CN102548564A - 用于预防和治疗痤疮的包含作为活性成分的蜂毒的组合物 - Google Patents

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李光吉
吕奏洪
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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗痤疮的组合物，其包含对已知为痤疮致病菌的痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)具有优异的抗菌活性并且对扩大炎症部位从而使痤疮恶化的皮肤菌群表现出强抗菌活性的物质，其中所述物质还有助于使受到痤疮损伤的皮肤细胞再生。本发明组合物包含(从蜜蜂(Apis meliffera)中收集的)蜂毒，并且以用于基础性预防和治疗痤疮的肥皂、化妆品以及供皮肤施用的药用产品(如软膏剂、绷带和敷料)形式使用。

Description

用于预防和治疗痤疮的包含作为活性成分的蜂毒的组合物
技术领域
本发明一般涉及包含作为活性成分的蜂毒的用于预防和治疗痤疮的组合物，更具体地，本发明涉及包含蜂毒的用于预防和治疗痤疮的药物组合物或化妆品组合物，所述蜂毒对已知为痤疮致病菌的痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacne)和扩大炎症部位从而使痤疮恶化的厌氧皮肤菌群具有优异的抗菌活性，其中所述蜂毒还具有优异的使受损皮肤细胞再生的能力。
背景技术
痤疮的确切病因尚不为人所知，但医生们认为引起它的主要相关因素包括皮脂分泌增加、由刺激皮脂腺的雄激素和在毛发皮脂腺中繁殖从而降解皮脂以形成游离脂肪酸的痤疮丙酸杆菌导致的炎症发展、毛囊角化不全(follicularparakeratosis)和遗传素质。而且，虽然需氧皮肤菌群不是引起炎症的主要原因，但已知其扩大炎症部位，从而促使痤疮恶化。已知用于治疗痤疮的一般方法包括给药口服抗生素和类视色素、施用外用药物、粉刺挤出、化学脱皮等。具体而言，可通过用抗生素治疗来缓解由细菌感染引起的炎性痤疮，但最近已有报道称主要用于抑制痤疮丙酸杆菌增殖和减少炎性反应的抗生素(如四环素、克林霉素和红霉素)可增加对抗生素具有耐药性的痤疮丙酸杆菌并产生副作用。迄今，为了治疗痤疮，在医药领域，已使用诸如红霉素的抗生素或过氧苯甲酰来抑制痤疮丙酸杆菌，或使用雌激素来控制皮脂，但这些药物引起副作用。在化妆品领域，已使用维生素A衍生物来去除皮肤角蛋白，并使用三氯生和水杨酸来抑制痤疮丙酸杆菌。这些药物表现出一些效应，但大多引起副作用，如皮肤红斑，皮肤超敏反应或光敏反应，而且用这些药物治疗后痤疮经常复发。因此，尚无用于预防和治疗痤疮的药品。
可在不对蜜蜂造成伤害的情况下采用电击法通过蜂毒收集器大量收集产于韩国的蜜蜂(Apis mellifera)的蜂毒，并且可通过从收集到的蜂毒中去除杂质随后进行冷冻干燥来获得纯化蜂毒。这样获得的蜂毒含有多种成分，在这些成分中，肽类具有抗炎和抗菌效应、强效止痛效应、免疫增强效应等。蜂毒对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌二者均表现出抗菌活性，但已知其对革兰氏阳性菌表现出更强的抗菌活性。蜂毒的大部分药效可归因于毒性成分和单一主要成分组的活性。蜂毒的已知成分及效应如下。
(1)治疗免疫系统疾病：蜂毒在大多数免疫疾病的治疗中是有效的，并且能够刺激免疫系统以成功对抗疾病。蜂毒的两大免疫功能是刺激有机体的生物系统以及增强机体的防御力。
(2)抗炎效应：蜂毒的主要成分在炎症的抑制中非常有效。具体而言，当向关节炎患者注射蜂毒肽和蜂毒明肽时，水肿得到显著抑制。此外，与蛋白酶抑制剂和dolapin共同治疗使水肿得到15-40％的抑制。
