CN116724108A - 用于使用多能干细胞来源的皮肤类器官构建特应性皮炎模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于从人多能干细胞构建特应性皮炎皮肤类器官的方法。观察到本发明的ALI皮肤类器官形成了与真实皮肤中的那些类似结构的皮肤细胞、附属物、神经细胞、脂肪细胞等，并表现出与通过常规培养方法构建的皮肤类器官相比极大改善的毛囊生长。此外，由于用金黄色葡萄球菌处理以构建特应性皮炎模型，对特应性皮炎的特征进行了良好模拟，例如皮肤屏障受损、上皮来源细胞因子增加、表皮干细胞表达下调、引起金黄色葡萄球菌菌落等。因此，预期本发明的皮肤类器官可有利地用作真实皮肤模型和特应性皮炎模型。

Description

用于使用多能干细胞来源的皮肤类器官构建特应性皮炎模型 的方法

技术领域

本发明涉及用于使用人多能干细胞来源的皮肤类器官构建特应性皮炎模型的方法等。

本申请要求分别于2020年10月21日和2021年10月20日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2020-0136977和10-2021-0140422的优先权和权益，这些申请的说明书和附图中公开的全部内容被并入本申请。

背景技术

人皮肤具有维持体液、调节体温和抵御外界压力或外界有害细菌的功能，并且在介导触觉和疼痛中起着重要作用。皮肤由表皮层、真皮层和皮下层构成，并且在皮肤中存在附属物(如毛囊和皮脂腺)以及神经细胞。特别是，表皮层和真皮层之间的相互作用对于皮肤的发育及其附属物的形成非常重要。

目前，大多数关于人皮肤发育和疾病的研究都是使用动物实验和离体人造皮肤模型进行的。然而，动物实验模型在遗传/生物学特性方面与人体不同，而常用于毒性和药物筛选的人造皮肤模型仅包括基础表皮和真皮，其不产生真实皮肤中存在的附属物如汗腺、毛囊和黑素细胞。因此，越来越需要开发一种能够模拟体内皮肤组织的复杂性和功能的更接近真实皮肤的皮肤模型。

最近，开发了一种利用人多能干细胞培养能够模拟活体器官中的组织和功能的3D类器官的方法，该3D类器官是一种能够重现真实器官的组织或器官的形态和功能的经培养的胚状体，也称为器官模拟物或假器官。最近，已经开发了用于培养类似于真实皮肤的皮肤类器官的方法，该皮肤类器官具有各种人皮肤细胞、神经细胞和脂肪细胞并具有形成在其中的附属物等。然而，由于通过现有研究的皮肤类器官培养方法(参见非专利文献1)形成的类器官显示出与真实皮肤不同的三维环状结构，因此难以将该类器官用作药物毒性功效实验、皮肤移植和特应性皮肤疾病的模型。

同时，特应性皮炎是一种慢性/难治性/炎症性皮肤疾病，表现出伴有红斑、瘙痒、皮疹和皮肤角质的干燥皮肤病变症状。特应性皮炎影响全世界发达国家中15％至30％的儿童和2％至10％的成年人，并且目前，韩国10％的人口和20％的儿童也患有特应性皮炎。根据健康保险审查评估院(Health Insurance Review&Assessment Service)的统计数据，韩国每年到医院就诊的特应性疾病患者人数接近100万，并且根据患病率估计的患者人数为约200万。已知目前确定的疾病原因是由诸如丝聚蛋白基因突变、免疫因素和皮肤屏障损伤的复杂相互作用引起的。此外，最近的研究已经表明，皮肤上金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)定植的增加和细菌多样性的减少(生态失调)是特应性皮炎的潜在原因。然而，确切的疾病机制和合适的治疗药物尚未阐明。此外，特应性皮炎的疾病机制和药物筛选研究目前主要基于利用现有细胞系、体外人造皮肤模型和动物模型进行二维培养方法的研究。

因此，需要开发一种具有更接近真实皮肤的结构并且能够模拟体内皮肤组织的复杂性和功能的改进的皮肤类器官模型。

[非专利文献]

