TW202317159A - 益生菌液態培養物及其在改善皮膚相關病況上的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種益生菌液態培養物，其是藉由下列方法而被製得：將一包含有菌數比為1：0.125：0.125至1：8：8的嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813)、唾液乳酸桿菌AP-32 (BCRC 910437)以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9 (BCRC 910645)的益生菌組成物共培養於一膠原蛋白溶液中。本發明亦揭示該益生菌液態培養物可被用來改善皮膚病況以及抑制病原菌感染。

Description

益生菌液態培養物及其在改善皮膚相關病況上的用途
本發明是有關於一種使用膠原蛋白溶液(collagen solution)來培養益生菌而得到的益生菌液態培養物(probiotic liquid culture)。本發明亦有關於該益生菌液態培養物可被用來改善皮膚病況(skin condition)以及抑制病原菌感染(pathogen infection)。
皮膚是保護人類個體的最大屏障，它能夠防止水分散失、皮膚病原菌[諸如金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)以及痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes)等]的侵入以及各種有害環境的損害。而當皮膚受到損害時，可能會導致各種不同的皮膚病況(skin condition)，包括：濕疹(eczema)、痤瘡(acne)、黑色素生成(melanogenesis)以及傷口癒合的延遲(delay of wound healing)等。
近年來，人類對於皮膚護理(skin care)的需求與日俱增，因此醫藥界以及化妝品工業的研究人員皆致力於開發出可以有效地改善各種皮膚病況的產品以供廣大的市場所需。
益生菌(probiotics)是一群可改善腸道菌相(intestinal microflora)以及腸道免疫(intestinal immunity)的微生物，並且已被廣泛地應用於食品與保健品中。常用的益生菌包括：乳酸桿菌屬( Lactobacillus)、乳球菌屬( Lactococcus)、小球菌屬( Pediococcus)、腸球菌屬( Enterococcus)、鏈球菌屬( Streptococcus)、雙歧桿菌屬( Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬( Bacillus)以及明串珠菌屬( Leuconostoc)等。
目前已有研究是有關於益生菌菌株在皮膚護理上的應用。例如，TW 202108125 A揭示一種用於美白功效之含乳酸菌發酵物的組成物，其包含以乳酸菌菌株所發酵產生之具有美白功效的發酵物，其中該乳酸菌菌株選自以下至少一者：短雙歧桿菌( Bifidobacterium breve) Bv-889、長雙歧桿菌嬰兒亞種( Bifidobacterium longumsubsp . infantis) BLI-02、動物雙歧桿菌乳亞種( Bifidobacterium animalissubsp . lactis) CP-9、雙歧型雙歧桿菌( Bifidobacterium bifidum) Bf-688、唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp . salicinius) AP-32以及副乾酪乳酸桿菌( Lactobacillus paracasei) GL-156。該等乳酸菌菌株的發酵物經由實驗而被證實各別單獨使用時具有抑制黑色素生成的效用。然而，該等菌株未被發現可改善其他皮膚病況。
雖然已存在有上述文獻報導，本技藝中仍然存在有一需要去開發出可以同時改善多種皮膚病況的產品以供產業界之用。
發明概要
於本發明中，申請人發現將菌數比為1：0.125：0.125至1：8：8的嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)、唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp . salicinius) AP-32 (BCRC 910437)以及動物雙歧桿菌乳亞種( Bifidobacterium animalissubsp . lactis) CP-9 (BCRC 910645)的菌株共培養(co-cultivation)於膠原蛋白溶液(collagen solution)中所得到的益生菌液態培養物(probiotic liquid culture)能夠有效地促進傷口癒合(wound healing)、抑制黑色素生成(melanogenesis)、治療痤瘡(acne)、降低皮膚發炎(skin inflammation)以及減少皮膚褐斑(skin brown spot)，因而被預期能夠應用於改善各種皮膚病況(skin condition)。此外，申請人亦發現該益生菌液態培養物具有抗金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)與痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes)的效用，因而被預期能夠應用於抑制病原菌感染(pathogen infection)。