(3)神经毒性效应：被蜜蜂蛰引起疼痛和炎症，并且引起疼痛和炎症的蜂毒成分有效地用于开发用于在哺乳动物中的止痛反应(pain withdrawal response)的止痛药物。具体而言，蜂毒中的蜂毒明肽起到止痛作用，并且表现出强止痛效应以及在神经痛、关节炎、类风湿性关节炎、痛风、肌肉疼痛等中的高疗效。
(4)溶血效应：蜂毒的最卓越效应之一是溶血效应。蜂毒中的蜂毒肽、磷脂酶等通过吸收和排泄源于挫伤或内出血的淤血(extravasated bood)以及向组织供应新鲜血液、氧和营养来表现出疗效和溶血效应。
(5)血管扩张效应：蜂毒中的组胺类物质在毛细血管、小动脉、小静脉特别是内脏血管的扩张中非常有效。因此，蜂毒用于治疗诸如对冷敏感、冻伤和肌肉疼痛的疾病。
(6)降血压效应：蜂毒中的组胺类物质具有强降血压效应。具体而言，它们甚至在1/2.5x107的浓度下表现出降血压作用，并且在原发性高血压等的治疗中高度有效。
(7)自主神经调节效应：当人体受到持续的压力时，交感神经系统和副交感神经系统中的自主神经变得紊乱，从而导致许多疾病。蜂毒中含有使自主神经正常化所需的儿茶酚胺和乙酰胆碱，这些成分是有效治疗心身疾病、绝经期病症、应激反应性疾病(stress-induced disease)等的脑细胞递质(transmitter)。
(8)抗菌效应：蜂毒具有很强的抗菌效应和抗真菌效应，也有效对抗病毒性肿瘤。具体而言，它在牙周炎、扁桃腺炎、睑腺炎、化脓性疾病等的治疗中高度有效。
基于蜂毒的上述生理效应，本发明的发明人进行研究，以提供有效预防和治疗痤疮的蜂毒系组合物。根据本发明，会提高患有严重痤疮的人们的生活质量，并且会促进韩国产蜂毒的消费，同时会提高韩国蜂毒在全球的地位。
发明内容
技术问题
本发明涉及用于预防和治疗痤疮的组合物。更具体地，本发明提供包含蜂毒的用于预防和治疗痤疮的组合物，所述蜂毒对已知使痤疮恶化的痤疮丙酸杆菌具有优异的抗菌效应，并且还具有优异的抗炎效应，能够抑制或减轻由多种皮肤疾病如痤疮引起的炎症，其中所述组合物可以肥皂、化妆品以及药用产品(如软膏剂、绷带(band)和敷料)形式使用。
从而，本发明的发明人已做了多方面的努力来研发有效用于预防和治疗痤疮的化妆品和药品，并且因此已开发出有效用于预防和治疗痤疮的组合物，其包含作为有效成分的蜂毒，所述蜂毒预期具有优异的抗菌、抗炎和细胞再生效应。
技术方案
本发明的一实施方案提供用于预防或治疗痤疮的组合物，其包含作为活性成分的蜂毒。
本发明的另一实施方案提供用于预防或治疗痤疮的化妆品组合物，其包含作为活性成分的蜂毒。
本发明的又一实施方案提供用于预防或治疗痤疮的身体清洁或清洗产品(body cleansing or cleaning product)，其包含作为活性成分的蜂毒。
蜂毒在所述组合物中的浓度可为0.0001-10％(w/v)。
具体而言，本发明提供用于预防和治疗痤疮的组合物，其包含韩国产的纯化蜂毒。
纯化蜂毒在本发明的用于预防和治疗痤疮的组合物中的含量是0.0001-10％(w/v)，优选为0.01-1％(w/v)。如果蜂毒在所述组合物中的含量少于0.0001％，则所述组合物对痤疮丙酸杆菌的抗菌和抗炎效应会较低，而如果所述含量大于10％，则所述组合物会具有细胞毒性。
同时，包含蜂毒的供皮肤施用的组合物可以任意状态(如液态、乳霜态、糊态或固态)存在，并且可以乳霜(cream)、护肤乳(skin lotion)、面膜(pack)、底妆(makeup base)、面部清洁剂和清洗剂(facial cleanser and cleaner)(如肥皂、洁面泡沫(facial foam)或沐浴露(body cleanser))以及发用产品(如洗发水或冲洗型护发素(rinse))的形式配制。所述组合物可视需要与那些常用于供皮肤施用的组合物的组分(如水性组分、油性组分、表面活性剂、保湿剂、增稠剂、防腐剂、香料、色素等)一起配制。而且，所述组合物可与药学上可接受的载体、成型剂(forming agent)或稀释剂混合，并以散剂、颗粒剂、胶囊剂或注射液的形式配制。此外，所述组合物也可用作身体清洁或清洗产品如湿巾(wet tissue)。