(非专利文献1)The latest research and development trend of 3D skinmodel,SungJae Jang,BRIC View 2019-T21

发明内容

[技术问题]

因此，本发明人通过应用气液界面培养方法从人多能干细胞构建了三维气液界面(ALI)类器官模型(ALI-皮肤类器官)，以便有效地构建类似于真实人皮肤的三维分层皮肤类器官，并开发了一种特应性皮炎类器官模型，该模型使得能够通过用金黄色葡萄球菌接种ALI-皮肤类器官来研究特应性皮肤疾病的机制和疾病因子，并使得能够通过药物筛选研究疾病治疗药物的效果。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于从人多能干细胞构建皮肤类器官的方法，包括以下步骤：

(a)在Wnt激动剂的存在下培养多能干细胞来源的类器官；

(b)将步骤(a)的培养产物在用于皮肤类器官成熟的培养基中培养40天或更久；和

(c)切割步骤(b)的培养产物并且在气液界面培养经切割的培养产物。

本发明的另一目的是提供一种用于构建皮肤类器官的方法，该方法包括用金黄色葡萄球菌处理通过上述方法构建的皮肤类器官，其中该皮肤类器官为特应性皮炎的皮肤模拟模型。

本发明的又一目的是提供一种通过该方法构建的皮肤类器官，其中该皮肤类器官为特应性皮炎的皮肤模拟模型。

本发明的又一目的是提供一种用于特应性皮炎治疗剂的筛选方法，该方法包括用特应性皮炎治疗剂的候选材料处理该皮肤类器官。

然而，本发明所要解决的技术问题并不局限于上述问题，本领域技术人员从以下描述中可以清楚地理解未提及的其它问题。

[技术方案]

因此，为实现本发明的上述目的，

本发明提供了一种用于从人多能干细胞构建皮肤类器官的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在Wnt激动剂的存在下培养多能干细胞来源的类器官；

(b)将步骤(a)的培养产物在用于皮肤类器官成熟的培养基中培养40天或更久；和

(c)切割步骤(b)的培养产物并且在气液界面培养经切割的培养产物。

在本发明的一个示例性实施方案中，Wnt激动剂可以为CHIR-99021，但不限于此。

在本发明的另一个示例性实施方案中，可以在培养多能干细胞的第5至7天添加Wnt激动剂，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，用于皮肤类器官成熟的培养基可以包含一种或多种选自由以下组成的组的组分：GlutaMax^TM、2-巯基乙醇、B-27、N2和normocin，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，该方法在进行步骤(a)之前可以包括以下步骤，但不限于此：

(1)培养多能干细胞的胚状体；

(2)诱导胚状体分化为非神经外胚层；和

(3)诱导非神经外胚层分化为颅神经嵴样细胞。

在本发明的又一示例性实施方案中，步骤(1)可以在Y-27632的存在下进行，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，步骤(2)可以在SB431542、FGF2和BMP4的存在下进行，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，步骤(3)可以在FGF2和LDN193189的存在下进行，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，步骤(a)的培养可以进行5至14天，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，步骤(b)的培养可以进行40至100天，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，步骤(c)的培养可进行3至4周，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，该方法可以进一步包括(d)将步骤(c)的培养产物在干燥条件培养1至10天，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，步骤(d)可以用于皮肤类器官的角质层成熟，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，在步骤(c)中，可以将步骤(b)的培养产物切割成四个均匀尺寸并且可以培养步骤(b)的经切割的培养产物，使得胶原蛋白包被的transwell培养插入物上的真皮层和表皮层分别暴露于胶原蛋白侧和空气，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，步骤(c)的气液界面培养可以在用于皮肤类器官成熟的培养基中进行，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，皮肤类器官可以具有抑制的软骨形成，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，皮肤类器官的直径可以为2至20mm，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，皮肤类器官可以具有位于表皮层下方的真皮层和皮下脂肪层，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，皮肤类器官可以表达选自由以下组成的组的一种或多种：角蛋白5(KRT5、CK5)、KRT10、KRT15、KRT17、兜甲蛋白、丝聚蛋白、SRY-Box转录因子2(SOX2)和melan-A，但不限于此。

