CN102559823A - 蛙皮提取物及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及蛙皮提取物的提取方法。该提取方法通过生物酶解技术，能够有效提取获得蛙皮提取物，其中蛙胶原蛋白的纯度达54.6～56.2％。获得的蛙皮提取物或能够有效治疗胃炎、肠炎、痢疾，治疗黄褐斑的有效率在95.0％，改善细纹的有效率在97.5％，改善皮肤暗黄的有效率在96.0％，还能够有效降低高血压。

Description

蛙皮提取物及其提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及蛙皮提取物及其提取方法。

背景技术

胶原蛋白(collagen)是一种含糖蛋白质，在自然界广泛分布，主要分布在动物的结缔组织中，作为皮肤、骨骼、肌腱、韧带、血管的构成材料；人体成分中有16％左右是蛋白质，胶原蛋白占体内蛋白质总量的30～40％，是人体内含量最多的蛋白质；胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白是人体组织结构的主要成分之一，也是人体内含量最多的一种蛋白质，约占人体蛋白质总量的1/3，相当于人体体重的6％，它遍及全身的各个组织器官，如：皮肤、骨骼、软骨、韧带、角膜、各种内膜、筋膜等，是维持皮肤与组织器官形态、结构的主要成分，也是修复各损伤组织的重要原料物质。当胶原蛋白不足时，不仅皮肤及骨骼会出现问题，对内脏器官也会产生不利影响。胶原蛋白是维持身体正常活动所不可缺少的重要成分，同时也是使身体保持年轻、防止老化的物质。另外，胶原蛋白还可以预防疾病，改善体质，对美容和健康都很有帮助。

胶原蛋白是大分子蛋白质，分子量约为30～50万道尔顿，而最适宜人体吸收的是分子量小于1500～1800D。并不能被人体直接吸收。食入含胶原蛋白的食物必须经消化道蛋白酶分解成单纯的小分子氨基酸，才能被肠道吸收利用，再经过机体复杂的生物化学反应，合成人体需要的胶原蛋白，供给各组织器官的需要。人体吸收是以肽的方式进行，食用蛋白肽的吸收利用率可达100％。肽的分子量、氨基酸排列顺序不同所表现的功能不同。

蛙皮是蛙科动物蛙的干燥皮肤，该动物为野生或养殖动物，其富含胶原蛋白、大孔多肽因子、透明质酸等成分。其中的胶原蛋白能有效增强人体皮肤组织细胞的储水功能，人体经常补充胶原蛋白可增加肌肤弹性，保持皮肤柔软、细嫩，也能使体内的血管、骨骼和神经保持韧性和弹性，淡化黑斑，降低血压等功效。蛙皮中的多肽具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌尤其对耐药菌株具有明显的抑制作用，还可以用来治疗胃痛、痢疾、肠炎等炎性疾病。

目前提取蛙胶原蛋白的方法收率不高，获得的蛙胶原蛋白含量较低。因此，提供蛙胶原蛋白含量较高的蛙皮提取物及提取方法，具有现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供蛙皮提取物及其提取方法。该提取方法通过生物酶解技术，能够有效提取获得蛙皮提取物，获得的蛙皮提取物中蛙胶原蛋白的纯度达54.6～56.2％。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种蛙皮提取物的提取方法，包括如下步骤：

取蛙皮肤经-80～-75℃冷冻干燥4～6h，粉碎过20～40目筛、预处理后，在37～38℃，加醋酸或盐酸酸化，调节pH值为2～3的条件下，加入酶活力为10万IU/g的胃蛋白酶和酶活力为140万IU/g的纤维酶进行酶解12～15h，获得酶解液，60℃酶灭活后，3000r/min离心收集上清液，用碳酸钠或氢氧化钠调节pH值为6～7，加入中性盐或强酸弱碱盐经盐析后收集沉淀，3～5℃透析20～24h后于60℃真空浓缩至相对密度为1.15～1.20，高压灭菌后经-80～-75℃冷冻干燥10～12h，即得；所述蛙皮肤、所述胃蛋白酶、所述纤维酶的质量比为100∶0.5～1.0∶1.0～1.5；所述透析的截留分子量为500～1500Da。

盐析过程中，加入中性盐或强酸弱碱盐至沉淀不再析出为止。

以蛙皮肤为原料，采用复合生物酶解技术，破坏生物细胞壁，破坏蛙皮中胶原蛋白的纤维网状结构，解开肽链，使溶媒直接深入生物细胞膜内与有效活性成分充分接触，有利于活性成分的溶出。采用缓冲液透析技术除去胶原蛋白液中的盐性成分及一些夹杂其中的小分子蛋白。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的提取方法，所述预处理为加水在55～60℃保温1h；以g/mL计，所述蛙皮肤与水的质量体积比为1∶8～10。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的提取方法，所述酸化为于37～38℃保温12～15h。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的提取方法，所述高压灭菌具体为在300～500MPa、15～35℃的条件下灭菌8～10min。本发明还提供了上述提取方法获得的蛙皮提取物。

