KR102491324B1 - 락티카제이바실루스 람노서스 idcc 3201의 발효를 이용한 콜라겐의 저분자화 방법과 콜라겐 및 포스트바이오틱스가 혼합된 복합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 발효를 이용한 콜라겐의 저분자화 방법과 콜라겐 및 포스트바이오틱스가 혼합된 복합체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 발효를 이용한 콜라겐의 저분자화 방법은, 상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201[기탁번호: ATCC BAA-2836]으로 제1분자량을 가지는 원료 콜라겐을 분해하는 단계를 포함하며, 상기 발효에 의해 상기 원료 콜라겐은 상기 제1분자량보다 낮은 제2분자량을 가지는 저분자화 콜라겐으로 전환된다.
Description
본 발명은 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 발효를 이용한 콜라겐의 저분자화 방법 및 콜라겐 및 포스트바이오틱스가 혼합된 복합체에 관한 것이다.
콜라겐은 약 18종의 아미노산으로 구성된 나선구조의 고분자 단백질이며, 인체 내 단백질의 25%에서 35%를 차지하고 있다.
콜라겐은 피부, 뼈, 치아, 힘줄 등의 세포와 세포사이를 연결하는 역할을 하며 다양한 기능성을 가지고 있다. 콜라겐은 피부의 진피를 구성하는 주성분으로 피부 건조 중량의 75%를 차지하며, 모근 및 피지선을 보호하는 역할을 하고, 피부의 신축성과 탄력성에 도움을 준다.
또한 콜라겐은 뼈에서 칼슘과 인이 빠져나가지 않도록 조절해주고, 관절의 충격을 완화해주는 역할을 하여 골다공증과 관절건강에도 도움을 준다. 이 외에도, 혈관벽의 유연성을 높여 고혈압, 동맥경화 예방에 효과적이며, 면역증강과 치아건강에도 도움을 준다고 알려져 있다.
체내에서 콜라겐의 합성과 분해가 반복되지만, 노화가 진행될수록 불균형이 생기고 합성보다 분해가 더욱 많이 일어난다. 특히, 노년기에는 콜라겐 합성 유전자의 활성이 감소하여 피부의 두께가 얇아지고 피부 탄력성이 떨어진다. 이를 예방하기 위해, 콜라겐을 꾸준히 섭취하는 것이 중요하다.
콜라겐을 섭취하면 생체 내 분해과정을 통해 다이펩타이드(dipeptide) 또는 트리펩타이드(tripeptide) 형태로 체내에 흡수되어 혈류를 통해 조직에 분포한다. 높은 분자량의 콜라겐은 체내의 흡수율이 떨어질 수 있다.
본 발명은 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 발효를 이용한 콜라겐의 저분자화 방법 및 콜라겐 및 포스트바이오틱스가 혼합된 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 본 발명의 목적은 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 발효를 이용한 콜라겐의 저분자화 방법에 있어서, 상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201[기탁번호: ATCC BAA-2836]으로 제1분자량을 가지는 원료 콜라겐을 분해하는 단계를 포함하며, 상기 발효에 의해 상기 원료 콜라겐은 상기 제1분자량보다 낮은 제2분자량을 가지는 저분자화 콜라겐으로 전환되는 것에 의해 달성된다.
상기 발효는, 상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201을 발효 후 여과하여 배양상등액을 얻는 단계; 및 상기 배양상등액과 상기 원료 콜라겐을 혼합하여 상기 원료 콜라겐을 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 배양상등액 내의 상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 사용량은 상기 원료 콜라겐에 대하여 2억 CFU/g 내지 15억 CFU/g일 수 있다.
상기 발효 이후에, 상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201을 사균화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 사균화는 열처리에 의해 수행될 수 있다.
상기 발효는 25 내지 50℃에서 20분 내지 3시간 동안 수행되며, 상기 열처리는 110 내지 140℃에서 5분 내지 1시간 동안 수행될 수 있다.
상기 저분자화 콜라겐의 3000Da이상의 콜라겐 함량은 상기 원료 콜라겐의 3000Da이상의 콜라겐 함량의 0.1 배 내지 0.4배이며, 상기 저분자화 콜라겐의 500Da이하의 콜라겐 함량은 상기 원료 콜라겐의 500Da이상의 콜라겐 함량의 2배 내지 8배일 수 있다.
상기 본 발명의 목적은 콜라겐 및 포스트바이오틱스가 혼합된 복합체에 있어서, 상기 포스트바이오틱스는 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201을 포함하는 것에 의해 달성된다.
상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201은 상기 콜라겐에 대하여 2억 CFU/g 내지 15억 CFU/g로 포함되어 있을 수 있다.
상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201은 사멸되어 있을 수 있다.
상기 콜라겐의 500Da이하의 콜라겐 함량은 3000Da이상의 콜라겐 함량의 8 배 내지 20배일 수 있다.
