KR20190098336A

KR20190098336A - 불개미 효소분해 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립성 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침의 제조방법

Info

Publication number: KR20190098336A
Application number: KR1020180018142A
Authority: KR
Inventors: 김원일; 황윤경; 정택근; 김형찬; 허정우; 이지승; 고환주; 김태헌; 정봉기; 조권일; 최원회; 김세란; 최성환; 황승연; 심태경; 김종현; 엄재연; 이경욱; 정연호; 정영목
Original assignee: 김용수; 한약진흥재단; 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2019-08-22

Abstract

본 발명은 불개미 효소분해 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립성 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 불개미 효소분해 추출물 또는 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약침은 천연 유래의 물질을 이용하므로 인체에 안전하여 장기간 사용시 부작용이 없으므로, 전립선 비대증 또는 배뇨장애 개선 또는 치료에 용이하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

불개미 효소분해 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립성 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침의 제조방법{Method for producing pharmacopuncture for improving prostatic hyperplasia or dysuresia comprising enzymatically hydrolyzed Formica yessensis extract as effective component}

본 발명은 불개미 효소분해 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립성 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침의 제조방법에 관한 것이다.

불개미(Formica yessensis)는 불개미 속에 속하는 개미의 한 종으로, 몸 빛깔이 암적황색을 띠고 몸 전체에 연한 황색 털이 있다. 불개미는 우리나라와 일본, 중국, 대만, 러시아 등지의 썩은 나무, 흙 또는 돌 밑 등에서 서식하고 있으며, 살아있는 나무 아래에서는 살지 않는다. 불개미는 우리나라의 내륙에 널리 분포되어 있고 남부지방으로 갈수록 개체수가 적다.

불개미의 효능으로는 관절 통증, 심뇌혈관병, 호흡계통 기관지염, 비뇨 계통, 소화계통, 신경계통 등이 알려져 있다. 말린 개미 100 g에는 70 g 이상의 단백질이 들어 있고 28종의 유리 아미노산과 8종의 아미노산이 들어 있으며, 이소잔토프테린(isoxanthoppterin), 비오틴(biotin), 비타민 B2, 2-아미노-6-하이드로사이프테리딘 등이 들어 있다.

불개미는 동의학에서는 홍의(紅蟻)라 불리우며, 관절염, 신경통, 요통, 폐결핵, 뱀에 물린 경우 또는 상처가 아물지 않은 경우 등에 사용되어 온 귀중한 약재이다. 지금까지의 불개미의 주된 약리 작용인 수렴 진통 진정기능은 개미산, 개미알데하이드 및 아세틸콜린에 의한 것으로 추론되고는 있지만 정확한 학술적인 연구 결과에 의한 것은 아니다. 또한, 기존에는 불개미를 건강식품조성물에 단순히 첨가하거나, 효소 분해하여 성기능 건강식 또는 비뇨기능 개선의 목적으로 사용되는 경우들만 제시하였을 뿐, 불개미 또는 불개미 추출물의 구체적인 기능성 성분에 대한 연구는 이루어지지 않았다.

한편, 한국공개특허 제2013-0085883호에는 골질환의 치료 및 진정 효과가 있는 '전갈 추출물의 제조 방법, 이에 의하여 제조된 전갈 추출물, 및 이를 포함하는 약침용 조성물'이 기재되어 있고, 한국공개특허 제2004-0023459호에는 '불개미를 주제로 한 건강보조식품'이 개재되어 있으나, 본 발명의 불개미 효소분해 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립성 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침의 제조방법에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 불개미 에탄올 추출물에 단백질 분해효소인 알칼라제를 처리하여 불개미 효소분해 추출물을 제조한 후 HPLC-MS로 분석한 결과, 불개미 효소분해 추출물에서 두 개의 주요 펩타이드를 확인하였다. 상기 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약침을 제조하여, 전립선 비대증 및 배뇨장애 환자를 대상으로 임상시험을 수행한 결과, 상기 약침이 전립선 비대증 및 배뇨장애에 개선 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 건조된 불개미를 알칼리 수용액에 침지한 후 꺼내는 단계; (b) 상기 (a)단계의 꺼낸 불개미에 에탄올을 첨가하고 추출한 후 불개미 에탄올 추출물의 농축물을 제조하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 농축물에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; (d) 상기 (c)단계의 효소 반응시킨 농축물에 에탄올을 첨가하여 효소를 실활시킨 후 여과하고 에탄올을 제거하여 불개미 효소분해 추출물을 제조하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계의 불개미 효소분해 추출물에 Tris 완충용액 및 염화나트륨(NaCl)을 혼합하고 여과 및 병입하여 살균 처리하는 단계를 포함하는, 전립선 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 전립선 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침을 제공한다.