於是，在第一個方面，本發明提供一種益生菌液態培養物，其是藉由下列方法而被製得：將一包含有菌數比為1：0.125：0.125至1：8：8的嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的益生菌組成物(probiotic composition)共培養於一膠原蛋白溶液中。
在第二個方面，本發明提供一種用於製備一益生菌液態培養物的方法，其包括一如上所述的方法。
在第三個方面，本發明提供一種如上所述的益生菌液態培養物供應用於製備一用來改善皮膚病況之組成物的用途。
在第四個方面，本發明提供一種用於改善皮膚病況的方法，其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的益生菌液態培養物。
在第五個方面，本發明提供一種如上所述的益生菌液態培養物供應用於製備一用來抑制病原菌感染之組成物的用途。
在第六個方面，本發明提供一種用於抑制病原菌感染的方法，其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的益生菌液態培養物。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種益生菌液態培養物(probiotic liquid culture)，其是藉由下列方法而被製得：將一包含有菌數比為1：0.125：0.125至1：8：8的嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)、唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp . salicinius) AP-32 (BCRC 910437)以及動物雙歧桿菌乳亞種( Bifidobacterium animalissubsp . lactis) CP-9 (BCRC 910645)的益生菌組成物(probiotic composition)共培養(co-cultivation)於一膠原蛋白溶液(collagen solution)中。
較佳地，在該益生菌組成物中，嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌數比為1：1：1至1：4：4。
在本發明的一個較佳具體例中，在該益生菌組成物中，嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌數比為1：1：1。
依據本發明，該益生菌組成物可具有一範圍落在10 7至10 12CFU/mL內的細菌濃度。在本發明的一個較佳具體例中，該益生菌組成物的細菌濃度為10 9-10 10CFU/mL。
依據本發明，該膠原蛋白溶液可以是商業上可購得的產品，亦可以是藉由熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術而被製得的產物，例如，從動物組織中所分離出的自然產物或經由基因工程所得到的重組型蛋白。
依據本發明，該膠原蛋白溶液可具有一範圍落在10% (w/v，g/mL)至50% (w/v，g/mL)內的濃度。在本發明的一個較佳具體例中，該膠原蛋白溶液的濃度為20% (w/v，g/mL)。
如本文中所使用的，術語“共培養(co-cultivation)”以及“共發酵(co-fermentation)”可被交換地使用。
有關共培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該共培養可在一範圍落在35℃至45℃內的溫度下被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該共培養是在37℃下被進行。
依據本發明，該共培養被進行歷時一段範圍落在42至72小時內的時間。在本發明的一個較佳具體例中，該共培養被進行歷時48小時。
依據本發明，該益生菌液態培養物可經固液分離處理(solid-liquid separation)而實質上不含有菌體(substantially free of cells)。
依據本發明，該固液分離處理是選自於由下列所構成的群組：離心處理(centrifugation treatment)、過濾處理(filtration treatment)、濃縮處理(concentration treatment)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該固液分離處理是離心處理。
依據本發明，該益生菌液態培養物亦可經滅菌處理(sterilization treatment)而實質上不含有活菌體(substantially free of viable cells)。
依據本發明，該滅菌處理可以藉由在90℃至180℃下加熱歷時10至30分鐘來進行。在本發明的一個較佳具體例中，該滅菌處理是在100℃下加熱歷時30分鐘來進行。
如本文中所使用的，術語“實質上不含有(substantially free of)”意指一被具體指明的組分缺少有意義的含量。較佳地，該組分的含量對於該益生菌液態培養物的性質不具有可測量的影響(measurable effect)。更佳地，該益生菌液態培養物完全不含有該組分。
依據本發明，該益生菌液態培養物可進一步進行一選自於下列的乾燥處理而呈粉末狀：冷凍-乾燥(freeze-drying)、噴霧乾燥(spray-drying)，以及流化床乾燥(fluid bed drying)。
本發明亦提供一種用於製備一益生菌液態培養物的方法，其包括：將一包含有菌數比為1：0.125：0.125至1：8：8的嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的益生菌組成物共培養於一膠原蛋白溶液中。
