BR112020024240A2

BR112020024240A2 - anticorpos contra entpd2, terapias de combinação e métodos para usar os anticorpos e terapias de combinação

Info

Publication number: BR112020024240A2
Application number: BR112020024240-3A
Authority: BR
Inventors: Michael DIDONATO; Jian Shi; Xenia Karola Wezler; Christoph Erkel; Anna GALKIN; Scott Martin GLASER; Klaus Felix Hartlepp; Yong Jia; Alexandra Kraus; Christian Cho-Hua Lee; Sarah Michelle Rue
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2021-03-02
Also published as: JOP20200305A1; JP2024073424A; PE20210916A1; MX2020012639A; AU2019277817A1; CA3099223A1; ECSP20076683A; CN112218656A; CU20200090A7; US11939397B2; CR20200579A; CO2020014773A2; IL278920A; SG11202010893WA; US20210155713A1; EP3801616A1; MA52781A; WO2019229658A1; CL2020003096A1; KR102578668B1

Abstract

''ANTICORPOS CONTRA ENTPD2, TERAPIAS DE COMBINAÇÃO E MÉTODOS PARA USAR OS ANTICORPOS E TERAPIAS DE COMBINAÇÃO''. A presente invenção refere-se a anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, por exemplo, anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente a ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana), e métodos para usar esses anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos. A presente invenção também se refere a terapias de combinação que compreendem um anticorpo anti-ENTPD2 humana ou fragmento de ligação a antígeno e pelo menos um agente terapêutico adicional e método para usar essas terapias de combinação.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para "ANTI- CORPOS DE ENTPD2, TERAPIAS DE COMBINAÇÃO E MÉTODOS PARA USAR OS ANTICORPOS E TERAPIAS DE COMBINAÇÃO".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisó- rio nº U.S. 62/677.850, depositado em 30 de maio de 2018, cujo con- teúdo está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

[0002] A presente invenção refere-se a anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, por exemplo, anticorpos monoclo- nais ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à ectoenzima ectonucleosídeo trifosfato difosfo- hidrolase 2 (ENTPD2) e métodos para usar esses anticorpos ou frag- mentos de ligação a antígeno.

[0003] A presente invenção também se refere a terapias de com- binação que compreendem um anticorpo de ENTPD?2 anti-humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e pelo menos um agente terapêutico adicional.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0004] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente no formato de ASCII e é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada a 5 de abril de 2019, é nomeada PATOS8145-WO0- PCT SL.txt e tem 635,873 bytes de tamanho.

ANTECEDENTES

[0005] O estresse celular e a apoptose disparam a liberação de ATP no espaço extracelular. A concentração de ATP aumentada pro- move inflamação rápida, resultando em amplificação de sinalização de célula T, inibindo células T reguladoras (Tregs) e promovendo ativação de inflamassoma em células dendríticas e macrófagos. A ectoenzima ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase 2 (ENTPD2) é parte da fa- mília de ecto-nucleosidases que hidrolisam 5'-trifosfatos e é uma prote- ína membrânica integral, que participa na sinalização purinérgica. EN- TPD?2 catalisa a conversão de adenosina trifosfato (ATP) em adenosi- na difosfato (ADP) e adenosina monofosfato (AMP). Por sua vez, a AMP é catalisada por Grupamento de diferenciação 73 (CD73), tam- bém conhecido como ecto-5'-nucleotidase (ecto-5'NT), em adenosina. A AMP da molécula interage com diversos receptores, incluindo os re- ceptores de Adenosina A1, A2A, A2B e A3. O receptor de A2A rece- beu atenção particular devido a sua ampla expressão em células imu- nes. A AMP tem efeitos pleiotrópicos no microambiente tumoral, inclu- indo a expansão de células T reguladoras (Tregs), inibição de respos- tas de célula T efetora (Teff) mediadas por interferon (IFN)-y e expan- são de células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs). Consul- tar, por exemplo, Allard B, et al., Curr Opin Pharmacol 29:7 a 16 (2016) e Allard D, et al., Imnmunotherapy 8:145 a 163 (2016).

[0006] Em um modelo de camundongo de carcinoma hepatocelu- lar, Emfoi mostrado que ENTPD2 converte a ATP extracelular em AMP, o que impede a diferenciação de células supressoras derivadas de mieloide monocítico (MDSCs) em células dendríticas, promovendo, assim, a manutenção de MDSCs in vitro e in vivo (Chiu et al., Nat Commun. 8:517 a 528 (2017).

[0007] ENTPD? é expressa em células cancerosas, conforme des- crito no presente documento. Novas composições e métodos para re- gular a atividade de ENTPD?2 e agentes terapêuticos relacionados são altamente desejáveis. SUMÁRIO DA INVENÇÃO:

[0008] São fornecidos no presente documento anticorpos ou frag- mentos de ligação a antígeno dos mesmos, por exemplo, anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à ectoenzima ectonucleosídeo trifosfato di- fosfo-hidrolase 2 (ENTPD2). Os anticorpos contra ENTPD2 ou frag- mentos de ligação a antígeno dos mesmos são úteis para tratar doen- ças associadas a ENTPD?2, tal como câncer.

[0009] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam especificamente à proteína ENTPD2 humana, em que o anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo compreende uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma região de- terminante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR?2), uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3), uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2), e uma região determinante de complementari- edade de cadeia leve 3 (LCDR3) de qualquer anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno fornecido na Tabela 1. Em algumas modalida- des, as HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno são selecionadas den- tre as sequências de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 fornecidas na Tabela 1. Em algumas modalidades, tais anti- corpos ou fragmentos de ligação a antígeno compreendem uma região variável de cadeia pesada (VH) fornecida na Tabela 1. Em algumas modalidades, tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno compreendem uma região variável de cadeia leve (VL) fornecida na Tabela 1.

[0010] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno selecionados dentre qualquer um dos seguintes: 1) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 1,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 2,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 3,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 14,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 15e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 16;

2) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 4,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 5,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 3,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 19;

3) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO:

7,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 8,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 9,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 20,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 16;

4) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 38,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 39,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 50,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 51e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 52;

5) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO:

41,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 39,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 53,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 54 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 55;

6) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 44,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 45,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 56,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 54 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 52;

7) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 38,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

39,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 61,

8) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 41,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 39,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 62,

9) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 44,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 45,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO:

63,

10) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 38,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 68,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 50,

11) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 41,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 68,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 53,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO:

54 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 55;

12) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 44,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 69,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 56,

13) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 82,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 83,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 84,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 95,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 96 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

97;

14) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 85,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 86,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 84,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 98,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 99e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 100;

15) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 88,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 89,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 90,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 101,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 99e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 97;

16) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 106,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 107,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 108,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 119,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 120 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 121;

17) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 109,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 110,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 108,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 122,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 99e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 123;

18) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO:

112,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 113,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 114,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 124,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 99e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 121;

19) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 106,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 129,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 108,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 119,

20) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 109,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO:

130,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 108 uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 122,

21) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 112,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 131,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 114,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 124,

22) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 136,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 137,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

138,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 149,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 150 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 151;

23) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 139,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 140,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 138,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 152,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 153 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 154;

24) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 142,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 143,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 144,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO:

155,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 153 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 151;

25) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 160,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 161,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 162,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 173,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 150 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 174;

26) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 163,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 164,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 162,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 175,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO:

153 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 176;

27) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 166,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 167,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 168,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 177,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 153 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 174;

28) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 220,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 221,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 61,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 51e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

52;

29) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 222,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 221,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 62,

30) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 223,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 224,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 63,

31) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 220,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 68,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 61,

32) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 222,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 68,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 62,

33) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO:

43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 223,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 69,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 63,

34) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 1,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 245,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 246,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 254,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 15e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 255;

35) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 4,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO:

247,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 246,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 256;

36) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 7,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 248,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 249,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 20,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 255;

37) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 1,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 261,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

262,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 254,

38) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 4,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 247,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 262,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17,

39) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 7,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 248,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 263,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO:

20,

40) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 272,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 273,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 274,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 254,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 285 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 16;

41) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 275,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 276,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 274,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO:

286 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 19; 42) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende: uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 278, uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 279, uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 280, uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 20, uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 286 e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

16.

[0011] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno selecionados dentre qualquer um dos seguintes: 1) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 10 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 21 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 2) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 25 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 29 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

3) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 33 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 29 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

4) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 46 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 57 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

5) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 46 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 64 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

6) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 70 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 74 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

7) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 25 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 78 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

8) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 91 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 102 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

9) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 115 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 125 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

10) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 132 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 125 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

11) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 145 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 156 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

12) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 169 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 178 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

13) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 225 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 229 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

14) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 233 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 237 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

15) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 241 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 229 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 16) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 250 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 257 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 17) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 264 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 268 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; ou 18) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 281 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 287 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma.

[0012] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno selecionados dentre qualquer um dos seguintes: 1) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 12 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 23 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 2) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 27 ou uma sequência pelo menos cerca de

95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 31 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

3) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 35 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 31 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

4) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 48 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 59 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

5) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 48 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 66 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

6) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 72 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 76 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

7) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 27 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 80 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

8) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 93 ou uma sequência pelo menos cerca de

95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 104 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

9) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 117 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 127 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

10) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 134 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 127 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

11) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 147 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 158 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

12) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 171 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 180 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

13) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 227 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 231 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

14) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 235 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 239 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 15) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 243 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 231 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 16) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 252 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 259 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 17) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 266 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 270 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; ou 18) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 283 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 289 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma.

[0013] São também fornecidos no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam espe- cificamente a um epítopo em ENTPD2 humana, em que o epítopo compreende pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois, pelo me- nos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, pelo menos quator-

ze, pelo menos quinze, pelo menos vinte) dos seguintes resíduos: His50, Asp76, Pro78, Gly79, GIy80, Tyr8ê5, Asp87, Asn88, Gly91, GIn94, Ser95, Gly98, Glu101, GIn102, GIn105, Asp106, Arg245, Thr272, Gln273, Leu275, Asp278, Arg298, Ala347, Ala350, Thr351, Arg392, Ala393, Arg394 ou Tyr398.

[0014] São também fornecidos no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam espe- cificamente a um epítopo em ENTPD2 humana, em que o epítopo compreende pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois, pelo me- nos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, pelo menos quator- ze, pelo menos quinze, pelo menos vinte) dos seguintes resíduos: Gly79, GIn250, Leu253, Trp266, Arg268, Gly269, Phe270, Ser271, Thr272, Gln273, Val274, Leu275, Asp278, Arg298, Ser300, Ser302, GlIy303, Thr380, Trp381, Ala382, Gly390, GIn391, Arg392, Ala393, Arg394 ou Asp397.

[0015] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento têm um isotipo I9gG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento têm um isotipo IgG1. Em algumas modalida- des, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento compreendem uma região Fc seleci- onada dentre uma região Fc de IgG1, uma região Fc de I9G2, uma re- gião Fc de IgG4 ou uma região Fc híbrida de IgG2/I9G4. . Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento compreende uma região Fc selecionada dentre uma região Fc de IgG1. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos des-

critos no presente documento compreendem uma região Fc modifica- da. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento compreende uma região Fc modificada que tem atividade reduzida de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) em comparação com o anticorpo precursor.

[0016] Em outro aspecto, são fornecidos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que competem com qualquer anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno fornecido na pela ligação à proteína humana ENTPD?2.

[0017] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se |i- gam essencialmente ao mesmo epítopo de ENTPD2 que qualquer anti- corpo ou seu fragmento de ligação a antígeno fornecido na Tabela 1.

[0018] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento se |i- gam à proteína ENTPD2 humana com uma constante de dissociação (KD) menor que 10 nM, por exemplo, com uma KD menor que 5 nM ou com uma KD menor que 3 nM, por exemplo, conforme medido por Biaco- re. Em algumas modalidades, a constante de dissociação dos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento à ENTPD2 humana é medida por Biacore a 25 “ºC.

[0019] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento ini- bem a atividade enzimática de ENTPD2 humana em pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%. Em algumas modalidades, a atividade enzimática de ENTPD2 humana é medida com o uso de um ensaio FRET in vitro, que mede a hidrólise de ATP a ADP por ENTPD2 recombinante ou ENTPD? expressa na superfície de células.

[0020] Em algumas modalidades, os anticorpos contra ENTPD2 anti-humanos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos des- critos no presente documento inibem a capacidade da ENTPD?2 de hi- drólise de adenosina trifosfato (ATP). Em algumas modalidades, a ca- pacidade da ENTPD?2 de hidrólise de ATP é medida com o uso de um ensaio FRET in vitro, que mede a hidrólise de ATP a ADP por EN- TPD?2 recombinante ou ENTPD?2 expressa na superfície de células.

[0021] Em algumas modalidades, os anticorpos contra ENTPD2 anti-humanos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos des- critos no presente documento interferem na ligação de ATP a ENTPD2 ou prendem a ATP dentro do domínio catalítico de ENTPD2. Em al- gumas modalidades, a capacidade da ENTPD?2 de hidrólise de ATP é medida com o uso de um ensaio FRET in vitro, que mede a hidrólise de ATP a ADP por ENTPD2 recombinante ou ENTPD2 expressa na superfície de células.

[0022] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento são anticorpos humanos ou humanizados ou fragmentos dos mesmos.

[0023] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento ácidos nucleicos que codificam um anticorpo de ENTPD?2 anti-humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento. Tais ácidos nucleicos podem codificar polipeptídeos que compreendem segmentos ou domínios dos anticorpos contra ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presen- te documento.

[0024] São também fornecidos vetores que compreendem tais áci- dos nucleicos que codificam um anticorpo de ENTPD?2 anti-humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente do- cumento. Em algumas modalidades, o vetor é selecionado dentre um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um cosmídeo ou um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral baseado em qualquer um dos seguintes vírus: lentivírus, adenovírus, vírus ade- noassociado (AAV), Vírus Herpes Simplex (HSV), parvovírus, retroví- rus, vírus vaccinia, vírus Sinbis, vírus influenza, reovírus, vírus da do- ença de Newcastle (NDV), vírus do sarampo, vírus da estomatite vesi- cular (VSV), poliovírus, poxvírus, vírus do Vale de Seneca, coxsackie- vírus, enterovírus, vírus Mixoma ou vírus Marabá. Em algumas moda- lidades, o vetor é um vetor de AAV. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o vetor compreende, ainda, um promotor, por exemplo, um promotor específico quanto ao tecido. Em algumas modalidades, o vetor compreende, ainda, um marcador detectável.

[0025] São também fornecidas no presente documento células que compreendem um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo de ENTPD2 anti-humano ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo descrito no presente documento ou um ve- tor que compreende tal ácido nucleico ou conjunto de ácidos nuclei- cos.

[0026] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento composições farmacêuticas que compreende um anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, um ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, um vetor que compre- ende tal ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos ou uma célula que compreende um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos ou vetor descrito no presente documento e um carreador farmaceuti- camente aceitável.

[0027] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento métodos para produzir um anticorpo de ENTPD2 anti-humano ou fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo cultivando-se uma célula que compreende um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo de ENTPD2 anti-humano ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo ou um vetor que compreende tal ácido nu- cleico ou conjunto de ácidos nucleicos, e coletar o anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo do meio de cultura.

[0028] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento métodos para tratar um câncer em um indivíduo que precisa do mes- mo administrando-se ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ENTPD?2 anti-humano ou fragmento de liga- ção a antígeno descrito no presente documento, um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos que codifica tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, uma cé- lula que compreende tal ácido nucleico ou conjunto de ácidos nuclei- cos ou vetor, ou uma composição farmacêutica que compreende tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, ácido nucleico ou con- junto de ácidos nucleicos, vetor ou célula. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o ácido nu- cleico ou conjunto de ácidos nucleicos, o vetor, a célula ou a composi- ção farmacêutica é administrada ao indivíduo através de uma via intra- venosa, intratumoral ou subcutânea.

[0029] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento métodos para estimular uma resposta imunológica em um indivíduo administrando-se ao indivíduo um anticorpo de ENTPD2 anti-humano ou fragmento de ligação a antígeno descrito no presente documento, um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos que codifica tal an- ticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, uma célula que compreende tal ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos ou vetor, ou uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, vetor ou célula, em uma quantidade eficaz para estimular a resposta imunológica.

[0030] Em algumas modalidades, tais métodos podem incluir, ain- da, a administração de pelo menos um agente terapêutico adicional ao indivíduo.

[0031] Em algumas modalidades, tais métodos podem incluir, ain- da, a administração de pelo menos dois agentes terapêuticos adicio- nais ao indivíduo.

[0032] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, o ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos que codifica tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, um vetor ou uma célula que compreende tal ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, ou uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, vetor ou célu- la, para uso como um medicamento.

[0033] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, o ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo, um vetor ou uma célula que compreende tal ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, ou uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo, ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, vetor ou célula, para uso no tratamento de um câncer.

[0034] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, e pelo menos um procedimento ou agente terapêutico adicional.

[0035] Em algumas modalidades, o pelo menos um procedimento ou agente terapêutico adicional é selecionado dentre um ou mais den- tre quimioterapia, uma terapia-alvo anticâncer direcionada, um fárma- co oncolítico, um agente citotóxico, uma terapia imunológica, uma cito- cina, procedimento cirúrgico, um procedimento de radiação, um ativa- dor de uma molécula coestimulante, um inibidor de uma molécula ini- bidora, uma vacina ou uma terapia celular.

[0036] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente tera- pêutico adicional é um inibidor de PD-1, por exemplo, um anticorpo de PD-1. Em algumas modalidades, o inibidor de PD-1 é selecionado dentre PDROO1, Nivolumabe, Pembrolizumabe, Pidilizumabe, ME- DIO680, REGN2810, TSR-042, PF-O06801591 ou AMP-224.

[0037] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente tera- pêutico adicional é um inibidor de PD-L1, por exemplo, um anticorpo de PD-L1. Em algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é seleciona- do dentre FAZO53, Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe ou BMS-

936559.

[0038] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente tera- pêutico adicional é um antagonista de A2AR. Em algumas modalida- des, o antagonista de A2AR é selecionado dentre: i. uma molécula de anticorpo anti-CD73, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, opcionalmente em que o anticorpo anti-CD73 é selecionado dentre: a. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 295 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 296, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 295 ou 296;

b. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 299, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 300, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 299 ou 300;

c. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 302 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 303, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 302 ou 303;

d. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 304 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 305, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 304 ou 305;

e. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 306 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 307, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 306 ou 307; ou f. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 308 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 309, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 308 ou 309; ou ii. PBFSO9/NIRI78, CPI444/V81444, AZDA4635/HTL- 1071, Vipadenant, GBV-2034, AB928, Teofilina, Istradefilina, Tozade- nant/SYN-115, KW-6356, ST-4206 e Preladenant/SCH 420814; ou iii. 5-bromo-2,6-di-(1H-pirazol-1-ila)pirimidina-4-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; (S)-7-(5-metilfurano-2- ila)-3-((6-(((tetra-hidrofurano-3-ila)óxi)mMetila)piridin-2-ila)metila)-3H- [1,2,3] triazolo[4,5-d]pirimidina-5-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; (R)-7-(5-metilfurano-2-ila)-3-((6-(((tetra-hidrofura- no-3-ila)óxi)metila)piridin-2-ila)Metila)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidina -5-amina, ou racemato da mesma, ou um sal farmaceuticamente acei- tável da mesma; 7-(5-metilfurano-2-ila)-3-((6-(((tetra-hidrofurano-3-ila) óxi)metila)piridin-2-ila)Metila)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidina-5- amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; e 6-(2-cloro- 6-metilpiridin-4-ila)-5-(4-fluorofenila)-1,2,4-triazin-3-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

[0039] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente tera- pêutico adicional é selecionado dentre: i. um inibidor de CTLA-4, opcionalmente em que o inibi- dor de CTLA-4 é selecionado dentre Ipilimumabe ou Tremelimumabe; ii. um inibidor de TIM-3, opcionalmente em que o inibidor de TIM-3 é selecionado dentre MBG453, TSR-022 ou LY3321367; iii. um inibidor de LAG-3, opcionalmente em que o inibidor de LAG-3 é selecionado dentre LAG525, BMS-986016, TSR-033, MK- 4280 ou REGN3767; iv. um agonista de GITR, opcionalmente em que o ago- nista de GITR é selecionado dentre GWN323, BMS-986156, MK-4166, MK-1248, TRX518, INCAGN1876, AMG 228 ou INBRX-110; v. uma molécula de anticorpo multiespecífico anti-CD3, opcionalmente em que a molécula de anticorpo multiespecífico anti- CD3 é uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD123

(por exemplo, XENP14045), ou uma molécula de anticorpo biespeciífi- co anti-CD3 x anti-CD20 (por exemplo, XENP13676); vi. uma molécula de citocina, opcionalmente em que a molécula de citocina é IL-15 complexada com uma forma solúvel de receptor de IL-15 alfa (IL-15Ra); vii. um inibidor de fator estimulante de colônia de macró- fago (M-CSF), opcionalmente em que o inibidor de M-CSF é MCS110; viii. um inibidor de CSF-1R, opcionalmente em que o inibi- dor de CSF-1R é BLZ945; ix. um inibidor de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) e/ou triptofano 2,3-dioxigenase (TDO); x. um inibidor de TGF-RB; xi. um vírus oncolítico; xii. uma terapia de célula T com receptor de antígeno quimérico (CAR).

[0040] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente tera- pêutico adicional é selecionado dentre: 1) um inibidor de proteína qui- nase C (PKC); 2) um inibidor de proteína de choque térmico 90 (HSP90); 3) um inibidor de uma fosfoinositida 3-quinase (PISK) e/ou alvo de rapamicina (mMTOR); 4) um inibidor de citocromo P450 (por exemplo, um inibidor de CYP17 ou um inibidor de 17alfa-Hidroxilase/ C17-20 Liase); 5) um agente quelante de ferro; 6) um inibidor de aro- matase; 7) um inibidor de p53, por exemplo, um inibidor de uma inte- ração p53/Mdm2; 8) um indutor de apoptose; 9) um inibidor de angio- gênese; 10) um inibidor de aldosterona sintase; 11) um inibidor de re- ceptor suavizado (SMO); 12) um inibidor de receptor de prolactina (PRLR); 13) um inibidor de sinalização de Wnt; 14) um inibidor de CDKA4/6; 15) um inibidor de receptor de fator de crescimento de fi- broblasto 2 (FGFR2)/receptor de fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGFR4); 16) um inibidor de fator estimulante de colônia de macrófa-

gos (M-CSF); 17) um inibidor de um ou mais dentre c-KIT, liberação de histamina, FIt3 (por exemplo, FLK2/STK1) ou PKC; 18) um inibidor de um ou mais dentre VEGFR-2 (por exemplo, FLK-1/KDR), PDGFRbeta, C-KIT ou Raf quinase C; 19) um agonista de somatostatina e/ou um inibidor de liberação de hormônio do crescimento; 20) um inibidor de quinase de linfoma anaplástico (ALK); 21) um inibidor de receptor de fator de crescimento similar à insulina (IGF-1R); 22) um inibidor de P- Glicoproteína 1; 23) um inibidor de receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR); 24) um inibidor de BCR-ABL quinase; 25) um inibidor de FGFR; 26) um inibidor de CYP11B2; 27) um inibidor de HDM2, por exemplo, um inibidor da interação HDM2-p53; 28) um inibidor de uma tirosina quinase; 29) um inibidor de c-MET; 30) um ini- bidor de JAK; 31) um inibidor de DAC; 32) um inibidor de 118B- hidroxilase; 33) um inibidor de IAP; 34) um inibidor de PIM quinase; 35) um inibidor de Porcupine; 36) um inibidor de BRAF, por exemplo, BRAF V600E ou BRAF do tipo selvagem; 37) um inibidor de HER3; 38) um inibidor de MEK; 39) um inibidor de uma lipídio quinase; ou um ou mais agentes, conforme fornecido na Tabela 16.

[0041] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno, o ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, o vetor, a célula ou a composição farmacêutica é administrada concomi- tantemente com, antes de ou subsequentemente ao pelo menos um agente terapêutico adicional.

[0042] Em algumas modalidades, administrar o anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo, o ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, o vetor, a célula ou a composição farmacêutica tem um ou mais dos seguintes efeitos: (a) número aumentado de células CD45+ CD4- CD8+ CD69+ CD25+ em um sítio de tumor ou lesão no indivíduo; (b) número aumentado de células CD45+ CD8- CD4+

FOXP3- CD69+ CD25+ em um sítio de tumor ou lesão no indivíduo; (c) nível plasmático de MCP1 ou IL-168 diminuído no indi- víduo; ou (d) nível de MCP1 aumentado em um sítio de tumor ou le- são no indivíduo.

[0043] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento o uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, do ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um vetor ou uma célula que compreende tal ácido nucleico, ou uma composição farmacêutica que compreende tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ácido nucleico, vetor ou célula, na fabricação de um medicamento para tratamento de um câncer.

[0044] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento métodos para tratar câncer em um indivíduo que precisa do mesmo, em que tal método compreende administrar ao indivíduo uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ENTPD2 anti- humano ou fragmento de ligação a antígeno descrito no presente do- cumento, em combinação com um segundo agente terapêutico seleci- onado dentre um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1.

[0045] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento métodos para estimular uma resposta imunológica em um indivíduo, em que tal método compreende administrar ao indivíduo uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ENTPD2 anti- humano ou fragmento de ligação a antígeno descrito no presente do- cumento, em combinação com um segundo agente terapêutico seleci- onado dentre um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1.

[0046] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento composições que compreendem um anticorpo de ENTPD2 anti- humano ou fragmento de ligação a antígeno descrito no presente do-

cumento para uso, em combinação com um segundo agente terapêuti- co selecionado dentre um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1, no tratamento de câncer em um indivíduo.

[0047] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento composições que compreendem um anticorpo de ENTPD2 anti- humano ou fragmento de ligação a antígeno descrito no presente do- cumento, em combinação com um segundo agente terapêutico seleci- onado dentre um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1, para uso no tratamento de câncer em um indivíduo.

[0048] Em algumas modalidades, o inibidor de PD-1 é um anticor- po de PD-1. Em algumas modalidades, o inibidor de PD-1 é seleciona- do dentre PDROO1, Nivolumabe, Pembrolizumabe, Pidilizumabe, ME- DIO680, REGN2810, TSR-042, PF-O06801591 ou AMP-224.

[0049] Em algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é um anti- corpo de PD-L1. Em algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é se- lecionado dentre FAZO53, Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe ou BMS-936559.

[0050] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer ENTPD2+. Em algumas modalidades, o câncer é câncer colorretal (CRC), câncer gástrico (por exemplo, adenocarcinoma do estômago, carcinoma gás- trico), câncer de esôfago (por exemplo, carcinoma de célula escamosa do esôfago (ESCC)), câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pul- mão de células pequenas), câncer de mama (por exemplo, adenocar- cinoma de mama) ou câncer de ovário.

[0051] Todas as publicações, patentes e números de acesso men- cionados no presente documento estão incorporados ao presente do- cumento a título de referência em sua totalidade como se cada publi- cação ou patente individual fosse específica e individualmente indica- da como estando incorporada a título de referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0052] A Figura 1A representa a expressão de ENTPD?2 através de linhagens de célula de câncer representativas conforme determina- do por citometria de fluxo. A Figura 1B é uma tabela (Tabela 20) que mostra densidade de receptor de ENTPD2 através de linhagens de células de câncer representativas.

[0053] A Figura 2 representa imagens de manchamento de IHC representativas de ENTPD2 em tecidos de tumor primário colorretal, esofágico e ovariano embebidos em parafina e fixados em formalina.

[0054] A Figura 3A mostra a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (SEQ ID NO: 330) e cadeia leve (SEQ ID NO: 334) de FAb22 de ENTPD?2 anti-humano com as CDRs sublinhadas (conforme defini- do por Kabat), e resíduos localizados na interface anticorpo-antígeno identificados para cada Fab como (*). A Figura 3B mostra a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (SEQ ID NO: 336) e cadeias leves (SEQ ID NO: 239) de FAb23 de ENTPD?2 anti-humano com as CDRs sublinhadas (conforme definido por Kabat), e resíduos localizados na interface anticorpo-antígeno identificados com (*). A Figura 3C mostra a sequência de aminoácidos da cadeia pesada (SEQ ID NO: 338) e cadeias leves (SEQ ID NO: 340) de FAb24 de ENTPD?2 anticamundongo com as CDRs sublinhadas (conforme definido por Kabat), e resíduos lo- calizados na interface anticorpo-antígeno identificados com (*).

[0055] A Figura 4A mostra a sequência de aminoácidos de EN- TPD2 humana recombinante (resíduos 29 a 462, mutante Y350A) usada em estudos cristalográficos (SEQ ID NO: 1014), com os ele- mentos de estrutura secundários mostrados abaixo da sequência de aminoácidos. As barras representam hélices qa, e as setas representam fitas B. As setas e barras não identificadas de quebras de formatação de sequência são contíguas a elementos estruturais precedentes iden- tificados. As regiões não estruturadas não estão marcadas. O domínio extracelular solúvel de ENTPD2 humana abrange os resíduos 29 a

462. O construto utiliza um peptídeo de sinalização de secreção de GP67 N-terminal (os primeiros 38 resíduos estão destacados em cinza) com o sítio de clivagem de peptídeo de sinalização após o último resíduo e uma etiqueta de afinidade metálica de hexa-histidina C-terminal (SEQ ID NO: 1010) para facilitar a purificação. Asn129, Asn294, Asn378 e Asn443 são sítios de glicosilação N-ligados previstos para os quais a glicosilação é observada em estruturas de cristal e mostrados em itáli- co. Asn64 é também um sítio de glicosilação N-ligado previsto não ob- servado nessas estruturas de cristal. Os resíduos localizados na inter- face antígeno-Fab para os complexos de FAb22 e FAb23 são indica- dos pelos símbolos (*) e (:), respectivamente, abaixo da sequência de aminoácidos. A Figura 4B mostra a sequência de aminoácidos de ENTPD?2 murina recombinante (resíduos 29 a 462) usada em estudos de cristalografia (SEQ ID NO: 1015), com os elementos de estrutura secundários mostrados abaixo da sequência de aminoácidos. As bar- ras representam hélices a, e as setas representam fitas B. As setas e barras não identificadas de quebras de linhagem são contíguas a ele- mentos estruturais precedentes identificados. As regiões não estrutu- radas não estão marcadas. A ENTPD2 murina madura se inicia a partir de Thr29. O construto utiliza um peptídeo de sinalização de secreção de GP67 N-terminal (resíduos 1 a 38) com o sítio de clivagem de pep- tídeo de sinalização após o resíduo 38 e uma etiqueta de afinidade metálica de hexa-histidina C-terminal (SEQ ID NO: 1010) para facilitar a purificação. Asn129, Asn294, Asn378 e Asn443 são sítios de glicosi- lação N-ligados potenciais mostrados em itálico. Os resíduos posicio- nados na interface antígeno-FAb24 são indicados pelo símbolo (*) abaixo da sequência de aminoácidos.

[0056] A Figura 5A mostra uma representação em desenho da estrutura de cristal do ectodomínio de ENTPD2 humana apo com os resíduos 33 a 453 mostrados. Duas vistas são giradas em 90 graus. Elementos estruturais secundários consecutivos são identificados. Os dissulfetos são mostrados como adesivos. As terminações amino e carbóxi são identificadas como NT e CT, respectivamente. O lóbulo proximal de membrana contém ambas as terminações N e C (subdo- mínio 1: Pro36-Ser161 e Lys427-Phe461) e tem sombreado mais es- curo que o lóbulo distal de membrana (subdomínio 2: Gly162-GIn426). A ATP de substrato se liga profundamente dentro da fenda entre lóbu- los. A localização do sítio de ligação de do sítio de ligação de ATP é ilustrada na Figura 5B. É mostrado o análogo de ATP AMP-PNP so- breposto no sítio ativo de ENTPD2 humana a partir da coestrutura de ENTPD? de rato (PDB 3CJA).

[0057] A Figura 6 ilustra uma vista geral de FAb22 de ENTPD2 anti-humano em complexo com ENTPD2 humano. Duas vistas são mostradas com 90 graus de separação. AMP-PNP é modelado no sítio ativo de ENTPD2 com base na sobreposição com a coestrutura de ENTPD? de rato PDB 3CJA. A cadeia pesada do Fab tem sombreado mais escuro.

[0058] A Figura 7 ilustra uma vista geral de FAb23 de ENTPD2 anti-humano em complexo com ENTPD2 humana. Duas vistas são mostradas com 90 graus de separação. AMP-PNP é modelado no sítio ativo de ENTPD2 com base na sobreposição com a coestrutura de ENTPD? de rato PDB 3CJA. A cadeia pesada do Fab tem sombreado mais escuro.

[0059] A Figura 8 ilustra uma vista geral de FAb24 de ENTPD2 antimurino em complexo com ENTPD2 murina. AMP-PNP é modelado no sítio ativo de ENTPD2 com base na sobreposição com a coestrutu- ra de ENTPD?2 de rato PDB 3CJA. A cadeia pesada do Fab tem som- breado mais escuro.

[0060] A Figura 9 é uma plotagem que ilustra a eficácia de longo prazo com mAb13 de ENTPD?2 anticamundongo em combinação com Ab anti-PD-1 no modelo tumoral B16LM3 singeneico.

[0061] As Figuras 10A a 10C são gráficos que ilustram a eficácia com mAb13 de ENTPD?2 anticamundongo em combinação com Ab an- ti-PD-1 no modelo tumoral B16F10 singeneico, associado ao influxo aumentado de células auxiliares CD8 e CDA4 T no sítio tumoral no dia 8 após o tratamento.

[0062] As Figuras 11A e 11B representam a caracterização do clone B5 de modelo B16LM3 geneticamente modificado de ENTPD2 humana, que ilustra a expressão de ENTPD2 humana por FACS in vitro e sustentabilidade de expressão de ENTPD2 humana em tumores in vivo por IHC com o Ab CD39L1 anti-humano Novus (diluição 1:40).

[0063] As Figuras 12A e 12B são gráficos que ilustram a eficácia de resposta à dose de mAb1 e mAb6 de ENTPD?2 anti-humano em combinação com Ab anti-PD-1 no modelo B5 de clone B16LM3 geneti- camente modificado de ENTPD2 humana.

[0064] As Figuras 13A e 13B são plotagem de pontos que mostra os níveis plasmáticos de IL-1b (Figura 13A) e MCP-1 (Figura 13B) após tratamento com mAb1 de ENTPD?2 anti-humano ou um controle de isotipo no modelo de xenoenxerto B5 de clone B16LM3 genetica- mente modificado de ENTPD2 humana em camundongos C57BL/6. As Figuras 13C e 13D são plotagem de pontos que mostra os níveis de IL-18 (Figura 13A) e MCP-1 (Figura 13B) em tumor após tratamento com mAb1 de ENTPD?2 anti-humano ou um controle de isotipo no mo- delo de xenoenxerto B5 de clone B16LM3 geneticamente modificado de ENTPD2 humana em camundongos C57BL/6.

[0065] A Figura 14 é um gráfico que mostra a eficácia in vivo de mAb1 anti-ENTPD2 em combinação com o antagonista de A2AR NIR178 no modelo de xenoenxerto B16LM3 geneticamente modificado de ENTPD2 humana em camundongos C57BL/6.

[0066] A Figura 15 é um gráfico que mostra a atividade represen- tativa de Abs anti-ENTPD2 no ensaio funcional de ENTPD2 humano bioquímico. mAb1, mAb17, mAb19 e mAb21 de ENTPD?2 anti- humanos potencialmente a atividade catalítica da ENTPD2 humana recombinante.

[0067] As Figuras 16A e 16B apresentam a atividade representa- tiva de Abs de ENTPD2 anti-humanos no ensaio funcional à base de célula NIH/38T3 ou RKO de ENTPD2 humano ou cino.

[0068] A Figura 17 representa um gráfico que ilustra a atividade funcional in vitro de mMAb13, mAb14, mAb15 de ENTPD?2 anticamun- dongo no ensaio funcional à base de célula NIH/38T3 de ENTPD2 de camundongo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0069] São fornecidos no presente documento anticorpos ou frag- mentos de ligação a antígeno dos mesmos, por exemplo, anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à ectoenzima ectonucleosídeo trifosfato di- fosfo-hidrolase 2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana). Os anti- corpos contra ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos são úteis para tratar doenças associadas a ENTPD?2, tal co- mo um câncer. Definições

[0070] Conforme usadas no relatório descritivo e nas reivindica- ções, as formas singulares “um”, “uma” e “a”, “a” incluem referentes no plural a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, inclu- indo misturas das mesmas.

[0071] Por todo este relatório descritivo e reivindicações que o se- guem, a não ser que o contexto exija de outro modo, o termo "compre- ender" e variações, tal como "compreende" e "que compreende", são usados no presente documento em seu sentido aberto e não limitante, a não ser que indicado de outro modo.

[0072] Quando usado no presente documento "que consiste em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado no aspecto, modalidade e/ou elemento reivindicado. Quando usado no presente documento, "que consiste essencialmente em" não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e inovadoras do aspecto, modalidade e/ou reivindicação.

[0073] Em cada caso no presente documento, qualquer um dos termos "que compreende", "que consiste essencialmente em" e "que consiste em" pode ser substituído por um dos outros dois termos.

[0074] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, tempe- ratura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faixas, são aproximações que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 0,1. De- ve ser entendido, apesar de nem sempre ser explicitamente afirmado, que todas as designações numéricas estão precedidas pelo termo "cerca de". Também deve ser entendido, apesar de nem sempre ser explicitamente afirmado, que os reagentes descritos no presente do- cumento são meramente exemplos e que equivalentes dos mesmos são conhecidos na técnica.

[0075] Conforme usado no presente documento, ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase 2 (ENTPD2) (também conhecido como CD39 similar a Antígeno 1, similar a CD39 1, CD39L1, Ecto-ATP Difos- fo-hidrolase 2, ecto-ATPase, Ecto-ATPase 2, Ecto-ATPDase 2, NTP- Dase-2, NTPDase 2) refere-se à enzima do tipo 2 da família de ecto- nucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase (E-NTPDase), que é uma famí- lia de ectonucleosidases que hidrolisam 5"-trifosfatos. A enzima EN- TPD?2 é codificada pelo gene ENTPD2. O gene ENTPD2 humano é mapeado à localização cromossômica 9934,3, e a sequência genômi- ca do gene ENTPD2 humano pode ser encontrada no GenBank em

NC 000009.12. As sequências de mRNA e proteínas das variantes de transcrito humano de ENTPD2 podem ser encontradas no GenBank com os seguintes números de acesso: Isoforma 1: NM 203468.2 (mMRNA) — NP 982293.1 (prote- Ína com 495 aa); Isoforma 2: NM 001246.3 (mMRNA) — NP 001237.1 (prote- Ína com 472 aa); Ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase 2 isoforma 1 [Homo sapiens, NP 982293.1]

MAGKVRSLLPPLLLAAAGLAGLLLLCVPTRDVREPPALKYGIVLDAGS SH TSMFIYKWPADKENDTGIVGQHSSCDVPGGGISSYADNPSGASQSL VGCL EQALQDVPKERHAGTPLYLGATAGMRLLNLTNPEASTSVLMAVTHTL TQOYPFDFRGARILSGQEEGVEFGWVTANYLLENFIKYGWVGRWFRPRKGT LGAMDLGGASTQITFETTSPAEDRASE VOLHLYGQHYRVYTHSFLCYGRDOQVLORLLASALQTHGFHPCWPRGFSTQVLLGDVYQSPCTMAQRPONFNSSARV SLSGSSDPHLCRDLVSGLFSFSSCPFSRCSFNGVFQPPVAGNEFVAFSAFFYTVDFLRTSMGLPVATLOQLEAAAVN

VCNQTWAQLOARVPGORARLADYCA GAMFVQOQLLSRGYGFDERAFGGVIFOKKAADTAVGWALGYMLNLTNLIPA DPPGLRKGTDFSSWVVLLLLFASALLAALVLLLROVHSAKLPSTI (SEQ ID NO: 291) Ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase 2 de Homo sapiens (ENTPD2), variante de transcrito 1, MRNA [NM 203468.2] 1 ggcteceege acteteceggg tecacgeate gtectecege gegecegece geceatggee 61 gggaaggtgc ggtcactgct gcegecegetg ctgctggeeg cegegggect cgeceggecte 121 ctactgctgt gegtececac cegegacgte cgggagecge cegeceteaa gtatggeate 181 gtcctggacg ctagttette acacacgtce atgtttatct acaagtggcce ggcagacaag 241 gagaacgaca caggcattgt gggccagcac agctcectgtg atgttccagg taggggcate 301 tccagetatg cagacaacce ttetggggee agccagagte ttgttggatg cctegaacag 361 gegetteagg atgtgcccaa agagagacac gegggcacac cceetetacet gggagccaca 421 gegggtatgc gectgcteaa cetgaccaat ccagaggcet cgaccagtgt gcteatggca 481 gtgactcaca cactgaccca gtaccecttt gacttceggg gtgcacgcat ceteteggge 541 caggaagagg gagtgtttgg ctagggtgact gccaactace tgctggagaa cttcatcaag 601 tacggctggg taggceggtg gttceggeca cggaagggga cactaggggge catggacctg 661 gggggtgcct ctacccagat cacttttgag acaaccagtc cagctgagga cagagccage 721 gaggtccage tgcateteta cggecageac tacegagtet acacccacag cttectetge 781 tatggcegtg accaggteet ccagaggetg ctggecageg ceetecagac ccacggette 841 cacceetget ggcegagggg cttttccace caagtgctgc teggggatgt gtaccagtca 901 ccatgcacca tggcccageg gececagaac ttcraacagea gtgccagggt cagectgtca

961 gggagcagtg acccecacet ctgcegagat ctggtttetg ggctettoag cttetectee 1021 tgcceettet ccegatgete tttceaatagg gtettecage ceceagtage taggaacttt 1081 gtggccttet ctgccttett ctacactgtg gactttttgc ggacttegat ggggetgece 1141 gtggccacee tgcagcaget ggaggcagee gcagtgaatg tetgcaacca gaccetggget 1201 cagctgcaag ctegggtgce agggcaacgg gecegectgg cegactactg cgcegggges 1261 atgttegtgc agcagctgct gagtegegge tacggetteg acgagegege ctteggegge 1321 gtgatcttcc agaagaagge cgeggacact gcagtggget gggegetegg ctacatgctg 1381 aacctgacca acctgatcce cegecegaceeg ceggggetge gcaagggeac agacttcage 1441 tccetgggteg tectectget getettegec teegegetee tggetgeget tgtectgcta 1501 ctgcgteagg tgcacteege caagetgcca agceaccattt aggggcegac gaggggcaget 1561 gceceatece tececeaace cetgtatece cacecegtac teceacecet ccecacaacec 1621 ctgtacctce caceeetgta tececacece tecacecace ceteteceaa cetetetecee 1681 cgcecectgta tectgcatte ctecacecac cetetatece ceacegetee aceceaceae 1741 tgtcttetee atecttecac cecacectea gegtetetge cectaaggea gcccaggaaa 1801 taggaactga gactctggta cccacaggag cctgggtggg caaagagege tcaatecage 1861 tccttgaace cetecagece getteagect gggcateact geaggeceeg tgctectect 1921 cctectecte agggctaggt ctccagagag tggggecttg gtectgagaa tcagecetta 1981 gaggctectt ctgtgtagte taggtetgta ctagggaggg tcacagecca cgggctggca 2041 gccagecceag caccetacttg taaaaatttt gtaataaaaa gtttttccta gagacgtgaa 2101 aaaaaaaaaa aaaaaaaadaa acaaaadaadaa aacaaacadca aaaaaaacaa aaaaaa (SEQ ID NO: 292) Ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase 2 isoforma 2 [Homo sapiens, NP 001237.1]

MAGKVRSLLPPLLLAAAGLAGLLLLCVPTRDVREPPALKYGIVLDAGSSHTSMFIYKWPADKENDTGIVGQHSSCD VPGGGISSYADNPSGASQSLVGCLEQALQDVPKERHAGTPLYLGATAGMRLLNLTNPEASTSVLMAVTHTLTQYPF DFRGARILSGQEEGVFGWVTANYLLENF IKYGWVGRWFRPRKGT LGAMDLGGASTQITFETTSPAEDRASEVQOLHL YGQOHYRVYTHSFLCYGRDOVLORLLASALQTHGFHPCWPRGFSTQVLLGDVYQSPCTMAQRPQONEFNSSARVSLSGS SDPHLCRDLVSGLFSFSSCPFSRCSFNGVFQPPVAGNFVAFSAFFYTVDFLRTSMGLPVATLOQLEAAAVNVCNQOT

WAQQLLSRGYGFDERAFGGVIFQOKKAADTAVGWALGYMLNLTNL IPADPPGLRKGTDFSSWVVLLLLFASALLAAL VLLLROQVHSAKLPSTI (SEQ ID NO: 293) Ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase 2 de Homo sapiens (ENTPD2), variante de transcrito 2, MRNA [NM 001246.3] 1 ggcteceege acteteceggg tecacgeate gtectecege gegecegece geceatggee 61 gggaaggtgc ggtcactgct gcegecegetg ctgctggeeg cegegggect cgeceggecte 121 ctactgctgt gegtececac cegegacgte cgggagecge cegeceteaa gtatggeate 181 gtcctggacg ctagttette acacacgtce atgtttatct acaagtggcce ggcagacaag 241 gagaacgaca caggcattgt gggccagcac agctcectgtg atgttccagg taggggcate 301 tccagetatg cagacaacce ttetggggee agccagagte ttgttggatg cctegaacag 361 gegetteagg atgtgcccaa agagagacac gegggcacac cceetetacet gggagccaca 421 gegggtatgc gectgcteaa cetgaccaat ccagaggcet cgaccagtgt gcteatggca 481 gtgactcaca cactgaccca gtaccecttt gacttceggg gtgcacgcat ceteteggge 541 caggaagagg gagtgtttgg ctagggtgact gccaactace tgctggagaa cttcatcaag 601 tacggctggg taggceggtg gttceggeca cggaagggga cactaggggge catggacctg

661 gggggtgcct ctacccagat cacttttgag acaaccagtc cagctgagga cagagccage 721 gaggtccage tgcateteta cggecageac tacegagtet acacccacag cttectetge 781 tatggcegtg accaggteet ccagaggetg ctggecageg ceetecagac ccacggette 841 cacceetget ggcegagggg cttttccace caagtgctgc teggggatgt gtaccagtca 901 ccatgcacca tggcccageg gececagaac ttcraacagea gtgccagggt cagectgtca 961 gggagcagtg acccecacet ctgcegagat ctggtttetg ggctettoag cttetectee 1021 tgcceettet ccegatgete tttceaatagg gtettecage ceceagtage taggaacttt 1081 gtggccttet ctgccttett ctacactgtg gactttttgc ggacttegat ggggetgece 1141 gtggccacee tgcagcaget ggaggcagee gcagtgaatg tetgcaacca gaccetggget 1201 cagcagctgc tgagtegegg ctacggctte gacgagegeg cetteggegg cgtgatette 1261 cagaagaagg ccgeggacac tgcagtggge tgggegeteg getacatgct gaacctgace 1321 aacctgatce cegeegacee geceggggetg cgcaagggea cagactteag ctectagggte 1381 gtccetectge tgctettege cteegegete ctagetgege ttgtectgct getgegteag 1441 gtgcactceg ccaagetgece aagcaccatt taggggcega cgggggcage tgccecatee 1501 ctcececeaace cectgtatece ceacecegta cteceacece teceacaace cetgtacete 1561 ccaccectgt atccecacee ctecacecac cectetecea acetetetee cegecectagt 1621 atcctgcatt ccetecaceca cectetatee cecacegete caceceacea ctgtettete 1681 catcetteca ceceacecte agegtetetg cecctaagge agcecaggaa ataggaacto 1741 agactctggt acccacagga gcctgggtgg gcaaagageg cteaatecag ctecttgaac 1801 ccetecagec egetteagec taggcateac tgcaggecee gtgetectee tecetectect 1861 cagggctggg tcetecagaga gtggggectt ggtectgaga atcageeett agaggetect 1921 tctgtgtagt ctgggtctgt actggggagg gtcacagece acgggctgge agecagecea 1981 gcacctactt gtaaaaattt tgtaataaaa agtttttcct agagacgtga aaaaaaaaaa 2041 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaadaaa aaaacaaadca aaaaaaa (SEQ ID NO: 294)

[0076] Conforme usado no presente documento, uma proteína ENTPD2 humana também abrange proteínas que têm ao longo de seu comprimento total pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, 76%, 177%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%de identidade de sequência com qualquer uma das iso- formas de ENTPD2: As sequências de proteínas ENTPD2 de murino, macacos cynomolgus e de outro animal são conhecidas na técnica.

[0077] O termo "anticorpo", conforme usado no presente docu- mento, refere-se a uma proteína ou sequência de polipeptídeos deri- vada de uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, de cadeia múltipla ou simples, ou imunoglobulinas intatas, e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes. Por exemplo, um anticorpo IgG de ocorrência natural pode ser uma glico- proteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e du- as cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável da cadeia pe- sada (abreviada no presente documento como VH) e uma região cons- tante da cadeia pesada. A cadeia pesada região constante é compre- endida por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é com- preendida por uma região variável de cadeia leve (abreviada no pre- sente documento como VL) e uma região constante de cadeia leve. À região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regi- ões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinadoras da complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que estão mais conservadas, denominadas regiões framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR?2, FR3, CDR3, FRA4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve podem conter um domínio de ligação que interage com um antí- geno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1qg) do sistema complementar clássico. Um anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, anticorpo humano, anti- corpo humanizado, anticorpo camelídeo ou anticorpo quimérico. Os anticorpos podem ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, I9gG2, 1963, I9G4, IgA1 e IgA2) ou subclasse.

[0078] O termo “fragmento de anticorpo” ou “fragmento de ligação a antígeno” refere-se a pelo menos uma porção de um anticorpo, que mantém a capacidade para interagir especificamente com (por exem-

plo, por ligação, impedimento estérico, estabilização/desestabilização, distribuição espacial) um epítopo de um antígeno.

Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, porém sem limitação, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, fragmentos de anticorpos scFv, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1, anticorpos lineares, anticorpos de domínio único, tais como sdAb (VL ou VH), domínios VHH de camelídeo, anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos, tais como um fragmen- to bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça, e uma CDR isolada ou outros fragmentos de ligação a epítopos de um anticorpo.

Um fragmento de ligação a antígenos também pode ser incorporado em anticorpos de domínio único, maxicorpos, minicorpos, nanocorpos, intracorpos, dia- corpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (consultar, por exemplo, Hollinger e Hudson, Nature Biotechnology 23:1,126 a 1,136, 2005). Fragmentos de ligação ao antígeno podem também ser enxer- tados em moldes baseados em polipeptídeos como uma fibronectina tipo Ill (Fn3) (ver patente U.S.

Nº: 6,703,199, que descreve minicorpos de polipeptídeo de fibronectina). O termo "scFv" se relaciona com uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um fragmento de anti- corpo compreendendo uma região variável de uma cadeia leve e pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variá- vel de uma cadeia pesada, em que as regiões variáveis da cadeia leve e pesada estão ligadas de modo contíguo, por exemplo, via um ligante sintético, por exemplo, um ligante polipeptídico curto flexível, e podem ser expressas como um polipeptídeo de cadeia única, e em que o scFv retém a especificidade do anticorpo intato de onde é derivado.

A me- nos que seja especificado, como usado aqui, um scFv pode ter as re- giões variáveis VL e VH em qualquer ordem, por exemplo, relativa- mente às extremidades N-terminal e C-terminal do polipeptídeo, o scFv pode compreender VL- ligante-VH ou pode compreender VH- li- gante-VL.

[0079] Os termos “região determinante de complementaridade” ou “CDR”, conforme usado no presente documento, se referem às se- quências de aminoácidos dentro de regiões variáveis de anticorpos que conferem especificidade e afinidade de ligação. Por exemplo, em geral existem três CDRs em cada região variável de cadeia pesada (por exemplo, HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e três CDRs em cada regi- ão variável de cadeia leve (por exemplo, LCDR1, LCDR2 e LCDR3). As fronteiras precisas de sequências de aminoácidos de uma dada CDR podem ser determinadas usando qualquer um dentre diversos esquemas bem conhecidos, incluindo os descritos por Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5º Ed. Pu- blic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (es- quema de numeração de “Kabat”), Al-Lazikani et a/., (1997) JMB 273, 927 a 948 (esquema de numeração de “Chothia”), ou uma combinação dos mesmos, e numeração de ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc, M.- P., The Immunologist, 7, 132 a 136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55 a 77 (2003) (esquema de numeração de "IMGT"). Em um esquema de numeração de Kabat e Chothia combi- nado para uma determinada região CDR (por exemplo, CDR1 de HC, CDR?2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC ou CDR3 de LC), em algumas modalidades, as CDRs correspondem aos resíduos de aminoácidos que são definidos como parte da CDR de Kabat, jun- tamente com os resíduos de aminoácidos que são definidos como par- te da CDR de Chothia. Conforme usado no presente documento, as CDRs definidas de acordo com o esquema de numeração de “Chothia” são também algumas vezes denominadas “alças hipervariáveis”.

[0080] Por exemplo, sob Kabat, os resíduos de aminoácidos de CDR no domínio variável de cadeia pesada (VH) são numerados 31 a

(HCDR1) (por exemplo, inserção (ou inserções) após a posição 35), 50 a 65 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácidos de CDR no domínio variável de cadeia leve (VL) são numerados 24 a 34 (LCDR1) (por exemplo, inserção (ou inserções) após a posição 27), 50 a 56 (LCDR2) e 89 a 97 (LCDR3). Como outro exemplo, sob Chothia, os aminoácidos de CDR na VH são numerados 26 a 32 (HCDR1) (por exemplo, inserção (ou inserções) após a posição 31), 52 a 56 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácidos na VL são numerados 26 a 32 (LCDR1) (por exemplo, inserção (ou inser- ções) após a posição 30), 50 a 52 (LCDR2) e 91 a 96 (LCDR3). Com- binando-se as definições de CDR tanto de Kabat quanto de Chothia, as CDRs compreendem ou consistem, por exemplo, nos resíduos de aminoácidos 26 a 35 (HCDR1), 50 a 65 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3) em VH humana e nos resíduos de aminoácidos 24 a 34 (LCDR1), 50 a 56 (LCDR2) e 89 a 97 (LCDR3) em VL humana. Sob IMGT, os resí- duos de aminoácidos de CDR no VH são numerados aproximadamen- te 26 a 35 (CDR1), 51 a 57 (CDR2) e 93 a 102 (CDR3), e os resíduos de aminoácidos de CDR no VL são numerados aproximadamente 27 a 32 (CDR1), 50 a 52 (CDR2) e 89 a 97 (CDR3) (numeração de acordo com “Kabat”). Sob IMGT, as regiões de CDR de um anticorpo podem ser determinadas com o uso do programa IMGT/DomainGap Align. Geralmente, a não ser que especificamente indicado, as moléculas de anticorpo podem incluir qualquer combinação de uma ou mais CDRs de Kabat e/ou CDRs de Chothia.

[0081] O termo “epítopo” inclui qualquer determinante proteico com capacidade para ligação específica a uma imunoglobulina ou inte- ração de outro modo com uma molécula. Os determinantes epitópicos consistem geralmente em agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou carboidrato ou cadeias laterais de açúcar e podem ter características estruturais tridimensio-

nais específicas, bem como características de carga específicas. Um epítopo pode ser “linear” ou “conformacional”. Os epítopos conforma- cionais e lineares são distinguidos pelo fato de a ligação ao primeiro, mas não ao último ser perdida na presença de solventes desnaturan- tes.

[0082] O termo "anticorpo monovalente", conforme usado no pre- sente documento, refere-se a um anticorpo que se liga a um epítopo único em uma molécula-alvo.

[0083] O termo "anticorpo bivalente", conforme usado no presente documento, refere-se a um anticorpo que se liga a dois epítopos em pelo menos duas moléculas-alvo idênticas. O anticorpo bivalente pode também reticular as moléculas-alvo umas às outras. Um "anticorpo bi- valente" também se refere a um anticorpo que se liga a dois epítopos diferentes em pelo menos duas moléculas-alvo idênticas.

[0084] O termo "anticorpo multivalente" refere-se a uma única mo- lécula de ligação com mais de uma valência, em que "valência" é des- crita como o número de porções químicas de ligação a antígeno pre- sentes por molécula de um construto de anticorpo. Desse modo, a mo- lécula de ligação única pode se ligar a mais de um sítio de ligação em uma molécula-alvo. Os exemplos de anticorpos multivalentes incluem, porém sem limitação, anticorpos bivalentes, anticorpos trivalentes, an- ticorpos tetravalentes, anticorpos pentavalentes, e similares, assim como anticorpos biespecíficos e anticorpos biparatópicos. Por exem- plo, por ENTPD?2, o anticorpo multivalente (por exemplo, um anticorpo biparatópico de ENTPD2) tem uma porção química de ligação para dois domínios de ENTPD?2, respectivamente.

[0085] O termo “anticorpo multivalente" também se refere a uma molécula de ligação única que tem mais de uma porção química de ligação a antígeno para duas moléculas-alvo separadas. Por exemplo, um anticorpo que se liga a ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana) e uma segunda molécula-alvo que não é ENTPD2. Em uma modalidade, um anticorpo multivalente é um anticorpo tetravalente que tem quatro domínios de ligação a epítopo. Uma molécula tetravalente pode ser biespecífico e bivalente para cada sítio de ligação nessa mo- lécula-alvo.

[0086] O termo "anticorpo biespecífico", conforme usado no pre- sente documento, refere-se a um anticorpo que se liga a dois ou mais epítopos diferentes. Em algumas modalidades, um anticorpo biespecí- fico que se liga a dois alvos diferentes. Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico se liga a dois epítopos diferentes em uma molé- cula-alvo única. Um anticorpo que se liga a dois epítopos diferentes em uma molécula-alvo única é também conhecido como um “anticorpo biparatópico”.

[0087] Os sintagmas “anticorpo monoclonal” ou “composição de anticorpo monoclonal”, conforme usado no presente documento, refe- re-se a polipeptídeos, incluindo anticorpos, anticorpos biespecíficos, etc., que têm sequência de aminoácidos substancialmente idêntica ou são derivados da mesma fonte genética. Esse termo também inclui preparações de moléculas de anticorpo de composição molecular úni- ca. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma única especi- ficidade e afinidade de ligação a um epítopo particular.

[0088] O sintagma “anticorpo humano", conforme usado no pre- sente documento, inclui anticorpos que têm regiões variáveis em que tanto as regiões de framework quanto CDR são derivadas de sequên- cias de origem humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma regi- ão constante, a região constante também é derivada de tais sequên- cias humanas, por exemplo, sequências de linhagem germinativa hu- mana, ou versões com mutação de sequências de linhagem germinati- va humana ou anticorpo contendo sequências de framework consenso derivadas da análise de sequências de framework humanas, por exemplo, conforme descrito em Knappik et al. (2000. J Mol Biol 296, 57 a 86). As estruturas e localizações dos domínios variáveis de imu- noglobulina, por exemplo, CDRs, podem ser definidas com o uso de esquemas de numeração bem conhecidos, por exemplo, o esquema de numeração Kabat, o esquema de numeração Chothia, ou uma combinação de Kabat e Chothia, e numeração ImMunoGenTics (IMGT) (consultar, por exemplo, Sequences of Proteins of Immunologi- cal Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et a/.; Al Lazikani et a/., (1997) J. Mol. Bio. 273:927 a 948); Kabat et a/l., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º edição, NIH Publicação nº 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et a/., (1987) J. Mol. Biol. 196:901 a 917; Chothia et a/., (1989) Nature 342:877 a 883; Al-Lazikani et a/l., (1997) J. Mal. Biol. 273:927 a 948 e Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132 a 136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol, 27, 55 a 77 (2003)).

[0089] Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro, ou por mutação somática in vivo, ou uma substituição conserva- dora para promover estabilidade ou fabricação). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, conforme usado no presente documento, não é concebido incluindo anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de framework hu- manas.

[0090] O sintagma “anticorpo humano recombinante”, conforme usado no presente documento, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recom- binantes, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo,

um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para ge- nes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir do mesmo, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpos hu- manos recombinantes e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolvem splicing de todo ou parte de um gene de imunoglobulina humana, sequências para outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm re- giões variáveis nas quais as regiões de framework e CDR são deriva- das de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombi- nantes podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando é usado um animal transgênico para sequências de Ig humanas, muta- gênese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL de anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertó- rio da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[0091] O termo “região Fc”, conforme usado no presente docu- mento, refere-se a um polipeptídeo que compreende a CH3, CH2 e pelo menos uma porção da região de dobradiça de um domínio cons- tante de um anticorpo. Opcionalmente, uma região Fc pode incluir um domínio CHA4, presente em algumas classes de anticorpo. Uma região Fc pode compreender a região de dobradiça inteira de um domínio constante de um anticorpo. Em uma modalidade, a invenção compre- ende uma região Fc e uma região CH1 de um anticorpo. Em uma mo- dalidade, a invenção compreende uma região Fc e uma região CH3 de um anticorpo. Em outra modalidade, a invenção compreende uma re- gião Fc, uma região CH1 e uma região Ckappa/lambda do domínio constante de um anticorpo. Em uma modalidade, uma molécula de li- gação da invenção compreende uma região constante, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada. Em uma modalidade, tal re- gião constante é modificada em comparação a uma região constante do tipo selvagem. Isto é, os polipeptídeos da invenção descritos no presente documento podem compreender alterações ou modificações a um ou mais dos três domínios constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) e/ou ao domínio de região constante de cadeia leve (CL). As modificações exemplificativas incluem adições, deleções ou substituições de um ou mais aminoácidos em um ou mais domínios. Tais alterações podem ser incluídas para otimizar a função efetora, meia-vida, etc.

[0092] Conforme usado no presente documento, o termo "afinida- de” refere-se à força de interação entre anticorpo e antígeno em sítios antigênicos únicos. Dentro de cada sítio antigênico, a região variável do "braço" de anticorpo interage através de forças não covalentes fra- cas com o antígeno em diversos sítios; quanto mais interações, mais forte a afinidade. Conforme usado no presente documento, o termo "alta afinidade" para um anticorpo IgG ou fragmento do mesmo (por exemplo, um fragmento Fab) se refere a um anticorpo que tem um knock down de 0º M ou menos, 10º M ou menos, ou 10º M, ou 10! M ou menos, ou 10? M ou menos, ou 103 M ou menos para um antí- geno alvo. Entretanto, a ligação de alta afinidade pode variar para ou- tros isotipos de anticorpo. Por exemplo, a ligação de alta afinidade pa- ra um isotipo IgM se refere a um anticorpo que tem um knock down de 107 M ou menos, ou 108 M ou menos.

[0093] Conforme usado no presente documento, o termo "avidez" refere-se a uma medida informativa da estabilidade ou resistibilidade geral do complexo anticorpo-antígeno. A mesma é controlada por três fatores principais: afinidade de epítopo de anticorpo; a valência tanto do antígeno quanto do anticorpo; e a disposição estrutural das partes que interagem. Por fim, esses fatores definem a especificidade do an- ticorpo, ou seja, a probabilidade de que o anticorpo particular esteja se ligando a um epítopo de antígeno específico.

[0094] O termo “especificidade de ligação”, conforme usado no presente documento, refere-se à capacidade de um sítio de combina- ção de anticorpo individual para reagir com um determinante antigêni- co e não com um determinante antigênico diferente. O sítio de combi- nação do anticorpo é localizado na porção Fab da molécula e é cons- truído a partir das regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve. A afinidade de ligação de um anticorpo é a força da reação entre um de- terminante antigênico único e m único sítio de combinação no anticor- po. A mesma é a soma das forças de atração e repulsão que operam entre o determinante antigênico e o sítio de combinação do anticorpo.