此外，本发明的组合物可与已用于现有的痤疮治疗药物中的抗菌剂(如过氧苯甲酰、四环素、红霉素或三氯生)、激素类(如雄激素药物或类固醇)或维生素A衍生物(如维甲酸)组合使用。
有益效果
如上所述，通过从使用蜂毒收集器从蜜蜂中收集的国产蜂毒中去除杂质得到的纯化蜂毒对已知通过扩大炎症部位从而使痤疮恶化的痤疮丙酸杆菌、对克林霉素具有耐药性的痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和酿脓链球菌(Sreptococcuspyogenes)具有优异的抗菌效应。并且，蜂毒可迅速而有效地使受损皮肤细胞再生，并且可促进皮肤细胞再生以使得受损部位不发炎。此外，蜂毒促进胶原蛋白的合成以及作为皮肤细胞生长因子的EGF和VEGF的表达，并且对预防皱纹和衰老具有优异的效应。因此，本发明可提供包含蜂毒并用于预防和治疗痤疮的化妆品、美容皂和药用产品如软膏剂、绷带或敷料。具体而言，本发明提供包含蜂毒的乳液(lotion)、润肤乳(nourishing lotion)、润肤霜(nourishingcream)、按摩霜(massage cream)和精华素(essence)。
因此，根据本发明研发的包含蜂毒的用于预防和治疗痤疮的组合物会大大有助于治疗患有严重痤疮的患者，并且由于该国产蜂毒的高附加值的应用会有助于提高养蜂者的收入。
附图说明
图1显示蜂毒对HEK(人表皮角质形成细胞)的细胞毒性的评价结果。
图2显示蜂毒对受损HEK(人表皮角质形成细胞)的再生的效应。
图3显示用蜂毒治疗受损HEK(人表皮角质形成细胞)后的胶原蛋白合成。
图4显示用蜂毒治疗受损HEK(人表皮角质形成细胞)后的EGF生成。
图5显示用蜂毒治疗受损HEK(人表皮角质形成细胞)后的VEGF生成。
发明实施方式
下文中会参考实施例对本发明进行进一步的详细说明。然而，本发明的范围并不局限于这些实施例。
采用SAS(SAS enterprise guide 3.0)的Duncan t-检验对所有数据进行方差分析。
实施例1：从蜂毒中分离有效成分
使用蜂毒收集器从蜜蜂(Apis meliffera L.)中收集蜂毒。将收集的蜂毒溶解于蒸馏水中，离心，过滤并冷冻干燥，从而得到用于测试的纯蜂毒。
实施例2：测量抗菌活性
测试例1：测量对痤疮致病菌的抗菌活性
测量对已知引起痤疮的痤疮丙酸杆菌和对抗生素克林霉素具有耐药性的痤疮丙酸杆菌的抗菌效应。采用肉汤稀释法测量对痤疮丙酸杆菌和对抗生素克林霉素具有耐药性的痤疮丙酸杆菌的最低抑制浓度(MIC)。
用蒸馏水稀释干燥的蜂毒，无菌过滤，并按照肉汤稀释法连续稀释。在35℃下将痤疮丙酸杆菌和对抗生素具有耐药性的痤疮丙酸杆菌各自在补充有5％羊血的TS(胰酪胨大豆)肉汤中无氧培养48小时，然后用于测试。以2×106个CFU/孔的细胞密度将每个细菌菌株加入到孔板中，并与蜂毒样品一起培养24小时，其后在肉眼和显微镜下均观察到菌株生长，并且测量在540nm的吸收波长下的吸光度。将表现出与纯肉汤的吸光度值相同的吸光度值的样品浓度测定为最低抑制浓度(MIC)。测量结果显示在下表1中
表1
  菌株   MIC(μg/ml)
  痤疮丙酸杆菌(ATCC 6919)   0.086±0.013
  对抗生素具有耐药性的痤疮丙酸杆菌(CCARM 9010)   0.067±0.028
*平均值±SD
测试例2：测量对厌氧皮肤菌群的抗菌活性