依據本發明，該方法所使用的益生菌組成物、膠原蛋白溶液以及共培養的條件是如上面所述者。
本發明亦提供一種如上所述的益生菌液態培養物供應用於製備一用來改善皮膚病況(skin condition)之組成物的用途。
依據本發明，該皮膚病況包括下列至少一者：傷口(wound)、黑色素生成(melanogenesis)、痤瘡(acne)、皮膚發炎(skin inflammation)、皮膚褐斑(skin brown spot)，以及皮膚病原菌感染(skin pathogen infection)。
本發明亦提供一種如上所述的益生菌液態培養物供應用於製備一用來抑制病原菌感染(pathogen infection)之組成物的用途。較佳地，該病原菌感染是皮膚病原菌感染。
如本文中所使用的，術語“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibiting)”意指防止或減緩病原菌在一個體中生長。
依據本發明，該病原菌感染是由一選自於由下列所構成之群組中的病原菌所造成：金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes)、大腸桿菌( Escherichia coli)、陰道加德納菌( Gardnerella vaginalis)、絮狀表皮癬菌( Epidermophyton floccosum)、紅色髮癬菌( Trichophyton rubrum)，以及它們的組合。
在本發明的一個較佳具體例中，該病原菌是金黃色葡萄球菌。在本發明的另一個較佳具體例中，該病原菌是痤瘡丙酸桿菌。
依據本發明，該組成物可以是一藥學組成物(pharmaceutical composition)。
依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、分解劑(decomposer)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、稀釋劑(diluent)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。較佳地，該藥學組成物被製造成適於以膠囊而被投藥的劑型。
此外，本發明亦提供一種用於改善皮膚病況的方法，其包括對一有此需要的個體投予(administering)一如上所述的益生菌液態培養物。本發明亦提供一種用於抑制病原菌感染的方法，其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的益生菌液態培養物。
如本文中所使用的，術語“投予”以及“投藥(administration)”可被交換地使用，並且意指藉由任何合適的途徑來對一個體導入(introducing)、提供(providing)或遞送(delivering)一預定的活性成分以執行其預期的效用。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類動物，諸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheep)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依據本發明，該益生菌液態培養物的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被改善的病況之嚴重性，投藥途徑，以及要被改善的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，該益生菌液態培養物可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被口服地投藥。
依據本發明，該組成物可以是一藥妝品組成物(cosmeceutical composition)。
依據本發明，該藥妝品組成物可進一步包含有一如上所述之藥學上可接受的載劑和/或一被廣泛地使用於化妝品製造技術之化妝品上可接受的佐劑(cosmetically acceptable adjuvant)。例如，該化妝品上可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑(gelling agent)、活性劑(active agent)、抗氧化劑(antioxidant)、遮蔽劑(screening agent)、介面活性劑(surfactant)、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料(fragrances)以及氣味吸收劑(odor absorbers)。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥妝品組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、面膜(mask)、貼片(patch)、貼布(pack)、繃帶(bandage)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、分散液(dispersion)、懸浮液(suspension)、滴劑(drop)、慕斯(mousse)、油膏(salve)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、眼影(eyeshadow)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。在本發明的一個較佳具體例中，該藥妝品組成物被製造成適於以凝膠而被施用的劑型。 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1.  益生菌菌株：
