CN116376758A - 詹氏乳杆菌ls06及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了詹氏乳杆菌LS06及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用，属于微生物技术领域。詹氏乳杆菌LS06的保藏编号为CGMCCNo.22096。詹氏乳杆菌LS06在体内能显著抑制Compoud48/80刺激斑马鱼分泌Tryptase，能够抑制体内肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒，具备应用于体内治疗或预防过敏反应的潜能。本发明公开的詹氏乳杆菌LS06在治疗或预防过敏反应方面有巨大的潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及詹氏乳杆菌LS06及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用。
背景技术
过敏又称超敏反应或变态反应，是指对无害且普遍存在的环境过敏原产生特异性的异常倾向，可能发生在肠道、皮肤和呼吸道，主要有腹痛腹泻、特异性皮炎、变应性鼻炎、哮喘等临床表现。典型的过敏反应是当过敏原诱导Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，能够有效的激活B细胞产生IgE抗体，IgE与肥大细胞结合，并导致肥大细胞脱颗粒释放丝氨酸蛋白酶、组胺、细胞因子等介质，启动针对特异性抗原的过敏反应。研究显示，肥大细胞是过敏反应中一种关键的效应细胞，其在被抗原激活特定信号转导通路后，不仅脱颗粒分泌炎性介质，还分泌相当数量的多种细胞因子，在过敏性疾病的发生和发展中起着关键性的作用。类胰蛋白酶(Tryptase)是肥大细胞中一种重要的蛋白酶，它与胰蛋白酶相似。类胰蛋白酶(Tryptase)在肥大细胞中的贮存和表达具有高度选择性，不能在其他类型细胞中被检出，故类胰蛋白酶(Tryptase)成为鉴定人肥大细胞的特异性标志。
目前，我们应对过敏性疾病的手段有限，只是在病发时服用一些抗过敏的药物，完全不能避免过敏反应的发生。随着科学对肠道微生物日益深入的研究，肠道微生物与健康的关系越来越受到人们的关注，特别是肠道微生物与过敏的关系。已有研究表明，食物过敏与肠道微生物组成有关，肠道中某些特定细菌可保护人类免受食物过敏的烦扰。因此，对肠道微生物菌群进行干预可能会提供一种预防变态反应致敏的新策略。
因此，提供詹氏乳杆菌LS06及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了詹氏乳杆菌LS06及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用。
肥大细胞是类过敏反应的主要效应细胞，激活的肥大细胞数量与过敏程度相关，激活的肥大细胞越多，过敏程度越严重。类胰蛋白酶(Tryptase)是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是含量最多的介质，经肥大细胞脱颗粒释放到细胞外，其在肥大细胞中的储存和表达有高度的选择性，可作为肥大细胞的激活和脱颗粒的标志。Tryptase通常只少量地分泌到体液中，当过敏引起肥大细胞脱颗粒时大量进入体液。类胰蛋白酶的急性过敏反应阳性反应和阴性反应的预测准确率分别为92.6％和54.3％，而且Tryptase的半衰期为2小时，因此，Tryptase的表达水平常作为类过敏反应的检测标志物之一。
斑马鱼的肥大细胞，其结构与功能与哺乳类动物相似，参与机体的免疫反应和过敏反应。N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)是Tryptase特异性底物，可以检测斑马鱼体内的Tryptase表达水平。检测某物质诱导斑马鱼体内24小时内的Tryptase表达水平，可以定量分析此物质的致敏性和抗过敏功效。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)LS06，其保藏编号为CGMCCNo.22096，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年03月29日，分类命名为詹氏乳杆菌Lactobacillusjensenii。
进一步，所述的詹氏乳杆菌LS06在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用。
进一步，所述的詹氏乳杆菌LS06在制备抑制肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒的药物中的应用。
进一步，所述詹氏乳杆菌LS06为菌悬液。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了詹氏乳杆菌LS06及其在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用，詹氏乳杆菌LS06是从广东省广州市健康育龄女性的生殖道分泌物中分离筛选得到的，詹氏乳杆菌LS06在体内能够显著抑制Compoud48/80刺激斑马鱼分泌Tryptase，能够抑制体内肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒，具备应用于体内治疗或预防过敏反应的潜能，此为利用詹氏乳杆菌LS06开发预治疗或预防过敏反应的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明詹氏乳杆菌LS06在MRS琼脂平板上的菌落形态；
图2附图为本发明詹氏乳杆菌LS06对Compoud 48/80刺激斑马鱼分泌Tryptase的表达水平的影响；
图3附图为本发明詹氏乳杆菌LS06对Compoud 48/80刺激斑马鱼分泌Tryptase的抑制率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
色甘酸钠和N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)购自北京华威锐科化工有限公司，Compoud 48/80购自美国Sigma公司；詹氏乳杆菌25258(ATCC 25258)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
实施例1詹氏乳杆菌LS06分离、鉴定及保藏
(1)分离：将健康育龄女性的生殖道分泌物经梯度稀释后，分别接种于厌氧血琼脂培养基、MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取平板上的单菌落划线分离得到纯菌落。将平板上的纯菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。
其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。
实验结果：从广东省广州市健康育龄女性的生殖道分泌物中筛选出的菌株，经形态观察、16S rDNA鉴定，其中菌株LS06被鉴定为詹氏乳杆菌，其16S rDNA序列如SEQ IDNO.3所示。
TCTTGGTTCCCCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAGGTTACCTCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACAGCTTTAAGAGATCCGCTTGCCTTCACAGGTTCGCTTCTCGTTGTACTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCAATAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTATTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTCTTTGTCCCCGAAGGGAAAACCTAATCTCTTAGGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTCCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGATTGACAGTTTCTGATGCAGTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTATCAATCCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTTCACCAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTAATGCATCGCAGGTCCATCCTTTAGCGACAGCTTACGCCGCCTTTTAAACTTCTTTCATGCGAAAGTAGCTTTTATCCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGGTATCCCAGACTTAAGGGCAGGTTACCCACGCGTTACTCACCCATCCGCCGCTAGCTTGTATCTATGTCCATTCCGAAGAATTTCAATAGGCAAGCTCGCTCGACTGCATGTATAGGCACGCCGCC；SEQ ID NO.3。
菌株LS06单菌落接种到MRS固体培养基上，37℃厌氧生长良好、呈圆形、边缘整齐的微白色菌落(图1)。菌株LS06已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年03月29日，分类命名为詹氏乳杆菌Lactobacillusjensenii，保藏编号为CGMCCNo.22096。
实施例2詹氏乳杆菌LS06菌悬液(菌体)的制备
将詹氏乳杆菌LS06活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例3詹氏乳杆菌25258菌悬液(菌体)的制备
将詹氏乳杆菌25258活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例4詹氏乳杆菌LS06对Compoud 48/80刺激斑马鱼分泌Tryptase的影响
挑选发育至5dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于96孔细胞培养板中，10条/孔。实验设置正常组、模型组、干预组(阳性对照组、詹氏乳杆菌25258、詹氏乳杆菌LS06)、溶剂调零组，每组设置6个复孔。正常组加入PBS，模型组加入PBS，阳性对照组加入色甘酸钠溶液(100μg/mL)，詹氏乳杆菌25258加入1×106CFU/mL詹氏乳杆菌25258，詹氏乳杆菌LS06加入1×106CFU/mL詹氏乳杆菌LS06，溶剂调零组(未加斑马鱼)加入PBS，每孔100μL，置于生化培养箱28℃孵育，24h后更换新溶液；孵育48h后，正常组加入150μL PBS，模型组、阳性对照组、詹氏乳杆菌25258、詹氏乳杆菌LS06、溶剂调零组分别加入Compoud 48/80(8μg/mL)，每孔150μL，28℃孵育2h后，每孔取150μL溶液分别置于2mL离心管中，同时每个离心管中加入150μL BAPNA溶液(20mg/ml)，37℃孵育48h后，每个离心管取200μL溶液置于96孔细胞培养板中，用酶标仪在405nm处测定吸光度(OD值)。Tryptase表达水平和抑制率公式如下：
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SD数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：####p<0.001，与模型组相比：**P<0.01，****P<0.001。
Tryptase表达水平和抑制率结果见图2和图3，结果显示，与正常组(100.00±9.35％)相比，模型组的Tryptase表达水平(343.16±36.77％)明显增加，说明本次Compoud48/80诱导过敏模型建立成功。
阳性对照组(色甘酸钠)Tryptase表达水平为126.49±11.86％，Tryptase抑制率为89.12±4.88％，与模型组(Tryptase表达水平：343.16±36.77％)相比差异性显著(P<0.001)。因此，色甘酸钠具有抗过敏作用，与临床结果一致，说明本次抗过敏试验有效。詹氏乳杆菌25258组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内的Tryptase表达水平为248.69±34.68％，同时Tryptase抑制率为38.85±14.27％，与模型组(Tryptase表达水平：343.16±36.77％)相比差异性显著(P<0.01)。另外，詹氏乳杆菌LS06组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内的Tryptase表达水平为148.20±18.41％，同时Tryptase抑制率为80.18±7.57％，与模型组(Tryptase表达水平：343.16±36.77％)相比差异性显著(P<0.001)，表现出良好的抑制肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒的益生功效。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，詹氏乳杆菌LS06对Compoud 48/80诱导体内肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒的抑制作用强于詹氏乳杆菌25258，具有治疗或预防过敏性疾病的潜能。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一株詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)LS06，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.22096。
2.权利要求1所述的詹氏乳杆菌LS06在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的詹氏乳杆菌LS06在制备治疗或预防过敏性疾病药物中的应用，其特征在于，所述詹氏乳杆菌LS06为菌悬液。
4.权利要求1所述的詹氏乳杆菌LS06在制备抑制肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的詹氏乳杆菌LS06在制备抑制肥大细胞或嗜碱粒细胞脱颗粒的药物中的应用，其特征在于，所述詹氏乳杆菌LS06为菌悬液。
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