BR112020010930A2

BR112020010930A2 - composição baseada em probióticos e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112020010930A2
Application number: BR112020010930-4A
Authority: BR
Inventors: Andrea BIFFI
Original assignee: Lac2biome S.r.l.
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2020-11-17
Also published as: US11534468B2; EA202091389A1; CA3084735A1; JP2021505689A; MX2020005777A; CN111511379A; KR20200096807A; US20230093060A1; WO2019111189A1; US20210236566A1; AU2018378419A1; EP3720457A1; ZA202003788B; JP2023133467A

Abstract

A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo probióticos, preferivelmente baseados em bactérias, em particular do gênero Lactobacillus, para ser usada para a finalidade de prevenir e/ou tratar os distúrbios que afetam a pele, em particular os distúrbios inflamatórios, em particular os distúrbios inflamatórios de interesse dermatológico, como a dermatite atópica. Além disso, a composição da invenção é útil para prevenir e/ou reduzir os danos induzidos pela radiação UV, em particular o envelhecimento da pele.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- SIÇÃO BASEADA EM PROBIÓTICOS E USOS DOS MESMOS".

DESCRIÇÃO CAMPO DE INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a uma composição compre- endendo probióticos, preferivelmente à base de bactérias, em particular do gênero Lactobacillus, a ser usada para a finalidade de prevenir e/ou tratar distúrbios que afetam a pele, em particular distúrbios inflamató- rios, em particular distúrbios autoinflamatórios de interesse dermatoló- gicas, como a dermatite atópica. Além disso, a composição da invenção é útil para prevenir e/ou reduzir os danos induzidos pela radiação UV, em particular o envelhecimento da pele.

TÉCNICA ANTERIOR

[0002] A pele humana é colonizada por um rico microbioma. No pas- sado, pensava-se que esse aspecto representasse uma fonte potencial de infecção, enquanto que hoje existe a consciência de que a microbiota humana, em geral, e, portanto, também a microbiota da pele, desempe- nha funções importantes e úteis no hospedeiro, não apenas por sua ca- pacidade de se opor à adesão e ao desenvolvimento de patógenos da pele, como também por sua capacidade de dialogar e interagir com o sistema imunológico.

[0003] Quando ocorre uma disbiose no nível da pele, os probióticos podem atuar como moduladores e restaurar o equilíbrio na microbiota da pele.

[0004] Na última década, o uso de novas tecnologias tem facilitado a análise taxonômica da microbiota da pele, cuja população bacteriana pode equivaler a cerca de 1010 espécies de microrganismos pertencen- tes a mais de 25 phyla, os mais representativos sendo Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria. Várias doenças de pele têm estado ligadas a alterações no microbioma da pele.

[0005] Por exemplo, no caso da acne, a P. acnes é considerada a bactéria principalmente associada a ela; nessas condições, de fato, o a produção aumentada de sebo proporciona um ambiente ideal para o seu crescimento.

[0006] A abordagem convencional para esses problemas é usar an- tibacterianos, isto é, usar desinfetantes e antibióticos tópicos.

[0007] Por um lado, os antibióticos são indubitavelmente eficazes, mas, além de eliminar também as bactérias benéficas, correm o risco de sensibilização e potenciais eventos adversos, particularmente no caso de uso prolongado de antibióticos de amplo espectro.

[0008] Por este motivo, a Requerente identificou, como uma nova solução para restabelecer o equilíbrio da microbiota da pele, o uso de composições probióticas, baseadas, em particular, no uso de bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus. De fato, a Requerente verificou que uma composição compreendendo probióticos pertencentes ao gê- nero Lactobacillus é capaz de impedir, ou em qualquer caso mitigar, a ação das bactérias que sejam perigosas para a pele, como a P. acnes, precisamente, e é, desse modo, capaz de: 1) contribuir para prevenir e/ou tratar os distúrbios que afetam a pele; 2) promover o processo normal de cura; e 3) promover e/ou melhorar os processos normais de re-epitelização e/ou cicatrização.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0009] A presente invenção é descrita em detalhes abaixo e ilus- trada a título de exemplo também com o auxílio das figuras anexas, nas quais:

[00010] - A Figura 1 mostra graficamente a adesão da P. acnes em termos de porcentagem de células vivas e viáveis que aderem após:  1a: pré-estimulação por contato de queratinócitos com os probióticos testados;

 1b: coincubação dos queratinócitos com a P. acnes e com os probióticos testados;  1c: incubação dos queratinócitos com os probióticos testa- dos, depois que as células eucarióticas foram desafiadas com o pató- geno. Onde 100 representa à adesão da P. acnes na ausência de estímulo pelos probióticos, a capacidade de inibição das cepas testadas foi ex- pressa como a % de redução de adesão pela P. acnes em comparação com o controle positivo. Em particular, a Figura 1a mostra a capacidade de ambas as cepas probióticas de impedir a adesão da P. acnes, em uma % semelhante (42% para L. casei DG® e 35% para L. paracasei LPC-S01).

[00011] A Figura 1b mostra a capacidade da cepa L. casei DG® de reduzir a adesão em 17%, enquanto a cepa L. paracasei LPC-S01 ficou em 9%. A mistura das cepas produziu uma redução estatisticamente significativa na adesão do P. acnes, que ficou em 42%, uma porcenta- gem claramente mais alta do que a observada tanto para as cepas con- sideradas individualmente quanto para a soma de seus efeitos.

[00012] A Figura 1C mostra um efeito sinergístico estatisticamente significativo ligado à mistura dos 2 probióticos, que mostrou ser capaz de reduzir a adesão de P. acnes em 42%. Os probióticos individuais, por outro lado, mostraram uma capacidade de reduzir a adesão que foi menos do que a metade daquela da mistura, 18% para L. casei DG e 11% para L. paracasei LPC-S01.

[00013] - A Figura 2 mostra graficamente os resultados do ensaio nas citocinas IL-10, IL-1beta, IL-8 e TSLP nos sobrenadantes das células, expressos em picogramas (pg) por ml de sobrenadante, obtidos por meio do teste ELISA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00014] Um aspecto da presente invenção refere-se a uma composi- ção compreendendo probióticos, preferivelmente uma ou mais bactérias probióticas, para uso no tratamento e/ou na prevenção de distúrbios e/ou patologias, preferivelmente de um tipo inflamatório, afetando a pele, preferivelmente de um tipo dermatológico.

[00015] Os ditos distúrbios e/ou patologias que afetam a pele são se- lecionados a partir de: dermatite, preferivelmente associada a irritações e/ou escoriações, acne, infecções, inflamações da pele, eritema, úlce- ras, psoríase, dermatite atópica, otite, rágades, fístulas, hemorroidas e qualquer outro distúrbio ou lesão da pele com ou sem a presença de um processo inflamatório adiantado e/ou combinações e/ou complicações e/ou resultados deles.

[00016] Os ditos distúrbios e/ou patologias que afetam a pele estão preferivelmente associados com, ou são causados por patógenos. Ou seja, a composição é particularmente eficaz não apenas para fins pre- ventivos/profiláticos, como também para fins de tratamento/terapêuti- cos, isto é, após um desafio com os ditos patógenos.