在下面實施例中拿來進行功效評估的益生菌菌株已被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)，並且已可自由分讓。另外，該等益生菌菌株亦有依據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)的規定被寄存於中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)以及中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)。為表清楚，各個益生菌菌株的相關資訊(包括：學名、相關出處、寄存編號以及寄存日期等)已被整合於下面表1中。 表1   各個益生菌菌株的相關資訊
菌株 相關出處 寄存編號 寄存日期
嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 TW I701034 B BCRC 910813 2018/01/18
CGMCC No. 15210 2018/01/15
唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp . salicinius) AP-32 TW I384990 B CN 102835666 B BCRC 910437 2009/07/30
CCTCC M 2011127 2011/04/10
動物雙歧桿菌乳亞種( Bifidobacterium animalissubsp . lactis) CP-9 TW I572713 B CN 105985918 B BCRC 910645 2014/08/21
CCTCC M 2014588 2014/11/24
2.  在下面的實施例中所使用的金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)(BCRC 12154)以及痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes)(BCRC 16146)皆是購自於台灣的食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。 3.  在下面的實施例中所使用的膠原蛋白溶液(collagen solution)是購自於杭州紐曲星生物科技有限公司(HANGZHOU NUTRITION BIOTECHNOLOGY CO., Ltd.)，商品名稱為膠原蛋白肽。 4.  細胞株的來源與培養：
在下面的實施例中所使用的人類表皮角質細胞細胞株(成人)(human epidermal keratinocytes cell line)(Adult) HaCaT是由國立成功大學醫學院(College of Medicine, National Cheng Kung University Hospital)的王志堯教授所提供；以及老鼠皮膚黑色素瘤細胞株(mouse skin melanoma cell line) B16F10 (BCRC 60031)是購自於台灣的食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。
這2種細胞皆被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)(Gibco)[添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(EMD Millipore Corp.)以及1%盤尼西林-鏈黴素(penicillin-streptomycin)(Sigma-Aldrich)]的10 cm培養皿(petri dish)中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO 2的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，進行細胞繼代培養(subculture)。 一般實驗方法： 1.  統計學分析(statistical analysis)：
在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，而實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。所有的數據是藉由史徒登氏t-試驗(Student’s t-test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是 p＜0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 益生菌液態培養物 (probiotic liquid culture) 的製備 實驗方法：