在本发明的又一示例性实施方案中，多能干细胞可以是胚胎干细胞或诱导多能干细胞，但不限于此。

此外，本发明提供了一种用于构建皮肤类器官的方法，该方法包括用金黄色葡萄球菌处理通过上述方法构建的皮肤类器官，其中该皮肤类器官为特应性皮炎的皮肤模拟模型。

此外，本发明还提供了一种通过该方法构建的皮肤类器官，其中该皮肤类器官为特应性皮炎的皮肤模拟模型。

在本发明的一个示例性实施方案中，皮肤类器官可以具有选自由以下特征组成的组的一种或多种特征，但不限于此：

皮肤真皮层中的细胞死亡增加；

选自由以下组成的组的一种或多种的表达下调：KRT5、KRT10、丝聚蛋白、兜甲蛋白和密封蛋白4，它们是皮肤表皮屏障相关标志物；

角质形成细胞分化基因KRT或KRTAP的表达降低；

选自由以下组成的组的一种或多种的表达增加：β-防御素、肽聚糖识别蛋白2(PGLYRP2)、toll样受体1(TLR1)、TLR2、半乳糖凝集素9(LGALS9)、脂质运载蛋白2(LCN2)和S100钙结合蛋白(S100A)，它们是抗菌肽基因；

选自由以下组成的组的一种或多种的表达增加：CXC基序趋化因子配体(CXCL)、C-C基序趋化因子配体(CCL)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)，它们是表皮或真皮细胞来源的炎性细胞因子基因；

表皮干细胞标志物KRT15的表达下调；和

金黄色葡萄球菌的定植。

此外，本发明提供了一种用于特应性皮炎治疗剂的筛选方法，该方法包括用特应性皮炎治疗剂的候选材料处理皮肤类器官。

此外，本发明提供了皮肤类器官用于筛选特应性皮炎治疗剂的用途。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，包含痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)或其培养液作为活性成分。

在本发明的一个示例性实施方案中，组合物可以增加丝聚蛋白的表达，但不限于此。

此外，本发明提供了一种用于预防或改善特应性皮炎的食品组合物，包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗特应性皮炎的方法，该方法包括将包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分的药物组合物施用于有需要的受试者。

此外，本发明提供了包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分的药物组合物用于预防或治疗特应性皮炎的用途。

此外，本发明提供了痤疮丙酸杆菌或其培养液用于生产用于预防或治疗特应性皮炎的药物的用途。

[有益效果]

本发明人确认，在第6天用Wnt激动剂处理不仅显著增加了类器官的尺寸，而且抑制了软骨的形成，软骨是皮肤类器官的不需要的组分。观察到本发明的ALI-皮肤类器官形成了与真实皮肤中的那些类似结构的皮肤细胞、附属物、神经细胞、脂肪细胞等，并表现出与通过现有培养方法构建的皮肤类器官相比极大改善的毛囊生长，并确认形成了与真实皮肤中的那些类似结构的类器官。此外，由于用金黄色葡萄球菌处理以构建特应性皮炎模型，产生了对特应性皮炎特征的良好模拟，例如皮肤屏障受损、上皮来源的细胞因子增加、皮肤屏障功能相关基因表达下调、角质形成细胞分化相关基因表达下调、抗菌肽基因表达增加、表皮和真皮细胞来源的细胞因子基因表达增加、表皮干细胞表达下调、引起金黄色葡萄球菌定植等。因此，预期本发明的皮肤类器官可有利地用作真实皮肤模型和特应性皮炎模型。

此外，使用本发明的特应性皮炎模型，确认了痤疮丙酸杆菌，作为微生物组治疗剂的有益人类共生菌，减少了由于金黄色葡萄球菌感染引起的皮肤屏障破坏，并提供了一种防止金黄色葡萄球菌定植的保护机制。因此，预期痤疮丙酸杆菌可通过对金黄色葡萄球菌介导的皮肤屏障破坏和细胞损伤的显著预防和治疗作用而有效地用于治疗特应性皮炎。