[00017] De acordo com um aspecto preferido da presente invenção, a composição também pode favorecer/facilitar/promover/acelerar o pro- cesso de cura das feridas e/ou os processos de re-epitelização e/ou ci- catrização.

[00018] Os ditos patógenos são preferivelmente selecionados a partir de: bactérias, fungos, leveduras, vírus e suas combinações.

[00019] Os ditos patógenos são preferivelmente selecionados a partir de bactérias, e os ditos patógenos bacterianos são preferivelmente se- lecionados a partir de: gênero Propionibacterium, preferivelmente a es- pécie acnes, Staphylococcus, preferivelmente epidermidis, aureus, war- neri, pyogenes, mitis Corynebacterium ssp; Pseudomonas, preferivel- mente aeruginosa; Acinetobacter, preferivelmente johnsonii; Strepto- coccus, preferivelmente pyogenes; Micrococcus ssp. e Brevibacterium ssp.

[00020] Além disso, a composição compreendendo probióticos, de preferência uma ou mais bactérias probióticas, como descritos em de- talhe abaixo, é indicada para proteger a pele e/ou os lábios e/ou as con- juntivas contra a radiação UV, UV-A e/ou UV-B. Por outras palavras, a composição é indicada para prevenir e/ou atenuar os danos e/ou os efeitos devidos/relacionados à exposição à radiação UV, UV-A e/ou UV- B. A composição é preferivelmente indicada para prevenir e/ou atenuar o envelhecimento da pele.

[00021] A partir deste ponto de vista, a composição compreendendo probióticos, preferivelmente uma ou mais bactérias probióticas, como descritos em detalhe abaixo, tem objetivos cosméticos. Os usos da com- posição preferivelmente estão relacionadas/são devidos à ação imuno- moduladora dos probióticos contidos na composição, preferivelmente os probióticos como definidos e descritos abaixo. A dita imunomodulação envolve uma modulação, preferivelmente uma redução da expressão de pelo menos uma citocina selecionada a partir de: citocinas hematopoié- ticas, preferivelmente os fatores de crescimento de hematopoese e/ou o FEC; citocinas inflamatórias primárias, preferivelmente a IL-1 e/ou o TNF; citocinas anti-inflamatórias e/ou imunossupressoras, preferivel- mente a IL-10 e/ou o TGF-b; citocinas inflamatórias secundárias (quimi- ocinas); citocinas que regulam uma resposta imune específica, preferi- velmente a IL-2, e as suas combinações. A dita imunomodulação en- volve preferivelmente uma modulação, preferivelmente uma redução da expressão de pelo menos uma citocina, selecionada a partir de: IL-1β, IL-10, IL-8, TSLP e suas combinações.

[00022] A este respeito, observaremos que as citocinas são media- dores polipeptídicos não específicos para o antígeno, que atuam como sinais de comunicação entre as células do sistema imunológico e entre este e vários órgãos e tecidos. Elas são produzidas por diferentes tipos de células e, uma vez liberadas no corpo, induzem reações específicas nas células adjacentes (efeito parácrino), em outras muito distantes (efeito endócrino) ou naquelas que as criaram (efeito autócrino). Em par- ticular, as produzidas pelas células do sistema imunológico, como as interleucinas e as quimiocinas, desempenham um papel fundamental na regulação e ativação de nossos mecanismos de defesa e nos processos inflamatórios. A complexa rede de citocinas mantém um equilíbrio entre os efeitos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios. Um desequilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, bem como uma pro- dução descontrolada de citocinas, pode resultar em doenças do tipo in- flamatório, alergias ou patologias autoimunes. A TSLP (linfopoietina es- tromal tímica) é uma proteína pertencente à família das citocinas e de- sempenha um papel importante na maturação das populações de célu- las T através da ativação de células que exibem o antígeno. A TSLP é produzida principalmente por células não hematopoiéticas, como os fi- broblastos, as células epiteliais e os vários tipos de células estromais, e a sua expressão está ligada a muitos estados patológicos, incluindo a asma, a artrite inflamatória, a dermatite atópica, o eczema, a esofagite eosinofílica e outras condições alérgicas.

[00023] Em particular, a Requerente mostrou que, quando os quera- tinócitos são expostos aos probióticos, estes são capazes de exercer um efeito imunomodulador, como é evidente a partir da avaliação de ensaios de citocinas no sobrenadante celular. Em particular, observou- se que a expressão de IL1β, IL10 e IL8 foi reduzida pelas cepas probió- ticas consideradas individualmente, em particular pelo L. paracasei LPC-S01. O efeito de conter a expressão de citocinas apareceu mais evidente após um desafio dos queratinócitos com os LPS.

[00024] No que se refere à TSLP, o contato com os probióticos de- terminou uma redução nesse indicador em comparação com a expres-

são da linha de base (de queratinócitos não estimulados pelo probió- tico). A pré-estimulação dos queratinócitos com os LPS não resultou em um aumento nos níveis de TLSP, um fenômeno esperado, pois é sabido que outras moléculas são mais estimulantes para os receptores Toll-like dos LPS. As cepas probióticas, consideradas individualmente e em uma mistura, mostraram-se eficazes no condicionamento da expressão desse indicador. O indicador é de considerável interesse, pois é supe- rexpresso em algumas patologias da pele, como a dermatite atópica. Além disso, essa citocina é considerada um mediador-chave na inter- face funcional entre os queratinócitos e as células dendríticas.

[00025] De acordo com um aspecto preferido da invenção, a compo- sição é útil nos processos de cura de feridas e/ou re-epitelização e/ou cicatrização da pele ferida e/ou da pele afetada por distúrbios.

[00026] Portanto, os dados indicam claramente que os probióticos, em particular as cepas testadas, são capazes de exercer um efeito anti- inflamatório e/ou imunomodulador sobre os queratinócitos e, portanto, sobre a pele.

[00027] Em geral, considerando os efeitos aqui descritos, a compo- sição baseada em probióticos aqui descrita é útil para o propósito de restaurar o equilíbrio da microbiota da pele.

[00028] No contexto da presente invenção, a "pele" significa a pri- meira linha de defesa contra o ambiente externo; em particular, essa defesa é realizada pela ação dos queratinócitos disseminados na ca- mada mais externa da pele (epiderme), onde eles podem induzir a se- creção de citocinas e quimiocinas, a fim de liberar uma mensagem de alerta para as camadas mais profundas da pele, gerando, assim, uma resposta inflamatória. No curso de seu desenvolvimento, os queratinó- citos migram das camadas mais profundas para as camadas mais su- perficiais, com uma deposição progressiva de queratina, que é respon- sável pela ação protetora em relação às células subjacentes.

[00029] No contexto da presente invenção, o "envelhecimento da pele" significa um processo fisiológico totalmente natural e inevitável que ocorre em todos os indivíduos. Com o passar do tempo, a pele sofre alterações estruturais causadas por uma série de fatores de diferentes origens, que provocam uma perda de umidade da pele, o aparecimento de rugas finas, a perda de elasticidade, a hiperceratose e a formação de manchas hiperpigmentadas, chamadas “manchas da idade”.

[00030] O dito envelhecimento é preferivelmente um envelhecimento intrínseco - ou cronológico - que depende substancialmente de fatores genéticos (ou intrínsecos). Alternativamente, o dito envelhecimento da pele é extrínseco - ou devido a fatores ambientais - isto é, causado por fatores externos (fatores extrínsecos).