首先，將上面“一般實驗材料”的第1項當中所述的3種益生菌菌株分別接種至補充有0.05%半胱胺酸(cysteine)的MRS肉湯培養基(MRS broth)(Difco)中，並於37℃下進行培養歷時24小時，俾以活化菌株。接著，將所得到之經活化的益生菌菌株培養物皆調整成具有一為10 9-10 10CFU/mL的細菌濃度(以平板計數培養基來進行菌數計數)，繼而依據下面表2所示的菌數比來進行混合而得到7種益生菌組成物(probiotic composition)(亦即益生菌組成物1至7)，並分別以一為3% (v/v)的接種量分別接種至1 L的20% (w/v，g/mL)膠原蛋白溶液中，並於37℃下進行培養歷時48小時，而得到益生菌組成物1至7的培養物。之後，將該等培養物在4℃下以3,000 rpm進行離心歷時10分鐘使菌體沉澱，繼而收取上澄液並於100℃下進行滅菌處理歷時30分鐘，藉此而得到各個益生菌組成物的培養上澄液(下稱益生菌液態培養物C1至C7)。 表2.  各個益生菌組成物所使用的菌數比
益生菌組成物 TYCA06：AP-32：CP-9
1 1：0.125：0.125
2 1：1：1
3 1：1：8
4 1：8：1
5 1：0.071：0.071
6 1：1：14
7 1：14：1
另外，將益生菌組成物2以一為3% (v/v)的接種量接種至5 mL的MRS肉湯培養基中，並於37℃下進行培養歷時48小時，接著將所得到之益生菌組成物2的培養物在4℃下以3,000 rpm進行離心歷時10分鐘使菌體沉澱，繼而收取上澄液並於100℃下進行滅菌處理歷時30分鐘，藉此而得到益生菌組成物2的培養上澄液(下稱益生菌液態培養物M)。 實施例 2. 益生菌液態培養物在促進傷口癒合 (wound healing) 上的效用評估 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第4項「細胞株的來源與培養」來進行繼代培養的HaCaT細胞分成10組，其中包括1個對照組、1個比較實驗組以及8個實驗組(亦即實驗組M以及實驗組C1至C7)。將各組細胞分別以一為1×10 6細胞/井的數量培養於含有3 mL的DMEM (添加有10% FBS以及1%盤尼西林-鏈黴素)的6-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO 2)中進行培養歷時24小時。
接著，使用量吸管尖管(pipette tip)沿著各井直徑來刮除HaCaT細胞，以沿著該培養盤的直徑產生一無細胞貼附且寬度約為5 μm的傷口區域(wound area)。之後，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)來洗滌各井。在更換以新鮮的DMEM (添加有10% FBS以及1%盤尼西林-鏈黴素)之後，將適量之在上面實施例1中所得到的益生菌液態培養物M以及益生菌液態培養物C1至C7分別添加至對應的實驗組中，而使得各個實驗組具有最終濃度為6.3 g/L的益生菌液態培養物。另外，將適量的膠原蛋白溶液添加至比較實驗組中，而使得比較實驗組具有最終濃度為6.3 g/L的膠原蛋白。至於對照組則不作任何處理。
各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時。在進行培養之前以及在開始培養之後的第24小時，使用一Olympus CKX41顯微鏡(Olympus CKX41 microscope)並在一為100倍的放大倍數下來對各組的傷口區域進行觀察，並且使用一數位相機(廠牌為Canon)來進行拍照，繼而藉由使用Image J軟體來對所拍到的照片進行分析而計算出該傷口區域的面積。傷口癒合百分比(wound healing percentage)(%)是藉由將所計算出的傷口區域的面積代入下列公式(1)而被計算出： 公式 (1) ： A = [1-(B/C)] × 100其中：A＝傷口癒合百分比(%) B＝在開始培養之後的第24小時所測得的傷口區域的面積 C＝在進行培養之前所測得的傷口區域的面積
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖1顯示HaCaT細胞在以不同益生菌液態培養物予以處理後所測得的傷口癒合百分比。從圖1可見，與對照組相較之下，比較實驗組以及實驗組M的傷口癒合百分比沒有明顯的差異存在，相對地，實驗組C2的傷口癒合百分比則有顯著的增加，這表示：將益生菌組成物2 (嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌數比為1：1：1)共培養(co-cultivation)於膠原蛋白溶液中所得到的益生菌液態培養物在促進傷口癒合上具有優異的效用，並且此效用是顯著優於將益生菌組成物2共培養於MRS培養基中所得到的益生菌液態培養物所具者，以及膠原蛋白本身所具者。另外，在實驗組C1、C3以及C4亦可觀察到相似於實驗組C2的優異效用，至於實驗組C5至C7則無此效用。這個實驗結果顯示：將益生菌組成物1、3與4 (嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌數比為1：0.125：0.125、1：1：8以及1：8：1)共培養於膠原蛋白溶液中所得到的益生菌液態培養物皆可展現優異的促進傷口癒合效用。 實施例 3. 本發明的益生菌液態培養物在抑制黑色素生成 (melanogenesis) 上的效用評估 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第4項「細胞株的來源與培養」來進行繼代培養的B16F10細胞分成11組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、1個比較實驗組以及8個實驗組(亦即實驗組M以及實驗組C1至C7)。將各組細胞分別以一為2×10 6細胞/井的數量培養於含有3 mL的DMEM (添加有10% FBS以及1%盤尼西林-鏈黴素)的6-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO 2)中進行培養歷時24小時。