본 발명에 따르면 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 발효를 이용한 콜라겐의 저분자화 방법 및 콜라겐 및 포스트바이오틱스가 혼합된 복합체가 제공된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 콜라겐의 저분자화 방법을 나타낸 순서도이고,
도 2는 실험예에서 다양한 균주의 단백질 분해 활성 결과를 나타낸 것이고,
도 3은 실험예에서 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201 배양상등액을 이용하여 콜라겐을 발효하였을 때 콜라겐 펩타이드의 분자량 분포가 다양하게 변화했음을 보여주는 것이고,
도 4는 실험예에서 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201 배양상등액을 이용하여 콜라겐을 발효하였을 때 고분자의 콜라겐이 저분자화된 것을 확인하는 크로마토그램이다.
도 2는 실험예에서 다양한 균주의 단백질 분해 활성 결과를 나타낸 것이고,
도 3은 실험예에서 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201 배양상등액을 이용하여 콜라겐을 발효하였을 때 콜라겐 펩타이드의 분자량 분포가 다양하게 변화했음을 보여주는 것이고,
도 4는 실험예에서 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201 배양상등액을 이용하여 콜라겐을 발효하였을 때 고분자의 콜라겐이 저분자화된 것을 확인하는 크로마토그램이다.
이하 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
첨부된 도면은 본 발명의 기술적 사상을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 도시한 일 예에 불과하므로 본 발명의 사상이 첨부된 도면에 한정되는 것은 아니다. 또한 첨부된 도면은 각 구성요소 간의 관계를 설명하기 위해 크기와 간격 등이 실제와 달리 과장되어 있을 수 있다.
본 발명에서는 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201[기탁번호: ATCC BAA-2836]의 발효에 의해 콜라겐을 저분자화하며, 구체적으로는 콜라겐의 분자량을 낮추어 원료 콜라겐보다 분자량이 낮은 저분자화 콜라겐을 제공한다.
즉 원료 콜라겐이 제1분자량을 가지고 저분자화 콜라겐이 제2분자량을 가지는 경우, 제2분자량은 제1분자량보다 분자량이 낮게 된다.
본 명세서에서 "분자량이 낮다"는 것은 수평균분자량 또는 질량평균분자량이 낮다는 것을 의미한다.
락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201은 모유를 먹인 유아의 대변에서 분리되었다.
이하 도 1을 참조하여 본 발명에 따른 콜라겐의 저분자화 방법을 설명한다.
먼저 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201을 배양한다. 발효는 적절한 생산배지를 이용하여 수행할 수 있다.
발효 이후 여과하여 배양상등액을 얻는다. 배양상등액에서의 세포 농도는 0.2억CFU/mL 내지 2억CFU/mL 또는 0.3억CFU/mL 내지 0.9억CFU/mL일 수 있다.
이후 배양상등액에 원료 콜라겐을 현탁하고 발효시킨다. 원료 콜라겐은 배양상등액의 5 내지 50중량% 또는 5 내지 15중량%일 수 있다. 원료 콜라겐의 분자량은 다양할 수 있다. 이에 한정되지 않으나, 원료콜라겐은 2,000Da 이상의 콜라겐을 20중량% 이상, 30중량% 이상, 40중량% 이상 또는 50중량%이상 포함하거나, 3,000Da 이상의 콜라겐을 20중량% 이상, 30중량% 이상, 40중량% 이상 또는 50중량%이상 포함하거나, 3,000Da 이상의 콜라겐을 20중량% 이상, 30중량% 이상, 40중량% 이상 또는 50중량%이상 포함하거나, 5,000Da 이상의 콜라겐을 20중량% 이상, 30중량% 이상, 40중량% 이상 또는 50중량%이상 포함할 수 있다.
현탁시 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201은 원료콜라겐에 대하여 2억 CFU/g 내지 15억 CFU/g 또는 3억 CFU/g 내지 9억 CFU/g일 수 있다.
발효는 25 내지 50℃에서 20분 내지 3시간 동안 수행될 수 있다.
발효에 의해 원료 콜라겐은 분자량이 감소한 저분자화 콜라겐으로 전환된다. 예를 들어, 저분자화 콜라겐의 3000Da이상의 콜라겐 함량은 상기 원료 콜라겐의 3000Da이상의 콜라겐 함량의 0.1 배 내지 0.4배이며, 저분자화 콜라겐의 500Da이하의 콜라겐 함량은 상기 원료 콜라겐의 500Da이상의 콜라겐 함량의 2배 내지 8배일 수 있다.
이후 열처리를 통해 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201을 사균화한다. 열처리는 110 내지 140℃에서 5분 내지 1시간 동안 수행될 수 있다.
