionadas quanto às suas cadeias laterais. Aminoácidos geneticamente codificados são, de modo geral, divididos em famílias: (1) aminoácidos ácidos são aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos são lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos não-polares são alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano e (4) aminoácidos polares não carregados são glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Os aminoácidos hidrofílicos incluem arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina e treonina. Os aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina. Outras famílias de aminoácidos incluem (i) serina e treonina, as quais são a família hidróxi-alifática; (ii) asparagina e glutamina, as quais são a família contendo amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, as quais são a família alifática; e (iv) fenilalanina, triptofano e tirosina, as quais são a família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina

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48/81 por uma isoleucina ou valina, um aspartato por glutamato, uma treonina por uma serina ou uma substituição similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado não tenha um grande efeito sobre a ligação ou propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolve um aminoácido dentro de um sítio de estrutura. Se uma alteração de aminoácido resulta em um peptídeo funcional pode ser prontamente determinado avaliando a atividade específica do derivado polipeptídico. Ensaios são descritos em detalhes aqui. Fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser prontamente preparados por aqueles versados na técnica. Amino- e carbóxi-términos preferidos de fragmentos ou análogos ocorrem próximo dos limites de domínios funcionais. Domínios estruturais e funcionais podem ser identificados através de comparação dos dados da sequência de aminoácido e/ou nucleotídeo em bancos de dados de sequências públicos ou privados. De preferência, métodos de comparação computadorizados são usados para identificar motivos de sequência ou domínios de conformação de proteína previstos que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecida. Métodos para identificar sequências de proteína que se duplicam em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Bowie et al Science 253: 164 (1991). Assim, os exemplos precedentes demonstram que aqueles versados na técnica podem reconhecer motivos de sequência e conformações estruturais que podem ser usadas para definir domínios estruturais e funcionais de acordo com a invenção.

[00100] Substituições de aminoácido preferidas são aquelas as quais: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formação de complexos de proteína, (4) alteram as afinidades de ligação e (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos. Análogos podem incluir várias muteínas de uma

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49/81 outra sequência que não a sequência peptídica que ocorre naturalmente. Por exemplo, substituições de um único ou de múltiplos aminoácidos (de preferência, substituições conservativas de aminoácido) podem ser feitas na sequência que ocorre naturalmente (de preferência, na porção do polipeptídeo fora do(s) domínio(s) que formam contatos intermoleculares). Uma substituição conservativa de aminoácido não deverá alterar substancialmente as características estruturais da sequência original (por exemplo, uma substituição de aminoácido não deverá ter uma tendência a romper uma hélice que ocorre na sequência original ou romper outros tipos de estruturas secundárias que caracterizam a sequência original). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reconhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton ed., W. H. Freeman e Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991) ); e Thornton et al, Nature 354: 105(1991).

[00101] O termo fragmento de polipeptídeo, conforme usado aqui, se refere a um polipeptídeo que tem uma deleção amino terminal e/ou carbóxi terminal, mas onde a sequência de aminoácidos restante é idêntica às posições correspondentes na sequência que ocorre naturalmente deduzida, por exemplo, a partir de uma sequência de cDNA de comprimento total. Fragmentos têm, tipicamente, pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, usualmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento e ainda mais preferivelmente pelo menos 70 aminoácidos de comprimento. O termo análogo, conforme usado aqui, se refere a polipeptídeos os quais são compreendidos de um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que tem identidade substancial a uma porção de uma sequência de aminoácidos deduzida e o qual tem pelo

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50/81 menos uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica à CD3, sob condições de ligação adequadas, (2) capacidade de bloquear a ligação apropriada à CD3 ou (3) capacidade de inibir o desenvolvimento de células que expressam a CD3 in vitro ou in vivo. Tipicamente, análogos de polipeptídeo compreendem uma substituição conservativa de aminoácido (ou adição ou deleção) com relação à sequência que ocorre naturalmente. Análogos têm, tipicamente, pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 50 aminoácidos de comprimento ou mais e podem, frequentemente, ser tão longos quanto um polipeptídeo que ocorre naturalmente de comprimento total. [00102] Análogos de peptídeo são comumente usados na indústria farmacêutica como drogas não-peptídicas com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Esses tipos de compostos nãopeptídicos são denominados miméticos peptídicos ou peptidomiméticos. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986), Veber e Freidinger TINS página 392 (1985); e Evans et al J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Tais compostos são, frequentemente, desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. Miméticos peptídicos que são estruturalmente similares aos peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. De modo geral, peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo paradigma (isto é, um polipeptídeo que tem uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica), tal como um anticorpo humano, mas tem uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada do grupo consistindo em: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH-- (cis e trans), --COCH2--, CH(OH)CH2-- e -CH2SO--, através de métodos bem-conhecidos na técnica. Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina em lugar de L-lisina) pode ser usaPetição 870190084596, de 29/08/2019, pág. 54/97

51/81 da para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, peptídeos restritos compreendendo uma sequência de consenso ou uma variação da sequência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados através de métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)); por exemplo, através de adição de resíduos de cisteína internos capazes de formação de ligações em ponte de dissulfeto os quais ciclizam o peptídeo.

[00103] O termo agente é usado aqui para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato feito de materiais biológicos.

[00104] Conforme usado aqui, os termos rótulo ou rotulado se referem à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, através de incorporação de um aminoácido radiorrotulado ou fixação a um polipeptídeo de porções biotinila que podem ser detectadas pela atividade marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou calorimétricos). Em determinadas situações, o rótulo ou marcador também pode ser terapêutico. Vários métodos de rotulação de polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, mas não estão limitados aos seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanídeo, fósforo), rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de armorácia, p-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescentes, grupos biotinila, epitopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências pares do zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epitopo). Em algumas modalidades, os rótulos são presos através de braços espaçadores de vários comprimentos para

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52/81 reduzir o impedimento estérico em potencial. O termo agente ou droga farmacêutica, conforme usado aqui, se refere a um composto químico ou composição capaz de induzir a um efeito terapêutico desejado quando apropriadamente administrado a um paciente.

[00105] Outros termos químicos aqui são usados de acordo com o uso convencional na técnica, conforme exemplificado pelo The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S. ed:, McGrawHill, San Francisco (1985)).

[00106] O termo agente anti-neoplásico é usado aqui para se referir a agentes que têm a propriedade funcional de inibir o desenvolvimento ou progressão de um neoplasma em um ser humano, particularmente uma lesão maligna (câncer), tal como um carcinoma, sarcoma, linfoma ou leucemia. Inibição de metástase é frequentemente uma propriedade de agentes antineoplásicos.

[00107] Conforme usado aqui, substancialmente puro significa que uma espécie em questão é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar, é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição) e, de preferência, uma fração substancialmente pura é uma composição em que a espécie em questão compreende pelo menos cerca de 50 por cento (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes.

[00108] De modo geral, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80 por cento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, mais preferivelmente mais de cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. Mais preferivelmente, a espécie em questão é purificada até homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição através de métodos convencionais de detecção), em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular.

[00109] O termo paciente inclui seres humanos e animais.

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Anticorpos Humanos e Humanização de Anticorpos [00110] Um anticorpo huCD3 é gerado, por exemplo, através de imunização de camundongos xenogênicos capazes de desenvolver anticorpos totalmente humanos (veja Exemplo 1). Um anticorpo huCD3 de IgG é gerado, por exemplo, através de conversão de um anticorpo anti-CD3 de IgM produzido por um camundongo transgênico (veja Exemplo 2). Alternativamente, tal anticorpo huCD3 é desenvolvido, por exemplo, usando métodos de visualização de fase usando anticorpos contendo apenas sequências humanas. Tais abordagens são bem-conhecidas na técnica, por exemplo, no W092/01047 e Pat. U.S. N° 6.521.404, os quais são incorporados aqui por referência. Nessa abordagem, uma biblioteca combinatorial de fagos trazendo pares aleatórios de cadeias leve e pesada é selecionada usando uma fonte natural ou recombinante de CD3 ou fragmentos da mesma.