[00031] Falando de um modo geral, o envelhecimento intrínseco nor- malmente começa após os 25 anos de idade. Normalmente envolve uma série de alterações que, em geral, levam a um afinamento e/ou colapso da estrutura da pele.

[00032] O envelhecimento extrínseco é, de preferência, causado pela agressão de agentes externos e/ou fatores ambientais, de prefe- rência selecionados a partir de: radiação UV (responsável pelo fotoen- velhecimento), tabagismo, abuso de álcool, poluição, contato contínuo com substâncias irritantes e suas combinações.

[00033] Os danos e/ou os efeitos devidos/relacionados à exposição à radiação UV são preferivelmente selecionados a partir de: eritema, pigmentação, ceratose, hiperceratose, vermelhidão da pele, queimadu- ras solares, queimaduras, fotoenvelhecimento actínico ou elastose so- lar, catarata cortical, pterígio, reativação do herpes oral, danos na pele de qualquer natureza, de preferência danos aos lábios e/ou às conjun- tivas, melanoma de pele, carcinoma de células escamosas da pele, car- cinoma basocelular, carcinoma de células escamosas da córnea ou con- juntivas e/ou combinações e/ou complicações e/ou seus resultados.

[00034] No contexto da presente invenção, "restaurar o equilíbrio da microbiota da pele" significa restaurar a composição fisiológica qualita- tiva-quantitativa da microbiota da pele, entendida como todo o conjunto de microrganismos presentes sobre a pele, e, assim, restaurar a ecolo- gia microbiana cutânea fisiológica.

[00035] No contexto da presente invenção, "desafio" significa qual- quer teste ou desafio ou ensaio experimental envolvendo a contamina- ção com microrganismos de diferentes espécies e uma avaliação sub- sequente das alterações na carga microbiana, normalmente por meio de uma contagem de placas do número de microrganismos vivos em intervalos regulares de tempo.

[00036] No contexto da presente invenção, "probiótico", de acordo com a definição dada pela FAO e pela OMS, significa: “Microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício de saúde ao hospedeiro”. Em outras palavras, os probióti- cos são microrganismos que demonstram ser capazes, uma vez consu- midos em quantidades adequadas, de exercer funções que são benéfi- cas para o corpo.

[00037] Os ditos microrganismos são preferivelmente selecionados a partir de: bactérias, fungos, leveduras e suas combinações.

[00038] De acordo com um aspecto preferido da invenção, as bacté- rias pertencem a pelo menos um gênero selecionado a partir de: Lacto- bacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Propionibacterium, Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus e Enterococcus. Mais preferivelmente, as bactérias pertencem ao gênero Lactobacillus.

[00039] De acordo com outro aspecto preferido da invenção, as bac- térias do gênero Lactobacillus pertencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophi- lus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobaci- llus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lac- tobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofa- ciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sa- livarius, Lactobacillus sanfranciscensis e suas combinações

[00040] Mais preferivelmente, os lactobacilos são da espécie Lacto- bacillus paracasei, preferivelmente a cepa Lactobacillus paracasei DG® CNCM I-1572 e/ou a cepa Lactobacillus paracasei LPC-S01.

[00041] Ambas as cepas foram isoladas e depositadas pela SOFAR S.p.A., em particular a cepa bacteriana Lactobacillus paracasei DG foi depositada com a Collection of Cultures of Microorganism (CNCM) do Instituto Pasteur, em Paris, em 05/05/1995, com o número de depósito CNCM I-1572. A cepa foi inicialmente chamada Lactobacillus casei DG sub. casei.

[00042] A cepa bacteriana Lactobacillus paracasei LPC-S01 foi de- positada com a DSMZ, com o número de acesso DSM26760.

[00043] As ditas cepas são particularmente eficazes para os usos aqui descritos quando são usadas em associação e/ou combinação; de fato, elas mostram um efeito aditivo e/ou mesmo sinergístico.

[00044] De acordo com um outro aspecto preferido da invenção, as bactérias do gênero Bifidobacterium pertencem a pelo menos uma es- pécie selecionada a partir de: B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infan- tis, B. longum, B. adolescentis, B. catenulatum, B. angulatum, B. aste- roides, B. bourn, B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. dentico- lens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. inopinatum,

B. lactis, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenula- tum, B. pseudolongum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. subtile, B. thermacidophilum, B. thermophilum e B. tsurumiense, mais preferivelmente selecionadas a partir de: Bacillus clausii, Bacillus subti- lis, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium Bacillus halodurans, Baci- llus thuringiensis, Bacillus insolitus e Bacillus marinus.

[00045] De acordo com um outro aspecto preferido da invenção, as bactérias do gênero Propionibacterium pertencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: P. shermanii, P. acnes, P. australiense, P. avidum, P. cyclohexanicum, P. freudenreichii, P. granulosum, P. jen- senii, P. microaerophilum, P. propionicum e P. thoenii.

[00046] De acordo com um outro aspecto preferido da invenção, as bactérias do gênero Streptococcus pertencem a pelo menos uma espé- cies selecionada a partir de: Streptococcus thermophilus, Streptococcus salivarius, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Strepto- coccus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus constellatus, Strepto- coccus downei, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus ferus, Streptococcus infantarius, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus orisratti, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pyoge- nes, Streptococcus ratti, Streptococcus tigurinus, Streptococcus sangui- nis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis, Streptococcus viridans e Streptococcus zo- oepidemicus.

[00047] De acordo com um outro aspecto preferido da invenção, as bactérias do gênero Lactococcus pertencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: L. chungangensis, L. formosensis, L. fujiensis,

L. garvieae, L. lactis, L. piscium, L. plantarum, L. raffinolactis e L. taiwa- nensis.

[00048] De acordo com um outro aspecto preferido da invenção, as bactérias do gênero Aerococcus pertencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: A. urinae, A. sanguinicola, A. christensenii, A. suis, A. urinaeequi e A. urinaehomini.

[00049] De acordo com um outro aspecto preferido da invenção, as bactérias do gênero Enterococcus pertencem a pelo menos uma espé- cie selecionada a partir de: Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hirae, Enterococcus ma- lodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococ- cus pseudoavium, Enterococcus raffinosus e Enterococcus solitarius.

[00050] De acordo com um outro aspecto preferido da invenção, as leveduras pertencem ao gênero Saccharomyces, mais preferivelmente à espécie Saccharomyces cerevisiae e/ou Saccharomyces boulardii.

[00051] Os microrganismos, preferivelmente a cepa bacteriana L. ca- sei DG® e/ou a cepa bacteriana Lactobacillus paracasei LPC-S01, são preferivelmente usados vivos, isto é, eles são usados como probióticos.

[00052] Em alternativa, os microrganismos, preferivelmente a cepa bacteriana L. casei DG® e/ou a cepa bacteriana Lactobacillus paracasei LPC-S01, estão mortos ou tindalizados.