[0095] Os termos "tratar" e "tratamento" referem-se a tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar uma alteração ou distúrbio fisiológico indesejado. Para os propósitos desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém sem limitação, atenuação de sintomas, di- minuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (isto é, sem piorar), atraso ou retardamento da progressão da doença, ate- nuação ou paliação do estado de doença e remissão (parcial ou total), detectável ou não detectável. “Tratamento” também pode significar prolongamento da sobrevida em comparação com a sobrevida espe- rada se não receber tratamento. Em outras modalidades, os termos “tratar”, “tratamento” e “que trata” referem-se à inibição da progressão de um distúrbio proliferativo, fisicamente, por exemplo, por estabiliza- ção de um sintoma discernível, fisiologicamente, por exemplo, por es- tabilização de um parâmetro físico ou ambos. Em outras modalidades, os termos “tratar”, “tratamento” e “que trata” referem-se à redução ou estabilização do tamanho tumoral ou contagem de células cancerosas.

[0096] O termo "indivíduo" refere-se a um animal, humano ou não humano, ao qual é fornecido tratamento de acordo com os métodos da presente invenção. São contempladas aplicações veterinárias e não veterinárias. O termo inclui, porém sem limitação, mamíferos, por exemplo, humanos, outros primatas, porcos, roedores, tais como ca- mundongos e ratos, coelhos, porquinhos da índia, hamsters, vacas, cavalos, gatos, cães, ovelhas e cabras. Os indivíduos típicos incluem humanos, animais de fazenda e animais domésticos, tais como gatos e cães. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.

[0097] Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade sufici- ente para originar resultados benéficos ou desejados. Por exemplo, uma quantidade terapêutica é aquela que atinge o efeito terapêutico desejado. Essa quantidade pode ser igual ou diferente de uma quanti- dade profilaticamente eficaz, que é uma quantidade necessária para prevenir o surgimento de doença ou sintomas de doença. Uma quanti- dade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto terapêutico (isto é, uma dosagem eficaz) depende dos compostos terapêuticos selecionados. As composições podem ser administradas desde uma ou mais vezes ao dia até uma ou mais ve- zes por semana. O versado na técnica perceberá que certos fatores podem influenciar a dosagem e temporização necessárias para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo, porém sem limitação, a gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, o estado geral de saú- de e/ou idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos terapêuticos descritos no presente documento pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos.

[0098] O termo "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" refere-se a ácidos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e polímeros dos mesmos na forma de fita simples ou dupla. O termo "conjunto de ácidos nucleicos" pode incluir, por exemplo, ácidos nu- cleicos isolados separados que codificam uma cadeia leve e uma ca- deia pesada de um anticorpo ou domínios de um anticorpo biespeciífi- co ou multiespecífico. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotí- deos naturais que têm propriedades de ligação similares às do ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que indicado de ou- tro modo, uma sequência de ácido nucleico particular abrange também implicitamente variantes conservadoramente modificadas destes (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs e sequências de complementaridade, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, podem ser obtidas substitui- ções de códons degenerados gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de bases mistas e/ou desoxi-inosina (Batzer et al., Nu- cleic Acid Res. 19:5.081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2,605 a 2,608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91 a 98 (1994)).

[0099] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são usa- dos de forma intercambiável e referem-se a um composto constituído por resíduos de aminoácidos ligados covalentemente por ligações pep- tídicas. Uma proteína ou peptídeo deve conter, pelo menos, dois ami- noácidos, e nenhuma limitação é colocada no número máximo de ami- noácidos que uma sequência de proteína ou peptídeo pode compre- ender. Polipeptídeos incluem qualquer peptídeo ou proteína que com- preende dois ou mais aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas. Conforme usado no presente documento, o termo se refere a cadeias curtas, que também são vulgarmente referidas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, e com ca- deias mais longas, que geralmente são denominadas na técnica como proteínas, das quais há muitos tipos. "Polipeptídeos" incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substanci- almente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, aná- logos, proteínas de fusão, entre outros. Um polipeptídeo inclui um pep- tídeo natural, um peptídeo recombinante ou uma combinação destes.

[00100] O termo "modificações conservativas de sequências" se refere a modificações de aminoácidos que não afetam nem alteram significativamente as características de ligação do anticorpo ou frag- mento de anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Tais modi- ficações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. Modificações podem ser introduzidas em um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção por técnicas comuns conheci- das na técnica, tais como mutagênese dirigida a sítios e mutagênese mediada por PCR. Substituições conservativas de aminoácidos são tais que um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treoni- na, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, me- tionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, vali- na, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[00101] O termo “homólogo” ou “identidade” se relaciona com a identidade da sequência de subunidades entre duas moléculas polimé- ricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, tais como, duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas polipeptídicas. Quando uma posição de subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica; por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então são homólogas ou idênticas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função direta do número de posições correspondentes ou homólogas; por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero com dez subu- nidades de comprimento) das posições em duas sequências forem homólogas, as duas sequências são 50% homólogas; se 90% das po- sições (por exemplo, 9 de 10) forem correspondentes ou homólogas, as duas sequências são 90% homólogas. A porcentagem da “identida- de de sequência” pode ser determinada comparando-se duas sequên- cias idealmente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, em que o fragmento da sequência de aminoácidos na janela de compara- ção pode compreender adições ou deleções (por exemplo, lacunas ou saliência) em comparação à sequência de referência (que não com- preende adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas se- quências. A porcentagem pode ser calculada determinando-se o nú- mero de posições em que o mesmo resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições corresponden- tes, dividindo-se o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resul- tado por 100 para gerar a percentagem de identidade de sequência. A saída é a identidade percentual da sequência em questão em relação à sequência de consulta.

[00102] O termo “isolado” significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não está “isolado”, mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcial ou completamente separado dos materi- ais coexistentes de seu estado natural está “isolado”. Um ácido nu- cleico ou proteína isolado pode existir em forma substancialmente puri- ficada, ou pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula hospedeira. Um anticorpo isolado está substanci- almente isento de outros anticorpos que têm diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especifi- camente a ENTPD2 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes de ENTPD2). No entan- to, um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma molécula- alvo pode, no entanto, ter reatividade cruzada com os mesmos antíge- nos de outras espécies, por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a ENTPD2 pode se ligar a moléculas de ENTPD2 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substanci- almente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.

[00103] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente compreendido pelos versados na técnica à qual esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática da presente invenção, métodos e mate- riais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionados aqui são in- corporados por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, pre- valecerá o presente relatório descritivo, incluindo as definições. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos.

[00104] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras ca- racterísticas, objetivos e vantagens da invenção serão evidentes a par- tir da descrição e desenhos e a partir das reivindicações. Anticorpos e Fragmentos de Ligação a Antígeno dos Mesmos que se Liga Especificamente Á ENTPD2 Humana

[00105] Em um aspecto, são fornecidos no presente documento an- ticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, por exem- plo, anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à proteína ENTPD?2 ("anticor- pos de ENTPD?2 ou fragmentos de ligação a antígeno" ou "anticorpos anti-ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antígeno"). Em algumas mo- dalidades, são fornecidos no presente documento anticorpos ou frag- mentos de ligação a antígeno dos mesmos, por exemplo, anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à proteína ENTPD2 humana ("anticorpos de ENTPD2 humanos ou fragmentos de ligação a antígeno" ou "anticor- pos ENTPD? anti-humanos ou fragmentos de ligação a antígeno").

[00106] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, anticor- pos de ENTPD?2 anti-humanos ou fragmentos de ligação a antígeno) fornecidos no presente documento incluem uma CDR1 de cadeia pe- sada (HCDR1), uma CDR?2 de cadeia pesada (HCDR2), uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) e uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1), uma CDR?2 de cadeia leve (LCDR2) e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos de ENTPD2 anti- humanos ou fragmentos de ligação a antígeno) fornecidos no presente documento incluem uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende CDR1, CDR2 e CDR3. Em algumas moda-

lidades, os anticorpos anti-ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antí- geno (por exemplo, anticorpos de ENTPD2 anti-humanos ou fragmen- tos de ligação a antígeno) fornecidos no presente documento incluem uma sequência de cadeia lesada de comprimento completo (HC) e uma sequência de cadeia leve de comprimento completo (LC).

[00107] A Tabela 1 lista as sequências de anticorpos de ENTPD2 exemplificativos ou fragmentos de ligação a antígeno que se ligam es- pecificamente à proteína ENTPD2 humana.

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[00108] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de an- ticorpo de ENTPD2 anti-humano (por exemplo, um fragmento de liga- ção a antígeno) compreende um domínio de VH que tem uma sequên- cia de aminoácidos de qualquer domínio de VH descrito na Tabela 1. Outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ENTPD2 anti- humanos adequados (por exemplo, fragmentos de ligação a antígeno) podem incluir aminoácidos que sofreram mutação, mas têm pelo me- nos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade no domí- nio de VH com as regiões de VH representadas nas sequências des- critas na Tabela 1. A presente descrição, em determinadas modalida- des, fornece também anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam especifica- mente a ENTPD2 humana, em que os anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) compre- endem uma CDR de VH que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 1. Em modalidades particulares, a invenção fornece anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam especi- ficamente a ENTPD2 humana, que compreendem (ou, alternativamen- te, consistem em) uma, duas, três, quatro, cinco ou mais CDRs de VH que têm uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 1.

[00109] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de an- ticorpo de ENTPD?2 anti-humano (por exemplo, fragmento de ligação a antígeno) compreende um domínio de VL que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer domínio de VL descrito na Tabela 1. Outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ENTPD?2 anti-humanos ade- quados (por exemplo, fragmentos de ligação a antígeno) podem incluir aminoácidos que sofreram mutação, mas têm pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade no domínio de VL com as regiões de VL representadas nas sequências descritas na Tabela 1. À presente descrição fornece também anticorpos ou fragmentos de anti- corpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam especificamente a ENTPD2 humana, em que os anticorpos ou frag- mentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) compreendem uma CDR de VL que tem uma sequência de aminoáci- dos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 1. Em parti- cular, a invenção fornece anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação a antígeno) que se ligam especifica- mente a ENTPD2 humana, que compreendem (ou, alternativamente, consistem em) uma, duas, três ou mais CDRs de VL que têm uma se- quência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 1.

[00110] Outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ENTPD2 anti-humanos (por exemplo, fragmento de ligação a antígeno) descri- tos no presente documento incluem aminoácidos que sofreram muta- ção, mas têm pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade nas regiões CDR com as regiões CDR representadas nas sequências descritas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o mes- mo inclui sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos sofreram mutação nas regiões CDR em comparação com as regiões CDR representadas na sequência descrita na Tabela 1.

[00111] São também fornecidas no presente documento sequências de ácidos nucleicos que codificam VH, VL, cadeia pesada de compri- mento total e cadeia leve de comprimento total de anticorpos e frag- mentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam especifica- mente a ENTPD2 humana, por exemplo, as sequências de ácidos nu- cleicos na Tabela 1. Tais sequências de ácidos nucleicos podem ser otimizadas para expressão em células de mamífero.

[00112] Outros anticorpos contra ENTPD2 anti-humanos descritos no presente documento incluem aqueles em que os aminoácidos ou ácidos nucleicos que codificam os aminoácidos sofreram mutação, mas têm pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade com as sequências descritas na Tabela 1. Em algumas modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos incluem sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos sofreram mutação nas regiões variáveis em comparação com as regiões variáveis representadas na sequência descrita na Tabela 1, enquanto mantêm substancialmente a mesma atividade terapêutica.

[00113] Uma vez que cada anticorpo fornecido se liga a ENTPD2 humana, as sequências de cadeia pesada de comprimento total e de cadeia leve de comprimento total VH, VL (sequências de aminoácidos e as sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de ami- noácidos) podem ser “misturadas e correlacionadas” para criar outros anticorpos de ligação a ENTPD2 descritos no presente documento. Tais anticorpos de ligação a ENTPD2 “misturados e correlacionados” podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na téc- nica (por exemplo, ELISA, ensaios descritos na Exemplificação). Quando as cadeias são misturadas e correlacionadas, uma sequência VH de um emparelhamento VH/VL particular deve ser substituída por uma sequência VH estruturalmente similar. Uma sequência de cadeia pesada de comprimento total de um emparelhamento particular de ca- deia pesada de comprimento total / cadeia leve de comprimento total deve ser substituída por uma sequência de cadeia pesada de compri- mento total estruturalmente similar. Uma sequência VL de um empare- lhamento VH/VL particular deve ser substituída por uma sequência VL estruturalmente similar. Uma sequência de cadeia leve de comprimen- to total de um emparelhamento particular de cadeia pesada de com-

primento total / cadeia leve de comprimento total deve ser substituída por uma sequência de cadeia leve de comprimento total estruturalmen- te similar.

[00114] Consequentemente, em uma modalidade, a invenção for- nece um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo que tem: uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 10, 25, 33, 46, 70, 91, 115, 132, 145, 169, 225, 233, 241, 250, 264, 281, 328; e uma cadeia variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos se- lecionada dentre qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 21, 29, 57, 64, 74, 78, 102, 125, 156, 178, 229, 237, 257, 268, 287, 332; em que o anti- corpo se liga especificamente à ENTPD2 humana.

[00115] Em outra modalidade, a invenção fornece (i) um anticorpo monoclonal isolado que tem: uma cadeia pesada de comprimento completo (HC) que compreende uma sequência de aminoácidos sele- cionada dentre qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 12, 27, 35, 48, 72, 93, 117, 134, 147, 171, 227, 235, 243, 252, 266, 283, 330; e uma ca- deia leve de comprimento completo (LC) que compreende uma se- quência de aminoácidos selecionada dentre uma dentre SEQ ID NOs: 23, 31, 59, 66, 76, 80, 104, 127, 158, 180, 231, 239, 259, 270, 289, 334; ou (ii) uma proteína funcional que compreende uma porção de ligação a antígeno da mesma.

[00116] Em outra modalidade, a presente descrição fornece anti- corpos de ligação a ENTPD2 humanos ou fragmentos de anticorpo dos mesmos que compreendem a CDR1 de cadeia pesada, CDR2 e CDR3 e CDR1 de cadeia leve, CDR2 e CDR3 conforme descrito na Tabela 1, ou combinações das mesmas. As sequências de aminoáci- dos das CDR1s de VH dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 1,4, 6,7, 37, 40, 42, 43, 82, 85, 87, 88, 106, 109, 111, 112, 136, 139,

141, 142, 160, 163, 165, 166, 185, 187, 188, 206, 207, 208, 213, 214, 215, 272, 275, 277. As sequências de aminoácidos das CDR2s de VH dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 38, 41, 44, 83, 86, 89, 107, 110, 113, 129, 130, 131, 137, 140, 143, 161, 164, 167, 186, 189, 220, 222, 223, 245, 247, 248, 261, 273, 276, 279. As se- quências de aminoácidos das CDR3s de VH dos anticorpos são mos- tradas em SEQ ID NO: 3, 39, 68, 84, 108, 138, 162, 221, 246, 262, 277, 274, 9, 45, 69, 90, 114, 144, 168, 190, 224, 249, 263, 274, 280. As sequências de aminoácidos das CDR1s de VL dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 14, 17, 20, 50, 53, 56, 61, 62, 63, 95, 98, 101, 119, 122, 124, 149, 152, 155, 173, 175, 177, 198, 201, 254. As sequências de aminoácidos das CDR2s de VL dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 15, 18, 51, 54, 96, 99, 120, 150, 153, 199, 285, 286. As sequências de aminoácidos das CDR3s de VL dos anti- corpos são mostradas em SEQ ID NOs: 16, 19, 52, 55, 97, 100, 121, 123, 151, 154, 174, 176, 200, 255, 256.

[00117] Dado que cada um dos anticorpos se liga a ENTPD2 hu- mana e que a especificidade de ligação a antígeno é fornecida princi- palmente pelas regiões CDR1, CDR2 e CDR3, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VL podem ser “misturadas e correlacionadas” (isto é, CDRs de diferentes anticorpos podem ser misturadas e correlacionadas, em- bora cada anticorpo deva conter uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VL para criar outros anticorpos de liga- ção a ENTPD2 humanos descritas no presente documento. Tais anti- corpos de ligação a ENTPD2 “misturados e correlacionados” podem ser testados com o uso dos ensaios de ligação conhecidos na técnica e os ensaios descritos nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando as sequências de VH CDR são misturadas e correlacionadas, a se- quência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VH particular deve ser substituída por uma sequência (ou sequências) de CDR es- truturalmente similar. Similarmente, quando as sequências VL CDR são misturadas e correlacionadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VL particular deve ser substituída por uma sequência (ou sequências) de CDR estruturalmente similar. Será pron- tamente evidente para aquele de habilidade comum que sequências VH e VL inovadoras podem ser criadas substituindo-se uma ou mais sequências de região de CDR de VH e/ou VL por sequências estrutu- ralmente similares das sequências de CDR mostradas no presente do- cumento para anticorpos monoclonais da presente descrição.

[00118] Consequentemente, a presente descrição fornece um anti- corpo monoclonal isolado ou região de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma CDR1 de cadeia que compreende uma sequên- cia de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 7, 37, 40, 42, 43, 82, 85, 87, 88, 106, 109, 111, 112, 136, 139, 141, 142, 160, 163, 165, 166, 182, 187, 188, 206, 207, 208, 213, 214, 215, 272, 275, 277; uma CDR2 de cadeia que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 38, 41, 44, 83, 86, 89, 107, 110, 113, 129, 130, 131, 137, 140, 143, 161, 164, 167, 183, 189, 220, 222, 223, 245, 247, 248, 261, 273, 276; uma CDR3 de cadeia pesada que com- preende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, 39, 68, 84, 108, 138, 162, 221, 246, 262, 277, 274, 9, 45, 69, 90, 114, 144, 168, 190, 224, 249, 263, 274, 280; uma CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 17, 20, 50, 53, 56, 61, 62, 63, 95, 98, 101, 119, 122, 124, 149, 152, 155, 173, 175, 177, 195, 201, 254; uma CDR2 de cadeia le- ve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada den- tre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 15, 18, 51, 54, 96, 99, 120,

150, 153, 196, 285, 286; e uma CDR3 de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 16, 19, 52, 55, 97, 100, 121, 123, 151, 154, 174, 176, 197, 255, 256; em que o anticorpo se liga especificamente à ENTPD?2 humana.

[00119] Em determinadas modalidades, um anticorpo que se liga especificamente a ENTPD2 humana é um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação a antígeno) que é des- crito na Tabela 1.

[00120] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região determinante de complementaridade de ca- deia pesada 1 (HCDR1) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 4,6 ou 7; uma região determinante de complemen- taridade de cadeia pesada 2 (HCDR2) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 5 ou 8; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (HCDR3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 9; uma região deter- minante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1) que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 17, ou 20; uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (LCDR2) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15 ou 18; e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (LCDR3) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou 19.

[00121] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; uma HCDR3 que compreende a se-

quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[00122] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 4; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[00123] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 6; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[00124] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 7; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; uma HCDR3 que compreende a se-

quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[00125] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37, 40, 42 ou 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, 41 ou 44; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 ou 45; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 53 ou 56; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou 54; e uma LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 ou 55.

[00126] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00127] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 40; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; uma HCDR3 que compreende a se-

quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

[00128] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 42; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00129] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00130] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37, 40, 42 ou 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, 41 ou 44; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 ou 45; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, 62 ou 63; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou 54; e uma LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 ou 55.

[00131] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00132] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 40; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

[00133] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 42; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; uma HCDR3 que compreende a se-

quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00134] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00135] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37, 40, 42 ou 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, 41 ou 44; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 53 ou 56; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou 54; e uma LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 ou 55.

[00136] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; uma HCDR3 que compreende a se-

quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00137] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 40; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

[00138] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 42; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00139] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; uma HCDR3 que compreende a se-

quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00140] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 82, 85, 87 ou 88; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83, 86 ou 89; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 ou 90; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95, 98 ou 101; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 ou 99; e uma LCDR3 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 ou 100.

[00141] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 82; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97.

[00142] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 85; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; uma HCDR3 que compreende a se-

quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100.

[00143] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 87; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97.

[00144] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 88; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97.

[00145] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 106, 109, 111 ou 112; uma HCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, 110 ou 113;

uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 ou 114; uma LCDR1 que compreende a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 119, 122 ou 124; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 ou 120; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 ou

123.

[00146] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 106; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.

[00147] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 109; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 123.

[00148] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 111; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108.

[00149] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 112; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 124; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.

[00150] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 106, 109, 111 ou 112; uma HCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, 130 ou 131; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 ou 114; uma LCDR1 que compreende a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 119, 122 ou 124; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 ou 120; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 ou

123.

[00151] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci-

dos de SEQ ID NO: 106; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.

[00152] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 109; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 123.

[00153] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 111; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.

[00154] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci-

dos de SEQ ID NO: 112; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 124; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.

[00155] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 136, 139, 141 ou 142; uma HCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, 140 ou 143; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 138 ou 144; uma LCDR1 que compreende a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 149, 152 ou 155; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 ou 153; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 ou 154.

[00156] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 136; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 138; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 150; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.

[00157] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 139; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 140; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 138; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 154.

[00158] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 141; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 138; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 150; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.

[00159] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 142; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 143; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.

[00160] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 160, 163, 165 ou 166; uma HCDR2 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161, 164 ou 167; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162 ou 168; uma LCDR1 que compreende a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 173, 175 ou 177; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 ou 153; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174 ou 176.

[00161] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 160; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 173; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 150; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174.

[00162] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 163; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 175; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 176.

[00163] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 165; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 173; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 150; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174.

[00164] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 166; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 167; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 177; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174.

[00165] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37, 40, 42 ou 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220, 222 ou 223; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221 ou 224; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 61, 62 ou 63; uma LCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 ou 55.

[00166] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00167] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 40; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

[00168] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 42; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00169] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 224; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00170] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37, 40, 42 ou 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220, 222 ou 223; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou 69; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, 62 ou 63; uma LCDR2 que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou 54; e uma LCDR3 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 ou 55.

[00171] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 37; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00172] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 40; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

[00173] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 42; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00174] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 43; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; uma LCDR1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[00175] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1, 4, 6 ou 7; uma HCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 245, 247 ou 248; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246 ou 249; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 17, 20 ou 254; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou 18; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 255 ou

256.

[00176] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 245; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 255.

[00177] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 4; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 247; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 256.

[00178] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 6; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 255.

[00179] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 7; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 248; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 249; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 255.

[00180] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1, 4, 6 ou 7; uma HCDR2 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 247, 248 ou 261; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 262 ou 263; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 17, 20 ou 254; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou 18; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou

19.

[00181] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 261; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 262; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[00182] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 4; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 247; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 262; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[00183] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 6; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 261; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 262; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 16.

[00184] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 7; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 248; uma HCDR3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 263; uma LCDR1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[00185] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 272, 275 ou 278; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 273, 276 ou 279; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 274, 277 ou 280; uma LCDR1 que compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 17, 20 ou 254; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 285 ou 286; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou 19.

[00186] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 272; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 273; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 274; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

285; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[00187] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 275; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 276; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 274; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 286; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[00188] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 277; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 273; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 274; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 285; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[00189] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma HCDR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 278; uma HCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 279; uma HCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 280; uma LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; uma LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

286; e uma LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[00190] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00191] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00192] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções,

deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00193] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00194] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00195] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre-

ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00196] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00197] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00198] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 125 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00199] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 125 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00200] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00201] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 178 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00202] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 225 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 229 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00203] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 237 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00204] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 241 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 229 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00205] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 250 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 257 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00206] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 264 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 268 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00207] Em algumas modalidades, o anticorpo ou região de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPD2 humana compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 281 (ou uma se- quência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 287 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inser- ções, deleções ou modificações).

[00208] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00209] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00210] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00211] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00212] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00213] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00214] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00215] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00216] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00217] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 134 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00218] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 147 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00219] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 180 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substi- tuições, inserções, deleções ou modificações).

[00220] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 227 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 231 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00221] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi-

camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 235 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 239 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00222] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 231 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00223] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 252 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 259 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00224] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi-

camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 266 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 270 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00225] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a ENTPD2 humana compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 283 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou modificações), e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 289 (ou uma sequência pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma e/ou que tem um, duas, três ou mais substituições, inserções, deleções ou mo- dificações).

[00226] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína ENTPD2 humana com uma constante de dissociação (Kp) menor que 10 nM, por exemplo, uma Kp menor que 9 nM, menor que 8 NM, menor que 7 nM, menor que 6 nM, menor que 5 nM, menor que 4 NM, menor que 3 nM, menor que 2 nM, menor que 1 nM, por exemplo, conforme medido por Biacore. Em algumas modalidades, os anticor- pos ou fragmentos de ligação a antígeno fornecidos no presente do- cumento se ligam à ENTPD2 humana com uma constante de dissocia- ção (Kp) menor que 5 nM, por exemplo, conforme medido por Biacore. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno fornecidos no presente documento se ligam à proteína EN- TPD2 humana com uma constante de dissociação (Ko) menor que 3 NM, por exemplo, conforme medido por Biacore. Em algumas modali- dades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno fornecidos no presente documento se ligam à proteína ENTPD2 humana com uma constante de dissociação (Ko) menor que 1 nM, por exemplo, conforme medido por Biacore. Em algumas modalidades, a constante de dissociação dos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos no presente documento à ENTPD2 humana é medida por Biacore a 25 ºC.

[00227] São também fornecidos no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam espe- cificamente a um epítopo em ENTPD2 humana, em que o epítopo compreende pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois, pelo me- nos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, pelo menos quator- ze, pelo menos quinze, pelo menos vinte) dos seguintes resíduos: His50, Asp76, Pro78, Gly79, GIy80, Tyr8ê5, Asp87, Asn88, Gly91, GIn94, Ser95, Gly98, Glu101, GIn102, GIn105, Asp106, Arg245, Thr272, Gln273, Leu275, Asp278, Arg298, Ala347, Ala350, Thr351, Arg392, Ala393, Arg394 ou Tyr398. Em algumas modalidades, tais an- ticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno incluem, porém sem limi- tação, MAb1, MAb2, MAb3, MAb7, MAb17, MAb19, MAb20, MAb21e Fab23, conforme descrito na Tabela 1.

[00228] São também fornecidos no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam espe- cificamente a um epítopo em ENTPD2 humana, em que o epítopo compreende pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois, pelo me- nos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, pelo menos quator- ze, pelo menos quinze, pelo menos vinte) dos seguintes resíduos: Gly79, GIn250, Leu253, Trp266, Arg268, Gly269, Phe270, Ser271, Thr272, Gln273, Val274, Leu275, Asp278, Arg298, Ser300, Ser302, GlIy303, Thr380, Trp381, Ala382, Gly390, GIn391, Arg392, Ala393, Arg394 ou Asp397. Em algumas modalidades, tais anticorpos ou frag- mentos de ligação a antígeno incluem, porém sem limitação, MADbA, MAb5, MAb6, MAb16, MAb18 e Fab22, conforme descrito na Tabela 1.

[00229] “Uma vez que um epítopo desejado em um antígeno é de- terminado, é possível gerar anticorpos para esse epítopo, por exem- plo, com o uso das técnicas descritas na presente invenção. Alternati- vamente, durante o processo de descrição, a geração e caracterização de anticorpos pode elucidar as informações sobre os epítopos desejá- veis. A partir dessas informações, é, então, possível triar competitiva- mente os anticorpos para ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para alcançar isso é conduzir estudos de competição cruzada para en- contrar anticorpos que se ligam competitivamente uns aos outros, por exemplo, os anticorpos competem pela ligação ao antígeno. Um pro- cesso de alto rendimento para “binagem” de anticorpos com base em sua competição cruzada é descrito no Pedido de Patente Internacional nº WO 2003/48731. Conforme será entendido por uma pessoa versada na técnica, praticamente qualquer coisa à qual um anticorpo pode se ligar especificamente poderia ser um epítopo. Um epítopo pode com- preender aqueles resíduos aos quais o anticorpo se liga.

[00230] De modo geral, os anticorpos específicos para um antíge- no-alvo particular reconhecerão preferencialmente um epítopo no antí- geno-alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromolécu- las.

[00231] As regiões de um dado polipeptídeo que incluem um epíto-

po podem ser identificadas com o uso de qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopo, bem conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biol- ogy, Volume 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996, Humana Press, Totowa, N.J). Por exemplo, os epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, sintetizando-se concomitantemente grandes números de peptídeos em suportes sólidos, em que os peptídeos correspondem às porções da molécula de proteína, e reagindo-se os peptídeos com an- ticorpos enquanto os peptídeos estão ainda fixados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, na Pa- tente nº U.S. 4.708.871; Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 8:3,998 a 4,002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:78 a 182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709 a 715. Simi- larmente, os epítopos conformacionais são prontamente identificados determinando-se a conformação espacial de aminoácidos, tal como, por exemplo, por cristalografia de raios X e ressonância magnética nu- clear bidimensional. Consultar, por exemplo, Epitope Mapping Proto- cols, supra. As regiões antigênicas de proteínas podem ser também identificadas com o uso de plotagens de hidropatia e antigenicidade padrão, tais como aquelas calculadas com o uso, por exemplo, do programa de software Omiga versão 1,0 disponível junto ao Oxford Molecular Group. Esse programa de computador emprega o método de Hopp/Woods, Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 78:3,824 a 3,828; para determinar os perfis de antigenicidade, e a téc- nica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., (1982) J. Mol. Biol. 157:105 a 132; para plotagens de hidropatia.

[00232] A molécula de anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. Um anticorpo monocional pode ser pre- parado por tecnologia de hibridoma ou por métodos que não usam tecnologia de hibridoma (por exemplo, métodos recombinantes). Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser produzido de modo re- combinante, por exemplo, produzido por exibição de fago ou por mé- todos combinatórios.

[00233] “Métodos combinatoriais e de exibição de fago para gerar anticorpos são conhecidos na técnica (conforme descrito, por exemplo, em Ladner et al. Patente nº U.S. 5.223.409; Kang et al. Publicação in- ternacional nº WO 92/18619; Dower et al. Publicação internacional nº WO 91/17271; Winter et al. Publicação internacional nº WO 92/20791; Markland et al. Publicação internacional nº WO 92/15679; Breitling et al. Publicação internacional nº WO 93/01288; McCafferty et al. Publi- cação internacional nº WO 92/01047; Garrard et al. Publicação inter- nacional nº WO 92/09690; Ladner et al. Publicação internacional nº WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1,370 a 1,372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81 a 85; Huse et al. (1989) Science 246:1,275 a 1,281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725 a 734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889 a 896; Clack- son et al. (1991) Nature 352:624 a 628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3,576 a 3,580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1,373 a 1,377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4,133 a 4,137; e Barbas et al. (1991) PNAS 88:7,978 a 7,982).

[00234] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo comple- tamente humano (por exemplo, um anticorpo produzido em um ca- mundongo que foi geneticamente modificado para produzir um anti- corpo a partir de uma sequência de imunoglobulina humana), ou um anticorpo não humano, por exemplo, um anticorpo de roedor (camun- dongo ou rato), cabra, primata (por exemplo, macaco), camelo.

[00235] “Um anticorpo pode ser aquele em que a região variável, ou uma porção da mesma, por exemplo, as CDRs, é gerada em um orga- nismo não humano, por exemplo, um rato ou camundongo. Os anti- corpos quiméricos, com enxerto de CDR, e humanizados são abrangi-

dos pela invenção. Os anticorpos gerados em um organismo não hu- mano, por exemplo, um rato ou camundongo e, então, modificados, por exemplo, no framework variável ou na região constante, para dimi- nuir a antigenicidade em um ser humano são abrangidos pela inven- ção.

[00236] Anticorpos quiméricos e/ou humanizados podem ser gene- ticamente modificados para minimizar a resposta imune de um pacien- te humano a anticorpos produzidos em indivíduos não humanos ou derivados da expressão de genes de anticorpos não humanos. Os an- ticorpos quiméricos compreendem uma região variável de anticorpo de animal não humano e uma região constante de anticorpo humano. Es- ses anticorpos retêm a especificidade de ligação a epítopo do anticor- po monoclonal original, mas podem ser menos imunogênicos quando administrados a seres humanos e, portanto, com maior probabilidade de serem tolerados pelo paciente. Por exemplo, uma ou todas (por exemplo, uma, duas ou três) as regiões variáveis da cadeia (ou cadei- as) leve e/ou uma ou todas (por exemplo, uma, duas ou três) as regi- ões variáveis da cadeia (ou cadeias) pesada de um anticorpo de ca- mundongo (por exemplo, um anticorpo monoclonal de camundongo) podem ser unidas a uma região constante humana, tal como, sem limi- tação, uma região constante humana de IgG1. Os anticorpos mono- clonais quiméricos podem ser produzidos por técnicas de DNA recom- binante conhecidas na técnica. Por exemplo, um gene que codifica a região constante de uma molécula de anticorpo não humano pode ser substituído por um gene que codifica uma região constante humana (consultar Robinson et al, Publicação de Patente PCT PCT/US86/02269; Akira, et al., Pedido de Patente nº EP 184.187; ou Taniguchi, M., Pedido de Patente nº EP 171.496). Além disso, outras técnicas adequadas que podem ser usadas para gerar anticorpos qui- méricos são descritas, por exemplo, nas Patentes nº U.S. 4.816.567;

4.978.775; 4.975.369; e 4.816.397.

[00237] Um anticorpo quimérico pode ser, ainda, "humanizado" substituindo-se porções da região variável não envolvidas em ligação de antígeno por porções equivalentes de regiões variáveis humanas. Os anticorpos humanizados compreendem uma ou mais regiões de framework na região variável juntamente com regiões determinantes de complementaridade (CDRs) não humanas (por exemplo, camun- dongo, rato ou hamster) da cadeia pesada e/ou leve. Em algumas mo- dalidades, um anticorpo humanizado compreende sequências que são inteiramente humanas, exceto pelas regiões CDR. Os anticorpos hu- manizados são tipicamente menos imunogênicos para humanos, em relação aos anticorpos não humanizados e, portanto, oferecem benefí- cios terapêuticos em certas situações. Os anticorpos de ENTPD2 hu- manizados podem ser gerados com o uso de métodos conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Hwang et al., Methods 36:35, 2005; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:10,029 a 10,033, 1989; Jones et al., Nature 321:522 a 525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323 a 327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1,534 a 1,536, 1988; Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86: 3,833 a 3,837, 1989; nº U.S. 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370; e WO 90/07861.

[00238] Os anticorpos de ENTPD2 humanos podem ser gerados com o uso de métodos que são conhecidos na técnica. Por exemplo, a tecnologia de engenharia de humanização usada para converter anti- corpos não humanos em anticorpos humanos geneticamente modifi- cados. A Publicação de Patente nº U.S. 20050008625 descreve um método in vivo para substituir um uma região variável de anticorpo não humano por uma região variável humana em um anticorpo enquanto mantém características de ligação iguais ou fornece melhores em rela- ção àquelas do anticorpo não humano. O método baseia-se em substi-

tuição guiada por epítopo de regiões variáveis de um anticorpo de re- ferência não humano por um anticorpo completamente humano. O an- ticorpo humano resultante, de modo geral, não está estruturalmente relacionado ao anticorpo não humano de referência, mas se liga ao mesmo epítopo do mesmo antígeno que o anticorpo de referência. Em resumo, a abordagem de substituição de complementaridade guiada por epítopo em série é possibilitada promovendo-se uma competição em células entre um "competidor" e uma biblioteca de diversos híbri- dos do anticorpo de referência ("anticorpos de teste") pela ligação a quantidades limitantes de antígeno na presença de um sistema repór- ter que responde à ligação de anticorpo de teste a antígeno. O compe- tidor pode ser o anticorpo de referência ou derivado do mesmo, tal como um fragmento Fv de cadeia única. O competidor pode ser tam- bém um ligante natural ou artificial do antígeno que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência. Os únicos requisitos do compe- tidor são que se ligue ao mesmo epítopo que o anticorpo de referên- cia, que que compita com o anticorpo de referência pela ligação a an- tígeno. Os anticorpos de teste têm uma região V de ligação a antígeno em comum em relação ao anticorpo de referência não humano, e a outra região V selecionada aleatoriamente a partir de uma fonte diver- sa, tal como uma biblioteca de repertório de anticorpos humanos. À região V comum do anticorpo de referência serve como um guia, posi- cionando os anticorpos de teste no mesmo epítopo no antígeno, e na mesma orientação, de modo que a seleção seja inclinada à fidelidade de ligação a antígeno mais alta ao anticorpo de referência.

[00239] Muitos tipos de sistema repórter podem ser usados para detectar interações desejadas entre anticorpos de teste e antígeno. Por exemplo, fragmentos repórter complementares podem ser ligados a antígeno e anticorpo de teste, respectivamente, de modo que a ati- vação de repórter por complementação de fragmento ocorra apenas quando o anticorpo de teste se liga ao antígeno. Quando as fusões de anticorpo de teste e antígeno-fragmento repórter são coexpressas com um competidor, a ativação de repórter se torna dependente da capaci- dade do anticorpo de teste de competir com o competidor, que é pro- porcional à afinidade do anticorpo de teste ao antígeno. Outros siste- mas repórter que podem ser usados incluem o reativador de um sis- tema de reativação de repórter autoinibido (RAIR) conforme descrito no pedido de patente de número de série U.S. 10/208.730 (Publicação nº 20030198971) ou sistema de ativação competitivo descrito no pedi- do de patente de número de série U.S. 10/076.845 (Publicação nº 20030157579).

[00240] Como sistema de substituição de complementaridade gui- ada por epítopo, a seleção é realizada para identificar células que ex- pressam um único anticorpo de teste juntamente com o competidor, antígeno e componentes repórter. Nessas células, cada anticorpo de teste compete individualmente com o competidor pela ligação a uma quantidade limitante de antígeno. A atividade do repórter é proporcio- nal à quantidade de antígeno ligado ao anticorpo de teste, que, por sua vez, é proporcional à afinidade do anticorpo de teste ao antígeno e à estabilidade do anticorpo de teste. Os anticorpos de teste são inici- almente selecionados com base em sua atividade em relação àquela do anticorpo de referência quando expresso como o anticorpo de tes- te. O resultado da primeira rodada de seleção é um conjunto de anti- corpos "híbridos", cada um dos quais é compreendido pela mesma re- gião V não humana do anticorpo de referência e uma região V humana da biblioteca, e cada um dos quais se liga ao mesmo epítopo no antí- geno que o anticorpo de referência. Um ou mais dos anticorpos híbri- dos selecionados na primeira rodada terá uma afinidade ao antígeno comparável ou maior que aquela do anticorpo de referência.

[00241] Na segunda etapa de substituição de região V, as regiões V humanas selecionadas na primeira etapa são usadas como guia para a seleção de substituições humanas pela região V de anticorpo de re- ferência não humano remanescentes com uma biblioteca diversa de regiões V humanas cognatas. Os anticorpos híbridos selecionados na primeira rodada podem ser também usados como competidores para a segunda rodada de seleção. O resultado da segunda rodada de sele- ção é um conjunto de anticorpos completamente humanos que diferem estruturalmente do anticorpo de referência, mas que competem com o anticorpo de referência pela ligação ao mesmo antígeno. Alguns dos anticorpos humanos selecionados se ligam ao mesmo epítopo que o mesmo antígeno que o anticorpo de referência. Entre esses anticorpos humanos selecionados, um ou mais se ligam ao mesmo epítopo com uma afinidade que é comparável ou maior que aquela do anticorpo de referência.

[00242] Como uso de um anticorpo de ENTPD2 de camundongo ou quimérico, podem ser gerados anticorpos humanos que se ligam à ENTPD2 humana com a mesma especificidade de ligação e afinidade de ligação igual ou melhor. Adicionalmente, tais anticorpos de EN- TPD2 humanos podem ser também comercialmente obtidos junto a empresas que normalmente produzem anticorpos humanos, por exemplo, KaloBios, Inc. (Mountain View, Calif.).

[00243] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína ENTPD2 humana e modula uma ou mais atividades/funções de ENTPD?2, por exemplo, inibindo as atividades enzimáticas de EN- TPD2 humana, por exemplo, em pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%. Em algumas modalidades, a atividade enzimática de ENTPD2 humana é medida com o uso de um ensaio FRET in vitro, que mede a hidrólise de ATP a ADP por ENTPD2 recombinante ou ENTPD2 ex-

pressa na superfície de células.

[00244] Em algumas modalidades, os anticorpos contra ENTPD2 anti-humanos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos des- critos no presente documento inibem a capacidade da ENTPD?2 de hi- drólise de adenosina trifosfato (ATP). Em algumas modalidades, a ca- pacidade da ENTPD?2 de hidrólise de ATP é medida com o uso de um ensaio FRET in vitro, que mede a hidrólise de ATP a ADP por EN- TPD?2 recombinante ou ENTPD?2 expressa na superfície de células.

[00245] Em algumas modalidades, os anticorpos contra ENTPD2 anti-humanos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos des- critos no presente documento interferem na ligação de ATP a ENTPD2 ou prendem a ATP dentro do domínio catalítico de ENTPD2. Em al- gumas modalidades, a interferência na ligação de ATP à ENTPD2 ou aprisionamento de ATP dentro do domínio catalítico de ENTPD2 é medida com o uso de um ensaio FRET in vitro que mede a hidrólise de ATP em ADP por ENTPD2 recombinante ou ENTPD2 expressa na su- perfície de células. Anticorpos e Fragmentos de Ligação a Antígeno dos Mesmos que se Liga Especificamente Á ENTPD2 de Camundongo

[00246] São fornecidos também no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, por exemplo, anti- corpos monoclionais ou fragmentos de ligação a antígeno dos mes- mos, que se ligam especificamente à proteína ENTPD2 de camundon- go. A Tabela 26 lista as sequências de anticorpos de ENTPD2 exem- plificativos ou fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especifi- camente à proteína ENTPD2 de camundongo.

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[00247] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de an- ticorpo de ENTPD2 anticamundongo (por exemplo, um fragmento de ligação a antígeno) compreende um domínio de VH que tem uma se- quência de aminoácidos de qualquer domínio de VH descrito na Tabe- la 26. Outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ENTPD?2 anti- camundongos adequados (por exemplo, fragmentos de ligação a antí- geno) podem incluir aminoácidos que sofreram mutação, mas têm pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade no do- mínio de VH com as regiões de VH representadas nas sequências descritas na Tabela 26. A presente descrição, em determinadas moda- lidades, fornece também anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam especifica- mente a ENTPD2 de camundongo, em que os anticorpos ou fragmen- tos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) compreendem uma CDR de VH que tem uma sequência de aminoáci- dos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 26. Em mo- dalidades particulares, a invenção fornece anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam especificamente a ENTPD2 de camundongo, que compreendem (ou, alternativamente, consistem em) uma, duas, três, quatro, cinco ou mais CDRs de VH que têm uma sequência de aminoácidos de qual- quer uma das CDRs de VH listadas na Tabelas 26.

[00248] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de an- ticorpo de ENTPD2 anticamundongo (por exemplo, fragmento de liga- ção a antígeno) compreende um domínio de VL que tem uma sequên- cia de aminoácidos de qualquer domínio de VL descrito na Tabela 26. Outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ENTPD2 anticamun- dongos adequados (por exemplo, fragmentos de ligação a antígeno) podem incluir aminoácidos que sofreram mutação, mas têm pelo me- nos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade no domí-

nio de VL com as regiões de VL representadas nas sequências descri- tas na Tabela 26. A presente descrição fornece também anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antí- geno) que se ligam especificamente a ENTPD2 de camundongo, em que os anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmen- tos de ligação ao antígeno) compreendem uma CDR de VL que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL lis- tadas na Tabela 26. Em particular, a invenção fornece anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação a antí- geno) que se ligam especificamente a ENTPD2 de camundongo, que compreendem (ou, alternativamente, consistem em) uma, duas, três ou mais CDRs de VL que têm uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 26.

[00249] Outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ENTPD2 anticamundongo (por exemplo, fragmento de ligação a antígeno) des- critos no presente documento incluem aminoácidos que sofreram mu- tação, mas têm pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade nas regiõêês CDR com as regiões CDR representadas nas sequências descritas na Tabela 26. Em algumas modalidades, o mesmo inclui sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos sofreram mutação nas regiões CDR em comparação com as regiões CDR representadas na sequência descrita na Tabela 26.

[00250] São também fornecidas no presente documento sequências de ácidos nucleicos que codificam VH, VL, cadeia pesada de compri- mento total e cadeia leve de comprimento total de anticorpos e frag- mentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam especifica- mente a ENTPD2 de camundongo, por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos na Tabela 26. Tais sequências de ácidos nucleicos podem ser otimizadas para expressão em células de mamífero.

[00251] São também fornecidos no presente documento anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam espe- cificamente a um epítopo em ENTPD2 de camundongo, em que o epí- topo compreende pelo menos um (por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, pelo menos quatorze, pelo menos quinze, pelo menos vinte) dos seguintes resí- duos: Ser74, Cys75, Asp76, Tyr349, Tyr350, Asp353, Phe354, Thr357, Val358, GIy360, GIn385, Ala386, Arg387, Val388, Pro389, Gly390, GIn391, Thr393, Arg394 ou Tyr398. Framework e Anticorpos Geneticamente Modificados ou Modifi- cados

[00252] "Um anticorpo da invenção pode ser, ainda, preparado com o uso de um anticorpo que tem uma ou mais das sequências de VH e/ou VL como material de partida para modificar geneticamente um anticorpo modificado, em que o anticorpo modificado pode ter proprie- dades alteradas em relação ao anticorpo de partida. Um anticorpo po- de ser geneticamente modificado modificando-se um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de framework. Adicional ou alternativamente, um anti- corpo pode ser geneticamente modificado modificando-se resíduos dentro da região (ou regiões) constante, por exemplo, para alterar a função (ou funções) efetora do anticorpo.

[00253] Um tipo de modificação genética da região variável que po- de ser realizada é o enxerto de CDR. Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoáci- dos que estão localizados nas seis regiões determinantes de comple- mentaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). Por essa razão, as se-

quências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre os anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRs. Uma vez que as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das intera- ções anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinan- tes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos construindo-se vetores de expressão que incluem sequên- cias de CDR do anticorpo de ocorrência natural específico enxertado em sequências de framework de um anticorpo diferente com proprie- dades diferentes (consultar, por exemplo, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323 a 327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522 a 525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., EUA 86:10,029 a 10,033; Pa- tente nº U.S. 5.225.539 de Winter, e as Patentes nº U.S. 5.530.101;

5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 por Queen et al.)

[00254] Tais sequências de framework podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpo de linhagem germinativa ou sequências de anticorpo reorganizadas. Por exemplo, as sequências de DNA de linhagem germinativa para genes humanos de região vari- ável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas no banco de da- dos de sequência de linhagens germinativas humanas "VBase" (dispo- nível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), assim como em Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, Quinta Edição, U.S. Department of Health e Human Services, Pu- blicação NIH nº 91 a 3242; Tomlinson, |. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776 a 798; e Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J imunol. 24:827 a 836). ; Por exemplo, as sequências de DNA de linhagem germinativa para genes de região variável de cadeia leve e pesada humanos e sequên- cias de anticorpo reorganizadas podem ser encontradas no banco de dados "IMGT" (disponível na Internet em www.imgt.org; consultar Le- franc, M.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209 a 212).

[00255] Um exemplo de sequências de framework para uso nos an- ticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção são aqueles que são estruturalmente similares às sequências de fra- mework usadas por anticorpos selecionados e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção, por exemplo, sequências consen- so e/ou sequências de framework usadas por anticorpos monoclonais da invenção. As sequências de CDR1, 2 e 3 de VH, e as sequências de CDR1, 2 e 3 de VL, podem ser enxertadas em regiões de fra- mework que têm a sequência idêntica àquela encontrada no gene da imunoglobulina da linhagem germinativa da qual a sequência de fra- mework deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões de framework que contêm uma ou mais mutações em compa- ração com as sequências da linhagem germinativa. Por exemplo, veri- ficou-se que, em certos casos, é benéfico realizar mutação de resí- duos dentro das regiões de framework para manter ou aumentar a ca- pacidade de ligação a antígeno do anticorpo (consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 por Que- en etal.)

[00256] Outro tipo de modificação de região variável é realizar mu- tação dos resíduos de aminoácido dentro de regiões de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL, para melhorar, assim, uma ou mais propri- edades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecido como “maturação de afinidade." Mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a mutação (ou mutações) e o efeito na ligação ao anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo conforme descrito no presente documento e fornecido nos Exemplos. Modificações conservadoras (conforme discutido aci- ma) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Além disso, tipicamente no má-

ximo um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região de CDR são alterados.

[00257] Uma grande variedade de frameworks ou arcabouços de anticorpo/imunoglobulina pode ser empregada, desde que o polipeptí- deo resultante inclua pelo menos uma região de ligação que se ligue especificamente a ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana). Tais estruturas ou arcabouços incluem os 5 idiotipos principais de imunoglobulinas humanas ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e incluem imunoglobulinas de outras espécies animais, de preferência, que têm aspectos humanizados. Anticorpos de cadeias pesadas únicas, tais como os identificados em camelídeos, são de particular interesse nesse sentido. Novos frameworks, arcabouços e fragmentos continuam a ser descritos e desenvolvidos pelos versados na técnica.

[00258] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um méto- do para gerar anticorpos não baseados em imunoglobulina com o uso de arcabouço de não imunoglobulina, em que as CDRs da invenção podem ser enxertadas. Frameworks e arcabouço de não imunoglobuli- na conhecidos ou futuros podem ser empregados, desde que compre- endam uma região de ligação específica para a proteína alvo de prote- ína ENTPD2 alvo. Frameworks ou arcabouços conhecidos de não imunoglobulinas incluem, porém sem limitação, fibronectina (Com- pound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurique, Suíça), domínios de anticorpos (Domantis, Ltd., Cam- bridge, MA e Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteo- lab AG, Freising, Alemanha), pequenos imuno-farmacêuticos modula- res (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicorpos (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suécia) e afilina (gama-cristalina ou ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha).

[00259] Os arcabouços de fibronectina baseiam-se no domínio de fibronectina do tipo Ill (por exemplo, o décimo módulo da fibronectina do tipo Ill (domínio 10 Fn3)). O domínio de fibronectina do tipo Ill tem 7 ou 8 fitas beta que estão distribuídas entre duas folhas beta, que se empacotam umas contra as outras para formar o núcleo da proteína, e contendo ainda alças (análogas a CDRs) que conectam as fitas beta umas às outras e são expostas a solventes. Há pelo menos três des- sas alças em cada borda do sanduíche de folha beta, onde a borda é o limite da proteína perpendicular à direção das cadeias beta (consultar o documento nº US 6.818.418). Esses arcabouços baseados em fi- bronectina não são uma imunoglobulina, embora a dobra global esteja intimamente relacionada àquela do menor fragmento de anticorpo fun- cional, a região variável da cadeia pesada, que compreende a unidade de reconhecimento de antígeno inteira na IgG de camelo e lhama. De- vido a esta estrutura, o anticorpo de não imunoglobulina imita proprie- dades de ligação a antígeno que são similares em natureza e afinida- de àquelas de anticorpos. Esses arcabouços podem ser usados em uma estratégia de aleatorização e de embaralhamento de alças in vitro que é similar ao processo de maturação por afinidade de anticorpos in vivo. Essas moléculas à base de fibronectina podem ser usadas como arcabouços em que as regiões de alça da molécula podem ser substi- tuídas por CDRs da presente descrição com o uso de técnicas de clo- nagem convencionais.

[00260] A tecnologia da anquirina baseia-se no uso de proteínas com módulos de repetição derivados da anquirina como arcabouços para portar regiões variáveis que podem ser usadas para ligação a di- ferentes alvos. O módulo de repetição de anquirina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos que consiste em duas hélices alfa antiparalelas e uma volta beta. A ligação das regiões variáveis é otimizada principal- mente com o uso de exibição de ribossomo.

[00261] —Avímeros são derivados de proteínas contendo o domínio À natural, tal como LRP-1. Esses domínios são usados por natureza pa- ra interações proteína-proteína e, em mais de 250 proteínas humanas, são estruturalmente baseados em domínios A. Os avímeros consistem em vários monômeros de "domínio A" diferentes (2 a 10) ligados atra- vés de ligantes de aminoácido. Podem ser cridos avímeros que podem se ligar ao antígeno-alvo com o uso da metodologia descrita, por exemplo, nas Publicações de Pedido de Patente nºº US 20040175756; 20050053973; 20050048512; e 20060008844.

[00262] Os ligantes por afinidade de aficorpo são proteínas peque- nas e simples compostas por um feixe de três hélices baseado no ar- cabouço de um dos domínios de ligação IgG da Proteína A. A Proteína A é uma proteína de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Esse domínio de arcabouço consiste em 58 aminoácidos, dos quais 13 são randomizados para gerar bibliotecas de aficorpos com um grande número de variantes de ligante (consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 5.831.012). As moléculas de aficorpo imitam anticorpos, têm um peso molecular de 6 kDa, em comparação com o peso molecular dos anticorpos, que é 150 kDa. Apesar do seu pequeno tamanho, o sítio de ligação das moléculas de aficorpo é similar àquele de um anticorpo.

[00263] — Anticalinas são produtos desenvolvidos pela empresa Pieris ProteoLab AG. São derivados de lipocalinas, um grupo generalizado de proteínas pequenas e robustas que usualmente estão envolvidas no transporte ou armazenamento fisiológico de compostos quimica- mente sensíveis ou insolúveis. Várias lipocalinas naturais ocorrem em tecidos humanos ou líquidos corporais. A arquitetura da proteína é re- miniscente de imunoglobulinas, com alças hipervariáveis no topo de um framework rígido. No entanto, em contraste com os anticorpos ou seus fragmentos recombinantes, as lipocalinas são compostas por uma cadeia polipeptídica única com 160 a 180 resíduos de aminoáci- do, sendo apenas marginalmente maiores do que um único domínio de imunoglobulina. O conjunto de quatro alças, que constitui a bolsa de ligação, mostra uma plasticidade estrutural pronunciada e tolera uma variedade de cadeias laterais. O sítio de ligação pode, assim, ser re- modelado em um processo proprietário, a fim de reconhecer molécu- las-alvo prescritas de forma diferente, com alta afinidade e especifici- dade. Uma proteína da família da lipocalina, a proteína de ligação à bilina (BBP) de Pieris Brassicae tem sido usada para desenvolver anti- calinas por mutagenização do conjunto de quatro alças. Um exemplo de um pedido de patente que descreve anticalinas esta na Publicação PCT nº WO 199916873.

[00264] —“Moléculas de afilina são pequenas proteínas não imunoglo- bulina que são projetadas para afinidades específicas em relação a proteínas e moléculas pequenas. Novas moléculas de afilina podem ser muito rapidamente selecionadas dentre duas bibliotecas, cada uma das quais é baseada em uma proteína de arcabouço derivada humana diferente. As moléculas de afilina não mostram qualquer homologia estrutural às proteínas de imunoglobulina. Atualmente, dois arcabou- ços de afilina são empregados, um dos quais é gama cristalina, uma proteína da lente ocular estrutural humana, e o outro são proteínas da superfamília de "ubiquitina". Ambos os arcabouços humanos são muito pequenos, mostram alta estabilidade térmica e são quase resistentes a mudanças de pH e agentes desnaturantes. Essa alta estabilidade se deve principalmente à estrutura de folha beta expandida das proteí- nas. Exemplos de proteínas derivadas de gama cristalina são descritos no documento nº WOZ200104144 e exemplos de proteínas "similares a ubiquitina” são descritos no documento nº WO2004106368.

[00265] Os miméticos de epítopo de proteína (PEM) são moléculas similares a peptídeos, cíclicas, de tamanho médio (MW 1 a 2 kDa) que imitam estruturas secundárias de em forma de grampo beta de proteí- nas, as principais estruturas secundárias envolvidas nas interações proteína-proteína.

[00266] Os anticorpos geneticamente modificados e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção incluem aqueles em que modificações foram realizadas em resíduos de framework dentro da VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações de framework são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é "muta- ção reversa" de um ou mais resíduos de framework à sequência de linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anti- corpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de fra- mework que diferem da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados compa- rando-se as sequências de framework de anticorpo às sequências de linhagem germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para devolver as sequências de região de framework à sua configuração de linha- gem germinativa, as mutações somáticas podem sofrer "mutação re- versa" para a sequência de linhagem germinativa, por exemplo, por mutagênese sítio-dirigida. Tais anticorpos “com mutação reversa” são também concebidos como sendo abrangidos pela invenção.

[00267] Outro tipo de modificação de framework envolve realizar mutação de um ou mais resíduos dentro da região de framework ou mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de célula T para, assim, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem é também denominada “desimunização” e é descrita em maior detalhe na Publicação de Patente US nº 20030153043 de Carr et al.

[00268] Adicional ou alternativamente às modificações feitas dentro das regiões de framework ou de CDR, os anticorpos da invenção po- dem ser manipulados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anti-

corpo, tais como meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação de receptor Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser fixadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas modalidades é descrita em mais detalhes abaixo. A nu- meração de resíduos na região Fc é aquela do índice EU de Kabat.

[00269] Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modi- ficada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem é descrita adicionalmente na Patente nº U.S. 5.677.425 de Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de dobradi- ça de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das ca- deias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[00270] Em outra modalidade, a região de dobradiça Fc de um anti- corpo sofre mutação para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são in- troduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de dobradiça Fc de modo que o anticorpo tenha ligação comprometida de Proteína Estafilocócica A (SpA) em relação a ligação de SpA de domínio de dobradiça Fc. Essa abordagem é descrita em mais deta- lhes na Patente nº U.S. 6.165.745 por Ward et al.

[00271] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para au- mentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzi- das: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na Patente nº U.S.

6.277.375 por Ward. Em alternativa, para aumentar a meia-vida bioló- gica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região de CH1 ou CL pa-

ra conter um epítopo de ligação ao receptor de salvamento retirado de duas alças de um domínio de CH2 de uma região Fc de uma IgG, con- forme descrito nas Patentes nºSUS 5.869.046 e 6.121.022 por Presta etal.

[00272] Em uma modalidade, a região Fc é alterada substituindo-se pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retenha a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo original. O ligante efetor ao qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 de complemento. Essa abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes nº U.S. 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter et al.

[00273] Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos seleciona- dos dentre os resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de modo que o anticorpo tenha liga- ção a C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida ou abolida. Essa abordagem é descrita em mais deta- lhes na Patente nº U.S. 6.194.551 por Idusogie et al.

[00274] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido são alterados para, assim, alterar a capacidade do anticorpo de se fi- xar ao complemento. Essa abordagem é adicionalmente descrita na publicação PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

[00275] Em algumas modalidades, os anticorpos de ligação a EN- TPD?2 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos contêm uma região constante de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a região constante de IgG1 humana inclui uma região Fc.

[00276] Em algumas modalidades, a região Fc dos anticorpos de ligação à ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos inclui uma ou mais mutações que mediam citotoxicidade celular de- pendente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de com- plemento (CDC) reduzida ou nula. Em algumas modalidades, os resí- duos de aminoácidos L234 e L235 da região constante de IgG1 são substituídos por A234 e A235. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido N267 da região constante de I9gG1 é substituído por A267. Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos D265 e P329 da região constante de IgG1 são substituídos por A265 e A329. Em certas modalidades, a região Fc opcionalmente compreende uma mu- tação ou combinação de mutações que conferem função efetora redu- zida selecionada dentre qualquer uma dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/ L235A, e P329G/L234A/L235A. Em algumas modalidades, a região Fc compreende uma mutação ou combinação de mutações que conferem função efetora reduzida selecionada dentre qualquer uma dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A (todas as posições por numeração de EU).

[00277] Em ainda outra modalidade, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor de Fc-gama por modificação de um ou mais aminoácidos. Essa abordagem é descrita, ainda, na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação em IgG1 humana para Fc-gama RI, Fc-gama RII, Fe-gama RIII e FcRn foram mapeados e as variantes com ligação aumentada foram descri- tas (consultar Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6,591 a 6,604). Por exemplo, a região Fc pode compreender uma mutação ou combinação de mutações que confere função efetora aumentada sele- cionada dentre qualquer uma dentre S239D, 1332E, A330L, S298A,

E333A, E333S, K334A, K236A, K236W, F243L, P2471, D280H, K290S, R292P, S298D, S298V, Y300L, V305l, A339D, A339Q, A339T, P396L (todas as posições por numeração EU).

[00278] Ainda em outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser prepa- rado (isto é, o anticorpo não tem glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, alterando-se um ou mais sítios de glicosilação dentro da se- quência de anticorpo. Por exemplo podem ser feitas uma ou mais substi- tuições de aminoácidos que resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de framework de região variável para assim eliminar a glicosilação nesse sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes nº U.S. 5.714.350 e 6.350.861 por Co et al.

[00279] — Adicionalmente ou alternativamente, pode ser produzido um anticorpo que possua um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac bissectoras aumen- tadas. Tais padrões de glicosilação alterados demonstraram aumentar a capacidade ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidratos podem ser conseguidas por, por exemplo, expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. As células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras para expressar anticorpos recombinantes da invenção para produzir assim um anti- corpo com glicosilação alterada. Por exemplo, o documento nº EP

1.176.195 por Hang et al. descreve uma linhagem celular com um ge- ne FUT8 funcionalmente interrompido, o qual codifica uma fucosil transferase, de tal modo que os anticorpos expressos em tal uma |i-

nhagem celular exibam hipofucosilação. A Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linhagem de células CHO varian- te, células Lecl3, com capacidade reduzida para ligar fucose a carboi- dratos ligados a Asn(297), resultando também na hipofucosilação de anticorpos expressos nessa célula hospedeira (consultar também Shi- elds, et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:2,6733 a 2,6740). A Publicação PCT WO 99/54342 por Umana et al. descreve linhagens celulares ge- neticamente modificadas para expressar glicosil transferases modifi- cadoras de glicoproteínas (por exemplo, beta(1,4)-N acetilglucosami- niltransferase Ill (GnTIII)) de modo que os anticorpos expressos nas linhagens celulares geneticamente modificadas exibam estruturas GlcNac bissectoras aumentadas que resultam no aumento da ativida- de ADCC dos anticorpos (consultar também Umana et a/., 1999 Nat. Biotech. 17:176 a 180).

[00280] Em algumas modalidades, o anticorpo ENTPD2 tem um isotipo IG1 com uma ou mais mutações (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em algumas mo- dalidades, a uma ou mais mutações são selecionadas dentre N297A, N297Q (BoltS et al. (1993) Eur J Immunol 23:403 a 411), D265A, L234A, L235A (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1,185 a 1,192), C226S, C2298S (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1,185 a 1,192), P238S (Davis et al., (2007) J Rheumatol, 34:2,204 a 2,210), E233P, L234V (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1,185 a 1,192), P238A, A3S27Q, A327G, P329A (Shields RL. et al., (2001) J Bioi Chern. 276(9):6591 a 604), K322A, L234F, L235E (Hezareh,et al., (2001) J Viral 75, 12,161 a 12,168; Oganesyan et al., (2008). Acta Crystallogra- phica 64, 700 a 704), P331S (Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallo- graphica 64, 700 a 704), T394D (Wilkinson et al. (2013) MAbs 5(3): 406 a 417), A330L, M252Y, S254T e/ou T256E, em que a posição de aminoácido está de acordo com a convenção de numeração de EU ou

Kabat. Em certas modalidades, a região Fc inclui, ainda, uma deleção de aminoácido em uma posição que corresponde à glicina 236 de acordo com a convenção de numeração de EU ou Kabat.

[00281] Em algumas modalidades, o anticorpo tem um isotipo I9G1 com uma região constante de cadeia pesada que contém uma muta- ção C2208S de acordo com a convenção de numeração de EU ou Ka- bat.

[00282] Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais mutações selecionadas dentre L234F, L235E, P331S, D265A e/ou N297Q, de acordo com a convenção de numeração de EU ou Kabat. Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais mutações selecionadas dentre L234A, L235A, D265A, P329A N297A, N297Q de acordo com a convenção de numeração de EU ou Kabat.