[00111] A presente invenção inclui métodos para produzir um anticorpo huCD3 através de um processo em que pelo menos uma etapa do processo inclui imunização de um animal transgênico não-humano com uma proteína de CD3 humana. Alguns dos loci de cadeia leve capa e/ou pesada endógenas desse animal não-humano xenogênico foram desabilitados e são incapazes da reestruturação requerida para gerar genes que codificam imunoglobulinas em resposta a um antígeno. Além disso, pelo menos um locus de cadeia pesada humana e pelo menos um locus de cadeia leve humana foram estavelmente transfectados no animal. Assim, em resposta a um antígeno administrado, os loci humanos se rearranjam para proporcionar genes que codificam regiões variáveis humanas imunoespecíficas para o antígeno. Quando de imunização, portanto, os xenocamundongos produzem células B que secretam imunoglobulinas totalmente humanas.

[00112] Uma variedade de métodos são bem-conhecidos na técnica para a produção de animais não-humanos xenogênicos. Por exemplo,

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54/81 veja Patentes U.S. N°s 6.075.181 e No. 6.150.584. Através de uma estratégia, os genes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina xenogenéicos (humano) são introduzidos na linhagem germinativa do hospedeiro (por exemplo, esperma ou oócitos) e, em etapas distintas, os genes do hospedeiro correspondentes são tornados não-funcionais através de inativação usando recombinação homóloga. Genes de cadeias leve e pesada de imunoglobulina humana são reconstruídos em um microorganismo eucariota ou procariota apropriado e os fragmentos de DNA resultantes são introduzidos no hospedeiro apropriado, por exemplo, os pró-núcleos de oócitos de camundongo fertilizados ou células-tronco embriônicas. Inativação dos loci de imunoglobulina do hospedeiro endógenos é obtida através de ruptura objetivada dos loci apropriados por meio de recombinação homóloga nas células hospedeiras, particularmente células-tronco embriônicas ou pró-núcleos de oócitos de camundongo fertilizados. A ruptura objetivada pode envolver introdução de uma lesão ou deleção no locus alvo ou deleção dentro do locus alvo acompanhado por inserção no locus, por exemplo, inserção de um marcador selecionável. No caso de células-tronco embriônicas, animais quiméricos são gerados, os quais são derivados, em parte, das células-tronco embriônicas modificadas e são capazes de transmitir as modificações genéticas através da linhagem germinativa. O cruzamento de hospedeiros com locis de imunoglobulina humana introduzidos com gêneros com loci endógenos inativados proporcionará animais cuja produção de anticorpo é puramente xenogenéica, por exemplo, seres humanos.

[00113] Em uma estratégia alternativa, pelo menos porções dos locis de cadeias pesada e leve de imunoglobulina humana são usados para substituir diretamente os locis de imunoglobulina endógena correspondentes através de recombinação homóloga em células-tronco embriogênicas. Isso resulta em inativação e substituição simultâneas

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55/81 da imunoglobulina endógena. Isso é seguido pela geração de animais quiméricos nos quais as células derivadas de célula-tronco embriônica podem contribuir com as linhagens germinativas.

[00114] Por exemplo, um clone de células B que expressa um anticorpo anti-CD3 humano é removido do animal não-humano xenogênico e imortalizado de acordo com vários métodos conhecidos na técnica. Tais células B podem ser derivadas diretamente do sangue do animal ou de tecidos linfáticos incluindo, mas não limitado a, baço, tonsilas, nódulos linfáticos e medula óssea. As células B imortalizadas resultantes podem ser expandidas e cultivadas in vitro para produzir grandes quantidades clinicamente aplicáveis de anticorpo huCD3. Alternativamente, genes que codificam as imunoglobulinas com uma ou mais regiões variáveis humanas podem ser recuperados e expressos em um tipo diferente de célula incluindo, mas não limitado a, um sistema de cultura de células de mamífero, de forma a obter os anticorpos diretamente ou cadeias individuais dos mesmos, compostas de moléculas de Fv com cadeia simples.

[00115] Além disso, o conjunto inteiro de anticorpos anti-CD3 totalmente humanos gerados pelo animal não-humano xenogênico pode ser selecionado para identificar um de tais clones com as características ótimas. Tais características incluem, por exemplo, afinidade de ligação à proteína CD3 humana, estabilidade da interação, bem como isotipo do anticorpo anti-CD3 totalmente humano. Clones do conjunto inteiro os quais têm as características desejadas são, então, usados como uma fonte de sequências de nucleotídeo que codificam as regiões variáveis desejadas, para manipulação adicional para gerar anticorpos com essas características em sistemas de células alternativos, usando técnicas recombinantes ou transgênicas convencionais.

[00116] Essa estratégia geral foi demonstrada com relação à geração dos primeiros gêneros de XenoMouse®, conforme publicado em

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1994. Veja Green et al Nature Genetics 7: 13-21 (1994). Essa aborda- gem é ainda discutida e delineada nos Pedidos de Patente U.S. N°s de Série 07/466.008, depositado em 12 de Janeiro de 1990, 07/610.515, depositado em 8 de Novembro de 1990, 07/919.297, depositado em 24 de Julho de 1992, 07/922.649, depositado em 30 de Julho de 1992, 08/031.801, depositado em 15 de Março de 1993, 08/112.848, depositado em 27 de Agosto de 1993, 08/234.145, depositado em 28 de Abril de 1994, 08/376.279, depositado em 20 de Janeiro de 1995,

08/430.938, depositado em 27 de Abril de 1995, 08/464.584, depositado em 5 de Junho de 1995, 08/464.582, depositado em 5 de Junho de

1995, 08/463.191, depositado em 5 de Junho de 1995, 08/462.837, depositado em 5 de Junho de 1995, 08/486.853, depositado em 5 de Junho de 1995, 08/486.857, depositado em 5 de Junho de 1995, 08/486.859, depositado em 5 de Junho de 1995, 08/462.513, depositado em 5 de Junho de 1995, 08/724.752, depositado em 2 de Outubro de 1996 e 08/759.620, depositado em 3 de Dezembro de 1996 e Patentes U.S. N°s 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 e

5.939.598 e Patentes Japonesas N°s. 3 068 180 B2,3 068 506 B2 e 3 068 507 B2. Veja também Mendez et al Nature Genetics 15: 146-156 (1997) e Green e Jakobovits J. Exp. Med.: 188: 483-495 (1998). Veja também Patente Européia No. EP 0 463 151 B1, concessão publicada em 12 de Junho de 1996, Pedido de Patente Internacional No. WO 94/02602, publicado em 3 de Fevereiro de 1994, Pedido de Patente Internacional No. WO 96/34096, publicado em 31 de Outubro de 1996, WO 98/24893, publicado em 11 de Junho de 1998, WO 00/76310, publicado em 21 de Dezembro de 2000.

[00117] Em uma abordagem alternativa, outros utilizaram uma abordagem com minilocus. Na abordagem como minilocus, um locus de Ig exógena é imitado através de inclusão de pedaços (genes individuais) no locus de Ig. Assim, um ou mais genes de VH, um ou mais

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57/81 genes de Dh, um ou mais genes de Jh, uma região mu constante e uma segunda região constante (de preferência uma região constante gama) são formados em uma estrutura para inserção em um mamífero. Essa abordagem é descrita na Patente U.S. N° 5.545.807 para Surani et al e Patentes U.S. N°s 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 e 6.255.458, cada uma para Lonberg e Kay, Patentes U.S. N°s 5.591.669 e 6.023.010 para Krimpenfort e Berns, Patentes U.S. N°s 5.612.205, 5.721.367 e 5.789.215 para Berns et al e Patente U.S. N° 5.643.763 para Choi e Dunn e Pedido de Patente U.S. da GenPharm International Nos. de Série 07/574.748, depositado em 29 de Agosto de 1990, 07/575.962, depositado em 31 de Agosto de 1990, 07/810.279, depositado em 17 de Dezembro de 1991, 07/853.408, depositado em 18 de Março de 1992, 07/904.068, depositado em 23 de Junho de 1992, 07/990.860, depositado em 16 de Dezembro de 1992, 08/053.131, depositado em 26 de Abril de 1993, 08/096.762, depositado em 22 de Julho de 1993, 08/155.301, depositado em 18 de Novembro de 1993, 08/1161.739, depositado em 3 de Dezembro de 1993, 08/165.699, depositado em 10 de Dezembro de 1993, 08/209.741, depositado em 9 de Março de 1994. Veja também Patente Européia No. 0 546 073 B1, Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 e WO 98/24884 e Patente U.S. N° 5.981.175. Veja ainda Taylor et al, 1992, Chen et al, 1993, Tuaillon et al, 1993, Choi et al, 1993, Lonberg et al, (1994), Taylor et al, (1994) e Tuaillon et al, (1995), Fishwild et al, (1996).