附图说明

图1示出了基于现有方法使用人诱导多能干细胞系形成皮肤类器官的时间线(第63天至第138天)和每个阶段的照片。比例尺＝500μm。

图2是第140天的使用现有方法构建的皮肤类器官的一组皮肤类器官照片，确认了包括色素毛囊(上图)和白化毛囊(下图)的方面。比例尺＝500μm。

图3A至3C示出了使用现有方法构建的皮肤类器官的分化标志物荧光染色的照片。图3A是第22天皮肤类器官的表皮祖细胞标志物(TFAP+KRT5+)的染色照片(左)和真皮祖细胞(TFAP+PDGFRα+)的染色照片(右)。图3B是第67天(左)和第83天(右)的皮肤毛囊真皮乳头细胞表达标志物(Sox2)的染色照片，并且图3C示出了透明软骨软骨细胞分化标志物(S100α；左和Coll2A1；右)的染色照片。比例尺＝50μm。

图4示出了使用现有方法构建的皮肤类器官中表皮层形成的时间线。图4示出了KRT5和KRT14(基底膜标志物)、KRT10(棘层标志物)、兜甲蛋白和丝聚蛋白(角质层标志物)的免疫组织化学分析结果。比例尺＝50μm。

图5示出了通过添加Wnt信号传导通路激活(0.5至8μM Wnt激动剂(CHIR-99021))的本发明从人多能干细胞培养三维ALI-皮肤类器官的方法。

图6显示了基于第6、14、25、49和85天的皮肤类器官图像量化皮肤类器官的直径(mm)的结果。CHIR(-)：未添加CHIR-99021，CHIR(+)：添加CHIR-99021。平均值±SEM；n＝9；***表示P<0.0005。

图7示出了第14、25、38、65或85天的诱导多能干细胞来源的皮肤类器官的照片。CHIR(-)：未添加CHIR-99021，CHIR(+)：添加CHIR-99021。第38、65和85天的CHIR(-)皮肤类器官照片中的红色圆圈表示软骨结构。比例尺＝1mm。

图8是通过实时PCR分析第69天的诱导多能干细胞来源的皮肤类器官中的软骨表达标志物COL2A1、ACAN和SOX9的基因表达水平的一组结果。CHIR(-)：未添加CHIR-99021，CHIR(+)：添加CHIR-99021。n＝3；***表示P<0.0005。

图9示出了用于从人诱导多能干细胞构建三维气液界面-皮肤类器官模型(ALI-皮肤类器官)的方法，其中应用了气液界面(ALI)培养方法。

图10A和10B示出了ALI-皮肤类器官与根据现有方案培养的皮肤类器官(全皮肤类器官)的比较结果。图10A示出了在第138天比较ALI-器官皮肤和现有器官皮肤的代表性照片，而图10B示出了苏木精和伊红(H&E)组织染色的结果。比例尺＝500μm。

图11示出了用油红O对ALI-皮肤类器官的皮下脂肪和在毛囊周围发育的皮脂腺进行染色的结果。x100(左)和x200(右)。

图12示出了在总共第119天(皮肤类器官培养68天+ALI培养51天)的ALI-皮肤类器官中毛囊的H&E染色的照片(x200)。

图13A是在总共第114天的ALI-皮肤类器官的照片，其中皮肤类器官培养85天，在100％湿度条件ALI培养3周，然后在干燥条件ALI培养0天、2天、4天或6天以使皮肤角质形成细胞成熟。比例尺＝500μm。

图13B示出了在总共第114天的ALI-皮肤类器官的苏木精和伊红(H&E)组织染色结果。皮肤类器官培养85天，在100％湿度条件ALI培养3周，然后在干燥条件ALI培养0天、2天、4天或6天以使皮肤角质形成细胞成熟。比例尺＝500μm。

图14示出了ALI-皮肤类器官的皮肤表皮层结构相关标志物的荧光染色照片。(A)是ALI-皮肤类器官基底膜标志物(KRT5)和棘层标志物(KRT10)的染色照片，(B)是ALI-皮肤类器官角质层标志物(兜甲蛋白)的染色照片，并且(C)是ALI-皮肤类器官角质层标志物(丝聚蛋白)的染色照片。比例尺＝50μm。