[00283] Em certas modalidades, o anticorpo tem um isotipo IgG2. Em algumas modalidades, o anticorpo contém uma região constante de IgG2 humana. Em algumas modalidades, a região constante de IgG2 humana inclui uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, a região Fc contém uma ou mais mutações (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações são selecionadas dentre V234A, G237A, P238S, H268A, H268E, H268Q, V309L, N297A, N297Q, V309L, A3S30S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, e/ou T256E, em que a posição de aminoácido está de acordo com a convenção de numeração de EU ou Kabat.

[00284] Em certas modalidades, o anticorpo tem um isotipo Ig9G4. Em algumas modalidades, o anticorpo contém uma região constante de IgG4 humana. Em algumas modalidades, a região constante de IgG4 humana inclui uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em algumas mo-

dalidades, a região Fc contém uma ou mais mutações (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em algumas modalidades, a um ou mais mutações são selecionadas den- tre E233P, F234V, L234A, L235A, G237A, E318A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl A cad Sci EUA, 92:11,980 a 11,984), S228P, L236E, S241P, L248E (Reddy et al., (2000) J Immunol,164:1,925 a 1,933; An- gal et al., (1993) Mol Immunol. 30(1):105 a 108; US 8614299 B2), T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, e/ou N297Q, em que a posi- ção de aminoácido está de acordo com a convenção de numeração de EU ou Kabat.

[00285] Em algumas modalidades, a região Fc contém, ainda, uma ou mais mutações adicionais selecionadas dentre M252Y, S254T e/ou T256E, em que a posição de aminoácido está de acordo com a con- venção de numeração de EU ou Kabat.

[00286] Em algumas modalidades, uma ou mais das variantes de IgG1 descritas no presente documento podem ser combinadas com uma mutação A330L (Lazaret al., (2006) Proc Natl Acad Sci EUA, 103:4,005 a 4,010), ou uma ou mais dentre as mutações L234F, L235E e/ou P331S (Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci EUA, 105:20,167 a 20,172), em que a posição de aminoácido está de acor- do com a convenção de numeração de EU ou Kabat, para eliminar a ativação de complemento. Em algumas modalidades, as variantes de IgG descritas no presente documento podem ser combinadas com uma ou mais mutações para aumentar a meia-vida do anticorpo em soro humano (por exemplo, mutações M252Y, S254T,T256E de acor- do com a convenção de numeração de EU ou Kabat) (Dall' Acqua et al., (2006) J Biol Chern, 281:23,514 a 23,524; e Strohl et al., (2009) Current Opinion in Biotechnology, 20:685 a 691).

[00287] Em algumas modalidades, uma variante I9G4 da presente descrição pode ser combinada com uma mutação S228P de acordo com a convenção de numeração de EU ou Kabat (Angal et al., (1993) Mol Immunol, 30:105 a 108) e/ou com uma ou mais mutações descri- tas em Peters et al., (2012) J Biol Chern. 13;287(29):24,525 a 24,533) para aumentar a estabilização de anticorpo.

[00288] Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região Fc selecionada dentre uma região Fc de IgG2, uma região Fc de I9gG4 ou uma região Fc híbrida de I9gG2/I19G4. Anticorpos de Camelídeos

[00289] Proteínas de anticorpos obtidas de membros da família de camelos e dromedários (Camelus bactrianus e Calelus dromaderius), incluindo novos membros do mundo, como espécies de lhama (Lama paccos, Lama glama e Lama vicugna) foram caracterizadas quanto ao tamanho, complexidade estrutural e antigenicidade para indivíduos humanos. Certos anticorpos IgG dessa família de mamífero, conforme encontrados na natureza, não possuem cadeias leves, e são assim estruturalmente distintos da estrutura quaternária típica de quatro ca- deias, tendo duas cadeias pesadas e duas leves, para anticorpos de outros animais. Consultar o documento nº PCT/EP93/02214 (WO 94/04678 publicado em 3 de março de 1994).

[00290] “Uma região do anticorpo camelídeo que é o domínio variá- vel único pequeno identificado como VHH pode ser obtida por modifi- cação genérica para produzir uma proteína pequena com alta afinida- de para um alvo, resultando em uma proteína derivada de anticorpo de baixo peso molecular conhecida como um "nanocorpo de camelídeo". Consultar a Patente nº U.S. 5.759.808 emitida em 2 de junho de 1998; consultar também Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1,256 a 1,261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783 a 788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440 a 448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456 a 462; e Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3,512 a 3,520. As bibliotecas geneticamente modificadas de anticorpos e fragmentos de anticorpo de camelídeos estão comer- cialmente disponíveis, por exemplo, junto à Ablynx, Ghent, Bélgica. Como com outros anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos de origem não humana, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo camelídeo pode ser alterada de modo recombinante para obter uma sequência que se assemelha mais proximamente a uma sequência humana, isto é, o nanocorpo pode ser "humanizado." As- sim, a baixa antigenicidade natural dos anticorpos de camelídeos para humanos pode ser ainda mais reduzida.

[00291] O nanocorpo de camelídeo tem um peso molecular de aproximadamente um décimo daquele da molécula de IgG humana, e a proteína tem um diâmetro físico de apenas alguns nanômetros. Uma consequência do pequeno tamanho é a capacidade dos nanocorpos de camelídeos de se ligarem a sítios antigênicos que são funcional- mente invisíveis a proteínas de anticorpo maiores, isto é, os nanocor- pos de camelídeos são úteis como reagentes que detectam antígenos que são de outra forma crípticos com o uso de técnicas imunológicas clássicas e como possíveis agentes terapêuticos. Assim, outra conse- quência do pequeno tamanho é que uma nanocorpo de camelídeo po- de inibir como resultado da ligação a um sítio específico em um sulco ou fenda estreita de uma proteína alvo e, portanto, pode servir em uma capacidade que mais se assemelha à função de um clássico fármaco de baixo peso molecular do que a de um anticorpo clássico.

[00292] O baixo peso molecular e o tamanho compacto resultam ainda em nanocorpos de camelídeos que são extremamente termoes- táveis, estáveis a pH extremo e à digestão proteolítica e pouco antigê- nicos. Outra consequência é que os nanocorpos de camelídeos se movem prontamente do sistema circulatório para os tecidos e até atra- vessam a barreira hematoencefálica e podem tratar distúrbios que afe- tam o tecido nervoso. Os nanocorpos podem facilitar, ainda, o trans-

porte de fármacos através da barreira hematoencefálica. Consultar p pedido de patente nº U.S. 20040161738 publicado em 19 de agosto de

2004. Essas características combinadas com a baixa antigenicidade para os seres humanos indicam um grande potencial terapêutico. Além disso, essas moléculas podem ser completamente expressas em célu- las procarióticas, tais como E. coli e são expressas como proteínas de fusão com bacteriófago e são funcionais.

[00293] “Consequentemente, um recurso da presente invenção é um anticorpo camelídeo ou nanocorpo que tem alta afinidade para EN- TPD2. Em uma modalidade no presente documento, o anticorpo de camelídeo ou nanocorpo é produzido naturalmente no animal camelí- deo, isto é, produzido pelo camelídeo após imunização com ENTPD2 ou um fragmento de peptídeo do mesmo, com o uso de técnicas des- critas no presente documento para outros anticorpos. Alternativamen- te, os nanocorpos de camelídeos de ligação a ENTPD2 são genetica- mente modificados, ou seja, produzidos por seleção de uma biblioteca de proteínas de nanocorpo de camelídeo mutagenizadas apropriada- mente de exibição de fago com o uso de procedimentos de panning com ENTPD2 como um alvo, conforme descrito nos exemplos no pre- sente documento. Os nanocorpos geneticamente modificados podem, ainda, ser personalizados por manipulação genética para ter uma meia-vida em um indivíduo receptor de 45 minutos a duas semanas. Em uma modalidade específica, o anticorpo ou nanocorpo de camelí- deo é obtido enxertando-se as sequências CDRs da cadeia pesada ou leve dos anticorpos humanos da invenção em sequências de fra- mework de anticorpo de domínio único ou de nanocorpo, conforme descrito, por exemplo, no documento nº PCT/EP93/02214. Moléculas Biespecíficas e Anticorpos Multivalentes

[00294] Em outro aspecto, a presente invenção apresenta molécu- las biespecíficas ou multiespecíficas que compreendem um anticorpo de ligação a ENTPD2, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou regiões de ligação a antígeno dos mesmos, pode ser derivado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação ou moléculas-alvo diferentes. O anti- corpo da invenção pode na verdade ser derivado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecífi- cas que se ligam a mais do que dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas-alvo; tais moléculas multiespecíficas também são devem ser abrangidas pelo termo "molécula biespecífica", conforme usado no presente documento. Para criar uma molécula biespecífica da inven- ção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outra) a uma ou mais outras moléculas de ligação, como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou ligação mimética, tal que resulta uma molécula biespecífica.

[00295] —“Consequentemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que compreendem pelo menos uma primeira especifici- dade de ligação para ENTPD2 e uma segunda especificidade de liga- ção para um segundo epítopo alvo. Por exemplo, o segundo epítopo alvo é outro epítopo de ENTPD? diferente do primeiro epítopo alvo.

[00296] Além disso, para a invenção, em que a molécula biespecifi- ca é multiespecífica, a molécula pode, ainda, incluir uma terceira es- pecificidade de ligação, adicionalmente ao primeiro e segundo epítopo- alvo.

[00297] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da inven- ção compreendem, como especificidade de ligação, pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou uma cadeia simples. O anticor-

po pode também ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou um construto de cadeia única, conforme descrito em Ladner et al. Patente nº U.S. 4.946.778.

[00298] Diacorpos são moléculas bivalentes, biespecíficas, nas quais os domínios de VH e VL são expressos em uma cadeia polipep- tídica única, conectados por um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Os domínios de VH e VL se pareiam com domínios complementares de outra ca- deia, criando, assim, dois sítios de ligação a antígeno (consultar, por exemplo, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:6,444 a 6,448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1,121 a 1,123). Os diacorpos po- dem ser produzidos expressando-se duas cadeias polipeptídicas com a estrutura VHA-VLB e VHB-VLA (configuração VH-VL) ou VLA-VHB e VLB-VHA (configuração VL-VH) dentro da mesma célula. A maioria dos mesmos pode ser expressa em forma solúvel em bactérias. Dia- corpos de cadeia única (scDb) são produzidos conectando-se as duas cadeias polipeptídicas de formação de diacorpos com um ligante de aproximadamente 15 resíduos de aminoácido (consultar Holliger e Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128 a 130; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21 a 36). scDb pode ser expresso em bactérias na forma monomérica ativa e solúvel (consultar Holliger e Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (34): 128 a 130; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21 a 36; Pluckthun e Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83 a 105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9 (7):617 a 621). Um diacorpo pode ser fundido a Fc para gerar um "di- diacorpo" (consultar Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2,856 a 2,865).

[00299] “Outros anticorpos que podem ser empregados nas molécu- las biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais murinos,

quiméricos e humanizados.

[00300] As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas conjugando-se as especificidades de ligação consti- tuintes, com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser ge- rada separadamente e, então, conjugada entre si. Quando as especifi- cidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou de ligação cruzada pode ser usada para a conjugação covalente. Exemplos de agentes de ligação cruzada inclu- em proteína A, carbodi-imida, N-succinimidil-5-acetil-ticacetato (SA- TA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (o0PDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e 4(N- maleimidometila)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidila (sul- fo-SMCC) (consultar, por exemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1.686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:8.648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. nº78, 118 a 132; Brennan et al., 1985 Science 229:81 a 83), e Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2,367 a 2,375). Os agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis junto à Pier- ce Chemical Co. (Rockford, Ill).

[00301] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, os mesmos podem ser conjugados por ligação de sulfidrila das regiões de dobradiça de terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma modali- dade particular, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, por exemplo um, antes da con- jugação.

[00302] —Alternativamente, ambas as especificidades de ligação po- dem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Esse método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb X mAb, mAb X

Fab, Fab X F(ab')2 ou ligante X Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única que compreende um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma mo- lécula biespecífica de cadeia única que compreende dois determinan- tes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Os métodos para preparar moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente nº U.S.

5.260.203; Patente nº U.S. 5.455.030; Patente nº U.S. 4.881.175; Pa- tente nº U.S. 5.132.405; Patente nº U.S. 5.091.513; Patente nº U.S.

5.476.786; Patente nº U.S. 5.013.653; Patente nº U.S. 5.258.498 e no Pedido de Patente nº U.S. 5.482.858.

[00303] —Aligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos espe- cíficos pode ser confirmada, por exemplo, por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (REA), análise FACS, bio- ensaio (por exemplo, inibição de crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios detecta geralmente a presença de comple- xos proteína-anticorpo de interesse particular empregando um rea- gente identificado (por exemplo, um anticorpo) específico para o com- plexo de interesse.

[00304] Em outro aspecto, a presente invenção fornece compostos multivalentes que compreendem pelo menos duas porções de ligação a antígeno idênticas ou diferentes dos anticorpos e fragmentos de |i- gação a antígeno dos mesmos da invenção que se ligam a ENTPD?2. As porções de ligação a antígeno podem ser ligadas entre si através de fusão proteica ou ligação covalente ou não covalente. Alternativa- mente, foram descritos métodos de ligação para as moléculas biespe- cíficas. Compostos tetravalentes podem ser obtidos, por exemplo, reti- culando-se anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mes- mos da invenção com um anticorpo ou fragmento de ligação a antíge- no que se liga às regiões constantes dos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção, por exemplo, a região Fc ou de dobradiça.

[00305] Os domínios de trimerização são descritos, por exemplo, na patente Boreana EP 1 012 280B1. Os módulos de pentamerização são descritos, por exemplo, no documento nº PCT/EP97/05897.

[00306] Em algumas modalidades, os anticorpos de ligação a EN- TPD?2 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos são anticor- pos biespecíficos que reconhecem um primeiro antígeno e um segun- do antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno é ENTPD2 humana ou uma variante de ocorrência natural da mesma. Em algu- mas modalidades, o segundo antígeno pode ser uma proteína, lipídio, polissacarídeo ou glicolipídio expresso em uma ou mais células tumo- rais. Anticorpos com Meia-Vida Estendida

[00307] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam espe- cificamente à ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana) e têm uma meia-vida estendida in vivo.

[00308] Muitos fatores podem afetar a meia-vida de uma proteína in vivo. Para exemplos, filtração renal, o metabolismo no fígado, degra- dação por enzimas proteolíticas (proteases) e respostas imunogênicas (por exemplo, neutralização de proteína por anticorpos e a absorção por macrófagos e células dendríticas). Uma variedade de estratégias podem ser usadas para estender a vida-útil dos anticorpos e fragmen- tos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção. Por exemplo, por ligação química com polietilenoglicol (PEG), reCODE PEG, arcabouço de anticorpo, ácido polissiálico (PSA), hidroxietil- amido (HES), ligantes de ligação a albumina e escudos de carboidra- tos; por fusão genética a proteínas que se ligam a proteínas séricas, tal como albumina, IgG, FcRn, e transferência; por acoplamento (gené- tico ou químico) a outras porções de ligação que se ligam a proteínas séricas, tais como, nanocorpos, Fabs, DARPins, avímeros, aficorpos e anticalinas; por fusão genética a rPEG, albumina, domínio de albumi- na, proteínas de ligação a albumina e Fc; ou por incorporação em na- nocarreadores, formulações de liberação lenta ou dispositivos médi- cos.

[00309] Para prolongar a circulação sérica de anticorpos in vivo, moléculas poliméricas inertes, tais como PEG de alto peso molecular, podem ser ligadas aos anticorpos ou a um fragmento do mesmo, com ou sem um ligante multifuncional, através da conjugação sítio- específica do PEG ao terminal C ou N dos anticorpos ou através de grupos épsilon-amino presentes nos resíduos de lisina. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tipicamente é reagido com polietilenoglicol (PEG), tal como um deriva- do de éster ou aldeído reativo de PEG, sob condições em que um ou mais grupos PEG se ligam ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. À peguilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou uma re- ação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um políme- ro análogo reativo solúvel em água). Conforme usado no presente do- cumento, o termo "polietilenoglicol" pretende abranger qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivar outras proteínas, tal como mono (C1-C10)alcóxi- ou arilóxi-polietilenoglicol ou polietile- noglicol-maleimida. Em uma modalidade, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Será usada derivação de polímeros lineares ou ramificados que resulta em perda mínima de atividade biológica. O grau de conjugação pode ser monitorado de perto por SDS-PAGE e espectrometria de massa para assegurar a conjugação adequada de moléculas de PEG aos anticorpos. O PEG não reagido pode ser sepa- rado dos conjugados de anticorpo-PEG por cromatografia de exclusão de tamanho ou de troca iônica. Os anticorpos derivados de PEG po- dem ser testados quanto à atividade de ligação, bem como à eficácia in vivo, com o uso de métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, por imunoensaios descritos no presente docu- mento. Os métodos de peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção. Consultar, por exemplo, o do- cumento nº EP 0154316 por Nishimura et al. e o documento nº EP 0401384 por Ishikawa et al .

[00310] Outras tecnologias de peguilação modificadas incluem tec- nologia de modificação genética direcionada ortogonal de reconstitui- ção química (ReCODE PEG), que incorpora cadeias laterais quimica- mente especificadas em proteínas biossintéticas por meio de um sis- tema reconstituído que inclui tRNA sintetase e tRNA. Essa tecnologia permite a incorporação de mais de 30 novos aminoácidos em proteí- nas biossintéticas em células de E. coli, levedura e mamífero. O tRNA incorpora um aminoácido não nativo em qualquer lugar em que um códon âmbar está posicionado, convertendo o âmbar de um códon de terminação em um que sinaliza a incorporação do aminoácido quimi- camente especificado.

[00311] A tecnologia de peguilação recombinante (rPEG) também pode ser usada para a extensão da meia-vida sérica. Esta tecnologia envolve fundir geneticamente uma cauda de proteína não estruturada de 300 a 600 aminoácidos a uma proteína farmacêutica existente. Uma vez que o peso molecular aparente de tal cadeia proteica não estruturada é cerca de 15 vezes maior do que o seu peso molecular real, a meia-vida sérica da proteína é grandemente aumentada. Em contraste com a peguilação tradicional, que exige conjugação química e repurificação, o processo de fabricação é grandemente simplificado e o produto é homogêneo.

[00312] A polissialização é outra tecnologia que usa o polímero na- tural de ácido polissiálico (PSA) para prolongar a vida ativa e melhorar a estabilidade de peptídeos e proteínas terapêuticos. O PSA é um po- límero de ácido siálico (um açúcar). Quando usado para entrega de fármacos proteicos e peptídicos terapêuticos, o ácido polissiálico for- nece um microambiente protetor na conjugação. Isso aumenta a vida ativa da proteína terapêutica na circulação e impede que a mesma se- ja reconhecida pelo sistema imunológico. O polímero de PSA é encon- trado naturalmente no corpo humano. O mesmo foi adotado por certas bactérias que evoluíram ao longo de milhões de anos para revestir su- as paredes com o mesmo. Essas bactérias naturalmente polissialila- das podiam, então, em virtude de mimetismo molecular, despistar o sistema de defesa do corpo. PSA pode ser facilmente produzido a par- tir dessas bactérias em grandes quantidades e com características fí- sicas predeterminadas. O PSA bacteriano é completamente não imu- nogênico, mesmo quando acoplado a proteínas, visto que é quimica- mente idêntico ao PSA no corpo humano.

[00313] Outra tecnologia inclui o uso de derivados de hidroxietilami- do ("HES") ligados a anticorpos. O HES é um polímero natural modifi- cado derivado do amido de milho ceroso e pode ser metabolizado pe- las enzimas do corpo. As soluções de HES são usualmente adminis- tradas para substituir o volume sanguíneo deficiente e melhorar as propriedades reológicas do sangue. Hesilação de um anticorpo permi- te o prolongamento da meia-vida em circulação aumentando a estabi- lidade da molécula, bem como reduzindo a depuração renal, resultan- do em um aumento da atividade biológica. Variando-se diferentes pa- râmetros, tal como o peso molecular de HES, uma ampla gama de conjugados de anticorpo HES pode ser personalizada.

[00314] — Anticorpos que têm uma meia-vida aumentada in vivo tam- bém podem ser gerados introduzindo-se uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, inserções ou deleções) em um domínio constante de IgG, ou fragmento de ligação a FcRn do mesmo (de preferência, um Fc ou fragmento de domínio Fc de dobra- diça). Consultar, por exemplo, a Publicação Internacional nº WO 98/23289; Publicação Internacional nº WO 97/34631; e Patente nº U.S.

6.277.375.

[00315] Além disso, os anticorpos podem ser conjugados a albumi- na de modo a tornar o anticorpo ou fragmento de anticorpo mais está- vel in vivo ou ter uma meia-vida mais longa in vivo. As técnicas são bem conhecidas na técnica, consultar, por exemplo, as Publicações Internacionais nºº WO 93/15199, WO 93/15200 e WO 01/77137; e Pa- tente Europeia no EP 413.622.

[00316] As estratégias para aumentar a meia-vida são especialmen- te úteis em nanocorpos, ligantes à base de fibronectina e outros anti- corpos ou proteínas para os quais é desejada meia-vida in vivo au- mentada. Conjugados de Anticorpo

[00317] A presente invenção fornece anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao do- mínio extracelular de ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 huma- na) fundidos de modo recombinante ou conjugados quimicamente (in- cluindo conjugações tanto covalentes quanto não covalentes) a uma proteína ou polipeptídeo heterólogo (ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de preferência, a um polipeptídeo de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo me- nos 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. Em particular, a invenção fornece proteínas de fusão que compreendem um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo descrito no presente documento (por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento F (ab)2, domínio de VH, uma CDR de VH, um domínio de VL ou uma CDR de VL) e uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogo. Métodos para fundir ou conjugar proteínas, polipeptídeos ou peptídeos a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo são co- nhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, as Patentes nº U.S.

5.336.603. 5.622.929. 5.359.046. 5.349.053. 5.447.851 e 5.112.946; Patentes Europeias nº EP 307.434 e EP 367.166; Publicações Inter- nacionais nº WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88: 10,535 a 10,539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5,590 a 5,600; e Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:11,337 a 11,341.

[00318] Proteínas de fusão adicionais podem ser geradas através das técnicas de embaralhamento de gene, embaralhamento de motivo, embaralhamento de éxon e/ou embaralhamento de códon (denomina- do coletivamente de "embaralhamento de DNA"). O embaralhamento de DNA pode ser empregado para alterar as atividades de anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção (por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos com afinidades mais altas e taxas de dissociação mais baixas). Con- sultar, de modo geral, as Patentes nº U.S. 5.605.793, 5.811.238,

5.830.721, 5.834.252 e 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724 a 733; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76 a 82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265 a 276; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308 a 313. Os anticorpos e frag- mentos de ligação a antígeno dos mesmos, ou os anticorpos codifica- dos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, podem ser alte- rados sendo submetidos a mutagênese aleatória por PCR propensa a erro, inserção de nucleotídeo aleatório ou outros métodos antes da recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a ENTPDZ2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana) pode ser recombi- nado com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domí-

nios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.

[00319] Além disso, os anticorpos e fragmentos de ligação a antí- geno do mesmo podem ser fundidos com sequências marcadoras, tal como um peptídeo para facilitar a purificação. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos marcadores é um peptídeo de hexa- histidina (SEQ ID NO: 1010), tal como a etiqueta fornecida em um ve- tor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Con- forme descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:821 a 824, por exemplo, a hexa-histidina (SEQ ID NO: 1010) forne- ce purificação conveniente da proteína de fusão. Outras etiquetas pep- tídicas úteis para purificação incluem, porém sem limitação, a etiqueta hemaglutinina ("HA"), que corresponde a um epítopo derivado da pro- teína hamaglutinina de influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), e a etiqueta “FLAG”.

[00320] Em uma modalidade, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção são conjugados a um agente diagnóstico ou detectável. Tais anticorpos podem ser úteis pa- ra monitorar ou prognosticar o início, desenvolvimento, progressão e/ou gravidade de uma doença ou distúrbio como parte de um proce- dimento de teste clínico, tal como determinar a eficácia de uma terapia particular. Tais diagnóstico e detecção podem ser realizados acoplan- do-se o anticorpo a substâncias detectáveis, incluindo, porém sem li- mitação, várias enzimas, tais como, porém sem limitação, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinestera- se; grupos protéticos, tais como, porém sem limitação, estreptavidi- na/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, porém sem limitação, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceí- na, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tal como, porém sem limita-

ção, luminol; materiais bioluminescentes, tais como, porém sem limita- ção, luciferase, luciferina, e aquorina, materiais radioativos, tais como, porém sem limitação, iodo (1311, 1251, 1231, e 1211,), carbono (14C), enxofre (358), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112Ih, e 111Ih,), tecnécio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99M0o), xénon (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Estanho; e metais emissores de pósitrons usando várias tomografias de emissão de pósitrons e íons metálicos paramag- néticos não radioativos.

[00321] Além disso, um anticorpo ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo pode ser conjugado a uma porção química ou porção farmacêutica terapêutica. As porções químicas terapêuticas e as por- ções químicas de fármaco não devem ser entendidas como limitadas a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção quíi- mica de fármaco pode ser uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina pseudo- monas, toxina da cólera ou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral, alfa-interferon, beta-interferon, fator de cres- cimento dos nervos, fator de crescimento derivado de plaquetas, ati- vador do plasminogênio em tecidos, um agente apoptótico, um agente antiangiogênico; ou um modificador de resposta biológica tal como, por exemplo, uma linfoquina.

[00322] Além disso, um anticorpo pode ser conjugado com porções químicas terapêuticas, tal como um íon metálico radioativo, tais como alfa-emissores, tal como 213Bi ou quelantes macrocíclicos úteis para conjugar íons radiometálicos, incluindo, porém sem limitação, 1311In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, a polipeptídeos. Em uma modalidade, o quelante — macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano- N,N',N", N"'-tetra-acético (DOTA) que pode ser ligado ao anticorpo através de uma molécula ligante. Tais moléculas ligantes são comu- mente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et al.,1998, Clin Cancer Res. 4(10):2.483 a 2.490; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553 a 557; e Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943 a 950, cada um incorporado ao presente documento a título referência na sua totalidade.

[00323] As técnicas para conjugar porções químicas terapêuticas de anticorpos são bem conhecidas, consultar, por exemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), páginas 243 a 256 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2º Ed.), Robinson et al. (eds.), páginas 623 a 653 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: À Review", em Monoclonal anticorpos 84: Biological And Clinical Applica- tions, Pinchera et al. (eds.), páginas 475 a 506 (1985); "Analysis, Re- sults, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), páginas 303 a 316 (Aca- demic Press 1985), e Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119 158.

[00324] Os anticorpos podem também ser ligados a suportes sóli- dos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antígeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, porém sem limitação, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, policloreto de vinila ou polipropileno. Ácidos Nucleicos que Codificam os Anticorpos, Vetores e Células Hospedeiras

[00325] Também são fornecidos no presente documento ácidos nu-

cleicos que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento. Tais ácidos nucleicos po- dem codificar polipeptídeos que compreendem segmentos ou domí- nios dos anticorpos contra ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antí- geno dos mesmos descritos acima. Tais ácidos nucleicos ou polinu- cleotídeos podem codificar pelo menos uma região CDR e usualmente todas as três regiões CDR da cadeia pesada ou leve dos anticorpos de ENTPD?2 descrito no presente documento. Tais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos podem também codificar toda ou substancialmente toda a sequência de região variável da cadeia pesada e/ou da cadeia leve dos anticorpos de ENTPD2 descritos no presente documento. Tais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos podem também codificar tanto uma região variável quanto uma região constante do anticorpo. Devido à degenerescência do código, uma variedade de sequências de ácidos nucleicos codificará cada uma das sequências de aminoáci- dos da imunoglobulina. Por exemplo, a invenção apresenta uma pri- meira e segunda regiões variáveis de cadeia pesada e leve de codifi- cação de ácido nucleico, respectivamente, de uma molécula de anti- corpo de ENTPD?2 anti-humano escolhida dentre uma ou mais das mo- léculas de anticorpo descritas no presente documento. O ácido nuclei- co pode compreender uma sequência de nucleotídeos, conforme apresentado na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente idênti- ca à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cerca de 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, ou que difere em no máximo 3, 6, 15, 30 ou 45 nucleotídeos em rela- ção às sequências mostradas na Tabela 1).

[00326] Em certas modalidades, o ácido nucleico pode compreen- der uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma, du- as ou três CDRs, ou alças hipervariáveis, de uma região variável de cadeia pesada que tem uma sequência de aminoácidos, conforme apresentado na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente homó- loga à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cer- ca de 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma e/ou que tem uma ou mais substituições, por exemplo, substi- tuições conservadas). Em outras modalidades, o ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma, duas ou três CDRs, ou alças hipervariáveis, de uma região variá- vel de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos, conforme apresentado na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente homó- loga à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cer- ca de 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma e/ou que tem uma, ou mais substituições, por exemplo, substi- tuições conservadas). Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs ou alças hipervari- áveis, de regiões variáveis de cadeia pesada e leve que têm uma se- quência de aminoácidos, conforme apresentado na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente homóloga à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cerca de 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma e/ou que tem uma ou mais substituições, por exemplo, substituições conservadas).

[00327] Em certas modalidades, o ácido nucleico pode compreen- der uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma, du- as ou três CDRs, ou alças hipervariáveis, de uma região variável de cadeia pesada que tem uma sequência de nucleotídeos, conforme apresentado na Tabela 1, uma sequência substancialmente homóloga à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cerca de 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma). Em outra modalidade, o ácido nucleico pode compreender uma se- quência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma, duas ou três

CDRs ou alças hipervariáveis de uma região variável de cadeia leve que tem a sequência de nucleotídeos, conforme apresentado na Tabe- la 1, ou uma sequência substancialmente homóloga à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cerca de 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma). Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs ou alças hipervariáveis de regiões variáveis de cadeia pesada e leve que têm as sequências de nucleotídeos, conforme apresentado na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente homó- loga à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cer- ca de 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma).

[00328] As sequências de polinucleotídeos podem ser produzidas por síntese de DNA de fase sólida de novo ou por mutagênese de PCR de uma sequência existente que codifica um anticorpo de ligação a ENTPD?2 ou seu fragmento de ligação. A síntese química direta de ácidos nucleicos pode ser realizada pelos métodos conhecidos na téc- nica, tal como o método de fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; o método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; o método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; e o método de suporte sólido da Pa- tente nº U.S. 4.458.066. A introdução de mutações a uma sequência de polinucleotídeos por PCR pode ser realizada conforme descrito em, por exemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Aca- demic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; e Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17,

1991.

[00329] São também fornecidos no presente documento vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreendem um ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo que compreende um segmento ou domínio dos anticorpos de ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antí- geno dos mesmos descritos no presente documento. Tais vetores po- dem ser empregados para expressar e/ou produzir os anticorpos de ligação a ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos. O termo "vetor de expressão" refere-se a uma molécula de ácido nu- cleico carreadora na qual pode ser inserida uma sequência de codifi- cação desejada para introdução em uma célula em que pode ser ex- pressa. O vetor pode ser um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um cosmídeo ou um vetor viral, ou cromossomos artificiais (consultar, por exemplo, Harrington et a/., Nat Genet 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão dos anticorpos de ligação a ENTPD?2 ou fragmentos de ligação a antígeno em células de mamíferos (por exemplo, seres humanos) incluem pThioHis A, B e C, pcDNA3.1/His, peEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), veto- res MPSV e inúmeros outros vetores conhecidos na técnica para ex- pressar proteínas. Por exemplo, uma classe de vetores utiliza elemen- tos de DNA que são derivados de vírus animais como, por exemplo, o vírus do papiloma bovino, vírus do papiloma, adenovírus, vírus vacci- nia, baculovírus, retrovírus (Vírus de Sarcoma de Rous, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Outra classe de vetores utiliza elementos de RNA derivados de vírus de RNA, tal como vírus de Semliki Forest, ví- rus de Encefalite Equina Oriental e Flavivírus.

[00330] Os vetores virais úteis incluem vetores à base de um dos seguintes vírus: retrovírus, lentivírus, adenovírus, vírus adenoassocia- do, vírus da herpes (por exemplo, Vírus Herpes Simplex (HSV)), veto- res à base de SV40, vírus do papiloma, Vírus de Epstein Barr HBP, vírus vaccinia, vírus de Sinbis, vírus influenza, reovírus, vírus da doen-

ça de Newcastle (NDV), vírus do sarampo, vírus da estomatite vesicu- lar (VSV), parvovírus, poliovírus, poxvírus, vírus do Vale de Seneca, vírus Coxsackie, enterovírus, vírus Mixoma, vírus Marabá ou vírus da Floresta de Semliki (SFV). Consultar, Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; e Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

[00331] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral. Ve- tores derivados de retrovírus, tais como o lentivírus, são ferramentas adequadas para alcançar a transferência de genes de longo prazo, uma vez que permitem integração estável de longo prazo de um trans- gene e a sua propagação em células filhas. Os vetores lentivirais têm a vantagem adicional em relação a vetores derivados de onco- retrovírus, tais como vírus de leucemia murina, de poderem transduzir células não proliferativas, tais como hepatócitos. Os mesmos também têm a vantagem adicional de possuírem baixa imunogenicidade. Um vetor retroviral pode também ser, por exemplo, um vetor gamarretrovi- ral. Um vetor gamarretroviral pode incluir, por exemplo, um promotor, um sinal de empacotamento (y), um sítio de ligação de iniciador (PBS), uma ou mais (por exemplo, duas) repetições terminais longas (LTR) e um transgene de interesse, por exemplo, um gene que codifi- ca um CAR. Um vetor gamarretroviral pode não ter genes estruturas virais como gag, pol e env. Os vetores gamarretrovirais exemplificati- vos incluem Vírus da Leucemia Murina (MLV), Vírus de Formação com Foco no Baço (SFFV) e Vírus do Sarcoma Mieloproliferativo (MPSV) e vetores derivados dos mesmos. Outros vetores gamarretrovirais são descritos, por exemplo, em Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. Junho de 2011; 3(6): 677 a 713.

[00332] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de vírus ade- noassociado (AAV), por exemplo, um vetor AAV recombinante (rAAV). "AAV" é uma abreviatura para vírus adenoassociado e pode ser usada para se referir ao próprio vírus ou derivados do mesmo. O termo abrange todos os subtipos e ambas as formas de ocorrência natural e recombinante, exceto quando requerido de outro modo. A abreviatura "rAAV" refere-se a vírus adenoassociado recombinante, também de- nominado como vetor de AAV recombinante (ou "vetor rAAV"). O ter- mo "AAV" inclui, por exemplo, AAV de tipo 1 (AAV1), AAV de tipo 2 (AAV2), AAV de tipo 3 (AAV3), AAV de tipo 4 (AAV4), AAV de tipo 5 (AAV5), AAV de tipo 6 (AAV6), AAV de tipo 7 (AAV7), AAV de tipo 8 (AAV8), AAV de tipo 9 (AAV9), AAV de tipo 10 (AAV10, incluindo AA- Vrh10), AAV de tipo 12 (AAV12), AAV aviário, AAV bovino, AAV cani- no, AAV equino, AAV de primata, AAV não primata e AAV ovino. "AAV primata" refere-se a AAV que infecta primatas, "AAV não primata" refe- re-se a AAV que infecta mamíferos que não são primatas, "AAV bovi- no" refere-se a AAV que infecta mamíferos bovinos e assim por diante.

[00333] As sequências genômicas de vários serotipos de AAV, bem como as sequências das repetições terminais invertidas (ITR) nativas, proteínas Rep e subunidades capsídicas, são conhecidas na técnica. Tais sequências podem ser encontradas na literatura ou em bancos de dados públicos, tal como GenBank. Consultar, por exemplo, números de Acesso ao GenBank NC-002077 (AAV1), AFO63497 (AAV1), NC- 001401 (AAV2), AFO43303 (AAV2), NC-001729 (AAV3), NC-001829 (AAV4), U89790 (AAV4), NC-006152 (AAV5), AF513851 (AAV7), AF513852 (AAV8) e NC-006261 (AAVB8); ou em publicações tais como o documento nº WO2005033321 (AAV1-9), cuja descrição está incor- porada ao presente documento a título de referência. Consultar, tam- bém, por exemplo, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71 :6.823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73:

1.309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3.994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221 :208; Shade et al.,(1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci.

EUA 99: 11.854; Moris et al. (2004) Virology 33:375 a 383; publicações de patente internacional WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; e Patente nº U.S. 6.156.303.

[00334] Um "vetorrAAV", conforme usado no presente documento, refere-se a um vetor AAV que compreende uma sequência de polinu- cleotídeos não originária de AAV (isto é, um polinucleotídeo heterólogo a AAV), tipicamente uma sequência de interesse para a transformação genética de uma célula. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo heterólogo pode ser flanqueado por pelo menos uma, e por vezes por duas, sequências de repetições terminais invertidas (ITR) de AAV. O termo vetor rAAV abrange tanto partículas de vetor rAAV quanto plas- mídeos de vetor rAAV. Um vetor rAAV pode ser de fita simples (ssA- AV) ou autocomplementar (scCAAV). Um "vírus AAV" ou "partícula viral de AAV" ou "partícula de vetor rAAV" refere-se a uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína capsídica de AAV (tipicamente por todas as proteínas capsídicas de um AAV de tipo selvagem) e um vetor rAAV polinucleotídico encapsidado. Se a partícula compreender um polinucleotídeo heterólogo (isto é, um polinucleotídeo diferente de um genoma de AAV de tipo selvagem, tal como um transgene a ser distribuído a uma célula de mamífero), a mesma é tipicamente deno- minada uma "partícula de vetor rAAV" ou simplesmente um "vetor rA- AV". Assim, a produção de partícula de rAAV inclui necessariamente a produção de vetor rAAV, visto que tal vetor está contido dentro de uma partícula de rAAV.

[00335] Em algumas modalidades, os vetor pode ser uma molécula de DNA recombinante contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo que se lia à proteína ENTPD2 humana. "Recombinante", conforme usado no presente documento, significa que o vetor, polinu- cleotídeo, polipeptídeo ou célula é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição ou ligação (por exemplo, em relação a um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreendido pelo mesmo) e/ou outros procedimentos que resultam em um construto que é distinto de um produto presente na natureza. Um vírus ou vetor recombinante é uma partícula viral que compreende um polinucleotídeo recombinante. Os termos incluem, respectivamente, repetições do construto polinu- cleotídico original e progênie do construto viral original.

[00336] O vetor recombinante inclui tipicamente uma ou mais se- quências reguladoras operavelmente ligadas à sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. O termo "sequência reguladora" inclui pro- motores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). As sequências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma se- quência de nucleotídeos, bem como sequências reguladoras e/ou in- duzíveis específicas para tecidos. Os vetores de expressão também podem incluir elementos projetados para otimizar a estabilidade e ca- pacidade de tradução de RNA mensageiro em células hospedeiras, e/ou marcadores de seleção de fármacos para estabelecer clones de células estáveis e permanentes que expressam um anticorpo que se liga à proteína ENTPD2 humana. O projeto do vetor de expressão po- de depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado e similares. Métodos gerais para gerar tais vetores de expressão recombinantes podem ser encontrados em Sambrook e Russell editores (2001) "Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual", 3º edição; a série Ausubel et al. editores (2007 com atualização até 2010) "Current Protocols in Mole- cular Biology", entre outros conhecidos na técnica.

[00337] Um "promotor" é uma sequência de controle que é uma re- gião de uma sequência de ácidos nucleicos na qual são controladas a iniciação e taxa de transcrição. O mesmo pode conter elementos ge- néticos aos quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar,

tal como RNA polimerase e outros fatores de transcrição. As frases "operavelmente posicionado", "operavelmente ligado", "sob controle" e "sob controle de transcrição" significam que um promotor está em uma localização e/ou orientação funcionais corretas em relação a uma se- quência de ácidos nucleicos para controlar a iniciação e/ou expressão de transcrição dessa sequência. Um promotor pode ou não ser usado em conjunto com um "intensificador", que se refere a uma sequência reguladora de atuação cis envolvida na ativação de transcrição de uma sequência de ácidos nucleicos.

[00338] Um promotor pode ser um promotor naturalmente associa- do a um gene ou sequência, visto que pode ser obtido isolando-se as sequências de não codificação 5' localizadas a montante do segmento e/ou éxon de codificação. Tal promotor pode ser denominado "endó- geno". Similarmente, um intensificador pode ser um intensificador na- turalmente associado a uma sequência de ácidos nucleicos, localizado a jusante ou a montante dessa sequência. Alternativamente, certas vantagens serão ganhas posicionando-se o segmento de ácido nuclei- co de codificação sob o controle de um promotor recombinante ou he- terólogo, que se refere a um promotor que não está normalmente as- sociado a uma sequência de ácidos nucleicos em seu ambiente natu- ral. Um intensificador recombinante ou heterólogo se refere também a um intensificador que não está normalmente associado a uma se- quência de ácidos nucleicos em seu ambiente natural. Tais promotores ou intensificadores podem incluir promotores ou intensificadores de outros genes, e promotores ou intensificadores isolados de qualquer outra célula procariótica, viral ou eucariótica, e promotores ou intensifi- cadores que não são "de ocorrência natural", isto é, contendo diferen- tes elementos de diferentes regiões reguladoras de transcrição e/ou mutações que alteram a expressão. Além de produzir sequências de ácidos nucleicos de promotores e intensificadores sinteticamente, as sequências podem ser produzidas com o uso de tecnologia de clona- gem recombinante e/ou amplificação de ácidos nucleicos, por exem- plo, POR, em conexão com as composições descritas no presente do- cumento (consultar os documentos nºs US 4683202, US 5928906). Adicionalmente, é contemplado que também podem ser empregadas sequências de controle que direcionam a transcrição e/ou expressão de sequências dentro de organelas não nucleares, tais como mitocôn- drias, cloroplastos e similares.

[00339] Os promotores empregados podem ser constitutivos, indu- zíveis, sintéticos, específicos para tecidos ou células e/ou úteis, sob as condições adequadas, para direcionar a expressão de alto nível do segmento de DNA introduzido, tal como é vantajoso na produção em larga escala de proteínas e/ou peptídeos recombinantes. Adicional- mente, outros elementos reguladores podem ser também incorporados para promover a expressão de um ácido nucleico que codifica um anti- corpo que se liga à proteína ENTPD2 humana, por exemplo, intensifi- cadores, sítio de ligação ribosomal, sequências terminadoras de trans- crição e similares.

[00340] Em algumas modalidades, um promotor conservador é em- pregado para fornecer expressão constante de um anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano. Os exemplos de um promotor constitutivo incluem, porém sem limitação, o promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), ao promotor inicial do vírus símio 40 (SV40), promotor do vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetições terminais longas (LTR) do vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor de MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor inicial imediato do vírus Epstein-Barr, um promotor do vírus do sarcoma de Rous, bem como promotores de genes humanos tais como, porém sem limitação, o promotor da actina, ao promotor de mi- osina, ao promotor do fator de alongamento-1a, ao promotor de hemo-

globina e ao promotor de creatina cinase.

[00341] Promotores induzíveis também são contemplados como parte da presente descrição. O uso de um promotor induzível propor- ciona um interruptor molecular capaz de ligar a expressão da sequên- cia polinucleotídica que é operavelmente ligada quando tal expressão é desejada, ou de desligar a expressão quando a expressão não é de- sejada. Os exemplos de promotores induzíveis incluem, porém sem limitação, um promotor de metalotionina, um promotor de glucocorti- coide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina.

[00342] Em algumas modalidades, um promotor específico para te- cido ou célula é empregado para fornecer expressão de um anticorpo de ENTPD?2 anti-humano apenas em tecidos ou células específicas. À identidade de promotores ou elementos específicos para tecidos ou células, bem como ensaios para caracterizar suas atividades, são bem conhecidos pelos versados na técnica. Os exemplos incluem o gene LIMK2 humano (Nomoto et a/. 1999, Gene, 236(2):259 a 271), o gene do receptor de somatostatina 2 (Kraus et a/., 1998, FEBS Lett., 428(3): 165 a 170), gene de ligação a ácido retinoico epididimal murino (La- reyre et al., 1999, J. Biol. Chem., 274(12):8,282 a 8,290), CD4 humano (Zhao-Emonet et a/., 1998, Biochirn. Biophys. Acta, 1442(2-3): 109 a 119), colágeno alfa2 de camundongo (XI) (Tsumaki, et a/., 1998, J. Bi- ol. Chem., 273(36):22,861 a 22,864), gene do receptor da dopamina D1A (Lee, et al., 1997, J. Auton. Nerv. Syst., 74(2-3):86 a 90), fator de crescimento do tipo insulina Il (Wu et al/., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 233(1):221 a 226), molécula de adesão plaquetária de células endoteliais humanas-1 (Almendro et a/., 1996, J. Immunol., 157(12):5,411 a 5,421), promotor da creatina cinase muscular (MCK) (Wang et a/., Gene Ther. novembro de 2008;15(22):1,489 a 1,499).

[00343] Em algumas modalidades, um promotor sintético é empre- gado para fornecer expressão de um anticorpo de ENTPD?2 anti-

humano. Os promotores sintéticos podem exceder grandemente as potências de transcrição de promotores naturais. Por exemplo, podem ser selecionados os promotores sintéticos que não são desativados ou cuja atividade não é reduzida pelo mecanismo celular ou fatores endó- genos. Outros elementos, incluindo sítios de ligação de fatores de atu- ação trans e intensificadores, podem ser inseridos no promotor sintéti- co para melhorar a eficiência da transcrição. Promotores sintéticos po- dem ser racionalmente projetados e sintetizados quimicamente para combinar as melhores características de promotores sintéticos e bioló- gicos. Oligos sintéticos são anelados e ligados através de vários pro- cessos para gerar o promotor quimicamente sintetizado de compri- mento completo. Os promotores sintéticos podem ser promotores in- duzíveis ou promotores específicos para tipos de células.

[00344] Um sinal de iniciação específico também pode ser necessá- rio para tradução eficiente de sequências de codificação. Esses sinais incluem o códon de iniciação ATG ou sequências adjacentes. Pode ser necessário fornecer sinais exógenos de controle de tradução, incluindo o códon de iniciação ATG. Alguém de habilidade comum na técnica será prontamente capaz de determinar o mesmo e proporcionar os si- nais necessários. É bem conhecido que o códon de iniciação precisa estar "na estrutura" com o quadro de leitura da sequência de codifica- ção desejada para assegurar a tradução de todo o inserto. Os sinais exógenos de controle de tradução e códons de iniciação podem ser naturais ou sintéticos. A eficiência de expressão pode ser intensificada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição adequados.

[00345] A expressão pode empregar quaisquer células hospedeiras apropriadas conhecidas na técnica, por exemplo, células hospedeiras de mamífero, células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de inseto, etc. Sistemas de expressão tanto procarióticos quanto eucarióticos estão amplamente disponíveis.

Em algumas modalidades, o sistema de expressão é um sistema de expressão de células de mamífero, tal como um sistema de expressão de células CHO. Em algumas modalidades, um ácido nucleico pode ser otimizado quanto a códons para facilitar a expressão em uma célu- la hospedeira desejada. Será importante empregar um promotor e/ou intensificador que direcionem eficazmente a expressão do segmento de DNA no tipo de células, organela e organismo escolhidos para ex- pressão. Aqueles versados na técnica da biologia molecular conhecem de modo geral o uso de combinações de promotores, intensificadores e tipos de células para expressão de proteínas, por exemplo, consultar Sambrook et a/. (2001).

[00346] A maior parte das moléculas de RNA eucarióticas transcri- tas irá sofrer splicing de RNA para remover íntrons dos transcritos pri- mários. Vetores contendo sequências genômicas eucarióticas podem requerer sítios de encadeamento doadores e/ou aceitadores para as- segurar processamento apropriado do transcrito para expressão de proteínas (consultar Chandler et a/., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(8):3,596 a 3,601).

[00347] Os vetores ou construtos da presente descrição compreen- derão, de modo geral, pelo menos um sinal de terminação. Um "sinal de terminação" ou "terminador" é compreendido pelas sequências de DNA envolvidas na terminação específica de um transcrito de RNA por uma RNA polimerase. Assim, em certas modalidades, é contemplado um sinal de terminação que termina a produção de um transcrito de RNA. Um terminador pode ser necessário in vivo para alcançar níveis desejáveis de mensagens. Em sistemas eucarióticos, a região termi- nadora também pode compreender sequências de DNA específicas que permitem clivagem sítio-específica do novo transcrito de modo a expor um sítio de poliadenilação. A mesma sinaliza uma polimerase endógena especializada para adicionar uma extensão de cerca de 200 resíduos A (poli A) à extremidade 3' do transcrito. Moléculas de RNA modificadas com essa cauda polyA parecem ser mais estáveis e são traduzidas de modo mais eficiente. Assim, em outras modalidades en- volvendo eucariotas, é preferencial que o terminador compreenda um sinal para a clivagem do RNA, e é mais preferencial que o sinal do terminador promova a poliadenilação da mensagem. O terminador e/ou elementos de sítio de poliadenilação podem servir para intensifi- car níveis de mensagens e/ou para minimizar a leitura através do cas- sete em outras sequências. Terminadores contemplados para uso na descrição incluem qualquer terminador de transcrição conhecido des- crito no presente documento ou conhecido por alguém de habilidade comum na técnica, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, as sequências de terminação de genes, tal como, por exemplo, o termi- nador do hormônio de crescimento bovino, ou sequências de termina- ção virais, tal como, por exemplo, o terminador do SV40. Em certas modalidades, o sinal de terminação pode ser uma ausência de se- quência passível de transcrição ou tradução, tal como devido a um truncamento de sequência.

[00348] Na expressão, particularmente expressão eucariótica, tipi- camente será incluído um sinal de poliadenilação para efetuar poliade- nilação apropriada do transcrito. Não se acredita que a natureza do sinal de poliadenilação seja crucial para a prática bem-sucedida da descrição e/ou qualquer tal sequência pode ser empregada. As moda- lidades preferenciais incluem o sinal de poliadenilação de SV40 e/ou o sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino, conveni- entes e/ou que são conhecidos por funcionarem bem em várias célu- las-alvo. A poliadenilação pode aumentar a estabilidade do transcrito ou pode facilitar o transporte citoplasmático.

[00349] “Para propagar um vetor em uma célula hospedeira, o mes- mo pode conter uma ou mais origens de sítios de replicação (muitas vezes denominadas "ori"), que é uma sequência de ácidos nucleicos específicas em que é iniciada a replicação. Alternativamente, uma se- quência de replicação autônoma (ARS) pode ser empregada se a célu- la hospedeira for levedura.

[00350] Em certas modalidades da descrição, células contendo um construto de ácido nucleico da presente descrição podem ser identifi- cadas in vitro ou in vivo incluindo-se um marcador no vetor de expres- são. Tais marcadores poderiam conferir uma mudança identificável à célula, permitindo a identificação fácil de células contendo o vetor de expressão. Em geral, um marcador selecionável é aquele que confere uma propriedade que permite seleção. Um marcador selecionável po- sitivo é aquele em que a presença do marcador permite a sua seleção, enquanto um marcador selecionável negativo é aquele em que a sua presença evita a sua seleção. Um exemplo de um marcador selecio- nável positivo é um marcador de resistência a fármacos.

[00351] “Habitualmente, a inclusão de um marcador de seleção de fármacos auxilia a clonagem e identificação de transformantes, por exemplo, genes que conferem resistência a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol são marcadores selecio- náveis úteis. Além de marcadores que conferem um fenótipo que per- mite a discriminação de transformantes com base na implementação de condições, também são contemplados outros tipos de marcadores, incluindo marcadores rastreáveis, tal como GFP, cuja base é análise colorimétrica. Alternativamente, podem ser utilizadas enzimas triáveis, tais como timidina cinase (tk) do vírus herpes simplex ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT). Um versado na técnica também saberá como empregar marcadores imunológicos, possivelmente em conjunto com análise FACS. Não se acredita que seja importante qual é o marcador usado, desde que possa ser expresso simultaneamente com o ácido nucleico que codifica um produto genético. Outros exemplos de mar-

cadores selecionáveis e triáveis são bem conhecidos pelo versado na técnica.

[00352] Os vetores de expressão podem também fornecer uma po- sição de sequência de sinal de secreção para formar uma proteína de fusão com polipeptídeos codificados por sequências de anticorpo de ligação a ENTPD?2 inseridas. Mais frequentemente, as sequências de anticorpo de ligação a ENTPD?2 inseridas são ligadas a uma sequência de sinal antes da inclusão no vetor. Os vetores a serem usados para receber sequências que codificam domínios variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpo de ligação a ENTPD2 também codificam, por ve- zes, regiões constantes ou partes das mesmas. Tais vetores permitem a expressão das regiões variáveis como proteínas de fusão com as regiões constantes levando, assim, à produção de anticorpos intactos ou fragmentos de ligação a antígeno nos mesmos. Tipicamente, tais regiões constantes são humanas.

[00353] A geração de um vetor de expressão pode utilizar um vetor que inclui um sítio múltiplo de clonagem (MCS), que é uma região de ácido nucleico que contém múltiplos sítios de enzimas de restrição, qualquer um dos quais pode ser usado em conjunto com tecnologia recombinante comum para digerir o vetor. Consultar Carbonelli et al, 1999, Levenson et al., 1998, e Cocea, 1997. "Digestão com enzima de restrição" refere-se à clivagem catalítica de uma molécula de ácido nu- cleico com uma enzima que funciona somente em localizações especí- ficas em uma molécula de ácido nucleico. Muitas dessas enzimas de restrição estão comercialmente disponíveis. O uso de tais enzimas é amplamente entendido pelos peritos na técnica. Frequentemente, um vetor é linearizado ou fragmentado com o uso de uma enzima de res- trição que corta dentro do MCS para permitir que sequências exóge- nas sejam ligadas ao vetor. "Ligação" refere-se ao processo de formar ligações de fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico, que podem ou não ser contíguos um em relação ao outro. Técnicas envol- vendo enzimas de restrição e reações de ligação são bem conhecidas pelos versados na técnica de tecnologia recombinante.

[00354] Os métodos para introduzir vetores de expressão contendo as sequências de polinucleotídeos de interesse variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto o tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado pa- ra outros hospedeiros celulares (consultar, de modo geral, Sambrook et al., supra). Outros métodos incluem, por exemplo, eletroporação, tratamento com fosfato de cálcio, transformação mediada por liposso- mo, injeção e microinjeção, métodos balísticos/pistola de genes, viros- somos, imunolipossomos, conjugados de policátion:ácido nucleico, DNA nu, vírions artificiais, fusão à proteína estrutural do vírus da her- pes VP22, absorção intensificada por agente de DNA, ex vivo transdu- ção, fusão de protoplasto, transdução retroviral, transfecção viral, transfecção à base de lipídio ou outras técnicas convencionais. No ca- so de fusão de protoplasto, as células são cultivadas em meios e tria- das quanto à atividade adequada. Para produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável será fre- quentemente desejada. Por exemplo, linhagens de células que ex pressam estavelmente polipeptídeos podem ser preparadas com o uso de vetores de expressão que contêm origens de replicação virais ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecioná- vel. Após a introdução do vetor, as células podem ser deixadas prolife- rar por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para meios seletivos. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite a proliferação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas em meios seletivos. Células resistentes estavelmente transfectadas podem ser proliferadas com o uso de técnicas de cultura de tecido adequadas pa- ra o tipo de célula. Os métodos e condições para cultivar as células transfectadas resultantes e para recuperar a molécula de anticorpo produzida são conhecidos pelos versados na técnica, e podem ser va- riadas ou otimizadas dependendo do vetor de expressão específico e célula hospedeira de mamífero empregados, com base na presente descrição.

[00355] Também são fornecidas no presente documento células que incluem qualquer um dos vetores de expressão descritos no pre- sente documento. Em algumas modalidades, a descrição apresenta uma célula hospedeira que inclui uma molécula de ácido nucleico des- crita no presente documento. Tais células podem ser uma célula hos- pedeira ou uma célula terapêutica. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados de forma intercambiável no presente documento, que se referem não só à célula em questão particular, mas também à progênie ou progênie potencial de tal célula. Devido ao fato de que certas modificações podem ocorrer em gera- ções sucessivas, devido a mutação ou influências ambientais, tal pro- gênie pode, de fato, não ser idêntica à célula paterna, mas ainda está incluída no escopo do termo conforme usado no presente documento.

[00356] Em uma modalidade, as células hospedeiras são genetica- mente modificadas para compreender ácidos nucleicos que codificam a molécula de anticorpo. Em uma modalidade, as células hospedeiras são geneticamente modificadas com o uso de um cassete de expres- são. O sintagma "cassete de expressão" refere-se a sequências de nucleotídeos que podem realizar a expressão de um gene em hospe- deiros compatíveis com tais sequências. Tais cassetes podem incluir um promotor, um quadro de leitura aberto com ou sem íntrons, e um sinal de terminação. Os fatores adicionais necessários ou úteis para realizar a expressão também podem ser usados, como, por exemplo,

um promotor induzível.

[00357] As células hospedeiras para abrigar e expressar as cadeias de anticorpo de ligação a ENTPD2 podem ser, porém sem limitação, uma célula eucariótica ou uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana, uma célula de inseto ou uma célula humana. E. coli é um hospedeiro procariótico útil para clonar e expressar os polinucleotídeos da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, tal como Bacillus subtilis, e outras entero- bacteriaceae, tal como Salmonella, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas. Nesses hospedeiros procarióticos, podem também ser produzidos vetores de expressão, que contêm tipicamente sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Adicionalmente, qualquer núme- ro dentre uma variedade de promotores bem conhecidos estará pre- sente, tal como o sistema promotor, um sistema promotor de triptofano (trp), um sistema promotor de beta-lactamase ou um sistema promotor de fago lambda. Os promotores controlam tipicamente a expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e têm sequências de sítio de ligação a ribossomo e similares, para iniciar e concluir a trans- crição e a tradução. Outros micróbios, tal como levedura, podem tam- bém ser empregados para expressar polipeptídeos de ligação a EN- TPD?2 da invenção. Podem também ser usadas células de inseto em combinação com vetores de baculovírus. As células de inseto adequa- das incluem, porém sem limitação, células Sf9.

[00358] Em uma modalidade, as células hospedeiras de mamífero são usadas para expressar e produzir os anticorpos de ligação a EN- TPD?2 da presente invenção. Por exemplo, as mesmas podem ser ou uma linhagem de células de hibridoma que expressa genes de imuno- globulina endógenos (por exemplo, clones de hibridoma de mieloma 1D6.C9) ou uma linhagem de células de mamífero que abriga um vetor de expressão exógeno (por exemplo, a célula de mieloma SP2/0). As mesmas incluem qualquer célula humana ou animal mortal normal ou imortal normal ou anormal. Por exemplo, várias linhagens de células hospedeiras adequadas com a capacidade para secretar imunoglobu- linas intactas foram desenvolvidas, incluindo as linhagens de células CHO, várias linhagens de células Cos, células HeLa, linhagens de cé- lulas de mieloma, células B transformadas e hibridomas. O uso de cul- tura celular de tecido de mamífero para expressar polipeptídeos é dis- cutido geralmente em, por exemplo, Winnacker, From Genes to Clo- nes, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Os vetores de expressão para células hospedeiras de mamífero podem incluir sequências de controle de expressão, tal como uma origem de replicação, um promotor e um intensificador (consultar, por exemplo, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 a 68, 1986), e sítios de informações de processamento necessá- rios, tais como sítios de ligação a ribossomo, sítios de splicing de RNA, sítios de poliadenilação e sequências terminadoras transcricionais. Es- ses vetores de expressão usualmente contêm promotores derivados de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Os promotores adequados podem ser constitutivos, específicos para tipo de célula, específicos para estágio e/ou moduláveis ou reguláveis. Os promoto- res úteis incluem, porém sem limitação, o promotor de metalotioneína, o promotor tardio principal de adenovírus constitutivo, o promotor de MMTV induzível por dexametasona, o promotor de SV40, o promotor de MRP pollll, o promotor de MPSV constitutivo, o promotor de CMV induzível por tetraciclina (tal como o promotor de CMV precoce imedia- to humano), o promotor de CMV constitutivo e combinações de e pro- motor-intensificador conhecidas na técnica.

[00359] uma célula hospedeira pode ser usada para produzir ou ex- pressar um anticorpo que se liga à proteína ENTPD2 humana. Conse- quentemente, a descrição também apresenta métodos para produzir um anticorpo que se liga à proteína ENTPD2 humana com o uso de uma célula hospedeira. Em uma modalidade, o método inclui cultivar a célula hospedeira (em que um vetor de expressão recombinante que codifica o anticorpo foi introduzido) em um meio adequado, de modo que o anticorpo que se liga à proteína ENTPD2 humana seja produzi- do. Em outra modalidade, o método inclui, ainda, isolar o anticorpo do meio ou da célula hospedeira. As células eucariotas adequadas inclu- em, porém sem limitação, células Vero, células HeLa, células COS, células CHO, células HEK293, células BHK e células MDCKII. Produção de Anticorpos Monoclonais

[00360] Os anticorpos monoclonais (mMAbs) podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpos monoclonais, por exemplo, a técnica padrão de hibridização de células somáticas de Kohler e Milstein, 1975 Nature 256: 495. Mui- tas técnicas para produzir anticorpos monoclonais podem ser empre- gadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

[00361] Um sistema animal para preparar hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamen- to de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.

[00362] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanizados. Os anticorpos quiméricos ou humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal murino preparado conforme descrito acima. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeias pesadas e leves pode ser obtido a partir do hibridoma murino de interesse e genetica- mente modificado para conter sequências de imunoglobulina não mu-

rinas (por exemplo, humanas) com o uso de técnicas padrão de biolo- gia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as re- giões variáveis murinas podem ser ligadas às regiões constantes hu- manas com o uso de métodos conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 4.816.567 por Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões de CDR murinas podem ser inseri- das em um framework humano com o uso de métodos conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 5.225.539 por Win- ter, e as Patentes nºº U.S. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e

6.180.370 por Queen et al.

[00363] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais huma- nos direcionados contra ENTPD2 podem ser gerados com o uso de camundongos transgênicos ou transcromossômicos portando partes do sistema imunológico humano em vez do sistema do camundongo. Esses camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem ca- mundongos denominados no presente documento camundongos Hu- MAb e camundongos KM, respectivamente, e são denominados coleti- vamente "camundongos de lg humana".

[00364] O HuMAb Mouse€& (Medarex, Inc.) contém miniloci do gene da imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina de cadeias pesada (mu e gama) e leve kappa humanas não rearranja- das, juntamente com mutações direcionadas que inativam os loci en- dógenos da cadeia mu e kappa (consultar, por exemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6.474): 856 a 859). Consequentemente, os ca- mundongos exibem expressão reduzida de IgM ou K de camundongo e, em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos sofrem troca de classes e mutação somática para gerar anticorpos monoclionais IgG-kappa humanos de alta afini- dade (Lonberg, N. et al., 1994 supra; revisto em Lonberg, N., 1994

Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 a 101; Lonberg, N. e Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65 a 93, e Harding, F. e Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536 a 546). A preparação e o uso de camundongos HuMAb, e as modificações genômicas trans- portadas por tais camundongos, são adicionalmente descritos em Tay- lor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6,287 a 6,295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647 a 656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 94:3,720 a 3,724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117 a 123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821 a 830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2,912 a 2,920; Taylor, L. et al, 1994 International Immunology 579 a 591; e Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845 a 851. Consultar, ainda, as Patentes nº U.S. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650;

5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas por Lonberg e Kay; Patente nº U.S. 5.545.807 por Surani et al.; Publi- cações PCT nº WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas por Lonberg e Kay; e Publicação PCT nº WO 01/14424 por Korman et al.