本发明提供的蛙皮提取物可以制备革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌抑制剂。

本发明提供的蛙皮提取物可以制备预防或/和治疗炎症药物。

本发明提供的蛙皮提取物可以制备预防或/和治疗胃炎、痢疾、肠炎药物。

本发明提供的蛙皮提取物可以制备降血压药物。

本发明提供的蛙皮提取物可以制备淡化色斑、减少皱纹、增加皮肤弹性、提亮肤色药物、保健品。

本发明提供蛙皮提取物及其提取方法。该提取方法通过生物酶解技术，破坏生物细胞壁，破坏蛙皮中胶原蛋白的纤维网状结构，解开肽链，使溶媒直接深入生物细胞膜内与有效活性成分充分接触，有利于活性成分的溶出。采用缓冲液透析技术除去胶原蛋白液中的盐性成分及一些夹杂其中的小分子蛋白，采用冷冻干燥技术将胶原蛋白液低温冷冻至海绵状胶原蛋白，能够有效提取获得蛙皮提取物，获得的蛙皮提取物中蛙胶原蛋白的纯度达54.6～56.2％，获得的蛙皮提取物能够有效治疗胃炎、肠炎、痢疾，对胃炎的治疗有效率由69.67％提高至83.67％，对肠炎的治疗有效率由74.67％提高至90.33％，对痢疾的治疗有效率由74.33％提高至88.67％，差异均具有显著性(P＜0.05)。

本发明提供的蛙皮提取物治疗黄褐斑的有效率在95.0％，改善细纹的有效率在97.5％，改善皮肤暗黄的有效率在96.0％，能够有效改善黄褐斑、细纹、皮肤暗黄。

本发明提供的蛙皮提取物还能够有效降低高血压。

具体实施方式

本发明公开了蛙皮提取物及其提取方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的蛙皮提取物中所用蛙皮肤、试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1蛙皮提取物的制备

取干燥的林蛙皮肤100g，浸渍于0.5％的氢氧化钠碱溶液中，浸泡至软化，于-75℃低温冷冻干燥6h，粉碎成40目粗粉，加入8倍量水搅拌加热至60℃，保温1小时，冷却至37℃，加入醋酸酸化，调节pH值为3，搅拌均匀，37℃保温15小时，调节pH值为3，加入0.5g胃蛋白酶(酶活力为10万IU/g)与1.0g的纤维酶(酶活力为140万IU/g)，搅拌均匀，进行生物酶解12小时，加热至60℃，使酶灭活，3000转/分钟高速离心，取上清液，用10％的碳酸钠溶液调PH值至6～7，加入饱和硫酸铵溶液进行盐析直至无沉淀析出，过滤收集沉淀，向沉淀中加入纯化水使之溶解，装入半透膜透析袋(截留分子量为1500Da)中，置于盛有纯化水的不锈钢桶中，在5℃环境中透析22h，中间进行3～4次更换纯化水，保留液60℃真空浓缩至相对密度1.15(60℃)，将浓缩液装入药用真空复合袋中，密封包装，置入超高压灭菌设备内胆中，在400MPa高压、28℃的条件下灭菌9分钟，取出浓缩液置冷冻干燥机中-80℃干燥10h，成海绵状白色或淡黄色固体，在十万级洁净环境中粉碎成100目细粉，批混，包装，入库。

对获得的海绵状白色或淡黄色固体，即蛙皮提取物进行检测，结果如下：

胶原蛋白的鉴别：氨基酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳均符合胶原蛋白的特征，本发明提供的蛙皮提取物中含有蛙胶原蛋白。

胶原蛋白含量：54.6％(请补充测定方法)

