CN113576943B

CN113576943B - 一种益生元发酵物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113576943B
Application number: CN202110778917.4A
Authority: CN
Inventors: 谢智勇; 叶思敏
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: CN113576943A

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种益生元发酵物及其制备方法与应用。所述益生元发酵物，以菊糖和低聚半乳糖为发酵底物，经嗜酸乳杆菌发酵制得。所述益生元发酵物对痤疮丙酸杆菌具有较好的生长抑制效果，且成分温和、对皮肤的刺激小。

Description

一种益生元发酵物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种益生元发酵物及其制备方法与应用。

背景技术

痤疮是一种涉及毛囊皮脂单位(pilosebaceous unit)的炎症性疾病，严重的痤疮会导致疤痕和毁容，给人带来生理、心理上的困扰和痛苦。痤疮的治疗药物主要有维A酸类药物、抗菌药物、激素类药物。然而，目前治疗痤疮的药物都存在不同程度的不足。例如，抗生素容易被滥用，导致了越来越多的细菌耐药现象的发生。同时，口服抗生素要注意药物不良反应的发生，如胃肠道反应、药疹、肝损害、光敏反应、色素沉着和菌群失调。而异维A酸也常常有头痛、恶心呕吐、甚至致畸等不良反应发生。激素类药物容易使患者产生依赖性。因此，痤疮患者亟需寻求一种更为安全和有效的治疗产品。

痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes，简称Ca菌)是皮肤毛囊皮脂腺里的一种皮肤共生菌，当皮脂分泌旺盛导致毛囊堵塞时，缺氧的环境使痤疮丙酸杆菌大量繁殖，对免疫系统产生强烈刺激，造成寻常痤疮的爆发。痤疮丙酸杆菌在痤疮的发病机制中发挥着重要作用，痤疮的严重程度和痤疮丙酸杆菌的相对丰度密切有关。有研究发现，痤疮病变的活组织检查显示毛囊皮脂腺周围的巨噬细胞表面Toll样受体-2的表达明显增加，主要原因可能是痤疮丙酸杆菌表面的肽聚糖和脂磷壁酸作为配体激活了TLR2的表达。在富含脂质的低氧环境中培养痤疮丙酸杆菌，该菌产生的短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)能够促进TLR2调控人角质形成细胞中IL-6、IL-8和TNF-α的产生，从而促进炎症的发生发展。同时随着核转录因子-κB(Nuclear factor-kappaB，NF-κB)的激活，TNF-ɑ、IL-1β等的基因转录明显升高，引起基质金属蛋白酶(matrix-degrading metalloproteinases，MMPS)合成增加，使得胶原纤维的降解和重塑发生紊乱，并在其修复过程中形成瘢痕。由此可见，在治疗痤疮的过程中，对痤疮丙酸杆菌的生长进行抑制属于关键的一环。但由于痤疮丙酸杆菌属于皮肤的共生菌，在一定数量下对维持皮肤的健康具有重要作用，因此对痤疮患者皮肤的痤疮丙酸杆菌的抑制作用必须是有效温和的，不可过度抑制，过度抑制会导致皮肤微生态的二次失衡。

因此，希望提出一种对皮肤温和，且对痤疮丙酸杆菌具有良好抑制作用的痤疮治疗产品。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种益生元发酵物及其制备方法与应用，所述益生元发酵物对痤疮丙酸杆菌具有较好的生长抑制效果，且成分温和、对皮肤的刺激小。

本发明提供了一种益生元发酵物，以菊糖和低聚半乳糖为发酵底物，经嗜酸乳杆菌发酵制得。

本发明所用菊糖和低聚半乳糖均为益生元组分，属于低聚糖类。本发明前期对比了三种益生元(菊糖、低聚半乳糖和甘露低聚糖)对乳杆菌的增殖作用及分别经乳杆菌发酵后的抑制痤疮丙酸杆菌的效果，发现使用特定益生元(菊糖和低聚半乳糖)进行复配，并采用特定菌种(嗜酸乳杆菌)进行发酵，所得益生元发酵物能够具备对痤疮丙酸杆菌良好的抑制作用。同时，以上述益生元为发酵底物，由于不含刺激性成分，因而所获得的发酵产物对皮肤较为温和，安全性好。

优选的，所述菊糖与所述低聚半乳糖的质量比为3：(3-5)。试验表明，当菊糖与低聚半乳糖的质量比为3：(3-5)时，所得益生元发酵物对痤疮丙酸杆菌的抑制率≥40％。