본 발명의 불개미 효소분해 추출물 또는 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약침은 전립선 비대증 또는 배뇨장애 개선에 효과가 있고 천연 유래의 물질로 인체에 안전하여 장기간 사용시 부작용이 없으므로, 전립선 비대증 또는 배뇨장애 개선 또는 치료에 용이하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 고성능 액체 크로마토그래피 질량분광법(HPLC-MS)을 통해 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드(333 mz)를 분석한 결과이다.
도 2는 고성능 액체 크로마토그래피 질량분광법(HPLC-MS)을 통해 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드(413 mz)를 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 불개미 효소분해 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립성 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침의 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "약침"이란 경혈이나 압통점 같은 특정 부위에 정제된 액체 형태의 약을 직접 주입하는 침법으로, 주사제 형태로 제조된 약물추출액을 주사기를 사용하여 경혈 또는 통처(痛處)에 주입함으로써 경락경혈의 치료작용과 약물의 약리작용을 혼합한 새로운 한방치료법이다. 일반적으로 한방침은 종류에 따라 혈자리에 관계되어 수지침, 사혈침, 연자침 등과 직접 피부를 자극하거나 해당하는 부위를 찌르는 요법이 있으며, 이외 다양한 요법이 시술되고 있다. 약침 요법은 한방 치료 점인 경혈을 자극함과 동시에, 고유의 약리효과를 가진 한약재 추출물의 피부삽입 효과가 동시에 나타나는 장점이 있다. 또한, 약침요법은 근육이나 혈관 등에 화학약물을 주입하는 양방의 주사와는 달리 약을 복용하기 어려운 환자나 응급환자에게도 수월하게 적용할 수 있다.

본 발명의 약침 제조방법은 구체적으로는,

(a) 건조된 불개미를 알칼리 수용액에 침지한 후 꺼내는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 꺼낸 불개미에 에탄올을 첨가하고 추출한 후 불개미 에탄올 추출물의 농축물을 제조하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 농축물에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 효소 반응시킨 농축물에 에탄올을 첨가하여 효소를 실활시킨 후 여과하고 에탄올을 제거하여 불개미 효소분해 추출물을 제조하는 단계; 및

(e) 상기 (d)단계의 불개미 효소분해 추출물에 Tris 완충용액 및 염화나트륨(NaCl)을 혼합하고 여과 및 병입하여 살균 처리하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 약침의 제조방법에 있어서, 상기 (a)단계의 알칼리 수용액은 바람직하게는 pH 8~9의 0.1~10 %(w/v) 알칼리 수용액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 pH 8.5의 0.1 %(w/v) 알칼리 수용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 알칼리 수용액에 사용되는 알칼리는 바람직하게는 중탄산나트륨, 초산나트륨, 초산칼륨, 구연산나트륨, 구연산칼륨 및 탄산칼륨 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 중탄산나트륨을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기와 같은 알칼리 처리를 통해 불개미에 포함된 개미산을 부분적으로 중화시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 약침의 제조방법에 있어서, 상기 (b)단계의 농축물은 감압 농축 또는 감압 증류에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들어 감압 농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있고, 감압 증류는 갑압 조건에서 증류하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 약침의 제조방법에 있어서, 상기 (c)단계의 단백질 분해 효소는 알칼라제(alkalase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 약침의 제조방법은 바람직하게는,

(a) 건조된 불개미를 pH 8~9의 알칼리 수용액에 50~70분 동안 침지한 후 꺼내는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 꺼낸 불개미에 45~55%(v/v) 에탄올을 첨가하고 50~70℃에서 1~3시간 동안 추출한 후 불개미 에탄올 추출물의 농축물을 제조하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 농축물에 알칼라제를 첨가하여 33~37℃에서 pH 8~9로 유지하면서 50~65분 동안 반응시키는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 효소 반응시킨 농축물에 90~100%(v/v) 에탄올을 첨가하여 효소를 실활시킨 후 여과하고 에탄올을 제거하여 불개미 효소분해 추출물을 제조하는 단계; 및

(e) 상기 (d)단계의 불개미 효소분해 추출물에 Tris 완충용액 및 염화나트륨(NaCl)을 혼합하고, 여과 및 병입하여 115~125℃에서 25~35분 동안 살균 처리하는 단계를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는,