在37℃下将典型的厌氧皮肤菌群金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和酿脓链球菌在Muller-Hiton肉汤中培养18小时，然后用于测试，并将酿脓链球菌在CO2培养箱中培养。以2×106个CFU/孔的细胞密度将每个细菌菌株加入到孔板中，并与蜂毒样品一起培养24小时，其后在肉眼和显微镜下均观察到菌株生长，并且测量在540nm的吸收波长下的吸光度。将表现出与纯肉汤的吸光度值相同的吸光度值的样品浓度测定为最低抑制浓度(MIC)。测量结果显示在下表2中。
表2
Figure BPA00001499282000061
*平均值±SD
测试例3：测量蜂毒对痤疮致病菌的抗生素后效应
按照Pankuch和Appelbaum法(2006)测量实施例1中获得的蜂毒对痤疮致病菌株痤疮丙酸杆菌和对抗生素克林霉素具有耐药性的痤疮丙酸杆菌的抗生素后效应(PAE)。简言之，用实施例1中所述浓度下的蜂毒处理每个培养菌株，并在1小时后通过离心和肉汤稀释法去除蜂毒。然后用新鲜肉汤替代原肉汤，并在37℃下在培养箱中培养，同时以2小时的时间间隔测量细菌数。较高的PAE值表明较高的抗菌效应。
按照以下等式计算PAE值：
[PAE＝T-C]
其中，T是指用天然抗生素处理的测试组中生长到1log10所用的时间；并且C是指空白对照组中生长到1log10所用的时间。
测量结果显示在下表3中
表3
  菌株  PAE(小时)
  痤疮丙酸杆菌(ATCC 6919)  4.30
  对抗生素具有耐药性的痤疮丙酸杆菌(CCARM 9010)  5.45
*接种细菌的细胞数：2.5±105个CFU/ml
测试例4：测量蜂毒对皮肤菌群的抗生素后效应
除使用金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和酿脓链球菌外，以与测试例3中相同的方式进行测试。测试结果显示在下表4中。
表4
  菌株   MIC(μg/ml)
  金黄色葡萄球菌(ATCC25923)   0.071±0.042
  表皮葡萄球菌(ATCC12228)   0.121±0.028
  酿脓链球菌(ATCC12353)   0.104±0.049
*接种细菌的细胞数；2.5±105个CFU/ml
实施例3：测量对皮肤细胞再生的效应
测试例5：测量皮肤细胞的细胞毒性
为了检测蜂毒对皮肤细胞的细胞毒性，从MTCC Co.(韩国首尔)购买原代培养的HEK(人表皮角质形成细胞)，并在37℃下，在5％CO2培养箱中，在KGM培养基中继代培养。当培养的细胞生长到90％融合度时，将它们继代培养，并将对数生长期的细胞用于测试。以5x105个细胞/ml的细胞密度将HEK细胞分布在96孔板中，并贴壁培养(cultured adherently)1天，并用新鲜培养基替代原培养基，之后用不同浓度的蜂毒加以处理。将细胞在37℃下在5％ CO2培养箱中培养48小时，然后用MTT(甲基噻唑-2-基-2，5二苯基溴化四唑)试剂处理该细胞，并用酶标仪测量540nm下的吸光度，从而评价蜂毒对皮肤细胞的细胞毒性。
评价结果显示在图1中。
测试例6：测试皮肤伤口模型中的细胞再生和生长因子表达
当原代培养的HEK(人表皮角质形成细胞)在100mm细胞培养皿中生长到80％融合度时，用牙签损伤细胞以形成宽度为10mm的伤口，并将0.01-10μg/ml的蜂毒注射入这些细胞中，之后测量细胞的再生。
此处，通过用MTT(甲基噻唑-2-基-2，5二苯基溴化四唑)分析该细胞或者通过用Diff quic染色剂将该细胞染色并用显微镜观察该细胞来测量细胞的增殖。使用胶原蛋白检测试剂盒分析胶原蛋白的合成，并且使用ELISA(酶联免疫吸附测定)分析与细胞生长相关的表皮生长因子(EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。分析结果显示在图2至图5中。