接著，病理對照組、比較實驗組以及各個實驗組的細胞培養物分別被更換以新鮮的DMEM [添加有10% FBS、1%盤尼西林-鏈黴素以及100 nM的α-促黑素細胞素(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)]，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時，而使得B16F10細胞被誘發黑色素生成。另外，正常對照組的細胞培養物被更換以不含有α-MSH的新鮮的DMEM (添加有10% FBS以及1%盤尼西林-鏈黴素)，並在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時。
接著，將各組的細胞培養物分別更換以不含有α-MSH的新鮮的DMEM (添加有10% FBS以及1%盤尼西林-鏈黴素)，繼而將適量之在上面實施例1中所得到的益生菌液態培養物M以及益生菌液態培養物C1至C7分別添加至對應的實驗組中，而使得各個實驗組具有最終濃度為6.3 g/L的益生菌液態培養物。另外，將適量的膠原蛋白溶液添加至比較實驗組中，而使得比較實驗組具有最終濃度為6.3 g/L的膠原蛋白。至於正常對照組與病理對照組則不作任何處理。
各組細胞在培養箱(37℃，5% CO 2)中進行培養歷時24小時之後，收取細胞培養物並以PBS予以清洗，繼而加入1 mL的1 N NaOH (配於RO水中)並予以充分混合，然後於80℃下進行加熱處理歷時1小時。之後，將所得到的混合物以3,000 rpm進行離心歷時3分鐘，繼而收取100 μL的上澄液，並於405 nm的波長下以一ELISA讀取機(ELISA reader)(廠牌為BioTek)來量測各井的吸光值(OD 405)。
黑色素含量(melanin content)(%)是藉由將所測得的吸光值(OD 405)代入下列公式(2)而被計算出： 公式 (2) ： D=(E/F)×100其中：D=黑色素含量(%) E=各組所測得的OD 405吸光值 F=正常對照組所測得的OD 405吸光值
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖2顯示被誘發黑色素生成的B16F10細胞在以不同益生菌液態培養物予以處理後所測得的黑色素含量。從圖2可見，正常對照組的黑色素含量是顯著地低於病理對照組所具者，這表示α-MSH會成功地誘發B16F10細胞的黑色素生成。而與病理對照組相較之下，比較實驗組以及實驗組M的黑色素含量沒有明顯的差異存在，相對地，實驗組C2的黑色素含量則有顯著的降低，這表示：將益生菌組成物2 (嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌數比為1：1：1)共培養於膠原蛋白溶液中所得到的益生菌液態培養物對於經α-MSH處理的B16F10細胞的黑色素生成具有優異的抑制效用，並且此效用是顯著優於將益生菌組成物2共培養於MRS培養基中所得到的益生菌液態培養物所具者，以及膠原蛋白本身所具者。另外，在實驗組C1、C3以及C4亦可觀察到相似於實驗組C2的優異效用，至於實驗組C5至C7則無此效用。這個實驗結果顯示：將益生菌組成物1、3與4 (嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌數比為1：0.125：0.125、1：1：8以及1：8：1)共培養於膠原蛋白溶液中所得到的益生菌液態培養物皆可展現優異的抑制黑色素生成效用，因而被預期可達到皮膚美白(skin whitening)的效果。 實施例 4. 本發明的益生菌液態培養物在抗菌上的效用評估 實驗方法： A、 抗金黃色葡萄球菌試驗：
將金黃色葡萄球菌接種至營養培養基(nutrient broth)(HIMEDIA)中，並在37℃的條件下進行培養歷時20小時。接著，將所增殖的金黃色葡萄球菌分成4組，其中包括1個正常對照組、1個比較實驗組以及2個實驗組(亦即實驗組M與實驗組C)，每組的體積皆為100 µL，並且具有一為1×10 9CFU/mL的細菌濃度(以平板計數培養基來進行菌數計數)。接著，將4.9 mL之在上面實施例1中所得到的益生菌液態培養物M與益生菌液態培養物C2分別添加至實驗組M與實驗組C中，以及將4.9 mL之膠原蛋白溶液添加至比較實驗組中。至於正常對照組則不作任何處理。
各組在37℃的條件下進行培養歷時6小時之後，對所得到的各組培養物進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，藉此而配製成具有不同稀釋倍數(10 1-10 3倍)的稀釋液。接著，對各個稀釋液取100 µL並將之均勻塗佈在營養瓊脂培養盤(nutrient agar plate)上，然後在37℃的條件下進行培養歷時48小時。之後，計數在營養瓊脂培養盤上所生成的菌落數，並依據稀釋倍數來換算出各組培養物中所含有的金黃色葡萄球菌菌數。
生長抑制率(%)是藉由將所得到的菌數代入下列公式(3)而被計算出： 公式 (3) ： G ＝ [1-(H/I)] × 100其中：G＝生長抑制率(%) H＝各組培養物所含有的菌數 I＝正常對照組的培養物所含有的菌數
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 B、 抗痤瘡丙酸桿菌試驗：