[00365] Em algumas modalidades, os anticorpos humanos podem ser criados com o uso de um camundongo que porta sequências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomos, tal como um camundongo que porta um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano. Tais camundongos, de- nominados no presente documento "camundongos KM", são descritos em detalhes na publicação PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

[00366] Adicionalmente, sistemas de animal transgênico alternati- vos que expressam genes de imunoglobulina humana estão disponí- veis na técnica e podem ser usados para produzir anticorpos de liga- ção a ENTPD?2 e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo denominado o Xenomou-

se (Abgenix, Inc.) pode ser usado. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes nº U.S. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598;

6.150.584 e 6.162.963 por Kucherlapati et al.

[00367] Além disso, sistemas animais transcromossômicos alterna- tivos que expressam genes da imunoglobulina humana estão disponí- veis na técnica e podem ser usados para aumentar anticorpos de liga- ção a ENTPD?2 da invenção. Por exemplo, podem ser usados camun- dongos que transportam tanto um transcromossomo da cadeia pesada humana como um transcromossomo da cadeia leve humana, denomi- nados "camundongos CT"; tais camundongos são descritos em To- mizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97:722 a 727. Além dis- So, vacas portadoras de transcromossomos de cadeias pesadas e le- ves humanas têm sido descritos na técnica (Kuroiwa et al, 2002 Nature Biotechnology 20:889 a 894) e podem ser usadas para criar anticorpos de ligação a ENTPD?2 da invenção.

[00368] Os anticorpos monoclonais humanos também podem ser preparados com o uso de métodos de exibição de fagos para triar bi- bliotecas de genes de imunoglobulinas humanas. Tais métodos de apresentação de fagos para isolar anticorpos humanos são estabele- cidos na técnica ou descritos nos exemplos abaixo. Consultar, por exemplo: As Patentes nºº U.S. 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 por Ladner et al; as Patentes nºº U.S. 5.427.908 e 5.580.717 por Dower et al; as Patentes nº U.S. 5.969.108 e 6.172.197 por McCatfferty et al; e as Patentes nº U.S. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313;

6.582.915 e 6.593.081 por Griffiths et al.

[00369] Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem também ser preparados com o uso de camundongos SCID nos quais as células imunes humanas foram reconstituídas de modo que uma resposta de anticorpos humanos possa ser gerada após a imunização. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes nº U.S.

5.476.996 e 5.698.767 por Wilson et al. Métodos para Modificar Geneticamente Anticorpos Modificados

[00370] Conforme discutido acima, os anticorpos de ligação a EN- TPD?2 que têm sequências de VH e VL ou sequências de cadeia pesa- da e leve de comprimento completo mostradas no presente documento podem ser usados para criar novos anticorpos de ligação a ENTPD2 modificando-se as sequências de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de comprimento completo, sequências de VH e/ou VL ou a região (ou regiões) constante ligada às mesmas. Assim, em outro aspecto da in- venção, as características estruturais de anticorpo de ligação a EN- TPD?2 da invenção são usadas para criar anticorpos de ligação a EN- TPD?2 estruturalmente relacionados que mantêm pelo menos uma pro- priedade funcional dos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção, tal como ligação e inibição de ENTPD2 hu- mana.

[00371] Por exemplo, uma ou mais regiões CDR dos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção, ou mutações dos mesmos, podem ser combinadas de modo recombi- nante com regiões de framework conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos de ligação a ENTPD2 geneticamente modificados de modo recombinante adicionais e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção, conforme discutido acima. Outros tipos de modi- ficações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o método de modificação genética é uma ou mais das se- quências VH e/ou VL fornecidas no presente documento, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Para criar o anticorpo geneticamente modificado, não é necessário preparar realmente (isto é, expressar como uma proteína) um anticorpo que tem uma ou mais das sequên- cias de VH e/ou VL fornecidas no presente documento ou uma ou mais regiõêês CDR das mesmas. Pelo contrário, as informações conti-

das na sequência (ou sequências) são usadas como material de parti- da para criar uma sequência (ou sequências) de "segunda geração" derivada da sequência (ou sequências) original e, então, a sequência (ou sequências) de "segunda geração” é preparada e expressada co- mo uma proteína.

[00372] A sequência de anticorpo alterada pode também ser prepa- rada triando-se bibliotecas de anticorpo que têm sequências de CDR3 fixas ou determinantes de ligação essenciais mínimos, conforme des- crito no documento nº US20050255552 e diversidade nas sequências de CDR1 e CDR?2. A triagem pode ser realizada de acordo com qual- quer tecnologia de triagem adequada para triar anticorpos de bibliote- cas de anticorpos, tal como tecnologia de apresentação de fagos.

[00373] Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpos alterada. O anti- corpo codificado pela sequência (ou sequências) de anticorpos altera- da é aquele que mantém uma, algumas ou todas as propriedades fun- cionais dos anticorpos de ligação a ENTPD?2 descritos no presente do- cumento, em que as propriedades funcionais incluem, porém sem limi- tação, se ligar especificamente a e estabilizar proteína ENTPD2 hu- mana.

[00374] As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas com o uso de ensaios padrão disponíveis na técnica e/ou descritos no presente documento, tais como aqueles apresenta- dos nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).

[00375] Em algumas modalidades dos métodos para modificar ge- neticamente anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mes- mos da invenção, mutações podem ser introduzidas aleatória ou sele- tivamente ao longo de todo ou parte de uma sequência de codificação de anticorpo de ligação a ENTPD?2 e os anticorpos de ligação a EN- TPD?2 modificados resultantes podem ser triados quanto a atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais, conforme descrito no pre- sente documento. Métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 descreve métodos pa- ra criar e triar mutações de anticorpos com o uso de mutagênese de saturação, montagem de ligação sintética ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 descre- ve métodos de utilização de métodos de rastreamento computacionais para otimizar as propriedades físico-químicas dos anticorpos. Caracterização dos Anticorpos

[00376] Os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção podem ser caracterizados por vários ensaios funcionais. Por exemplo, podem ser caracterizados por sua capacida- de de se ligar à proteína ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana).

[00377] A capacidade de um anticorpo de se ligar a ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana) pode ser detectada identificando- se o anticorpo de interesse diretamente, ou o anticorpo pode ser não identificado e a ligação detectada indiretamente com o uso de vários formatos de ensaio de sanduíche conhecidos na técnica.

[00378] Em algumas modalidades, os anticorpos de ligação a EN- TPD?2 e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção bloqueiam ou competem por a ligação de um anticorpo de ligação a ENTPD?2 de referência à proteína ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana). Os mesmos podem ser anticorpos de ligação a ENTPD2 completamente humanos ou humanizados descritos acima. Os mesmos podem ser também outros anticorpos de ligação a EN- TPD2 humanos, de camundongo, quiméricos ou humanizados que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência. A capacidade de bloquear ou competir com a ligação de anticorpo de referência indi- ca que o anticorpo de ligação a ENTPD?2 sob teste se liga a um epíto-

po igual ou similar àquele definido pelo anticorpo de referência, ou a um epítopo que é suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anti- corpo de ligação a ENTPD2 de referência. É especialmente provável que tais anticorpos compartilhem as propriedades vantajosas identifi- cadas para o anticorpo de referência. A capacidade de bloquear ou competir com o anticorpo de referência pode ser determinada, por exemplo, por um ensaio de ligação competitiva. Com um ensaio de ligação competitiva, o anticorpo sob teste é examinado quanto à capa- cidade de inibir a ligação específica do anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como proteína ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana). Um anticorpo de teste compete com o anticorpo de referência pela ligação específica ao antígeno se um excesso do anti- corpo de teste inibir substancialmente a ligação do anticorpo de refe- rência. Inibição substancial significa que o anticorpo de teste reduz a ligação específica do anticorpo de referência usualmente em pelo me- nos 10%, 25%, 50%, 75% ou 90%.

[00379] Há diversos ensaios de ligação competitiva conhecidos que podem ser usados para avaliar a competição de um anticorpo com um anticorpo de referência pela ligação a uma proteína particular, nesse caso, ENTPD?2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana). Os mesmos incluem, por exemplo, radioimunoensaio direto ou indireto de fase sóli- da (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição de sanduíche (consultar Stahli et al., Me- thods in Enzymology 9:242 a 253, 1983); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (consultar Kirkland et al., J. Immunol. 137:3.614 a 3,619, 1986); ensaio identificado direto de fase sólida, ensaio de sanduíche identificado direto de fase sólida (consultar Harlow & Lane, supra); RIA de identificação direta de fase sólida com o uso de identificação com |- 125 (consultar Morel et al., Molec. Immunol. 25:7 a 15, 1988); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 a

552, 1990); e RIA identificado direto (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 a 82, 1990). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que por- tam qualquer um dos destes: um anticorpo de teste de ligação a EN- TPD?2 não identificado e um anticorpo de referência identificado. A ini- bição competitiva é medida determinando-se a quantidade de identifi- cação ligada à superfície sólida ou células na presença do anticorpo de teste. Usualmente, o anticorpo de teste está presente em excesso. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos competitivos) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adja- cente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de re- ferência para que impedimento estérico ocorra.

[00380] Para determinar se os anticorpos monoclonais de ligação a ENTPD?2 selecionados se ligam a epítopos exclusivos, cada anticorpo pode ser biotinilado com o uso de reagentes comercialmente disponí- veis (por exemplo, reagentes da Pierce, Rockford, Ill.). Estudos de competição com o uso de anticorpos monoclonais não identificados e anticorpos monoclionais biotinilados podem ser realizados com o uso de placas de ELISA revestidas com proteína ENTPD?2. A ligação de MAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda de estrepavidina- fosfatase alcalina. Para determinar o isotipo de um anticorpo de liga- ção a ENTPD?2 purificado, ELISA de isotipo pode ser realizado. Por exemplo, os poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com 1 ug/ml de IgG anti-humana de um dia para o outro a 4 “C. Após bloqueio com 1% de BSA, as placas são reagidas com 1 ug/ml ou me- nos do anticorpo monoclional de ligação a ENTPD2 ou controles de isotipo purificados, à temperatura ambiente por uma a duas horas. Os poços podem ser, então, reagidos com IgG1 humana ou sondas con- jugadas à fosfatase alcalina específicas para IM humana. As placas são, então, desenvolvidas e analisadas de modo que o isotipo do anti- corpo purificado possa ser determinado.

[00381] Para demonstrar a ligação de anticorpos monoclionais de ligação a ENTPD2 a células vivas que expressão proteína ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana), citometria de fluxo pode ser usada. Em resumo, as linhagens celulares que expressam ENTPD2 (cultivadas sob condições de crescimento padrão) podem ser mistura- das com várias concentrações de anticorpo de ligação a ENTPD2 em PBS contendo 0,1% de BSA e 10% de soro fetal de bezerro, e incuba- das a 37 “C por 1 hora. Após lavagem, as células são reagidas com anticorpo IgG anti-humano identificado com fluoresceína sob as mes- mas condições que o manchamento de anticorpo primário. As amos- tras podem ser analisadas por instrumento FACScan com o uso de propriedades de dispersão lateral e de luz para entrar em células úni- cas. Um ensaio alternativo com o uso de microscopia de fluorescência pode ser usado (adicionalmente ou em vez do ensaio de citometria de fluxo). As células podem ser manchadas exatamente conforme des- crito acima e examinado por microscopia de fluorescência. Esse méto- do permite a visualização de células individuais, mas pode ter sensibi- lidade diminuída dependendo da densidade do antígeno.

[00382] Os anticorpos de ligação a ENTPD?2 e fragmentos de liga- ção a antígeno dos mesmos da invenção podem ser, ainda, testados quanto á reatividade com proteína ENTPD2 (por exemplo, proteína ENTPD2 humana) ou fragmento antigênico por Western blotting. Em resumo, proteína ENTPD?2 purificada (por exemplo, proteína ENTPD2 humana) ou proteínas de fusão ou extratos celulares que expressam ENTPD?2 podem ser preparados e submetidos a eletroforese de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio. Após eletroforese, os antí- genos separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com 10% de soro fetal de bezerro e sondados com os an-

ticorpos monoclonais a serem testados. A ligação a IgG humana pode ser detectada com o uso de fosfatase alcalina de IgG anti-humana e desenvolvida com tabletes de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

[00383] Os anticorpos de ligação a ENTPD?2 e fragmentos de liga- ção a antígeno dos mesmos da invenção podem ser, ainda, testados quanto à suas capacidades de modular uma ou mais ativida- des/funções de ENTPD?2.

[00384] Os anticorpos de ligação a ENTPD?2 e fragmentos de liga- ção a antígeno dos mesmos da invenção podem ser também testados com o uso de qualquer um dos métodos ou ensaios descritos nos Exemplos. Métodos de Tratamento e Uso Terapêutico

[00385] Os anticorpos da presente invenção têm inúmeras utilida- des diagnósticas e terapêuticas in vitro e in vivo envolvendo o diag- nóstico e o tratamento de distúrbios com patofisiologia dependente de ENTPD?2. Por exemplo, essas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir e diagnosticar uma variedade de distúrbios com patofisiologia dependente de ENTPD2. Consequente- mente, em um aspecto, são fornecidos no presente documento méto- dos para tratar um câncer em um indivíduo que precisa do mesmo administrando-se ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efi- caz de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, um ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, um vetor que compre- ende um ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno, uma célula que compreende tal ácido nucleico ou vetor, ou uma composição farmacêutica que compreende tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, ácido nucleico, vetor ou célula.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para inibir ou reduzir a proliferação de células tumorais em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ENTPD?2 anti-humano conforme descrito no presente documento.

[00386] Em outro aspecto, um método para tratar um indivíduo, por exemplo, reduzir ou melhorar, uma afecção ou distúrbio hiperprolifera- tivo (por exemplo, um câncer), por exemplo, tumor sólido, um câncer hematológico, tumor de tecido macio ou uma lesão metastática em um indivíduo é fornecido.

[00387] — Consequentemente, em uma modalidade, a invenção for- nece um método para inibir a proliferação de células tumorais em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas de anticorpo de ENTPD?2 anti-humano ou fragmento funcional do mesmo, conforme descrito no presente documento, sozinho ou em combinação com ou- tros agentes, por exemplo, agentes terapêuticos, ou modalidades tera- pêuticas.

[00388] Em algumas modalidades, tais métodos pode compreender, ainda, uma etapa de avaliar os níveis de expressão de ENTPD2 em uma amostra obtida a partir de um indivíduo, por exemplo, biópsia de tecido do indivíduo.

[00389] O termo "câncer" destina-se a incluir todos os tipos de crescimentos cancerosos ou processos oncogênicos, tecidos metastá- ticos ou células, tecidos ou órgãos transformados de modo maligno, independentemente do tipo histopatológico ou estágio da invasão. Exemplos de distúrbios cancerosos incluem, porém sem limitação, tu- mores sólidos, tumores de tecido mole e lesões metastáticas. Os exemplos de tumores sólidos incluem malignidades, por exemplo, sar- comas, adenocarcinomas e carcinomas, dos vários sistemas de ór-

gãos, tais como aqueles que afetam o fígado, pulmão, mama, linfoide, gastrointestinal (por exemplo, cólon), trato genitourinário (por exemplo, células renais, uroteliais), próstata e faringe. Os adenocarcinomas in- cluem malignidades, tais como a maioria dos cânceres de cólon, cân- cer retal, carcinoma de célula renal, câncer de fígado (hepatocarcino- ma, por exemplo, um hepatocarcinoma avançado, com ou sem uma infecção viral, por exemplo, uma hepatite viral crônica), carcinoma de células não pequenas do pulmão, câncer do intestino delgado e câncer do esôfago. Os carcinomas de células escamosas incluem malignida- des, por exemplo, no pulmão, esôfago, pele, região da cabeça e do pescoço, cavidade oral, ânus e colo do útero.

[00390] Lesões metastáticas dos cânceres supracitados também podem ser tratadas ou prevenidas com o uso dos métodos e composi- ções da invenção.

[00391] Cânceres exemplificativos, cujo crescimento pode ser inibi- do com o uso das moléculas de anticorpos descritas no presente do- cumento, incluem cânceres tipicamente responsivos à imunoterapia. Os exemplos não limitantes de cânceres preferenciais para tratamento incluem câncer gastrointestinal (por exemplo, câncer gástrico (estô- mago), câncer colorretal (CRC)) e câncer do esôfago (por exemplo, carcinoma de célula escamosa do esôfago (ESCC)). Adicionalmente, malignidades refratárias ou recorrentes podem ser tratadas usando-se as moléculas de anticorpo descritas no presente documento.

[00392] Os exemplos de outros cânceres que podem ser tratados incluem câncer de pulmão (por exemplo, um câncer de pulmão de cé- lula não pequena (NSCLC) (por exemplo, um NSCLC com histologia escamosa e/ou não escamosa, ou um adenocarcinoma NSCLC)), um melanoma (por exemplo, um melanoma avançado), um câncer renal (por exemplo, um carcinoma de célula renal, por exemplo, carcinoma de célula renal clara), um câncer de fígado, um mieloma (por exemplo,

um mieloma múltiplo), um câncer de próstata, um câncer de mama (por exemplo, um câncer de mama que não expressa um, dois ou to- dos dentre receptor de estrogênio, receptor de progesterona ou Her2/neu, por exemplo, um câncer de mama triplo negativo), um cân- cer pancreático, um câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carci- noma de célula escamosa de cabeça e pescoço (HNSCC), câncer anal, câncer gastroesogáfico, câncer da tireoide, câncer cervical, uma doença linfoproliferativa (por exemplo, uma doença linfoproliferativa após transplante) ou um câncer hematológico, linfoma de célula T, um linfoma não Hodgkin ou uma leucemia (por exemplo, uma leucemia mieloide), câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uteri- no, câncer de ovário, câncer retal, câncer anal, câncer gastresofágico, câncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, mieloma (por exemplo, mieloma múltiplo) câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, leucemias crônicas ou agudas, incluindo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leu- cemia linfocítica crônica, tumores sólidos da infância, linfoma linfocíti- co, câncer da bexiga, câncer do rim (por exemplo, câncer rena, por exemplo, um carcinoma de célula renal (RCC) (por exemplo, um RCC metastático ou carcinoma de célula renal clara)), câncer do ureter, car- cinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), linfoma primário do CNS, angiogênese tumoral, tumor do eixo espi- nhal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de célula escamosa, linfoma de célula T, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo aqueles induzi- dos por asbestos, e combinações de ditos cânceres.

[00393] Em algumas modalidades, as terapias aqui podem ser usa- das para tratar um paciente que tem (ou é identificado como tendo) um câncer associado a uma infecção, por exemplo, uma infecção viral ou bacteriana. Os cânceres exemplificativos incluem câncer cervical, cân- cer anal, câncer de célula escamosa de cabeça e pescoço associado ao HPV, papilomas esofágicos associados ao HPV, linfomas associa- dos ao HHVG6, linfomas associados ao EBV (incluindo linfoma de Bur- kitt), linfoma de MALT gástrico, outros linfomas de MALT associados à infecção, HCC e sarcoma de Kaposi.

[00394] Em outras modalidades, o câncer é uma malignidade ou câncer hematológico, incluindo, mas sem limitações, uma leucemia ou um linfoma. Por exemplo, a molécula de anticorpo de ENTPD?2 anti- humano ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo sozinho ou em, combinação com outros agentes, por exemplo, agentes terapêuti- cos, pode ser usada para tratar cânceres e malignidades, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, leucemias agudas, incluindo, po- rém sem limitação, por exemplo, leucemia linfoide aguda de célula B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de célula T ("TALL"), leucemia linfoi- de aguda (ALL); uma ou mais leucemias crônicas, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, leucemia mielógena crônica (CML), leu- cemia linfocítica crônica (CLL); cânceres hematológicos ou afecções hematológicas adicionais incluindo, porém sem limitação, por exemplo, leucemia pró-linfocítica de células B, neoplasma blástico de células dendríticas plasmacitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de gran- des células B, Linfoma folicular, Leucemia de células pilosas, linfoma folicular de pequenas células ou grandes células, afecções linfoprolife- rativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células do manto, Linfoma da zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielo-

displásica, linfoma não de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de células dendríticas plasmacitoides, macroglobulinemia de Waldens- trom e "pré-leucemia" que são um conjunto diversificado de afecções hematológicas unidas pela produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides e similares.

[00395] Em uma modalidade, o câncer é escolhido dentre um cân- cer de cólon (por exemplo, câncer colorretal (CRC) ou adenocarcino- ma colorretal), câncer gástrico (por exemplo, adenocarcinoma do es- tômago, carcinoma gástrico), câncer de esôfago (por exemplo, carci- noma de célula escamosa do esôfago (ESCC)), câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas), câncer de mama (por exemplo, adenocarcinoma de mama) ou câncer de ovário.

[00396] Em uma modalidade, o câncer é câncer colorretal (CRC) ou adenocarcinoma colorretal.

[00397] Em outramodalidade, o câncer é câncer gástrico.

[00398] Em ainda outra modalidade, o câncer é carcinoma de célula escamosa do esôfago (ESCC).

[00399] Em ainda outra modalidade, o câncer superexpressa EN- TPD?2 (ENTPD?2 positivo/ENTPD2+), tal como ENTPD2+ CRC, câncer de estômago ENTPD2+ (por exemplo, câncer gástrico ENTPD2), car- cinoma de célula escamosa do esôfago ENTPD2+ (ENTPD2+ ESCC).

[00400] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, em que o ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, ou o vetor, ou a célu- la que compreende um ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou fra- gmento de ligação a antígeno, ou a composição farmacêutica que compreende tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, ácido nucleico, vetor, ou célula pode ser administrado ao indivíduo através de uma via intravenosa, intratumoral ou subcutânea. Em algumas mo- dalidades, tal anticorpo ou fragmento do mesmo, ácido nucleico, vetor,

célula ou composição farmacêutica é administrado por via intravenosa.

[00401] “Também é fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, uma composi- ção farmacêutica que compreende tal anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno, um ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno ou um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, para uso no tratamento de um câncer.

[00402] A presente descrição também inclui os usos de um anticor- po ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, uma composição farmacêutica que compreende tal anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno, um ácido nucleico que codi- fica tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ou um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica tal anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, na fabricação de um medicamento para trata- mento de um câncer. Terapias de Combinação

[00403] Os vários tratamentos descritos acima podem ser combina- dos com outro tratamento. A presente descrição também se refere a uma composição farmacêutica que compreende uma combinação de acordo com a descrição descrita no presente documento, em particular juntamente com instruções para uso simultâneo, separado ou sequen- cial use (especialmente para ser ativa em conjunto) da mesma no tra- tamento de um câncer. Por exemplo, os anticorpos de ENTPD2 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descrito no presente documento pode ser combinado com um ou mais dentre padrão de tratamento (por exemplo, para um câncer), outra molécula de anticor- po, um imunomodulador (por exemplo, um ativador de uma molécula coestimuladora ou um inibidor de uma molécula coinibidora); uma va- cina, por exemplo, uma vacina terapêutica contra câncer; ou outras formas de terapia celular, conforme descrito abaixo.

[00404] Consequentemente, os métodos para tratar um câncer descrito no presente documento podem, ainda, incluir administrar pelo menos um agente terapêutico adicional ao indivíduo que precisa de tratamento. São também fornecidos no presente documento métodos par tratar um câncer que compreendem administrar pelo menos dois agentes terapêuticos adicionais ao indivíduo que precisa de tratamen- to.

[00405] O termo "combinação" refere-se a uma combinação fixa em uma forma unitária de dosagem ou uma administração combinada em que um composto da presente invenção e pelo menos um parceiro de combinação (por exemplo, pelo menos um outro fármaco conforme explicado abaixo, também denominado "agente (ou agentes) terapêu- tico" ou "coagente (ou coagentes)") pode ser administrado indepen- dentemente ao mesmo tempo ou separadamente dentro de intervalos de tempo, especialmente onde esses intervalos de tempo permitem que os parceiros de combinação mostrem um efeito cooperativo, por exemplo, sinérgico. Os componentes únicos podem ser embalados em um kit ou separadamente. Um ou ambos os componentes (por exem- plo, pós ou líquidos) podem ser reconstituídos ou diluídos até uma do- se desejada antes da administração. Os termos "coadministração" ou "administração combinada" ou outros semelhantes, tal como aqui utili- zados, pretendem abranger a administração do parceiro de combina- ção selecionado a um único sujeito em necessidade do mesmo (por exemplo, um paciente) e pretendem incluir os regimes de tratamento em que os agentes não são administrados necessariamente pela mesma via de administração ou ao mesmo tempo. O termo “combina- ção farmacêutica”, como usado no presente documento, significa um produto que resulta da mistura ou combinação de mais de um agente terapêutico e inclui tanto combinações fixas como não fixas dos agen-

tes terapêuticos. O termo "combinação fixa" significa que os agentes terapêuticos, por exemplo um composto da presente invenção e um parceiro de combinação, são ambos administrados a um paciente si- multaneamente na forma e uma entidade ou dosagem única. O termo "combinação não fixa" significa que os agentes terapêuticos, por exemplo, um composto da presente invenção e pelo menos um parcei- ro de combinação, são administrados a um paciente como entidades separadas simultânea, concomitante ou sequencialmente sem nenhum limite de tempo específico, em que tal administração fornece níveis terapeuticamente eficazes dos dois compostos no corpo do paciente. O último também se aplica à terapia de coquetel, por exemplo, a ad- ministração de três ou mais agentes terapêuticos.

[00406] O termo "combinação farmacêutica", conforme usado no presente documento, refere-se a uma combinação fixa em uma forma unitária de dosagem ou combinação não fixa ou um Kkit de partes para a administração combinada em que dois ou mais agentes terapêuticos podem ser administrados independentemente ao mesmo tempo ou separadamente dentro de intervalos de tempo, especialmente quando esses intervalos de tempo permitem que os parceiros de combinação exibam um efeito cooperativo, por exemplo, sinérgico.

[00407] O termo "terapia de combinação" refere-se à administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar uma afecção ou dis- túrbio terapêutico descrito na presente descrição. Tal administração engloba a coadministração desses agentes terapêuticos de um modo substancialmente simultâneo, tal como em uma cápsula única tendo uma razão fixa de ingredientes ativos. Alternativamente, tal adminis- tração abrange a coadministração em recipientes múltiplos ou separa- dos (por exemplo, tabletes, cápsulas, pós e líquidos) para cada ingre- diente ativo. Pós e/ou líquidos podem ser reconstituídos ou diluídos até uma dose desejada antes da administração. Além disso, tal admi-

nistração abrange também o uso de cada tipo de agente terapêutico de um modo sequencial, aproximadamente ao mesmo tempo ou em diferentes momentos. Em ambos os casos, o regime de tratamento irá conferir efeitos benéficos da combinação de fármaco no tratamento das condições ou distúrbios descritos no presente documento.

[00408] As moléculas de anticorpo de ENTPD2 anti-humano po- dem ser usadas em combinação com outras terapias. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição da presente in- venção coformulada com, e/ou coadministrada com, um ou mais agen- tes terapêuticos adicionais, por exemplo, um ou mais agentes anticân- cer, agentes citotóxicos ou citostáticos, tratamento hormonal, vacinas e/ou outras imunoterapias. Em outras modalidades, as moléculas de anticorpo são administradas em combinação com outras modalidades de tratamento terapêuticas, incluindo cirurgia, radiação, criocirurgia e/ou termoterapia. Tais terapias de combinação podem utilizar vanta- josamente dosagens mais baixas dos agentes terapêuticos adminis- trados, evitando, assim, possíveis toxicidades ou complicações asso- ciadas às várias monoterapias.

[00409] O termo "em combinação com" não se destina a implicar que a terapia ou os agentes terapêuticos devem ser administrados ao mesmo tempo e/ou formulados para entrega juntos, embora esses mé- todos de entrega sejam abrangidos pelo escopo descrito no presente documento.

[00410] As moléculas de anticorpo de ENTPD?2 anti-humano podem ser administradas simultaneamente com, antes de ou subsequente a pelo menos uma ou mais outras terapias ou agentes terapêuticos adi- cionais. A molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano e o outro pelo menos um agente ou protocolo terapêutico pode ser administrado em qualquer ordem. Em geral, cada agente será administrado a uma dose e/ou em um cronograma temporal determinado para esse agen-

te. Será adicionalmente percebido que o agente terapêutico adicional utilizado nessa combinação pode ser administrado em conjunto em uma composição única ou administrado separadamente em diferentes composições. Em geral é esperado que os agentes terapêuticos adici- onais utilizados em combinação sejam utilizados a níveis que não ex- cedam os níveis em que são utilizados individualmente. Em algumas modalidades, os níveis utilizados em combinação serão mais baixos do que aqueles utilizados individualmente.

[00411] A presente descrição, assim, entre outros, refere-se a um produto de combinação para uso simultâneo, separado ou sequencial, tal como uma preparação combinada ou uma combinação farmacêuti- ca fixa, ou uma combinação de tal preparação e combinação. Antagonistas de Receptor de Adenosina A2A Exemplificativos

[00412] Em certas modalidades, as moléculas de ENTPD2 anti- humano descritas no presente documento são administradas em com- binação com pelo menos um antagonista de receptor de adenosina AZA (A2AR). Em certas modalidades, as moléculas de ENTPD?2 anti- humanas descritas no presente documento são administradas em combinação com pelo menos dois antagonistas de receptor de adeno- sina A2A (A2AR). Os antagonistas de A2AR exemplificativos incluem, porém sem limitação, por exemplo, PBF509/NIR178 (Palobiofarma/ Novartis), CPI444/V81444 (Corvus/Genentech), AZD4635/HTL-1071 (AstraZeneca/Heptares), Vipadenant (Redox/Juno), GBV-2034 (Globa- vir), AB928 (Arcus Biosciences), Teofilina, Istradefilina (Kyowa Hakko Kogyo), Tozadenante/SYN-115 (Acorda), KW-6356 (Kyowa Hakko Kogyo), ST-4206 (Leadiant Biosciences) e Preladenant/SCH 420814 (Merck/Schering).

[00413] Em certas modalidades, o antagonista de APAR é PBF509/ NIR178. PBF509/NIR178 e outros antagonistas de A2AR são descritos no documento nº U.S. 8.796.284 e WO 2017/025918, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Em cer- tas modalidades, o antagonista de A2AR é 5-bromo-2,6-di-(1H-pirazol- 1-ila)pirimidina-4-amina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma. Em certas modalidades, o antagonista de A2AR tem a seguin- te estrutura: NH; EO nO NX — LD ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00414] Em certas modalidades, o antagonista de APAR é CPI444/ V81444. CPI-444 e outros antagonistas de A2AR são descritos no do- cumento nº WO 2009/156737, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o antago- nista AZAR é (S)-7-(5-metilfurano-2-ila)-3-((6-(((tetra-hidrofurano-3-ila) óxi)metila)piridin-2-ila)Metila)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidina-5-ami- na ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma. Em certas mo- dalidades, o antagonista A2AR é (R)-7-(5-metilfurano-2-ila)-3-((6-(((tetra - hidrofurano-3-ila)óxi)metila)piridin-2-ila)Metila)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-d] pirimidina-5-amina ou racemato da mesma, ou um sal farmaceutica- mente aceitável da mesma. Em certas modalidades, o antagonista AZAR é 7-(5-metilfurano-2-ila)-3-((6-(((tetra-hidrofurano-3-ila)>Óxi) meti- la)piridin-2-ila)Mmetila)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidina-5-amina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma. Em certas modalidades, o antagonista de A2AR tem a seguinte estrutura: =

RA o é Í CÚ y PS ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00415] Em certas modalidades, o antagonista de APAR é AZDA4635/ HTL-1071. Os antagonistas de A2AR são descritos no documento nº WO 2011/095625, incorporado ao presente documento a título de refe- rência em sua totalidade. Em certas modalidades, o antagonista APAR é 6-(2-cloro-6-metilpiridin-4-ila)-5-(4-fluorofenila)-1,2,4-triazin-3-amina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma. Em certas modali- dades, o antagonista de A2AR tem a seguinte estrutura: x no e EX

SS A

TZ F ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo.

[00416] Em certas modalidades, a antagonista de APAR é ST-4206 (Leadiant Biosciences). Em certas modalidades, o antagonista de A2AR é um antagonista de A2AR descrito no documento nº U.S.

9.133.197, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o antagonista de APAR tem a seguinte estrutura: NH, pa o 1 | ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00417] Em certas modalidades, o antagonista de A2AR é um anta- gonista de A2AR descrito nos documentos nº U.S. 8114845, U.S.

9029393, U.S. 20170015758 ou U.S. 20160129108, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00418] Em certas modalidades, o antagonista de A2AR é istradefi- lina (Número de Registro do CAS: 155270-99-8). Istradefilina também é conhecida como KW-6002 ou 8-[(E)-2-(3,4-dimetoxifenila)vinil]-1,3- dietil-7-metil-3,7-di-hidro-1H-purina-2,6-diona. Istradefilina é revelada, por exemplo, em LeWitt et al. (2008) Annals of Neurology 63 (3): 295 a 302).

[00419] Em certas modalidades, o antagonista de A2aR é tozade- nant (Biotie). O tozadenant também é conhecido como SYN115 ou 4- hidroxi-N-(4-metoxi-7-morfolin-4-il-1,3-benzotiazol-2-ila)-4-metilpiperidi- na-1-carboxamida. O tozadenant bloqueia o efeito de adenosina endó- gena nos receptores de A2a, resultando na potenciação do efeito de dopamina no receptor de D2 e inibição do efeito de glutamato no re- ceptor de MGIuR5. Em algumas modalidades, o antagonista de A2aR é preladenant (Número de Registro do CAS: 377727-87-2). O prelade- nant também é conhecido como SCH 420814 ou 2-(2-Furanila)-7-[2-[4- [4-(2-metoxietóxi)fenil]-1-piperazinil]Jetil]7 H-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo [1,5-c]pirimidina-5-amina. O preladenant foi desenvolvido como um fármaco que atuou como um antagonista potente e seletivo no recep- tor de A2A de adenosina.

[00420] Em certas modalidades, o antagonista de A2aR é vipade- nant. O vipadenant também é conhecido como BIIBO014, V2006 ou 3- [(4-amino-3-metilfenila)metil]-7 -(furan-2-ila)triazolo[4,5-d]pirimidina-5- amina.

[00421] Outros antagonistas de A2aR exemplificativos incluem, por exemplo, ATL-444, MSX-3, SCH-58261, SCH-412,348, SCH-442,416, VER-6623, VER-6947, VER-7835, CGS-15943 ou ZM-241,385.

[00422] Em algumas modalidades, o antagonista de A2aR é um an- tagonista de trajetória de A2aR, por exemplo, um inibidor de CD-73,

por exemplo, um anticorpo anti-CD73. Alvejar a produção extracelular de adenosina por CD73 pode reduzir os efeitos imunossupressores de adenosina. Os anticorpos anti-CD73 têm uma gama de atividades, por exemplo, inibição da atividade de ectonucleotidase de CD73, alívio de supressão de linfócito mediada por AMP e inibição de crescimento de tumor singeneico. Os anticorpos anti-CD73 podem ativar alterações tanto em populações de leucócito de infiltração mieloide quanto linfoi- de dentro do microambiente de tumor. Essas alterações incluem, por exemplo, aumentos em células efetoras CD8 e macrófagos ativados, assim como uma redução nas proposições de células supressoras de- rivadas de mieloide (MDSC) e linfócitos T reguladores. Em uma moda- lidade, uma molécula de anticorpo anti-CD73 é uma molécula de anti- corpo completa ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-CD73 é escolhida dentre qualquer uma das moléculas de anticorpo listadas na Tabela 2. Em outras modalidades, a molécula de anticorpo anti-CD73 compre- ende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada, uma se- quência de domínio variável de cadeia leve, ou ambas, conforme des- crito na Tabela 2. Em determinadas modalidades, a molécula de anti- corpo anti-CD73 se liga a uma proteína CD73 e reduz, por exemplo, inibe ou antagoniza, uma atividade de CD73, por exemplo, CD73 hu- mano.

[00423] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº WO2016/075099, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totali- dade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é MEDI 9447, por exemplo, como descrito no documento nº WO2016/075099. Nomes alternativos para MEDI 9447 incluem clone 10.3 ou 73combo83. MEDI 9447 é um anticorpo IgG1 que inibe, por exemplo, antagoniza, uma atividade de CD73. MEDI 9447 e outra molécula de anticorpo an-

ti-CD73s também são descritos nos documentos nºº WO2016/075176 e US2016/0129108, cujos conteúdos totais estão incorporados ao pre- sente documento a título de referência em sua totalidade.

[00424] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 compreende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio vari- ável de cadeia leve, ou ambos, de MEDI 9477. A sequência de amino- ácidos do domínio variável de cadeia pesada de MEDI 9477 é revela- da como a SEQ ID NO: 295 (consultar a Tabela 2). A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de MEDI 9477 é des- crito como a SEQ ID NO: 296 (consultar a Tabela 2).

[00425] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº WO2016/081748, incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é 11F11, por exemplo, conforme descrito no documento nº WO2016/

081748. 11F11 é um anticorpo IgG2 que inibe, por exemplo, antagoni- za, uma atividade de CD73. Os anticorpos derivados de 11F11, por exemplo, CD73.4, e CD73.10; clones de 11F11, por exemplo, 11F11-1 e 11F11-2; e outras moléculas de anticorpo anti-CD73 são descritos nos documentos nº WO2016/081748 e US 9.605.080, cujos conteú- dos totais estão incorporados ao presente documento a título de refe- rência em sua totalidade.

[00426] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 compreende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio vari- ável de cadeia leve, ou ambos, de 11F11-1 ou 11F11-2. A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 11F11-1 é descrito como a SEQ ID NO: 302 (consultar a Tabela 2). A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 11F11-1 é des- crito como a SEQ ID NO: 303 (consultar a Tabela 2). A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 11F11-2 é des-

crito como a SEQ ID NO: 299 (consultar a Tabela 2). A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 11F11-2 é descrito como a SEQ ID NO: 300 (consultar a Tabela 2). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 compreende uma cadeia pesada, uma cadeia leve, ou ambas, de 11F11-1 ou 11F11-2. As sequências de aminoácidos de cadeia pesada e leve de 11F11-1 são descritas como a SEQ ID NO: 297 e a SEQ ID NO: 301, respectivamente (con- sultar a Tabela 2). As sequências de aminoácidos de cadeia pesada e leve de 11F11-2 são descritas como a SEQ ID NO: 294 e a SEQ ID NO: 298, respectivamente (consultar a Tabela 2).

[00427] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelado, por exemplo, no documento nº US

9.605.080, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00428] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é CD73.4, por exemplo, conforme descrito no documento nº US

9.605.080. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 compreende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio vari- ável de cadeia leve, ou ambos, de CD73.4. A sequência de aminoáci- dos do domínio variável de cadeia pesada de CD73.4 é descrito como a SEQ ID NO: 304 (consultar a Tabela 2). A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 11F11-2 é descrito como a SEQ ID NO: 305 (consultar a Tabela 2).

[00429] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é CD73.10, por exemplo, conforme descrito no documento nº US

9.605.080. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 compreende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio vari- ável de cadeia leve, ou ambos, de CD73.10. A sequência de aminoá- cidos do domínio variável de cadeia pesada de CD73.10 é descrito como a SEQ ID NO: 306 (consultar a Tabela 2). A sequência de ami-

noácidos do domínio variável de cadeia leve de CD73.10 é descrito como a SEQ ID NO: 307 (consultar a Tabela 2).

[00430] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº WO2009/0203538, incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é 067- 213, por exemplo, conforme descrito no documento nº WOZ2009/

0203538.

[00431] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 compreende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio vari- ável de cadeia leve, ou ambos, de 067-213. A sequência de aminoáci- dos do domínio variável de cadeia pesada de 067-213 é descrito como a SEQ ID NO: 308 (consultar a Tabela 2). A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 067-213 é descrito como a SEQ ID NO: 309 (consultar a Tabela 2).

[00432] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 descrito no documento nº US 9.090.697, incor- porado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é TY/23, por exemplo, conforme descrito no documento nº US 9.090.697. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 compreende um do- mínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de TY/23.

[00433] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº WO2016/055609, incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 com- preende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpo anti-CD73 descrito no do- cumento nº WO2016/055609.

[00434] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº WO2016/146818, incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 com- preende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpo anti-CD73 descrito no do- cumento nº WO2016/146818.

[00435] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº WO2004/079013, incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 com- preende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpo anti-CD73 descrito no do- cumento nº WO2004/079013.

[00436] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº WO2012/125850, incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 com- preende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpo anti-CD73 descrito no do- cumento nº WO2012/125850.

[00437] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº WO2015/004400, incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 com- preende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpo anti-CD73 descrito no do- cumento nº WO2015/004400.

[00438] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº WO2007/146968,

incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 com- preende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpo anti-CD73 descrito no do- cumento nº WO2007 146968.

[00439] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº US2007/0042392, incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 com- preende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpo anti-CD73 descrito no do- cumento nº US2007/0042392.

[00440] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 revelada no documento nº US2009/0138977, incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 com- preende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpo anti-CD73 descrito no do- cumento nº US2009/0138977.

[00441] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 descrito em Flocke et al/., , Eur J Cell Biol. Ju- nho de 1992;58(1):62 a 70, incorporado ao presente documento a títu- lo de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 compreende um domínio variável de cadeia pesa- da, um domínio variável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpos anti-CD73 descrito em Flocke et al., Eur J Cell Biol. JUnho de 1992;58(1):62 a 70.

[00442] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 é um anticorpo anti-CD73 descrito em Stagg et a/l., PNAS. janeiro de 2010 107(4): 1.547:1.552, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-CD73 é TY/23 ou TY11.8, conforme descrito em Stagg et al. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-CD73 compreende um domínio variável de cadeia pesada, um domínio vari- ável de cadeia leve, ou ambos, de um anticorpo anti-CD73 descrito em Stagg et al.

[00443] Em uma modalidade, o anticorpo de ENTPD?2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, é administrado em combi- nação com uma molécula de anticorpo anti-CD73, por exemplo, con- forme descrito no presente documento, e um antagonista de A2AR, opcionalmente “selecionado dentre o grupo que compreende PBF509/NIR178, CPI444/V81444, AZD4635/HTL-1071, Vipadenante, GBV-2034, AB928, Teofilina, Istradefilina, Tozadenant/SYN-115, KW- 6356, ST-4206 e Preladenant/SCH 420814.

SE T T = co co g$8S 8 Fls 8 3 |8 |=|s nn BS je =| SI IS je ES . NO |jô |8|ô O oO |O |[8lô a ig|Z Zz SZ Zz Zz Zz Ss 2 3 |s|º | Se | a jo Se 8 e ka 3 ig kks Ê on |O o o On | |E|o oo x e = | E e ” Ee kEXoE E | E E VE E | E | 523 Syrukg |8 &S Ê & E & 8 C o O O C O O >--O OE O “% Ó Ó x x So |AgxZ> |& 3-1 a |ó 2 8 o o O > O o Ó Ó o” 7 O & = Ss |8 A jo E O A |O Lu OGCIL O a = O [4 o3IE o uu Ú >= x o 2 Loss É & C & |& o 19 $5 <$sZ |< 2 |$ Z | 8 |> oO Ends á & Fs 6 a Ó o as To o) O õ E õ 8 jo Es JPÉRIR |S à | Ss 18 2 | Ho <EoSX | > |8 Z 8 = |X E > & O rj x = = 2 3 nXio Cr ZE >32ozZ > 07 > 07 o OZ a 3s< o o < Dj < Dj Zz ES 238322 ZE Ze $ÉElá <o SazgEe>=|S Z>|É Z>|É EE a o 3G929T3 25 3 E|5 >) 2/5 U5ZIo ao HesioE;H oro oro o 3X ca rea E oz OX YO e ga 2 LEDS SO o Ia o Ia <O< 52 <EX Lo & O & O Er St BSósias | ásÉ | sé | 3ês <= 2 O 03 ao ojo são o E TgE SS É 2& É 2& É 23 3 22 dsúeaá | sas | Eal8 | S2)8z W Z = = 3 SERES EX EX ESSE 2% EXFoSE“%| 8 Ev] 582 22/88 3 GUS >73/< = HS ZH Sd SEI RO zo x-cú 3 ôx0 SúZ=2) 38 = 2] AsiZgo Bs 86 E SS EG BEL E GIBE| 228 0> Fr Ego) EE 2o) ESSE ud Forte Zo|l |£àÉ5 E É E X=> == oosbcE SOS) ES EO ESG 53/50 Pa x QE 2/0 na 2 6 O 2/6 O É RO Z > or ES 0 E $ E £E E < E = O 3) = £20 44 ar Fr = 07 <xx < & AE > = CIA 2 XX õ2 õ32 2/60 O Ea joz=ch<o=| << /0S| IN < /0L&| BE oo z 95 w/8KÇ BEE > BEE > BE OZ à 5 6 ZErigo4Z zo je O zo je O = A 2 & > 2/E >| 3UUE2 3 U|>Z 3 U|><Z É UE $ & ng X << % <£| E > SEX dg> ESSE due Era e w580| 2a] PES 2SSBSSS258/ S3/98| 63/98) lda/8% ã& so 22 GZz ES) dégr) dz) FZ228 o O Ss = 6 > = = o sr ERZ 083 284 23éE) 2 age Ssj5a DZ 9< GC oO20< oO o Os ;o< o 22 FS 2X” > 2u > [OL =” L =| <á [Bs ITrozZ2/02/H o O UlÃo O Uh oO O UI O vos <mosSoH<m O E jo O El uu o 2 ao ESS5LA de &o NEGA NEGA NE wu Ss | uu wu X/GO wu X/ OO Úú CIgO <= 2 0 3 Ç| > 2/0 3 > O ES > O ES > <ÃÉ O Zz == 9 2<S3452) 2458] 34éá/=223) 32/25 < Sis=2320=2 22882 282 9837 àpxXoób5>2 60 5) Goes) Soe5) joso4á o o o a a a o o o = = = [ó) I = I = I = I = = > |> > |> > |)> > |> « 2 e 2 É & = a o os o oie m jo o 8 8 | loig |8 jol& | |8|8 |8 õ O || |86 |ô |8l6 |ô I2wô |ô Zz z |j2 S 2 |Z |SZ 2 |NZ2 |Z Q Q Q 8o Q 8o Q So Q = — — o — o = OI = fe og |& jogo o jojo (od So |o uu uu uu O ju uu O ju wu Ou wu o mn jo [So jo [So o 1Sjo |

[00444] As moléculas de anticorpo anti-CD73 usadas nas terapias de combinação descritas no presente documento podem incluir qualquer uma das sequências de VH/VL descritas na Tabela 2, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mesma (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma). As se- quências exemplificativas para anticorpos de CD73 incluem:

(i) as sequências de aminoácidos de VH e VL para MEDI 9447, SEQ ID NOs: 295 a 296, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica às mesmas (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 295 a 296);

(ii) as sequências de aminoácidos de HC e LC para 11F11- 2, SEQ ID NOs: 297 a 298, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica às mesmas (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 297 a 298);

(iii) as sequências de aminoácidos de VH e VL para 11F11- 2, SEQ ID NOs: 299 a 300, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica às mesmas (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 299 a 300);

(iv) as sequências de aminoácidos de HC e LC para 11F11- 1, SEQ ID NOs: 297 e 301, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica às mesmas (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 297 e 301);

(v) as sequências de aminoácidos de VH e VL para 11F11- 1, SEQ ID NOs: 302 a 303, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica às mesmas (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs:

302 a 303); (vi) as sequências de aminoácidos de VH e VL para CD73.4, SEQ ID NOs: 304 a 305, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica às mesmas (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 304 a 305); (vii) as sequências de aminoácidos de VH e VL para CD73.10, SEQ ID NOs: 306 a 307, respectivamente, ou uma sequên- cia de aminoácidos substancialmente idêntica às mesmas (por exem- plo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 306 a 307); ou (viii) as sequências de aminoácidos de VH e VL para 067- 213, SEQ ID NOs: 308 a 309, respectivamente, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica às mesmas (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 308 a 309).

[00445] O anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, pode ser combinado com um inibidor de uma molé- cula coinibidora (por exemplo, um inibidor de PD-1 (por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-PD-1), um inibidor de PD-L1 (por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-PD-L1), um inibidor de PD-L2 (por exem- plo, uma molécula de anticorpo anti-PD-L2), um inibidor de LAG-3 (por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-LAG-3), um inibidor de TIM-3 (por exemplo, uma molécula e anticorpo anti-TIM-3)), um ativador de uma molécula coestimulatória (por exemplo, um agonista de GITR (por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-GITR)), uma citocina (por exemplo, IL-15 formando complexo com uma forma solúvel de recep- tor de IL-15 alfa (IL-15Ra)), ou qualquer combinação dos mesmos. Inibidores de PD-1

[00446] Em certas modalidades, o anticorpo de ENTPD2, conforme descrito no presente documento, é administrado em combinação com um inibidor de PD-1. Em algumas modalidades, o inibidor de PD-1 é es- colhido dentre PDROO01 (Novartis), Nivolumabe (Bristol-Myers Squibb), Pembrolizumabe (Merck & Co), Pidilizumabe (CureTech), MEDIO680 (Medimmune), REGN2810 (Regeneron), TSR-042 (Tesaro), PF- 06801591 (Pfizer), BGB-A317 (Beigene), BGB-108 (Beigene), IN- CSHR1210 (Incyte) ou AMP-224 (Amplimmune). Inibidores de PD-1 Exemplificativos

[00447] Em uma modalidade, o inibidor de PD-1 é uma molécula de anticorpo anti-PD-1. Em uma modalidade, o inibidor de PD-1 é uma molécula de anticorpo anti-PD-1, conforme descrito no documento nº US 2015/0210769, publicado em 30 de julho de 2015, intitulado "Anti- body Molecules to PD-1 and Uses Thereof", incorporado a título de re- ferência na sua totalidade.

[00448] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (ou coletivamente todas as CDRs) de uma região variável de cadeia pesada e leve que com- preende uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 3 (por exemplo, das sequências de região variável de cadeia pesada e leve de BAPO49-Clone-E ou BAPO49-Clone-B descritas na Tabela 3), ou codificada por uma sequência de nucleotídeos mostrada na Tabela 3. Em algumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Kabat (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 3). Em al- gumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Chothia (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 3). Em algu- mas modalidades, as CDRs estão de acordo com as definições de CDR combinadas tanto de Kabat quanto de Chothia (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 3). Em uma modalidade, a combina- ção de CDR de Kabat e Chothia de CDR1 de VH compreende a se-

quência de aminoácidos GYTFTTYWMH (SEQ ID NO: 541). Em uma modalidade, uma ou mais das CDRs (ou coletivamente todas as CDRs) têm uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais alterações, por exemplo, substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas) ou deleções, em relação a uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 3, ou codificadas por uma se- quência de nucleotídeos mostrada na Tabela 3.

[00449] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende uma sequência de aminoácidos de VMHCDR1 de SEQ ID NO: 501, uma sequência de aminoácidos de VHCDR2 de SEQ ID NO: 502, e uma sequência de aminoácidos de VHCDR3 de SEQ ID NO: 503; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma se- quência de aminoácidos de VLCDR1 de SEQ ID NO: 510, uma se- quência de aminoácidos de VLCDR2 de SEQ ID NO: 511, e uma se- quência de aminoácidos de VLCDR3 de SEQ ID NO: 512, cada uma revelada na Tabela 3.

[00450] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH que compreende uma VHCDR1 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 524, uma VHCDR?2 codificada pela sequên- cia de nucleotídeos de SEQ ID NO: 525, e uma VHCDRS3 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 526; e uma VL que compre- ende uma VLCDR1 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 529, uma VLCDR?2 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 530, e uma VLCDR3 codificada pela sequência de nucleo- tídeos de SEQ ID NO: 531, cada uma revelada na Tabela 3.

[00451] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 506, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 506. Em uma mo-

dalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 520, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 520. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma VL que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 516, ou uma sequência de amino- ácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 516. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 506 e uma VL que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 520. Em uma modalidade, a molécula de anti- corpo anti-PD-1 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 506 e uma VL que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 516.

[00452] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 507, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 507. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 521 ou 517, ou uma sequência de nu- cleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 521 ou 517. Em uma modalidade, a molécula de anticor- po compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 507 e uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 521 ou 517.

[00453] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 508, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:

508. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compre-

ende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 522, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 522. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ca- deia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 518, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 518. Em uma modalida- de, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma cadeia pesa- da que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 508, e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 522. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti- PD-1 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 508, e uma cadeia leve que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 518.

[00454] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 509, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 509. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve codifi- cada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 523 ou 519, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 523 ou 519. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 509 e uma cadeia leve co- dificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 523 ou 519.

[00455] As moléculas de anticorpo descritas no presente documen- to podem ser produzidas por vetores, células hospedeiras e métodos descritos no documento nº US 2015/0210769, incorporado a título de referência em sua totalidade.

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Outros Inibidores de PD-1 Exemplificativos

[00456] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é Nivolumabe (Bristol-Myers Squibb), também conhecido como MDX- 1106, MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 ou OPDIVOO. Nivolu- mabe (clone 5C4) e outros anticorpos anti-PD-1 são descritos no do- cumento nº US 8.008.449 e WO 2006/121168, incorporados a título de referência na sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anti- corpo anti-PD-1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de regi- ão variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de ca- deia pesada ou cadeia leve de Nivolumab, por exemplo, conforme descrito na Tabela 4.

[00457] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é Pembrolizumabe (Merck & Co), também conhecido como Lambrolizu- mabe, MK-3475, MK03475, SCH-900475 ou KEYTRUDAG. Pembroli- zumabe e outros anticorpos anti-PD-1 são descritos em Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134 a 144, docu- mento nº US 8.354.509 e documento nº WO 2009/114335, incorpora- dos a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ou mais das se- quências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de Pembrolizumabe, por exemplo, conforme descrito na Tabela 4.

[00458] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é Pidilizumabe (CureTech), também conhecido como CT-011. Pidilizu- mabe e outros anticorpos anti-PD-1 são descritos em Rosenblatt, J. et al. (2011) J Immunotherapy 34(5): 409 a 418, documentos nº US

7.695.715, US 7.332.582 e US 8.686.119, incorporados a título de re- ferência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anti-

corpo anti-PD-1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de regi- ão variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de ca- deia pesada ou cadeia leve de Pidilizumabe, por exemplo, conforme descrito na Tabela 4.

[00459] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é MEDIO680 (Medimmune), também conhecido como AMP-514. ME- DIO0680 e outros anticorpos anti-PD-1 são descritos nos documentos nº US 9.205.148 e WO 2012/145493, incorporados a título de referên- cia na sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou cole- tivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variá- vel de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesa- da ou cadeia leve de MEDIO680.

[00460] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é REGN2810 (Regeneron). Em uma modalidade, a molécula de anticor- po anti-PD-1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de REGN2810.

[00461] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é PF-06801591 (Pfizer). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou cole- tivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variá- vel de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesa- da ou cadeia leve de PF-06801591.

[00462] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é BGB-A317 ou BGB-108 (Beigene). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de BGB-A317 ou BGB-108.

[00463] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é INCSHR1210 (Incyte), também conhecido como INCSHRO01210 ou SHR-1210. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de ca- deia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou ca- deia leve de INCSHR1210.

[00464] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é TSR-042 (Tesaro), também conhecido como ANBO11. Em uma moda- lidade, a molécula de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia le- ve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de TSR-042.

[00465] “Outros anticorpos anti-PD-1 conhecidos incluem aqueles descritos, por exemplo, nos documentos nº WO 2015/112800, WO 2016/092419, WO 2015/085847, WO 2014/179664, WO 2014/194302, WO 2014/209804, WO 2015/200119, US 8.735.553, US 7.488.802, US

8.927.697, US 8.993.731 e US 9.102.727, incorporados a título de re- ferência em sua totalidade.

[00466] Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é um anticorpo que compete pela ligação e/ou se liga ao mesmo epítopo em PD-1 que um dos anticorpos anti-PD-1 descritos no presente documento.

[00467] Em uma modalidade, o inibidor de PD-1 é um peptídeo que inibe a via de sinalização de PD-1, por exemplo, conforme descrito no documento nº US 8.907.053, incorporado a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, o inibidor de PD-1 é uma imunoade- sina (por exemplo, uma imunoadesina que compreende uma porção de ligação extracelular ou de PD-1 de PD-L1 ou PD-L2 fundida com uma região constante (por exemplo, uma região de Fc de uma se- quência de imunoglobulina). Em uma modalidade, o inibidor de PD-1 é AMP-224 (B7-DClg (Amplimmune), por exemplo, descrito nos docu- mentos nºs WO 2010/027827 e WO 2011/066342, incorporados a título de referência em sua totalidade).

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[00468] Em uma modalidade, o anticorpo de ENTPD?2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, é administrado em combi- nação com pelo menos um inibidor de PD1, conforme descrito no pre- sente documento, e pelo menos um antagonista do receptor de AZ2A, conforme descrito no presente documento. Inibidores de PD-L1

[00469] Em certas modalidades, o anticorpo de ENTPD2 anti- humano, conforme descrito no presente documento, é administrado em combinação com um inibidor de PD-L1. O inibidor de PD-L1 pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma imunoa- desina, uma proteína de fusão ou um oligopeptídeo. Em algumas moda- lidades, o inibidor de PD-L1 é escolhido dentre FAZO53 (Novartis), Atezo- lizumabe, também conhecido como Tecentrig& (Genentech/Roche), Ave- lumabe, também conhecido como Bavencio& (Merck Serono e Pfizer), Durvalumabe, também conhecido como Imfinzi& (Medlmmune/ Astra- Zeneca) ou BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb). Inibidores de PD-L1 Exemplificativos

[00470] Em uma modalidade, o inibidor de PD-L1 é uma molécula de anticorpo anti-PD-L1. Em uma modalidade, o inibidor de PD-L1 é uma molécula de anticorpo anti-PD-L1, conforme descrito no docu- mento nº US 2016/0108123, publicado em 21 de abril de 2016, intitu- lado “Antibody Molecules to PD-L1 and Uses Thereof', incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00471] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (ou coletivamente todas as CDRs) de uma região variável de cadeia pesada e leve que com- preende uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 5 (por exemplo, das sequências de região variável de cadeia pesada e leve de BAPOS8-Clone O ou BAPOS58-Clone N descritas na Tabela 5), ou codificada por uma sequência de nucleotídeos mostrada na Tabela 5. Em algumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Kabat (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 5). Em al- gumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Chothia (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 5). Em algu- mas modalidades, as CDRs estão de acordo com as definições de CDR combinadas tanto de Kabat quanto de Chothia (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 5). Em uma modalidade, a combina- ção de CDR de Kabat e Chothia de CDR1 de VH compreende a se- quência de aminoácidos GYTFTSYWMY (SEQ ID NO: 647). Em uma modalidade, uma ou mais das CDRs (ou coletivamente todas as CDRs) têm uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais alterações, por exemplo, substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas) ou deleções, em relação a uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 5, ou codificadas por uma se- quência de nucleotídeos mostrada na Tabela 5.

[00472] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende uma sequência de aminoácidos de VMHCDR1 de SEQ ID NO: 601, uma sequência de aminoácidos de VHCDR2 de SEQ ID NO: 602, e uma sequência de aminoácidos de VHCDR3 de SEQ ID NO: 603; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma se- quência de aminoácidos de VLCDR1 de SEQ ID NO: 609, uma se- quência de aminoácidos de VLCDR2 de SEQ ID NO: 610, e uma se- quência de aminoácidos de VLCDR3 de SEQ ID NO: 611, cada uma revelada na Tabela 5.

[00473] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma VH que compreende uma VHCDR1 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 628, uma VHCDR?2 codifi- cada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 629, e uma

VHCDRS3 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 630; e uma VL que compreende uma VLCDR1 codificada pela se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 633, uma VLCDR?2 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 634, e uma VLCDR3 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 635, cada uma revelada na Tabela 5.

[00474] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 606, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 606. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 616, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 616. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma VH que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 620, ou uma sequência de amino- ácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 620. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 624, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 624. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 606 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

616. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 com- preende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 620 e uma VL que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 624.

[00475] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:

607, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 607. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 617, ou uma sequência de nucleotí- deos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 617. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 621, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 621. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 625, ou uma sequência de nucleotí- deos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 625. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 607 e uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 617. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 621 e uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 625.

[00476] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 608, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:

608. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 com- preende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 618, ou uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 618. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 622, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%,

90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 622. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 626, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 626. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 608, e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 618. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti- PD-L1 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 622, e uma cadeia leve que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 626.

[00477] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 615, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 615. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve codifi- cada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 619, ou uma se- quência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 619. Em uma modalidade, a molécula de anti- corpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 623, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:

623. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 627, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 627. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 615 e uma cadeia leve co- dificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 619. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 623 e uma cadeia leve codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:

627.

[00478] As moléculas de anticorpo descritas no presente documen- to podem ser produzidas por vetores, células hospedeiras e métodos descritos no documento nº US 2016/0108123, incorporado a título de referência em sua totalidade.

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Outros Inibidores de PD-L1 Exemplificativos

[00479] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 é Atezolizumabe (Genentech/Roche), também conhecido como MPDL 3280A, RG7446, RO5S541267, YW243.55.S870 ou TECENTRIQY. Ate- zolizumabe e outros anticorpos anti-PD-L1 são descritos no documen- to nº US 8.217.149, incorporado a título de referência em sua totalida- de. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compre- ende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de Atezolizumabe, por exemplo, conforme descrito na Tabela 6.

[00480] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 é Avelumabe (Merck Serono e Pfizer), também conhecida como MSB 0010718C ou BavencioO. Avelumabe e outros anticorpos anti-PD-L1 são descritos no documento nº WO 2013/079174, incorporado a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de Avelumabe, por exemplo, conforme descrito na Tabela 6.

[00481] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 é Durvalumabe (Medimmune/AstraZeneca), também conhecido como MEDI4736 ou Imfinziê. Durvalumabe e outros anticorpos anti-PD-L1 são descritos no documento nº US 8.779.108, incorporado a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anti- corpo anti-PD-L1 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de regi- ão variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de ca- deia pesada ou cadeia leve de Durvalumabe, por exemplo, conforme descrito na Tabela 6.

[00482] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 é BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb), também conhecida como MDX- 1105 ou 12A4. BMS-936559 e outros anticorpos anti-PD-L1 são des- critos nos documentos nº US 7.943.743 e WO 2015/081158, incorpo- rados a título de referência na sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma ou mais das se- quências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de BMS-936559, por exemplo, conforme descrito na Tabela 6.

[00483] “Outros anticorpos anti-PD-L1 conhecidos incluem aqueles descritos, por exemplo, nos documentos nº WO 2015/181342, WO 2014/100079, WO 2016/000619, WO 2014/022758, WO 2014/055897, WO 2015/061668, WO 2013/079174, WO 2012/145493, WO 2015/ 112805, WO 2015/109124, WO 2015/195163, US 8.168.179, US

8.552.154, US 8.460.927 e US 9.175.082, incorporados a título de re- ferência em sua totalidade.

[00484] Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-L1 é um anticorpo que compete pela ligação e/ou se liga ao mesmo epítopo em PD-L1 que um dos anticorpos anti-PD-L1 descritos no presente documento.

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[00485] Em uma modalidade, o anticorpo de ENTPD?2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, é administrado em combi- nação com pelo menos um inibidor de PD-L1, conforme descrito no presente documento, e pelo menos um antagonista do receptor de AZA, conforme descrito no presente documento. Inibidores de LAG-3

[00486] Em certas modalidades, o anticorpo de ENTPD2 anti- humano descrito no presente documento é administrado em combina- ção com um inibidor de LAG-3. O inibidor de LAG-3 pode ser um anti- corpo, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma imunoa- desina, uma proteína de fusão ou um oligopeptídeo. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de LAG-3 é escolhido dentre LAG525 (Novartis), BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb), TSR-033 (Tesaro), MK-4280 (Merck & Co) ou REGN3767 (Regeneron). Inibidores de LAG-3 Exemplificativos

[00487] Em uma modalidade, o inibidor de LAG-3 é uma molécula de anticorpo anti-LAG-3. Em uma modalidade, o inibidor de LAG-3 é uma molécula de anticorpo anti-LAG-3, conforme descrito no docu- mento, nº US 2015/0259420, publicado em 17 de setembro de 2015, intitulado “Antibody Molecules to LAG-3 and Uses Thereof”, incorpora- do a título de referência em sua totalidade.