更优选的，所述菊糖与所述低聚半乳糖的质量比为3：5。进一步的试验表明，当菊糖与低聚半乳糖的质量比为3：5时，所得益生元发酵物对痤疮丙酸杆菌的抑制率可达47％。

本发明还提供了上述益生元发酵物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将菊糖与低聚半乳糖加入至水中，制得益生元水溶液；

(2)往所述益生元水溶液接种嗜酸乳杆菌进行发酵，取发酵上清液并除菌，即得益生元发酵物。

由于本发明所需产品为发酵后的代谢产物，因此在步骤(2)中采用除菌以去除发酵体系中的嗜酸乳杆菌。

优选的，步骤(1)还包括对所述益生元水溶液进行除菌操作。由于益生元或水中可能存在会影响发酵进程的微生物杂质，采用除菌操作可有助于保证发酵的良好进行。具体的，可采用微孔滤膜(0.22μm)对益生元水溶液进行除菌操作。

优选的，步骤(2)中所述嗜酸乳杆菌的接种量为2-5％。

更优选的，步骤(2)中所述嗜酸乳杆菌的接种量为3％。

优选的，步骤(2)中所述嗜酸乳杆菌为活化后的嗜酸乳杆菌，采用活化操作使菌种复壮，有助于提高发酵的效果。

优选的，步骤(2)中进行所述发酵的时间为48-72h。

本发明还提供了上述益生元发酵物在制备抑制痤疮丙酸杆菌活性的产品中的应用。本发明所述益生元发酵物具备良好的抑制痤疮丙酸杆菌作用，而痤疮丙酸杆菌在全身各处皮肤都有生长并引发痤疮，因而所述益生元发酵物可广泛应用于多类日化产品，如洗发水、沐浴露、身体乳和脸部化妆品等。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明所用菊糖和低聚半乳糖均为益生元组分，属于低聚糖类。以上述益生元为发酵底物，由于不含刺激性成分，因而所获得的发酵产物对皮肤较为温和，安全性好；

(2)本发明使用特定益生元(菊糖和低聚半乳糖)进行复配，并采用特定菌种(嗜酸乳杆菌)进行发酵，所得益生元发酵物能够具备对痤疮丙酸杆菌良好的抑制作用。

附图说明

图1表示不同益生元发酵物对痤疮丙酸杆菌的抑制率，****表示P＜0.0001；

图2表示发酵组和未发酵组对痤疮丙酸杆菌的抑制率，***表示P＜0.001；

图3表示经不同乳杆菌发酵所得益生元发酵物对痤疮丙酸杆菌的抑制率，其中P6-Lr、P6-Lp、P6-Lc、P6-La组所使用菌株分别为罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

以不同比例菊粉与低聚半乳糖作为发酵底物，使用嗜酸乳杆菌进行发酵制得相应益生元发酵物，并测试相应益生元发酵物对痤疮丙酸杆菌的抑制效果。

其中具体发酵方法如下所示：

1.益生元水溶液配置：采用SPSS软件生成两因素四水平正交试验设计表，得到16组不同比例菊粉和低聚半乳糖的发酵底物(如表1所示，其中添加量为占益生元水溶液的质量百分数)，将每组发酵底物分别加入至水中，充分溶解，过0.22μm的微孔滤膜进行除菌，制得相应益生元水溶液；

2.嗜酸乳杆菌的活化：A、将MRS液体培养基以52.24g：1000mL的比例溶于蒸馏水中，118℃高压灭菌15分钟，得到MRS液体培养基，备用；B、将甘油保藏的嗜酸乳杆菌按培养基体积的3％接种，进行活化操作；C、经过第二次活化的嗜酸乳杆菌培养至对数生长期(菌浓度约为1.0×10⁸CFU/mL)后，以4000r/min离心5min后(温度保持在40℃以下)，弃培养基，菌体用中性PBS缓冲液洗涤2次，备用；

3.益生菌发酵：将活化后的嗜酸乳杆菌(菌浓度约为1.0×10⁸CFU/mL)按3％的接种量接种至相应益生元水溶液中，在37℃恒温箱中发酵培养48h后，离心取发酵上清，发酵上清过0.22um的微孔滤膜除菌，制得16种益生元发酵物。