[00053] Em uma modalidade adicional, os microrganismos, preferi- velmente a cepa bacteriana L. casei DG® e/ou a cepa bacteriana Lacto- bacillus paracasei LPC-S01, são usados na forma de um lisado e/ou extrato, ou seja, eles são usados como um paraprobióticos. Alternativa- mente, os microrganismos, de preferência a cepa bacteriana L. casei DG® e/ou a cepa bacteriana Lactobacillus paracasei LPC-S01, são usa- dos na forma de produtos bacterianos, sobrenadantes, derivados, pre-

ferivelmente derivados bacterianos, preferivelmente metabólitos, bio- produtos metabólicos, pós-bióticos, parede celular e seus componentes, exopolissacarídeos ou compostos contendo componentes imunogêni- cos, preferivelmente selecionados a partir de: ribossomos e glicoproteí- nas, derivados imunoestimulantes, como glucanos e outros polissacarí- deos, lipopolissacarídeos e qualquer componente do sobrenadante.

[00054] Em geral, os ditos microrganismos são microrganismos indi- viduais ou combinações de microrganismos, ou associações, de qual- quer espécie microbiana indicada na lista de QPS da EFSA.

[00055] Em qualquer caso, a composição da invenção pode compre- ender qualquer tipo de microrganismo, em particular bactérias, tendo um efeito/ação/função probióticos e/ou microrganismos como definidos acima, preferivelmente bactérias, que sejam capazes de colonizar esta- velmente a pele, o intestino e/ou outras regiões do corpo, retirando es- paço de microrganismos/bactérias patogênicos e/ou combatendo-os di- retamente. A composição cosmética e/ou a composição para uso mé- dico, conforme descrito acima, compreende preferivelmente uma com- binação das cepas especificadas acima com outros microrganismos como descritos acima, preferivelmente selecionados a partir de: bacté- rias, fungos, leveduras e suas combinações.

[00056] Os microrganismos, preferivelmente as bactérias, estão pre- sentes em uma quantidade mínima que seja suficiente para permitir uma colonização temporária da pele, do intestino e/ou de outras regiões do corpo. A dita quantidade varia preferivelmente entre 106 e 1011 unidades de microrganismos, mais preferivelmente 108 e 109 unidades de micror- ganismos, sendo a dita quantidade preferivelmente uma quanti- dade/dose por dia (diariamente).

[00057] A composição compreende ainda excipientes e/ou outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis e/ou veículos.

[00058] A composição da presente invenção preferivelmente com- preende ainda uma substância selecionada a partir de: plasma, PRP, substâncias cicatrizantes, substâncias de re-epitelização, agentes umectantes, agentes hidratantes, agentes emolientes, agentes adsor- ventes, analgésicos e flebotômicos, anti-inflamatórios, relaxantes mus- culares, substâncias peptídicas e/ou proteicas e/ou proteínas, como co- lágeno, substâncias pertencentes ao tecido conjuntivo, como glicosami- noglicanos, preferivelmente sulfato de condroitina e/ou suas combina- ções.

[00059] Em uma modalidade da presente invenção, a composição é formulada para aplicações preferivelmente de um tipo tópico, preferivel- mente na forma de um creme, gel, óleo, emulsões, sprays, gazes, em- plastros, bandagens, loções, musses, unguentos, pastas ou formula- ções líquidas, nos quais a composição é preferivelmente adicionada ex- temporaneamente, antes da aplicação sobre a pele.

[00060] Em uma modalidade da presente invenção, a composição é usada para o transplante de microbiota da pele. No contexto da presente invenção, o transplante de microbiota da pele significa a administração, preferivelmente tópica, da microbiota da pele, e/ou parte dela, de paci- entes saudáveis, que não tenham distúrbios da pele, a fim de restabe- lecer um equilíbrio correto, tratando assim qualquer disbiose que possa estar presente. Para esses fins, a composição da invenção compreende preferivelmente as bactérias, preferivelmente a cepa bacteriana L. casei DG® e/ou a cepa bacteriana Lactobacillus paracasei LPC-S01, e opcio- nalmente também fungos, vírus, peptídeos, substâncias proteicas e/ou peptídicas, carboidratos, vitaminas, microelementos ou qualquer outra substância que caracterize a microbiota da pele e/ou outras regiões do corpo. Para tais fins, a dita composição é preferivelmente usada em combinação com: aminoácidos, suplementos, vitaminas, microelemen-

tos, como zinco e selênio, macro e micronutrientes, enzimas e/ou subs- tâncias prebióticas, como fruto-oligossacarídeos (FOS), galacto-oligos- sacarídeos (GOS), inulina, goma guar e/ou suas combinações. Em uma modalidade da presente invenção, a composição é formulada para a administração oral, preferivelmente como uma formulação sólida, prefe- rivelmente como pílulas, cápsulas, comprimidos, pó granular, cápsulas de revestimentos duros, grânulos que se dissolvem oralmente, sachês ou pastilhas.

[00061] Alternativamente, a composição é formulada como um lí- quido, de preferência para preparações extemporâneas.

[00062] Alternativamente, a composição está em uma forma capaz de exercer uma ação tópica, por exemplo, como um enema, creme, spray, gel, emplastro, loções, musses, unguentos, pastas ou formula- ções líquidas, nos quais a composição é preferivelmente adicionada e/ou preparada extemporaneamente, antes da aplicação sobre a pele.

[00063] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a composição da invenção é usada em combinação com: aminoácidos, suplementos, vitaminas, microelementos, como zinco e selênio, macro e micronutrientes, enzimas e/ou substâncias prebióticas, como fruto-oli- gossacarídeos (FOS), galacto-oligossacarídeos (GOS), inulina, goma guar ou suas combinações.

EXEMPLO Cepas e células bacterianas

[00064] A título de exemplo, a invenção foi demonstrada usando as seguintes cepas bacterianas: - L. casei DG® {Lactobacillus paracasei CNCM I-1572) - L. paracasei LPC-S01; - mistura a 1:1 de L. casei DG® + L. paracasei LPC-S01.

[00065] As cepas bacterianas foram cultivadas em um meio seletivo consistindo em MRS (de Man Rogosa Sharpe), por 16 horas, a 37°C.

Assim que o crescimento atingiu a fase estacionária, uma amostra de bactérias foi coletada para ser usada nos testes. Elas foram lavadas várias vezes com PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfato) e cen- trifugadas para remover o meio de cultura gasto. Utilizou-se células vi- vas na fase estacionária porque nesta fase, e não na estacionária, as bactérias induzem uma resposta imune menor.

[00066] Todos os testes descritos abaixo foram realizados em tripli- cado.

[00067] Os queratinócitos humanos normais, mantidos em cultura com suplementos adequados, foram usados para as experiências.

[00068] O Propionibacterium acnes (P. acnes) CCUG 50865 (adqui- rido da CCUG (Culture Collection, Universidade de Goteborg)) foi culti- vado por 16 horas, a 37°C, em Cooked Meat Medium (tanto líquido quanto sólido), preparado de acordo com as instruções do fornecedor. A concentração bacteriana foi subsequentemente determinada por es- pectrofotometria, com leituras em D.O. 600 nm, e foi usada para os tes- tes de adesão. Teste de adesão e desafio da linhagem celular com o patógeno

[00069] Os queratinócitos foram semeados a 37°C, com 5% de CO2, em placas de cultura de células e deixados crescer até atingirem a con- fluência (isto é, cerca de 105 células totais). A razão de semeadura foi 2,5x105 células/0,32 cm2 (isto é, uma densidade celular de 7,8x105 cé- lulas/cm2). No momento da experiência, o meio foi removido, as células foram lavadas com um meio isento de antibióticos e as bactérias foram então adicionadas aos testes, que foram realizados de acordo com os diferentes protocolos descritos abaixo. 1) Adesão das cepas aos queratinócitos.