[00488] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (ou coletivamente todas as CDRs) de uma região variável de cadeia pesada e leve que com- preende uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 7 (por exemplo, das sequências de região variável de cadeia pesada e leve de BAPOS5O-Clone | ou BAPOSO-CIone J descritas na Tabela 7), ou co- dificada por uma sequência de nucleotídeos mostrada na Tabela 7. Em algumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Kabat (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 7). Em al- gumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Chothia (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 7). Em algu- mas modalidades, as CDRs estão de acordo com as definições de CDR combinadas tanto de Kabat quanto de Chothia (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 7). Em uma modalidade, a combina- ção de CDR de Kabat e Chothia de CDR1 de VH compreende a se- quência de aminoácidos GFTLTNYGMN (SEQ ID NO: 766). Em uma modalidade, uma ou mais das CDRs (ou coletivamente todas as CDRs) têm uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais alterações, por exemplo, substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas) ou deleções, em relação a uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 7, ou codificadas por uma se- quência de nucleotídeos mostrada na Tabela 7.

[00489] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende uma sequência de aminoácidos de VMHCDR1 de SEQ ID NO: 701, uma sequência de aminoácidos de VHCDR2 de SEQ ID NO: 702, e uma sequência de aminoácidos de VHCDR3 de SEQ ID NO: 703; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma se- quência de aminoácidos de VLCDR1 de SEQ ID NO: 710, uma se- quência de aminoácidos de VLCDR2 de SEQ ID NO: 711, e uma se- quência de aminoácidos de VLCDR3 de SEQ ID NO: 712, cada uma revelada na Tabela 7.

[00490] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma VH que compreende uma VHCDR1 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 736 ou 737, uma VHCDR2 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 738 ou 739, e uma VHCDR3 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 740 ou 741; e uma VL que compreende uma VLCDR1 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 746 ou 747, uma VLCDR?2 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 748 ou 749, e uma VLCDR3 codificada pela sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 750 ou 751, cada uma revelada na Tabela 7. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma VH que compreende uma VHCDR1 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 758 ou 737, uma VHCDR?2 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 759 ou 739, e uma VHCDRS3 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 760 ou 741; e uma VL que compreende uma VLCDR1 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 746 ou 747, uma VLCDR2 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 748 ou 749, e uma VLCDR3 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 750 ou 751, cada uma revelada na Tabela 7.

[00491] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 706, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 706. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 718, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 718. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma VH que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 724, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 724. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti- LAG-3 compreende uma VL que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 730, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 730. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 706 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 718. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 724 e uma VL que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 730.

[00492] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 707 ou 708, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 707 ou 708. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VL codifi- cada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 719 ou 720, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 719 ou 720. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 725 ou 726, ou uma sequência de nu- cleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 725 ou 726. Em uma modalidade, a molécula de anticor- po compreende uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 731 ou 732, ou uma sequência de nucleotídeos pelo me- nos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 731 ou

732. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 707 ou 708, e uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 719 ou 720. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo com- preende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 725 ou 726, e uma VL codificada pela sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 731 ou 732.

[00493] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 709, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:

709. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 com- preende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 721, ou uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 721. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 727, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 727. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 733, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 733. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 709, e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 721. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti- LAG-3 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 727, e uma cadeia leve que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 733.

[00494] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 716 ou 717, ou uma sequência de nucleotídeos pelo me- nos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 716 ou

717. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 722 ou 723, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 722 ou 723. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 728 ou 729, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 728 ou 729. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve codifi- cada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 734 ou 735, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 734 ou 735. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 716 ou 717 e uma cadeia leve codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 722 ou

723. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 728 ou 729 e uma cadeia leve codificada pela sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 734 ou 735.

[00495] As moléculas de anticorpo descritas no presente documen- to podem ser produzidas por vetores, células hospedeiras e métodos descritos no documento nº US 2015/0259420, incorporado a título de referência em sua totalidade.

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Outros Inibidores de LAG-3 Exemplificativos

[00496] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 é BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb), também conhecida como BMS

986016. BMS-986016 e outros anticorpos anti-LAG-3 são descritos nos documentos nº WO 2015/116539 e US 9.505.839, incorporados a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de BMS-986016, por exemplo, conforme descrito na Tabela 8.

[00497] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 é TSR-033 (Tesaro). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti- LAG-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coleti- vamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de TSR-033.

[00498] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 é MK-4280 (Merck & Co). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou co- letivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região vari- ável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pe- sada ou cadeia leve de MK-4280.

[00499] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 é REGN3767 (Regeneron). Em uma modalidade, a molécula de anticor- po anti-LAG-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de REGN3767.

[00500] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 é

IMP731 ou GSK2831781 (GSK e Prima BioMed). IMP731 e outros an- ticorpos anti-LAG-3 são descritos nos documentos nº WO 2008/ 132601 e US 9.244.059, incorporados a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de IMP731, por exemplo, conforme descrito na Tabela 8. Em uma moda- lidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia le- ve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de GSK2831781.

[00501] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 é IMP761 (Prima BioMed). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-LAG-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou co- letivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região vari- ável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pe- sada ou cadeia leve de IMP761.

[00502] Outros anticorpos anti-LAG-3 conhecidos incluem aqueles descritos, por exemplo, nos documentos nº WO 2008/132601, WO 2010/019570, WO 2014/140180, WO 2015/116539, WO 2015/200119, WO 2016/028672, US 9.244.059, US 9.505.839, incorporados a título de referência em sua totalidade.

[00503] Em uma modalidade, o anticorpo anti-LAG-3 é um anticorpo que compete pela ligação e/ou se liga ao mesmo epítopo em LAG-3 que um dos anticorpos anti-LAG-3 descritos no presente documento.

[00504] Em uma modalidade, o inibidor de anti-LAG-3 é uma proteína LAG-3 solúvel, por exemplo, IMP321 (Prima BioMed), por exemplo, con- forme descrito no documento nº WO 2009/044273, incorporado a título de referência em sua totalidade.

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Inibidores de TIM-3

[00505] Em certas modalidades, o anticorpo de ENTPD2 anti- humano, conforme descrito no presente documento, é administrado em combinação com um inibidor de TIM-3. O inibidor de TIM-3 pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou um oligopeptídeo. Em algu- mas modalidades, o inibidor de TIM-3 é escolhido dentre MBG453 (Novartis), TSR-022 (Tesaro) ou LY3321367 (Eli Lilly). Inibidores de TIM-3 Exemplificativos

[00506] Em uma modalidade, o inibidor de TIM-3 é uma molécula de anticorpo anti-TIM-3. Em uma modalidade, o inibidor de TIM-3 é uma molécula de anticorpo anti-TIM-3 conforme descrito no documen- to nº US 2015/0218274, publicado em 6 de agosto de 2015, intitulado “Antibody Molecules to TIM-3 and Uses Thereof”, incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00507] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (ou coletivamente todas as CDRs) de uma região variável de cadeia pesada e leve que com- preende uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 9 (por exemplo, das sequências de região variável de cadeia pesada e leve de ABTIM3-hum11 ou ABTIM3-humO3 descritas na Tabela 9), ou codi- ficada por uma sequência de nucleotídeos mostrada na Tabela 9. Em algumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Kabat (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 9). Em algumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Chothia (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 9). Em uma modalida- de, uma ou mais das CDRs (ou coletivamente todas as CDRs) têm uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais alterações, por exemplo, substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições de aminoá-

cidos conservativas) ou deleções, em relação a uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 9, ou codificadas por uma sequência de nucleotídeos mostrada na Tabela 9.

[00508] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende uma sequência de aminoácidos de VMHCDR1 de SEQ ID NO: 801, uma sequência de aminoácidos de VHCDR2 de SEQ ID NO: 802, e uma sequência de aminoácidos de VHCDR3 de SEQ ID NO: 803; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma se- quência de aminoácidos de VLCDR1 de SEQ ID NO: 810, uma se- quência de aminoácidos de VLCDR2 de SEQ ID NO: 811, e uma se- quência de aminoácidos de VLCDR3 de SEQ ID NO: 812, cada uma revelada na Tabela 9. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos de VHCDR1 de SEQ ID NO: 801, uma sequência de aminoácidos de VÓHCDR2 de SEQ ID NO: 820, e uma sequência de aminoácidos de VHCDR3 de SEQ ID NO: 803; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos de VLCDR1 de SEQ ID NO: 810, uma sequência de aminoácidos de VLCDR2 de SEQ ID NO: 811, e uma sequência de aminoácidos de VLCDR3 de SEQ ID NO: 812, cada uma revelada na Tabela 9.

[00509] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 806, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 806. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 816, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 816. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma VH que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 822, ou uma sequência de amino- ácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 822. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 826, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 826. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo anti- TIM-3 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 806 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 816. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 822 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 826.

[00510] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 807, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 807. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 817, ou uma sequência de nucleotí- deos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 817. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 823, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 823. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 827, ou uma sequência de nucleotí- deos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 827. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:

807 e uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 817. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 823 e uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 827.

[00511] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 808, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:

808. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compre- ende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 818, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 818. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma ca- deia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 824, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 824. Em uma modalida- de, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 828, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 828. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma cadeia pesada que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 808, e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

818. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compre- ende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 824, e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 828.

[00512] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de

SEQ ID NO: 809, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 809. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve codifi- cada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 819, ou uma se- quência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 819. Em uma modalidade, a molécula de anti- corpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 825, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:

825. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 829, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 829. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 809 e uma cadeia leve co- dificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 819. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 825 e uma cadeia leve codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:

829.

[00513] As moléculas de anticorpo descritas no presente documen- to podem ser produzidas por vetores, células hospedeiras e métodos descritos no documento nº US 2015/0218274, incorporado a título de referência em sua totalidade.

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Outros Inibidores de TIM-3 Exemplificativos

[00514] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 é TSR-022 (AnaptysBio/Tesaro). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de TSR-022. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma ou mais das se- quências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de APES137 ou APE5S121, por exemplo, conforme descrito na Tabela 10. APES137, APE51I21 e outros anticorpos anti-TIM-3 são descritos no documento nº WO 2016/161270, incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00515] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 é LY3321367 (Eli Lilly). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou co- letivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região vari- ável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pe- sada ou cadeia leve de LY3321367.

[00516] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-TIM-3 é o clone de anticorpo F38-2E2. Em uma modalidade, a molécula de an- ticorpo anti-TIM-3 compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de regi- ão variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de ca- deia pesada ou cadeia leve de F38-2E2.

[00517] Outros anticorpos anti-TIM-3 conhecidos incluem aqueles descritos, por exemplo, nos documentos nº WO 2016/111947, WO 2016/071448, WO 2016/144803, US 8.552.156, US 8.841.418 e US

9.163.087, incorporados a título de referência em sua totalidade.

[00518] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIM-3 é um anticorpo que compete pela ligação e/ou se liga ao mesmo epítopo em TIM-3 que um dos anticorpos anti-TIM-3 descritos no presente documento. Tabela 10. Sequências de aminoácidos de outras moléculas de anticorpo anti-TIM-3 exemplificativas

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[00519] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com um inibidor de CTLA-4. O inibidor de CTLA-4 pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou um oligopeptídeo. Em algu- mas modalidades, o inibidor de CTLA-4 é Ipilimumabe (Yervoyº, Bris- tol-Myers Squibb) ou Tremelimumabe (Pfizer). O anticorpo Ipilimuma- be e outros anticorpos anti-CTLA-4 são descritos no documento nº US

6.984.720, incorporado ao presente documento a título de referência. O anticorpo Tremelimumabe e outros anticorpos anti-CTLA-4 são des- critos no documento nº US 7.411.057, incorporado ao presente docu- mento a título de referência.

Agonistas de GITR

[00520] Em certas modalidades, o anticorpo de ENTPD2 anti- humano, conforme descrito no presente documento, é administrado em combinação com um agonista de GITR. O agonista de GITR pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou um oligopeptídeo. Em algu- mas modalidades, o agonista de GITR é GWN323 (Novartis), BMS- 986156 (BMS), MK-4166 ou MK-1248 (Merck), TRX518 (Leap Thera- peutics), INCAGN1876 (Incyte/Agenus), AMG 228 (Amgen) ou INBRX- 110 (Inhibrx). Moléculas de Anticorpo Anti-GITR Exemplificativas

[00521] Em uma modalidade, o agonista de GITR é uma molécula de anticorpo anti-GITR. Em uma modalidade, o agonista de GITR é uma molécula de anticorpo anti-GITR conforme descrito no documento nº WO 2016/057846, publicado em 14 de abril de 2016, intitulado “Compositions and Methods of Use for Augmented Immune Response and Cancer Therapy”, incorporado a título de referência em sua totali- dade.

[00522] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (ou coletivamente todas as CDRs) de uma região variável de cadeia pesada e leve que com- preende uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 11 (por exemplo, das sequências de região variável de cadeia pesada e leve de MAB7 descritas na Tabela 11), ou codificada por uma sequência de nucleotídeos mostrada na Tabela 11. Em algumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Kabat (por exemplo, con- forme apresentado na Tabela 11). Em algumas modalidades, as CDRs estão de acordo com a definição de Chothia (por exemplo, conforme apresentado na Tabela 11). Em uma modalidade, uma ou mais das

CDRs (ou coletivamente todas as CDRs) têm uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais alterações, por exemplo, substituições de aminoá- cidos (por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas) ou deleções, em relação a uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela 11, ou codificadas por uma sequência de nucleotídeos mostra- da na Tabela 11.

[00523] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende uma sequência de aminoácidos de VMHCDR1 de SEQ ID NO: 909, uma sequência de aminoácidos de VHCDR2 de SEQ ID NO: 911, e uma sequência de aminoácidos de VÓHCDR3 de SEQ ID NO: 913; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma se- quência de aminoácidos de VLCDR1 de SEQ ID NO: 914, uma se- quência de aminoácidos de VLCDR2 de SEQ ID NO: 916, e uma se- quência de aminoácidos de VLCDR3 de SEQ ID NO: 918, cada uma revelada na Tabela 11.

[00524] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 901, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 901. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 902, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 902. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compreende uma VH que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 901 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 902.

[00525] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 905, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95%

ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 905. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 906, ou uma sequência de nucleotí- deos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 906. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma VH codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 905 e uma VL codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 906.

[00526] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 903, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:

903. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compre- ende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 904, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 904. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compreende uma ca- deia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 903, e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 904.

[00527] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 907, ou uma sequência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 907. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve codifi- cada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 908, ou uma se- quência de nucleotídeos pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 908. Em uma modalidade, a molécula de anti- corpo compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 907 e uma cadeia leve codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 908.

[00528] As moléculas de anticorpo descritas no presente documen- to podem ser produzidas por vetores, células hospedeiras e métodos descritos no documento nº WO 2016/057846, incorporado a título de referência em sua totalidade.

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Outros Agonistas e Anticorpos anti-GITR Exemplificativos

[00529] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR é BMS-986156 (Bristol-Myers Squibb), também conhecida como BMS 986156 ou BMS986156. BMS-986156 e outros anticorpos anti-GITR são descritos, por exemplo, nos documentos nº US 9.228.016 e WO 2016/196792, incorporados a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as se- quências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de BMS-986156, por exemplo, conforme descrito na Tabela 12.

[00530] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR é MK-4166 ou MK-1248 (Merck). MK-4166, MK-1248 e outros anticorpos anti-GITR são descritos, por exemplo, nos documentos nº US

8.709.424, WO 2011/028683, WO 2015/026684 e Mahne et al. Cancer Res. 2017; 77(5):1.108 a 1.118, incorporados a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti- GITR compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coleti- vamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de MK-4166 ou MK-1248.

[00531] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR é TRX518 (Leap Therapeutics). TRX518 e outros anticorpos anti-GITR são descritos, por exemplo, nos documentos nº US 7.812.135, US

8.388.967, US 9.028.823, WO 2006/105021 e Ponte J et al. (2010) Clinical Immunology; 135:S896, incorporados a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti- GITR compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coleti- vamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de TRX518.

[00532] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR é INCAGN1876 (Incyte/Agenus). INCAGN1876 e outros anticorpos anti- GITR são descritos, por exemplo, nos documentos nº US 2015/0368349 e WO 2015/184099, incorporados a título de referência em sua totali- dade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR com- preende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente to- das as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de INCAGN1876.

[00533] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR é AMG 228 (Amgen). AMG 228 e outros anticorpos anti-GITR são des- critos, por exemplo, nos documentos nº US 9.464.139 e WO 2015/ 031667, incorporados a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de AMG 228.

[00534] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GITR é INBRX-110 (Inhibrx). INBRX-110 e outros anticorpos anti-GITR são descritos, por exemplo, nos documentos nº US 2017/0022284 e WO 2017/015623, incorporados a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, o agonista de GITR compreende uma ou mais das sequências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia le- ve, ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de INBRX-110.

[00535] Em uma modalidade, o agonista de GITR (por exemplo, uma proteína de fusão) é MEDI 1873 (Medlmmune), também conheci- do como MEDI1873. MEDI 1873 e outros agonistas de GITR são des- critos, por exemplo, nos documentos nº US 2017/0073386, WO

2017/025610 e Ross et al. Cancer Res 2016; 76(14 Suppl): Abstract nr 561, incorporados a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, o agonista de GITR compreende um ou mais dentre um domínio Fc de IgG, um domínio de multimerização funcional e um do- mínio de ligação de receptor de um ligante de receptor de TNF induzi- do por glicocorticoide (GITRL) de MEDI 1873.

[00536] Outros agonistas de GITR conhecidos (por exemplo, anti- corpos anti-GITR) incluem aqueles descritos, por exemplo, no docu- mento nº WO 2016/054638, incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00537] Em uma modalidade, o anticorpo anti-GITR é um anticorpo que compete pela ligação e/ou se liga ao mesmo epítopo em GITR como um dos anticorpos anti-GITR descritos no presente documento.

[00538] Em uma modalidade, o agonista de GITR é um peptídeo que ativa a trajetória de sinalização de GITR. Em uma modalidade, o agonista de GITR é um fragmento de ligação à imunoadesina (por exemplo, um fragmento de ligação à imunoadesina que compreende uma porção de ligação de GITR ou extracelular de GITRL) fundida a uma região constante (por exemplo, uma região Fc de uma sequência de imunoglobulinas). Tabela 12. Sequências de aminoácidos de outras moléculas de anticorpo anti-GITR exemplificativas |APGKGLEWVAVIWYEGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTL

YLQMNSLRAEDTAVYYCARGGSMVRGDYYYGMDVWGQG TTVTVSS

KAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF |ATYYCQQFNSYPYTFGQGTKLEIK Moléculas de anticorpo multiespecífico anti-CD3 exemplificativas

[00539] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN-

TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com uma molécula de anticorpo multiespecífico anti-CD3 (por exemplo, uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo multiespecífico anti-CD3 se liga a CD3 e um antígeno de tumor-alvo (TTA). Em uma modalidade, o TTA é escolhido dentre CD19, CD20, CD38 ou CD123. Em uma moda- lidade, a molécula de anticorpo multiespecífico anti-CD3 está em um formato descrito nas Figuras 1A, 1B, 1C e 125 do documento nº WO 2016/182751, incorporado ao presente documento a título de referên- cia em sua totalidade.

[00540] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo multiespecífi- co anti-CD3 é uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti- CD123, por exemplo, XENP14045 (por exemplo, conforme apresenta- do na Tabela 15) ou uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD123 revelada no documento nº WO 2016/086189 ou WO 2016/182751, incorporados no presente documento a título de referên- cia em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD123 compreende uma ou mais das se- quências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de XENP14045, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma).

[00541] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo multiespecífi- co anti-CD3 é uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti- CD?20, por exemplo, XENP13676 (por exemplo, como apresentado na Tabela 13) ou uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti- CD20 revelada nos documentos nºº WO 2016/086189 ou WO 2016/182751, incorporados ao presente documento a título de referên-

cia em sua totalidade.

Em uma modalidade, a molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD20 compreende uma ou mais das se- quências de CDR (ou coletivamente todas as sequências de CDR), a sequência de região variável de cadeia pesada ou cadeia leve ou a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve de XENP13676, ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma).

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Complexos de IL15/IL-15Ra

[00542] Em certas modalidades, o anticorpo de ENTPD2 anti- humano, conforme descrito no presente documento, é administrado em combinação com um complexo de IL-15/IL-15Ra. Em algumas mo- dalidades, o complexo de IL-15/IL-15Ra é escolhido dentre NIZ985 (Novartis), ATL-803 (Altor) ou CYP0150 (Cytune). Complexos de IL-15/IL-15Ra exemplificativos

[00543] Em uma modalidade, o complexo de IL-15/IL-15Ra com- preende IL-15 humana que forma complexo com uma forma solúvel de IL-15Ra humana. O complexo pode compreender IL-15 covalente ou não covalentemente ligada a uma forma solúvel de IL-15Ra. Em uma modalidade particular, a IL-15 humana é não covalentemente ligada a uma forma solúvel de IL-15Ra. Em uma modalidade particular, a IL-15 humana da composição compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1001 na Tabela 14 e a forma solúvel de IL-15Ra hu- mana compreendem sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1002 na Tabela 14, conforme descrito no documento nº WO 2014/066527, incorporado a título de referência em sua totalidade. As moléculas descritas no presente documento podem ser produzidas por vetores, células hospedeiras e métodos descritos no documento nº WO 2007/084342, incorporado a título de referência em sua totalidade. Tabela 14. Sequências de aminoácidos e nucleotídeos de comple- xos de IL-15/IL-15Ra exemplificativos

E 1001 FLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGC

KECEELEEKNIKEFLOSFVHIVOQMFINTS 1002 Humano LTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHORPAPPSTVTT

AGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLM PSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQP PGVYPQG

Outros complexos de IL-15/IL-15Ra exemplificativos

[00544] Em uma modalidade, o complexo de IL-15/IL-15Ra é ALT- 803, uma proteína de fusão Fc de IL-15/IL-15Ra (complexo solúvel de IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc). ALT-803 é descrito no documento nº WO 2008/14379A4, incorporado a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a proteína de fusão Fc de IL-15/IL-15Ra compreende as sequências conforme descrito na Tabela 15.

[00545] Em uma modalidade, o complexo de IL-15/IL-15Ra com- preende IL-15 fundida ao domínio de sushi de IL-15Ra (CYPO0150, Cytune). O domínio sushi de IL-15Ra refere-se a um domínio que co- meça no primeiro resíduo de cisteína após o peptídeo de sinalização de IL-15Ra e que termina no quarto resíduo de cisteína após o dito peptídeo de sinalização. O complexo de IL-15 fundido ao domínio sus- hi de IL-15Ra é descrito nos documentos nºs WO 2007/04606 e WO 2012/175222, incorporados a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a fusão de domínio sushi de IL-15/IL-15Ra com- preende as sequências conforme as descrito na Tabela 15.

[00546] Em uma modalidade, o complexo de IL-15/IL-15Ra com- preende uma proteína de fusão de IL-15 e IL-15Ra, que pode compre- ende, ainda, um ligante, particularmente ligante glicina-serina, que co- necta a I1L-15 e IL-15Ra, conforme descrito no documento nº WO 2014/186469 (Board of Regents, the University of Texas System), in- corporado a título de referência em sua totalidade. Em uma modalida- de, a proteína de fusão IL-15/IL-15Ra compreende as sequências con- forme descrito na Tabela 15.

[00547] Em uma modalidade, o complexo de IL-15/IL-15Ra com- preende uma proteína de fusão de um domínio sushi de IL-15Ra e IL- 15, ligado por um ligante glicina-serina, conforme descrito no docu- mento nº WO 2015/109124 (Kadmon Corp.), incorporado a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a proteína de fusão

IL-15/IL-15Ra compreende as sequências conforme descrito na Tabela

15.

[00548] Em uma modalidade, o complexo de IL-15/IL-15Ra com- preende uma proteína de fusão de IL-15, IL-15Ra, um domínio Fc e um peptídeo RGD, de preferência, configurado como polipeptídeo RGD-domínio Fc-polipeptídeo IL-15-polipeptídeo L-15Ra, conforme descrito no documento nº WO 2017/000913 (Numab Biopharmaceuti- cals), incorporado a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a proteína de fusão RGD -Fc-IL-15-IL-15Ra compreende as sequências conforme descrito na Tabela 15.

[00549] Em uma modalidade, o complexo de IL-15/IL-15Ra com- preende uma proteína heterodimérica que compreende 1IL-15 ligada a um primeiro domínio Fc e IL-15Ra ligada a um segundo domínio Fc. À IL-15 é a forma madura de IL-15 humana e o IL-15Ra é o domínio ex- tracelular de IL-15Ra humana ou uma variante truncada do mesmo, tal como IL-15Ra-sushi. Os dois domínios Fc podem compreender muta- ções para possibilitar a formação de heterodímero através de intera- ções "Knob-into-Hole" e construtos exemplificativos são descritos no documento nº WO 2015/103928 (Jiangsu Hendrui Medicine Co), incor- porado a título de referência em sua totalidade.

[00550] Em uma modalidade, o complexo de IL-15/IL-15Ra com- preende uma combinação de IL-15 que compreende uma mutação de aminoácido cys e IL-15Ra (domínio extracelular ou sushi do mesmo) que compreende uma mutação cys para facilitar a formação de liga- ções de dissulfeto intramoleculares entre os polipeptídeos. As sequên- cias de IL-15 e IL-15Ra com combinações de mutação são descritas no documento no WO 2016/095642 (Jiangsu Hendrui Medicine Co), incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00551] Em uma modalidade, o complexo de IL-15/IL-15Ra com- preende uma proteína heterodimérica que compreende 1IL-15 ligada a um primeiro domínio Fc e IL-15Ra ligada a um segundo domínio Fc.

O primeiro e o segundo domínios Fc podem ter um conjunto de substitui- ções de aminoácido conforme listado: S267K/L368D/K370S: S267K/ LSS364K/E357Q; S364K/ES57Q: L3GHD/K370S; L36HD/K370S; S364K; L36HE/K370S: S364K; T411T/ES6OE/Q362E: D401K; L368D/ K370S: S364K/E357L e K370S; S364K/E357Q, de acordo com a nu- meração de EU, podem compreender, ainda, substituições de aminoá- cido e substituições para extirpar a ligação de receptor Fc gama, con- forme descrito no documento nº WO 2018/071919 (Xencor, Inc.), in- corporado a título de referência em sua totalidade.

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Agentes de Ligação de CSF-1/1R Exemplificativos

[00552] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com um agente de ligação de CSF-1/1IR.

[00553] Em algumas modalidades, o agente de ligação de CSF- 1/1R é um inibidor de fator estimulante de colônia de macrófago (M- CSF). M-CSF por vezes também é conhecido como CSF-1.

[00554] Em outra modalidade, o agente de ligação de CSF-1/IR é um inibidor de tirosina quinase de CSF-1R, 4-((2-(((1R,2R)-2-hidroxici- clo-hexila)>amino)benzo[d]tiazol-6-ila)óxi)-N-metilpicolinamida — (Com- posto A15), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2005/073224. Em algumas modalidades, o agente de ligação de CSF- 1/1R é um inibidor de M-CSF, Composto A33 ou um agente de ligação a CSF-1 descrito na Publicação PCT nº WO 2004/045532 ou Publica- ção PCT nº WO 2005/068503 incluindo RX1 ou 5H4 (por exemplo, uma molécula de anticorpo ou fragmento Fab contra M-CSF).

[00555] Em algumas modalidades, o agente de ligação de CSF- 1/I1R é um inibidor de CSFIR ou 4-(2-((1R,2R)-2-hidroxiciclo-hexila- mino)benzotiazol-6-ilóxi)-N-metilpicolinamida. 4-(2-((1R,2R)-2-hidroxi- ciclo-hexilamino)benzotiazol-6-ilóxi)-N-metilpicolinamida é revelada como o exemplo 157 na página 117 da Publicação PCT nº WO 2007/121484.

[00556] Em algumas modalidades, o agente de ligação de CSF- 1/IR é pexidartinibe (Número de Registro do CAS 1029044-16-3). Pexidartinibe também é conhecido como PLX3397 ou 5-((5-cloro-1H- pirrolo[2,3-b]piridin-3-ila)metila)-N-((6-(trifluorometila)piridin-3-ila)Meti- la)piridin-2-amina. O pexidartinibe é um inibidor de tirosina quinase re- ceptora (RTK) de molécula pequena de KIT, CSF1IR e FLT3.

[00557] Em algumas modalidades, o agente de ligação de CSF- 1/IR é emactuzumabe. O emactuzumabe também é conhecido como

RG7155 ou ROS509554. Emactuzumabe é um mAb IgG1 humanizado que tem como alvo CSF1R.

[00558] Em algumas modalidades, o agente de ligação de CSF- 1/1R é FPAOO8. FPAOO8 é um mAb humanizado que inibe CSFIR. Inibidores de IDO/TDO Exemplificativos

[00559] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com um inibidor de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) e/ou triptofano 2,3-dioxigenase (TDO).

[00560] Em algumas modalidades, o inibidor de IDO/TDO é esco- lhido dentre (4E)-4-[(3-chloro-4-fluoroanilino)-nitrosometilideno]-1,2,5- oxadiazol-3-amina (também conhecido como INCB24360 ou Epaca- dostat; Número de Registro CAS: 1204669-58-8 (Incyte)), Indoximode (1-metil-D-triptofano), — a-ciclo-hexil-5H-Imidazo[5,1-alisoindol-5-etanol (também conhecido como NLG919) ou BMS-986205 (também conhe- cido como FO01287 ou ONO-7701).

[00561] Em algumas modalidades, o inibidor de IDO/TDO é Epaca- dostat. O mesmo é um inibidor de indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO1) potente e seletivo com um ICs5o de 10 nM. Epacadostat altamente sele- tivo em relação a outras enzimas relacionadas, tal como IDO2 ou trip- tofano 2,3-dioxigenase (TDO).

[00562] Em algumas modalidades, o inibidor de IDO/TDO é Indoxi- mode (New Link Genetics). O Indoximode, o isômero D de 1-metil- triptofano, é um inibidor de trajetória de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) de molécula pequena administrado de modo oral que perturba os mecanismos através dos quais os tumores escapam da destruição imunomediada. NLG919 é um inibidor potente da trajetória de IDO com um Ki/ECso de 7 nM/75 nM, respectivamente, em ensaios sem célula.

[00563] Em algumas modalidades, o inibidor de IDO/TDO é BMS-

986205 (também conhecido como FOO01287 ou ONO-7701) (Fle- xus/BMS). BMS-986205 é um inibidor de indolamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1) de molécula pequena. Inibidores de TGF-B Exemplificativos

[00564] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com um inibidor de fator de crescimento de transformação beta (TGF-B). O inibidor de TGF-B pode ser um anticorpo, um frag- mento de ligação a antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma pro- teína de fusão ou um oligopeptídeo. Em algumas modalidades, o inibi- dor de TGF-B é escolhido dentre fresolimumabe e XOMA 089 (Xoma).

[00565] O TGF-B pertence a uma grande família de citocinas estru- turalmente relacionadas incluindo, por exemplo, proteínas morfogené- ticas ósseas (BMPs), fatores de crescimento e de diferenciação, acti- vinas e inibinas. Em algumas modalidades, os inibidores de TGF-B descritos no presente documento podem se ligar e/ou inibir uma ou mais isoformas de TGF-B (por exemplo, um, dois ou todos os TGF-B1, TGF-B2 ou TGF-B3).

[00566] Em algumas modalidades, o inibidor de TGF-B é fresolimu- mabe (Número de Registro CAS: 948564-73-6). Fresolimumabe tam- bém é conhecido como GC1008. Fresolimumabe é um anticorpo mo- noclonal humano que se liga a e inibe as isoformas 1, 2 e 3 de TGF- beta. Fresolimumabe é revelado, por exemplo, nos documentos nºWO 2006/086469, U.S. 8.383.780 e U.S. 8.591.901.

[00567] A cadeia pesada de fresolimumabe tem a sequência de aminoácidos de:

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLE WMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVY YCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEF LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY

PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 1012).

[00568] A cadeia leve de fresolimumabe tem a sequência de aminoácidos de:

ETVLTAOSPGTLSLSPGERATLSCRASQOSLGSSYLAWYQQKPGQAPR LLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYAD SPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR

EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 1013).

[00569] Em algumas modalidades, o inibidor de TGF-B é XOMA

089. XOMA 089 também é conhecido como XPA.42.089. XOMA 089 é um anticorpo monoclonal totalmente humano que se liga e neutraliza ligantes 1 e 2 de T]GF-beta, enquanto modera TGF-beta 3.

[00570] A região variável de cadeia pesada de XOMA 089 tem a sequência de aminoácidos de:

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLE

WMGGIIPIFGTANYAQKFOQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY YCARGLWEVRALPSVYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 310) (revelada como a SEQ ID NO: 6 no documento nº WO2012/167143).

[00571] A região variável de cadeia leve de XOMA 089 tem a se- quência de aminoácidos de:

SYELTQPPSVSVAPGQTARITCGANDIGSKSVHWYQQKAGQAPVLV

VSEDIIRPSGIPERISGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRDS DQYVFGTGTKVTVLG (SEQ ID NO: 311) (revelada como a SEQ ID NO: 8 no documento nº WO2012/167143).

Inibidores de VEGFR Exemplificativos

[00572] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com um inibidor de receptor de fator de crescimento en- dotelial vascular (VEGF) (por exemplo, um inibidor de um ou mais den- tre VEGFR (por exemplo, VEGFR-1, VEGFR-2 ou VEGFR-3) ou VEGF).

[00573] Em algumas modalidades, o inibidor de VEGFR é succinato de vatalanibe (Composto A47) ou um composto descrito no documento nº EP 296122.

[00574] Em alguma modalidade, o inibidor de VEGFR é um inibidor de um ou mais dentre VEGFR-2, PDGFRbeta, KIT ou Raf quinase C, 1-metil-5-((2-(5-(trifluorometila)-1H-imidazol-2-ila)piridin-4-ila)Óxi )-N-(4- (triluorometila)fenila)-1H-benzo[d]imidazol-2-amina (Composto A37) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/030377.

[00575] Outros inibidores de trajetória de VEGFR exemplificativos que podem ser usados nas combinações descritas no presente docu- mento incluem, por exemplo, bevacizumabe (AVASTINO), axitinibe (INLYTAG); alaninato de brivanibe (BMS-582664, propanoato de (S)- ((R)-1-(4-(4-Fluoro-2-metil-1H-indol-5-ilóxi)-S-metilpirrolo[2,1- fI[1,2,4]triazin-B-ilóxi)propan-2-ila)2-amino); sorafenibe (NEXAVARO); pazopanibe (VOTRIENTO); malato de sunitinibe (SUTENTO); cedira- nibe (AZD2171, CAS 288383-20-1); vargatef (BIBF1120, CAS 928326- 83-4); Foretinibe (GSK1363089); telatinibe (BAY57-9352, CAS 332012-40-5); apatinibe (YN968D1, CAS 811803-05-1); imatinibe (GLEEVECO); ponatinibe (AP24534, CAS 943319-70-8); tivozanibe (AV951, CAS 475108-18-0); regorafenibe (BAY73-4506, CAS 755037- 03-7); di-hidrocloreto de vatalanibe (PTK787, CAS 212141-51-0); bri- vanibe (BMS-540215, CAS 649735-46-6); vandetanibe (CAPRELSAO ou AZD6474); difosfato de motesanibe (AMG706, CAS 857876-30-3,

N-(2,3-di-hidro-3,3-dimetil-1H-indol-6-ila)-2-[(4-piridinil metila) amino]-3- piridinecarboxamida, descritos na Publicação PCT nº WO 02/066470); linfanibe (ABT869, CAS 796967-16-3); cabozantinibe (XL184, CAS 849217-68-1); lestaurtinibe (CAS 111358-88-4); N-[5-[[[5-(1,1-dimetile- tila)-2-oxazolil]Jmetil]tio]-2-tiazolil])-4-piperidinacarboxamida (BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-amino-1-((4-((3-metoxifenila)>amino) pir- rolo[2,1-f][1,2,4]triazin-5-ila)Metila)piperidin-3-0l (BMS690514); N-(3,4- Dicloro-2-fluorofenila)-6-metoxi-7-[[(3aa,58B,6aa)-octa-hidro-2-metilci- clopenta[c]pirrol-5-il]Jmetoxi]-4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613- 23-8); 4-metil-3-[[1-metil-6-(3-piridinila)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-4- illamino]-N-[3-(trifluorometila)fenil]-benzamida (BHG712, CAS 940310- 85-0); aflibercept (EYLEAG) e endostatina (ENDOSTARGO).

[00576] Os anticorpos anti-VEGF exemplificativos que podem ser usados nas combinações descritas no presente documento incluem, por exemplo, um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo anti-VEGF monoclional A4.6.1 produzido por hibridoma ATCC HB 10709; um anticorpo anti-VEGF monoclonal humanizado recombinante gerado de acordo com Presta et a/. (1997) Cancer Res. 57:4.593 a 4.599. Em uma modalidade, o anticorpo anti-VEGF é Be- vacizumabe (BV), também conhecido como VEGF de rhuMAb ou AVASTINO. O mesmo compreende regiões de framework de IgG1 humana com mutação e regiões determinantes de complementaridade de ligação a antígeno do anticorpo monoclonal anti-hoVEGF murino A.4.6.1 que bloqueia a ligação de VEGF humano aos seus receptores. O bevacizumabe e outros anticorpos anti-VEGF humanizados são adi- cionalmente descritos na Patente nº U.S. 6.884.879 emitida em 26 de fevereiro de 2005. Os anticorpos adicionais incluem os anticorpos de série G6 ou B20 (por exemplo, G6-31, B20-4.1), conforme descrito na Publicação PCT nº WOZ2005/012359, Publicação PCT nº WO2005/

044853. Para anticorpos adicionais, consultar as Patentes nº U.S.

7.060.269, 6.582.959, 6./03.020, 6.054.297, WOS98/45332, WO 96/30046, WOS94/10202, EP 0666868B1, Publicações de Pedido de Patente nºs U.S. 2006/009360, 2005/0186208, 2003/0206899, 2003/ 0190317, 2003/0203409 e 2005/0112126; e Popkov et al, Journal of Immunological Methods 288: 149 a 164 (2004). Outros anticorpos in- cluem aqueles que se ligam a um epítopo funcional em VEGF humano que compreende os resíduos F17, MI 8, D19, Y21, Y25, Q89, 191, KI 01, El 03 e C104 ou, alternativamente, que compreende resíduos F17, Y21, 022, Y25, D63, 183 e Q89. Inibidores de EGFR Exemplificativos

[00577] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD2 anti-humano, por exemplo, a molécula de anticorpo anti- ENTPD?2 descrita no presente documento, é usada em combinação com um inibidor de tirosina quinase (por exemplo, um inibidor de tiro- sina quinase receptora (RTK)). O inibidor de tirosina quinase exempli- ficativo inclui, porém sem limitação, um inibidor de trajetória de fator de crescimento epidérmico (EGF) (por exemplo, um inibidor de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)), um inibidor de trajetória de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (por exemplo, um inibi- dor de receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) (por exemplo, um inibidor de VEGFR-1, um inibidor de VEGFR-2, um inibidor de VEGFR-3)), um inibidor de trajetória de fator de crescimen- to derivado de plaqueta (PDGF) (por exemplo, um inibidor de receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR) (por exemplo, um inibidor de PDGFR-B8)), um inibidor de RAF-1, um inibidor de KIT e um inibidor de RET. Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de ENTPD?2 anti-humano descrita no presente documento é adminis- trada em combinação com um inibidor de Receptor de Fator de Cres- cimento Epidérmico (EGFR).

[00578] Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é (R,E)-N-(7-

cloro-1-(1-(4-(dimetilamino)but-2-enoila)azepan-3-ila)-1H-benzo[d] imi- dazol-2-ila)-2-metilisonicotinamida (Composto A40) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2013/184757.

[00579] Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é escolhido dentre um ou mais dentre erlotinibe (TarcevaO), gefitinibe (IressaO), cetuximabe (Erbitux O), panitumumabe (Vectibix&), necitumumabe (PortrazzaG), dacomitinibe, nimotuzumabe, Imgatuzumabe, afatinibe ou osimertinibe (Tagrisso).

[00580] “Outros agentes anticâncer, por exemplo, inibidores de traje- tória de inibidores de tirosina quinase, que podem ser usados nas combinações descritas no presente documento incluem, porém sem limitação, inibidores de tirosina quinase selecionados que são escolhi- dos dentre sunitinibe (Sutent&) ou sorafenibe (NexavarO).

[00581] Em algumas modalidades, o agente anticâncer usado em combinação com o inibidor tipo porco-espinho é selecionado dentre o grupo que consiste em: axitinibe (AG013736), bosutinibe (SKI-606), cediranibe (RECENTINTY, AZD2171), dasatinibe (SPRYCELO, BMS- 354825), erlotinibe (TARCEVAGO), gefitinibe (IRESSAGO), imatinibe (GleevecO&, CGP57148B, STI-571), lestaurtinibe (CEP-701), neratinibe (HKI-272), nilotinibe (TASIGNAGO), semaxanibe (semaxinibe, SUS416), sunitinibe (SUTENTO, SU11248), toceranibe (PALLADIAG), vandeta- nibe (ZACTIMAG, ZD6474), vatalanibe (PTK787, PTK/ZK), trastuzu- mabe (HERCEPTINO), bevacizumabe (AVASTINO), rituximabe (RI- TUXANO), cetuximabe (ERBITUXO), panitumumabe (VECTIBIXO), ranibizumabe (LucentisO&), nilotinibe (TASIGNAGO), sorafenibe (NEXA- VARO), alemtuzumabe (CAMPATHO), ozogamicina de gemtuzumabe (MYLOTARGO), ENMD-2076, PCl-32765, AC220, BIBW 2992 (TOVOKTY), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS- 777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEFO), AP24534, JNJ- 26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, tivoza-

nibe (AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647, XL228, AEE788, AG-490, AST-6, BMS-599626, CUDC-101, PD153035, pelitinibe (EKB- 569), vandetanibe (zactima), WZ3146, WZ4002, WZ8040, ABT-869 (linifanibe), AEE788, AP24534 (ponatinibe), AV-951(tivozanibe), axiti- nibe, BAY 73-4506 (regorafenibe), alaninato de brivanibe (BMS- 582664), brivanibe (BMS-540215), cediranibe (AZD2171), CP 673451, CYC116, E7080, Ki8751, masitinibe (AB1010), MGCD-265, difosfato de motesanibe (AMG-706), MP-470, OSI-930, Cloridrato de Pazopani- be, PD173074, Tosilato de Sorafenibe (Bay 43-9006), SU 5402, TSU- 68(SU6668), vatalanibe, XL880 (GSK1363089, EXEL-2880). Inibidores de c-MET Exemplificativos

[00582] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com um inibidor de c-MET.

[00583] Em algumas modalidades, o inibidor de c-MET é o Com- posto A17 ou um composto descrito nas Patentes nº U.S. 7.767.675 e

8.420.645).

[00584] Em algumas modalidades, o inibidor de c-MET é JNJ-

38877605. JNJ-38877605 é um inibidor de molécula pequena, dispo- nível de modo oral de c-Met. JNJ-38877605 se liga seletivamente a c- MET, inibindo, assim, a fosforilação de c-MET e interrompendo as tra- jetórias de transdução de sinal de c-Met.

[00585] Em algumas modalidades, o inibidor de c-Met é AMG 208. AMG 208 é um inibidor de molécula pequena seletivo de c-MET. AMG 208 inibe a ativação dependente de ligante e independente de ligante de c-MET, inibindo sua atividade de tirosina quinase, que pode resultar em inibição de crescimento celular em tumores que superexpressam c-Met.

[00586] Em algumas modalidades, o inibidor de c-Met é AMG 337. AMG 337 é um inibidor de c-Met biodisponível de modo oral. AMG 337 se liga seletivamente a c-MET, interrompendo, assim, as trajetórias de transdução de sinal de c-MET.

[00587] Em algumas modalidades, o inibidor de c-Met é LY2801653. LY2801653 é um inibidor de molécula pequena, disponível de modo oral de c-Met. LY2801653 se liga seletivamente a c-MET, inibindo, assim, a fosforilação de c-MET e interrompendo as trajetórias de transdução de sinal de c-Met.

[00588] Em algumas modalidades, o inibidor de c-Met é MSC 2156119J. MSC2156119J é um inibidor de c-Met biodisponível de mo- do oral. MSC2156119J se liga seletivamente a c-MET, o que inibe a fosforilação de c-MET e interrompe as trajetórias de transdução de si- nal mediado por c-Met.

[00589] Em algumas modalidades, o inibidor de c-MET é capmatini- be. O capmatinibe também é conhecido como INCB028060. O capma- tinibe é um inibidor de c-MET biodisponível de modo oral. O capmati- nibe se liga seletivamente a c-Met, inibindo, assim, a fosforilação de c- Met e interrompendo as trajetórias de transdução de sinal de c-Met.

[00590] Em algumas modalidades, o inibidor de c-MET é crizotinibe. O crizotinibe também é conhecido como PF-02341066. O crizotinibe é um inibidor à base de aminopiridina disponível de modo oral da qui- nase de linfoma anaplásico de tirosina quinase receptora (ALK) e o receptor de fator de crescimento de c-Met/hepatócito (HGFR). Crizoti- nibe, de uma maneira competitiva por ATP, se liga a e inibe a ALK quinase e proteínas de fusão de ALK. Além disso, o crizotinibe inibe c- Met quinase, e interrompe a trajetória de sinalização de c-Met. De mo- do geral, esse agente inibe o crescimento de célula de tumor.

[00591] Em algumas modalidades, o inibidor de c-MET é golvatini- be. O golvatinibe é um inibidor de quinase duplo biodisponível de mo- do oral de c-MET e VEGFR-2 com atividade antineoplásica potencial. O golvatinibe se liga a e inibe as atividades tanto de c-MET quanto de

VEGFR-2, o que pode inibir o crescimento de célula de tumor e a so- brevida de células de tumor que superexpressam essas tirosina quina- ses receptoras.

[00592] Em algumas modalidades, o inibidor de c-MET é tivantinibe. O tivantinibe também é conhecido como ARQ 197. O tivantinibe é um inibidor de molécula pequena de c-MET biodisponível de modo oral. O tivantinibe se liga à proteína de c-MET e interrompe as trajetórias de transdução de sinal de c-Met, o que pode induzir a morte celular em células de tumor que superexpressam a proteína de c-MET ou que ex- pressam proteína de c-Met constitutivamente ativada. Inibidores de IAP Exemplificativos

[00593] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com um inibidor de Inibidor de Proteína de Apoptose (IAP).

[00594] Em algumas modalidades, o inibidor de IAP é (S)-N-((S)-1- ciclo-hexil-2-((S)-2-(4-(4-fluorobenzoila)tiazol-2-ila)pirrolidin-1-ila)-2-0x0- etila)-2-(metilamino)propanamida (Composto A21) ou um composto descrito na Patente nº U.S. 8.552.003. Inibidores exemplificativos de mMTOR

[00595] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com um inibidor de alvo mamífero de rapamicina (mMTOR).

[00596] Em algumas modalidades, o inibidor de MTOR é 8-(6-Metoxi- piridin-3-ila)-3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometil-fenila)-1,3-di-hidro- imidazo[4,5-c]quinolin-2-0na (Composto A41).

[00597] Em algumas modalidades, o inibidor de MTOR é everolimus (também conhecido como RADO01 ou AFINITORO; Composto A36) ou um composto primeiramente descrito na Publicação PCT nº WO 94/09010.

[00598] Em algumas modalidades, o inibidor de MTOR é escolhido a partir de um ou mais dentre, temsirolimo (TORISELO), PF-4691502, GDCO0980, OSI-027, GSK1059615, KU-0063794, WYE-354, Palomid 529 (P529), PF-04691502, gedatolisibe (PF-05212384, PKI-587), rida- forolimo (formalmente conhecido como deferolimo, dimetilfosfinato de (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,98,128,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,287Z,30S,328S,35R)- 1,18-di-hidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14, 20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.04,9] — hexatriaconta-16, 24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclo-hexila, também conhecido como AP23573 e MK8669 e descrito na Publicação de PCT nº WO 03/064383); rapamicina (AY22989, SIROLIMUSO); simapimode (Nú- mero de Registro do CAS: 164301-51-3); (5-(2,4-Bis[(3S)-3-metilmor- folin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidina-7-il)-2-metoxifenila)metanol (AZD8055); 2-Amino-8-[trans-4-(2-hidroxietóxi)ciclo-hexil]-6-(6-metoxi-3-piridinila)- 4-metil-pirido[2,3-d]pirimidina-7(8H)-ona (PFO4691502, Número de Registro do CAS: 1013101-36-4); sal interno de N2-[1,4-diox0-4-[[4-(4- o0x0-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-ila)Morfolinio-4-il|metoxi]butol]-L-arginil- glicil-L-a-aspartilL-serina (SF1126, Número de Registro CAS: 936487- 67-1) (SEQ ID NO: 1011) ou XL765 (SAR245409). Inibidores de PI3K-y, -5 Exemplificativos

[00599] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo ENTPD2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em com- binação com um inibidor de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinase (PISK), por exemplo, fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinase gama e/ou delta (PI3K-y,5).

[00600] Em algumas modalidades, o inibidor de PISK é um inibidor de isoformas delta e gama de PI3K. Os inibidores de PI3K exemplifica- tivos que podem ser usados em combinação são descritos, por exem- plo, nos documentos nºº WO 2010/036380, WO 2010/006086, WO

09/114870, WO 05/113556. Em algumas modalidades, o inibidor de PI3K é escolhido dentre um ou mais dentre GSK 2126458, GDC-0980, GDC-0941, Sanofi XL147, XL756, XL147, PF-46915032, CAL-101, CAL 263, SF1126, PX-886, e um inibidor duplo de PI3K.

[00601] Em algumas modalidades, o inibidor de PISK-y,ô é idelalisi- be (Número de Registro do CAS: 870281-82-6). O idelalisibe também é conhecido como ZYDELIGO, GS-1101, CAL-101 ou 5-Fluoro-3-fenil- 2-[(18)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-quinazolinona. O idelalisibe bloqueia P1106, a isoforma delta de PI3K. O idelalisibe é revelado, por exemplo, em Wu et al. Journal of Hematology & Oncology (2013) 6:

36.

[00602] Em algumas modalidades, o inibidor de PISK-y,ô é 8-(6- Metoxi-piridin-3-ila)-3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometil-fenila)- 1,3-di-hidro-imidazo[4,5-c]quinolin-2-o0na (Composto A41).

[00603] Outros inibidores de PISK-y,ô exemplificativos que podem ser usados na combinação incluem, por exemplo, pictilisibe (GDC- 0941), LY294002, pilaralisibe (XL147), PI-3065, PI-103, VS-5584 (SB2343), CZC24832, duvelisibe (IPI-145, INK1197), TG100-115, CAY10505, GSK1059615, PF-04691502, AS-605240, voxtalisibe (SAR245409, XL765), IC-87114, omipalisibe (GSK2126458, GSK458), TG100713, gedatolisibe (PF-05212384, PKI-587), PKI-402, análogo de XL147, PIK-90, PIK-293, PIK-294, 3-Metiladenina (3-MA), AS-252424, AS-604850 ou apitolisibe (GDC-0980, RG7422).

[00604] Em algumas modalidades, o inibidor de PI3K é o Composto A8 ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO2010/029082.

[00605] Em algumas modalidades, o inibidor de PI3K é um inibidor de pan-PI3K, (48,5R)-3-(2'-amino-2-morfolino-4'-(trifluorometila)-[4,5'- bipirimidina]-6-ila)-4-(hidroximetila)-5-metiloxazolidin-2-0na — (Composto A13) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO2013/124826.

[00606] Os inibidores de PI3K-y, -5 exemplificativos incluem, porém sem limitação, duvelisibe e idelalisibe. Idelalisibe (também denomina- do GS-1101 ou CAL-101; Gilead) é uma molécula pequena que blo- queia a isoforma delta de PISK. A estrutura de idelalisibe (5-Fluoro-3- fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-quinazolinona) é mos- trada abaixo.

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[00607] Duvelisibe (também chamado IPI-145; Infinity Pharmaceuti- cals e Abbvie) é uma molécula pequena que bloqueia PISK-5,y. A es- trutura de duvelisibe (8-Cloro-2-fenil-3-[(1S)-1-(9H-purin-6-ilamino)etil]- 1(2H)-isoquinolinona) é mostrada abaixo. do O Co

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[00608] Em uma modalidade, o inibidor é uma fosfatidilinositol 3- quinase dupla (PI3K) e o inibidor de MTOR selecionado a partir de 2- Amino-8-[trans-4-(2-hidroxietóxi)ciclo-hexil]-6-(6-metoxi-3-piridinila)-4- metil-pirido[2,3-a]pirimidina-7(8H)-ona (PF-04691502); N-[4-[[4-(Dime- tilamino)-1-piperidinil]carbonil]fenil]-N'-[4-(4,6-di-4-morfolinil-1,3,5-tria- zin-2-ila)fenilJureia (PF-05212384, PKI-587); apitolisibe (GDC-0980, RG7422); 2,4-Difluoro-N-(2-(metilóxi)-5-[4-(4-piridazinila)-6-quinolinil]- 3-piridinil)benzenossulfonamida (GSK2126458); ácido 8-(6-metoxi- piridin-3-ila)-3-metil-1-(4-(piperazin-1-ila)-3-(trifluorometila)fenila)-1H- imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)-ona maleico (NVP-BGT226); 3-[4-(4-mor-

folinilpirido[3',2':4,5]furo[3,2-d]pirimidina-2-il]fenol (PI-103); 5-(9-isopro- pil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-ila)pirimidina-2-amina (VS-5584, SB2343); ou N-[2-[(3,5-Dimetoxifenila)amino]quinoxalin-3-il]-4-[(4-metil -3-metoxifenila)carbonilJaminofenilsulfonamida (XL765).

Inibidores de JAK Exemplificativos

[00609] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento é administrada em combinação com um inibidor de Janus quinase (JAK).

[00610] Em algumas modalidades, o inibidor de JAK é 2-fluoro-N- metil-4-(7-(quinolin-6-ilmetila):midazo[1,2-b][1,2,4]triazin-2-ila)Denzami- da (Composto A17) ou um sal diclorídrico do mesmo, ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/070514.

[00611] Em alguma modalidade, o inibidor de JAK é fosfato de ruxo- litinibe (também conhecido como JAKAFI; Composto A18) ou um com- posto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/070514.

[00612] Em certas modalidades, qualquer uma das combinações descritas no presente documento, alternativamente ou em combina- ção, inclui adicionalmente um ou mais dos agentes descritos na Tabe- la 16.

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[00613] As moléculas de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, con- forme descrito no presente documento, podem ser administradas em combinação com um agente terapêutico adicional.

Em algumas moda- lidades, o agente terapêutico adicional é escolhido dentre um ou mais dentre: 1) um inibidor de proteína quinase C (PKC); 2) um inibidor de proteína de choque térmico 90 (HSP90); 3) um inibidor de uma fosfoi- nositida 3-quinase (PISK) e/ou alvo de rapamicina (mMTOR); 4) um ini- bidor de citocromo P450 (por exemplo, um inibidor de CYP17 ou um inibidor de 17alfa-Hidroxilase/C17-20 Liase); 5) um agente quelante de ferro; 6) um inibidor de aromatase; 7) um inibidor de p53, por exemplo, um inibidor de uma interação p53/Mdm2; 8) um indutor de apoptose; 9) um inibidor de angiogênese; 10) um inibidor de aldosterona sintase; 11) um inibidor de receptor suavizado (SMO); 12) um inibidor de re- ceptor de prolactina (PRLR); 13) um inibidor de sinalização de Wnt; 14) um inibidor de CDK4/6; 15) um inibidor de receptor de fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGFR2)/receptor de fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGFRA4); 16) um inibidor de fator estimulante de colô- nia de macrófagos (M-CSF); 17) um inibidor de um ou mais dentre |i- beração de histamina, FIt3 (por exemplo, FLK2/STK1) ou PKC; 18) um inibidor de um ou mais dentre VEGFR-2 (por exemplo, FLK-1/KDR), PDGFRbeta, c-KIT ou Raf quinase C; 19) um agonista de somatostati- na e/ou um inibidor de liberação de hormônio do crescimento; 20) um inibidor de quinase de linfoma anaplástico (ALK); 21) um inibidor de receptor de fator de crescimento similar à insulina (IGF-1R); 22) um inibidor de P-Glicoproteína 1; 23) um inibidor de receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR); 24) um inibidor de BCR-ABL quinase; 25) um inibidor de FGFR; 26) um inibidor de CYP11B2; 27) um inibidor de HDM2, por exemplo, um inibidor da interação HDM2-p53; 28) um inibidor de uma tirosina quinase; 29) um inibidor de c-MET; 30) um inibidor de JAK; 31) um inibidor de DAC; 32) um inibidor de 118-

hidroxilase; 33) um inibidor de IAP; 34) um inibidor de PIM quinase; 35) um inibidor de Porcupine; 36) um inibidor de BRAF, por exemplo, BRAF V600E ou BRAF do tipo selvagem; 37) um inibidor de HER3; 38) um ini- bidor de MEK; ou 39) um inibidor de uma lipídio quinase, por exemplo, conforme descrito no presente documento e na Tabela 1.

[00614] Em uma modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de PKC, Sotrastaurina (Com- posto A1), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2005/039549, para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio des- crito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de PKC é Sotrastaurina (Composto A1) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2005/039549.

[00615] Em uma modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de BCR-ABL, nilotinibe (Com- posto A2, TasignaO), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2004/005281, para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de BCR-ABL é nilotinibe ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2004/005281.

[00616] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de HSP90 para tratar um dis- túrbio, por exemplo, um distúrbio, conforme descrito no presente do- cumento, por exemplo, um câncer.

[00617] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, é usada em combinação com um inibidor de PI3SK e/ou mTOR, 8-(6-Metoxi-piridin- 3-ila)-3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometil-fenila)-1,3-di-hidro-imi- dazo[4,5-c]quinolin-2-0na (Composto A41), para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de PI3BK e/ou mTOR é 8-(6-Metoxi-piridin-3-ila)- 3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometil-fenila)-1,3-di-hidro-imidazo [4,5-c]quinolin-2-ona (Composto A41).

[00618] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de FGFR, 3-(2,6-dicloro-3,5- dimetoxifenila)-1-(6-((4-(4-etilpiperazin-1-ila)fenila)amino)pirimidina-4- ila)-1-metilureia (Composto A5) ou um composto descrito na Patente nº U.S. 8.552.002, para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de FGFR é 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenila)-1-(6-((4-(4-etilpiperazin-1- ila)fenila)>amino)pirimidina-4-ila)-1-metilureia (Composto A5) ou um composto descrito na Patente nº U.S. 8.552.002. O composto A5 tem a seguinte estrutura: o-s HC E" N=CHz3 Ne &

NH ” = Ca

[00619] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de PI3K, Buparlisibe (Compos- to A6), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/084786, para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio des- crito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de PISK é Buparlisibe (Composto A6) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/084786. O composto A6 tem a seguinte estrutura: O.

CC

E (JT XXO a. HN ON

[00620] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de FGFR, 8-(2,6-difluoro-3,5- dimetoxifenila)-N-(4-((dimetilamino)metila)-1H-imidazol-2- ila)quinoxalina-5-carboxamida (Composto A7) ou um composto des- crito na Publicação PCT nº WO 2009/141386 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de FGFR é 8-(2,6-difluoro-3,5-dimetoxifenila)-N- (4-((dimetilamino)metila)-1H-imidazol-2-ila)quinoxalina-5- carboxamida(Composto A7) ou um composto descrito em uma Publi- cação PCT nº WO 2009/141386.

[00621] Em outra modalidade a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de PI3SK, (S)-N1-(4-metil-5-(2-

(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-ila)piridin-4-ila)tiazol-2-ila)pirrolidina- 1,2-dicarboxamida (Composto A8) ou um composto descrito na Publi- cação PCT nº WO 2010/029082 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de PISK é (S)-N1-(4-metil-5-(2-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2- ila)piridin-4-ila)tiazol-2-ila)pirrolidina-1,2-dicarboxamida (Composto A8) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/029082.

[00622] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de citocromo P450 (por exem- plo, a inibidor de CYP17) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/149755, para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúr- bio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de citocromo P450 (por exemplo, o inibidor de CYP17) é um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/149755; nº U.S. 8.263.635 B2; ou EP 2445903 B1.

[00623] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de HDM?2, (S)-1-(4-clorofenila)- 7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-(metil(((1r,4S)-4-(4-metil-3-oxopiperazin-1- ila)ciclo-hexila)metila)amino)fenila)-1,2-di-hidroisoquinolin-3(4H)-ona (Composto A10) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2011/076786 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio des- crito no presente documento). Em uma modalidade, o inibidor de HDM? é (S)-1-(4-clorofenila)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-(metil(((1r,4S)- 4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-ila)ciclo-hexila)mMetila)amino)fenila)-1,2-di- hidroisoquinolin-3(4H)-ona (Composto A10) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2011/076786.

[00624] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um agente quelante de ferro, Deferasirox (também conhecido como EXJADE; Composto A11), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 1997/049395 para tratar um distúr- bio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o agente quelante de ferro é Deferasirox ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 1997/049395. Em uma modalidade, o agente quelante de ferro é Deferasirox (Composto A11).

[00625] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de aromatase, Letrozole (tam- bém conhecido como FEMARA; Composto A12), ou um composto descrito no documento nº US 4.978.672 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o inibidor de aromatase é Letrozol (Composto A12) ou um composto descrito na Patente nº U.S. 4.978.672.

[00626] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de PI3SK, por exemplo, um ini- bidor de pan-PI3K, (48,5R)-3-(2-amino-2-morfolino-4"-(trifluorometila)- [4,5'-bipirimidina]-6-ila)-4-(hidroximetila)-5-metiloxazolidin-2-0na (Com- posto A13) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO?2013/124826 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de PISK é (48,5R)-3-(2'-amino-2-morfolino-4'"-(trifluorometila)-[4,5'- bipirimidina]-6-ila)-4-(hidroximetila)-5-metiloxazolidin-2-ona (Composto

A13) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO2013/

124826.

[00627] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de p53 e/ou uma interação de p53/Mdm2, —(S)-5-(5-cloro-1-metil-2-0x0-1,2-di-hidropiridin-3-ila)-6-(4- clorofenila)-2-(2,4-dimetoxipirimidina-S-ila)-1-isopropil-5,6-di-hidropirro- lo[3,4-d]imidazol|-4(1H)-ona (Composto A14), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO2013/111105 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o p53 e/ou um inibidor de interação p53/Mdm2 é (S)-5-(5- cloro-1-metil-2-0x0-1,2-di-hidropiridin-3-ila)-6-(4-clorofenila)-2-(2,4-di- metoxipirimidina-5-ila)-1-isopropil-5,6-di-hidropirrolo[3,4-d]imidazo|-4 (1H)-ona (Composto A14) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO2013/111105.

[00628] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de tirosina quinase de CSF- 1R, 4-((2-(((1R,2R)-2-hidroxiciclo-hexila)amino)benzo[d]tiazol-6-ila)Óxi) -N-metilpicolinamida (Composto A15), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2005/073224 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o inibidor de tirosina quinase de CSF-1R é 4-((2-(((1R,2R)-2- hidroxiciclo-hexila)amino)benzof[d]tiazol-6-ila)Óxi)-N-metilpicolinamida (Composto A15), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2005/07322A4.