图15示出了ALI-皮肤类器官毛囊结构相关标志物的荧光染色照片。(A)是ALI-皮肤类器官表皮细胞标志物(E-钙粘蛋白)和真皮细胞标志物(PDGGR)的染色照片，(B)是ALI-皮肤类器官毛发隆起区域标志物(KRT15)的染色照片，(C)是ALI-皮肤类器官表皮层黑素细胞标志物(melan-A)的染色照片，(D)是ALI-皮肤类器官毛囊真皮乳头细胞标志物(Sox2)和Merkel细胞标志物(Sox2)的染色照片，(E)是ALI-皮肤类器官毛囊黑素细胞标志物(melan-A)的染色照片，并且(F)是ALI-皮肤类器官外根鞘标志物(KRT17)的染色照片。比例尺＝50μm。

图16示出了皮肤类器官的皮肤表皮层结构相关标志物的荧光染色照片，其中皮肤类器官培养85天，在100％湿度条件ALI培养3周，然后在干燥条件ALI培养0天、2天、4天或6天以使皮肤角质形成细胞成熟。‘a’是ALI-皮肤类器官基底膜标志物(KRT5)和角质层标志物(丝聚蛋白)的一组染色照片，‘b’是ALI-皮肤类器官角质层标志物(兜甲蛋白)和棘层标志物(KRT10)的一组照片。比例尺＝50μm。

图17示出了皮肤类器官的皮肤真皮层结构相关标志物的荧光染色照片，其中皮肤类器官培养85天，在100％湿度条件ALI培养3周，然后在干燥条件ALI培养0天、2天、4天或6天以使皮肤角质形成细胞成熟。该照片是ALI-皮肤类器官基底膜标志物(KRT5；红色)、真皮层标志物胶原蛋白3(COL3；绿色；左)和波形蛋白标志物(VIM；绿色；右)的染色照片。比例尺＝50μm。

图18示出了培养85天、在100％湿度条件ALI培养并且在干燥条件ALI培养0天、2天、4天或6天以使皮肤角质形成细胞成熟的皮肤类器官的毛囊周围发育的皮下脂肪(Lipidtox；红色；左)和皮脂腺(Lipid tox；红色；右)的染色结果。比例尺＝50μm。

图19示出了通过用金黄色葡萄球菌接种并感染ALI-皮肤类器官的表面对特应性皮炎进行建模的照片。具体来说，图19示出了在将金黄色葡萄球菌(ATCC 29213；0CFU(仅PBS)、1x10⁵ CFU、1x10⁶ CFU或1x10⁷ CFU)接种到ALI-皮肤类器官表面之后24小时，(顶部)ALI-皮肤类器官H&E染色照片和(底部)金黄色葡萄球菌(绿色)和基底上皮层标志物(KRT5，红色)的染色照片。比例尺＝50μm。

图20示出了通过用金黄色葡萄球菌感染ALI-皮肤类器官对特应性皮炎进行建模，并且示出了在将金黄色葡萄球菌接种到ALI-皮肤类器官表面之后24小时，(顶部)细胞增殖标志物(Ki67；绿色)和基底上皮层标志物(KRT5；红色)的染色照片和(底部)细胞死亡标志物(TUNEL，红色)和基底上皮层标志物(KRT5；绿色)的染色照片。比例尺＝50μm。

图21示出了通过用金黄色葡萄球菌感染ALI-皮肤类器官对特应性皮炎进行建模，并且示出了在将金黄色葡萄球菌接种到ALI-皮肤类器官表面之后24小时，(顶部)角质层标志物(丝聚蛋白；绿色)和基底上皮层标志物(KRT5；红色)的染色照片，(中间)角质层标志物(兜甲蛋白；绿色)和基底上皮层标志物(KRT14；红色)的染色照片，以及(底部)棘层标志物(KRT10；绿色)和基底上皮层标志物(KRT5；红色)的染色照片。比例尺＝50μm。