이후 통상의 정립 및 포장 절차를 거치면 콜라겐 및 포스트바이오틱스가 혼합된 복합체가 얻어진다. 본 발명에 따른 복합체에서 콜라겐은 분자량 조절과정을 통해 분자량이 낮아진 저분자화 콜라겐이다.
복합체에서 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201과 콜라겐은, 이에 한정되지 않으나, 불규칙적으로 혼합되어 있을 수 있다.
복합체에서 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201은 저분자화 콜라겐에 대하여 2억 CFU/g 내지 15억 CFU/g로 포함되어 있을 수 있으며, 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201은 90% 이상, 95%이상 또는 99%이상 사멸화되어 있을 수 있다.
저분자화 콜라겐에서 500Da이하의 콜라겐 함량은 3000Da이상의 콜라겐 함량의 8 배 내지 20배일 수 있다.
이하 실험예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
[실험 1] 단백질 분해 활성 확인
본 실험에 사용된 균주는 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201, 락티카제이바실루스 람노서스 KCTC 5033 그리고 락티카제이바실루스 람노서스 KCTC 5510이다.
상기 3종의 프로바이오틱스를 배양하기 위해 MRS배지(DB Difico, Franklin Lakes, NJ, USA)를 121℃, 15분 동안 멸균하였다. 플레이트로부터 단일 콜로니를 배지에 1일 동안 혐기적으로 37℃, 정치 조건으로 배양하였다.
단백질 분해 활성을 확인하기 위해, 동물성 및 식물성 단백질이 혼합된 복합 단백질을 사용하였다. 구체적으로, 배양배지는 복합 단백질 28g/L, tryptone 5g/L, yeast extract 2.5g/L, glucose 1g/L, agar 15g/L로 만들었으며 단백질 응고를 막기 위해 복합 단백질 + 50% D.W., 나머지 조성물 + 50% D.W.로 만들어 멸균 후 혼합하여 사용하였다. 플레이트에 프로바이오틱스를 10㎕ 떨어뜨린 후 37℃에서 48시간 배양하였고, 배양 후 프로바이오틱스 스팟 주위에 단백질이 분해되어 생겨난 clear zone의 길이를 측정하였다.
단백질 분해 활성 결과는 도 3에 나타내었다. 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201이 락티카제이바실루스 람노서스 KCTC 5033과 KCTC 5510보다 월등히 높은 단백질 분해 활성을 보였다.
[실험 2] 콜라겐 저분자화
락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201을 일동바이오사이언스 생산배지에서 발효한 후 여과하여 배양상등액을 회수하였으며, 이때 세포의 농도는 0.57억CFU/mL이었다. 회수한 상등액에 콜라겐을 10 중량%로 현탁하여 37℃, 1시간 동안 발효시킨 후, 121℃, 15분 동안 열처리를 진행하였다. 열처리 후 발효된 콜라겐을 30℃로 냉각 후 건조하여 분말화하였다.
분석을 위한 대조군으로 사용된 콜라겐은 멸균상등액 대신 멸균 생산배지로 현탁되었다. 멸균 생산배지는 포도당, 펩톤, 효모추출물 분말, 황산마그네슘 수화물, 초산나트륨, 수산화나트륨 등을 포함하여 구성되었다.
콜라겐은 실험에 사용된 콜라겐은 Kangcare Bioindustry사로부터 공급받은 피쉬 콜라겐 펩타이드이며 분자량 분포는 표 2와 같다.
[실험 3] 콜라겐 저분자화 확인
본 실험에서는 실험 2에서 준비한 시료의 펩타이드 프로파일링 실험을 진행하였다. 분석 기기는 액체 크로마토그래피/질량분석기(Ultimate 3000 RSLC HPLC, Thermo Fisher Scientific Dionex, Germany)를 사용하였고, 물질의 분리를 위해 C8컬럼(Agilent ZORBAX 300SB-C8, 3.5㎛, 50 x 2.1 mm, Agilent Technologies, CA, USA)을 사용하였다. 이동상 용매의 조건은 표 1에 나타내었으며, 0.3 mL/min 유속으로 분석을 진행하였다. 질량분석기의 이온화 모드는 포지티브 모드로 측정하였고, 사용한 이온화 에너지와 온도는 각각 5,500V와 500℃로 진행하였다. NCBI의 콜라겐 펩타이드 데이터베이스를 사용하여 펩타이드를 정성 분석한 뒤, 아미노산 개수에 따라 펩타이드를 분류하였다. 해당 결과는 도 3에 나타내었다.
| 시간(분) | 0.1% 포름산 (v/v)(%) | 아세토나이트릴(%) |
| 0.0 | 95 | 5 |
| 1.0 | 95 | 5 |
| 17.0 | 55 | 45 |
| 24.0 | 0 | 100 |
| 26.0 | 0 | 100 |
| 26.5 | 95 | 5 |
| 27.0 | 5 | 5 |
| 30.0 | 5 | 5 |
전체적으로 콜라겐대조군에 비교하여 저분자화 콜라겐에서 상대적으로 작은 분자크기를 가진 콜라겐 펩타이드가 검출되었다. 아미노산 43개 이상의 분자량이 큰 펩타이드는 콜라겐 시료에서만 검출되었다. 한편, 배양상등액에서는 약 1000Da 내외의 분자량을 가진 펩타이드만 낮은 종류로 검출되었다. 이를 통해, 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201 균주의 배양상등액을 이용한 발효를 통하여 원료콜라겐을 저분자화시켜 저분자의 다양한 펩타이드가 생성되었다고 추측할 수 있다.