[00070] Após o número de queratinócitos por poço ter sido determi- nado, as cepas de L. paracasei foram adicionadas em uma MOI de 1:10

(10^5 células e 10^6 UFC de bactérias por poço). As cepas foram tes- tadas em uma razão de 1:1, tanto individualmente quanto em combina- ção.

[00071] As bactérias foram deixadas em contato com as células man- tidas a 37°C, com agitação leve, por 60 minutos. No final da incubação, o meio foi removido e as células foram lavadas com um meio estéril para remover as bactérias que não aderiram à monocamada celular.

[00072] Para calcular o número de bactérias aderentes, as células foram separadas e lisadas e as bactérias foram contadas por coloração supravital após a semeadura em meio MRS com ágar. 2) Teste de exclusão de adesão.

[00073] Após o número de queratinócitos ser determinado para cada poço, as cepas de L. paracasei foram adicionadas às células na razão de 1:1, tanto individualmente quanto em combinação.

[00074] As bactérias foram deixadas em contato com as células man- tidas a 37°C, com agitação leve, por 60 minutos. No final da incubação, o meio foi removido e as células foram lavadas com um meio estéril para remover as bactérias que não aderiram à monocamada celular.

[00075] O P. acnes (em uma MOI de 1:10) foi então colocado em contato com as células deixadas incubar por 60 minutos, a 37°C. No final da incubação, o meio de cultura foi removido e as bactérias não aderentes foram eliminadas por lavagem com meio estéril.

[00076] Para calcular o número de P. acnes aderentes aos querati- nócitos, as células foram separadas e lisadas e as bactérias foram con- tadas por coloração supravital após semeadura em ágar de sangue de ovelha a 5%, sob anaerobiose, por 48-72 horas, a 37°C. Os poços com os queratinócitos que não tinham sido pré-incubados com as cepas de L. paracasei, porém mais exatamente inoculados com o P. acnes sozi- nho, foram usados como um controle positivo para a adesão do P. acnes (controle de adesão de P. acnes), enquanto os poços com células que não tinham sido incubadas com qualquer bactéria foram usados como um controle negativo (controle de esterilidade). 3) Teste de competição da adesão

[00077] Após o número de queratinócitos por poço ter sido determi- nado, as cepas de L. paracasei foram adicionadas (tanto individual- mente quanto na razão de 1:1) simultaneamente com o P. acnes. As bactérias foram adicionadas em uma MOI geral de 1:10 e em uma razão de probiótico:patógeno de 1:1.

[00078] As bactérias foram deixadas em contato com as células a 37°C, com agitação leve, por 60 minutos. No final da incubação, o meio foi removido e as células foram lavadas com um meio estéril para remo- ver as bactérias que não tinham aderido à monocamada celular.

[00079] Para calcular o número de P. acnes aderentes aos querati- nócitos, as células foram separadas e lisadas e as bactérias foram con- tadas por coloração supravital após semeadura em ágar de sangue de ovelha a 5%, sob anaerobiose, por 48-72 horas, a 37°C. Os poços com queratinócitos inoculados com P. acnes sozinho foram usados como um controle positivo (controle de adesão de P. acnes), enquanto os poços com as células que não tinham sido incubadas com qualquer bactéria foram usados como um controle negativo (controle de esterilidade). 4) Teste de remoção dos patógenos aderentes.

[00080] Após o número de queratinócitos por poço ter sido determi- nado, foi adicionado o P. acnes (MOI de 1:10).

[00081] As bactérias foram deixadas em contato com as células man- tidas a 37°C, com agitação leve, por 60 minutos. No final da incubação, o meio foi removido e as bactérias que não tinham aderido à monoca- mada celular foram removidas por lavagens repetidas com meio estéril.

[00082] Em seguida, as cepas de L. paracasei (tanto individualmente quanto em combinação em uma razão de 1:1) foram deixadas em con- tato com as células mantidas a 37°C, com leve agitação, por 60 minutos.

No final da incubação, o meio foi removido e as células foram lavadas com um meio estéril para remover as bactérias que não tinham aderido à monocamada celular.

[00083] Para calcular o número de P. acnes aderentes aos querati- nócitos, as células foram separadas e lisadas e as bactérias foram con- tadas por coloração supravital após semeadura em ágar de sangue de ovelha a 5%, sob anaerobiose, por 48-72 horas, a 37°C.

[00084] Os queratinócitos tratados com P. acnes foram usados como um controle positivo (controle de adesão de P. acnes), enquanto os que- ratinócitos que não tinham sido tratados com as bactérias foram usados como um controle negativo (controle de esterilidade).

[00085] Os testes realizados tanto sobre as cepas individuais na forma pura, quanto sobre a mistura a 1:1 foram repetidos duas vezes. 1) Adesão das cepas aos queratinócitos - Resultados

[00086] Os resultados deste teste mostraram a capacidade das ce- pas, consideradas individualmente e em combinação, de aderirem aos queratinócitos. Em particular, a cepa L. casei DG® mostrou uma maior capacidade de adesão aos queratinócitos do que o L. paracasei LPC- S01. A capacidade de adesão observada para a combinação é, assim, presumivelmente atribuível à contribuição proporcionada pela cepa L. casei DG®. Tabela 1 Adesão (No. de bactérias - CFU/poço) L. casei DG 139 x 10^2 - 141 x 10^2 L. paracasei S01 18,2 x 10^2 - 21,8 x 10^2 mistura a 1:1 98 x 10^2 - 122 x 10^2 Propionibacterium acnes 700 x 10^2 - 2000 x 10^2 - Teste de exclusão da adesão (pré-tratamento das células eucarióticas com probióticos e subsequente incubação com o patógeno) - Resulta- dos

[00087] Como observado acima, a monocamada de queratinócitos foi inicialmente exposta ao contato com os probióticos e, subsequente- mente, após a remoção das bactérias não aderentes, ao contato com P. acnes, que foi então removido por lavagem; isto foi seguido por uma quantificação da viabilidade residual do P. acnes.

[00088] O controle negativo é representado por células eucarióticas sem estimulação pelo contato com as bactérias, enquanto o controle positivo é representado pela capacidade do P. acnes de aderir aos que- ratinócitos sem qualquer pré-tratamento com probióticos. A Fig. 1A mos- tra os resultados referentes à adesão do P. acnes, em termos da por- centagem de células vivas e viáveis que aderem após a pré-estimulação dos queratinócitos pelo contato com os diferentes probióticos testados. Onde 100 representa a adesão do P. acnes na ausência de estimulação com probióticos, a capacidade de inibição das cepas testadas foi ex- pressa como uma % de redução da adesão pelo P. acnes em compara- ção com o controle positivo.