其中抑菌试验的测试方法为：

a.将甘油保藏的痤疮丙酸杆菌用哥伦比亚血平板复苏后，用平板划线法培养单菌落，挑取适量的痤疮丙酸杆菌单菌落于灭菌后的液体硫乙醇酸盐培养基(FT培养基)中，在37℃下培养1-2天，使痤疮丙酸杆菌处于对数生长期，菌液置于-4℃中作为工作液备用。

b.取上述制得的16种益生元发酵物作为试验组，并增设阴性对照组、阳性对照组，将以上组别加入至96孔板中，每个孔加100μL的FT培养基，阴性对照组和阳性对照组添加50μL的无菌中性PBS，试验组添加50μL的益生元发酵物，阳性对照组和试验组接20μL的痤疮丙酸杆菌工作液，阴性对照组接等量的无菌FT培养基。每组平行设置两个板，一个板加完药液后，用酶标仪测吸光值，作为背景吸光值；另一块96孔板放入无氧环境中，37℃恒温培养2-3天后，用酶标仪测各个孔的吸光度。抑菌率的计算公式为：抑菌率＝(△阳性对照组OD值-△试验组OD值)/(△阳性对照组OD值-△阴性对照组OD值)。

具体测试结果如表1与图1所示。

表1不同益生元发酵物对痤疮丙酸杆菌的抑制率

由表1与图1可知，当菊粉添加量与低聚半乳糖添加量比例为3:3(即组合4)、3:5(即组合6)、2:3(即组合16)时，经嗜酸乳杆菌发酵后的产物对痤疮丙酸杆菌的抑制率均在40％以上。尤其在组合6中，采用3％菊粉与5％低聚半乳糖作为发酵底物，所得益生元发酵物对痤疮丙酸杆菌的抑制率可达47％，实现了优异的抗菌抑菌效果。

实施例2

配置含3％菊粉与5％低聚半乳糖的益生元水溶液，以此为试验材料，测试上述益生元水溶液经嗜酸乳杆菌发酵(发酵组)和未经嗜酸乳杆菌发酵(未发酵组)处理后，所得产物对痤疮丙酸杆菌的抑制率，测试结果如图2所示。由图2可知，经嗜酸乳杆菌发酵后的益生元水溶液对痤疮丙酸杆菌的抑菌率达到了47％，比未发酵的益生元水溶液抑菌率提高了117.8％，表明嗜酸乳杆菌的发酵处理对于提高抑菌效果具有重要作用。

实施例3

本发明所使用的嗜酸乳杆菌属于乳杆菌(乳酸杆菌)中的一种，为了验证其他类型的乳杆菌是否对菊粉和低聚半乳糖所组成的益生元水溶液也具有相同或相近的发酵效果，配置含3％菊粉与5％低聚半乳糖的益生元水溶液，以此为试验材料，分别以罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌替代嗜酸乳杆菌作为发酵菌种，采用与实施例1相同的发酵方法和抑菌试验方法进行处理，所测得抑菌效果与实施例1中组合6所得益生元发酵物的抑菌效果进行比较，具体结果如图3所示(其中P6-Lr、P6-Lp、P6-Lc、P6-La组所使用菌株分别为罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌)。

由图3可得，采用罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌对益生元水溶液进行发酵，不仅没能提高发酵产物对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果，其发酵代谢产物还可能会促进痤疮丙酸杆菌的生长和繁殖。该结果表明，仅有特定的乳杆菌-嗜酸乳杆菌对菊粉和低聚半乳糖进行发酵处理后，所得益生元发酵物才具有对痤疮丙酸杆菌良好的抑菌效果。

上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种用于抑制痤疮丙酸杆菌活性的益生元发酵物，其特征在于，以菊糖和低聚半乳糖为发酵底物，经嗜酸乳杆菌发酵制得；所述菊糖与所述低聚半乳糖的质量比为3：（3-5）。

2.根据权利要求1所述的益生元发酵物，其特征在于，所述菊糖与所述低聚半乳糖的质量比为3：5。

3.权利要求1-2中任一项所述的益生元发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将菊糖与低聚半乳糖加入至水中，制得益生元水溶液；

（2）往所述益生元水溶液接种嗜酸乳杆菌进行发酵，取发酵上清液并除菌，即得益生元发酵物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）还包括对所述益生元水溶液进行除菌操作。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述嗜酸乳杆菌的接种量为2-5%。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述嗜酸乳杆菌的接种量为3%。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述嗜酸乳杆菌为活化后的嗜酸乳杆菌。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中进行所述发酵的时间为48-72h。

9.权利要求1-2中任一项所述的益生元发酵物在制备抑制痤疮丙酸杆菌活性的产品中的应用。