為瞭解本發明的益生菌液態培養物的抗痤瘡丙酸桿菌效用，將痤瘡丙酸桿菌接種至添加有5%脫纖維綿羊血(defibrinated sheep blood)的胰蛋白腖大豆培養基(tryptone soy broth)(HIMEDIA)中，並在37℃的條件下進行培養歷時48小時。接著大體上參照上面針對金黃色葡萄球菌所描述的方式來進行痤瘡丙酸桿菌的分組、益生菌液態培養物與膠原蛋白溶液的處理以及菌落數的計數，不同之處在於：以痤瘡丙酸桿菌來代替金黃色葡萄球菌。接著，將所得到的痤瘡丙酸桿菌菌數代入上面公式(3)來計算出生長抑制率(%)。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖3與圖4分別顯示益生菌液態培養物對於金黃色葡萄球菌以及痤瘡丙酸桿菌的生長抑制率。從圖3與圖4可見，無論是金黃色葡萄球菌或痤瘡丙酸桿菌，實驗組C所測得的生長抑制率皆顯著高於實驗組M所具者。至於比較實驗組所測得的生長抑制率則與正常對照組沒有顯著差異。
這些實驗結果顯示：膠原蛋白本身沒有抗菌活性，但當將嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌株共培養於膠原蛋白溶液中之後卻能顯著提升益生菌液態培養物的抗菌效用。 實施例 5. 本發明的益生菌液態培養物在改善皮膚病況 (improving skin condition) 上的效用評估 實驗個體：
參與本試驗的實驗個體是藉由使用一由安泰醫療社團法人安泰醫院的倫理委員會(ethics committee of the Antai Medical Care Corporation Antai Tian-Sheng Memorial Hospital)所認可的操作程序而被募集。在向所有參與試驗的受試者進行完整的實驗說明之後，有取得他們的告知同意書(informed consent)。本試驗共計有20位年齡介於18歲至50歲的受試者，其中包括8位男性與12位女性。 實驗材料： 1.  製備含有益生菌液態培養物的凝膠：
首先，將在上面實施例1中所得到的益生菌液態培養物C2拿來配製成1種可施用於人類皮膚上的凝膠(下面簡稱為液態培養物凝膠)。另外，為供比較，1種不含有益生菌液態培養物的凝膠(下面簡稱為對照凝膠)被製備。有關這2種凝膠的配方被顯示於下面表3中。 表3   凝膠的配方
組分 含量(%)(w/w)
液態培養物凝膠 對照 凝膠
益生菌液態培養物C2 5 －
卡波姆(carbomer) 0.3 0.3
丙烯醯二甲基牛磺酸銨/VP共聚物 (ammonium acryloyldimethyltaurate/VP copolymer) 0.7 0.7
透明質酸鈉(sodium hyaluronate) 0.01 0.01
水 93.99 98.99
有關液態培養物凝膠的製備是依照下面步驟來進行：首先，將卡波姆、丙烯醯二甲基牛磺酸銨/VP共聚物以及透明質酸鈉之粉末加入水中以進行溶脹作用(swelling)，繼而置於攪拌機中予以充分攪拌直到呈現膠狀，接著，加入益生菌液態培養物C2，並以氫氧化鈉水溶液來調整pH值至5.0-5.5。另外，對照凝膠大體上是依照上述步驟而被製得，不同之處在於：沒有添加益生菌液態培養物C2。 實驗方法： A、 凝膠的施用：
首先，以各個受試者的右臉皮膚作為實驗區(experimental area)，而左臉皮膚作為對照區(control area)，接著，各個受試者的實驗區與對照區分別被施用以依據上面“實驗材料”的第1項所得到的液態培養物凝膠與對照凝膠。實驗區與對照區的施用劑量皆為：每1平方公分的面積施用以3-5 mg的凝膠，每天2次，試驗期間總共歷時28天。
在施用凝膠之前(亦即第0天)以及在施用凝膠之後的第14天與第28天之時，從20位受試者中挑選出在左右臉上具有相似痤瘡(acne)症狀的10位受試者並依據下面第B項當中所述的方法來對各個受試者之實驗區與對照區的皮膚進行痤瘡的觀察。另外，在施用凝膠之前(亦即第0天)以及在施用凝膠之後的第28天之時，依據下面第C與D項當中所述的方法來對各個受試者之實驗區與對照區的皮膚進行皮膚發炎指數(skin inflammation index)與皮膚褐斑(skin brown spot)數目的測定。 B、 痤瘡的觀察：
各個受試者的實驗區與對照區的皮膚是藉由使用一智能皮膚分析系統(intelligent skin analysis system)(型號為ES3100，購自於伊麗美科技有限公司)來對皮膚的痤瘡部位進行觀察與拍照。 C、 皮膚發炎指數的測定：
各個受試者的實驗區與對照區的皮膚是藉由使用一VISIA™皮膚分析儀(VISIA™ Complexion Analysis, U.S.A)來進行皮膚發炎指數的測定。
皮膚發炎指數的相對量(%)是藉由將各區在施用凝膠之前(亦即第0天)以及在施用凝膠之後的第28天所計算出之皮膚發紅處數目代入下列公式(4)而被計算出： 公式 (4) ： J=(K/L)×100其中：J=皮膚發炎指數的相對量(%) K=各區在施用凝膠之後的第28天所測得的皮膚發紅處數目 L=各區在施用凝膠之前所測得的皮膚發紅處數目
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 D、 皮膚褐斑數目的測定：
各個受試者的實驗區與對照區的皮膚是藉由使用一VISIA™皮膚分析儀(VISIA™ Complexion Analysis, U.S.A)來進行皮膚褐斑數目的測定。
皮膚褐斑的相對量(%)是藉由將各區在施用凝膠之前(亦即第0天)以及在施用凝膠之後的第28天所計算出的皮膚褐斑數目代入下列公式(5)而被計算出： 公式 (5) ： M=(N/O) ×100其中：M=皮膚褐斑的相對量(%) N=各區在施用凝膠之後的第28天所測得的皮膚褐斑數目 O=各區在施用凝膠之前所測得的皮膚褐斑數目