[00629] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um indutor de apoptose e/ou um inibidor de angiogênese, como mesilato de Imatinibe (também conhecido co- mo GLEEVECGO; Composto A16) ou um composto descrito na Publica- ção PCT nº WO1999/003854 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito. Em uma modalidade, o indutor de apoptose e/ou um inibidor de angiogênese é mesilato de Imatinibe (Composto A16) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO1999/003854.

[00630] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de JAK, 2-fluoro-N-metil-4-(7- (quinolin-6-ilmetila)imidazo[1,2-b][1,2,4]triazin-2-ila)Denzamida — (Com- posto A17), ou um sal diclorídrico do mesmo, ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/070514, para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o inibidor de JAK é 2-fluoro-N-metil-4-(7-(quinolin-6-ilmetila) imidazo[1,2-b][1,2 4]triazin-2-ila)benzamida (Composto A17) ou um sal diclorídrico do mesmo, ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/070514.

[00631] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de JAK, Fosfato de ruxolitinibe (também conhecido como JAKAFI; Composto A18) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/070514 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o inibidor de JAK é Fosfato de ruxolitinibe (Composto A18) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/070514.

[00632] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de desacetilase (DAC), Pano- binostate (Composto A19), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2014/072493 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o ini- bidor de DAC é Panobinostate (Composto A19) ou um composto des- crito na Publicação PCT nº WO 2014/072493.

[00633] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de um ou mais dentre citocro- mo P450 (por exemplo, 11B2), aldosterona ou angiogênese, Osilo- drostate (Composto A20), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO2007/024945 para tratar um distúrbio, por exemplo, um dis- túrbio descrito no presente documento.

[00634] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de IAP, (S)-N-((S)-1-ciclo-hexil- 2-((S)-2-(4-(4-fluorobenzoila)tiazol-2-ila)pirrolidin-1-ila)-2-0x0etila)-2- (metilamino)propanamida (Composto A21) ou um composto descrito no documento nº U.S. 8.552.003 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de IAP é (S)-N-((S)-1-ciclo-hexil-2-((S)-2-(4-(4-fluorobenzoila) tiazol-2-ila)pirrolidin-1-ila)-2-0x0etila)-2-(metilamino)propanamida (Composto A21) ou um composto descrito na Patente nº U.S.

8.552.003.

[00635] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor Suavizado (SMO), (R)-2-(5-(4- (6-benzil-4,5-dimetilpiridazin-3-ila)-2-metilpiperazin-1-ila)pirazin-2-ila) propan-2-ol (Composto A25), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/007120 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o ini- bidor SMO é (R)-2-(5-(4-(6-benzil-4,5-dimetilpiridazin-3-ila)-2-metilpipe- razin-1-ila)pirazin-2-ila)propan-2-0l (Composto A25) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/007120.

[00636] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de AIk, ceritinibe (também co- nhecido como ZYKADIA; Composto A23) para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento.

[00637] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de JAK e/ou CDKA4/6, 7-ciclo- pentil-N, N-dimetil-2-((5-(piperazin-1-ila)piridin-2-ila)amino)-7H-pirrolo [2,3-d]pirimidina-6-carboxamida (Composto A24), ou um composto descrito na Patente nº U.S. 8.415.355 ou Patente nº U.S. 8.685.980 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presen- te documento. Em uma modalidade, o inibidor de JAK e/ou de CDK4/6 é 7-ciclopentil-N N-dimetil-2-((5-(piperazin-1-ila)piridin-2-ila)amino)-7H- pirrolo[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida (Composto A24) ou um compos- to descrito na Patente nº U.S. 8.415.355 ou Patente nº U.S. 8.685.980.

[00638] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de receptor de prolactina (PRLR), uma molécula de anticorpo monoclonal humano (Composto A26), conforme descrito na Patente nº U.S. 7.867.493), para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento.

[00639] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de PIM Quinase, N-(4- ((1R,38,58)-3-amino-5-metilciclo-hexila)piridin-3-ila)-6-(2,6-difluorofeni- la)-5-fluoropicolinamida (Composto A27) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/026124 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o inibidor de PIM Quinase é N-(4-((1R,3S,58S)-3-amino-5- metilciclo-hexila)piridin-3-ila)-6-(2,6-difluorofenila)-S-fluoropicolinamida (Composto A27) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/026124.

[00640] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de sinalização de Wnt, 2-(2',3- dimetil-[2,4'-bipiridin]-5-ila)-N-(5-(pirazin-2-ila)piridin-2-ila)acetamida (Composto A28) ou um composto descrito na publicação PCT nº WO 2010/101849 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio des- crito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de sinali- zação de Wnt é 2-(2',3-dimetil-[2,4'-bipiridin]-5-ila)-N-(5-(pirazin-2-ila) piridin-2-ila)acetamida (Composto A28) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/101849. Em uma modalidade, o inibidor de sinalização de Wnt é 2-(2',3-dimetil-[2,4'-bipiridin]-5-ila)-N-(5-(pirazin -2-ila)piridin-2-ila)acetamida (Composto A28).

[00641] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de BRAF para tratar um distúr- bio, por exemplo, um distúrbio, conforme descrito no presente docu- mento, por exemplo, um câncer.

[00642] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de CDK4/6, 7-ciclopentil-N,N- dimetil-2-((5-((1R,6S)-9-metil-4-0x0-3,9-diazabiciclo[4.2.1]nonan-3-ila) piridin-2-ila)>amino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida (Com- posto A30), ou um composto descrito na publicação PCT nº WO 2011/ 101409 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de CDK4/6 é 7- ciclopentil-N,N-dimetil-2-((5-((1R,6S)-9-metil-4-0x0-3,9-diazabiciclo [4.2.1]nonan-3-ila)piridin-2-ila)amino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-6-car- boxamida (Composto A30) ou um composto descrito na publicação PCT nº WO 2011/101409.

[00643] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de HER3, Composto A31, ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2012/022814, para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente do- cumento. Em uma modalidade, o inibidor de HER3 é o Composto A31 ou um composto descrito na Publicação PCT WO 2012/022814.

[00644] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação um inibidor de FGFR2 e/ou FGFR4, Composto

A32, ou um composto descrito em uma publicação PCT nº WO 2014/160160 (por exemplo, um fármaco de molécula de anticorpo con- jugado contra um FGFR2 e/ou FGFRA, por exemplo, mAb 12425), pa- ra tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o composto A32 é um conju- gado de fármaco e molécula de anticorpo contra um FGFR2 e/ou FGFRA, por exemplo, mAb 12425.

[00645] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de M-CSF, Composto A33, ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2004/045532 (por exemplo, uma molécula de anticorpo ou fragmento Fab contra M- CSF), para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento.

[00646] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de MEK para tratar um distúr- bio, por exemplo, um câncer, conforme descrito no presente documen- to.

[00647] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de um ou mais dentre c-KIT, liberação de histamina, FIt3 (por exemplo, FLK2/STK1) ou PKC, Mi- dostaurina (Composto A35) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2003/037347 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o ini- bidor é Midostaurina (Composto A35) ou o composto descrito na Pu-

blicação PCT nº WO 2003/037347.

[00648] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de um ou mais dentre VEGFR- 2, PDGFRbeta, KIT ou Raf quinase C, 1-metil-5-((2-(5-(trifluorometila)- 1H-imidazol-2-ila)piridin-4-ila)óxi)-N-(4-(trifluorometila)fenila)-1H- benzo[d]imidazol-2-amina (Composto A37) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/030377 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o inibidor de um ou mais dentre VEGFR-2, PDGFRbeta, KIT ou Raf quinase C é 1-metil-5-((2-(5-(trifluorometila)-1H-imidazo|-2- ila)piridin-4-ila)óxi)-N-(4-(trifluorometila)fenila)-1 H-benzo[d]imidazo|-2- amina (Composto A37) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2007/030377.

[00649] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um agonista de somatostatina e/ou libera- ção de hormônio de crescimento inibidor, diaspartato de Pasireotídeo (também conhecido como SIGNIFOR; Composto A38) ou um compos- to descrito na Publicação PCT nº WO2002/010192 ou Patente nº U.S.

7.473.761 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o agonista de somatos- tatina e/ou o inibidor de liberação de hormônio de crescimento é dias- partato de Pasireotídeo (Composto A38) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO2002/010192 ou Patente nº U.S. 7.473.761.

[00650] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um modulador de transdução de sinal e/ou inibidor de angiogênese, por exemplo, para tratar um distúrbio tal co- mo um câncer, conforme descrito no presente documento.

[00651] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de EGFR, (R,E)-N-(7-cloro-1- (1-(4-(dimetilamino)but-2-enoila)azepan-3-ila)-1H-benzo[d]imidazo|-2- ila)-2-metilisonicotinamida (Composto A40) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2013/184757 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o inibidor de EGFR é (R,E)-N-(7-cloro-1-(1-(4-(dimetilamino) but-2-enoila)azepan-3-ila)-1H-benzo[d]imidazol|-2-ila)-2-metilisonico- tinamida (Composto A40) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2013/184757. Em uma modalidade, uma molécula de anti- corpo de ENTPD?2 anti-humano é usada em combinação com (R,E)-N- (7-cloro-1-(1-(4-(dimetilamino)but-2-enoila)azepan-3-ila)-1H-benzo[d] imidazol-2-ila)-2-metilisonicotinamida (Composto A40), ou um compos- to descrito na Publicação PCT nº WO 2013/184757, para tratar um dis- túrbio como um câncer, por exemplo, um tumor sólido.

[00652] Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR, (R,E)-N-(7- cloro-1-(1-(4-(dimetilamino)but-2-enoila)azepan-3-ila)-1H-benzo[d]imi- dazol-2-ila)-2-methilisonicotinamida (Composto A40), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2013/184757, é administrado em combinação com um inibidor de ENTPD?2 (por exemplo, uma molécula de anticorpo de ENTPD?2 anti-humano) para tratar um câncer.

[00653] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de ALK, Nº-(2-isopropoxi-5-

metil-4-(1-metilpiperidin-4-ila)fenila)-Nº-(2-(isopropilsulfonila)fenila)-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidina-4,6-diamina (Composto A42) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2008/073687 para tratar um distúr- bio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de ALK é Nº-(2-isopropoxi-5-metil-4-(1- metilpiperidin-4-ila)fenila)-Nº-(2-(isopropilsulfonila)fenila)-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidina-4,6-diamina (Composto A42) ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2008/073687.

[00654] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de IGF-1R, 3-(4-(4-((5-cloro-4- ((5-metil-1H-pirazol-3-ila)amino)pirimidina-2-ila)amino)-5-fluoro-2-me- tifenila)piperidin-1-ila)tietano 1,1-dióxido (Composto A43), 5-cloro-N?- (2-fluoro-5-metil-4-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-ila)piperidin-4-ila) fenila)- Nº-(5-metil-1H-pirazol-3-ila)pirimidina-2,4-diamina (Composto A44), ou B5-cloro-N2-(4-(1-etilpiperidin-4-ila)-2-fluoro-5-metilfenila)-Nº-(5-metil- 1H-pirazol-3-ila)pirimidina-2,4-diamina (Composto A45) ou um com- posto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/002655 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito. Em uma modalidade, o inibidor de IGF-1R é 1,1-dióxido de 3-(4-(4-((5-cloro-4-((5-metil-1H- pirazol-3-ila)>amino)pirimidina-2-ila)amino)-5-fluoro-2-metilfenila) piperi- din-1-ila)tietano (Composto A43), 5-cloro-Nº-(2-fluoro-5-metil-4-(1- (tetra-hidro-2H-piran-4-ila)piperidin-4-ila)fenila)-Nº-(5-metil-1H-pirazol- 3-ila)pirimidina-2,4-diamina (Composto A44), 5-cloro-N2-(4-(1-etilpipe- ridin-4-ila)-2-fluoro-5-metilfenila)-Nº-(5-metil-1H-pirazol-3-ila)pirimidina- 2,4-diamina (Composto A45), ou um composto descrito na Publicação PCT nº WO 2010/002655.

[00655] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de P-glicoproteína 1, Valspo- dar (também conhecido como AMDRAY; Composto A46) ou um com- posto descrito no documento nº EP 296122 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de P-glicoproteína 1 é Valspodar (Composto A46) ou um composto descrito no documento nº EP 296122.

[00656] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um ou mais dentre um inibidor de VEGFR, succinato de Vatalanibe (Composto A47) ou um composto descrito no documento nº EP 296122 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o ini- bidor de VEGFR é succinato de Vatalanibe (Composto A47) ou um composto descrito no documento nº EP 296122.

[00657] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de IDH ou um composto des- crito no documento nº WOZ2014/141104 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o inibidor de IDH é um composto descrito na Publicação PCT nº WO2014/141104.

[00658] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usa- da em combinação com um inibidor de BCL-ABL ou um composto des- crito nas Publicações de PCT nºs WO2013/171639, WO2013/171640, WO?2013/171641 ou WOZ2013/171642 para tratar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma mo- dalidade, o inibidor de BCL-ABL é um composto descrito nas Publica- ções PCT nºs WO2013/171639, WO2013/171640, WO2013/171641 ou WO?2013/171642.

[00659] Em outra modalidade, a combinação, por exemplo, uma combinação que compreende uma molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano, conforme descrito no presente documento, inclui ou é usada em combinação com um inibidor de c-RAF ou um composto descrito na Publicação PCT nº. WO2014/151616 para tratar um distúr- bio, por exemplo, um distúrbio descrito no presente documento. Em uma modalidade, o inibidor de c-RAF é o Composto A50 ou um com- posto descrito na Publicação PCT nº WO2014/151616. Em algumas modalidades, o inibidor de c-RAF ou o Composto A50 é um composto de fórmula (|): 1 ta EE o nf À OO b. (1) c. ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que: d. Zé O, S, S(=O) ou SO;>; e. ZZéN,S ou CRº, em que Rº é H, halo, C14 alquila ou C1-1 haloalquila; f. R' é CN, halo, OH, C14 alcóxi ou C1.1 alquila, que é op- cionalmente substituída por um a três grupos selecionados dentre ha- lo, C1-4 alcóxi, CN e hidroxila; g. O anel B é selecionado dentre fenila, piridina, pirimidina, pirazina, piridazina, piridona, pirimidona, pirazinona, piridazinona e ti- azol, cada um dos quais é opcionalmente substituído por até dois gru- pos selecionados dentre halo, OH, CN, C1.« alquila, C2.4 alquenila, -O- (Cia alquila) NHa NH-(Cia alquila),) -N(Cis alquila)— -SO2R?,

NHSO2R?, NHC(O)R?, NHCO2R?, Ca-6 cicloalquila, heteroarila com 5 a 6 membros, -O-C3-6 cicloalquila, -O-(heteroarila com 5 a 6 membros), Ca-8 heterocicloalquila e -O-(heterocicloalquila com 4 a 8 membros), em que cada heterocicloalquila e heteroarila contém até três heteroá- tomos selecionados dentre N, O e S como membros de anel,

iem que cada C1.4 alquila, C2.4 alquenila, C3a.6 cicloalquila, heteroarila com 5 a 6 membros e heterocicloalquila com 4 a 8 mem- bros é, cada uma, opcionalmente substituída por até três grupos sele- cionados dentre oxo, hidroxila, halo, C1-1 alquila, C1-4 haloalquila, C14a alcóxi e -(CH2):-2Q, em que Q é OH, C1.4 alcóxi, -CN, NH, -NHRS3, - N(Rº)2, - SO2R3, NHSO2R?, NHC(O)OR? ou NHC(O)R?; cada R? e Rº é independentemente C1-1 alquila; e i.O anel B é opcionalmente fundido a um anel aromático ou não aromático com 5 a 6 membros contendo até dois heteroátomos selecionados dentre N, O e S, em que o anel com 5 a 6 membros pode ser substituído por halo, C1-1 alquila, C14 haloalquila ou C1-4 alcóxi, e se o anel fundido for não aromático, as opções de substituinte podem incluir adicionalmente oxo;

h. cada Y é independentemente selecionado dentre C1-a alquila, C14 alcóxi, CN, halo, oxo, -(CH2)JORº, -(CH2)p N(Rº)2, - (CH2)DNHC(O)Rº, -(CH2),NHCOO(C1+ alquila) e imidazo|,

i. ou dois Y grupos no anel A são opcionalmente tomados juntos para formar um anel fundido a ou que faz ponte com o anel A, em que o dito anel fundido ou de ponte opcionalmente contém um he- teroátomo selecionado dentre N, O e S como um membro de anel, e é opcionalmente substituído por até dois grupos selecionados dentre C1- 4 alquila, Cia alcóxi, CN, halo, oxo, -(CH2),ORº, -(CH2)p N(R)2, - (CH2),NHC(O)Rº e -(CH2),NHCOO(C1-4 alquila);

j. cada Rº é independentemente H ou C14 alquila;

k. cada p é independentemente O, 1 ou 2;

l. gé0, 1ou2; m. Z3, Zº e 7º são independentemente selecionados a par- tir de CH e N e opcionalmente NO; n. L é -C(=O)-NR+-[CY] ou -NR*-C(=O)-[CY], em que [CY] indica qual átomo de L é fixado a CY; e o. CY é um anel aromático selecionado dentre fenila, piri- dina, pirimidina, pirazina, piridazina, piridona, tiazol, isotiazol, oxazol, pirazol e isoxazol, em que o anel é opcionalmente fundido a um anel de tiofeno, imidazol, oxazolona ou pirrol; p. e CY é substituído por até dois grupos selecionados dentre halo, CN, R5, OR, SO2R5, -S(=NH)(=O)R5, OH, NH2, NHRº e - N(R$)2, i.em que cada Rº é independentemente C14 alquila, Ca al- quenila, C2.6 heterociclila, heteroarila com 5 membros contendo até três heteroátomos selecionados dentre N, O e S como membros de anel ou C3.38 cicloalquila e Rº é opcionalmente substituído por até qua- tro grupos selecionados dentre oxo, halo, CN, Rô, OH, OR$, SO2R$, NH2, NHRS, N(R6)a, NHSO2Rº, NHCOORS, NHC(=O)R6, -CH2OR”, - CH2N(R”)2, em que cada q. Rô é independentemente C1.1 alquila, e cada R' é inde- pendentemente H ou C14 alquila; r. edois R$, Rº, Rº ou R' no mesmo átomo de nitrogênio podem ser tomados juntos para formar um anel heterocíclico com 5 a 6 membros opcionalmente contendo um N, O ou S adicional como um membro de anel e opcionalmente substituído por até dois grupos sele- cionados a partir de C1-1 alquila, oxo, halo, OH, e C1-4 alcóxi.

Terapias Celulares Exemplificativas

[00660] As moléculas de anticorpo de ENTPD2 anti-humano tam- bém podem ser combinadas com uma terapia celular, por exemplo, uma terapia de receptor de antígeno quimérico (CAR), uma terapia de célula T, uma terapia de célula exterminadora natural (NK) ou uma te- rapia de célula dendrítica. Combinações com terapias de CAR

[00661] As moléculas de anticorpo de ENTPD?2 anti-humano descri- tas no presente documento podem ser administradas em combinação com um segundo agente terapêutico, por exemplo, uma célula que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR). O CAR pode compreender i) um domínio extracelular de ligação de antígeno, ii) um domínio transmembranar e iii) um domínio de sinalização intracelular (que pode compreender um ou ambos dentre um domínio de sinaliza- ção primária e um domínio coestimulante). O CAR pode compreender, ainda, uma sequência líder e/ou uma sequência de dobradiça. Em modalidades específicas, o construto de CAR compreende um domínio de scFv, em que o scFv pode ser precedido por uma sequência líder opcional, e seguido por uma sequência de dobradiça opcional, uma região transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, em que os domínios são contíguos a e estão no mesmo quadro de leitura para formar uma única proteína de fusão.

[00662] Em algumas modalidades, a molécula de CAR compreende uma molécula de CAR de CD19 descrita no presente documento, por exemplo, uma molécula de CAR de CD19 descrita no documento nº U.S. 2015/0283178, por exemplo, CTLO19. Nas modalidades, o CAR de CD19 compreende um aminoácido, ou tem uma sequência de nu- cleotídeos mostrada no documento nº U.S. 2015/0283178, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade, ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de identi- dade de sequência com a mesma).

[00663] Em uma modalidade, a célula CAR T que se liga a CD19 tem a designação de USAN TISAGENLECLEUCEL-T. CTLO19 é pro-

duzida por uma modificação de gene de células T mediada por inser- ção estável por meio de transdução com um vetor lentiviral deficiente em replicação de auto-inativação (LV) que contém o transgene de CTLO19 sob o controle do promotor EF-1 alfa. CTLO19 pode ser uma mistura de células T positivas e negativas quanto ao transgene que são administradas ao indivíduo com base na percentagem de células T positivas quanto ao transgene.

[00664] Em uma modalidade, o CAR CD19 compreende uma se- quência de aminoácidos fornecida como SEQ ID NO: 12 na publicação PCT WO?2012/079000. Em uma modalidade, a sequência de aminoá- cidos é: MALPVTALLLPLALLLHAARPdiqmtattss|saslgdrvtiscrasqdiskyInwygqgk pdatvklliyhtsrlhsgvpsrfisgsgsgtdysltisnlegediatyfegaggntlpytfggatkleitagg gsggggsggggsevklgesgpglvapsgslisvtctvsgvslpdygvswirgpprkglewlgviw gsettyynsalksritiikinsksqvflkmnslgtddtaiyycakhyyyggsyamdywgggtsvtv sstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlye krgrkkllyifkgpfmrpvattgeedgescripeeeeggcelrvkfisrsadapaykgggnglyneln Igrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpgeglynelgkdkmaeayseigmkgerrrakghdg]l yaglstatkdtydalhmgalppr (SEQ ID NO: 312), ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma (por exemplo, uma sequência que tem pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma), com ou sem a sequência de peptídeos de sinalização indicada em letras maiúsculas.

[00665] Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos é: diqgmtattss|saslgdrvtiscrasqdiskyInwyggkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfísgsgsgt dysltisnlegediatyfcgggntlpytfgggtkleitagggsagagsagggsevkligesgpgalvap saslsvtctvsgvsl|pdygvswiragpprkglewlgviwgsettyynsalksritiilkdnsksqvflkm nslgtddtaiyycakhyyyggsyamdywgaqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacr paaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkgpfmrpvattaeedgese rípeeeeggcelrvkfsrsadapaykggqgnglynelnigrreeydvidkrrgrdpemggkprrkn pgeglynelgkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqgglstatkdtydalhmgalppr (SEQ ID NO: 313), ou uma sequência substancialmente homóloga à mesma (por exem- plo, uma sequência que tem pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma).

Domínio de ligação a antígeno de um receptor de antígeno quimé- rico (CAR)

[00666] O domínio de ligação a antígeno pode ser qualquer domínio que se liga ao antígeno incluindo, porém sem limitação, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado e um fragmento funcio- nal do mesmo, incluindo, porém sem limitação, um anticorpo de domí- nio único como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domí- nio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável (VHH) de nano- corpo derivado de camelídeo, e a um arcabouço alternativo conhecido na especialidade por funcionar como o domínio de ligação a antígeno, como um domínio de fibronectina recombinante, um receptor de célula T (TOR) ou um fragmento dos mesmos, por exemplo, TCR de cadeia única e similares. Em alguns casos, é benéfico que o domínio de liga- ção ao antígeno seja derivado da mesma espécie na qual o CAR será em última instância usado. Por exemplo, para uso em humanos, pode- rá ser benéfico que o domínio de ligação ao antígeno do CAR compre- enda resíduos humanos ou humanizados para o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[00667] Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antígeno do CAR é um fragmento de anticorpo de scFv que é humanizado em comparação com a sequência murina do scFv do qual é derivada.

[00668] Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antígeno se liga a um antígeno de tumor descrito no presente documento. Nas modalidades, o antígeno de tumor é escolhido dentre: CD19; CD123;

CD22; CD30; CD171; CS-1 (também denominado 1 de CD2, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 tipo lectina tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante de receptor de fator de crescimento epidér- mico Ill (EGFRvIII); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeco GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGIcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptor de TNF (BCMA); antíge- no de Tn ((Ag de Tn) ou (GalNAca-Ser/Thr)); antígeno de membrana específico da próstata (PSMA); receptor órfão tipo tirosina quinase de receptor 1 (ROR1); Tirosina Quinase Tipo Fms 3 (FLT3); glicoproteína associada a tumor 72 (TAG72); CD38; CD44v6; antígeno carcinoem- briônico (CEA); molécula de adesão de célula epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); subunidade de receptor de Interleucina-13 alfa- 2 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; receptor 11 de interleucina alfa (IL-11Ra); antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA); Serina de Protease 21 (Testisina ou PRSS21); receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2); antígeno de Lewis(Y) ; CD24; recep- tor de fator de crescimento derivado de plaqueta beta (PDGFR-beta); antígeno embriônico específico de estágio-4 (SSEA-4); CD20; receptor de Folato alfa; tirosina-quinase de proteína de receptor ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1, associada à superfície celular (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína de ativa- ção de fibroblasto alfa (FAP); receptor de fator de crescimento tipo in- sulina 1 (receptor de IGF-I), anidrase carbônica IX (CAIX); Proteassomo (Prossomo, Macropaina) subunidade, Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteí- na 100 (gp100); proteína de fusão oncogene que consiste em região de grupamento de ponto de ruptura (BCR) e homólogo de oncogene viral de leucemia murina de Abelson1 (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo-A 2 (EphA2); Fucosil GM1; molécula de adesão de sialil Le-

wis (sLe); gangliosídeco GM3 (aNeu5Ac(2-3) bDGalp(1-4)bDGIcp(1- 1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o-acetil-GD2 gangliosídeo (OA- cGD2); receptor de Folato beta; marcador endotelial de tumor 1 (TEM1/CD248); marcador endotelial de tumor 7-relacionado (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tiroide (TSHR); membro D, grupo 5, classe C de receptor acoplado à proteína G (GPRC5D); quadro de leitura cromossomo X aberto 61 (CXORF61); CDS97; CD179a; quinase de linfoma anaplástica (ALK); ácido polissiáli- co; específico de placenta 1 (PLAC1); porção de hexassacarídeo de globoH glicoceramida (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR-1); uroplacina 2 (UPK2); receptor celular do vírus da Hepatite A 1 (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); receptor acoplado à proteína G 20 (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, locus K 9 (LY6K); receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de Quadro de Leitura Alternada Gama de TCR (TARP); proteína de tumor de Wilms (WT1); antígeno de Câncer/ testí- culo 1 (NY-ESO-1); antígeno de Câncer/testículo 2 (LAGE-1a); antíge- no associado à Melanoma 1 (MAGE-A1); gene variante de transloca- ção de ETS 6, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína de espermatozoide 17 (SPA17); Família de Antígeno X, Membro 1A (XAGE1); receptor de superfície celular de ligação de angiopoietina 2 (Tie 2); antígeno de câncer de testículo de melanoma-1 (MAD-CT-1); antígeno de câncer de testículo de melanoma -2 (MAD-CT-2); antíge- no relacionado a Fos 1; proteína de tumor p53 (p53); p53 mutante; prosteína; sobrevivência; telomerase; antígeno de tumor de carcinoma de próstata-1 (PCTA-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhe- cido por células T 1 (MelanA ou MART1); sarcoma de rato (Ras) mutan- te; transcriptase reversa da Telomerase humana (hTERT); pontos de rup- tura de translocação de sarcoma; inibidor de melanoma de apoptose

(ML-IAP); ERG (protease transmembranar, serina 2 (TMPRSS2) gene de fusão de ETS); N-Acetil glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa emparelhada Pax-3 (PAX3); receptor de androgênio; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma oncogênio viral de mieloci- tomatose v-myc aviana (MYCN); Membro C de Família Homóloga de Ras (RhoC); proteína relacionada à tirosinase 2 (TRP-2); Citocoromo P450 1B1 (CYP1B1); Fator de Ligação de CCCTC tipo (Proteína de Dedo de Zinco) (BORIS ou Irmão do Regulador de Sítios Impressos), Antígeno de Carcinoma de Célula Escamosa Reconhecido por células T 3 (SART3); proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína de ligação de proacrosina sp32 (OY-TES1); proteína tirosina quinase específica de linfócito (LCK); proteína de âncora de quinase A 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, ponto de ruptura de X 2 (SSX2); Receptor para Advanced Glycation Endproducts (RAGE-1); ubíquo renal 1 (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaina; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; receptor tipo imunoglobulina associada a leu- cócito 1 (LAIR1); fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); membro da subfamília de receptor tipo imunoglobulina de leucócito A 2 (LILRA2); membro de família tipo molécula CD300 f (CD300LF); mem- bro da família de domínio de lectina tipo C 12 A (CLEC12A); antígeno de célula estromal da medula óssea 2 (BST2); tipo receptor de hormô- nio tipo mucina contendo módulo de EGF 2 (EMR2); antígeno de linfó- cito 75 (LY75); Glipican-3 (GPC3); tipo receptor de Fc 5 (FCRL5); e polipeptídeo tipo lambda de imunoglobulina 1 (IGLL1).

[00669] Em uma modalidade, a molécula de CAR compreende uma molécula de CAR de BCMA, por exemplo, um CAR de BCMA descrito no documento nº U.S. 2016/0046724 ou WO 2016/014565, incorpora- do ao presente documento a título de referência. Nas modalidades, o

CAR de BCMA compreende um aminoácido, ou tem uma sequência de nucleotídeos de uma molécula de CAR, ou um domínio de ligação a antígeno de acordo com o documento nº U.S. 2016/0046724, ou Tabe- la 1 ou 16, SEQ ID NO: 271 ou SEQ ID NO: 273 do documento nº WO 2016/014565, incorporado ao presente documento a título de referên- cia, ou uma sequência substancialmente idêntica a qualquer uma das sequências supracitadas (por exemplo, que tem pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de CAR de BCMA supracitadas). As sequências de aminoá- cidos e nucleotídeos que codificam as moléculas de CAR de BCMA e domínios de ligação a antígeno (por exemplo, incluindo uma, duas, três CDRs de VH; e uma, duas, três CDRs de VL de acordo com Kabat ou Chothia), são especificadas no documento nº WO 2016/014565.

Domínio transmembranar de um receptor de antígeno quimérico (CAR)

[00670] Em relação ao domínio transmembrana, em várias modali- dades, um CAR pode ser concebido para compreender um domínio transmembrana que está ligado ao domínio extracelular do CAR.

[00671] O domínio transmembranar pode ser derivado de uma fonte natural ou de uma recombinante. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada a membrana ou trans- membrana. Em um aspecto, o domínio transmembranar pode de sina- lizar o domínio (os domínios) sempre que o CAR se tenha ligado a um alvo. Um domínio transmembranar pode incluir pelo menos a região (ou regiões) transmembranar, por exemplo, da cadeia alfa, beta ou ze- ta do receptor de célula T, CD28, CD27, CD3 épsilon, CD45, CDA, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CDB86, CD134, CD137, CD154. Em algumas modalidades, um domínio transmembranar pode incluir pelo menos a região (ou regiões) trans- membranar, por exemplo, de KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR,

HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R-a, ITGA1, VLA1I, CD49a, ITGAA, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMFA4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMFB8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, ou NKG2C.

[00672] Em alguns casos, o domínio transmembrana pode ser liga- do à região extracelular do CAR, por exemplo, o domínio de ligação a antígenos do CAR, via uma região de dobradiça, por exemplo, uma região de dobradiça de uma proteína humana. Por exemplo, em uma modalidade, a dobradiça pode ser uma dobradiça de Ig (imunoglobuli- na) humana (por exemplo, uma dobradiça de IgG4, uma dobradiça de Ig9D), um ligante de GS (por exemplo, um ligante de GS descrito no presente documento), uma dobradiça de KIR2DS2 ou uma dobradiça de CD8a. Domínio de sinalização intracelular de um receptor de antígeno quimé- rico (CAR)

[00673] O domínio ou região citoplásmica do CAR incluem um do- mínio de sinalização intracelular. Um domínio de sinalização intracelu- lar é, de modo geral, responsável pela ativação de pelo menos uma das funções efetoras normais da célula imune em que o CAR foi intro- duzido.

[00674] Os exemplos de domínios de sinalização intracelulares para uso no CAR incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de cé- lulas T (TOR) e correceptores que atuam em conjunto para iniciar a transdução do sinal após engate do receptor de antígeno, bem como qualquer derivado ou variante dessas sequências e qualquer sequên-

cia recombinante que tenha a mesma capacidade funcional.

[00675] Um domínio de sinalização primário regula a ativação pri- mária do complexo de TCR de um modo estimulador ou de um modo inibidor. Domínios de sinalização intracelulares primários que atuam de um modo estimulador podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação baseados em tirosina do imu- norreceptor ou ITAMs.

[00676] Os exemplos de ITAM contendo domínios de sinalização intracelulares primários incluem aqueles de CD3 zeta, FcR gama co- mum (FCER1G), Fc gama Rlla, FcR beta (Fc épsilon R1b), CD3 ga- ma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 e DAP12. Em uma modalidade, um CAR compreende um domínio de sinalização in- tracelular, por exemplo, um domínio de sinalização primário de CD3 zeta.

[00677] O domínio de sinalização intracelular do CAR pode com- preender o domínio de sinalização de CD3-zeta por si só ou pode ser combinado com qualquer outro domínio (ou domínios) de sinalização intracelular desejado útil no contexto de um CAR da invenção. Por exemplo, o domínio de sinalização intracelular do CAR pode compre- ender uma porção de cadeia CD3 zeta e um domínio de sinalização coestimulador. O domínio de sinalização coestimulador se refere a uma porção do CAR que compreende o domínio intracelular de uma molécula coestimuladora. A molécula coestimuladora é uma molécula da superfície celular que não um receptor de antígenos ou seus ligan- tes que é necessária para uma resposta eficiente de linfócitos a um antígeno. Os exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno associado à fun- ção de linfócitos-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e um ligante que se liga a CD83 e similares. Por exemplo, foi demonstrado que coestimulação com CD27 intensifica a expansão, função efetora e sobrevivência de células CART humanas in vitro e aumenta persistên- cia e atividade antitumoral de células T humanas in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):6896 a 706). Outros exemplos de tais moléculas coestimuladoras incluem CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CDôalfa, CD8beta, IL2R beta, IL2PR gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGAA, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGAA, IA4, CD49D, ITGA6, VLA- 6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11(Tactile), NKG2D, CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, e CD19a. Ativação e Expansão de Células Efetoras Imunes (por exemplo, Célu- las T)

[00678] As células efetoras imunes como células T podem ser ati- vadas e expandidas geralmente com o uso de métodos conforme des- crito, por exemplo, nas Patentes nº U.S. 6.352.694; 6.534.055;

6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575;

7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874;

6.797.514; 6.867.041; e Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2006/0121005, incorporados ao presente documento a título de refe- rência.

[00679] “Exemplos de células efetoras imunes incluem células T, por exemplo, células T alfa/beta e células T gama/delta, células B, células exterminadoras naturais (NK), células T exterminadoras naturais (NK- T), mastócitos e fagócitos derivados de mieloide.

[00680] Os métodos para produzir células que expressam CAR são descritos, por exemplo, no documento º U.S. 2016/0185861, incorpo- rado ao presente documento a título de referência. Vacinas contra Câncer Exemplificativas

[00681] As moléculas de anticorpo de ENTPD?2 anti-humano podem ser combinadas com um agente imunogênico, como células cancero- sas, antígenos de tumor purificados (incluindo proteínas recombinan- tes, peptídeos e moléculas de carboidrato), células e células transfec- tadas com genes que codificam citocinas imunoestimulantes (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4.919 a 4.928). Os exemplos não limitantes de vacinas contra tumor que podem ser usadas incluem peptídeos de an- tígenos de melanoma, como peptídeos de gp100, antígenos de MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase, células de tumor transfectadas para ex- pressar a citocina GM-CSF, vacinas à base de DNA, vacinas à base de RNA e vacinas à base de transdução viral. A vacina contra câncer pode ser profilática ou terapêutica.

[00682] O bloqueio de ENTPD2 pode ser usado em conjunto com uma coleção de proteínas recombinantes e/ou peptídeos expressados em um tumor a fim de gerar uma resposta imune a essas proteínas.

[00683] Outras vacinas de tumor podem incluir as proteínas de ví- rus implicados em cânceres humanos como Vírus do Papiloma Huma- no (HPV), Vírus da Hepatite (HBV e HCV), Vírus de Sarcoma de Her- pes de Kaposi (KHSV) e vírus de Epstein-Barr (EBV). Outra forma de antígeno específico de tumor que pode ser usada em conjunto com o bloqueio de ENTPD?2 são as proteínas de choque térmico purificadas (HSP) isoladas do próprio tecido de tumor. Essas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células de tumor e essas HSPs são altamente eficazes na entrega a células apresentadoras de antígeno para produzir imunidade contra tumor (Suot, R & Srivastava, P (1995) Science 269:1.585 a 1.588; Tamura, Y. et al. (1997) Science

278:117 a 120).

[00684] As células dendríticas (DC) são células apresentadoras de antígeno potentes que podem ser usadas para iniciar respostas espe- cíficas para antígeno. As DCs podem ser produzidas ex vivo e carre- gadas com vários antígenos de proteína e peptídeo, assim como extra- tos de célula de tumor (Nestle, F. et al. (1998) Nature Medicine 4: 328- 332). As DCs também podem ser transduzidas por meios genéticos para expressar esses antígenos de tumor também. As DCs também foram fundidas diretamente às células de tumor para os propósitos de imunização (Kugler, A. et al. (2000) Nature Medicine 6:332 a 336). Como um método de vacinação, a imunização de DC pode ser efeti- vamente combinada com o bloqueio de CD73 para ativar respostas antitumorais mais potentes. Vírus Oncolíticos Exemplificativos

[00685] As moléculas de anticorpo de ENTPD?2 anti-humano podem ser administradas em combinação com o vírus oncolítico. Em modali- dades, vírus oncolíticos são capazes de se replicar seletivamente em, e despoletar a morte de, ou retardar o crescimento de, uma célula cancerígena. Em alguns casos, os vírus oncolíticos não têm qualquer efeito ou têm um efeito mínimo sobre células cancerígenas. Em algu- mas modalidades, a combinação é usada para tratar um câncer, por exemplo, um câncer descrito no presente documento. Um vírus oncolí- tico inclui, sem limitação, um adenovírus oncolítico, Vírus Herpes Sim- plex oncolíticos, retrovírus oncolítico, parvovírus oncolítico, vírus vac- cinia oncolítico, vírus de Sindbis oncolítico, vírus influenza oncolítico ou vírus de RNA oncolítico (por exemplo, reovírus oncolítico, Vírus da Doença de Newcastle oncolítico (NDV), Vírus de sarampo oncolítico ou Vírus de somatite vesicular oncolítico (VSV)).

[00686] Vírus oncolíticos exemplificativos incluem, mas não se limi- tam aos seguintes:

Adenovírus Oncolítico do Grupo B (ColoAd1) (PsiOxus The- rapeutics Ltd.) (consultar, por exemplo, o Identificador de Teste Clíni- co: NOT02053220);

ONCOS-102 (anteriormente chamado de CGTG-102), que é um adenovírus que compreende fator estimulante de colônia de gra- nulócitos e macrófagos (GM-CSF) (Oncos Therapeutics) (consultar, por exemplo, o Identificador de Teste Clínico: NCETO1598129);

VCN-01, que é um adenovírus oncolítico humano geneti- camente modificado codificando hialuronidase PH20 humana (VCN Biosciences, S.L.) (consultar, por exemplo, os Identificadores de Teste Clínico: NCTO2045602 e NCT02045589);

O Adenovírus Condicionalmente Replicativo ICOVIR-5, que é um vírus derivado do sorotipo de adenovírus humano tipo selvagem (Had5) que foi modificado para se replicar seletivamente em células cancerosas com uma trajetória desregulada de retinoblastoma/E2F (Institut Català d'Oncologia) (consultar, por exemplo, o Identificador de Teste Clínico: NCTO01864759);

Celyvir, que compreende células-tronco mesenquimais au- tólogas derivadas da medula óssea (MSCs) infectadas com ICOVIRS5, um adenovírus oncolítico (Hospital Infantil Universitario Niho Jesús, Madrid, Espanha/ Ramon Alemany) (consultar, por exemplo, o Identifi- cador de Teste Clínico: NCTO1844661);

CG0070, que é um adenovírus de sorotipo oncolítico de re- plicação condicional 5 (Ad5) em que o promotor de E2F-1 humano aciona a expressão dos genes virais de Ela essenciais, restringindo, assim, a replicação viral e a citotoxicidade às células de tumor defeitu- osas de trajetória de Rb (Cold Genesys, Inc.) (consultar, por exemplo, o Identificador de Teste Clínico: NCTO2143804); ou

DNX-2401 (anteriormente denominado Delta-24-RGD), que é um adenovírus que foi geneticamente modificado para se replicar seletivamente em células deficientes de trajetória de retinoblastoma (Rb) e para infectar as células que expressam certas integrinas de |i- gação de RGD de modo mais eficaz (Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/ DNAtrix, Inc.) (consultar, por exemplo, o Iden- tificador de Teste Clínico: NCTO1956734).

[00687] Em algumas modalidades, um vírus oncolítico descrito no presente documento é administrado por injeção, por exemplo, injeção subcutânea, intra-arterial, intravenosa, intramuscular, intratecal ou in- traperitoneal. Em modalidades, um vírus oncolítico aqui descrito é ad- ministrado por via intratumoral, transdérmica, transmucosa, oral, intra- nasal ou pulmonar. Terapias de Câncer Exemplificativas Adicionais

[00688] As combinações exemplificativas de moléculas de anticorpo de ENTPD?2 anti-humano (sozinhas ou em combinação com outros agentes estimulantes) e padrão de cuidado para câncer, incluem pelo menos o seguinte. Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de ENTPD?2 anti-humano, por exemplo, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano descrita no presente documento, é usada em com- binação com um agente padrão de cuidado de câncer quimioterápico, incluindo, mas sem limitações, anastrozol (Arimidexº), bicalutamida (Casodexº), sulfato de bleomicina (Blenoxaneº), bussulfano (Myle- ranº), injeção de bussulfano (Busulfexº), capecitabina (Xelodaº), N4- pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, —carboplatina (Paraplatinº), carmustina (BICNUº), clorambucila (Leukeranº), cisplatina (Platinolº), cladribina (Leustatinº), ciclofosfamida (Cytoxanº ou Neosarº), citarabi- na, citosina arabinosídeo (Cytosar-Uº), injeção de lipossomo de citara- bina (DepoCytº), dacarbazina (DTIC-Domeº), dactinomicina (Actinomi- cina D, Cosmegan), cloridrato de daunorrubicina (Cerubidineº), injeção de lipossomo de citrato de daunorrubicina (DaunoXomeº), dexameta- sona, docetaxel (Taxotereº), cloridrato de doxorrubicina (Adriamicina?,

Rubexº), etoposídeo (Vepesidº), fosfato de fludarabina (Fludaraº), 5- fluorouracila (Adrucilº, Efudexº), flutamida (Eulexinº), tezacitibina, Germrcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiureia (Hydreaº), Idarrubici- na (Idamicinaº), ifosfamida (IFEXº), irinotecana (Camptosarº), L- asparaginase (ELSPARº), cálcio de leucovorina, melfalano (Alkeranº), 6-mercaptopurina (Purinetolº), metotrexato (Folexº), mitoxantrona (Novantroneº), milotarg, paclitaxel (Taxolº), fênix (Ítrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosano 20 com implante de carmustina (Gliadelº), citrato de tamoxifeno (Nolvadexº), teniposídeo (Vumonº), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazoneº), cloridrato de topotecano para injeção (Hycamptinº), vinblastina (Velbanº), vincristina (Oncovinº), vinorelbina (Navelbineº), Ibrutinibe, idelalisibe e vedotinade brentuximabe.

[00689] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano, por exemplo, a molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano descrita no presente documento, é usada em combinação com um agente alquilante, incluindo, porém sem limitação, mostardas de nitrogênio, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquila, nitrosou- reias e triazenos): mostarda de uracila (Aminouracil MustardO, Chlore- thaminacilO, DemethyldopanO, DesmethyldopanO, HaemanthamineO, NordopanO, Uracil nitrogen mustardO, Uracillosta, UracilmostazaO, UramustinO, UramustineG), clormetina (MustargenO), ciclofosfamida (CytoxanO, NeosarO, ClafenO, EndoxanO, ProcytoxO&, RevimmuneT”), ifosfamida (MitoxanaO), melfalano (AlkeranO), Clorambucila (Leuke- ranO), pipobromano (AmedelO, VercyteO), trietilenomelamina (HemelO, HexalenO, HexastatO), trietilenotiofosforamina, Temozolomida (Temo- dar8), tiotepa (Thioplex&), bussulfano (BusilvexO, MyleranO), carmusti- na (BICNUG), lomustina (CeeNUGO), estreptozocina (ZanosarO) e Da- carbazina (DTIC-DomeGO). Os agentes alquilantes exemplificativos adi- cionais incluem, sem limitação, Oxaliplatina (Eloxatin&); Temozolomida (TemodarO e TemodalO); Dactinomicina (também conhecida como ac-

tinomicina-D, CosmegenO); Melfalano (também conhecido como L- PAM, L-sarcolisina, e mostarda de fenilalanina, AlkeranO); Altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), HexalenO); Car- mustina (BICNUG); Bendamustina (Treanda&G); Busulfano (BusulfexO e MyleranO); Carboplatina (Paraplatin&O); Lomustina (também conhecida como CCNU, CeeNUG); Cisplatina (também conhecida como CDDP, Platinol& e Platinol&-AQ); Clorambucila (LeukeranG); Ciclofosfamida (CytoxanO e NeosarO); Dacarbazina (também conhecida como DTIC, DIC e imidazol carboxamida, DTIC-DomeG); Altretamina (também co- nhecida como hexametilmelamina (HMM), HexalenO); Ifosfamida (Ifex&); Prednumustina; Procarbazina (Matulane&); Mecloretamina (também conhecida como mostarda de nitrogênio, mustina e cloridrato de meclioroetamina, MustargenO); Estreptozocina (ZanosarO); Tiotepa (também conhecida como tiofosfoamida, TESPA e TSPA, ThioplexO); Ciclofosfamida (EndoxanO, CytoxanO, NeosarO, ProcytoxO, Revimmu- neO); e HCl de Bendamustina (TreandaO).

[00690] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano, por exemplo, a molécula de anticorpo de ENTPD2 anti-humano descrita no presente documento, é usada em combinação com antraciclinas, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, doxoru- bicina (Adriamycin& e RubexO); bleomicina (lenoxaneO); daunorubicina (cloridrato de dauorubicina, daunomycina e cloridrato de rubidomicina, Cerubidine&); daunorubicina lipossomal (lipossoma de citrato de dauno- rubicina, DaunoXome6); mitoxantrona (DHAD, NovantroneO6); epirubicina (EllenceTY); idarubicina (IdamycinO, Idamycin PFSO); mitomicina C (Mu- tamycinO); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; edesacetilravi- domicina. Os alcaloides de vinca exemplificativos que podem ser usa- dos em combinação com as moléculas de anticorpo de ENTPD?2 anti- humano, incluem, mas sem limitações, tartrato de vinorrelbina (Navel- bineG), Vincristina (OncovinO) e Vindesina (EldisineO)); vinblastina

(também conhecida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina e VLB, Alkaban-AQQO e VelbanO); e vinorrelbina (NavelbineO).

[00691] Os inibidores de proteossomo exemplificativos que podem ser usados em combinação com o anticorpo de ENTPD?2 anti-humano conforme descrito no presente documento incluem, porém sem limita- ção, bortezomibe (Velcade&); carfilzomibe (PX-171-007, (S)-4-Metil-N- ((S)-1-(((S)-4-metil-1-((R)-2-metiloxiran-2-ila)-1-o0xopentan-2-ila)amino)- 1-0x0-3-fenilpropan-2-ila)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4- fenilbutanamido)-pentanamida); marizomibe (NPI-0052); citrato de ixa- zomibe (MLN-9708); delanzomibe (CEP-18770); e O-Metil-N-[(2-metil- B5-tiazolila)carbonil]-L-seril-O-metil-N-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2- o0x0-1-(fenilmetila)etil]-L-serinamida (ONX-0912).

[00692] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano é administrada em combinação com radioterapia. À radioterapia pode ser administrada através de um dentre vários méto- dos, ou uma combinação de métodos, incluindo, sem limitação, terapia de feixe externo, radioterapia interna, radiação por implante, radioci- rurgia estereotática, radioterapia sistêmica, radioterapia e braquitera- pia intersticial permanente ou temporária. O termo "braquiterapia" se refere à radioterapia entregue por um material radioativo confinado es- pacialmente inserido no corpo em um tumor ou próximo ao mesmo ou outro sítio de doença proliferativa de tecido. O termo se destina, sem limitação, a incluir exposição a isótopos radioativos (por exemplo, At- 211, 1-131, 1-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32 e isó- topos radioativos de Lu). As fontes de radiação adequadas para uso como um condicionador de célula da presente invenção incluem tanto sólidos quanto líquidos. A título de exemplo não limitante, a fonte de radiação pode ser um radionuclídeo, como 1-125, 1-131, Yb-169, 11--192 como uma fonte sólida, 1-125 como uma fonte sólida ou outros radio- nuclídeos que emitem fótons, partículas beta, radiação gama ou outros raios terapêuticos. O material radioativo também pode ser um fluido produzido a partir de qualquer solução de radionuclídeo (ou radionu- clídeos), por exemplo, uma solução de |1-125 ou 1-131, ou um fluido ra- dioativo pode ser produzido com o uso de uma pasta fluida de um flui- do adequado contendo partículas pequenas de radionuclídeos sólidos, como Au-198, Y-90.

[00693] O bloqueio de ENTPD2 também pode ser efetivamente combinado com regimes quimioterápicos. Nesses casos, pode ser possível reduzir a dose de reagente quimioterápico administrado.

[00694] Os agentes citotóxicos exemplificativos que podem ser ad- ministrados em combinação com uma molécula de anticorpo de EN- TPD?2 anti-humano incluem agentes antimicrotúbulo, inibidores de to- poisomerase, antimetabólitos, inibidores mitóticos, agentes alquilantes, antraciclinas, alcaloides de vinca, agentes intercalantes, agentes com capacidade de interferir em uma trajetória de transdução de sinal, agentes que promovem apoptose, inibidores de proteossomo e radia- ção (por exemplo, irradiação local ou de corpo inteiro). Preparação de Amostras

[00695] As amostras usadas nos métodos descritos no presente documento podem ser obtidas de um indivíduo com o uso de qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por biopsia ou cirurgia. A amostra pode ser instantaneamente congelada e armaze- nada a -80 “C para uso posterior. A amostra também pode ser fixada com um agente fixador, tal como formaldeído, paraformaldeído ou áci- do acético/etanol. RNA ou proteína pode ser extraído de uma amostra fresca, congelada ou fixada para análise. Composições Farmacêuticas, Dosagem e Métodos de Adminis- tração

[00696] São também fornecidas no presente documento composi- ções, por exemplo, composição farmacêuticas, para uso no tratamento de uma doença associada a ENTPD2, por exemplo, um câncer, con- forme descrito no presente documento. Tais composições incluem um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno descritos no presente documento, ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, ou vetores que compreendem um ácido nucleico que codifica tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno. Tais composições também podem incluir outro agente, por exemplo, um padrão de cuidado de saúde atual para uma doença a ser tratada.

[00697] As composições farmacêuticas incluem tipicamente um car- reador farmaceuticamente aceitável. Conforme usado no presente do- cumento, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui solu- ção salina, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes an- tibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e similares, compatíveis com administração farmacêutica. As composições farmacêuticas são tipicamente formuladas para serem compatíveis com a sua via de administração destinada. Os exemplos de vias de administração incluem administração parenteral (por exem- plo, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal), intracraniana, intratecal ou intranasal (por exemplo, inalação), intradérmica, subcutânea ou in- tratumoral.

[00698] O sintagma "farmaceuticamente aceitável” é empregado no presente documento para referência a esses compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico sólido, adequados para uso em contato com os te- cidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação excessiva, proporcional- mente a uma relação risco/benefício razoável.

[00699] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis,

incluindo, por exemplo, trocadores de íons, alumina, estearato de alu- mínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina sérica humana, substâncias tampão, tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeos parciais de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpir- rolidona, substâncias à base de celulose, polietilenoglicol, carboxime- tilcelulose sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polietile- no-polioxipropileno, polietilenoglicol e lanolina.

[00700] Os métodos de formulação de composições farmacêuticas adequadas são conhecidos na técnica, consultar, por exemplo, "Re- mington: The Science and Practice of Pharmacy. 21º edição, 2005, e OS livros da série "Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs" (Dekker, NY). Por exemplo, as soluções ou suspensões usadas para aplicação parentérica ou subcutânea po- dem incluir os seguintes componentes: um diluente esterilizado como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicois, glice- rina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacteri- anos como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajustamento da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como áci- do clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação pode ser contida em ampolas, seringas descartáveis, ou múltiplos frascos de dose feitos de vidro ou plástico.

[00701] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetá- vel podem incluir soluções (quando solúveis em água) ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intra- venosa, os carreadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, cremophor EL'Y (BASF, Parsippany, NJ) ou so- lução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e precisa ser fluida de modo que que exis- ta fácil seringabilidade. Deve ser estável sob as condições de fabrica- ção e armazenamento e precisa ser protegida contra a ação contami- nante de micro-organismos tais como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietileno- glicol líquido e similares) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revesti- mento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol|, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos será preferencial incluir na composição agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tal como manitol, sorbitol, cloreto de sódio. À absorção prolongada das composições injetáveis pode ser causada incluindo-se na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00702] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorpo- rando-se o composto ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido de esterilização filtrada.

[00703] Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dis- persão básico e os outros ingredientes necessários dentre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de so-

luções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferenciais são secagem a vácuo e secagem por congelamento, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.

[00704] As formulações parenterais podem consistir em uma dose de bolus única, uma infusão ou uma dose de bolus de carregamento seguida por uma dose de manutenção. Essas composições podem ser administradas em intervalos específicos fixos ou variáveis, por exem- plo, uma vez ao dia, ou em uma base "conforme necessário".

[00705] “Uma composição farmacêutica adequada para injeção pode compreender um tampão (por exemplo, tampão acetato, fosfato ou ci- trato), um tensoativo (por exemplo, polissorbato), opcionalmente um agente estabilizador (por exemplo, albumina humana), etc. As prepa- rações para administração periférica incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais como azeite e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etilo. Os carrea- dores aquosos incluem, por exemplo, água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e meios tam- ponados. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende tampão fosfato 0,01 a 0,1 M ou solução salina 0,8%. Outros veículos parenterais comuns incluem soluções de fosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de flui- dos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos, como aqueles à base de dextrose de Ringer, e similares. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobia- nos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e similares.

[00706] Em uma modalidade, os compostos terapêuticos são prepa- rados com carreadores que protegerão os compostos terapêuticos contra eliminação rápida do corpo, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsu- lados.

[00707] As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, pacote ou dispensador juntamente com instruções para administração.

[00708] A dosagem, toxicidade e eficácia terapêutica dos compos- tos terapêuticos podem ser determinadas mediante procedimentos farmacêuticos comuns em culturas de células ou animais experimen- tais, por exemplo, para determinar o valor LD50 (a dose letal para 50% da população) e o valor ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuti- cos é o índice terapêutico e pode ser expresso na forma da razão LD50/ED50. Compostos que exibem elevados índices terapêuticos são preferenciais. Embora possam ser usados compostos que exibam efei- tos colaterais tóxicos, deve ter-se o cuidado de projetar um sistema de entrega que direcione tais compostos ao sítio de tecido afetado a fim de minimizar danos potenciais a células não infectadas e, desse modo, reduzir os efeitos colaterais.

[00709] Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagens para uso em seres humanos. A dosagem de tais compostos situa-se preferencialmente em uma faixa de concentrações em circula- ção que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosa- gem pode variar dentro dessa faixa, dependendo da forma de dosa- gem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado no método da invenção, a dose terapeuticamente efi- caz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais de modo a alcançar uma faixa de concentrações plasmáticas em circulação que inclui o valor IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge metade da inibição máxima de sintomas), conforme determina- do em cultura celular. Tais informações podem ser usadas para de- terminar mais precisamente doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho. Kits

[00710] Também são fornecidos no presente documento kits que incluem uma ou mais das composições fornecidas no presente docu- mento e instruções para uso. As instruções para uso podem incluir ins- truções para diagnóstico ou tratamento de uma doença associada a ENTPD?2, por exemplo, um câncer, conforme descrito no presente do- cumento. Os kits fornecidos no presente documento podem ser usa- dos de acordo com qualquer um dos métodos descritos no presente documento. Aqueles que são versados na técnica estarão cientes de outros usos adequados para kits fornecidos no presente documento e serão capazes de empregar os kits para tais usos. Os kits fornecidos no presente documento também podem incluir uma postagem (por exemplo, um envelope ou embalagem postal com porte pago) que po- de ser usada para enviar de volta a amostra para análise, por exem- plo, para um laboratório. O kit pode incluir um ou mais recipientes para a amostra, ou a amostra pode estar contida em um frasco padrão de coleta de sangue. O kit também pode incluir um ou mais de um formu- lário de consentimento informado, um formulário de requisição de teste e instruções sobre como usar o kit em um método descrito no presente documento. Os métodos para uso de tais kits também estão incluídos no presente documento. Um ou mais dos formulários (por exemplo, o formulário de requisição de teste) e o recipiente contendo a amostra podem ser codificados, por exemplo, com um código de barras, para identificar o indivíduo que forneceu a amostra.

[00711] Um versado na técnica reconhecerá muitos métodos e ma- teriais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente docu- mento que podem ser usados na prática da presente invenção. De fa- to, a presente invenção não está de modo nenhum limitada aos méto- dos e materiais descritos.

EXEMPLOS

[00712] Embora modalidades específicas da matéria da invenção tenham sido discutidas, o relatório descritivo acima é ilustrativo e não restritivo. Muitas variações da invenção se tornarão aparentes aos versados na técnica após análise deste relatório descritivo e das rei- vindicações abaixo. O escopo completo da invenção deve ser determi- nado por referência às reivindicações, em conjunto com o seu escopo completo de equivalentes, e ao relatório descritivo, em conjunto com tais variações. A invenção é, ainda, descrita nos exemplos a seguir, que não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações. Exemplo 1: Expressão de ENTPD2 em Câncer

[00713] Ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase 2 (também de- nominada ENTPD2, NTPDase 2, NTPDase-2, Ecto-ATPase 2, Ecto- ATPDase 2, similar a Antígeno CD39 1, CD39L1, ecto-ATP-Difosfo- hidrolase 2) pertence a uma família de ATP hidrolases extracelulares que regulam a sinalização purinérgica, especificamente ATP, UTP, as- sim como ADP e UDP no espaço extracelular (para análise, consultar Robson et al Purinergic Signaling 2:409 a 430 (2006)). O produto final de hidrólise de ATP/ADP 5'AMP é subsequentemente desfosforilado em adenosina pela ecto-5'-nucleotidase (também conhecida como Ec- to5'Ntase ou CD73).

[00714] O papel funcional de ENTPD2 em câncer ainda não foi bem descrito. Relatórios anteriores focaram na superexpressão de ENTPD2 em um modelo de glioma de rato que levou ao crescimento tumoral in vivo aumentado através de modulação mediada por ADP de plaquetas e do microambiente tumoral, assim como promoveu um estado infla- matório que potencializa a difusão tumoral (Braganhol et al Cancer Sci 100(8): 1.434 a 1.442 (2009); Braganhol et al Purinergic Signal 8(2):235 a 243 (2012)). Mais recentemente, a expressão elevada de ENTPD? foi relatada em carcinoma hepatocelular, em que sua expres- são foi associada ao pior prognóstico devido ao acúmulo / manutenção de célula supressora derivada de mieloide aumentados (Chiu et al Na- ture Communications 8(1): 517 (2017)).

[00715] Embora a caracterização funcional de ENTPD2 em câncer seja limitada no domínio público, os medidores purinérgicos, tal como ATP e adenosina, liberados no espaço extracelular, mostraram exercer um papel importante na imunidade de inflamação. A ATP liberada de células em estresse, danificadas ou apoptóticas dispara inflamação rápida através da ativação de receptores de P2RX e P2RY que au- mentam o recrutamento de células imunes, potencializam a sinaliza- ção de TCR em células T e promovem ativação de células dendríticas e macrófagos. Por outro lado, a sinalização de adenosina resulta em um nicho imunossuppressivo através de inibição de células T efetoras, assim como desregulação de células fagócitos mononucleares (para análises, consultas Cekic et al Nature Reviews Immunology 16: 177 a 192 (2016), Antonioli et al Nature Reviews Cancer 13: 842:857 (2013)). O bloqueio pré-clínico de sinalização de adenosina ou restauração de ATP extracelular no sítio tumoral demonstrou induzir o recrutamento de linfócito e respostas antitumorais (Michaud et al Science 334(6062):

1.573 a 1.577 (2011); Allard et al Clinical Cancer Research 19(20): 5626:35 (2013)).

[00716] A expressão elevada de ENTPD2 em células cancerosas tem o potencial de alterar drasticamente o equilíbrio de sinalização pu- rinérgica no microambiente tumoral, deslocando o mesmo em direção a um estado mais imunossuppressivo. A inibição direcionada de fun-

ção catalítica de ENTPD2 pode, portanto, fornecer uma oportunidade de deslocar o equilíbrio em direção a um estado similar a Th-1 pró- inflamatório acionado por ATP, potencializando a resposta imunológica antitumoral.

[00717] A expressão de ENTPD2 não foi examinada com cuidado através de diferentes subtipos de tumor. mAb1 de ENTPD?2 anti- humano foi usado para avaliar a expressão de ENTPD?2 através de linhagens celulares cancerosas de diferentes indicações. As células foram manchadas com mAb1 de ENTPD?2 anti-humano a 5 pg/ml por 45 min em gelo, seguido por uma incubação com IgG anti-humana de cabra, específico para Fcy, Alexa Fluor 647 ou Ab secundário conju- gado a APC (diluição a 1:400; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Todas as incubações e lavagens foram realizadas em Tampão FACS composto por 1x Solução salina tamponada com fosfato HyClone (GE Healthcare, Pittsburg, PA), 1% de Soro fetal bo- vino HyClone (GE Healthcare, Pittsburg, PA), EDTA 2 mM (Thermo- Fisher, Waltham MA).

[00718] A expressão elevada de ENTPD?2 foi observada em linha- gens celulares cancerosas representativas de indicações de câncer colorretal, esofágico, gástrico, de mama e de pulmão, conforme mos- trado na Figura 1A. A densidade de receptor de ENTPD?2 foi quantifi- cada com o uso da IgG anti-humana Quantum Simply Cellular dos Bangs Laboratories (Fishers, IN) de acordo com as orientações do fa- bricante (Tabela 20, Figura 1B).

[00719] Afim de avaliar a expressão de proteína ENTPD2 em teci- dos tumorais primários, microarranjos de tecido tumoral embebidos em parafina e fixados em formalina com tecidos normais adjacentes corre- lacionados foram obtidos junto à Cureline (Brisbane, CA). Mancha- mento com IHC foi realizado com o Ab anti-CD39L1/ENTPD2 IHC (NBP1-85752, Novus, Littleton, CO) com o uso de um protocolo de

Ventana automatizado com recuperação de antígeno CC1 de alto pH padrão a 95 'C, e seguido por incubações com Ab secundário HRP anti-Rb Ventana DISCOVERYO OmniMap e Kit Ventana DISCO- VERYO ChromoMap DAB (Ventana, Tuscon AZ).