(a) 건조된 불개미 1kg을 pH 8.5의 0.1% 알칼리 수용액에 60분 동안 침지한 후 꺼내는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 꺼낸 불개미에 50%(v/v) 에탄올 2500 ㎖을 첨가하고 60℃에서 2시간 동안 추출한 후 불개미 에탄올 추출물의 농축물을 제조하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 농축물에 알칼라제를 첨가하여 35℃에서 pH 9로 유지하면서 60분 동안 반응시키는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 효소 반응시킨 농축물에 95%(v/v) 에탄올을 동량 첨가하여 효소를 실활시킨 후 여과하고 에탄올을 제거하여 불개미 효소분해 추출물을 제조하는 단계; 및

(e) 상기 (d)단계의 불개미 효소분해 추출물에 Tris 완충용액 및 염화나트륨(NaCl)을 혼합하고, 여과 및 병입하여 121℃에서 30분 동안 살균 처리하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 전립선 비대증 또는 배뇨장개 개선용 약침을 제공한다. 본 발명에 따른 약침은 항균 작용이 있으며, 전립성 비대증 및 배뇨장애 개선 효과가 있는 불개미 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하고 있으므로, 전립선 비대증 또는 배뇨장애의 개선 치료를 위한 용도로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 불개미 효소분해 추출물의 제조 방법

경동시장에서 구입한 건조 불개미 1 kg을 pH 8.5의 0.1% 중탄산나트륨 수용액에 1시간 동안 침지한 후 건져내었다. 상기 건져낸 불개미에 50% 에탄올 2,500 ㎖을 첨가하여 60℃에서 2시간 동안 추출한 후 에탄올을 제거하여 불개미 에탄올 추출물의 농축물을 제조하였고, 상기 농축물에 단백질 분해효소인 알칼라제(alkalase, 노보자임) 5 g을 첨가하여 35℃에서 pH 9로 유지하면서 1시간 효소 반응시킨 후, 95% 에탄올을 동량으로 첨가하여 효소를 실활시킨 다음 여과하고 회전증발기로 에탄올을 제거하여 불개미 효소분해 추출물을 제조하였다.

제조예 2. 약침의 제조방법

약침을 제조하기 위해 전체 중량을 기준으로, 상기 제조된 5 brix% 불개미 효소분해 추출물 10 중량%, pH 7.4 Tris 1mM 완충용액 89.1 중량% 및 염화나트륨(NaCl) 0.9 중량%의 조성으로 혼합한 후 0.2 ㎛ pore size UF 필터로 여과 및 병입하여 121 ℃에서 30분 동안 살균함으로써, 본 발명의 약침을 제조하였다.

실시예 1. 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드 분석

상기 제조된 불개미 효소분해 추출물을 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피 질량분광법(High performance Liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)을 수행하였으며, HPLC-MS의 조건은 하기 표 1과 같다.

그 결과, 약 5.54분에서 분자량 333 mz 및 약 10.19분에서 분자량 413 mz의 펩타이드에 해당하는 피크가 관찰되었다(도 1 및 도 2).

HPLC-MS 분석 조건

항목	조건
기기	HPLC Ultimate3000(Thermo, 미국)
컬럼	Shisedo 2.7 μm 2.1 mm * 150 mm
이동상	A(0.1% formic acid/Water)		B(0.1% formic acid/MeOH)
	0분 10분 45분 50분 60분	10% 10% 70% 10% 10%	90% 90% 30% 90% 90%
기타	- 유량 : 0.4 ㎖/min - 컬럼 온도 : 45 ℃ - 주입량 : 20 ㎕ - 검출기 : MSD TSQ Plus(Thermo) - 검출기모드 : Con voltage 100으로 positive mode

실시예 2. 항균 작용 분석

상기 제조예 1에서 제조된 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드 함유 수용액의 항균력을 분석하기 위해, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne)를 대상으로 하여 최소억제농도(minimum inhibition conc, MIC)와 최소살균농도(minimum batriocidal conc, MBC)를 분석하였다.

그 결과, 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드 수용액의 스타필로코커스 아우레우스 균주에 대한 최소억제농도값은 0.28 ㎍/㎖이고 최소살균농도값은 1.62 ㎍/㎖이었으며, 프로피오니박테이움 아크네 균주에 대한 최소억제농도값은 0.27 ㎍/㎖이고 최소살균농도값은 2.24 ㎍/㎖이었다(표 2). 최소억제농도와 최소살균농도의 수치가 낮을수록 항생제 감수성이 높고 세균에 대한 항균력이 높다는 것을 의미하므로, 본 발명의 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드 수용액의 항균력이 우수함을 알 수 있었다.