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果： A、 痤瘡的觀察：
圖5顯示各區皮膚在施用液態培養物凝膠後痤瘡的型態隨著時間的變化。從圖5可見，在施用凝膠之後的第14天，實驗區之皮膚痤瘡部位的紅腫情形有明顯地改善，並在施用凝膠之後的第28天，該部位的紅腫情形已完全消除且幾乎沒有殘留疤痕，相對地，對照區之皮膚痤瘡部位的紅腫情形則沒有隨著時間而有顯著的變化。 B、 皮膚發炎指數的測定：
圖6顯示各區皮膚在施用液態培養物凝膠前後所測得之皮膚發炎指數的相對量。從圖6可見，在施用凝膠28天後，對照區所測得的皮膚發炎指數的相對量沒有顯著的變化，而實驗區所測得的皮膚發炎指數的相對量有顯著的降低，並且是顯著低於對照區所具者。 C、 皮膚褐斑數目的測定：
圖7顯示各區皮膚在施用液態培養物凝膠前後所測得之皮膚褐斑的相對量。從圖7可見，在施用凝膠28天後，實驗區所測得的皮膚褐斑的相對量有顯著的降低，相對地，對照區所測得的皮膚褐斑的相對量則沒有顯著的變化。
這些實驗結果顯示：將嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌株共培養於膠原蛋白溶液中所得到的益生菌液態培養物能夠有效地治療痤瘡、降低皮膚發炎反應並減少皮膚褐斑的形成。
綜合以上的實驗結果可知：本發明將菌數比為1：0.125：0.125至1：8：8的嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌株共培養於膠原蛋白溶液中所得到的益生菌液態培養物具有優異的抗菌效用(特別是抗皮膚病原菌)，並且能夠促進傷口癒合、抑制黑色素生成與改善各種皮膚病況。因此，申請人認為：依據本發明的益生菌液態培養物具有發展成為皮膚藥物與護膚產品的高潛力。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1顯示在下面實施例2中各組所測得的傷口癒合百分比(%)，其中“**”表示：當與對照組作比較， p＜0.01； 圖2顯示在下面實施例3中各組所測得的黑色素含量(%)，其中“***”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.001；以及“##”與“###”分別表示：當與病理對照組作比較， p＜0.01與 p＜0.001； 圖3顯示在下面實施例4中各組所測得之對於金黃色葡萄球菌的生長抑制率(%)，其中“**”與“***”分別表示：當與正常對照組作比較， p＜0.01與 p＜0.001； 圖4顯示在下面實施例4中各組所測得之對於痤瘡丙酸桿菌的生長抑制率(%)，其中“*”與“***”分別表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05與 p＜0.001； 圖5顯示在下面實施例5中實驗區與對照區的皮膚痤瘡的型態； 圖6顯示在下面實施例5中實驗區與對照區的皮膚所測得之皮膚發炎指數的相對量(%)，其中“***”表示：當與施用凝膠前(亦即第0天)作比較， p＜0.001；以及“##”表示：當與對照區作比較， p＜0.01；以及 圖7顯示在下面實施例5中實驗區與對照區的皮膚所測得之皮膚褐斑的相對量(%)，其中“***”表示：當與施用凝膠前(亦即第0天)作比較， p＜0.001。

Claims (10)

  1. 一種益生菌液態培養物，其是藉由下列方法而被製得：將一包含有菌數比為1：0.125：0.125至1：8：8的嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)、唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp . salicinius) AP-32 (BCRC 910437)以及動物雙歧桿菌乳亞種( Bifidobacterium animalissubsp . lactis) CP-9 (BCRC 910645)的益生菌組成物共培養於一膠原蛋白溶液中。
  2. 如請求項1的益生菌液態培養物，其中在該益生菌組成物中，嗜酸乳酸桿菌TYCA06、唾液乳酸桿菌AP-32以及動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌數比為1：1：1。
  3. 如請求項1的益生菌液態培養物，其實質上不含有菌體。
  4. 一種如請求項1至3中任一項的益生菌液態培養物供應用於製備一用來改善皮膚病況之組成物的用途。
  5. 如請求項4的用途，其中，該皮膚病況包括下列至少一者：傷口、黑色素生成、痤瘡、皮膚發炎、皮膚褐斑，以及皮膚病原菌感染。
  6. 一種如請求項1至3中任一項的益生菌液態培養物供應用於製備一用來抑制病原菌感染之組成物的用途。
  7. 如請求項6的用途，其中該病原菌感染是由一選自於由下列所構成之群組中的病原菌所造成：金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes)、大腸桿菌( Escherichia coli)、陰道加德納菌( Gardnerella vaginalis)、絮狀表皮癬菌( Epidermophyton floccosum)、紅色髮癬菌( Trichophyton rubrum)，以及它們的組合。
  8. 如請求項4至7中任一項的用途，其中該組成物是一藥學組成物。
  9. 如請求項8的用途，其中該藥學組成物是呈一供口服投藥的劑型。
  10. 如請求項4至7中任一項的用途，其中該組成物是一藥妝品組成物。
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