[실험 4] 정량적 분자량 분석
실험 3의 추론적인 정성적인 결과를 겔 투과 크로마토그래피(Waters 1260, Waters Co., Milford, MA, USA) 및 굴절률 검출기를 이용한 Peak intensity분석을 통하여 분자량이 높은 콜라겐은 분해가 되고 낮은 분자량의 콜라겐이 생성되었는지 여부를 관찰하였다. 물질의 분리를 위해 SEC컬럼(Xbridge Protein BEH SEC, 3.5㎛, 7.8 × 150 mm, Waters Co.)을 사용하였고, 컬럼의 온도는 40℃로 조절되었다. 이동상으로는 메탄올 10%(v/v)를 사용하였고, 유속은 0.7 mL/min로 진행하였다.
본 실시예에서 진행한 분석 결과는 도 4에 나타내었다. 대조군과 실험군의 분석을 하기 전에 배양상등액의 펩타이드를 분석할 결과 분자량 257Da의 피크가 높은 감도로 측정이 되었으며, 콜라겐 대조군의 경우 26,750Da에서 380Da의 크기의 펩타이드 분자들이 골고루 분포되었음을 확인하였다. 반면, 배양 상등액을 처리한 콜라겐에서는 26,750Da과 3,460Da사이의 콜라겐 펩타이드들은 확연하게 분해된 것을 확인하였으며, 이로 인하여 작은 펩타이드 (1,130Da - 380Da)들이 새롭게 생성됨을 확인하였다. 이를 통해, 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 발효에 의해 콜라겐이 효과적으로 저분자화된 것을 확인할 수 있다. 380Da이하의 분자량 범위에서는 상등액 내의 아미노산과 유기산 등의 대사체가 다량 검출되었다고 판단된다.
원료 콜라겐과 저분자화 콜라겐의 분자량별 함량은 표 2와 같다.
| <500Da | 500-1000Da | 1000-1500Da | 1500-2000Da | 2000-2500Da | 2500-3000Da | >3000Da | |
| 원료 콜라겐 |
11.68 중량% | 22.42 중량% | 22.55 중량% | 13.76 중량% | 7.82 중량% | 4.86 중량% | 16.92 중량% |
| 저분자화 콜라겐 | 47.53 중량% | 20.70 중량% | 13.95 중량% | 7.10 중량% | 4.40 중량% | 2.56 중량% | 3.75 중량% |
Claims (11)
- 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 발효를 이용한 콜라겐의 저분자화 방법에 있어서,
상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201[기탁번호: ATCC BAA-2836]으로 제1분자량을 가지는 원료 콜라겐을 분해하는 단계를 포함하며,
상기 발효에 의해 상기 원료 콜라겐은 상기 제1분자량보다 낮은 제2분자량을 가지는 저분자화 콜라겐으로 전환되며,
상기 저분자화 콜라겐의 3000Da이상의 콜라겐 함량은 상기 원료 콜라겐의 3000Da이상의 콜라겐 함량의 0.1 배 내지 0.4배이며,
상기 저분자화 콜라겐의 500Da이하의 콜라겐 함량은 상기 원료 콜라겐의 500Da이상의 콜라겐 함량의 2배 내지 8배인 저분자화 방법. - 제1항에서,
상기 발효는,
상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201을 발효 후 여과하여 배양상등액을 얻는 단계; 및
상기 배양상등액과 상기 원료 콜라겐을 혼합하여 상기 원료 콜라겐을 발효하는 단계를 포함하는 저분자화 방법. - 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양상등액 내의 상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201의 사용량은 상기 원료 콜라겐에 대하여 2억 CFU/g 내지 15억 CFU/g인 저분자화 방법. - 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 발효 이후에,
상기 락티카제이바실루스 람노서스 IDCC 3201을 사균화하는 단계를 더 포함하는 저분자화 방법. - 제4항에 있어서,
상기 사균화는 열처리에 의해 수행되는 저분자화 방법. - 제5항에 있어서,
상기 발효는 25 내지 50℃에서 20분 내지 3시간 동안 수행되며,
상기 열처리는 110 내지 140℃에서 5분 내지 1시간 동안 수행되는 저분자화 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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