图22示出了通过用金黄色葡萄球菌感染ALI-皮肤类器官对特应性皮炎进行建模，并且示出了在将金黄色葡萄球菌接种到ALI-皮肤类器官表面之后24小时，通过荧光染色确认皮肤上皮细胞细胞因子表达的结果。图22示出了金黄色葡萄球菌感染的ALI-皮肤类器官上皮细胞细胞因子(TSLP；绿色)和基底上皮层(KRT14；红色)标志物的染色照片。比例尺＝50μm。

图23示出了通过用金黄色葡萄球菌感染ALI-皮肤类器官对特应性皮炎进行建模，并且示出了在将金黄色葡萄球菌接种到ALI-皮肤类器官表面之后24小时，通过荧光染色确认皮肤上皮干细胞表达减少的结果。图23示出了(顶部)金黄色葡萄球菌感染的ALI-皮肤类器官表皮干细胞(KRT15；绿色)和基底上皮层(KRT5；红色)标志物以及(底部)表皮干细胞标志物(p63；绿色)和基底上皮层标志物(KRT5；红色)的染色照片。比例尺＝50μm。

图24示出了通过用金黄色葡萄球菌感染ALI-皮肤类器官对特应性皮炎进行建模，并且示出了在将金黄色葡萄球菌接种到ALI-皮肤类器官表面之后24小时，通过荧光染色确认皮肤上皮细胞细胞因子表达的结果。图24示出了作为紧密连接蛋白标志物的聚集蛋白(密封蛋白4(CLDN4)；绿色)和基底上皮层标志物(KRT5；红色)的染色照片。比例尺＝50μm。

图25A至25F示出了通过用金黄色葡萄球菌感染ALI-皮肤类器官对特应性皮炎进行建模，并且示出了在将金黄色葡萄球菌接种到ALI表面之后18小时，通过RNA测序分析方法确认基因表达变化的结果。确认了在用金黄色葡萄球菌处理的ALI-皮肤类器官和未处理的对照之间的生物复制之间显示出许多基因表达的显著差异。

图25A示出了差异表达基因(DEG；深蓝色)的火山图表示。

图25B通过描绘差异表达基因的热图的可视化来示出。通过金黄色葡萄球菌的接种，在4255个差异表达基因(DEG)中，2162个基因高表达，2093个基因低表达(调整后的p值<0.05)。红色表示对照，并且蓝色表示用金黄色葡萄球菌处理的ALI-皮肤类器官。

图25C示出了通过RNA测序分析比较金黄色葡萄球菌感染的ALI-皮肤类器官和未处理的对照之间皮肤屏障功能相关基因的表达的结果。

图25D示出了通过RNA测序分析比较金黄色葡萄球菌感染的ALI-皮肤类器官和未处理的对照之间角质形成细胞分化相关基因的表达的结果。

图25E示出了通过RNA测序分析比较金黄色葡萄球菌感染的ALI-皮肤类器官和未处理的对照之间抗菌肽(AMP)相关基因的表达的结果。

图25F示出了通过RNA测序分析比较金黄色葡萄球菌感染的ALI-皮肤类器官和未处理的对照之间炎性细胞因子相关基因的表达的结果。

图26A示出了ALI-皮肤类器官培养方法以及痤疮丙酸杆菌预处理和金黄色葡萄球菌接种方法。

图26B示出了根据痤疮丙酸杆菌处理的丝聚蛋白(绿色)和KRT5(红色)的免疫组织化学染色分析结果。比例尺＝50μm。

具体实施方案

本发明提供了一种用于从人多能干细胞构建皮肤类器官的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在Wnt激动剂的存在下培养多能干细胞来源的类器官；

(b)将步骤(a)的培养产物在用于皮肤类器官成熟的培养基中培养40天或更久；和

(c)切割步骤(b)的培养产物并且在气液界面培养经切割的培养产物。

以下，对本发明进行详细描述。

如本文所用，术语“类器官”是指模拟组织或器官的表面外观或实际结构或功能的一种或多种细胞类型的三维集合。此外，类器官可以类似地再现人体的生理功能，并且通过从患者的组织构建器官模拟物，可以进行基于患者遗传信息的疾病建模、通过反复测试的药物筛选等。