从图2中可以看出，用蜂毒治疗细胞促进了受损皮肤细胞的再生，而从图3中可以看出，用蜂毒治疗细胞增加了胶原蛋白的生成。并且，从图4和图5中可以看出，当用蜂毒治疗细胞时，皮肤细胞生长因子EGF和VEGF的生成分别增加了2倍或更多。同时，这些成熟细胞的形态是正常的。
实施例4：包含蜂毒的化妆品的制备
制备例1：包含蜂毒的乳液的配方
表5
  序号   原料 配方1(wt％)  对照配方1(wt％)
  1   纯化蜂毒 0.001   -
  2   甘油 3.0   3.0
  3   丁二醇 2.0   2.0
  4   丙二醇 2.0   2.0
  5   聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油 1.0   1.0
  6   乙醇 10.0   10.0
  7   三乙醇胺 0.1   0.1
  8   防腐剂 痕量   痕量
  9   色素 痕量   痕量
  10   香料 痕量   痕量
  11   纯净水 余量   余量
配方1：将原料2、3、4和8相继加入到原料11中，并在搅拌下溶解混合物。然后，通过将原料5加热至约60℃使其熔解，然后向其中加入原料10并搅拌，并将该混合物加入到原料11中。最后，向其中加入原料1、6、7和9，并充分搅拌，并使该混合物通过高压均化器，随后老化。
对照配方1：除了没有使用蜂毒(原料1)外，以与配方1相同的方式制备对照配方1。
制备例2：包含蜂毒的润肤乳的配方
  序号   原料 配方1(wt％)  对照配方1(wt％)
  1   纯化蜂毒 0.001   -
  2   谷甾醇 1.7   1.7
  3   聚甘油2-油酸酯 1.5   1.5
  4   神经酰胺 0.7   0.7
  5   硬脂酸酯-4 1.2   1.2
  6   胆固醇 1.5   1.5
  7   磷酸鲸蜡酯 0.4   0.4
  8   甘油 5.0   5.0
  9   葵花籽油 10.0   10.0
  10   羧乙烯基聚合物(Carboxyvinyl polymer) 0.2   0.2
  11   黄原胶 0.3   0.3
  12   防腐剂 痕量   痕量
  13   香料 痕量   痕量
  14   纯净水 余量   余量
配方1：将原料2、3、4、5和6在预定温度下均质化以制备非离子型两亲脂质。将该两亲脂质与原料1、7、8和14混合，并在预定温度下均质化，并使该混合物通过高压均化器。然后，在预定温度下向其中缓慢添加原料9并均质化，并使该混合物通过高压均化器。然后，向其中加入原料10、11、12和13，分散，稳定化和老化。
对照配方1：除了没有使用蜂毒(原料1)外，以与配方1相同的方式制备对照配方1。
制备例3：包含蜂毒的润肤霜的配方
表7
  序号   原料 配方1(wt％)  对照配方1(wt％)
  1   纯化蜂毒 0.001   -
  2   谷甾醇 4.0   4.0
  3   聚甘油2-油酸酯 3.0   3.0
  4   神经酰胺 0.7   0.7
  5   硬脂酸酯-4 2.0   2.0
  6   胆固醇 3.0   3.0
  7   磷酸鲸蜡酯   0.4   0.4
  8   甘油   5.0   5.0
  9   葵花籽油   22.0   22.0
  10   羧乙烯基聚合物   0.5   0.5
  11   黄原胶   0.5   0.5
  12   三乙醇胺   痕量   痕量
  13   香料   痕量   痕量
  14   纯净水   余量   余量
配方1：将原料2、3、4、5和6在预定温度下均质化以制备非离子型两亲脂质。将该两亲脂质与原料1、7、8和14混合，并在预定温度下均质化，并使该混合物通过高压均化器。然后，在预定温度下向其中缓慢添加原料9并均质化，并使该混合物通过高压均化器。然后，向其中加入原料10、11、12和13，分散，稳定化和老化。