항균작용 분석

균주	MIC (㎍/㎖)	MBC (㎍/㎖)
스타필로코커스 아우레우스	0.28	1.62
프로피오니박테이움 아크네	0.27	2.24

실시예 3. 여성 배뇨장애 개선 효과 분석

여성의 배뇨장애 개선 여부를 객관적으로 확인하기 위해 하부요로증상 평가에 광범위하게 사용되고 있는 국제 전립선증상점수(International prostate symptom score, IPSS)를 이용하여 증상 평가를 수행하였다. 야간뇨, 빈뇨, 각박뇨 또는 소변무력증세를 겪고 있는 환자 3인을 대상으로 하여 주 2회 간격으로 관원, 곡골, 신유 혈자리에 상기 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드 수용액이 함유된 약침을 2 ㎖ 주입하였으며, 치료 전, 10회 치료 후 및 20회 치료 후를 기준으로 각각 평가하였다.

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 치료 전에 비해 20회 치료 후에는 배뇨장애가 효과적으로 개선된 것을 확인하였다.

배뇨장애 개선 효과 분석

구분	환자 1	환자 2	환자 3
치료 전	10	25	30
10회 치료 후	3	17	28
20회 치료 후	1	3	9

(숫자가 작을 수록 증상이 경미한 것을 의미.)

실시예 4. 전립선 비대증 개선 효과 분석

남성의 전립선 비대증 개선 여부를 객관적으로 확인하기 위해 국제 전립선증상점수를 이용하여 증상 평가를 수행하였다. 야간뇨, 빈뇨, 각박뇨 또는 소변무력증세를 겪고 있는 환자 3인을 대상으로 하여 주 2회 간격으로 관원, 곡골, 신유 혈자리에 상기 불개미 효소분해 추출물 유래 펩타이드 수용액이 함유된 약침을 2 ㎖ 주입하였으며, 치료 전, 10회 치료 후 및 20회 치료 후를 기준으로 각각 평가하였다.

그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 치료 전에 비해 20회 치료 후에는 배뇨장애가 효과적으로 개선된 것을 확인하였다.

전립선 비대증 개선 효과 분석

구분	환자 1	환자 2	환자 3
치료 전	29	25	30
10회 치료 후	10	17	18
20회 치료 후	5	4	2

(숫자가 작을 수록 증상이 경미한 것을 의미.)

Claims

(a) 건조된 불개미를 알칼리 수용액에 침지한 후 꺼내는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 꺼낸 불개미에 에탄올을 첨가하고 추출한 후 불개미 에탄올 추출물의 농축물을 제조하는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 농축물에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 효소 반응시킨 농축물에 에탄올을 첨가하여 효소를 실활시킨 후 여과하고 에탄올을 제거하여 불개미 효소분해 추출물을 제조하는 단계; 및
(e) 상기 (d)단계의 불개미 효소분해 추출물에 Tris 완충용액 및 염화나트륨(NaCl)을 혼합하고 여과 및 병입하여 살균 처리하는 단계를 포함하는, 전립선 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 단백질 분해 효소는 알칼라제(alkalase)인 것을 특징으로 하는 약침의 제조방법.
제1항에 있어서,
(a) 건조된 불개미를 pH 8~9의 알칼리 수용액에 50~70분 동안 침지한 후 꺼내는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 꺼낸 불개미에 45~55%(v/v) 에탄올을 첨가하고 50~70℃에서 1~3시간 동안 추출한 후 불개미 에탄올 추출물의 농축물을 제조하는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 농축물에 알칼라제를 첨가하여 33~37℃에서 pH 8~9로 유지하면서 50~65분 동안 반응시키는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 효소 반응시킨 농축물에 90~100%(v/v) 에탄올을 첨가하여 효소를 실활시킨 후 여과하고 에탄올을 제거하여 불개미 효소분해 추출물을 제조하는 단계; 및
(e) 상기 (d)단계의 불개미 효소분해 추출물에 Tris 완충용액 및 염화나트륨(NaCl)을 혼합하고, 여과 및 병입하여 115~125℃에서 25~35분 동안 살균 처리하는 단계를 포함하는, 전립선 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 전립선 비대증 또는 배뇨장애 개선용 약침.