如本文所用，“类器官培养”包括能够产生或维持类器官的所有行为。例如，细胞或从特定组织分离的细胞可以分化为具有特定功能的组织或器官细胞，和/或类器官可以存活、生长或增殖。

在本发明中，多能干细胞通常指能够分化成构成内胚层、中胚层和外胚层的几乎所有类型的细胞的干细胞。在本发明中，多能干细胞可以是胚胎干细胞或诱导多能干细胞，但不限于此。

如本文所用，术语“胚胎干细胞(ESC)”是指通过在受精卵即将植入母体子宫之前从处于囊胚期的胚胎中提取内细胞团并离体培养内细胞团而获得的细胞，其具有分化为动物所有细胞的多能性，优选为人源性人胚胎干细胞。

如本文所用，术语“诱导多能干细胞(iPSC，去分化干细胞)”是指通过在动物体细胞中使用去分化技术建立具有类似于胚胎干细胞的分化能力的未分化干细胞而产生的干细胞，其具有与ESC相当的分化能力。

如本文所用，术语“胚状体”是指在悬浮培养状态中产生的一群球形干细胞衍生细胞，并且在大多数分化诱导过程中用作前体，以通过具有潜在分化为内胚层、中胚层和外胚层的能力来确保组织特异性分化细胞。

在本发明中，Wnt激动剂可以为CHIR-99021，但不限于此。

在本发明中，可以在培养诱导多能干细胞的第5至7天添加Wnt激动剂，但不限于此。

在本发明中，用于皮肤类器官成熟的培养基可以包含一种或多种选自由以下组成的组的组分：GlutaMax^TM、2-巯基乙醇、B-27、N2和normocin，但不限于此。如本文所用，术语“用于皮肤类器官成熟的培养基”是指以皮肤类器官的形式培养多能干细胞或多能干细胞来源的类器官所需的培养基。在示例性实施方案中，用于皮肤类器官成熟的培养基包含在1:1比例的Advanced DMEM/F12和Neurobasal培养基中的1X GlutaMax^TM、0.5X B-27减去维生素1A、0.5X N2、补充剂、0.1mM 2-巯基乙醇和100μg/ml normocin。

在本发明中，用于皮肤类器官成熟的培养基可以是Advanced DMEM/F12和Neurobasal培养基的混合培养基，但不限于此。

在本发明中，气液界面培养(ALI培养)可以在部分敞开的培养容器或部分填充培养基的培养容器中培养细胞，但不限于此。气液界面培养可以将细胞或类器官的表面暴露于空气。

在本发明中，气液界面培养可以在胶原蛋白包被的板上进行，但不限于此。

在本发明中，该方法在进行步骤(a)之前可以包括以下步骤，但不限于此：

(1)培养多能干细胞的胚状体；

(2)诱导胚状体分化为非神经外胚层；和

(3)诱导非神经外胚层分化为颅神经嵴样细胞。

在本发明中，步骤(1)可以在Y-27632的存在下进行，但不限于此。

在本发明中，步骤(2)可以在SB431542、FGF2和BMP4的存在下进行，但不限于此。

在本发明中，步骤(3)可以在FGF2和LDN193189的存在下进行，但不限于此。

在本发明中，步骤(a)的培养可以进行5至14天，但不限于此。例如，步骤(a)的培养可以进行5天至13天、5天至12天、5天至11天、5天至9天、6天至13天、6天至12天、6天至11天、6天至10天、6天至9天、7天至13天、7天至12天、7天至11天、7天至10天、7天至9天、或约8天。

在本发明中，步骤(b)的培养可以进行40至100天，但不限于此。例如，步骤(b)的培养可以进行40天至95天、40天至90天、45天至95天、45天至90天、45天至80天、50天至80天、40天至75天、40天至70天、55天至75天、58天至75天、59天至74天、60天至72天、或61天至71天。