[00118] Uma vantagem da abordagem com minilocus é a rapidez com a qual estruturas incluindo porções do locus de Ig podem ser geradas e introduzidas em animais. Comensuravelmente, contudo, uma

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58/81 desvantagem significativa da abordagem com minilocus é que, em teoria, diversidade insuficiente é introduzida através da inclusão de pequenos números de genes V, D e J. Na verdade, o trabalho publicado parece sustentar essa preocupação. O desenvolvimento de células B e produção de anticorpo de animais produzidos através de uso da abordagem com minilocus parece impedida. Portanto, pesquisa que fundamenta a presente invenção tem sido consistentemente dirigida à introdução de grandes porções do locus de Ig de forma a obter maior diversidade e em um esforço de reconstituir o repertório imune dos animais.

[00119] Kirin também demonstrou a geração de anticorpos humanos a partir de camundongos nos quais, através de fusão de microcélulas, grandes pedaços de cromossomas ou cromossomas inteiros foram introduzidos. Veja Pedidos de Patente Européia Nos. 773 288 e 843 961.

[00120] Respostas de anticorpo anticamundongo humano (HAMA) têm levado a indústria a preparar anticorpos quiméricos ou, de outro modo, humanizados. Embora anticorpos quiméricos tenham uma região constante humana e uma região variável imune, espera-se que determinadas respostas de anticorpo antiquimérico (HACA) sejam observadas, particularmente em utilizações crônicas ou de multidoses do anticorpo. Assim, seria desejável proporcionar anticorpos totalmente humanos contra a CD3 de forma a eliminar as preocupações e/ou efeitos da resposta HAMA ou HACA.

[00121] A produção de anticorpos com imunogenicidade reduzida é também obtida via técnicas de humanização e visualização usando bibliotecas apropriadas. Será apreciado que anticorpos de murino ou anticorpos de outras espécies podem ser humanizados ou primatizados usando métodos bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Winter e Harris Immunol Today 14: 43 46 (1993) e Wright et al, Crit.

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Reviews em Immunol. 12125-168 (1992). O anticorpo de interesse pode ser manipulado através de técnicas de DNA recombinante para substituir os domínios de CH1, CH2, CH3, de dobradiça e/ou o domínio estrutura pela sequência humana correspondente (Veja WO 92102190 e Patentes U.S. N°s 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761,

5.693.792, 5.714.350 e 5.777.085). Também, o uso de cDNA de Ig para a construção de genes de imunoglobulina quiméricos é conhecido na técnica (Liu et al P.N.A.S. 84: 3439 (1987) e J. Immunol. 139: 3521 (1987)). mRNA é isolado de um hibridoma ou outra célula que produz o anticorpo e usado para produzir cDNA. O cDNA de interesse pode ser amplificado através da reação em cadeia de polimerase usando iniciadores específicos (Patentes U.S. N°s 4.683.195 e 4.683.202). Alternativamente, uma biblioteca é feita e selecionada para isolar a sequência de interesse. A sequência de DNA que codifica a região variável do anticorpo é, então, fundida à sequências da região constante humana. As sequências dos genes da região constante humana podem ser encontradas em Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H., publicação no. 91-3242. Genes da região C humana estão prontamente disponíveis de clones conhecidos. A escolha do isotipo será orientada pelas funções ativadoras desejadas, tal como fixação de complemento ou atividade em citotoxicidade celular anticorpo-dependente. Isotipos preferidos são IgG1, IgG3 e IgG4. As regiões constantes de cadeia leve humana, capa ou lambda, podem ser usadas. O anticorpo humanizado quimérico é, então, expresso através de métodos convencionais.

[00122] Fragmentos de anticorpo, tais como Fv, F(ab')2 e Fab, podem ser preparados através de clivagem da proteína intacta, por exemplo, através de clivagem química ou com protease. Alternativamente, um gene truncado é projetado. Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção do fragmento F(ab')2 incluiria sequências

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60/81 de DNA que codificam o domínio CH1 e a região de dobradiça da cadeia H, seguido por um códon de término de tradução para proporcionar a molécula truncada.

[00123] Sequências de consenso de regiões H e L J podem ser usadas para projetar oligonucleotídeos para uso como iniciadores para introduzir sítios de restrição úteis na região J para subsequente ligação dos segmentos da região V em segmentos da região C humana. cDNA da região C pode ser modificado através de mutagênese sítio dirigida para substituir um sítio de restrição na posição análoga na sequência humana.

[00124] Vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, YACs, epissomas derivados de EBV e semelhantes. Um vetor conveniente é um que codifica uma sequência de imunoglobulina de CH ou CL humana funcionalmente completa, com sítios de restrição apropriados manipulados de modo que qualquer sequência de VH ou VL-31 possa ser facilmente inserida e expressa. Em tais vetores, união usualmente ocorre entre o sítio doador de união na região J inserida e o sítio aceitador de união que precede a região C humana e também nas regiões de união que ocorrem dentro dos éxons de CH humana. Poliadenilação e término de transcrição ocorrem nos sítios cromossômicos nativos a jusante das regiões de codificação. O anticorpo quimérico resultante pode ser unido a qualquer promotor forte, incluindo LTRs virais, por exemplo, promotor precoce de SV-40 (Okayama et al Mol. Cell. Bio. 3: 280 (1983)), LTR do vírus do sarcoma de Rous (Gorman et al P.N.A.S. 79: 6777 (1982)) e LTR do vírus da leucemia de Moloney em murinos (Grosschedl et al Cell 41: 885 (1985)). Também, conforme será apreciado, promotores de Ig nativos e semelhantes podem ser usados.

[00125] Ainda, anticorpos humanos ou anticorpos de outras espécies podem ser gerados através de tecnologias do tipo visualização

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61/81 incluindo, sem limitação, visualização de fago, visualização retroviral, visualização ribossômica e outros métodos, usando tecnologias bemconhecidas na técnica e as moléculas resultantes podem ser submetidas à maturação adicional, tal como maturação por afinidade, conforme tais tecnologias são conhecidas na técnica. Wright e Harris, supra., Hanes e Plucthau PEAS USA 94: 4937-4942 (1997) (visualização ribossômica), Parmley e Smith Gene 73: 305-318 (1988) (visualização de fago), Scott TIBS 17: 241-245 (1992), Cwirla et al PNAS USA 87: 6378-6382 (1990), Russel et al Nucl. Acids Research 21: 1081-1085 (1993), Hoganboom et al Immunol. Reviews 130: 43-68 (1992),

Chiswell e McCafferty TIBTECH; 10: 80-8A (1992) e Patente U.S. N° 5.733.743. Se tecnologias de visualização forem utilizadas para produzir anticorpos que não são humanos, tais anticorpos podem ser humanizados conforme descrito acima.

[00126] Usando essas técnicas, anticorpos podem ser gerados a células que expressam CD3, à CD3 em si, formas de epitopos de CD3 ou peptídeos dos mesmos e bibliotecas de expressão dos mesmos (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.703.057) os quais podem, após o que, ser selecionados conforme descrito acima com relação às atividades descritas acima.

Design e Geração de Outros Produtos Terapêuticos [00127] De acordo com a presente invenção e baseado na atividade dos anticorpos que são produzidos e caracterizados aqui com relação à CD3, o design de outras modalidades terapêuticas além de porções de anticorpo é facilitado. Tais modalidades incluem, sem limitação, produtos terapêuticos de anticorpo avançados, tais como anticorpos biespecificos, imunotoxinas e produtos terapêuticos radiorrotulados, geração de produtos terapêuticos peptídicos, terapias genéticas, particularmente intracorpos, produtos terapêuticos anti-sentido e pequenas moléculas.

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62/81 [00128] Por exemplo, com relação a anticorpos biespecíficos, anticorpos biespecíficos podem ser gerados os quais compreendem (i) dois anticorpos, um com uma especificidade pela CD3 e outro por uma segunda molécula que são conjugadas juntas, (ii) um único anticorpo que tem uma cadeia específica à CD3 e uma segunda cadeia específica a uma segunda molécula ou (iii) um anticorpo com cadeia simples que tem especificidade pela CD3 e a outra molécula. Tais anticorpos biespecíficos podem ser gerados usando métodos que são bemconhecidos, por exemplo, com relação à (i) e (ii). Veja, por exemplo, Fanger et al Immunol Methods 4: 72-81 (1994) e Wright e Harris, supra e, com relação à (iii) veja, por exemplo, Traunecker et al Int. J. Cancer (Supl. ) 7: 51-52 (1992). Em cada caso, a segunda especificidade pode ser feita a receptores de ativação de cadeia pesada incluindo, sem limitação, CD16 ou CD64 (veja, por exemplo, Deo et al 18: 127 (1997)) ou CD89 (veja, por exemplo, Valerius et al Blood 90: 4485-4492 (1997)). Anticorpos biespecíficos preparados de acordo com o precedente provavelmente matarão células expressando CD3 e particularmente aquelas células nas quais os anticorpos à CD3 da invenção são eficazes.