胶原蛋白分子量测定：3000Da(参考2010年药典二部附录VH)。

实施例2蛙皮提取物的制备

取干燥的林蛙皮100g，浸渍于0.5％的氢氧化钠碱溶液中，浸泡至软化，于-78℃低温干燥4h，粉碎成20目粗粉，加入10倍量水搅拌加热至58℃，保温1小时，冷却至38℃，加入盐酸酸化，调节pH值为2，搅拌均匀，38℃保温12小时，调节pH值为2，加入1.0g胃蛋白酶(酶活力为10万IU/g)与1.2g的纤维酶(酶活力为140万IU/g)，搅拌均匀，进行生物酶解15小时，加热至60℃，使酶灭活，3000转/分钟高速离心，取上清液，用10％的氢氧化钠溶液调PH值至中性，加入饱和硫酸铵溶液进行盐析直至无沉淀析出，过滤收集沉淀，向沉淀中加入纯化水使之溶解，装入半透膜透析袋(截留分子量为500Da)中，置于盛有纯化水的不锈钢桶中，在3℃环境中透析24h，中间进行3～4次更换纯化水，保留液60℃真空浓缩至相对密度1.18(60℃)，将浓缩液装入药用真空复合袋中，密封包装，置入超高压灭菌设备内胆中，在500MPa高压、20℃的条件下灭菌8分钟，取出浓缩液置冷冻干燥机中-75℃干燥12h，成海绵状白色或淡黄色固体，在十万级洁净环境中粉碎成100目细粉，批混，包装，入库。

对获得的海绵状白色或淡黄色固体，即蛙皮提取物进行检测，结果如下：

胶原蛋白的鉴别：氨基酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳均符合胶原蛋白的特征，本发明提供的蛙皮提取物中含有蛙胶原蛋白。

胶原蛋白含量：56.2％(请补充测定方法)

胶原蛋白分子量测定：1500Da(参考2010年药典二部附录VH)。

实施例3蛙皮提取物的制备

取干燥的林蛙皮肤100g，浸渍于0.5％的氢氧化钠碱溶液中，浸泡至软化，于-76℃低温干燥5h，粉碎成30目粗粉，加入9倍量水搅拌加热至55℃，保温1小时，冷却至37.5℃，加入醋酸酸化，调节pH值为2，搅拌均匀，37.5℃保温14小时，调节pH值为2，加入0.8g胃蛋白酶(酶活力为10万IU/g)与1.5g的纤维酶(酶活力为140万IU/g)，搅拌均匀，进行生物酶解14小时，加热至60℃，使酶灭活，3000转/分钟高速离心，取上清液，用10％的碳酸钠溶液调PH值至中性，加入饱和硫酸铵溶液进行盐析直至无沉淀析出，过滤收集沉淀，向沉淀中加入纯化水使之溶解，装入半透膜透析袋(截留分子量为1000Da)中，置于盛有纯化水的不锈钢桶中，在4℃环境中透析20h，中间进行3～4次更换纯化水，保留液60℃真空浓缩至相对密度1.20(60℃)，将浓缩液装入药用真空复合袋中，密封包装，置入超高压灭菌设备内胆中，在300MPa高压、35℃的条件下灭菌10分钟，取出浓缩液置冷冻干燥机中-78℃干燥11h，成海绵状白色或淡黄色固体，在十万级洁净环境中粉碎成100目细粉，批混，包装，入库。

对获得的海绵状白色或淡黄色固体，即蛙皮提取物进行检测，结果如下：

胶原蛋白的鉴别：氨基酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳均符合胶原蛋白的特征，本发明提供的蛙皮提取物中含有蛙胶原蛋白。

胶原蛋白含量：55.3％(请补充测定方法)

胶原蛋白分子量测定：2660Da(参考2010年药典二部附录VH)。

实施例4抑菌效果评价

对照组：将本发明实施例1至3提供的蛙皮提取物5g，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含蛙皮提取物的平板，分别接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况；

试验组：在50℃左右的定量MH琼脂中，分别接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况。

本发明实施例1至3提供的蛙皮提取物对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。特别是对革兰氏阴性菌作用显著(P≤0.05)，如大肠杆菌、沙门氏菌、伤寒杆菌、产气杆菌、克雷伯氏杆菌、巴氏杆菌、布氏杆菌、痢疾杆菌等作用较强，对革兰氏阳性菌中如炭疽杆菌、葡萄球菌、棒状杆菌、肺炎球菌、链球菌、肠球菌和放线菌的作用也较显著(P≤0.05)。

实施例5微生物检测结果

本发明实施例1至3提供的蛙皮提取物中微生物检测结果见表1。

表1微生物检测结果

项目	标准	结果
			菌落总数	≤100cfu/g	60cfu/g
酵母菌、霉菌	≤50cfu/g	10cfu/g
			大肠杆菌	不得检出	未检出
沙门菌	不得检出	未检出
			金黄色葡萄球菌	不得检出	未检出