[00089] Ambas as cepas probióticas mostraram uma capacidade de impedir a adesão do P. acnes, em uma % semelhante (42% para L. casei DG® e 35% para L. paracasei LPC-S01. - Teste de competição da adesão (coincubação das células eucarióticas com os probióticos e com o patógeno) - Resultados

[00090] Durante esses testes, a redução, se alguma, da adesão do P. acnes aos queratinócitos foi avaliada após um tratamento simultâneo da linhagem celular com os probióticos e o patógeno, com o objetivo de avaliar o possível efeito de inibição competitiva exercido pelos probióti- cos, quando coincubados com o P. acnes.

[00091] Os queratinócitos tratados com o P. acnes foram usados como um controle positivo, enquanto os queratinócitos que não foram tratados com as bactérias foram usados como um controle negativo (controle de esterilidade).

[00092] A Fig. 1B mostra graficamente os resultados relacionados à adesão do P. acnes em termos da porcentagem de células vivas e viá- veis que aderiram após a coincubação dos queratinócitos com o P. ac- nes e com os diferentes probióticos testados. Como descrito anterior- mente, onde 100 representa a adesão do P. acnes na ausência de esti- mulação pelos probióticos, a capacidade de inibição das cepas testadas foi expressa como uma % de redução da adesão pelo P. acnes em com- paração com o controle positivo.

[00093] Nesse modo de interação entre os probióticos e o patógeno, a cepa L. casei DG® mostrou uma capacidade de reduzir a adesão em 17%, enquanto a cepa L. paracasei LPC-S01 ficou em 9%. A combina- ção das cepas produziu uma redução estatisticamente significativa na adesão do P. acnes, que ficou em 42%, uma porcentagem distintamente maior do que a observada para as cepas consideradas individualmente, e maior que a soma dos seus efeitos. - Teste sobre a remoção de patógenos aderentes (pré-tratamento das células eucarióticas com o patógeno e subsequente incubação com o probiótico) - Resultados

[00094] Durante esses testes, qualquer redução na adesão do P. ac- nes aos queratinócitos foi avaliada após um pré-tratamento da linhagem celular com o patógeno e incubação subsequente com os probióticos após a remoção do patógeno não aderente.

[00095] Os queratinócitos tratados com P. acnes foram usados como um controle positivo, enquanto os queratinócitos que não foram tratados com as bactérias foram usados como um controle negativo (controle de esterilidade).

[00096] A Fig.1C mostra graficamente os resultados relacionados à adesão do P. acnes em termos da porcentagem de células vivas e viá- veis que aderiram após a incubação dos queratinócitos com os diferen- tes probióticos testados, após o desafio das células eucarióticas com o patógeno. Como descrito anteriormente, onde 100 representa a adesão do P. acnes na ausência de probióticos, a capacidade de inibição das cepas testadas foi expressa como uma % de redução da adesão pelo P. acnes em comparação com o controle positivo.

[00097] Também nesses testes, como no caso do protocolo de coin- cubação, foi observado um efeito sinergístico interessante, estatistica- mente significativo, ligado à combinação dos 2 probióticos, que mostra- ram ser capazes de reduzir a adesão do P. acnes em 42%. Os probióti- cos individuais, por outro lado, mostraram uma capacidade de reduzir a adesão que era menos que a metade daquela da mistura, 18% par oa L. casei DG® e 11% para o L. paracasei LPC-S01. Testes de imunomodulação

[00098] Os testes de imunomodulação foram realizados com o obje- tivo de verificar se as cepas probióticas teriam a capacidade de modular a liberação de citocinas pelos queratinócitos humanos expostos à esti- mulação negativa de lipopolissacarídeos (LPS) bacterianos.

[00099] Os queratinócitos humanos normais foram semeados como descrito acima em placas de cultura de células e, ao atingirem a con- fluência, foram usados para as experiências. Em particular, as monoca- madas celulares foram lavadas e incubadas em um meio novo que não continha antibióticos. Em seguida, as cepas de L. paracasei foram adi- cionadas individualmente e em combinação, em uma razão de 1:1, em uma MOI de 1:10.

[000100] As bactérias foram deixadas em contato com os queratinóci- tos por 120 minutos, a 37°C, com leve agitação. Em alguns casos, as células foram pré-estimuladas (desafiadas por cerca de 24 h) com os LPS a uma concentração final de 100 ng/ml.

[000101] No final da incubação, o meio foi removido, as células foram lavadas com um meio estéril para eliminar as bactérias que não tinham aderido às células e subsequentemente mantidas em um meio de cul- tura por 24 horas, a 37°C.

[000102] No final da incubação, o meio de cultura foi coletado para quantificar as citocinas produzidas por meio do ensaio ELISA (IL-10, IL- 1 beta, IL-8, linfopoietina estromal tímica [TSLP]), enquanto os níveis de ciclooxigenase-2 (COX-2) e NF-kB ativado (induzido por LPS ou IL- 1beta) foram determinados por Western Blot sobre as proteínas totais, extraídas dos queratinócitos lisados.

[000103] Esses marcadores foram selecionados porque estão envol- vidos tanto na flogose aguda quanto na dermatite alérgica, bem como na flogose crônica associada. Em particular, a IL-10 é considerada anti- inflamatória e a sua produção em geral aumenta em paralelo com a das citocinas pró-inflamatórias poderosas, como a IL-1beta. A TSLP é uma citocina que modula a ação dos linfócitos e está envolvida no desenvol- vimento de ceratite crônica. Resultados

[000104] A capacidade das cepas testadas de estimular a resposta imune dos queratinócitos foi avaliada de acordo com o protocolo des- crito acima. Os testes foram concentrados na determinação das citoci- nas (IL-8, IL-1beta e IL-10) e na avaliação da ativação de 2 marcadores, COX-2 e NF-kB.

[000105] A COX-2 (ciclo-oxigenase-2) representa um marcador indu- zível, produzido por um número limitado de tipos de células em resposta a um estímulo inflamatório específico. Ela é superexpressa em várias neoplasias, incluindo as neoplasias da pele. O NF-kB (fator nuclear re- forçador de cadeia leve capa de células B ativadas) é um complexo de proteínas com a função de um fator de transcrição, produzido por todos os tipos de células em resposta a vários estímulos, incluindo aqueles de uma natureza inflamatória.

[000106] Os queratinócitos cultivados foram expostos aos probióticos

L. paracasei, L. casei DG® e L. paracasei LPC-S01, e a combinação das duas cepas em uma razão de 1:1, de acordo com os procedimentos já descritos.

Os sobrenadantes celulares foram então analisados para de- terminar as citocinas, com referência particular àquelas de um tipo anti- inflamatório que poderiam ser analisadas nos queratinócitos colocados em contato com cepas probióticas.

Os resultados do ensaio estão resu- midos na Fig. 2 e mostram graficamente o ensaio de IL-10, IL-1beta e IL-8 nos sobrenadantes celulares, expresso em pg por ml de sobrena- dante, obtido por meio do teste ELISA.

As avaliações detalhadas dos resultados obtidos permitem concluir como se segue: - IL1β: níveis de expressão de alguns nanogramas por ml de sobrena- dante dos queratinócitos.

O contato com os probióticos não provocou uma redução estatisticamente significativa nessa citocina, em compara- ção com a expressão da linha de base (de queratinócitos não estimula- dos pelo probiótico). O L. paracasei LPC-S01 mostrou um impacto mo- deradamente positivo em comparação com o L. casei DG® e um que foi comparável ao da combinação.