[00720] A expressão de ENTPD?2 elevada, localizada na membrana celular, foi observada em subconjuntos de amostras de tumor colorre- tal, esofágico e ovariano. Níveis de fundo nulos ou muitos baixos de expressão de ENTPD?2 foram detectados nas seções de tecido normal correlacionadas (Figura 2). Exemplo 2: Geração de anticorpos monoclonais humanizados que se ligam à ENTPD2 humana Geração de construtos de expressão para ENTPD2 de ser huma- no, rato, camundongo e macacos cynomolgus

[00721] Sequências de nucleotídeos que codificam ENTPD2 de comprimento completo de ser humano, macaco cinomolgo (cino), rato e camundongo assim como ENTPD1 (CD39) de ser humano e camun- dongo foram sintetizadas com base nas sequências de aminoácido dos bancos de dados GenBankº ou UniProtKB (consultar a Tabela 24). Todos os fragmentos de DNA sintetizados foram clonados em vetores de expressão adequados.

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Expressão e purificação de ENTPD1 de camundongo recombinan- te e ENTPD2 de camundongo e rato a partir de culturas HEK

[00722] A ENTPD2 de camundongo ou rato monomérica recombi- nante, assim como a ENTPD1 de camundongo, foram geradas con- forme segue: Células FreeStyle'y 293-F (Thermo Fisher Scientific) foram cultivadas em meio de expressão Gibco'Y FreeStyle'Y 293 e transfectadas temporariamente com um plasmídeo contendo um pro- motor de CMV, um peptídeo de sinalização de IgK de camundongo, resíduos 29 a 462 de ENTPD2 de camundongo ou rato (o domínio ex- tracelular) ou resíduos 38 a 478 de ENTPD1 de camundongo e uma etiqueta de poli-histidina (Hiss) (SEQ ID NO: 1010). Quatro dias após a transfecção, as células de uma cultura de 1 | foram peletizadas a

2.600xg por 10 minutos e o sobrenadante foi clarificado por filtração através de um filtro de 0,22 um. O sobrenadante foi suplementado com Tris-HCI 20 mM pH 8,0 e imidazol 20 mM e carregado em uma coluna pré-embalada com 6 ml de agarose NI-NTA (Qiagen). A coluna foi la- vada com 10 volumes de coluna de Tampão de Lavagem [Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, Imidazol 20 mM] e eluída com 5 volumes de coluna de Tampão de Eluição [Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, Imidazol 250 mM]. A proteína teve o tampão trocado por TBS pH 7,4 com o uso de uma coluna de dessalinização de PD-10 (GE Healthca- re) e congelada para armazenamento. Expressão e purificação de ENTPD1 humana e ENTPD2 humana e cino de células de inseto

[00723] O sistema de expressão de baculovírus Bac-to-Bacº (Thermo Fisher Scientific) foi usado para expressar ENTPD1 humana recombinante e proteínas ENTPD?2 cino. Os resíduos 38 a 478 de EN- TPD1 humana ou resíduos 29 a 462 de ENTPD2 humana ou cino foram clonados no vetor de expressão pFastBac'"1 (Thermo Fisher Scientific) com um peptídeo de sinalização de GP67 e uma etiqueta Avi-Hiss C-

terminal (SEQ ID NO: 1010). Os vetores clonados foram transforma- dos em células competentes paraEscherichia coli DH1I0Bac'“Y (Ther- mo Fisher Scientific) para produzir bacmídeos recombinantes. Os bacmídeos recombinantes foram, então, extraídos com o uso do Kkit PureLinkº HiPure Plasmid Miniprep (Thermo Fisher Scientific) e trans- fectados em células Sf9 (Spodoptera frugiperda) com o uso de FuGe- neº HD (Promega) para gerar bacmídeo recombinante (BV). Uma ro- dada de amplificação, o BV resultante foi usado para infectar células High Five'!Y (Trichoplusia ni) (Thermo Fisher Scientific) em uma cultura de suspensão de 1 | a uma densidade de 2x10º células/ml e a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. Em 72 h após a infecção, as células foram peletizadas por centrifugação a 2.600xg por 10 min, e os meios contendo a proteína secretada, glicosilada, recombinante foi co- letado. O sobrenadante foi, então, suplementado com Tris 50 mM pH 8,0, NÍCl2 1 MM, CaCl2 5 mM e, então, centrifugado a 2.600xg por 30 min. O sobrenadante foi submetido a filtração através de um filtro de 0,22 um e carregado em uma coluna embalada com 6 ml de agarose NIi-NTA (Qiagen). A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de Tampão de Lavagem descrito acima e eluída com Tampão de Eluição (também descrito acima). A proteína teve o tampão trocado por TBS (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM) com o uso de uma coluna de PD- (GE Healthcare) e congelada para armazenamento.

Geração de linhagens celulares que expressam estavelmente EN- TPD1 e ENTPD2

[00724] Foram geradas linhagens celulares que expressam EN- TPD1 ou ENTPD? estáveis com o uso de transdução retroviral. Para gerar retrovírus, células 293T foram cotransfectadas com um vetor de expressão retroviral que expressa ENTPD1 ou ENTPD?2 e um vetor de empacotamento de pCL-Eco ou pCL-10A1 (Novus Biologicals, número de catálogo NBP2-29540 ou NBP2-2952) com o uso de reagentes de transfecção FuGeneº 6 (Promega, número de catálogo E2692) de acordo com a recomendação do fabricante. As células foram mantidas em uma incubadora umidificada a 37 ºC e 5% de CO,» e sobrenadan- tes de célula contendo vírus foram coletados 48 horas após a trans- fecção. Células NIH/3T3 e 300.19 (ATCCº) foram cultivadas próximo à confluência em placa de 6 poços. O meio de crescimento foi removido das células e sobrenadante viral foi adicionado na presença de 8 ug de polibreno/ml (EMD Millipore, número de catálogo TR-1003-G). Após incubação por 3 a 6 horas a 37 ºC, foi adicionado meio fresco. As célu- las foram então cultivadas sob condições de seleção adequadas para produzir linhagens celulares que expressam ENTPD1 ou ENTPD? es- táveis.

Geração, expressão e purificação de partículas similares a vírus (VLP)

[00725] Células 300.19 foram mantidas em DMEM com 10% de FBS. Para produzir VLP, as células foram trocadas para DMEM com FBS 4% e, em seguida, cotransfectadas com um plasmídeo de ex- pressão de ENTPD2 humana e um plasmídeo de expressão de Gag retroviral a uma razão em ug de 3:2. Quarenta e oito horas após a transfecção, o sobrenadante celular foi coletado e clarificado por centri- fugação a 2500 x g por 5 min em uma centrífuga de bancada e mantido em gelo. VLPs foram purificadas por ultracentrifugação a 100.000 x g através de uma almofada de sacarose a 20% em tubos de centrifuga- ção de 38,5 ml Ultra-Clear"" (Beckman Coulterº, número de catálogo 344058) em um rotor Beckman Coulterº SW 32 Ti em uma ultracentrífu- ga Sorvall"'" RC 6 Plus. Os péletes resultantes foram novamente sus- pensos em 300 ul de PBS estéril frio e quantificados utilizando um En- saio Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific número de catálogo 23225). Geração de hibridoma

[00726] Os camundongos transgênicos Bcl-2 [cepa C57BL/6-Tgn

(bcl-2) 22 WEHI] foram imunizados com antígeno com o uso de um procedimento que exige Imunização Repetitiva em Vários Locais (RIMMS) (K.E. Kilpatrick et al. Hybridoma 1997). Em resumo, os ca- mundongos receberam injeção de 22,5 ug de proteína ENTPD2 29- 462 ECD humana com etiqueta de Hiss ("His6" revelada como SEQ ID NO: 1010) em 8 sítios específicos próximos aos nódulos linfáticos peri- féricos (PLNs). Esse procedimento foi repetido 8 vezes durante um período de 20 dias. No Dia 18, uma sangria de teste foi coletada e o título de anticorpo no soro foi analisado por FACS e ELISA. Em alguns casos, os camundongos BALB/c foram imunizados com 50 ug de pro- teína ENTPD2 29-462 ECD humana com etiqueta de Hiss ("His6" reve- lada como SEQ ID NO: 1010) em Freund's Complete, Sigma Adjuvant Systemº ou adjuvante incompleto de Freund, 50 ug de VLPs que ex- pressam ENTPD2 humana em PBS, ou 5x10e6 células 300.19 que superexpressam estavelmente ENTPD2 humana (SEQ ID NO: 291) em PBS. Os animais receberam injeção por via subcutânea ou intrape- ritoneal com intervalo de duas semanas, seguida por um reforço intra- venoso aproximadamente duas semanas depois com 50 ug de VLPs que expressam ENTPD2 humana ou proteína ENTPD2 29-462 ECD humana com etiqueta de His; em PBS ("His6" revelada como SEQ ID NO: 1010). Dez dias após a segunda imunização, uma sangria de tes- te foi coletada e o título de anticorpo no soro foi analisado por FACS e ELISA. Baços e nódulos linfáticos periféricos (PLNs) agrupados foram removidos de camundongos com títulos elevados. Para colher linfóci- tos, os baços e PLNs foram lavados uma vez em PBS, em seguida dissociados por passagem através de uma peneira de 70 mícrons (Falcon nº 352350). Os linfócitos resultantes foram lavados mais 2 ve- zes antes de fusão em meio Cytofusionº (Meio de Eletroporação BTX- press Cytofusionº, número de catálogo 47001).

[00727] Para a fusão, células de mieloma FO foram misturadas com linfócitos em uma razão de 1:4. A mistura de células foi centrifugada, suspensa em meio Cytofusion? e, em seguida, adicionada a uma câ- mara de eletrofusão (Harvard Apparatus Coaxial chamber 9ML Part nº 470020). Foi realizada eletrofusão de acordo com as instruções do fa- bricante, usando o sistema CEEF-50B Hybrimune/Hybridoma (Cyto Pulse Sciences, Inc). As células fundidas foram deixadas de recuperar por 5 minutos na câmara, diluídas a 1:10 em meios sem hipoxantina- aminopterina-timidina (HAT) [DMEM + 20% de FBS, 1% de Penicilina- Estreptomicina-Glutamina (PSG), 1X Aminoácidos essenciais (NEAA), 0,5X Fusão de Hibridoma e Suplemento de Clonagem (Roche; HFCS)) e colocadas a 37 ºC e 5% de CO» por uma hora. Em seguida, 4X meio HAT (DMEM + 20% de FBS, 1% de PSG, 1X NEAA, 4X HAT, 0,5X HFCS) foi adicionado para elevar a concentração de HAT a IX e a densidade foi ajustada em 66.000 células/ml. As células foram coloca- das em placas de 384 poços a 60 ul/poço.

Triagem por FACS

[00728] Dez dias após a infusão, as placas de hibridoma foram tria- das quanto à presença de anticorpos específicos para ENTPD2 com o uso de citometria de fluxo para confirmar a ligação específica de anti- corpos candidatos à ENTPD2 humana expressa na superfície celular com o uso de três linhagens celulares: células NIH/3T3 precursoras, células NIH/38T3 que superexpressam estavelmente ENTPD2 humana e células RKO (ATCCº), que expressam ENTPD2 humana endógena. As células foram enxaguadas com PBS e cuidadosamente, tratadas com Accutase (Millipore nº SCROO05) para se elevarem de placas de crescimento e ressuspensas em PBS frio. As células foram biotiniladas e identificadas com um corante fluorescente de acordo com as instru- ções do fabricante (FluoReporter"y Cell-Surface Biotinylation Kit, Thermo Fisher Scientific número de catálogo F-20650; PE-Cy7 Stepta- vidin, ThermoFisher Scientific número de catálogo SA1012). As células foram ressuspensas a aproximadamente 1X10º células/ml em tampão FACS (PBS com 2% de FBS + 0,1% de NaN3). Em uma placa de 384 poços, foram pré-inoculados 20 ul de sobrenadante de hibridoma e foram adicionados 20 ul de suspensão celular. As células foram incu- badas por 1 hora a 4 ºC, lavadas duas vezes com tampão FACS frio e ressuspensas em 20 ul de tampão FACS contendo anticorpo secundá- rio a uma diluição de 1:400 (IgG anticamundongo de cabra F(ab')2 conjugada a aloficocianina, específica para Fcy; Jackson Immunore- search, número de catálogo 115-136-071). Após incubação adicional por 45 min a 4 ºC, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspensas em 20 ul de tampão FACS + 2 ug/ml de iodeto de propídio (Sigma Aldrich número de catálogo 4864-10P ML). A in- tensidade de fluorescência média geométrica foi calculada em células únicas vivas com o uso do software FlowJo""Y.

[00729] Os acertos dessa triagem de citometria de fluxo baseada em célula primária foram confirmados em uma triagem de citometria de fluxo secundária. Os hibridomas que expressam anticorpos que se liga- ram a células tanto NIH/8T3-hENTPD2 quanto RKO foram expandidos em culturas de produção de proteína de 45 ml em meio sem soro de hibridoma com Suplemento de Meio HT (50x) Hybri-Max'Y (Sigma, nú- mero de catálogo H0137) em CellStarº Autoflasks'Y (Greiner Bio-One). As culturas foram mantidas em uma incubadora de agitação a 37 "Ce 5% de CO2 por aproximadamente 8 dias e, então, as células foram pe- letizadas e os sobrenadantes foram coletados através de purificação em resina de Proteína G. As proteínas tiveram subsequentemente o tampão trocado para PBS com o uso de colunas NAP-107Y (GE Healthcare). Produção de Anticorpos Recombinantes

[00730] mAbs derivados de hibridoma foram triados em um ensaio baseado em célula para inibição de hidrólise de ATP por ENTPD?2. Dois mAbs inibidores líderes foram identificados nesse ensaio: mAb17 e mAb16.

[00731] Foram preparados anticorpos quiméricos compreendidos por regiões variáveis murinas e regiões constantes humanas. Sequên- cias de DNA de região variável (VH e VL) de hibridomas foram obtidas para clonagem e otimização de anticorpo (humanização, remoção de modificações pós-traducionais potenciais, etc.). O DNA de região vari- ável de anticorpos monoclonais de murino foi amplificado por 5' RACE a partir de RNA obtido de cada linhagem celular de hibridoma selecio- nada com o uso de métodos-padrão. As sequência de polipeptídeos para cada uma das cadeias pesada/leve variáveis murinas são mos- tradas na Tabela 1 para mAb17 e mAb16, respectivamente. As se- quências de nucleotídeos pesadas/leves variáveis derivadas corres- pondentes para cada um dos hibridomas são mostradas na SEQ ID NO: 234/ SEQ ID NO: 238 e SEQ ID NO: 226/ SEQ ID NO: 230. Para preparação de anticorpos quiméricos, sequências de DNA que codifi- cam a VL e VH de hibridoma amplificadas por 5' RACE-PCR foram clonadas em vetores de expressão contendo as respectivas sequên- cias de região constante de cadeia leve humana e cadeia pesada do tipo selvagem humana (IgG1, kappa). Esses vetores passaram por mini- preparação com o uso do Kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, número de catálogo 27106) e sofreram nucleofecção em uma linhagem de célu- las CHO patenteada com o uso de um Amaxa'“ 4D-NucleofectorTv (Lonza). As células transfectadas foram colocadas em meios seletivos para geração de grupamento estável, e os grupamentos resultantes fo- ram submetidos a um processo de produção de proteína por batelada alimentada de 14 duas. Os sobrenadantes celulares contendo proteína foram clarificados por centrifugação a 3.000 xg por 15 minutos e filtra- ção através de um filtro de 0,22 um. As proteínas foram purificadas com o uso da resina MabSelect SuRe'" (GE Healthcare) em um Puri- ficador ÁKTA'Y Pure ou ÁKTA'Y e eluídas com o uso de Tampão de

Eluição de IgG Pierce"" (Thermo Fisher Scientific nº 21004), então, tiveram o tampão trocado para PBS por diálise ou com o uso de uma coluna de dessalinização HiPrep (GE Healthcare). Em casos em que a proteína resultante foi <95% de dímero por cromatografia de exclusão de tamanho analítica (ANSEC) com o uso de um Superdex?º 200 In- crease, a proteína foi submetida a SEC preparativa com o uso de uma coluna HiLoadº Superdexº 200 (GE Healthcare) com o uso de PBS como a fase móvel.

Humanização

[00732] —Construtos de região variável foram também projetados pa- ra humanização e otimização de sequências (por exemplo, remoção de sítios de modificação pós-traducional potenciais) com o uso de um programa de software interno. Um ou mais frameworks humanos fo- ram escolhidos para cada VH e VL de camundongo com retromuta- ções nas Zonas de Vernier (Foote e Winter 1992, Journal of Molecular Biology; 224 (2):487 a 499) para manter a afinidade e atividade funcio- nal desejada. Tanto mMAb17 quanto mAb16 foram também humaniza- dos com o uso de projeto baseado em estrutura tridimensional de cris- tal. Em resumo, a estrutura de cristal foi carregada em Molecular Ope- rating Environment (MOETY) (Chemical Computing Group ULC) e pre- parada com o uso da metodologia de preparação de estrutura padrão com o campo de força Amber10EHT. O Fab foi, então, comparado es- truturalmente com uma biblioteca interna de Fabs humanizados com o uso de um script personalizado denominado "cdr grafter SVL". O script compara estruturalmente a estrutura de Fab murino de entrada com estruturas de Fab humano em um banco de dados interno e lista pa- râmetros detalhados em relação a similaridades estruturais entre os Fabs murino (doador) e humano (aceitante). Esses parâmetros inclu- em RMSDs de região de framework e tronco e comparações de com- primento de CDR. Com base nesses parâmetros, quatro Fabs aceitan-

tes candidatos foram selecionados para enxertar CDRs doadoras de mAb17 e três Fabs aceitantes candidatos foram selecionados para en- xertar CDRs doadoras de mMAb16. A humanização de mAb17 levou à geração de mAb1, mAb2, mAb3 e mAb7. A humanização e otimização de mAb16 levou à geração de mAb4, mAb5 e mAb6.

[00733] As sequências de DNA que codificam os domínios de VL e VH humanizados projetados a partir de ambas as estratégias de hu- manização foram adquiridas junto à GeneArt (Life Technologies Inc. Regensburg, Alemanha) com otimização de códon para Cricetulus gri- seus. Essas regiões variáveis foram subclonadas em vetores de ex- pressão contendo a respectiva cadeia pesada do tipo selvagem huma- na e sequências de região constante de cadeia leve humana (IgG1, kappa) com o uso de métodos-padrão.

[00734] Os anticorpos recombinantes foram produzidos por cotrans- fecção de vetores que codificam cadeias pesada e leve em células 293-F FreeStyle"" (Thermo Fisher Scientific). As células transfectadas foram mantidas em Meio de expressão de 293 Gibcoº FreeStyleTv (Thermo Fisher Scientific nº 12338018) em CellStarº Autoflasks "Tv (Greiner Bio-One) alojados em uma incubadora de agitação a 37 ºC e 5% de CO» por aproximadamente 5 dias e, então, as células foram pe- letizadas e os sobrenadantes contendo proteína foram coletados atra- vés de purificação em resina MabSelect SuRe'Y (GE Healthcare). As proteínas tiveram subsequentemente o tampão trocado para PBS com o uso de colunas NAP-107"Y (GE Healthcare). Exemplo 3. Geração de anticorpos de ENTPD2 humanos e anti- humanos e fragmentos Fab dos mesmos com o uso de exibição de fago

[00735] Os Fabs que se ligam especificamente à ENTPD2 humana (SEQ ID NO: 291) foram gerados com o uso da tecnologia de exibição de fago MorphoSys HuCAL PLATINUMº. A biblioteca de fagomídeo é baseada no conceito de HUCALº (Knappik et al., 2000, J Mol Biol 296, 57 a 86) e emprega a tecnologia CysDisplayTM para exibir o Fab na superfície do fago (Lohning, WO 2001/05950).

[00736] Quatro tipos de panning foram realizados: panning de fase sólida contra ENTPD2 humana recombinante diretamente revestida (nENTPD?2), panning de solução contra ENTPD2, panning de célula inteira e panning de maturação por afinidade. Panning Baseado em Microesfera

[00737] Antes de um panning baseado em microesfera, o antígeno foi imobilizado em microesferas magnéticas revestidas com ácido car- boxílico (Dynabeads'y M-270 Carboxylic Acid, Thermo Fisher Scienti- fic número de catálogo 14306D). Por grupamento de fago, 1x10' mi- croesferas revestidas com antígeno foram bloqueadas 1x ChemiBloc- ker (EMD Millipore). Em paralelo, uma quantidade adequada de fago- anticorpos foi bloqueada com 50% de soro humano/0,33x quimioblo- queador/0,05% de Tween20. Para impedir a seleção de fago de liga- ção a microesfera, partículas de fago bloqueadas foram pré-incubadas com o uso de microesferas com proteína irrelevante imobilizada. As microesferas revestidas com antígeno bloqueadas foram adicionadas às partículas de fago pré-absorvidas e bloqueadas e foi permitido que os fago-anticorpos se ligassem às microesferas revestidas com antí- geno. As partículas de fago ligadas às microesferas revestidas com antígeno foram coletadas por separação magnética. Diversas etapas de lavagem removeram fago ligado não especificamente. Finalmente, fagos ligados especificamente foram eluídos de microesferas revesti- das com antígeno. O eluído foi transferido para 14 ml de cultura de E. coli TG1 e incubado para infecção de fago.

[00738] Mediante centrifugação, as bactérias infectadas foram pele- tizadas e ressuspensas em meio 2xYT, colocadas em placas em pla- cas de ágar de LB/cloramfenicol e incubadas de um dia para o outro.

As colônias foram removidas por raspagem das placas e foram usadas para resgate de fago, amplificação policlonal de clones selecionados e produção de fago. Com o fago purificado, a rodada de panning seguin- te foi iniciada. A segunda e a terceira rodadas de panning de fase sóli- da foram realizadas com o uso do mesmo protocolo que a primeira ro- dada, exceto pelo fato de que menos antígeno e mais condições de lavagem mais estringentes foram usadas.

Panning de Solução

[00739] Uma quantidade adequada de microesferas de estreptavi- dina (Dynabeads'y M-280 Streptavidin, Thermo Fisher Scientific nú- mero de catálogo 11206D) foi bloqueada. Em paralelo, uma quantida- de adequada de fago-anticorpos foi bloqueada. Para remoção de fago de ligação a estreptavidina ou microesfera, pré-adsorção de partículas de fago bloqueadas foi realizada com o uso de microesferas de estrep- tavidina bloqueadas revestidas com proteína irrelevante biotinilada. Então, a ENTPD?2 biotinilada foi adicionada às partículas de fago pré- adsorvidas e bloqueadas e foi permitido que os fago-anticorpos se |i- gassem ao antígeno em solução. Os complexos de fago-antígeno fo- ram capturados com o uso de microesferas de estreptavidina bloquea- das e partículas de fago ligadas às microesferas de estreptavidina fo- ram coletadas com um separador magnético. Os fagos não especifi- camente ligados foram removidos por lavagem por várias etapas de lavagem. Os fagos ligados especificamente foram eluídos de microes- feras de estreptavidina. O eluído foi transferido para 14 ml de cultura de E. coli TG1 e incubado para infecção de fago. A infecção de fago e a produção de fago subsequentes foram realizadas de acordo com o protocolo de Panning Baseado em microesfera e a rodada de panning seguinte foi iniciada. A segunda e a terceira rodada de panning de so- lução baseado em microesfera foram realizadas com o uso do mesmo protocolo que a primeira rodada, exceto pelo fato de que condições de lavagem com estringência aumentada foram aplicadas. Panning de Célula Inteira

[00740] Para cada panning, uma quantidade adequada de fago- anticorpos foi bloqueada. Em paralelo, uma quantidade adequada de células-alvo que expressa ENTPD2 e uma quantidade adequada de células de adsorção sem expressão de ENTPD?2 de antígeno foram bloqueadas para cada grupamento de fago. As células-alvo bloquea- das foram centrifugadas, ressuspensas nas partículas de fago pré- bloqueadas e foi permitido que os fago-anticorpos se ligassem ao an- tígeno apresentado na célula. Os complexos de fago-célula foram la- vados diversas vezes. Os fagos ligados especificamente foram eluídos de células-alvo. Após centrifugação, o sobrenadante (eluído) foi apli- cado a células de adsorção negativas para antígeno para remoção de ligação de fago às moléculas da superfície celular diferentes do antí- geno-alvo (após adsorção). O sobrenadante final foi transferido para uma cultura de E. coli TG1 para infecção por fago. A segunda e a ter- ceira rodadas do panning de célula inteira foram realizadas com o uso do mesmo protocolo que a primeira rodada de panning. Panning de Maturação por Afinidade

[00741] Geração de Bibliotecas de Maturação HUCAL PLATINUMº

[00742] “Quatro candidatos de Fab foram selecionados para matura- ção por afinidade. Para aumentar a afinidade e a atividade de anticor- pos selecionados, as regiões de CDR-L3 e CDR-H2 foram otimizadas por mutagênese de cassete com o uso de mutagênese trinucleotídeo- dirigida, enquanto as regiões de framework foram mantidas constantes (Virnekãs et al. 1994, Nucleic Acids Research 22 (25), páginas 5.600 a

5.607). Para otimização de CDR-L3, um fragmento de DNA de 400 pares de bases que codificam o CDR-L3, framework 4 assim como a região constante da cadeia leve foram removidos da sequência que codifica os anticorpos precursores por digestão por restrição e substi-

tuídos por um repertório de fragmentos de DNA que codificam regiões de CDR-L3 diversificadas juntamente com o framework 4 e o domínio constante. Em um segundo conjunto de biblioteca, a sequência de co- dificação de CDR-H2 foi diversificada, enquanto as regiões de fra- mework de conexão foram mantidas constantes. A fim de reduzir o fundo da sequência não diversificada precursora, um fragmento de DNA de — 150 pares de bases contendo a CDR-H2 precursora e as sequências de framework 3 foram substituídas por uma sequência fic- tícia de — 590 pares de bases através de digestão por restrição e liga- ção, antes de o cassete de CDR-H2 diversificado (incluindo framework 3) ser inerido também através digestão por restrição e ligação. Eletro- poração de misturas de ligação em células MC1061F' produziram aproximadamente 10º a 10º em > 5x10º colônias independentes. Am- plificação da biblioteca foi realizada conforme descrito anteriormente (Rauchenberger et al. 2003, J biol chem 278 (40), páginas 38.194 a

38.205). Para controle de qualidade, aproximadamente 10 a 20 clones únicos por biblioteca foram aleatoriamente escolhidos e sequenciados.

[00743] Para a seleção de candidatos que têm a afinidade aprimo- rada, fagos derivados de bibliotecas de maturação foram submetidos a duas ou três rodadas de panning de maturação. A estringência de panning foi aumentada reduzindo-se a concentração de antígeno em cada rodada de panning (Low et al. 1996, J.Mol.Biol. 260, páginas 359 a 368). Adicionalmente à redução de antígeno, a seleção de taxa de dissociação foi realizada (Hawkins et al. 1992, J.Mol.Biol. 226 (3), pá- ginas 889 a 896). Essas estratégias foram combinadas com etapas de lavagem prolongadas.

Expressão Subclonagem de Vetor de Exibição em vetor de expressão de Fab para E. coli

[00744] Para facilitara expressão rápida de Fab solúvel, os insertos que codificam Fab do fago HUCAL PLATINUMº selecionado foram subclonados a partir de vetor de exibição pMORPHº30 em vetor de expressão de pMORPHºx11 pMORPHºx11 FH. Após transformação de clone único de E. coli TG1, a expressão e a preparação de extratos periplásmicos contendo fragmentos HuCALº-Fab foram realizadas conforme descrito anteriormente (Rauchenberger et al., 2003, J Biol Chem 278: 38.194 a 38.205). Produção em Microescala de Fragmentos de Fab com etiqueta His

[00745] A expressão de fragmentos Fab codificados por vetor de expressão bacteriano em células TG1 F de E. foi executada em tubos Falcon de 50 ml com o uso de 25 ml de meio 2xYT suplementado com 0,1% de glicose, 34 ug/ml de cloranfenicol e IPTG 1 mM (isopropil-B- D-thiogalactopiranosídeo). As culturas foram agitadas a 30 ºC por 18 h. As células foram coletadas e rompidas com o uso de uma combina- ção de lisozima e Reagente de Extração de Proteína Bug Busterº (Merck, Alemanha). Os fragmentos Fab com etiqueta His6 ("His6" re- velada como a SEQ ID NO: 1010) foram isolados por meio de IMAC (GE Healthcare, Alemanha) e eluídos com o uso de imidazol. Troca de tampão para 1X PBS de Dulbecco (pH 7.2) foi realizada com o uso de placas “PD MultiTrap'Y G-25' (GE Healthcare, Alemanha). As concen- trações de proteína foram determinadas por espectrofotometria de UV. A pureza de amostras selecionadas representativamente foi analisada em 15% de SDS-PAGE não redutor desnaturante. Subclonagem em Vetor de Expressão IgG e FabCys e Expressão em Células HKB11

[00746] Para expressão de IgG de comprimento completo em célu- las HKB11, os candidatos selecionados ou grupamentos de candidatos foram clonados no vetor pMORPHº%4 IgG1f. A subclonagem foi reali- zada como um método em duas etapas para uma conversão conveni- ente e eficiente de um grande número de clones de Fab de sequência única no formato de IgG.

[00747] Células HKB11 eucarióticas foram transfectadas com DNA de vetor de expressão de mamífero que codifica cadeias tanto pesa- das quanto leves de IgG. Os sobrenadantes de cultura celular foram coletadas no dia 3 ou 6 após a transfecção e submetidos a cromato- grafia de afinidade de Proteína A (MabSelect'y SuRe'Y, GE Healthca- re). A não ser que determinado de outro modo, a troca de tampão foi realizada e 1x PBS de Dulbcecco (pH 7,2, Invitrogen) e amostras fo- ram filtradas (0,2 um de tamanho de poro).

[00748] As concentrações de proteína foram determinadas por es- pectrofotometria de UV e as purezas de IgG foram analisadas sob condições desnaturantes, redutoras e não redutoras com o uso de CE- SDS (LabChip GXII, PerkinElmer, EUA). HP-SEC foi realizado para analisar preparações de IgG em estado nativo. Sumário de Anticorpos

[00749] A Tabela 1 apresenta informações de sequência para anti- corpos de ENTPD?2 anti-humanos derivados de hibridomas murinos. Exemplo 4. Caracterização bioquímica de anticorpos de ENTPD2 anti-humanos

[00750] Os anticorpos de ENTPD2 anti-humanos foram avaliados nos seguintes ensaios.

[00751] Triagem por FACS: A ligação específica de anticorpos candidatos a ENTPD2 expressa endogenamente foi avaliada por cito- metria de fluxo. As células foram lavadas com 1xPBS e cuidadosa- mente tratadas com Accutase (Millipore nº SCROO05) para se elevarem de placas de crescimento e ressuspensas a aproximadamente 1x10º células/90 ul em 1x tampão FACS (2% de FBS + 0,1% de NaN3 em PBS). Em uma placa de fundo em U com 96 poços, foram pré- inoculados 10 ul de solução de anticorpo 10x em tampão FACS e fo- ram adicionados 90 ul de suspensão celular. As células foram incuba-

das durante 30 minutos a 4 ºC, lavadas 1x com PBS frio e ressuspen- sas em 100 ul de 1:500 de tampão 1x FACS de anticorpo secundário (IgG anti-humano de cabra F(ab')2 conjugado com aloficocianina, es- pecífico de Fcy; Jackson, Immunoresearch número de catálogo 109- 136-098). Após incubação adicional por 15 min a 4 ºC, as células fo- ram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em 100 ul de 1x tampão FACS com 4 ug/ml de iodeto de propídio (Life Technologies, número de catálogo P3566). A intensidade de fluorescência média ge- ométrica foi calculada em células únicas vivas com o uso do software FlowdJo.

[00752] Triagem por ELISA em antígeno diretamente revestido: Placas com 384 poços Maxisorp'"" (Thermo Nunc) foram revestidas com 2 ug/ml de ENTPD2 recombinante diluído em PBS. Após bloqueio com 2% de BSA (albumina sérica bovina) em PBS por 1 hora à tempe- ratura ambiente, placas de lavagem 3x com TBST (0,05% de Tween em TBS, Sigma número de catálogo T9039), anticorpos primários em TBST e 2% de BSA foram adicionados em uma diluição em série e incubados por 1 h à temperatura ambiente. As placas foram lavadas novamente e foram detectados anticorpos ligados por incubação com anti-hFc gama conjugado a peroxidase de rábano silvestre (HRP; Jackson ImmunoResearch, número de catálogo 115-035-098, diluído a 1:5000 em 1xXTBST +2% de BSA) durante 1 h à temperatura ambiente, seguido de lavagem com TBST e, em seguida, adição de substrato de Peroxidase SureBlue (KPL, nº 52-00-03). Após 15 min, a absorbância a 650 nM foi registrada e analisada em GraphPad Prism6.

[00753] Triagem Biacore: A afinidade foi medida determinando-se as constantes de taxa cinética com o uso de ressonância de plásmon de superfície (SPR) em um Biacore T200 ou T100 com o instrumento de aprimoramento de sensibilidade T200 (Biacore, GE Healthcare). Os anticorpos foram capturados em chips sensores CM5 (Biacore, GE

Healthcare) preparados com uma amina de anticorpo IgG Fc anti- humano de camundongo (ThermoFisher catalogue nº 05-4200) aco- plada à superfície. A ligação de ECDs de ENTPD2 humana e cinomol- ga (cino) a 25 ºC foi detectada em concentrações na faixa de 0,78 nM a 500 nM dependendo da afinidade do anticorpo. Os analitos de EN- TPD?2 foram deixados se associar por 180 s e dissociar por até 1.800 s dependendo da taxa de dissociação do anticorpo a uma taxa de fluxo de 30 ul/min. O tampão contínuo foi PBS pH 7,2 (preparado a partir de estoque Corning 10X, número de catálogo 46-013-CM) + 0,05% de Tween 20. A regeneração foi realizada com injeções de 30 s de MgCI2 3 ou 4 M para remover todo anticorpo capturado e complexo remanes- cente da superfície, após o qual anticorpo fresco foi capturado. Os da- dos brutos foram analisados com o uso de Software de Avaliação Bia- core T200 versão 1,0 e ajustados a um modelo de ligação 1:1, com todos os parâmetros definidos para se ajustarem globalmente exceto por RI, que foi definido para de ajustar localmente.

[00754] A especificidade de anticorpo para mAb1-mAb10 foi confir- mada. Todos os mostraram ligação significativa em nM a sub-nM à ENTPD2 humana. Os anticorpos mAb8, mAb9 e mAb10 mostram afi- nidade fraca a ENTPD2 de camundongo. Nenhum dos anticorpos se- lecionados se liga a ENTPD?2 de rato. Consultar a Tabela 21 e a Tabe- la 22.

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[00755] Reatividade cruzada Células NIH/8T3 que expressam EN- TPD1 humana (NP 001767) foram geradas com o uso de uma abor- dagem de transdução retroviral. 72 horas após a transdução, as célu- las geneticamente modificadas foram manchadas com o anticorpo conjugado a CD39/ENTPD1 APC anti-Humano (R&D systems, Minne- apolis, MN) e células vivas que expressaram ENTPD1 humana foram separadas do restante da população por meio de separação de célula ativada por fluorescência. A expressão estável de ENTPD1 foi periodi- camente reconfirmada por FACS com o anticorpo conjugado a CD39/ENTPD1 APC anti-humano (1:100).

[00756] As células H520 foram identificadas como linhagem de cé- lulas cancerosas com expressão de ENTPD3 (Ct 25) e ENTPD8 (Ct 26) por Tagman e foram usadas para triagem por seletividade.

[00757] “Nenhuma ligação significativa a qualquer uma das linha- gens celulares de controle foi observada com qualquer um dos Abs de ENTPD?2 anti-humanos testados (Tabela 25).

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Binagem de Epítopo com o uso do sistema Octet Red96

[00758] Foi realizada a binagem de epítopo de anticorpos de EN- TPD?2 anti-humanos com o uso do sistema Octet Red96 (ForteBio, EUA.), que mede a interferometria de biocamada (BLI). A proteína humana ENTPD?2-Avi-Hiss ("His6" revelada como SEQ ID NO: 1010) foi biotinilada através de um AviTag'"Y utilizando biotina ligase BirA de acordo com as recomendações do fabricante (Avidity, LLC, EUA. nú- mero de catálogo BirA500). O arcabouço de imunógeno biotinilado foi carregado a 0,5 ug/ml para sensores de estreptavidina pré-equilibra- dos (ForteBio, EUA). Os sensores foram então transferidos para uma solução contendo anticorpo A 100 nM em 1x tampão de cinética (For- teBio, EUA.). Os sensores foram lavados brevemente em 1x tampão de cinética e transferidos para uma segunda solução contendo anti- corpo competidor 100 nM. A cinética de ligação foi determinada a par- tir de dados em bruto com o uso do software de análise de sistema Octet Red96 (versão 9.0, ForteBio, EUA.). Os anticorpos foram testa- dos em todas as combinações em pares, tanto como o primeiro anti- corpo (bloqueio) ligado a hpENTPD2 quanto como o segundo anticorpo (competidor). Todos os anticorpos demonstraram bloqueio cruzado significativo nesse ensaio, indicando que mAb1-10 pode ter epítopo similar. Exemplo 5. Cristalografia e mapeamento de epítopo de FAb22 de ENTPD?2 anti-humano

[00759] Nesse Exemplo, o FAb22 de ENTPD?2 anti-humano foi cris- talizado em complexo com ectodomínio de ENTPD2 humana (mutante Y350A) e a estrutura correspondente foi determinada. A análise de |li- gação de FAb22 de ENTPD?2 anti-humano a ENTPD2 humana com base em dados de raios X forneceu detalhes moleculares de engate de antígeno e conhecimentos sobre os parátopos Fab e epítopos de antígeno descritos.

Materiais e Métodos Expressão e purificação de fragmentos Fab

[00760] As sequências de DNA que codificam os domínios de VH e VL identificados foram subclonadas em vetores de expressão de ma- mífero contendo as respectivas sequências de CH1 do tipo selvagem humana e de região constante de cadeia leve kappa humana. Fabs humanos recombinantes foram produzidos por cotransfecção temporá- ria de vetores em células com o uso de reagente de transfecção. Após transfecção, as células foram cultivadas por 5 a 6 dias, e a purificação de anticorpos foi executada. As células foram peletizadas por centrifu- gação (2.600xg por 10 minutos), e os sobrenadantes celulares conten- do anticorpo foram clarificados por filtração através de um filtro de 0,22 um. Fabs foram purificados com colunas de Proteína G (GE Healthca- re Life Sciences) e eluídos com o uso de condições de tampão de elu- ído ácido. Preparação de complexo de ENTPD2 humana e FAb22 de ENTPD2 anti-humano

[00761] Para preparar o complexo ENTPD2-FAb22, um excesso molar de 1,3 vez de FAb22 foi combinado com hENTPD2 Y350A em Tris 20 mM pH 7,5 com NaCl 150 mM para gerar uma concentração final de 5,65 mg/ml. A amostra complexa foi incubada em gelo por 2 horas e submetida a ajustes de triagem de cristalização. Cristalização e coleta de dados de raios X

[00762] Os cristais foram cultivados em placas de 96 poços (placas Greiner Bio-One Crystalquick Plus) por difusão de vapor em gota sen- tada. Em detalhes, 0,2 ul de estoque de proteína foi misturado com 0,2 ul de solução de reservatório, e a gota foi equilibrada contra 50 ul da mesma solução de reservatório a 20 ºC. Os experimentos foram confi- gurados com um sistema robótico Phoenix (Art Robbins Instruments) e armazenados em imageador e pórtico de cristal geneticamente modifi-

cados personalizados internos (sistema interno Novartis GNF).

[00763] Para coleta de dados de raios X, um único cristal foi direta- mente montado em uma crio-alça e resfriado rapidamente em nitrogê- nio líquido. Os dados de raios X foram coletados na Fonte de Luz Avançada, BL5.03, com detector de CCD Quantum Q315, com o uso de radiação por raios X 0,9765À. 180 imagens de oscilação de 1.0º cada foram registradas a uma distância entre cristal e detector de 350 mm e processadas com HKL2000 (Z. Otwinowski e W. Minor, "Proces- sing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode", Methods in Enzymology, Volume 276: Macromolecular Crystallography, parte A, páginas 307 a 326, 1997,C.W. Carter, Jr. & R. M. Sweet, Eds., Aca- demic Press (New York). Determinação de estrutura e análise

[00764] A estrutura do complexo de FAb22-ENTPD? foi determina- da por substituição molecular com o programa Phaser (McCoy et al., 2007, J Appl Crystallogr 40:658 a 674), com o uso das estruturas refi- nadas de ENTPD2 humana anteriormente determinadas internamente e coordenadas para Fab anti-RSV B21m (código de PDB 3QRG) como modelos de pesquisa independentes. A estrutura foi refinada com o uso de ciclos iterativos de construção de modelo seguidos por refina- mento cristalográfico automatizado com os programas Coot 0.8.0 (Crystallographic Object-Oriented Toolkit; Emsley et al., 2010, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486 a 501) e Autobuster 2.11.5 (Bricogne et al., 2011, BUSTER versão 2.11.2. Cambridge, Reino Uni- do: Global Phasing Ltd.).

[00765] A inspeção visual das estruturas de cristal foi executada com o uso dos programas Coot (Emsley et al., 2010, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486 a 501) e PyMOL (Molecular Graphics System; DeLano Scientific: Palo Alto, CA). A qualidade dos modelos refinados finais foi avaliada com os programas Coot e PROCHECK v3.3 (Laskowski et al., 1992, J Appl Crystallogr; 26:283 a 291). Resí- duos de ENTPD2 humana que se tornaram menos acessíveis a sol- vente mediante ligação do FAb22 de ENTPD?2 anti-humano foram identificados pelo programa AREAIMOL do pacote de programa CCP4 (Collaborative Computational Project, Número 4, 1994). Os contatos intermoleculares foram definidos com o uso de uma distância de corte de 4,0À e foram identificados com o programa CCP4 NCONT. Resultados Estrutura de Cristal do FAb22 anti-hENTPD2 em complexo com EN- TPD2 humana

[00766] O FAb22 antichpENTPD2 em complexo com o mutante Y350A de ENTPD2 humana foi cristalizado em placas de 96 poços pe- lo método de difusão em gotas sentadas, a 20 ºC. Os cristais cresce- ram em HEPES 0,1 M pH 7,5, 20% de polietilenoglicol 3350, cloreto de magnésio 0,2 M. Os cristais apareceram após aproximadamente 6 semanas e cresceram até tamanho completo dentro de alguns dias.

[00767] O cristal do complexo de FAb22-ENTPD?2 estava no grupo de espaço monoclínico C2, com um complexo por unidade assimétri- ca. Um conjunto de dados de difração completa foi coletado para o complexo até resolução de 2,75 Angstrom.

[00768] A determinação de estrutura por substituição molecular foi realizada com o uso das coordenadas de ENTPD2 humana anterior- mente determinadas e coordenadas de Fab a partir de código de PDB 3QRG. O refinamento com AutoBuster levou a boas estatísticas de refinamento e geometria geral. Dois resíduos de FAb22, Ala55L e Tyr33H, e quatro resíduos de ENTPD2, Gly120, Thr122, Tyr229 e Ala430, foram valores discrepantes de Ramachandran na estrutura do complexo de FAb22-ENTPD2. Os resíduos de ENTPD2 Gly120 e Thr122, adicionalmente aos resíduos Fab Ala55L e Tyr33H, são bem definidos na densidade de elétron e são valores discrepantes de geo-

metria provavelmente genuínos. Observa-se que Tyr33H é um resíduo de CDR envolvido em ligação de ENTPD2, conforme descrito abaixo. Os resíduos de ENTPD2 Tyr229 e Ala430 foram frouxamente modela- dos na densidade de elétron.

[00769] As sequências de aminoácidos da cadeia pesada e da ca- deia leve de FAb22 de ENTPD?2 anti-humano são fornecidas na Figura 3A, com as CDRs sublinhadas (conforme definido por Kabat, 1991, Sequences of proteins of immunological interest, Publicação NIH nº 91 a 3.242) e os resíduos localizados na interface Fab-antígeno identifi- cados com *. Um vista geral da estrutura tridimensional do complexo de FAb22 de ENTPD?2 anti-humano/Y350A de ENTPD? é representa- do na Figura 6.

[00770] A sequência de aminoácidos de ENTPD2 humana recombi- nante usada nesse exemplo (SEQ ID NO: 291) é fornecida na Figura 4A. O domínio extracelular solúvel de ENTPD2 humana abrange os resíduos 29 a 462. Uma mutação geneticamente modificada de Y350A estava presente no construto e destacada em itálico cinza. O construto usado aqui utilizou um peptídeo de sinalização de secreção de GP67 N-terminal (primeiros 38 resíduos) e uma etiqueta de 6xHistidina C- terminal (SEQ ID NO: 1010). Asn64, Asn129, Asn294, Asn378 e Asn443 são sítios de glicosilação N-ligados previstos para os quais apenas aqueles em que glicosilação foi observada na estrutura de cris- tal destacada em itálico cinza. Os elementos estruturais secundários são mostrados abaixo da sequência de aminoácidos com barras que representam hélices a, setas que representam fitas B. Os resíduos pa- ra os quais nenhum elemento estrutural secundário é identificado re- presentam segmentos de alça e volta não estruturados.

[00771] A sequência de aminoácidos de ENTPD2 humana porta alta homologia de sequência com espécies de roedor e outros mamiífe- ros e a estrutura possui uma dobra geral quase idêntica àquela descri-

ta para a ENTPD?2 de rato (isto é, código de PDB 3CJA, Zebisch, M., Strater, N. (2008) Proc.Natl.Acad.Sci.Usa 105: 6.882 a 6.887). Parea- mentos de dissulfeto invariantes e conservados são observados para Cys75/Cys99, Cys242/Cys284, Cys265/Cys310, Cys323/Cys328 e Cys377/Cys399. A RMSD (raiz do desvio médio quadrático) através de 388 carbonos C-a entre as estrutura de ENTPD2 de ser humano e rato é aproximadamente 0,365À.

[00772] O modelo final para o complexo de FAb22/ENTPD?2 conti- nha os resíduos 37 a 448 de ENTPD?2. O sítio ativo para hidrólise de ATP se encontra entre os dois subdomínios (subdomínio 1: Pro36- Ser161 e Lys427-Phe461; subdomínio 2: Gly162-GIn426). Os resíduos de ENTPD2 omitidos do modelo final incluem os resíduos 29 a 36 da terminação N e 60 a 65 correspondentes aos resíduos de alça que co- nectam as fitas B2 e B3, os resíduos 179 a 193 correspondentes à alça de interação de membrana (MIL) e resíduos C-terminais além de lle448. Todos os resíduos Fab de cadeia pesada e leve foram incluí- dos no modelo refinado final exceto as cisteínas terminais (cadeia pe- sada Cys228/cadeia leve Cys218).

[00773] O FAb22 se liga a antígeno de ENTPD2 principalmente através de engate do lóbulo distal da membrana prevista através de interações que envolvem todas as 6 CDRs de domínios variáveis de cadeia pesada e leve. Nenhum resíduo de CDR de FAb22 parece pe- netrar consideravelmente na fenda de sítio ativo de ENTPD?2 para afe- tar a ligação de substrato a ATP. Os resíduos de CDR3 e CDR2 de cadeia pesada sequestram resíduos que incluem e que flanqueiam a folha B com 2 fitas antiparalelas compreendidas pelas fitas B10/B11. Os resíduos de CDR3 de cadeia pesada terminais fazem contatos de ligação adicionais com resíduos da extremidade N-terminal da hélice a14, assim como das hélices a8 e a13. As interações de ligação de domínio variável de cadeia leve com ENTPD2 envolvem grandemente os resíduos-

CDR1 e CDR3 que se ligam predominantemente à extremidade N- terminal da hélice a14. A formação do complexo FAb22/ENTPD?2 ocul- ta aproximadamente 16.700 À2 da superfície acessível por solvente combinada total com contribuições quase iguais de cadeia Fab pesa- das e leves.

Resíduos de epítopo e parátopo envolvidos em contatos intermoleculares diretos calculados dentro de um corte de distância de 4,0À são listados na Tabela 17 e identificados na Figura 3A e 4A.

Um total de 25 resíduos de Fab e 26 resíduos de ENTPD?2 está envolvido em contatos intermoleculares diretos, com CDRs de cadeia pesada contribuindo com mais resíduos de ligação do que CDRs de cadeia leve.

Desses resíduos de parátopo de Fab, as tirosinas de CDR contri- buem com um grande número de contatos de ENTPD2 com 10 de 14 resíduos Tyr de CDR envolvidos.

Os resíduos de CDR de cadeia pe- sada em contatos intermoleculares incluem os resíduos de CDR1 Ser31, Gly32, Tyr33 e Tyr34; os resíduos de CDR2 Tyr54, Asp55, Asp57; e os resíduos de CDR3 Tyr100, Tyr101, Arg102, Tyr103, Ser106, Tyr107, Asp112, Tyr113. Tyr27 de FR1 de cadeia pesada também faz contato com o antígeno de ENTPD2. Os resíduos de CDR1 de cadeia leve envolvidos em ligação a ENTPD?2 incluem Tyr31, Asp32, Gly33 e Tyr36 assim como resíduos de cadeia leve de CDR2 Glu59, Ser60, e resíduos de CDR3 Ser95, Asn96 e Asp 98. Glu1 cuja cadeia lateral é desordenada e não modelada em estrutura complexa adicionalmente a GIy61 de FR3 está dentro da distância de contato de glicosilação N-ligada observada para Asn294 de antígeno de ENTPD2 e destacada na Figura 3A.

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Exemplo 6. Cristalografia e mapeamento de epítopo de FAb23 de ENTPD?2 anti-humano

[00774] Nesse Exemplo, o FAb23 de ENTPD?2 anti-humano foi cris- talizado em complexo com ectodomínio de ENTPD2 humana (mutante Y350A) e a estrutura correspondente foi determinada. A análise de |li- gação de FAb23 de ENTPD?2 anti-humano a ENTPD2 humana com base em dados de raios X forneceu detalhes moleculares de engate de antígeno e conhecimentos sobre os parátopos Fab e epítopos de antígeno descritos. Materiais e Métodos Preparação de complexo de ENTPD2 humana e FAb23 de ENTPD2 anti-humano

[00775] Para preparar o complexo de ENTPD2-FAb23, um excesso molar de 1,6 vez de ENTPD?2 foi combinado com o FAb23 em Tris 20 mM pH 7,5 com NaCl 100 mM e concentrado a 9,08 mg/ml por ultrafil- tração, incubado em gelo por 10 minutos e submetido a configurações de teste de cristalização. Cristalização e coleta de dados de raios X

[00776] O FAb23 antichnENTPD2 em complexo com mutante Y350A de ENTPD2 humana foi cristalizado em placas de 96 poços (Greiner Bio-One) pelo método de difusão de vapor em gotas sentadas, a 20 ºC. Em detalhes, 0,2 ul de estoque de proteína foi misturado com 0,2 ul de solução de reservatório, e a gota foi equilibrada contra 50 ul da mesma solução de reservatório a 20 ºC. Os experimentos foram confi- gurados com um sistema robótico Phoenix (Art Robbins Instruments) e armazenados em imageador e pórtico de cristal geneticamente modifi- cados personalizados internos (sistema interno Novartis GNF).

[00777] Para coleta de dados de raios X, um cristal foi diretamente montado em uma crio-alça e resfriado rapidamente em nitrogênio |í- quido. Os dados de raios X foram coletado na Fonte de Luz Avançada,

BL5.03, com detector de CCD Quantum Q315r, com o uso de radiação por raios X de 0,9765À. 140 imagens de oscilação de 1.0º cada foram registradas a uma distância entre cristal e detector de 300mm e pro- cessadas com HKL2000 (Z. Otwinowski e W. Minor, "Processing of X- ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode", Methods in Enzymology, Volume 276: Macromolecular Crystallography, parte A, páginas 307 a 326, 1997,C.W. Carter, Jr. & R. M. Sweet, Eds., Aca- demic Press (New York). Determinação e Análise de Estrutura

[00778] A estrutura do complexo de FAb23-ENTPD? foi determina- da por substituição molecular com o programa Phaser (McCoy et al., 2007, J Appl Crystallogr 40:658 a 674), com o uso das coordenadas refinadas de ENTPD2 humana anteriormente determinadas interna- mente e um modelo de homologia do FAb23 gerado com a ferramenta de modelador de anticorpo em software MOE (Molecular Operating Environment (MOE), 2013.08; Chemical Computing Group ULC, 1010 Sherbooke St. West, Pacote nº 910, Montreal, QC, Canadá, H3A 2R7, 2018) que mostrou alta similaridade de sequência com o fragmento Fab de ICSM 18 - anti-PRP (código PDB 4W9D) como modelos de pesquisa independentes. A estrutura foi refinada com o uso de ciclos iterativos de construção de modelo seguidos por refinamento cristalo- gráfico automatizado com os programas Coot 0.8.0 (Crystallographic Object-Oriented Toolkit; Emsley et al., 2010, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486 a 501) e Autobuster 2.11.5 (Bricogne et al., 2011, BUSTER versão 2.11.2. Cambridge, Reino Unido: Global Pha- sing Ltd.).

[00779] A inspeção visual da estrutura de cristal foi executada com o uso dos programas Coot (Emsley et al., 2010, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486 a 501) e PyYMOL (Molecular Graphics Sys- tem; DeLano Scientific: Palo Alto, CA). A qualidade dos modelos refi-

nados finais foi avaliada com os programas Coot e PROCHECK v3.3 (Laskowski et al., 1992, J App! Crystallogr; 26:283 a 291). Resíduos de ENTPD2 humana que se tornaram menos acessíveis a solvente medi- ante ligação do Fab MAB17 de ENTPD?2 anti-humano foram identifica- dos pelo programa AREAIMOL do pacote de programa CCP4 (Colla- borative Computational Project, Número 4, 1994). Os contatos intermo- leculares foram definidos com o uso de uma distância de corte de 4,0À e foram identificados com o programa CCP4 NCONT. Resultados Estrutura de Cristal do complexo de FAb23 anti-hENTPD2/ENTPD2

[00780] O FAb23 anti-chnENTPD2 em complexo com mutante Y350A de ENTPD2 humana foi cristalizado em placas de 96 poços pelo mé- todo de difusão de vapor em gotas sentadas, a 20 “ºC. Os cristais cres- ceram em Bis-Tris propano 0,08 M pH 8,8, ácido cítrico 0,02 M, 16% de PEG3350. Os cristais apareceram após aproximadamente 6 sema- nas e cresceram até tamanho completo dentro de alguns dias.

[00781] O cristal do complexo de FAb23-ENTPD?2 estava no grupo de espaço monoclínico P21, com um complexo por unidade assimétri- ca. Um conjunto de dados de difração completa foi coletado para o complexo até resolução de 2,0 Angstrom. O modelo final para o FAb23 em complexo com ENTPD? foi refinado com AutoBuster com boas es- tatísticas de refinamento e geometria geral. Um total de quatro valores discrepantes de Ramachandran estavam presentes no modelo final com dois resíduos da cadeia leve de FAb23 (Ser39 e Thr50) e dois de ENTPD?2 (Thr122 e Ala430). A densidade de elétron foi ruim para Ser39 da cadeia leve de Fab e modelada provisoriamente. Todos os outros resíduos foram adequadamente definidos na densidade de elé- tron e valores discrepantes de Ramachandran provavelmente genuí- nos. Os resíduos de ENTPD2 omitidos do modelo final incluem os re- síduos 29 a 34 da terminação N e os resíduos além de 448 da termi-

nação C. Os resíduos 139 a 144 da região constante da cadeia de FAb23 e a cisteína terminal (Cys227) foram também omitidos do mo- delo final. Os dois últimos resíduos da cadeia leve de FAb23 (Glu212 e Cys213) também estavam ausentes do modelo final devido ao distúr- bio.

[00782] As sequências de aminoácidos da cadeia pesada e cadeias leves de FAb23 de ENTPD?2 anti-humano são fornecias na Figura 3B, com as CDRs sublinhadas (conforme definido por Kabat, 1991, Se- quences of proteins of immunological interest, Publicação NIH nº 91 a

3.242) e resíduos localizados na interface Fab-antígeno identificados com *. Uma vista geral da estrutura tridimensional do complexo de FAb23/Y350A de ENTPD? é representada na Figura 7.

[00783] Em contrapartida a FAb22, a ligação do FAb23 a ENTPD2 envolve engate significativo de ambos os lóbulos proximal e distal da membrana por ambos os domínios variáveis de cadeia pesada e leve. As alças de região variável de cadeia pesada CDR2 e CDR3 partici- pam na ligação de ENTPD2, sem nenhuma contribuição de CDR1. Os resíduos de todas as 3 CDRs da região variável de cadeia leve estão envolvidos na ligação de ENTPD?2. Os contatos com o lóbulo distal da membrana de ENTPD2 são amplamente conferidos por resíduos de CDR3 de cadeia pesada, CDR2 de cadeia leve e resíduos FR3 de ca- deia leve que se ligam a resíduos dos resíduos de região de alça de ENTPD?2 entre a13 e a14, assim como interações de FR3 com fitas antiparalelas B10/B11 e hélice a9. Os resíduos de cadeia leve de CDR3 e cadeia pesada de CDR2 conferem ligação extensiva a resí- duos de alça e hélice a2 que conectam B3 e a1 do lóbulo proximal de membrana de ENTPD2. CDR3 de cadeia pesada projeta os resíduos terminais Tyr104, Tyr105 e GIy106 na fenda de sítio ativo de ENTPD2 entre extremidades N-terminais de hélices a8, a11 e a14 do lóbulo dis- tal de membrana. A superposição do análogo de ATP AMP-PNP da estrutura de cristal de ENTPD2 de rato liada PDB 3CJA sugere que Tyr105 está posicionado onde seria previsto que o anel de adenina da ATP se ligaria, potencialmente obstruindo de modo estérico a ligação de substrato.

Tyr105 e Tyr104 da terminação de CDR3 de cadeia pe- sada pode também perturbar resíduos de sítio ativo de ENTPD?2, inclu- indo Tyr350 e Arg394 necessários para interações de empilhamento de TI-TT e cátion-tr com o anel de adenina de ATP de substrato.

A liga- ção do FAb23 à ENTPD?2 oculta aproximadamente 17.500 À2 da su- perfície acessível por solvente combinada.

Os resíduos de epítopo e parátopo envolvidos em contatos intermoleculares diretos calculados dentro de um corte de distância de 4,0À são listados na Tabela 18 e identificados nas Figuras 3B e 4A. 25 resíduos de Fab e 29 resíduos de ENTPD?2 estavam envolvidos em contatos intermoleculares diretos.

Os resíduos de cadeia pesada Tyr55, lle57, Thr59, GIn62 de CDR?2, assim como Phe102, Tyr105, lle107, Tyr110 de CDR3 contribuem para a ligação de ENTPD2 sem nenhuma contribuição de resíduos CDR1. Os resíduos de cadeia leve que contribuem para ligação de ENTPD2 incluem Ser27 e Tyr31 de CDR1, Ser49 e Asn52 de CDR?2, e Trp90, Ser91, Ser92, Tyr93 e Trp95 de CDR3. Os resíduos de cadeia leve não CDR que contribuem para ligação de ENTPD?2 incluem Glu1, que é observado e modelado como piroglutamato na estrutura de cristal, Thr22 de FR1, e Ser64, GIy65, Ser66, Gly67, Thr68 e Phe69 de FR3. TABELA 18. Resíduos de Epítopo e parátopo FAb23 /ENTPD?2 hu- mana contato asa O e eo

Br Ser91L, Ser92L, Tyr93L L-CDR3 alça a1-02 |ASp87 Ser27L L-CDR1 jasnãs eua, Tyro3L L-FR1, L-CDR3 a2 Ga TyroaL L-CDR3 GInga4 GIn62H, Tyra3L H-CDR2, L-CDR3 jserss == nes L-CDR3 GIy98 lle57H, Thr59H H-CDR2 Glu101 lle57H H-CDR2 GIn1o2 Tyr55H, Nle57H H-CDR2 GIn1o5 Tyr55H, Nle57H H-CDR2 |Asp106 Tyr55H H-CDR2 ja8 Arg Tyr104H, Tyr105H H-CDR3 B10 Thr272 (Ser64L, GIy65L L-FR3 Gin273 Phe69L L-FR3 Leu275 Thr68L, Phe6o9L L-FR3 ja o jAspo7e Ser66L, GIy67L, Thr68L, Phe69L |L-FR3 Bm Argos Thr22L, Phe69L L-FR1, L-FR3 alça B12-011 Ala347 Tyr105H H-CDR3 a11 |Ala350 Tyr105H H-CDR3 Thr351 Tyr105H H-CDR3 alça a13-014 |Arg392 Asn52L L-CDR2 Ala393 Phe102H, Tyr104H, Ser49L H-CDR3, L-CDR2 [Arg394 Tyr104H, Tyr31L H-CDR3, L-CDR1 a yes Tyr104H, Tyr105H H-CDR3 |As listas de resíduos de epítopo e parátopo em contato direto foram derivadas das coorde- nadas refinadas finais com o programa de CCP4 NCONT, com o uso de um corte de dis- tância de 4,0À. Exemplo 7. Cristalografia e mapeamento de epítopo de FAb24 de ENTPD?2 anticamundongo

[00784] Nesse Exemplo, o Fab MAB13 de ENTPD?2 antimurino foi cristalizado em complexo com ectodomínio de ENTPD2 murina e a estrutura correspondente foi determinada. A análise de ligação de FAb24 de ENTPD?2 anticamundongo a ENTPD2 murina com base em dados de raios X forneceu detalhes moleculares de engate de antíge- no e conhecimentos sobre os parátopos Fab e epítopos de antígeno descritos.

Materiais e Métodos Preparação de complexo de ENTPD2 murina e FAb24 de ENTPD2 anticamundongo

[00785] Para preparar o complexo de FAb24 de ENTPD2 murina, ENTPD?2 murina e FAb24 em Tris 20 mM pH 7,5 com NaCl 100 mM foram combinados em razão molar de 1:1, incubados em gelo a 4 graus Celcius de um dia para o outro. Na manhã seguinte, a amostra foi concentrada até 9,88 mg/ml por ultrafiltração e submetida a configu- rações de teste de cristalização. Cristalização e coleta de dados de raios X

[00786] O FAb24 de ENTPD2 anticamundongo em complexo com mutante Y350A de ENTPD? foi cristalizado em placas de 96 poços (Greiner Bio-One) pelo método de difusão de vapor em gotas sentadas, a ºC. Em detalhes, 0,2 ul de estoque de proteína foi misturado com 0,2 ul de solução de reservatório, e a gota foi equilibrada contra 50 ul da mesma solução de reservatório a 20 ºC. Os experimentos foram configu- rados com um sistema robótico Phoenix (Art Robbins Instruments) e ar- mazenados em imageador e pórtico de cristal geneticamente modifi- cados personalizados internos (sistema interno Novartis GNF).

[00787] Para coleta de dados de raios X, um cristal foi diretamente montado em uma crio-alça e resfriado rapidamente em nitrogênio |í- quido. Conjuntos de dados de raios X foram coletados no SSRL, linha de feixe 7-1, com o uso de radiação por raios X 1,1808Ã, equipado com um detector de CCD ADSC Quantum 315r. 340 imagens de osci- lação de 0.5º cada foram registradas a uma distância entre cristal e detector de 400mm e processadas com HKL2000 (Z. Otwinowski e W. Minor, "Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode", Methods in Enzymology, Volume 276: Macromolecular Crystallography, parte A, páginas 307 a 326, 1997,C.W. Carter, Jr. & R. M. Sweet, Eds., Academic Press (New York).