实施例6药效评价

试验组：本发明实施例1至3提供的蛙皮提取物，对胃炎、肠炎、痢疾各300名患者进行治疗；每天服用三次，每次服用2～4g；

阳性药物对照组：阳性药物对胃炎、肠炎、痢疾各300名患者进行治疗；每天三次，每次服用2～4片，每片1g。

疗效判定标准：

痊愈：临床症状消失，肠镜检查、肠粘膜检查恢复正常。

好转：临床症状减轻，肠镜检查、肠粘膜病变较前明显改善，大便常规检查有少量红、白细胞。

无效：治疗前后，临床症状和镜检等检查无改善或无明显改善。

结果见表2。

表2本发明提供的蛙皮提取物药效试验

由表2结果可知，本发明实施例1至3提供的蛙皮提取物，与阳性药物对照组相比，胃炎的有效率由69.67％提高至83.67％，差异具有显著性(P＜0.05)；肠炎的有效率由74.67％提高至90.33％，差异具有显著性(P＜0.05)；痢疾的有效率由74.33％提高至88.67％，差异具有显著性(P＜0.05)。

综合上述结果，本发明实施例1至3提供的蛙皮提取物，与阳性药物对照组相比，显著提高了药效。

实施例7疗效评价

疗效判定标准：

基本治愈：肉眼视色斑面积消退＞90％，颜色基本消失，皮肤有光泽，肤色暗黄改善＞90％，细纹减少＞90％；评分法计算治疗后下降指数≥0.8；

显效：肉眼视色斑面积消退＞60％，颜色明显变淡，皮肤较有光泽，肤色暗黄改善＞60％，细纹减少＞60％；评分法计算治疗后下降指数≥0.5；

好转：肉眼视色斑面积消退＞30％，颜色变淡，皮肤有光泽，肤色暗黄改善＞30％，细纹减少＞30％；评分法计算治疗后下降指数≥0.3；

无效：肉眼视色斑面积消退＜30％，颜色变化不明显，肤色暗黄改善＜30％，细纹减少＜30％；评分法计算治疗后下降指数≥0。

评分方法和标准见表3。

表3评分方法和标准

评分法中下降指数的计算方法：

病情评分资料及疗效对比采用SPSS统计软件进行统计学处理，采用卡方检验，以P＜0.05为显著差异具有统计学意义，疗效见表4。

表4临床治疗效果

临床治疗效果显示，本发明实施例1至实施例3提供的蛙皮提取物治疗黄褐斑的有效率在95.0％，改善细纹的有效率在97.5％，改善皮肤暗黄的有效率在96.0％。

综上所述，本发明实施例1至实施例3提供的蛙皮提取物能够有效改善黄褐斑、细纹、皮肤暗黄。

实施例7病例

病例1：北京张女士，52岁，面部黄褐斑七年，皮肤暗黄，眼角多细纹。

每天用豆浆或水冲服本发明实施例1至3制备的蛙皮提取物，一个月后开始逐渐出现面部下颚赘肉减少，逐渐出现尖下颌，面部暗斑也逐渐淡化，面部及眼皮细皱纹逐渐减少，皮肤出现潮润，有光泽。

病例2：重庆王女士，56岁，高血压。

每天用豆浆或水冲服本发明实施例1至3制备的蛙皮提取物，服用一个月后，血压开始回落，基本接近正常值85～130mmHg。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种蛙皮提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

取蛙皮肤经-80～-75℃冷冻干燥4～6h，粉碎过20～40目筛、预处理后，在37～38℃，加醋酸或盐酸酸化，调节pH值为2～3的条件下，加入酶活力为10万IU/g的胃蛋白酶和酶活力为140万IU/g的纤维酶进行酶解12～15h，获得酶解液，60℃酶灭活后，3000r/min离心收集上清液，用碳酸钠或氢氧化钠调节pH值为6～7，加入中性盐或强酸弱碱盐经盐析后收集沉淀，3～5℃透析20～24h后于60℃真空浓缩至相对密度为1.15～1.20，高压灭菌后经-80～-75℃冷冻干燥10～12h，即得；所述蛙皮肤、所述胃蛋白酶、所述纤维酶的质量比为100∶0.5～1.0∶1.0～1.5；所述透析的截留分子量为500～1500Da。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述预处理为加水在55～60℃保温1h；以g/mL计，所述蛙皮肤与水的质量体积比为1∶8～10。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述加酸酸化为于37～38℃保温12～15h。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述高压灭菌具体为在300～500MPa、20～35℃的条件下灭菌8～10min。

5.根据权利要求1至4任一项所述提取方法获得的蛙皮提取物。

6.根据权利要求5所述的蛙皮提取物在制备革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌抑制剂中的应用。

7.根据权利要求5所述的蛙皮提取物在制备预防或/和治疗炎症药物中的应用。

8.根据权利要求5所述的蛙皮提取物在制备预防或/和治疗胃炎、痢疾、肠炎药物中的应用。

9.根据权利要求5所述的蛙皮提取物在制备降血压药物中的应用。

10.根据权利要求5所述的蛙皮提取物在制备淡化色斑、减少皱纹、增加皮肤弹性、提亮肤色药物或保健品中的应用。