Considerações análogas também se aplicam no caso de pré-estimulação dos queratinócitos com os LPS, a fim de maximizar a resposta imune. - IL-10: níveis de expressão de várias dezenas de pg por ml de sobre- nadante dos queratinócitos.

O contato com os probióticos provocou uma redução nessa citocina em comparação com a expressão da linha de base (de queratinócitos não estimulados pelo probiótico). O L. paracasei LPC-S01 mostrou um impacto moderadamente positivo em comparação com o L. casei DG® e comparável ao da combinação.

Considerações análogas também se aplicam no caso de pré-estimulação dos querati- nócitos com os LPS, a fim de maximizar a resposta imune. - IL-8: níveis de expressão de alguns nanogramas por ml de sobrena- dante dos queratinócitos.

O contato com os probióticos provocou uma redução nessa citocina em comparação com a expressão da linha de base (de queratinócitos não estimulados pelo probiótico). O L. paracasei LPC-S01 mostrou um impacto positivo em comparação com o L. casei DG® e comparável ao da combinação. No caso da pré-estimulação dos queratinócitos com os LPS, a fim de maximizar a resposta imune, ambos os probióticos mostraram uma capacidade de influenciar positivamente o controle da citocina, com um potencial análogo tanto para os probióti- cos considerados individualmente, quanto para a mistura. - TSLP: níveis de expressão de alguns nanogramas por ml de sobrena- dante dos queratinócitos. O contato com os probióticos provocou uma redução no indicador em comparação com a expressão da linha de base (de queratinócitos não estimulados pelo probiótico). As cepas probióti- cas, consideradas individualmente e em combinação, mostraram ser efi- cazes no condicionamento da expressão desse indicador. O indicador é de considerável interesse, pois é superexpresso em algumas patologias da pele, como a dermatite atópica. Além disso, essa citocina é conside- rada um mediador-chave na interface funcional entre os queratinócitos e as células dendríticas.

[000107] A avaliação dos níveis de expressão da COX-2 tornou pos- sível mostrar que os níveis desse marcador não parecem sofrer altera- ções particulares após o contato dos queratinócitos com os probióticos, em comparação com os níveis de linha de base, exceto por uma ação moderada de contenção devida ao contato com o L. paracasei LPC-S01. O tratamento com os LPS mostrou um aumento nos níveis de expressão da COX-2 pelas células eucarióticas, um aumento que foi efetivamente contido e limitado pela ação dos probióticos. A presença do L. paracasei LPC-S01 elimina a expressão do marcador em um maior grau em com- paração com o L. casei DG®, enquanto a combinação das 2 cepas pro- bióticas não pareceu mostrar qualquer ação.

[000108] Como a expressão da IL8 e da COX-2 é regulada por meio do fator de transcrição NF-kB, foi realizada uma avaliação qualitativa da liberação de NF-kB pelos queratinócitos expostos aos probióticos. Os resultados demonstram que, na ausência do estímulo inflamatório re- presentado pelos LPS, a expressão do marcador não parece ser detec- tável. No entanto, ela é ativada pelos lipopolissacarídeos bacterianos através da fosforilação de p65. As 2 cepas probióticas manifestaram uma capacidade de conter a expressão do NF-kB, com referência parti- cular ao L. paracasei LPC-S01, cuja presença, tanto como uma única cepa quanto em uma mistura com DG, mostrou ser particularmente efi- caz em conter a expressão do NF-kB induzido por LPS. Avaliação da redução de danos causados por UV

[000109] A capacidade da cepa probiótica LPC-S01 de reduzir os da- nos causados pela radiação UV foi avaliada em um modelo completo de pele 3D reconstruída in vitro que reproduz os compartimentos da derme e da epiderme, assim possibilitando o estudo das modificações da ma- triz extracelular da derme e da diferenciação das camadas viáveis da pele (Modelo de Espessura Total da Pele). O estudo considerou a ava- liação do efeito da cepa LPC-S01 sobre a ativação do inflamassoma em resposta à radiação UV. A cepa LPC-S01 foi aplicada diretamente sobre a superfície do modelo de pele 3D, incubada durante a noite e depois enxaguada com solução salina para remover o excesso de produto. O tecido foi arranhado levemente e depois exposto a 1 MED (dose erite- matosa mínima) de UV, a fim de imitar a exposição solar normal. A ati- vação da inflamação foi testada 4 e 24 horas após a exposição à radia- ção UV. O tecido tratado com uma solução salina e exposto à radiação UV foi usado como um controle positivo. Uma solução salina foi usada como um controle negativo. Análise histomorfológica com tingimento de hematoxilina/eosina

[000110] No final do tratamento, os tecidos foram lavados com solu- ção salina e fixados em formalina a 10%. Para cada amostra, as réplicas biológicas (n = 3) foram incluídas nos mesmos blocos de parafina e 2 seções de 5 µm não consecutivas foram cortadas e coletadas. As se- ções de tecido foram tingidas com hematoxilina e eosina. As amostras histológicas foram analisadas com um microscópio óptico (aumento de 20x e 40x) e as alterações morfológicas no tecido e o efeito citotóxico foram avaliados. Imunocoloração do NFkB

[000111] A marcação do NFkB permite que o seu deslocamento do citoplasma celular para o núcleo seja avaliado; o seu deslocamento é de fato capaz de ativar o processo inflamatório. O NFkB foi marcado usando a prática de imunocoloração, conhecida na técnica. Em particu- lar, foi feito uso de um anticorpo primário Anti-NFkB (Abcam) e um anti- corpo secundário tingido com o fluoróforo Alexa 555 e uma contracolo- ração com DAPI para destacar os núcleos celulares. As imagens foram adquiridas com um microscópio de fluorescência com aumento de 40X. Quantificação da interleucina 1β por ELISA

[000112] Os anticorpos foram adsorvidos sobre uma placa ELISA e as amostras foram então incubadas. Um anticorpo secundário foi adicio- nado para formar um "sanduíche". A quantificação foi baseada em uma curva padrão. Os dados foram adquiridos por meio de medições espec- trofotométricas. Resultados da redução dos danos causados por UV

[000113] 4 horas após a exposição à radiação UV, o tecido não tratado (controle positivo) mostrou uma morfologia que não foi alterada, mas com células danificadas pela radiação UV na parte inferior da epiderme. Após 4 h, o tecido tratado com a cepa LPC-S01 não mostrou alteração substancial na morfologia ou na arquitetura geral do tecido ou no dano por queimadura presente na epiderme inferior. 24 horas após a exposi- ção à radiação UV, o tecido mostrou alterações típicas da epiderme de- vidas às queimaduras, com os núcleos picnóticos, a epiderme e a derme com alterações. A administração da cepa LPC-S01 não mostrou melho- ras na prevenção das alterações morfológicas no tecido induzidas pela radiação UV.

[000114] A Tabela 2 resume os resultados da quantificação do deslo- camento do NFkB 4 horas após a exposição à radiação UV. Tabela 2 Controle negativo Controle positivo LPC-S01 Número de 25,7 47,2 22,4 Translocações

[000115] 4 horas após a irradiação, o controle positivo mostrou um elevado número de deslocamentos do NFkB, particularmente na ca- mada suprabasal da epiderme.