Determinação e Análise de Estrutura

[00788] A estruturado complexo de FAb24-ENTPD2 de camundon- go foi determinada por substituição molecular com o programa Phaser (McCoy et al., 2007, J Appl Crystallogr 40:658 a 674), com o uso das estruturas refinadas de ENTPD2 murina e FAb24 anteriormente de- terminadas internamente como modelos de pesquisa independentes. À estrutura foi refinada com o uso de ciclos iterativos de construção de modelo seguidos por refinamento cristalográfico automatizado com os programas Coot 0.8.0 (Crystallographic Object-Oriented Toolkit; Ems- ley et al., 2010, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486 a 501) e Autobuster 2.11.5 (Bricogne et al., 2011, BUSTER versão 2.11.2. Cambridge, Reino Unido: Global Phasing Ltd.).

[00789] A inspeção visual da estrutura de cristal foi executada com o uso dos programas Coot (Emsley et al., 2010, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486 a 501) e PyYMOL (Molecular Graphics Sys- tem; DeLano Scientific: Palo Alto, CA). A qualidade dos modelos refi- nados finais foi avaliada com os programas Coot e PROCHECK v3.3 (Laskowski et al., 1992, J App! Crystallogr; 26:283 a 291). Resíduos de ENTPD2 murina que se tornaram menos acessíveis a solvente medi- ante ligação do FAb24 de ENTPD?2 anticamundongo foram identifica- dos pelo programa AREAIMOL do pacote de programa CCP4 (Colla- borative Computational Project, Número 4, 1994). Os contatos intermo- leculares foram definidos com o uso de uma distância de corte de 4,0À e foram identificados com o programa CCP4 NCONT.

[00790] A estrutura do complexo de FAb24-ENTPD2 de camundon- go foi determinada por substituição molecular com o programa Phaser (McCoy et al., 2007, J Appl Crystallogr 40:658 a 674), com o uso das estruturas refinadas de ENTPD2 murina e FAb24 anteriormente de- terminadas internamente como modelos de pesquisa independentes. À estrutura foi refinada com o uso de ciclos iterativos de construção de modelo seguidos por refinamento cristalográfico automatizado com os programas Coot 0.8.0 (Crystallographic Object-Oriented Toolkit; Ems- ley et al., 2010, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486 a 501) e Autobuster 2.11.5 (Bricogne et al., 2011, BUSTER versão 2.11.2. Cambridge, Reino Unido: Global Phasing Ltd.). Resultados Estrutura de Cristal do complexo de FAb24 de ENTPD2 anticamun- dongo/ENTPD2 de camundongo

[00791] O FAb24 de ENTPD2 anticamundongo em complexo com ENTPD?2 murina foi cristalizado em placas de 96 poços pelo método de difusão de vapor em gotas sentadas, a 20 ºC. Os cristais cresceram em citrato de amônio 0,2 M pH 7,0, 20% de PEG3350. Os cristais apa- receram após aproximadamente 1 mês e cresceram até o tamanho completo dentro de alguns dias.

[00792] O cristal de complexo de FAb24-ENTPD2 de camundongo estava no grupo de espaço monoclínico P21, com um complexo por unidade assimétrica. Um conjunto de dados de difração completa foi coletado para o complexo até resolução de 3,0 Angstrom. O modelo final para o FAb24 em complexo com ENTPD2 de camundongo foi re- finado com AutoBuster com boas estatísticas de refinamento e geome- tria geral. Dois valores discrepantes Thr122 de ENTPD2 de camun- dongo e Ala57 do FAb24 estavam presentes no modelo final, ambos os quais foram bem definidos em densidade de elétron. Asn129 e Asn378 foram os únicos resíduos em que a glicosilação N-ligada foi observada. Glu1 da cadeia pesada de FAb24 foi observado e modela- do como piroglutamato. Os resíduos de ENTPD2 de camundongo omi- tidos do modelo final incluem os resíduos 29 a 35 da terminação N, 61 a 66 correspondentes aos resíduos de alça que conectam as fitas 82 e B3, os resíduos 182 a 194 correspondentes à alça de interação de membrana (MIL), resíduos de alça 290 a 293 entre a9 e 811 e resí-

duos C-terminais além de Ala450. Todos os resíduos de cadeia pesa- da e leve do FAb24 foram incluídos no modelo refinado final exceto pela cisteína terminal da Cys225 de cadeia pesada.

[00793] As sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve de FAb24 de ENTPD2 anticamundongo são fornecias na Figura 3C, com as CDRs sublinhadas (conforme definido por Kabat, 1991, Se- quences of proteins of immunological interest, Publicação NIH nº 91 a

3.242) e resíduos localizados na interface Fab-antígeno identificados com *. Uma vista geral da estrutura tridimensional do complexo de FAb24/mENTPD? é representada na Figura 8.

[00794] FAb24 de ENTPD2 anticamundongo se encaixa predomi- nantemente ao lóbulo distal da membrana presumida (resíduos G162- E426) do antígeno de ENTPD2. Uma contribuição igual à ligação de ENTPD? é observada para resíduos de CDR dos domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve.

[00795] Em comparação com a ligação de FAb22 e FAb23 à EN- TPD2 humana, o FAb24 se encaixa com a ENTPD2 murina de um di- reção completamente diferente ortogonal a que é observada em com- plexos de FAb22 e FAb23 com hENTPD?2. O FAb24 se liga predomi- nantemente com o lóbulo distal da membrana de ENTPD2 murina através de interações de CDR de cadeia pesada extensivas e relati- vamente poucas interações de CDR de cadeia leve. Os resíduos de CDR1 e CDR3 de cadeia pesada em conjunto com resíduos de CDR1 e CDR2 de cadeia leve se ligam a hélices a11 e a13 de MENTPD?2. Os resíduos de CDR2 de cadeia pesada realizam interações com os resí- duos de alça interconectantes entre a13 e a14. A cadeia pesada de CDR3 é observada em uma conformação em que está dobrada quase 90 graus e adota um motivo de volta B curto em sua extremidade ter- minal. Dois resíduos da cadeia pesada de FR3 realizam contatos úni- cos com o lóbulo proximal de ENTPD2 de camundongo através de in-

terações com B3 da folha antiparalela com 5 fitas.

Nenhuma CDRs de MAB13 mostrou se estender o suficiente no sítio de ENTPD2 de ca- mundongo para afetar a atividade de hidrólise de ATP através de obs- trução direta do sítio de ligação de substrato.

A ligação do FAb24 à ENTPD2 murina oculta aproximadamente 16.300 À2 da superfície acessível por solvente combinada total.

Os resíduos de epítopo e pa- rátopo envolvidos em contatos intermoleculares diretos calculados dentro de um corte de distância de 4,0À são listados na Tabela 19 e identificados nas Figuras 3C e 4B. 22 resíduos de Fab e 18 resíduos de ENTPD2 murina estavam envolvidos em contatos intermoleculares diretos e compreendem o parátopo e o epítopo observados em encai- xe de Fab/ENTPD?2. Os resíduos de CDR de cadeia pesada incluem CDR1 Thr28, Thr30, His31, Tyr32 e Gly33; CDR2 Trp50, Asn52, Thr53 e Asp54, Thr55; CDR3 Tyr99, GIy100, Thr101, Leu102, Tyr103 e Phe110. Dois resíduos de FR3 Thr74 e Ser75 da cadeia pesada tam- bém contribuem para a ligação.

Os resíduos de CDR de cadeia leve que contribuem para ligação incluem Thr34 e Lys36 de CDR1, Tyr56 de CDR?2 e Trp97 de CDR3. TABELA 19. Resíduos de Epítopo e parátopo FAB24 /ENTPD2 de camundongo Epítopo de ENTPD2 de camun-|Parátopo de FAb24 de ENTPD2 anticamundongo dongo Elemento estrutural [Resíduos de — [Resíduos de contato Elemento estrutural contato ão 11

Thrã57 Tyr32H H-CDR1

Thr101H, Leu102H, Tyr103H H-CDR3 Val358 Tyr32H H-CDR1 Thr101H, Tyr103H H-CDR3

Epítopo de ENTPD2 de camun-|Parátopo de FAb24 de ENTPD2 anticamundongo dongo alça a11-012 Gly360 Tyr103H H-CDR3 a13 GIn385 Thr34L L-CDR1 Ala386 Phe110H H-CDR3 Lys36L L-CDR1 Tyr56L L-CDR2 [Arg387 GIy100H, Thr101H H-CDR3 alça a13-014 Val388 His31H H-CDR1 Pro389 Tyro9H, Gly100H, Phe110H H-CDR3 Trpg7L L-CDR3 GIy390 Trp5oH H-CDR2 GIn391 Thr30H, Tyr32H, Gly33H H-CDR1 Trp50H, Asn52H, Thr53H, Asp54H |H-CDR2 Thrã93 |ASp54H, Thr55H H-CDR2 [Arg394 |Asp54H H-CDR2 atá yes His31H H-CDR1 As listas de resíduos de epítopo e parátopo em contato direto foram derivadas das coordena- das refinadas finais com o programa de CCP4 NCONT, com o uso de um corte de distância de 4,0. Exemplo 8. Inibição de crescimento tumoral por MAB13 anti- ENTPD2 em combinação com um Ab anti-PD-1 no modelo de tu- mor B16LM3 singeneico

[00796] O modelo B16LM3 foi estabelecido em camundongos C57BL/6 fêmeas por injeção subcutânea de 0,5x106 células no flanco direito de cada camundongo. No dia após o implante, os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento (n=10 por grupo). Os camundongos receberam tratamentos de mAb13 de ENTPD?2 antica- mundongo ou um controle de isotipo mlgG2a não específico (clone MOPC-173, BioLegend, San Diego, CA) a uma dose final de 15 mg/kg no Dia 1, 5, 8, 12, 15.

[00797] Ab anti-PD-1 (clone RMP1-14 Bio X Cell, West Lebanon, NH) ou controle de isotipo rlgG2a mão específico (clone RTK2758, Bi- oLegend, San Diego, CA) foram entregues i.p. a uma dose final de 10 mg/kg nos dias 1, 5, 8, 12, 15. Todas as doses foram ajustadas aos pesos corporais individuais dos camundongos.

[00798] Todos os agentes de teste foram tolerados no estudo e não foram observados sintomas clínicos evidentes de toxicidade ou perda de peso corporal em qualquer dos grupos de tratamento. A combina- ção de mAb13 de ENTPD2 anticamundongo com tratamento com Ab anti-PD-1 estendeu significativamente a sobrevida em relação a Sem Tratamento (p<0,005), Controle de Isotipo (p<0,05) ou Ab anti-PD-1 (p<0,01) (teste Log-rank (Mantel-Cox) foi usado para determinar se as curvas de sobrevida eram significativamente diferentes)) (Figura 9). Exemplo 9. Tratamento de combinação de mAb13 anti-ENTPD2 com Ab anti-PD-1 modelo de tumor B16F10 singeneico induz in- fluxo de tumor de células T ativadas

[00799] O modelo B1I6F10 foi estabelecido em camundongos C57BL/6 fêmeas por injeção subcutânea de 0,5x10º células no flanco direito de cada camundongo. No dia 7, quando os tumores atingiram cerca de 30 mmº?, os camundongos foram randomizados de acordo com o volume do tumor em grupos de tratamento (n= 10 por grupo). Os camundongos receberam tratamento de mAb13 de ENTPD?2 anti- camundongo a uma dose a final de 15 mg/kg, Ab anti-PD-1 (clone RMP1-14 Bio X Cell, West Lebanon, NH) i.p. a uma dose final de 10 mg/kg ou a combinação de ambos os tratamentos nos dias 1, 5 e 8. Todas as doses foram ajustadas aos pesos corporais individuais dos camundongos.

[00800] “Nenhuma eficácia antitumoral significativa foi observada após o tratamento com mAb13 de ENTPD2 anticamundongo ou Ab anti-PD-1 sozinho, entretanto, uma redução significativa em cresci- mento tumoral em relação ao controle Sem Tratamento foi observada no braço de combinação de mAb13 de ENTPD?2 anticamundongo e Ab anti-PD-1 (p<0,05 ANOVA de um fator / Teste de Comparações Múlti- plas de Tukey) (Figuras 10A-10B).

[00801] Afim de entender o impacto dos tratamento no microambi- ente tumoral, os camundongos foram eutanizados no dia 8 e os tumo-

res foram dissociados em meio HyClone RPMI1I640 (GE Healthcare, Pittsburg, PA) com o uso de tubos em C gentleMacs (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) no Dissociador gentleMacs Octo (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Aproximadamente 2x10º células tumorais dissociadas foram blo- queadas com Ab de CD16/CD32 anticamundongo de rato (Biolegend, San Diego, CA) para reduzir a ligação de FcyRIll/ll não específica e subsequentemente manchadas com o seguinte coquetel de Abs: CD45-BUV395 anticamundongo de rato (clone 30-F11) (BD Bioscien- ces, San Jose, CA), CD8a-BUV737 anticamundongo de rato (clone 53-

6.7) (BD Biosciences, San Jose, CA), CD4-BV510 anticamundongo de rato (clone RM4-5) (BD Bioscience, San Jose CA), CD69-PercPCy5.5 anticamundongo (clone H1-2F3) (Biolegend, San Diego, CA) e CD25- eFluor450 anticamundongo de rato (clone eBio3C7) (eBioscience, San Diego, CA) nas diluições recomendadas pelos fabricantes. Todas as incubações e lavagens foram realizadas em Tampão FACS composto por 1x Solução salina tamponada com fosfato HyClone (GE Healthca- re, Pittsburg, PA), 1% de Soro fetal bovino HyClone (GE Healthcare, Pittsburg, PA), EDTA 2 mM (ThermoFisher, Waltham MA). Após o man- chamento com o coquetel de anticorpo de antígeno de superfície celular, células tumorais dissociadas foram lavadas em tampão FACS, fixadas e permeabilizadas com o uso do Kit eBioscience Foxp3/Transcription Fac- tor Staining Buffer (ThermoFisher, Waltham MA) para permitir o man- chamento intracelular com o FOXP3-eFluor660 anticamundongo de rato (clone 150D/E4) (eBioscience, San Diego, CA).

[00802] “Um influxo significativo de células T CD4 auxiliares ativadas (definidas como CD45+ CD8- CD4+ FOXP3- CD69+ CD25+) (aumento de 7,0 vezes versus Nenhum tratamento, p<0,0001 ANOVA de uma via / Teste de Comparações Múltiplas de Tukey) e células T CD8 (de- finidas como CD45+ CD4- CD8+ CD69+ CD25+) (alteração de 5,8 ve- zes versus Nenhum tratamento, p<0,05 ANOVA de uma via / Teste de

Comparações Múltiplas de Tukey) foi observado com o tratamento de combinação de Ab Anti-PD-1 e mAb13 de ENTPD2 Anticamundongo em relação a todos os outros grupos de tratamento (Figura 10C). Exemplo 10. Eficácia in vivo dependente de dose de mAb1 e mAb6 de ENTPD2 anti-humano em combinação com Ab anti-PD-1 no modelo de xenoenxerto B16LM3 geneticamente modificado de ENTPD2 humana em camundongos C57BL/6.

[00803] “Para demonstrar a atividade antitumoral alvejada de Abs de ENTPD?2 anti-humano in vivo, um modelo geneticamente modificado de ENTPD2 humana foi desenvolvido, B16LM3 clone 5. Esse modelo foi derivado do modelo de melanoma B16LM3, em que a expressão de ENTPD?2 de camundongo endógena sofreu knockout por meio de uma eletroporação temporária da proteína CAS9 com sequências de RNA- guia de CRISPR contra ENTPD2 de camundongo, e ENTPD2 humana foi superexpressa com o uso de uma abordagem de transdução retro- viral. A expressão de ENTPD2 humana no modelo foi confirmada in vitro por FACS com o mAb17 de ENTPD?2 anti-humano seletivo de ENTPD2 humana. mAb13 de ENTPD2 anticamundongo seletiva de ENTPD?2 de camundongo foi usada para demonstrar o knockout com- pleto de ENTPD2 de camundongo endógeno (Figura 11A). B5 de clo- ne B16LM3 demonstrou cinética de crescimento comparável à linha- gem parental e expressão de ENTPD2 humana sustentada no hospe- deiro singeneico (Figura 11B).

[00804] O modelo de B5 de clone B16LM3 geneticamente modifica- do de ENTPD2 humana foi estabelecido em camundongos C57BL/6 fêmeas por injeção subcutânea de 0,5x10º células no flanco direito de cada camundongo. Quando os tumores atingiram cerca de 35 a 50 mm?, os camundongos foram randomizados de acordo com o volume do tumor em grupos de tratamento (n= 8 por grupo). Os camundongos receberam um tratamento i.v. de mMAb1 ou mAb6 de ENTPD?2 anti-

humano a uma dose final de 0,1, 1 ou 10 mg/kg ou um controle de iso- tipo I9G1 humano não específico 10 mg/kg no dia 1 do estudo. Ab anti- PD-1 (clone RMP1-14 Bio X Cell, West Lebanon, NH) foi dosado i.p. a uma dose final de 10 mg/kg em D1 D5. Todas as doses foram ajusta- das aos pesos corporais individuais dos camundongos. Todos os agentes de teste foram tolerados no estudo e não foram observados sintomas clínicos evidentes de toxicidade ou perda de peso corporal em qualquer um dos grupos de tratamento (Tabela 23).

[00805] “Nenhuma eficácia antitumoral significativa foi observada após o tratamento com mAb1 ou mAb6 de ENTPD?2 anti-humano como agentes únicos ou a combinação do controle de isotipo não específico e Ab anti-PD-1. O regime de combinação de mAb1 de ENTPD? anti- humano com Ab anti-PD-1 (dose fixa de 10 mg/kg) demonstrou um efeito antitumoral dependente de dose com valor de AT/AC de 18,4% (10 mg/kg), 35,7% (1 mg/kg) e 33,4% (0,1 mg/kg). Similarmente, o re- gime de combinação de mAb6 de ENTPD?2 anti-humano com Ab anti- PD-1 (dose fixa de 10 mg/kg) também demonstrou um efeito antitumo- ral dependente de dose com valor de AT/AC de 29,2% (10 mg/kg), 27,3% (1 mg/kg) e 41,0% (0,1 mg/kg) (Tabela 23 e Figuras 12A-12B).

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Exemplo 11. Atividade de mAb de ENTPD2 anti-humano no mode- lo de xenoenxerto de B5 de clone B16LM3 geneticamente modifi- cado com ENTPD2 humana em camundongos C57BL/6

[00806] A fim de entender o impacto imediato do bloqueio de EN- TPD?2 da perspectiva de engate de trajetória imunológica, plasma e tumores B5 de clone B16LM3 (volume tumoral médio -170 mm?) fo- ram coletados de camundongos C57BL/6 24 horas após o tratamento com mAb1 de ENTPD?2 anti-humano ou Controle de Isotipo a 10 mg/kg. mAb1 de ENTPD?2 anti-humano não tem reação cruzada de ENTPD2 de camundongo, então, qualquer modulação de citocina na periferia seria reflexiva de alterações no microambiente tumoral.

[00807] Em suma, plasma foi isolado por meio da coleta de sangue em tubos Microvette MV-H-300 Capillary Plasma Lithium Heparin Blo- od Collection (Sai Infusion technologies, Lake Villa, IL), que foram cen- trifugados a 1.000 a 2.000 Xg por 10 min. Amostras de plasma foram armazenadas a -80 “C até o uso. Amostras do tumor foram cirurgica- mente extirpadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. O tecido tumoral foi, então, homogeneizado no Reagente de Extração de Proteína de Tecido T-PER (ThermoFisher, Waltham, MA) com o uso do instrumento TissueLyser (Qiagen, Alemanha). As amostras de lisado de tumor foram centrifugadas a 11.000 rpm por 15 min, e os so- brenadantes foram coletados para análise de concentrações de prote- Ína com o uso do Kit Pierce BCA Protein Assay (ThermoFisher, Wal- tham, MA). 200 ug de proteína ou 25 ul de plasma não diluído foram usados para análise de citocina com o uso do Kit V-PLEX Mouse Cytokine 29-Plex (MSD, Rockville, MD) de acordo com as recomenda- ção do fabricante.

[00808] Uma diminuição significa em MCP1 plasmático (p<0,05 Teste T não Pareado), acompanhada por um aumento de aproxima- damente 2 vezes em MCP1 no sítio tumoral foi observada com trata-

mento com mAb1 de ENTPD?2 anti-humano (Figuras 13B e 13D), refle- tindo potencialmente o engate e recrutamento de células mieloides ao sítio tumoral. Adicionalmente, uma diminuição de aproximadamente 2 vezes de IL-18 foi observada no plasma de animais tratados com mAb1 de ENTPD?2 anti-humano (p=0,05 Teste T não Pareado) e uma tendência sugerindo uma redução paralela no sítio tumoral (Figuras 13A e 13C). Exemplo 12. Atividade de mAb de ENTPD2 anti-humano em com- binação com antagonista de A2AR no modelo de xenoenxerto de B5 de clone B16LM3 geneticamente modificado com ENTPD2 hu- mana em camundongos C57BL/6

[00809] B5 de clone B1I16LM3 geneticamente modificado de EN- TPD2 humana foi estabelecido em camundongos C57BL/6 fêmeas por injeção subcutânea de 0,5 x 1086 células no flanco direito de cada ca- mundongo. Quando os tumores atingiram cerca de 50 mm?, os ca- mundongos foram randomizados de acordo com o volume do tumor em grupos de tratamento (n= 8 por grupo). Os camundongos recebe- ram um tratamento intravenoso (i.v.) de mAb1 anti-ENTPD2 a uma do- se final de 10 mg/kg ou um controle de isotipo IIG1 humano não es- pecífico 10mg/Kkg no dia 1 do estudo. NIR1I78 foi administrado por os (p.o.) por 4 dias sim e 3 dias não, iniciando no começo do estudo em 50 mg/kg ou 200 mg/kg. Todas as doses foram ajustadas aos pesos corporais individuais dos camundongos. O estudo foi executado por treze dias após o início do tratamento, e os volumes tumorais foram avaliadas em dias alternados para avaliar a eficácia. Todos os agentes de teste foram tolerados no estudo e não foram observados sintomas clínicos evidentes de toxicidade ou perda de peso corporal em qual- quer um dos grupos de tratamento (Tabela 27). Tabela 27. Eficácia in vivo de Ab de ENTPD2 anti-humano e anta- gonista de APAR em modelo de xenoenxerto de B5 de clone

B16LM3 geneticamente modificado com ENTPD2 humana no Dia 13 de tratamento. ENTPD2 anti NIR178 ou Veí-|Resposta |Resposta do Hospe- humana ou culo iTumoral [deiro mMAb de isotipo IA peso Dose, — crono-|Dose, crono-| Sobrevida Tratamento [AT/AC (%) corporal | grama grama (vivo/total) [(%) pense fe fem | e mg/kg, Veículo + Isotipo hlgG1 14d SIM/3d NÃO -2,0 6/8 dosado D1 10 mg/kg, 50 mg/kg, NIR178 + Isotipo hlgG1 a 99 123,6 -1,4 7/8 dosado D1 [4d SIM/8d NÃO 10 mg/kg, 1200 mg/kg, NIR178 + Isotipo hlgG1 a 99 93,3 -2,5 6/8 dosado D1 [4d SIM/8d NÃO NIR1I78 + mAb1 del10 mg/kg, 50 mg/kg, gh 9 61,6 1,3 EE) ENTPD? anti-humano Jdosado D1 [4d SIM/83d NÃO O experimento foi avaliado no Dia 13 de tratamento. % AT/AC = 100 AT/AC em que: AT =| Ivolume tumoral médio do grupo tratado com fármaco em D13 do estudo - volume tumoral médio do grupo tratado com fármaco no dia inicial da dosagem; AC = volume tumoral médio)| Ido grupo de controle em D13 do estudo - volume tumoral médio do grupo de controle no dia| inicial de dosagem D1. A peso corporal (%) = (peso corporal médio D28-peso corporal mé-| dio D1) *100 / Peso médio D1 de tratamento.

[00810] “Nenhuma eficácia antitumoral significativa foi observada após o tratamento com a combinação do controle de isotipo não espe- cífico e o antagonista de A2AR, NIR178, em 50 ou 200 mg/kg. O regi- me de combinação de mAb1 anti-ENTPD2 (10 mg/kg) com NIR178 (50 mg/kg) demonstrou um efeito antitumoral com valor de T/AC de 61,6% (Tabela 27 e Figura 14). Esses dados sugerem que há eficácia antitumo- ral aumentada ao bloquear múltiplos nódulos na trajetória de adenosina. Exemplo 13. Avaliação de Abs Anti-ENTPD2 nos ensaios funcio- nais bioquímicos e baseados em célula

[00811] Ensaios funcionais bioquímicos e baseados em célula fo- ram desenvolvidos internamente para entender o impacto funcional de

Abs anti-ENTPD?2 contra o domínio extracelular purificado de ENTPD2 (resíduos 29 a 462), assim como contra a proteína completamente in- tacta no contexto da conformação baseada em célula nativa. ENTPD2 hidrolisa ATP em ADP, que pode ser subsequentemente detectado com o uso do Ensaio HTRF Transcreener ADP2 TR-FRET Red (Bell- Brook Labs, Madison, WI) em que ADP produzido por ENTPD2 com- petiria com o Sinalizador de ADP para ligação ao anticorpo anti-ADP- Tb. O sinal resultante é inversamente proporcional à concentração de ADP na amostra.

[00812] Para avaliar a atividade de Abs anti-ENTPD2 no ensaio bi- oquímico de ENTPD?2, Abs anti-=ENTPD2 e ENTPD?2 recombinante (re- síduos 29 a 462) foram diluídos em tampão de reação (HEPES 50 MM, pH 7,1, MgCl2 10 mM, BSA 0,01%) à concentração desejada. 4 ul por poço da solução de ENTPD?2 e 2 ul por poço da solução de Ab An- ti-ENTPD?2 foram transferidos para uma ProxiPlate (PerkinElmer, Wal- tham, MA) e incubados por 30 min à temperatura ambiente. A reação foi, então iniciada por meio da adição de 2 ul de ATP (concentração de ensaio final de 1 UM), e a amostra foi incubada por 25 min à tempera- tura ambiente. A reação foi bruscamente arrefecida com EDTA 200 MM/EGTA 200 mM (5 ul por poço) e reagentes de detecção foram adi- cionados aos poços (5 ul por poço), com uma concentração final de anticorpo ADP2 4 nM e Sinalizador de ADP 4 nM no poço (BellBrooks Labs, Madison, WI). A placa foi, então, incubada à temperatura ambi- ente por 60 min antes da medição do sinal HTRF.

[00813] Para estabelecer os ensaios funcionais baseados em célu- la, células NIH/3T3 geneticamente modificado de ENTPD2 de ser hu- mano/cino/camundongo ou células de câncer colorretal RKO (ATCC, Manassa VA) com expressão de ENTPD2 endógenas foram plaquea- das de um dia para o outro a 150, 200 e 250 células por poço para li- nhagens de ENTPD2 de camundongo, cino e ser humano NIH/3T3,

respectivamente, ou 1.000 células por poço para RKO na placa de cul- tura de tecido de 384 poços, em 30 ul por poço (PerkinElmer, Wal- tham, MA). As células do dia seguinte foram pré-incubadas com Abs Anti-ENTPD2 em resposta à dosagem por 60 min a 37 ºC, CO25% (10 ul de dose anticorpo 5X por poço) e subsequentemente estimuladas com uma concentração final de ATP 10 uM (Teknova, Hollister, CA) por 20 minutos à temperatura ambiente (10 ul de ATP 5X (50 UM) por poço). As reações foram bruscamente arrefecidas com EDTA 40 MM/EGTA 40 mM, 25 ul por poço, e 15 ul de meio bruscamente arre- fecido foram transferidos para Proxiplates de baixo volume (PerkinEl- mer, Waltham, MA) para detecção de ADP. A produção de ADP foi de- tectada com o Ensaio Transcreener ADP2 TR-FRET Red (BellBrook Labs, Madison, WI) com uma concentração final de anticorpo de ADP2 4 nM e 13,4 nM de Sinalizador de ADP nos poços (uma solução 4X foi preparada e 5 ul de "Mistura de Reagente de Detecção" foram adicio- nados ao meio condicionado bruscamente arrefecido). As placas foram incubadas com reagentes de detecção por 1 hora à temperatura ambi- ente antes da leitura das placas no modo HTRF.

[00814] O sinal HTRF (Emissão a 620 nm e 665 nm) foi avaliado em ambos os ensaios com o uso do leitor de placas Envision no modo HTRF (PerkinElmer, Waltham, MA). A razão de HTRF foi determinada com o uso da seguinte fórmula: razão de HTRF = R = Emissão a 665 nm/Emissão a 620 nm x 10.000. Subsequentemente, a % de Atividade Residual e a % de Inibição foram determinadas na seguinte forma: vo Atividade Resiáucl = medos 100; % de Inibição = 100 — [Es 100]

[00815] Em que Ro% é a razão de HTRF do controle negativo (0% de atividade enzimática), e R100% é a razão de HTRF do controle posi- tivo (100% de atividade enzimática). Os dados foram analisados no

Microsoft Excel e colocados em gráficos com o uso do software Gra- phPad's Prism 7.0, e os valores de IC5o foram obtidos com o uso de análise de regressão não linear, log (agonista) versus coeficiente an- gular de variável de resposta (quatro parâmetros). Atividade representativa de Abs anti-ENTPD2 no ensaio funcional de ENTPD2 humano bioquímico

[00816] Abs AntiENTPD2 das campanhas de apresentação em fa- go e hibridoma foram triados quanto à atividade funcional no ensaio bioquímico de ENTPD2 humana. A atividade representativa de Abs Anti-ENTPD?2 e suas ICsos são mostradas na Figura 15 e na Tabela

28. Uma faixa de atividades foi observada para vários Abs com alguns exibindo atividade muito potente no ensaio com ICso subnanomolar e inibição de alvo completa ou outros demonstrando atividade muito mais fraca e inibição apenas parcial de enzima (dados não mostra- dos). Tabela 28: Perfis de atividade in vitro de Abs Anti-ENTPD2 no en- saio funcional bioquímico de ENTPD2 humana Anticorpo Ensaio Bioquímico de ENTPD2 em ATP 1 Cn MR Atividade de Abs anti-ENTPD2 nos ensaios funcionais de ENTPD2 de ser humano e sino baseados em célula

[00817] A perfilação inicial de Abs no ensaio de ENPTD2 bioquími- co identificou vários acertos potentes com forte atividade inibitória con- tra o domínio extracelular recombinante de ENTPD?, entretanto, perfis de comportamento diferenciais foram observados para um subconjunto de Abs entre os ensaios funcionais baseados em célula e bioquímicos, sugerindo que diferenças conformacionais podem existir entre a prote- íÍna recombinante purificada e a conformação baseada em célula nati- va (dados não mostrados). A fim de confirmar a atividade potente de Abs contra ENTPD2 nativa, Abs anti-ENTPD2 foram perfilados para atividade inibitória com o uso de células NIH/38T3 geneticamente modi- ficado de ENTPD2 de ser humano ou cino ou a linhagem de células RKO com expressão de ENTPD2 endógena.

O sumário dos perfis de atividade de Abs anti-ENTPD?2 através dos ensaios baseados em célu- la NIH/8T3 ou RKO de ENTPD?2 de ser humano ou cino é capturado na Tabela 29. Gráficos representativos que representam a atividade potente através de todos os três ensaios funcionais para um subcon- junto de Abs anti-ENTPD2 são mostrados na Figura 16. Tabela 29: Perfis de atividade in vitro de Abs seletivos de ENTPD2 nos ensaios baseados em célula NIH/3T3 ou RKO de ENTPD2 de ser humano ou cino Ensaio de Ensaio RKO Ensaio de NIH/3T3 NIH/3T3 de EN- de ENTPD?2 de cino 2 et O eee | Anticorpo 1Cso % de 1lCs % de |ICso % de inibi- nr ea ue fo “nas fin fã em o e e ese e E mm e me eee e ee eee e e e paravam e e pe e aeee o as ee mAb10 anti- Jo4 88 o,2 77 0,5 ENTPD2 mAb11 anti- (1,5 55 ENTPD2 mAb12 anti- 26,6 ENTPD2 mAb16 anti- [>133 [30 >133 |5 ENTPD2 mAb17 anti- o,5 1,0 91 ENTPD2 mAb18 anti- 0,4 88 20 ENTPD2 Exemplo 14. A modificação genética quiada por estrutura identifi- cou Abs de ENTPD2 anticamundongo substitutos mais potentes

[00818] “mAb13 Anti-ENTPD?2 foi identificado como um Ab seletivo de ENTPD2 de camundongo (FACS ECso 3 a 4 nM) sem nenhuma |i- gação à ENTPD?2 de ser humano ou cino. A atividade de mAb13 Anti- ENTPD?2 foi avaliada com o uso da linhagem celular geneticamente modificada de ENTPD2 de camundongo NIH3T3, em que mAb13 Anti- ENTPD?2 exibiu atividade como um inibidor enzimático parcial com uma ICs5o de 2,8 nM e inibição de alvo máxima de 44%. O exame da estrutura de cristal complexa de Fab/mENTPD2 de mAb13 Anti- ENTPD?2 e superposição de análogo de substrato de ATP de PDB có- digo 3CJA rENTPD?2 dentro do sítio ativo de mMENTPD?2, revelou T30 em CDR1 da HC de mAb13 Anti-ENTPD2 como um sítio ideal em que a substituição do aminoácido maior seria prevista para bloquear esteri- camente a ligação de ATP. Um subconjunto de construtos com substi- tuições na posição T30 de CDR1 de mAb13 Anti-ENTPD?2 foi geneti- camente modificado, incluindo mAb14 e mAb15 Anti-ENTPD?2. A avali- ação de variantes geneticamente modificadas de MAb14 e mAb15 An- ti-ENTPD2 no ensaio funcional baseado em célula NIH/3T3 de EN- TPD2 de camundongo demonstrou inibição de alvo significativamente aumentada em comparação ao mAb13 Anti-ENTPD?2 parental, alcan-

çando aproximadamente 76 a 79% de inibição de ENTPD2 de camun- dongo com IC50 de 5 a 6 nM (Tabela 30, Figura 17). Tabela 30: Perfis de atividade in vitro de Abs seletivos de ENTPD2 de camundongo no ensaio baseado em célula de ENTPD2 de ca- mundongo Anticorpo ICso de Ensaio Funcional/% de inibição A femea pxomcemPano |

[00819] Anão ser que definido de outro modo, os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o usualmente entendido por um especialista familiarizado com o campo ao qual a descrição pertence.

[00820] A não ser que indicado de outro modo, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descri- tos em detalhes podem ser realizados e foram realizados de uma ma- neira conhecida por si, conforme ficará claro para a pessoa versada na técnica. Referência é, por exemplo, feita novamente aos manuais pa- drão e aos antecedentes da técnica gerais mencionados no presente documento e às referências adicionais citadas no presente documento. A não ser que indicado de outro modo, cada uma das referências cita- das no presente documento é incorporada em sua totalidade a título de referência.

[00821] As reivindicações da invenção não são limitantes e são for- necidas abaixo.

[00822] “Embora aspectos e reivindicações particulares tenham sido descritos no presente documento em detalhes, isso foi feito a título de exemplo para propósitos de ilustração apenas e não se destina a ser limitante em relação ao escopo das reivindicações anexas, ou o esco-

po da matéria das reivindicações de qualquer pedido futuro correspon- dente.

Em particular, é contemplado pelos inventores que várias subs- tituições, alterações e modificações podem ser feitas à descrição sem se afastar do espírito e escopo da descrição conforme definido pelas reivindicações.

Acredita-se que a escolha do material de partida de ácido nucleico, clone de interesse ou tipo de biblioteca é uma questão de rotina para uma pessoa de habilidade comum na técnica com co- nhecimento dos aspectos descritos no presente documento.

Conside- ra-se que outros aspectos, vantagens e modificações sejam abrangi- dos pelo escopo das reivindicações a seguir.

Os peritos na técnica re- conhecerão, ou serão capazes de determinar utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes dos aspectos es- pecíficos da invenção descrita no presente documento.

Tais equivalen- tes são destinados a serem abrangidos pelas reivindicações a seguir.

A reformulação do escopo da reivindicação em pedidos corresponden- tes posteriormente depositados pode ser devido às limitações pelas leis de patente dos vários países e não deve ser interpretada como desistindo da matéria das reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à proteína ENTPD2 humana, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma região determinante de complemen- tariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2), uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3), uma região determi- nante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2), e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) de qualquer anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno fornecido na Tabela 1.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 são selecionadas dentre as sequências de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 fornecidas na Tabela 1.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada na Tabela 1.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve fornecida na Tabela 1.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é selecionado dentre qualquer um dos seguintes:

1) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 1,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 2,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 3,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 14,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 15,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 16;

2) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 4,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 5,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 3,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 19;

3) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 7,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 8,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 9,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 20,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 16;

4) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 38,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 39,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 50,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 51,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 52;

5) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 41,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 39,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 53,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 54,0 uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 55;

6) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 44,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 45,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 56,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 54,0 uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 52;

7) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 38,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 39,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 61,

8) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 41,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 39,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 62,

9) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 44,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 45,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 63,

10) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 38,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 68,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 50,

11) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 41,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 68,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 53,

12) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 44,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 69,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 56,

13) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 82,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 83,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 84,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 95,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 9, e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 97;

14) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 85,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 86,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 84,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 98,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 99,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 100;

15) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 88,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 89,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 90,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 101,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 99,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 97;

16) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 106,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 107,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 108,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 119,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 120,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 121;

17) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 109,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 110,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 108,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 122,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 99,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 123;

18) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 112,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 113,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 114,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 124,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 99,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 121;

19) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 106,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 129,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 108,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 119,

20) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 109,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 130,

21) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 112,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 131,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 114,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 124,

22) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 136,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 137,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 138,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 149,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 150, e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 151;

23) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 139,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 140,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 138,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 152,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 153,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 154;

24) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 142,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 143,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 144,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 155,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 153,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 151;

25) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 160,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 161,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 162,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 173,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 150, e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 174;

26) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 163,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 164,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 162,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 175,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 153,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 176;

27) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 166,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 167,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 168,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 177,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 153,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 174;

28) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 220,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 221,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 61,

29) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 222,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 221,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 62,

30) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 223,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 224,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 63,

31) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 37,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 220,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 68,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 61,

32) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 40,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 222,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 68,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 62,

33) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 43,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 223,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 69,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 63,

34) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 1,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 245,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 246,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 254,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 15,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 255;

35) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 4,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 247,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 246,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 256;

36) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 7,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 248,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 249,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 20,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 255;

37) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 1,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 261,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 262,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 254,

38) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 4,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO:

247,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 262,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17,

39) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 7,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 248,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 263,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 20,

40) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 272,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 273,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 274,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 254,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 285,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 16;

41) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 275,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 276,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 274,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 286, e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 19;

42) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende:

uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 278,

uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 279,

uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 280,

uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 20,

uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 286, e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

16.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é selecionado dentre qualquer um dos seguintes: 1) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 10 ou uma sequência pelo menos cer- ca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 21 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 2) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 25 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 29 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 3) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 33 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 29 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 4) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 46 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 57 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 5) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 46 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 64 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

15) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 241 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 229 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

16) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 250 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 257 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

17) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 264 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 268 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; ou 18) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma VH que compreende a SEQ ID NO: 281 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mes- ma e uma VL que compreende a SEQ ID NO: 287 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é selecionado dentre qualquer um dos seguintes: 1) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 12 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 23 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 2) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 27 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 31 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 3) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 35 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 31 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 4) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 48 ou uma sequência pelo menos cerca de

95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 59 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

8) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 93 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 104 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

14) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 235 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 239 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

15) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 243 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 231 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma;

16) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 252 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 259 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; 17) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 266 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 270 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma; ou 18) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 283 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 289 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 1, uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 2, uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 3, uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 14, uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 15,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

16.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 4, uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 5, uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 3, uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 17, uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

19.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: uma sequência de HCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 7, uma sequência de HCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 8, uma sequência de HCDR3 que compreende a SEQ ID NO: 9, uma sequência de LCDR1 que compreende a SEQ ID NO: 20, uma sequência de LCDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18,e uma sequência de LCDR3 que compreende a SEQ ID NO:

16.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 10 ou uma sequência pelo menos cer- ca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 21 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende compreende a SEQ ID NO: 12 ou uma se- quência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 23 ou uma sequência pelo menos cerca de 95% ou mais idêntica à mesma.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a um epítopo em ENTPD2 humana, em que o epíto- po compreende pelo menos um dos seguintes resíduos: His50, Asp76, Pro78, Gly79, GIy80, Tyr85, Asp87, Asn88, Gly91, GIn94, Ser95, GlIy98, Glu101, GIn102, GIn105, Asp106, Arg245, Thr272, Gln273, Leu275, Asp278, Arg298, Ala347, Ala350, Thr351, Arg392, Ala393, Arg394 ou Tyr398.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a um epítopo em ENTPD2 humana, em que o epíto- po compreende pelo menos um dos seguintes resíduos: Gly79, GIn250, Leu253, Trp266, Arg268, Gly269, Phe270, Ser271, Thr272, Gln273, Val274, Leu275, Asp278, Arg298, Ser300, Ser302, Gly303, Thr380, Trp381, Ala382, GlIy390, GIn391, Arg392, Ala393, Arg394 ou Asp397.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um epí- topo em ENTPD2 humana, em que o epítopo compreende pelo menos um dos seguintes resíduos: His50, Asp76, Pro78, Gly79, GIy80, Tyr85,

Asp87, Asn88, GIy91, GIn94, Ser95, Gly98, Glu101, GIn102, GIn105, Asp106, Arg245, Thr272, Gln273, Leu275, Asp278, Arg298, Ala347, Ala350, Thr351, Arg392, Ala393, Arg394 ou Tyr398.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um epí- topo em ENTPD2 humana, em que o epítopo compreende pelo menos um dos seguintes resíduos: Gly79, GIn250, Leu253, Trp266, Arg268, Gly269, Phe270, Ser271, Thr272, Gln273, Val274, Leu275, Asp278, Arg298, Ser300, Ser302, Gly303, Thr380, Trp381, Ala382, Gly390, GIn391, Arg392, Ala393, Arg394 ou Asp397.

17. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, caracterizado pelo fato de que compete com qualquer anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno fornecido na Tabela 1 para ligação à proteína humana ENTPD?2.

18. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, caracterizado pelo fato de que se liga a um epítopo igual, um epí- topo substancialmente igual, um epítopo que se sobrepõe, ou um epí- topo que substancialmente se sobrepõe, ao epítopo de qualquer anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno fornecido na Tabela 1.

19. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à proteína humana ENTPD2 com uma constante de dissociação (Ko) menor que 10 nM, por exemplo, conforme medido por Biacore.

20. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à proteína humana ENTPD2 com uma constante de dissociação (Ko) menor que 5 nM, por exemplo, conforme medido por

Biacore.

21. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga à proteína humana ENTPD2 com uma constante de dissociação (Ko) menor que 3 nM, por exemplo, conforme medido por Biacore.

22. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo inibe a atividade enzimática de ENTPD2 humana em pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pe- lo menos 80% ou pelo menos 90%.

23. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo inibe a capacidade da ENTPD?2 de hidrólise de adenosina trifosfato (ATP).

24. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo interfere na ligação de ATP à ENTPD2 ou detém ATP den- tro do domínio catalítico de ENTPD?2.

25. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo possui um isotipo I9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

26. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região Fc selecionada dentre uma região Fc de IgG1, uma região Fc de IgG2, uma região Fc de IgG4 ou uma região Fc híbrida de I9gG2/I9G4.

27. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região Fc modificada que possui ativida- de reduzida de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) em comparação com o anticorpo precursor.

28. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo humano ou humanizado ou fragmento do mesmo.

29. Ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, carac- terizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 28.

30. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, como definido na rei- vindicação 29.

31. Vetor, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado dentre um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um cosmídeo ou um vetor viral.

32. Vetor, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral baseado em qualquer um dos seguintes vírus: lentivírus, adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), Vírus Herpes Simplex (HSV), parvovírus, retrovírus, vírus vacínia, vírus Sinbis, vírus influenza, reovírus, vírus da doença de Newcastle (NDV),

vírus do sarampo, vírus da estomatite vesicular (VSV), poliovírus, pox- vírus, vírus do Vale de Seneca, coxsackievírus, enterovírus, vírus Mi- xoma ou vírus Marabá.

33. Vetor, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de AAV.

34. Vetor, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor lentiviral.

35. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações a 34, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, um promo- tor.

36. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, um mar- cador detectável.

37. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, como definido na rei- vindicação 29, ou o vetor, como definido em qualquer uma das reivin- dicações 30 a 36.

38. Método para produzir um anticorpo ou fragmento de |li- gação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivar a célula, como definida na reivindicação 37, e co- letar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo do meio de cultura.

39. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, o ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, como definido na rei- vindicação 29, o vetor, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 30 a 36, ou a célula, como definida na reivindicação 37, e um car- reador farmaceuticamente aceitável.

40. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes-

mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindica- ção 29, vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 36, célula de acordo com a reivindicação 37, ou composição farma- cêutica, de acordo com a reivindicação 39, caracterizados pelo fato de que se destinam ao uso como um medicamento.

41. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 29, vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 36, célula, de acordo com a rei- vindicação 37, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivin- dicação 39, caracterizados pelo fato de que se destinam ao uso no tra- tamento de um câncer.

42. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, do ácido nucleico, como definido na reivindicação 29, do vetor, como de- finido em qualquer uma das reivindicações 30 a 36, da célula, como definida na reivindicação 37, ou da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que se destina à fabricação de um medicamento para tratamento de um câncer.

43. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 41, ou uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer ENTPD2+.

44. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 41, ou uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer colorretal (CRC), câncer gástrico (por exemplo, adenocarcinoma do estômago, carcinoma gástrico), câncer de esôfago (por exemplo, carcinoma de célula escamosa do esôfago (ESCC)), câncer pancreático, colangiocarcinoma, câncer de pulmão (por exem- plo, câncer de pulmão de células pequenas), câncer de mama (por exemplo, adenocarcinoma de mama) ou câncer de ovário.

45. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 41, ou uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o áci- do nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, o vetor, a célula ou a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo através de uma via intravenosa, intratumoral ou subcutânea.

46. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 41, ou uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpo é administrada em combinação com pelo menos um procedimento ou agente terapêutico adicional.

47. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 46, ou uso, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que pelo menos um procedimento ou agente terapêutico adicional é selecionado dentre um ou mais dentre quimioterapia, uma terapia-alvo anticâncer direcionada, um fármaco oncolítico, um agente citotóxico, uma terapia imunológica, uma citocina, procedimento cirúrgico, um procedimento de radiação, um ativador de uma molécula coestimulan- te, um inibidor de uma molécula inibidora, uma vacina ou uma terapia celular.

48. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 46, ou uso, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é um inibidor de PD-1, por exemplo, um anticorpo de PD-1.

49. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 48, ou uso, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o inibidor de PD-1 é selecionado dentre PDROO1, Nivolumabe, Pembrolizumabe, Pidilizumabe, MEDIO680, REGN2810, TSR-042, PF- 06801591 ou AMP-224.

50. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 46,

ou uso, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é um inibidor de PD-L1, por exemplo, um anticorpo de PD-L1.

51. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 50, ou uso, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o inibidor de PD-L1 é selecionado dentre FAZO53, Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe ou BMS-936559.

52. Anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 51, ou uso, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 46 a 51, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é um antagonista de A2AR, em que o an- tagonista de A2AR é selecionado dentre: i. uma molécula de anticorpo anti-CD73, ou fragmento de |i- gação a antígeno do mesmo, opcionalmente em que o anticorpo anti- CD73 é selecionado dentre: a. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 295 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 296, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 295 ou 296; b. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 299, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 300, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 299 ou 300; c. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 302 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 303, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 302 ou 303;

d. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 304 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 305, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 304 ou 305;

e. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 306 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 307, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 306 ou 307; ou f. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 308 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 309, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 308 ou 309; ou ii.

PBF5O09/NIR1I78, CPI444/V81444, AZD4635/HTL-1071, Vipadenant, GBV-2034, AB928, Teofilina, Istradefilina, Tozadenant/ SYN-115, KW-6356, ST-4206 e Preladenant/SCH 420814; ou iii. 5-bromo-2,6-di-(1H-pirazol-1-ila)pirimidina-4-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; (S)-7-(5-metilfurano-2- ila)-3-((6-(((tetra-hidrofurano-3-ila)óxi)|mMetila)piridina-2-ila)metila)-3H- [1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidina-5-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; (R)-7-(5-metilfurano-2-ila)-3-((6-(((tetra-hidrofura- no-3-ila)óxi)metila)piridina-2-ila)Metila)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidi-

na-5-amina, ou racemato da mesma, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; 7-(5-metilfurano-2-ila)-3-((6-(((tetra-hidrofurano-3- ila)óxi)mMetila)piridina-2-ila)Metila)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidina-5- amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; e 6-(2-cloro- 6-metilpiridin-4-ila)-5-(4-fluorofenila)-1,2,4-triazin-3-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

53. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 46, ou uso, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado den- tre: i. um inibidor de CTLA-4, opcionalmente em que o inibidor de CTLA-4 é selecionado dentre Ipilimumabe ou Tremelimumabe; ii. um inibidor de TIM-3, opcionalmente em que o inibidor de TIM-3 é selecionado dentre MBG453, TSR-022 ou LY3321367; iii. um inibidor de LAG-3, opcionalmente em que o inibidor de LAG-3 é selecionado dentre LAG525, BMS-986016, TSR-033, MK- 4280 ou REGN3767; iv. um agonista de GITR, opcionalmente em que o agonista de GITR é selecionado dentre GWN323, BMS-986156, MK-4166, MK- 1248, TRX518, INCAGN1876, AMG 228 ou INBRX-110; v. uma molécula de anticorpo multiespecífico anti-CD3, op- cionalmente em que a molécula de anticorpo multiespecífico anti-CD3 é uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD123 (por exemplo, XENP14045), ou uma molécula de anticorpo biespecífico an- ti-CD3 x anti-CD20 (por exemplo, XENP13676); vi. uma molécula de citocina, opcionalmente em que a mo- lécula de citocina é IL-15 complexada com uma forma solúvel de re- ceptor de IL-15 alfa (IL-15Ra); vii. um inibidor de fator estimulante de colônia de macrófago (M-CSF), opcionalmente em que o inibidor de M-CSF é MCS110;

viii. um inibidor de CSF-1R, opcionalmente em que o inibi- dor de CSF-1R é BLZ945; ix. um inibidor de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) e/ou triptofano 2,3-dioxigenase (TDO); x. um inibidor de TGF-B; xi. um vírus oncolítico; xii. uma terapia de célula T com receptor de antígeno qui- mérico (CAR).

54. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 46, ou uso, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado den- tre: 1) um inibidor de proteína quinase C (PKC); 2) um inibidor de pro- teína de choque térmico 90 (HSP90); 3) um inibidor de uma fosfoinosi- tida 3-quinase (PISK) e/ou alvo de rapamicina (mMTOR); 4) um inibidor de citocromo P450 (por exemplo, um inibidor de CYP17 ou um inibidor de 17alfa-Hidroxilase/C17-20 Liase); 5) um agente quelante de ferro; 6) um inibidor de aromatase; 7) um inibidor de p53, por exemplo, um inibidor de uma interação p53/Mdm2; 8) um indutor de apoptose; 9) um inibidor de angiogênese; 10) um inibidor de aldosterona sintase; 11) um inibidor de receptor suavizado (SMO); 12) um inibidor de receptor de prolactina (PRLR); 13) um inibidor de sinalização de Wnt; 14) um inibidor de CDKA4/6; 15) um inibidor de receptor de fator de crescimen- to de fibroblasto 2 (FGFR2)/receptor de fator de crescimento de fi- broblasto 4 (FGFR4); 16) um inibidor de fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF); 17) um inibidor de um ou mais dentre c-KIT, liberação de histamina, FIt3 (por exemplo, FLK2/STK1) ou PKC; 18) um inibidor de um ou mais dentre VEGFR-2 (por exemplo, FLK- 1/KDR), PDGFRbeta, c-KIT ou Raf quinase C; 19) um agonista de so- matostatina e/ou um inibidor de liberação de hormônio do crescimento; 20) um inibidor de quinase de linfoma anaplástico (ALK); 21) um inibi-

dor de receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGF- 1R); 22) um inibidor de P-Glicoproteína 1; 23) um inibidor de receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR); 24) um inibidor de BCR-ABL quinase; 25) um inibidor de FGFR; 26) um inibidor de CYP11B2; 27) um inibidor de HDM2, por exemplo, um inibidor da inte- ração HDM2-p53; 28) um inibidor de uma tirosina quinase; 29) um ini- bidor de c-MET; 30) um inibidor de JAK; 31) um inibidor de DAC; 32) um inibidor de 11B-hidroxilase; 33) um inibidor de IAP; 34) um inibidor de PIM quinase; 35) um inibidor de Porcupine; 36) um inibidor de BRAF, por exemplo, BRAF V600E ou BRAF do tipo selvagem; 37) um inibidor de HER3; 38) um inibidor de MEK; 39) um inibidor de uma lipí- dio quinase; ou um ou mais agentes, conforme fornecido na Tabela 16.

55. Método para tratar câncer em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende ad- ministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do an- ticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 28, do ácido nucleico, como definido na reivindicação 29, do vetor, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 30 a 36, da célula, como definida na reivindicação 37, ou da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 39.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é um câncer ENTPD2+.

57. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer colorretal (CRC), câncer gástri- co (por exemplo, adenocarcinoma do estômago, carcinoma gástrico), câncer de esôfago (por exemplo, carcinoma de célula escamosa do esôfago (ESCC)), câncer pancreático, colangiocarcinoma, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas), câncer de mama (por exemplo, adenocarcinoma de mama) ou câncer de ová- rio.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 57, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o ácido nucleico ou conjunto de áci- dos nucleicos, o vetor, a célula ou a composição farmacêutica é admi- nistrada ao indivíduo através de uma via intravenosa, intratumoral ou subcutânea.

59. Método para estimular uma resposta imunológica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo o anticorpo ou fragmento de ligação a antíge- no, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, o ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, como definido na reivindica- ção 29, o vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 36, a célula, como definida na reivindicação 37, ou a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 39, em uma quantidade eficaz para estimular a resposta imunológica.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 59, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, ad- ministrar ao indivíduo pelo menos um procedimento ou agente tera- pêutico adicional.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que pelo menos um procedimento ou agente terapêuti- co adicional é selecionado dentre um ou mais dentre quimioterapia, uma terapia-alvo anticâncer direcionada, um fármaco oncolítico, um agente citotóxico, uma terapia imunológica, uma citocina, procedimen- to cirúrgico, um procedimento de radiação, um ativador de uma molé- cula coestimulante, um inibidor de uma molécula inibidora, uma vacina ou uma terapia celular.

62. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é um inibidor de PD-1, por exemplo, um anticorpo de PD-1.

63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracteriza- do pelo fato de que o inibidor de PD-1 é selecionado dentre PDROO01, Nivolumabe, Pembrolizumabe, Pidilizumabe, MEDIO680, REGN2810, TSR-042, PF-06801591 ou AMP-224.

64. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é um inibidor de PD-L1, por exemplo, um anticorpo de PD-L1.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteriza- do pelo fato de que o inibidor de PD-L1 é selecionado dentre FAZO53, Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe ou BMS-936559.

66. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é um antagonista de A2AR, em que o antagonista de A2AR é seleciona- do dentre: i. uma molécula de anticorpo anti-CD73, ou fragmento de |i- gação a antígeno do mesmo, opcionalmente em que o anticorpo anti- CD73 é selecionado dentre: a. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 295 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 296, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 295 ou 296; b. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 299, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 300, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 299 ou 300; c. uma molécula de anticorpo anti-CD73 que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 302 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 303, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 302 ou 303;

PBF5O09/NIR1I78, CPI444/V81444, AZD4635/HTL-1071, Vipadenant, GBV-2034, AB928, Teofilina, Istradefilina, Tozadenant/ SYN-115, KW-6356, ST-4206 e Preladenant/SCH 420814; ou iii. 5-bromo-2,6-di-(1H-pirazol-1-ila)pirimidina-4-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; (S)-7-(5-metilfurano-2- ila)-3-((6-(((tetra-hidrofurano-3-ila)óxi)|mMetila)piridina-2-ila)metila)-3H- [1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidina-5-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; (R)-7-(5-metilfurano-2-ila)-3-((6-(((tetra-hidrofu- rano-3-ila)9óxi)Metila)piridina-2-ila)Mmetila)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimi- dina-5-amina, ou racemato da mesma, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; 7-(5-metilfurano-2-ila)-3-((6-(((tetra-hidrofurano-3- ila)óxi)mMetila)piridina-2-ila)Metila)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidina-5- amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma; e 6-(2-cloro- 6-metilpiridin-4-ila)-5-(4-fluorofenila)-1,2,4-triazin-3-amina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

67. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado dentre: i. um inibidor de CTLA-4, opcionalmente em que o inibidor de CTLA-4 é selecionado dentre Ipilimumabe ou Tremelimumabe; ii. um inibidor de TIM-3, opcionalmente em que o inibidor de TIM-3 é selecionado dentre MBG453, TSR-022 ou LY3321367; iii. um inibidor de LAG-3, opcionalmente em que o inibidor de LAG-3 é selecionado dentre LAG525, BMS-986016, TSR-033, MK- 4280 ou REGN3767; iv. um agonista de GITR, opcionalmente em que o agonista de GITR é selecionado dentre GWN323, BMS-986156, MK-4166, MK- 1248, TRX518, INCAGN1876, AMG 228 ou INBRX-110; v. uma molécula de anticorpo multiespecífico anti-CD3, op- cionalmente em que a molécula de anticorpo multiespecífico anti-CD3 é uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD123 (por exemplo, XENP14045), ou uma molécula de anticorpo biespecífico an- ti-CD3 x anti-CD20 (por exemplo, XENP13676); vi. uma molécula de citocina, opcionalmente em que a mo- lécula de citocina é IL-15 complexada com uma forma solúvel de re- ceptor de IL-15 alfa (IL-15Ra); vii. um inibidor de fator estimulante de colônia de macrófago

(M-CSF), opcionalmente em que o inibidor de M-CSF é MCS110; viii. um inibidor de CSF-1R, opcionalmente em que o inibi- dor de CSF-1R é BLZ945; ix. um inibidor de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) e/ou triptofano 2,3-dioxigenase (TDO); x. um inibidor de TGF-B; xi. um vírus oncolítico; xii. uma terapia de célula T com receptor de antígeno qui- mérico (CAR).

68. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado dentre: 1) um inibidor de proteína quinase C (PKC); 2) um inibidor de proteína de choque térmico 90 (HSP90); 3) um inibidor de uma fosfoinositida 3-quinase (PI3K) e/ou alvo de rapamicina (mMTOR); 4) um inibidor de citocromo P450 (por exemplo, um inibidor de CYP17 ou um inibidor de 17alfa-Hidroxilase/C17-20 Liase); 5) um agente que- lante de ferro; 6) um inibidor de aromatase; 7) um inibidor de p53, por exemplo, um inibidor de uma interação p53/Mdm2; 8) um indutor de apoptose; 9) um inibidor de angiogênese; 10) um inibidor de aldoste- rona sintase; 11) um inibidor de receptor suavizado (SMO); 12) um ini- bidor de receptor de prolactina (PRLR); 13) um inibidor de sinalização de Wnt; 14) um inibidor de CDK4/6; 15) um inibidor de receptor de fa- tor de crescimento de fibroblasto 2 (FGFR2)/receptor de fator de cres- cimento de fibroblasto 4 (FGFR4); 16) um inibidor de fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF); 17) um inibidor de um ou mais dentre c-KIT, liberação de histamina, FIt3 (por exemplo, FLK2/STK1) ou PKC; 18) um inibidor de um ou mais dentre VEGFR-2 (por exemplo, FLK-1/KDR), PDGFRbeta, c-KIT ou Raf quinase C; 19) um agonista de somatostatina e/ou um inibidor de liberação de hormônio do cresci- mento; 20) um inibidor de quinase de linfoma anaplástico (ALK); 21)

um inibidor de receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1R); 22) um inibidor de P-Glicoproteína 1; 23) um inibidor de re- ceptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR); 24) um inibidor de BCR-ABL quinase; 25) um inibidor de FGFR; 26) um inibi- dor de CYP11B2; 27) um inibidor de HDM2, por exemplo, um inibidor da interação HDM2-p53; 28) um inibidor de uma tirosina quinase; 29) um inibidor de c-MET; 30) um inibidor de JAK; 31) um inibidor de DAC; 32) um inibidor de 11B-hidroxilase; 33) um inibidor de IAP; 34) um ini- bidor de PIM quinase; 35) um inibidor de Porcupine; 36) um inibidor de BRAF, por exemplo, BRAF V600E ou BRAF do tipo selvagem; 37) um inibidor de HER3; 38) um inibidor de MEK; 39) um inibidor de uma lipí- dio quinase; ou um ou mais agentes, conforme fornecido na Tabela 16.

69. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, o ácido nu- cleico ou conjunto de ácidos nucleicos, como definido na reivindicação 25, o vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 26 a 32, a célula, como definida na reivindicação 33, ou a composição far- macêutica, como definida na reivindicação 35, é administrada conco- mitantemente com, antes de, ou subsequentemente ao, pelo menos um agente terapêutico adicional.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 69, caracterizado pelo fato de que administrar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o ácido nucleico ou con- junto de ácidos nucleicos, o vetor, a célula ou a composição farmacêu- tica possui um ou mais dos seguintes efeitos: (a) número aumentado de células CD45+ CD4- CD8+ CD69+ CD25+ em um sítio de tumor ou lesão no indivíduo; (b) número aumentado de células CD45+ CD8- CD4+ FOXP3- CD69+ CD25+ em um sítio de tumor ou lesão no indivíduo;

(c) nível plasmático de MCP1 ou IL-18 diminuído no indiví- duo; ou (d) nível de MCP1 aumentado em um sítio de tumor ou le- são no indivíduo.

71. Método para tratar um câncer em um indivíduo que pre- cisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 28, em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado dentre um inibidor de PD-1 ou um ini- bidor de PD-L1.

72. Método para estimular uma resposta imunológica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo o anticorpo ou fragmento de ligação a antíge- no, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado dentre um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1.

73. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, para uso, em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado dentre um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1, no tratamento de câncer em um indivíduo.

74. Composição para uso no tratamento de câncer em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que a composição compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 28, em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado dentre um inibidor de PD-1 ou um ini- bidor de PD-L1.

75. Método, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, ou composição, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um inibidor de PD-1.

76. Método, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, ou composição, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que o inibidor de PD-1 é um anticorpo de PD-1.

77. Método, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, ou composição, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que o inibidor de PD-1 é selecionado dentre PDROO1, Ni- volumabe, Pembrolizumabe, Pidilizumabe, MEDIO680, REGN2810, TSR-042, PF-06801591 ou AMP-224.

78. Método, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, ou composição, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um inibidor de PD-L1.

79. Método, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, ou composição, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que o inibidor de PD-L1 é um anticorpo de PD-L1.

80. Método, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, ou composição, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que o inibidor de PD-L1 é selecionado dentre FAZOS53, Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe ou BMS-936559.

81. Método, de acordo com a reivindicação 71, ou composi- ção, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer ENTPD2+.

82. Método, de acordo com a reivindicação 71, ou composi- ção, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer colorretal (CRC), câncer gástrico (por exem- plo, adenocarcinoma do estômago, carcinoma gástrico), câncer de esôfago (por exemplo, carcinoma de célula escamosa do esôfago (ESCC)), câncer pancreático, colangiocarcinoma, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas), câncer de ma- ma (por exemplo, adenocarcinoma de mama) ou câncer de ovário.