[00129] Com relação à imunotoxinas, anticorpos podem ser modificados para atuar como imunotoxinas utilizando métodos que são bemconhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Vitetta Immunol Today 14: 252 (1993). Veja também Patente U.S. N° 5.194.594. Com relação ao preparo de anticorpos radiorotulados, tais anticorpos modificados também podem ser prontamente preparados utilizando métodos que são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Junghans et al em Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2^a edição, Chafner e Longo eds., Lippincott Raven (1996)). Veja também Patentes U.S. N°s 4.681.581, 4.735.210, 5.101.827, 5.102.990 (RE 35.500), 5.648.471 e 5.697.902. Cada uma das imunotoxinas e moléculas radiorrotuladas

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63/81 provavelmente matará células expressando CD3 e particularmente aquelas células nas quais os anticorpos da invenção são eficazes. [00130] Com relação à geração de peptídeos terapêuticos, embora a utilização de informação estrutural relacionada à CD3 e anticorpos à mesma, tais como os anticorpos da invenção ou seleção de bibliotecas de peptídeo, peptídeos terapêuticos podem ser gerados os quais são dirigidos contra a CD3. O design e seleção de produtos terapêuticos peptídicos é discutido em Houghten et al Biotechniques 13: 412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82: 5131-5135 (1985), Pinalla et al Biotechniques 13: 901-905 (1992), Blake e Litzi-Davis BioConjugate

Chem. 3: 510-513 (1992). Imunotoxinas e moléculas radiorotuladas também podem ser preparadas e de maneira similar com relação a porções peptídicas conforme discutido acima com relação aos anticorpos. Admitindo que a molécula de CD3 (ou uma forma, tal como uma variante com união ou forma alternativa) é funcionalmente ativa em um processo doentio, também seria possível projetar produtos terapêuticos genéticos e anti-sentido através de técnicas convencionais. Tais modalidades podem ser utilizadas para modulação da função de CD3. Com relação aos anticorpos da presente invenção, esses facilitam o design e uso de ensaios funcionais relacionados aos mesmos. Um design e estratégia para produtos terapêuticos anti-sentido são discutidos em detalhes no Pedido de Patente Internacional No. WO 94/29444. Design e estratégias para terapia genética são bem-conhecidos. Contudo, em particular, o uso de técnicas de produtos terapêuticos genéticos envolvendo intracorpos provaria ser particularmente vantajosa. Veja, por exemplo, Chen et al Human Gene Therapy 5: 595-601 (1994) e Marasco Gene Therapy 4: 11-15 (1997). Design geral e considerações relacionadas a produtos terapêuticos genéticos também são discutidos no Pedido de Patente Internacional No. WO 97/38137.

[00131] O conhecimento proveniente da estrutura da molécula de

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CD3 e suas interações com outras moléculas de acordo com a presente invenção, tais como os anticorpos da invenção e outros, pode ser utilizado no design racional de modalidades terapêuticas adicionais. A esse respeito, técnicas de design racional de droga, tais como cristalografia de raios X, modelamento molecular auxiliado (ou assistido) por computador (CAMM), relação de atividade-estrutura quantitativa ou qualitativa (QSAR) e tecnologias similares podem ser utilizadas para focalizar esforços de descoberta de drogas. Design racional permite a previsão de estruturas sintéticas ou de proteína as quais podem interagir com a molécula ou formas específicas das mesmas as quais podem ser usadas para modificar ou modular a atividade de CD3. Tais estruturas podem ser sintetizadas quimicamente ou expressas em sistemas biológicos. Essa abordagem foi revista em Capsey et al Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Ainda, bibliotecas combinatoriais podem ser projetadas e sintetizadas e usadas em programas de seleção, tais como esforços de seleção de elevado rendimento.

Administração Terapêutica e Formulações [00132] Será apreciado que a administração de entidades terapêuticas de acordo com a invenção será administrada com veículos, excipientes e outros agentes adequados que são incorporados em formulações para proporcionar transferência, distribuição, tolerância aperfeiçoadas e semelhantes. Uma multiplicidade de formulações apropriadas pode ser encontrada em formulários conhecidos por todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15^a ed, Mack Publishing Company Easton, PA (1975)), particularmente Capítulo 87, pela Blaug, Seymour, no mesmo. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geléias, ceras, óleos, lipídios, vesículas contendo lipídios (catiônicas ou aniônicas) (tal como Lipofectin®), conjugados de DNA, pastas de absorção anidra, emulsões óleo

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65/81 em-água ou água-em-óleo, emulsões de carbowax (polietilenos glicóis de vários pesos moleculares), géis semi-sólidos e misturas semisólidas contendo carbowax. Qualquer uma das misturas precedentes pode ser apropriada em tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção, contanto que o ingrediente ativo na formulação não seja inativado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a via de administração. Veja também Baldrick P. Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance, Regul. Toxicol Pharmacol. 32 (2): 210-8 Wang W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN Lipids, lipophilic drugs and oral drug delivery-some emerging concepts, J Pharm Sci. 89 (8): 967-78 Powell et al Compendium of excipients for parenteral formulations, PDA J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 (1998) e citações nos mesmos para informação adicional relacionada a excipientes e veículos para formulações bem-conhecidos por químicos farmacêuticos.

[00133] Formulações farmacêuticas da invenção, as quais incluem um anticorpo huCD3 da invenção, são usadas para tratar ou aliviar um sintoma associado a um distúrbio imune-relacionado, tal como, por exemplo, uma doença auto-imune ou um distúrbio inflamatório.

[00134] Doenças auto-imunes incluem, por exemplo, Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS, a qual é uma doença viral com um componente auto-imune), alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome anti-fosfolipídio, doença de Addison auto-imune, anemia hemolítica auto-imune, hepatite auto-imune, doença do ouvido interno auto-imune (AIED), síndrome linfoproliferativa auto-imune (ALPS), púrpura trombocitopênica auto-imune (ATP), doença de Behcet, cardiomiopatia, dermatite hepetiforme, síndrome de disfunção imune por fadiga crônica (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIPD), penfigóide cicatricial, doença de aglutinina pelo frio,

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66/81 síndrome de Crest, doença de Crohn, doença de Dego, dermatomiosite juvenil, lupus discóide com crioglubulinemia essencial mista, fibromialgia-fibromiosite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, tiroidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, trombocitopenia púrpura idiopática (ITP), nefropatia por IgA, diabetes mellitus insulinadependente, artrite crônica juvenil (doença de Still), artrite reumatóide juvenil, doença de Meniere, doença mista do tecido conectivo, esclerose múltipla, miastenia gravis, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, febre reumática, artrite reumatóide, sarcoidose, escleroderma (esclerose sistêmica progressiva (PSS), também conhecida como esclerose sistêmica (SS)), síndrome de Sjogren, síndrome de Stiffman, lupus eritematoso sistêmico, arterite de Takayasu, arterite temporal/arterite de células gigantes, colite ulcerativa, uveíte, vitiligo e granulomatose de Wegener.

[00135] Distúrbios inflamatórios incluem, por exemplo, distúrbios inflamatórios crônicos e agudos. Exemplos de distúrbios inflamatórios incluem mal de Alzheimer, asma, alergia tópica, alergia, aterosclerose, asma brônquica, eczema, glomerulonefrite, doença enxerto vs. hospedeiro, anemias hemolíticas, osteoartrite, sepsia, derrame, transplante de tecido e órgãos, vasculite, retinopatia diabética e lesão pulmonar induzida por ventilador.