对照配方1：除了没有使用蜂毒(原料1)外，以与配方1相同的方式制备对照配方1。
制备例4：包含蜂毒的按摩霜的配方
表8
  序号   原料 配方1(wt％)  对照配方1(wt％)
  1   纯化蜂毒 0.001   -
  2   蜂蜡 10.0   10.0
  3   聚山梨酯60 1.5   1.5
  4   山梨坦倍半油酸酯 0.8   0.8
  5   液体石蜡 40.0   40.0
  6   角鲨烯 5.0   5.0
  7   辛酸/癸酸甘油三酯 4.0   4.0
  8   羧乙烯基聚合物 0.2   0.2
  9   甘油 5.0   5.0
  10   丁二醇 3.0   3.0
  11   丙二醇 3.0   3.0
  12   三乙醇胺 0.2   0.2
  13   防腐剂 痕量   痕量
  14   色素 痕量   痕量
  15   香料 痕量   痕量
  16   纯净水 余量   余量
配方1：在将原料8、9、10、11、13和16加热至80-85℃的温度的同时在搅拌下将它们混合，然后加入到制备装置(preparation unit)中。然后，将原料2、3、4、5、6、7和12加热至80-85℃的温度，并将它们加入到该制备装置中，并将该混合物乳化。当乳化完成后，在将该乳化混合物冷却至50℃的同时将其搅拌。然后，向其中加入原料14，并将该混合物冷却至45℃。然后，向其中加入原料15，并将该混合物冷却至35℃，并向其中加入原料1。将所得混合物冷却至25℃，然后老化。
对照配方1：除了没有使用蜂毒(原料1)外，以与配方1相同的方式制备对照配方1。
制备例5：包含蜂毒的精华素的配方
表9
  序号   原料   配方1(wt％)  对照配方1(wt％)
  1   纯化蜂毒   0.001  -
  2   谷甾醇   1.7  1.7
  3   聚甘油2-油酸酯   1.5  1.5
  4   神经酰胺   0.7  0.7
  5   神经酰胺   1.2  1.2
  6   硬脂酸酯-4   1.5  1.5
  7   磷酸鲸蜡酯   0.4  0.4
  8   甘油   5.0  5.0
  9   葵花籽油   15.0  15.0
  10   羧乙烯基聚合物   0.2  0.2
  11   黄原胶   0.2  0.2
  12   防腐剂   痕量  痕量
  13   香料   痕量  痕量
  14   纯净水   余量  余量
配方1：将原料2、3、4、5和6在预定温度下均质化以制备非离子型两亲脂质。将该两亲脂质与原料1、7、8和14混合，并在预定温度下均质化，并使该混合物通过高压均化器。然后，在预定温度下向其中缓慢添加原料9，并均质化，并使该混合物通过高压均化器。然后，向其中加入原料10、11、12和13，分散，稳定化和老化。
对照配方1：除了没有使用蜂毒(原料1)外，以与配方1相同的方式制备对照配方1。

Claims (6)

1.用于预防或治疗痤疮的组合物，其包含作为活性成分的蜂毒。
2.权利要求1的组合物，其中所述蜂毒在所述组合物中的浓度为0.0001-10％(w/v)。
3.用于预防或治疗痤疮的化妆品，其包含作为活性成分的蜂毒。
4.权利要求3的化妆品，其中所述蜂毒在所述化妆品中的浓度为0.0001-10％(w/v)。
5.用于预防或治疗痤疮的身体清洁或清洗产品，其包含作为活性成分的蜂毒。
6.权利要求5的身体清洁或清洗产品，其中所述蜂毒在所述产品中的浓度为0.0001-10％(w/v)。
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