[000116] O tratamento com o probiótico LPC-S01 foi capaz de inibir o deslocamento nuclear do NFkB em um grau significativo em compara- ção com o controle positivo. Além disso, a cepa LPC-S01 também mos- trou ser capaz de reduzir os níveis citoplasmáticos de NFkB.

[000117] Finalmente, a secreção de IL-1b mostrou um aumento 4, 8 e 24 horas após o dano com a radiação UV. A administração do probiótico LPC-S01 permitiu que a secreção da IL-1b fosse revertida 4, 8 e 24 ho- ras após o dano. Em particular, uma redução significativa foi observada 8 e 24 horas após o dano. Tabela 3 secreção de IL-13 NC 4h PC 4h S01 NC 8h PC 8h S01 NC PC S01 4h 8h 24h 24h 24h IL-1 β 2,12 2,74 2,10 2,49 3,18 1,92 3,13 4,78 3,44 (PG/ML)

[000118] O probiótico LPC-S01 mostrou, assim, uma capacidade de impedir a ativação da inflamação por inibição do deslocamento do NFkB para o núcleo das células submetidas ao dano pela radiação UV. Além disso, a cepa S01 mostrou um efeito direto na redução dos níveis de inflamação por redução dos níveis da interleucina pró-inflamatória 1β 4, 8 e 24 horas após o dano por irradiação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende probióticos para uso na prevenção e/ou no tratamento de distúrbios e/ou patologias, preferivelmente de um tipo inflamatório, que afetam a pele e/ou na redução e/ou no tratamento dos sintomas e/ou dos efeitos as- sociados aos ditos distúrbios/patologias e/ou para promover o processo de cura das feridas e/ou os processos de re-epitelização e/ou cicatriza- ção, em que os probióticos são bactérias da cepa Lactobacillus paraca- sei DG® CNCM I-1572 e/ou bactérias da cepa Lactobacillus paracasei LPC-S01 DSM26760.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que os ditos distúrbios e/ou as patologias que afetam a pele são selecionados a partir de: dermatite, possivelmente associada a irritações e/ou escoriações, acne, infecções, inflamações da pele, eri- tema, úlceras, psoríase, dermatite atópica, otite, rágades, fístulas, he- morroidas, qualquer outro distúrbio ou lesão da pele com a presença de um processo inflamatório adiantado e/ou combinações e/ou complica- ções e/ou resultados deles.

3. Uso de uma composição compreendendo probióticos, ca- racterizado pelo fato de que é para proteger a pele, preferivelmente os lábios e/ou as conjuntivas, contra a radiação UV, UV-A e/ou UV-B, pre- ferivelmente para prevenir e/ou atenuar os danos e/ou os efeitos devi- dos/relacionados à exposição à radiação UV, UV-A e/ou UV-B, mais preferivelmente para prevenir e/ou atenuar o envelhecimento da pele.

4. Composição para uso como definido na reivindicação 1 ou 2 ou para o uso como definido na reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda microrganismos selecio- nados a partir de: bactérias, fungos, leveduras e suas combinações; eles são preferivelmente bactérias pertencentes a pelo menos um gê- nero selecionado a partir de: Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus,

Propionibacterium, Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus e Entero- coccus; eles são preferivelmente bactérias pertencentes ao gênero Lac- tobacillus.

5. Composição para uso ou o uso, de acordo com a reivindi- cação 4, caracterizada pelo fato de que as bactérias do gênero Lacto- bacillus pertencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lac- tobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lacto- bacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus coryniformis, Lac- tobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus galli- narum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hil- gardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobaci- llus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus col- linoides, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactoba- cillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis e suas combinações.

6. Composição para uso ou o uso, de acordo com a reivindi- cação 4, caracterizada pelo fato de que as bactérias do gênero Bifido- bacterium pertencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum, B. adoles- centis, B. catenulatum, B. angulatum, B. asteroides, B. boum, B. choeri- num, B. coryneforme, B. cuniculi, B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. inopinatum, B. lactis, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. subtile, B. thermacidophilum, B. thermophilum e B. tsurumiense; mais preferivelmente selecionadas a partir de: Bacillus clausii, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium Bacillus halodurans, Bacillus thuringiensis, Bacillus insolitus e Bacillus marinus; e/ou as bactérias do gênero Propionibacterium per- tencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: P. sherman ii, P. acnes, P. australiense, P. avidum, P. cyclohexanicum, P. freuden- reichii, P. granulosum, P. jensenii, P. microaerophilum, P. propionicum e P. thoenii; e/ou as bactérias do gênero Streptococcus pertencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: Streptococcus ther- mophilus, Streptococcus salivarius, Streptococcus agalactiae, Strepto- coccus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Strepto- coccus constellatus, Streptococcus downei, Streptococcus dysgalac- tiae, Streptococcus equinus, Streptococcus ferus, Streptococcus infan- tarius, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus ora- lis, Streptococcus orisratti, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pseudopneumo- niae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus tigu- rinus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis, Streptococcus viridans e Streptococcus zooepidemicus; e/ou as bactérias do gênero Lactococcus pertencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: L. chungangensis, L. formosensis, L. fujiensis, L. garvieae, L. lactis, L. piscium, L. plantarum, L. raffinolactis e L. taiwanensise; e/ou as bac- térias do gênero Aerococcus pertencem a pelo menos uma espécie se- lecionada a partir de: A. urinae, A. sanguinicola, A. christensenii, A. suis, A. urinaeequi e A. urinaehominis; e/ou as bactérias do gênero Entero- coccus pertencem a pelo menos uma espécie selecionada a partir de: Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, En- terococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus haemope- roxidus, Enterococcus hirae, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus pseudoavium, Ente- rococcus raffinosus e Enterococcus solitarius e/ou as leveduras perten- cem ao gênero Saccharomyces, mais preferivelmente das espécies Saccharomyces cerevisiae e/ou Saccharomyces boulardii.

7. Composição para uso ou o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que os ditos microrganismos estão vivos ou mortos ou tindalizados, ou na forma de um lisado e/ou extrato, ou na forma de produtos bacterianos ou na forma de um sobrenadante ou em uma forma derivada preferivelmente selecionada a partir de: metabólitos, bioprodutos metabólicos, pós-bió- ticos, parede celular e seus componentes, exopolissacarídeos e com- postos contendo componentes imunogênicos preferivelmente selecio- nados a partir de: ribossomos e glicoproteínas, derivados imunoestimu- lantes, como glucanos e outros polissacarídeos, lipopolissacarídeos e qualquer componente do sobrenadante.

8. Composição para uso ou o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que os ditos microrganismos, de preferência as ditas bactérias, estão presentes em uma quantidade que varia entre 106 e 1011 unidades de microrganis- mos, preferivelmente 108 e 109 unidades de microrganismos, a dita quantidade sendo preferivelmente uma quantidade/dose por dia (diaria- mente).

9. Composição para uso ou o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que é para uso tópico, de preferência na forma de creme, gel, óleo, emulsões, sprays, gazes, emplastros, bandagens, loções, musses, unguentos, pastas ou formulações líquidas para preparações extemporâneas.