[00136] Em uma modalidade, as composições de anticorpo huCD3 da invenção são administradas em conjunto com um segundo agente, tal como, por exemplo, GLP-1 ou um composto de interrupção de células beta (isto é, um composto que reduz ou, de outro modo, inibe a liberação de insulina, tais como agentes que abrem o canal de potássio). Exemplos de compostos de GLP-1 adequados são descritos, por

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67/81 exemplo, no pedido publicado U.S. 20040037826 e exemplos de compostos que interrompem células beta adequados são descritos no pedido publicado U.S. 20030235583, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[00137] Em uma outra modalidade, as composições de anticorpo huCD3 usadas para tratar um distúrbio imune-relacionado são administradas em combinação com qualquer um de uma variedade de compostos antiinflamatórios e/ou imunossupressores adequados. Compostos conhecidos adequados incluem, mas não estão limitados a, metotrexato, ciclosporina A (incluindo, por exemplo, microemulsão de ciclosporina), tacrolimus, corticosteróides, estatinas, interferon beta, Remicade (Infliximab), Enbrel (Etanercept) e Humira (Adalimumab).

[00138] Por exemplo, no tratamento de artrite reumatóide, as composições de anticorpo huCD3 da invenção podem ser coadministradas com corticosteróides, metotrexato, ciclosporina A, estatinas, Remicade (Infliximab), Enbrel (Etanercept) e/ou Humira (Adalimumab).

[00139] No tratamento de uveíte, as composições de anticorpo huCD3 podem ser administradas em conjunto, por exemplo, com corticosteróides, metotrexato, ciclosporina A, ciclofosfamida e/ou estatinas. Da mesma forma, pacientes que sofrem de uma doença, tal como doença de Crohn ou psoríase, podem ser tratados com uma combinação de uma composição de anticorpo huCD3 da invenção e Remicaid (Infliximab) e/ou Humira (Adalimumab).

[00140] Pacientes com esclerose múltipla podem receber uma combinação de uma composição de anticorpo huCD3 da invenção em combinação, por exemplo, com acetato de glatirâmero (Copaxone), interferon beta-1 a (Avonex), interferon beta-1a (Rebif), interferon beta1b (Betaseron ou Betaferon), mitoxantrona (Novantrone), dexametasona (Decadron), metilprednisolona (Depo-Medrol) e/ou prednisona

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68/81 (Deltasone) e/ou estatinas.

[00141] A presente invenção também proporciona métodos de tratamento ou alívio de um sintoma associado a um distúrbio imunerelacionado ou um sintoma associado à rejeição após transplante de órgãos. Por exemplo, as composições da invenção são usadas para tratar ou aliviar um sintoma de qualquer uma das doenças auto-imunes e distúrbios inflamatórios descritos aqui.

[00142] As composições terapêuticas da invenção são também usadas como agentes de imunossupressão em transplante de órgãos ou tecido. Conforme usado aqui, agente de imunossupressão se refere a um agente cuja ação sobre o sistema imune leva a uma redução imediata ou retardada da atividade de pelo menos uma via envolvida em uma resposta imune, quer essa resposta ocorra naturalmente ou seja artificialmente disparada, quer essa resposta ocorra como parte do sistema imune inato, do sistema imune adaptativo ou ambos. Essas composições de anticorpo huCD3 imunosspressoras são administradas a um indivíduo antes de, durante e/ou após transplante de órgão ou tecido. Por exemplo, um anticorpo huCD3 da invenção é usado para tratar ou impedir rejeição após transplante de órgão ou tecido.

[00143] Em uma modalidade, as composições de anticorpo huCD3 imunosspressoras da invenção são administradas em conjunto com um segundo agente, tal como, por exemplo, GLP-1 ou um composto de interrupção de células beta, conforme descrito acima.

[00144] Em outra modalidade, essas composições de anticorpo huCD3 imunosspressoras são administradas em combinação com qualquer um de uma variedade de compostos antiinflamatórios e/ou imunossupressores conhecidos. Compostos antiinflamatórios e/ou imunossupressores adequados para uso com os anticorpo huCD3 da invenção incluem, mas não estão limitados a, metotrexato, ciclosporina A (incluindo, por exemplo, microemulsão de ciclosporina), tacrolimus,

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69/81 corticosteróides e estatinas.

[00145] Em ainda outra modalidade da invenção, um anticorpo huCD3 é administrado a um ser humano quando de detecção da presença de anticorpos auto-reativos dentro do ser humano. Tais anticorpos auto-reativos são conhecidos na técnica como anticorpos com afinidade de ligação por uma ou mais proteínas expressas endogenamente dentro do ser humano. Em um aspecto da invenção, o ser humano é testado com relação à presença de anticorpos auto-reativos especificamente envolvidos em uma ou mais doenças auto-imunes, conforme bem-conhecida na técnica. Em uma modalidade específica, um paciente humano é testado com relação à presença de anticorpos contra insulina, descarboxilase de ácido glutâmico e/ou a proteína IA-2 e subsequentemente administrado com um anticorpo huCD3 quando de detecção positiva de um ou mais de tais anticorpos auto-reativos.

[00146] Em outra modalidade, um anticorpo huCD3 é administrado a seres humanos para impedir, reduzir ou diminuir o recrutamento de células imunes aos tecidos humanos. Um anticorpo huCD3 da invenção é administrado a um indivíduo que precisa do mesmo para impedir e tratar condições associadas ao recrutamento anormal ou desregulado de células imunes aos locais de tecidos de doenças humanas.

[00147] Em outra modalidade da invenção, um anticorpo huCD3 é administrado a um ser humano para impedir, reduzir ou diminuir o extravasamento e diapedese de células imunes aos tecidos humanos. Assim, os anticorpos huCD3 da invenção são administrados para impedir e/ou tratar condições associadas à infiltração anormal ou desregulada de células imunes aos locais de tecidos de doença humana.

[00148] Em outra modalidade da invenção, um anticorpo huCD3 é administrado a seres humanos para impedir, reduzir ou diminuir os efeitos mediados pela liberação de citocinas dentro do corpo humano. O termo citocina se refere a todas as citocinas humanas conhecidas

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70/81 na técnica que ligam receptores extracelulares sobre a superfície celular e, desse modo, modulam a função celular incluindo, mas não limitado a, IL-2, IFN-g, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13.

[00149] A liberação de citocinas pode levar a uma condição tóxica conhecida como a síndrome de liberação de citocina (CRS), uma complicação clínica comum que ocorre, por exemplo, com o uso de um anticorpo anti-células T, tal como ATG (globulina antitimócito) e OKT3 (um anticorpo anti-CD3 humana de murino). Essa síndrome é caracterizada pela liberação excessiva de citocinas, tais como TNF, IFN-gama e IL-2 na circulação. A CRS ocorre como um resultado da ligação simultânea dos anticorpos à CD3 (via a região variável do anticorpo) e os receptores de Fc e/ou receptor de complemento (via a região constante do anticorpo) a outras células, desse modo, ativando as células T para liberar citocinas que produzem uma resposta inflamatória sistêmica caracterizada por hipotensão, pirexia e rigores. Sintomas de CRS incluem febre, calafrios, náusea, vômito, hipotensão e dispnéia. Assim, um anticorpo huCD3 da invenção contém uma ou mais mutações projetadas para impedir a liberação e produção anormal de uma ou mais citocina (s) in vivo.

[00150] Em outra modalidade da invenção, um anticorpo huCD3 é administrado a um ser humano para impedir, reduzir ou diminuir os efeitos mediados pela liberação de receptores de citocina dentro do corpo humano. O termo receptor de citocina se refere a todos os receptores de citocina humana dentro da técnica que se ligam a uma ou mais citocinas, definidas aqui, incluindo, mas não limitado a, receptores das citocinas antes mencionadas. Assim, um anticorpo huCD3 da invenção é administrado para tratar e/ou impedir condições mediadas pela ativação, ligação ou ligação anormal de um ou mais receptores de citocina dentro do corpo humano. Considera-se ainda que a administração do anticorpo huCD3 in vivo eliminará a sinalização intracelular

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71/81 mediada pelos receptores de citocina dentro de tal ser humano. [00151] Em um aspecto da invenção, um anticorpo huCD3 é administrado a um ser humano quando de diminuição da função de células beta pancreáticas no mesmo. Em uma modalidade, o indivíduo é testado com relação à função de células beta, secreção de insulina ou níveis de c-peptídeo, conforme é conhecido na técnica. Subsequentemente, quando de percepção de diminuição suficiente do indicador, o ser humano é administrado com um regime de dosagem suficiente de um anticorpo huCD3 para impedir progressão adicional de destruição auto-imune de função de células beta no mesmo.

Formulações Diagnosticas e Profiláticas [00152] Os MAbs anti-CD3 totalmente humanos da invenção são usados em formulações diagnósticas e profiláticas. Em uma modalidade, um MAb anti-CD3 da invenção é administrado a pacientes que estão em risco de uma ou mais das doenças auto-imunes antes mencionadas. Uma predisposição do paciente a uma ou mais das doenças auto-imunes antes mencionadas pode ser determinada usando marcadores genotípicos, sorológicos ou bioquímicos. Por exemplo, a presença de subtipos de HLA em particular e auto-anticorpos sorológicos (contra insulina, GAD65 e IA-2) são indicativos de diabetes do Tipo I.

[00153] Em outra modalidade da invenção, um anticorpo huCD3 é administrado a seres humanos diagnosticados com uma ou mais das doenças auto-imunes antes mencionadas. Quando de diagnóstico, um anticorpo huCD3 é administrado para aliviar ou inverter os efeitos de auto-imunidade. Em um de tais exemplos, um ser humano diagnosticado com diabetes do Tipo I é administrado com uma dose suficiente de um anticorpo huCD3 para restaurar a função pancreática e minimizar dano por infiltração auto-imune no pâncreas. Em outra modalidade, um ser humano diagnosticado com artrite reumatóide é administrado com um anticorpo huCD3 para reduzir a infiltração de células imunes

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72/81 em e a destruição de articulações dos membros.

[00154] Anticorpos da invenção são também úteis na detecção de CD3 em amostras de pacientes e, consequentemente, são úteis como diagnósticos. Por exemplo, os anticorpos huCD3 da invenção são usados em ensaios in vitro, por exemplo, ELISA, para detectar os níveis de CD3 em uma amostra do paciente.

[00155] Em uma modalidade, um anticorpo huCD3 da invenção é imobilizado sobre um suporte sólido (por exemplo, nas cavidades de uma placa de microtitulação). O anticorpo imobilizado serve como um anticorpo de captura para qualquer CD3 que possa estar presente em uma amostra de teste. Antes de contato do anticorpo imobilizado com uma amostra do paciente, o suporte sólido é enxaguado e tratado com um agente de bloqueio, tal como proteína de mink ou albumina, para impedir adsorção não-específica do analito.

[00156] Subsequentemente, as cavidades foram tratadas com uma amostra de teste suspeita de conter o antígeno ou com uma solução contendo uma quantidade padrão do antígeno. Tal amostra pode ser, por exemplo, uma amostra de soro de um indivíduo suspeito de ter níveis de antígeno em circulação considerados como sendo diagnósticos de uma patologia. Após enxágue da amostra de teste ou padrão, o suporte sólido é tratado com um segundo anticorpo que é detectavelmente rotulado. O segundo anticorpo rotulado serve como um anticorpo de detecção. O nível de rótulo detectável é medido e a concentração de antígeno CD3 na amostra de teste é determinada através de comparação com uma curva padrão desenvolvida a partir das amostras-padrão.

[00157] Será apreciado que, baseado nos resultados obtidos usando os anticorpos huCD3 da invenção em um ensaio diagnóstico in vitro, é possível classificar uma doença (por exemplo, um distúrbio autoimune ou inflamatório) em um indivíduo baseado nos níveis de expres

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73/81 são do antígeno CD3. Para uma determinada doença, amostras de sangue são tomadas de indivíduos diagnosticados como estando em vários estágios na progressão da doença e/ou em vários pontos no tratamento terapêutico da doença. Usando uma população de amostras que proporciona resultados estatisticamente significativos para cada estágio de progressão ou terapia, uma faixa de concentrações do antígeno que pode ser considerada característica de cada estágio é projetada.

[00158] Todas as publicações e documentos de patente citados aqui são incorporados aqui por referência como se cada uma de tais publicações ou documentos fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado aqui por referência. Citação de publicações e documentos de patente não se destina a ser uma admissão de que qualquer um é a técnica anterior pertinente, nem constitui qualquer admissão quanto aos conteúdos ou data dos mesmos. A invenção tendo sido agora descrita por meio da descrição por escrito, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção pode ser praticada em uma variedade de modalidades e que a descrição precedente e os Exemplos abaixo são para fins de ilustração e não limitação das reivindicações que seguem.

EXEMPLOS [00159] Os Exemplos a seguir, incluindo os experimentos conduzidos e resultados obtidos, são proporcionados para fins ilustrativos apenas e não devem ser construídos como limitando a presente invenção.

EXEMPLO 1: Geração de anticorpos huCD3 [00160] Estratégias de imunização: Para gerar um anticorpo huCD3 totalmente humano, duas linhagens de camundongos transgênicos foram utilizadas, os camundongos HuMAb® e os camundongos KM® (Medarex, Princeton NJ). Estratégias iniciais de imunização se

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74/81 guiram protocolos bem-documentados da literatura para a geração de anticorpos de camundongo. (Veja por exemplo, Kung P et al, Science; 206 (4416): 347-9 (1979); Kung PC et al, Transplant Proc. (3 Supl. 1): 141-6 (1980); Kung PC et al, Int J Immunopharmacol. 3 (3): 175-81 (1981). Os protocolos-padrão conhecidos na técnica falharam em produzir anticorpos anti-CD3 totalmente humanos nos camundongos HuMAb® ou camundongos KM®. Por exemplo, as seguintes estratégias de imunização não obtiveram sucesso e não produziram anticorpos funcionais nos camundongos HuMAb® ou KM®:

- imunização com timócitos apenas ou células T apenas

- imunização com material de CD3 humana recombinante apenas

- imunização com material de CD3 recombinante em adjuvante de Freund

- imunização com células em adjuvante de Freund

- imunização com timócitos ou células T co-administrados com CD3 solúvel

- imunização com timócitos ou células T co-administrados com células expressando CD3 recombinante [00161] Quando essas estratégias de imunização da técnica anterior são usadas em camundongos BALB/c ao invés de um camundongo HuMAb® ou KM®, essas estratégias produzem um anticorpo anti-CD3 de murino ao invés de um anticorpo anti-CD3 humana.

[00162] Consequentemente, novas estratégias de imunização foram desenvolvidas variando os seguintes parâmetros:

- tipos de imunógenos empregados

- frequência de injeção

- tipos de adjuvantes empregados

- tipos de técnicas de co-estimulação empregadas

- vias de imunização empregadas

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- tipos de tecido linfóide secundário usado para fusão [00163] Uma série de novas estratégias de imunização foram desenvolvidas incluindo, por exemplo, (i) imunização com uma partícula viral expressando CD3 apenas e (ii) imunização com sinais coestimulatórios (por exemplo, CD40, CD27 ou combinações dos mesmos) co-administrados com células T, timócitos ou com células que tenham sido transfectadas para expressar CD3 recombinante.

[00164] Em uma primeira estratégia de imunização, referida aqui como o protocolo de hiper-reforço, um camundongo HuMAb® (Medarex, Inc., Princeton, NJ) ou um camundongo KM® (Medarex, Inc., Kirin) foi imunizado primeiro através de injeção de células humanas, por exemplo, timócitos ou células T. Em pontos de tempo oscilando de 1 a 8 semanas após injeção dos timócitos e/ou células T, os camundongos receberam uma ou mais subsequentes injeções de hiper-reforço. A injeção de hiper-reforço incluía, por exemplo, proteína de CD3 solúvel (por exemplo, proteína de CD3 solúvel recombinante), injeções adicionais de timócitos ou células T, células CD3-transfectadas, partículas virais expressando altos níveis de CD3 e combinações dos mesmos. Por exemplo, a injeção de hiper-reforço continha uma combinação de proteína CD3 solúvel e células CD3-transfectadas.

[00165] De preferência, nos protocolos de imunização de hiperreforço, os camundongos imunizados receberam duas injeções finais de hiper-reforço a 6 e 3 dias antes de fusão dos nódulos linfáticos e/ou baço. Por exemplo, nos camundongos KM®, o tecido fundido é derivado do baço e nos camundongos HuMAb®, o tecido fundido é derivado de nódulos linfáticos e/ou tecido esplênico.

[00166] Em um exemplo do protocolo de hiper-reforço, um camundongo HuMAb® foi imunizado três vezes com timócitos humanos (~10⁶ células) nos dias 0, 7 e 28. A linhagem de células ovarianas de hâmster Chinês (CHO) transfectada com o cDNA que codifica as ca

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76/81 deias δ e ε da CD3 humana (CHO/CD3, ~10⁶ células) foi, então, injetada nos dias 47 e 65. Outro reforço com uma partícula viral expressando altos níveis de CD3δε em sua superfície foi fornecido no dia 79. Finalmente, o camundongo foi injetado com CD3δε humana recombinante solúvel nos dias 121 e 124 antes de fusão dos nódulos linfáticos no dia 127.

[00167] Todas as imunizações foram fornecidas subcutaneamente com Ribi (Corixa Corp., Seattle WA) como um adjuvante. Um total de

8,5 x 10⁶ células foi fundido. Apenas sete de 470 hibridomas selecionados produziram um anticorpo anti-CD3 totalmente humano e todos os anticorpos anti-CD3 totalmente humanos eram moléculas de IgM. Dois desses anticorpos anti-CD3 foram selecionados como candidatos clínicos terapêuticos (Figuras 1-3).

[00168] Em um segundo exemplo do protocolo de imunização, um camundongo KM® foi imunizado duas vezes com CD3δε humana recombinante nos dias 0 e 25. Timócitos humanos (~10⁶ células) foram, então, usados para reforço nos dias 40, 49 e 56. A CD3 δε recombinante humana foi injetada duas vezes nos dias 70, 77, 84 e 91. A linhagem de células T de camundongo transfectada com o cDNA que codifica as cadeias δ e ε da CD3 humana (EL4/CD3, ~10⁶ células) foi, então, injetada no dia 98. Finalmente, o camundongo foi injetado com CD3δε humana recombinante solúvel no dia 101 antes de fusão do baço no dia 104. As imunizações foram administradas intraperitonealmente com Alume como um adjuvante, exceto no dia 70, onde adjuvante Ribi foi usado. CpG foi usado como um agente co-estimulatório nos dias 0, 25, 84 e 91. Um total de 1,27 x 10⁸ células foi fundido. Apenas cinco de 743 hibridomas selecionados produziram um anticorpo anti-CD3 totalmente humano e todos os anticorpos produzidos eram moléculas de IgG. Um dos anticorpos anti-CD3 totalmente humano foi selecionado como um candidato clínico terapêutico (Figura

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4).

[00169] Critérios de Seleção: Os candidatos clínicos terapêuticos foram selecionados usando os seguintes critérios. Primeiro, a ligação de anticorpo a células CD3-positivas versus células CD3-negativas foi analisada. Para isso, células Jurkat CD3-positivas (J+) e células Jurkat CD3-negativas foram incubadas com os diferentes anticorpos e a ligação foi avaliada através de citometria de fluxo (Figura 9A). Segundo, um ensaio de competição no qual a capacidade do anticorpo candidato de inibir a ligação do anticorpo monoclonal anti-humano OKT3 de murino a células CD3-positivas foi avaliada usando células J+ e a competição foi analisada através de citrometria de fluxo (Figura 9B). Em seguida, a modulação antigênica de CD3 e do TCR da superfície de células T de sangue periférico humano foi analisada através de citrometria de fluxo (Figura 9C). Finalmente, o ensaio de proliferação de células T foi realizado usando células T de sangue periférico humano coradas com CFSE e a divisão celular foi analisada através de citometria de fluxo (Figura 9D).

EXEMPLO 2: Troca de Isotipo de anticorpos Anti-CD3 Humanos [00170] Alguns anticorpos huCD3 produzidos usando os novos protocolos descritos no Exemplo 1 eram anticorpos de IgM. Esses anticorpos de IgM foram convertidos em um anticorpo de IgG, de preferência em um anticorpo de IgG1. Por exemplo, os anticorpos de IgM foram convertidos através de um procedimento de clonagem no qual a região VDJ do gene que codifica o anticorpo de IgM foi clonada em um gene da cadeia pesada de IgG obtido de um vetor que contém um gene que codifica o alótipo F gama1. Para conversão da cadeia leve, a sequência de IgM foi clonada em um vetor contendo a região capa. Em camundongos da Medarex, por exemplo, o camundongo HuMAb®, múltiplas cadeias leves são produzidas, em virtude da falta de exclusão alélica.

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78/81 [00171] Cada combinação de cadeias pesada e leve foi transfectada em células T 293 usando o agente de transfecção FuGENE 6 (Roche Diagnostics) de acordo com as diretrizes do fabricante. Os anticorpos monoclonais secretados foram testados com relação à funcionalidade otimizada, por exemplo, ligação ao antígeno alvo, usando os critérios de seleção descritos no Exemplo 1.

EXEMPLO 3: Modulação Antigênica Usando os Anticorpos huCD3 [00172] Os anticorpos huCD3 da invenção são capazes de modulação antigênica, a qual é definida como a redistribuição e eliminação do complexo CD3-TCR induzida pela ligação do anticorpo. A expressão na superfície celular de outras moléculas sobre células T, incluindo, por exemplo, CD4, não é alterada pela exposição a um anticorpo antiCD3 da invenção (Figura 9C).

EXEMPLO 4: Redução da síndrome tóxica de liberação de citocina gerada pelos anticorpos huCD3 [00173] De preferência, os anticorpos huCD3 da invenção incluem uma mutação na região Fc, de modo que a mutação altera a síndrome de liberação de citocina. Conforme descrito acima, a síndrome de liberação de citocina (CRS) é uma complicação imediata comum que ocorre com o uso de um anticorpo anticélulas T, tais como ATG (globulina antitimócito) e OKT3 (um anticorpo anti-CD3 de murino). Essa síndrome é caracterizada pela liberação excessiva de citocinas, tais como TNF, IFN-gama e IL-2 na circulação. As citocinas liberadas pelas células T ativadas produzem um tipo de resposta inflamatória sistêmica similar àquela encontrada em infecção grave caracterizada por hipotensão, pirexia e rigores. Sintomas de CRS incluem, por exemplo, febre, calafrios, náusea, vômito, hipotensão e dispnéia.

[00174] Os anticorpos huCD3 da invenção contêm uma ou mais mutações que impedem a liberação de uma ou mais citocina (s) in vivo, mediada pela constante região de cadeia pesada. Em uma modaliPetição 870190084596, de 29/08/2019, pág. 82/97

79/81 dade, os anticorpos huCD3 da invenção são moléculas de IgG tendo uma ou mais das seguintes mutações em uma estrutura principal de IgG γ1 modificada: γ1 N297A, na qual o resíduo de asparagina na posição 297 é substituído por um resíduo de alanina; γ1 L234/A,

L235/A, na qual os resíduos de leucina nas posições 234 e 235 são substituídos por resíduos de alanina; γ1 L234/A; L235/E, na qual o resíduo de leucina na posição 234 é substituído por um resíduo de alanina, enquanto que o resíduo de leucina na posição 235 é substituído por um resíduo de ácido glutâmico; γ1 L235/E, na qual o resíduo de leucina na posição 235 é substituído por um resíduo de ácido glutâmico; e γ1 D265/A, na qual o resíduo de ácido aspártico na posição 265 é substituído por um resíduo de alanina. A numeração dos resíduos da cadeia pesada descrita aqui é aquela do índice norte americano (veja Kabat et al, Proteins of Immunological Interest, US Dept. of Health & Human Services (1983)), conforme mostrado, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.624.821 e 5.648.260, cujos conteúdos das quais são aqui incorporados em sua totalidade por referência.

[00175] Outras modificações da parte principal de IgG γ1 que podem ser usadas nos anticorpos huCD3 da invenção incluem, por exemplo, A330/S na qual o resíduo de alanina na posição 330 é substituído por um resíduo de serina e/ou P331/S, na qual o resíduo de prolina na posição 331 é substituído por um resíduo de serina.

[00176] Os anticorpos de CD3 totalmente humanos da invenção tendo uma mutação L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ E²³⁵ na região Fc têm uma função única - eliminação da liberação de citocina na presença do anticorpo huCD3. Estudos anteriores realmente ensinaram o uso de uma mutação L E (veja, por exemplo, Xu et al, Cellular Immunology, 200, páginas 16-26 (2000), na página 23). Contudo, essas duas mutações em particular na posições 234 e 235 (isto é, L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ E²³⁵) eliminou a síndrome de liberação de citocina, conforme analisado no sistema de

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80/81 ensaio de células mononucleares de sangue periférico humano in vitro (Figuras 11A, 11B). Nesse ensaio, células mononucleares de sangue periférico humano foram isoladas usando um gradiente de Ficoll, rotuladas com CFSE e as células CFSE-rotuladas foram, então, colocadas em lâminas com 96 cavidades. Os vários anticorpos monoclonais foram adicionados em várias diluições e incubados durante 72 horas a 37 °C. Após 6 horas, 50 gl de sobrenadante foram removidos para avaliação a liberação de TNF através de ELISA. Após 48 horas, 50 gl de sobrenadante foram removidos para avaliar a liberação de IFN-γ através de ELISA. Após 72 horas, as células foram coletadas e a proliferação foi avaliada através de FACS usando a intensidade de CFSErotulação.

[00177] Assim, contrário às cadeias pesadas do tipo silvestre e contrário a uma série de outras mutações que tinham sido descritas por outros (por exemplo, TolerX (mutação por aglicosilação), Bluestone (mutação L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ A²³⁵) (veja, por exemplo, Patente. U.S N°

5.885.573)), as quais retêm um nível significativo do efeito de liberação de citocina, as mutações L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ E²³⁵ dos anticorpos huCD3 da invenção não exibem o fenômeno de liberação de citocina. O nível do efeito restante de liberação de citocina era de 100% para a Fc do tipo silvestre, cerca de 50 a 60% para a mutação de (L²³⁴ L²³⁵ A²³⁴ A²³⁵) e indetectável para as mutações Ala/Glu Fc descritas aqui (Figuras 11A, 11B).

EXEMPLO 5: Identificação por Arranjo de Peptídeo do Epitopo de Ligação do Anticorpo huCD3 [00178] A síntese e seleção por ELISA de grandes números de peptídeos tem sido usada para determinar os resíduos de aminoácido envolvidos no epitopo para vários anticorpos monoclonais. (veja por exemplo, Geysen et al, J Immunol Methods, vol. 102(2): 259-74 (1987)). Nos experimentos descritos aqui, arranjos de peptídeos em

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81/81 sobreposição derivados da sequência de aminoácido da cadeia epsilon da CD3 foram adquiridos da Jerini (Berlin, Alemanha) e subsequentemente testados com relação a um padrão de ligação pelos mAbs anti-CD3 totalmente humanos da invenção.

[00179] Os peptídeos nos arranjos foram produzidos usando a técnica de síntese SPOT para síntese química direta sobre suportes de membrana (veja Frank e Overwin, Meth Mol Biol, vol. 66: 149-169 (1996); Kramer e Schneider-Mergener, Meth Mol Biol, vol. 87: 25-39 (1998)). Os peptídeos lineares de 14-mer foram covalentemente ligados a um suporte de celulose Whatman 50 através do C-término, deixando o N-término livre (isto é, não ligado). Usando técnica padrão de Western blot, esses peptídeos ligados à fase sólida revelaram que o anticorpo monoclonal 28F11 reconhecia um conjunto em sobreposição de aminoácidos em proximidade com o N término (Fig. 10).

OUTRAS MODALIDADES [00180] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição precedente se destina a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, a qual é definida pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo monoclonal anti-CD3 totalmente humano isolado ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido de cadeia pesada compreendendo três regiões de determinação de complementariedade (CDRs) e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve compreendendo três CDRs, em que as três CDRs de cadeia pesada e as três CDRs de cadeia leve são selecionadas de:

   a. uma CDR1 de cadeia pesada variável (VH CDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos GYGMH (SEQ ID NO:27), uma CDR2 de cadeia pesada variável (VH CDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEQ ID NO:28), uma CDR3 de cadeia pesada variável (VH CDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos QMGYWHFDL (SEQ ID NO:29), uma CDR1 de cadeia leve variável (VL CDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:30), uma CDR2 de cadeia leve variável (VL CDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos DASNRAT (SEQ ID NO:31), uma CDR3 de cadeia leve variável (VL CDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos QQRSNWPPLT (SEQ ID NO:32);

   b. uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos SYGMH (SEQ ID NO:33), uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IIWYDGSKKNYADSVKG (SEQ ID NO:34), uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos GTGYNWFDP (SEQ ID NO:35), uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:36), RASQGISSALA (SEQ ID NO:39) ou WASQGISSYLA (SEQ ID NO:43), uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO:37), YASSLQS (SEQ ID NO:40) ou DASSLGS (SEQ ID NO:42), e uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQYGSSPIT

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2. 2/6 (SEQ ID NO:38) ou QQYYSTLT (SEQ ID NO:41); e

   c. uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos SYGMH (SEQ ID NO:33); uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AIWYNGRKQDYADSVKG (SEQ ID NO:44); e uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos GTGYNWFDP (SEQ ID NO:35); uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:30) ou RASQGISSALA (SEQ ID NO:39); uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos DASNRAT (SEQ ID NO:31) ou DASSLES (SEQ ID NO:46); e uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQRSNWPWT (SEQ ID NO:45) ou QQFNSYPIT (SEQ ID NO:47), em que o dito anticorpo contém pelo menos uma primeira mutação na cadeia pesada na posição 234 e uma segunda mutação na posição 235, e em que a primeira mutação resulta em um resíduo de alanina na posição 234 e a segunda mutação resulta em um resíduo de ácido glutâmico na posição 235.

   2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo inibe a ligação do anticorpo monoclonal anti-humano OKT3 de murino a um linfócito T.
3. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo se liga a um epítopo que inclui, total ou parcialmente, a sequência de aminoácidos EMGGITQTPYKVSISGT (SEQ ID N0: 67).
4. 4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYGMH (SEQ ID NO: 27); um VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de VIWYDGSKKY YVDSVKG (SEQ ID NO: 28); um VH CDR3 com

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   3/6 preendendo a sequência de aminoácidos de QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 29); um VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQSVS SYLA (SEQ ID NO: 30); um VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de DASNRAT (SEQ ID NO: 31) e um VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 32) e em que o anticorpo ainda compreende uma cadeia pesada variável compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 e uma cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:4.
5. 5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYGMH (SEQ ID NO: 27); um VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de VIWYDGSK KYYVDSVKG (SEQ ID NO: 28); um VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 29), um VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQSVS SYLA (SEQ ID NO: 30); um VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de DASNRAT (SEQ ID NO: 31) e um VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 32), e em que o anticorpo ainda compreende uma cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:6 e uma cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:8.
6. 6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SYGMH (SEQ ID NO: 33); um VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IIWYDGSKKNYADSVKG (SEQ ID NO: 34); um VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 35); um VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

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   GASSRAT (SEQ ID NO: 37), um VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de YASSLQS (SEQ ID NO: 40) ou DASSLGS (SEQ ID NO: 42); e um VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQYGSSPIT (SEQ ID NO: 38) ou QQYYSTLT (SEQ ID NO: 41), e em que o anticorpo ainda compreende uma cadeia pesada variável compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve variável compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19 ou 20.
7. 7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que apresenta uma cadeia pesada com três CDRs compreendendo um VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SYGMH (SEQ ID NO:33); um VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AIWYNGRKQDYADSVKG (SEQ ID NO:44); um VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GTGYNWFDP (SEQ ID NO:35); e uma cadeia leve com três CDRs compreendendo um VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:30) ou RASQGISSALA (SEQ ID NO:39); um VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de DASNRAT (SEQ ID NO:31) ou DASSLES (SEQ ID NO:46); e um VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQRSNWPWT (SEQ ID NO:45) ou QQFNSYPIT (SEQ ID NO:47), e em que o dito anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 ou 26.
8. 8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região estrutura 2 (FWR2) compreendendo a sequência de aminoácidos WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 73).

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9. 9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região estrutura 3 (FRW3) compreendendo a sequência de aminoácidos RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 74).
10. 10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável localizada C-terminal à região CDR3, em que a referida região variável compreende a sequência de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO: 64) em uma posição que é C-terminal à região CDR3.
11. 11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável localizada C-terminal à região CDR3, em que a referida região variável compreende a sequência de aminoácidos GTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) em uma posição que é C-terminal à região CDR3.
12. 12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável localizada C-terminal à região CDR3, em que a referida região variável compreende a sequência de aminoácidos WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66) em uma posição que é C-terminal à região CDR3.
13. 13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
14. 14. Uso de um anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de um sintoma associado com um distúrbio imunorelacionado ou um sintoma relacionado à rejeição associada com transplante de órgãos.
15. 15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que ao indivíduo é ainda administrado um segundo agen-

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    6/6 te.
16. 16. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o distúrbio imuno-relacionado é selecionado de doenças autoimunes e um distúrbio inflamatório.
17. 17. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
18. 18. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 17.
19. 19. Método de produção de um anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de cultivar uma célula hospedeira que compreenda o vetor como definido na reivindicação 18 sob condições adequadas para produção do anticorpo.