在本发明中，步骤(c)可以是切割步骤(b)的培养产物并且在气液界面培养步骤(b)的经切割的培养产物的步骤。在本发明的示例性实施方案中，在用剪刀将步骤(b)的培养产物切割成4等份后，将每个经切割的培养产物铺展在12孔插入物板中并且在100％湿度条件培养箱中通过ALI培养方法培养3-4周，然后在干燥条件(0％湿度条件培养箱)培养2-6天，以使分层的上皮层成熟。

在本发明中，步骤(c)可以是将步骤(b)的培养产物切割成四个均匀尺寸，和

培养步骤(b)的经切割的培养产物，使得胶原蛋白包被的transwell培养插入物上的真皮层和表皮层分别暴露于胶原侧和空气，但不限于此。

因此，在本发明中，该方法还可以包括(d)将步骤(c)的培养产物在干燥条件培养1至10天，但不限于此。步骤(d)可以进行1至10天、1至9天、1至8天、1至7天、1至6天、2至10天、2至9天、2至8天、2至7天、2至6天、3至10天、3至9天、3至8天、3至7天、3至6天、4至10天、4至9天、4至8天、4至7天、或4至6天，但不限于此。

步骤(d)可用于皮肤类器官的角质层成熟，但不限于此。

在本发明中，步骤(c)的培养可进行3周至4周，但不限于此。

在本发明中，步骤(c)的气液界面培养可在用于皮肤类器官成熟的培养基中进行，但不限于此。

考虑到组织的量和类型、所用培养基的类型、期望类器官的尺寸、量和特征等，可以调整本发明的培养持续时间。

在本发明中，皮肤类器官可以具有抑制的软骨形成，但不限于此。

在本发明中，皮肤类器官可以具有位于真皮层下方的皮下脂肪层，但不限于此。

在本发明中，皮肤类器官可以表达选自由以下组成的组的一种或多种：角蛋白5(KRT5)、KRT10、KRT15、KRT17、兜甲蛋白、丝聚蛋白、SRY-Box转录因子2(SOX2)、melan-A、胶原蛋白3(COL3)和波形蛋白(VMT)，但不限于此。

此外，本发明提供了一种用于构建皮肤类器官的方法，该方法包括用金黄色葡萄球菌处理通过上述方法构建的皮肤类器官，其中该皮肤类器官为特应性皮炎的皮肤模拟模型。

以下，将对本发明的该方法进行详细描述，省略了与上述用于构建皮肤类器官的方法重复的描述。

此外，本发明提供了一种通过该方法构建的皮肤类器官，其中该皮肤类器官为特应性皮炎的皮肤模拟模型。

在本说明书中，皮肤类器官的特征在于具有扁平形状而不是球形，但不限于此。

在本说明书中，皮肤类器官的直径可以为2至20mm，但不限于此。在本发明的示例性实施方案中，确认了本发明的皮肤类器官具有比通过现有培养方法培养的类器官更大的直径。

在本说明书中，特应性皮炎是一种慢性炎症性皮肤疾病，其中湿疹病变在特定区域反复发作，伴有剧烈瘙痒和整体皮肤干燥，具有遗传易感性，并且特征是过敏性进展(从湿疹进展到过敏性疾病，例如食物过敏、过敏性哮喘和过敏性鼻炎)。特应性皮炎的发病机制主要分为与皮肤屏障相关的发病机制和与异常免疫反应相关的发病机制，据报道约40％的特应性皮炎患者中出现丝聚蛋白基因突变，并且更常见于出现严重症状或持续到成年期时。引起特应性皮炎的机制是外部过敏原更容易地通过角质层并且使具有先天受损的皮肤屏障的人身体敏感。

在本发明中，皮肤类器官可以具有选自由以下特征组成的组的一种或多种特征，但不限于此：

皮肤真皮层中的细胞死亡增加；

选自由以下组成的组的一种或多种的表达下调：KRT5、KRT10、丝聚蛋白、兜甲蛋白和密封蛋白4，它们是皮肤表皮屏障相关标志物；

角质形成细胞分化基因KRT或KRTAP的表达降低；

选自由以下组成的组的一种或多种的表达增加：β-防御素、肽聚糖识别蛋白2(PGLYRP2)、toll样受体1(TLR1)、TLR2、半乳糖凝集素9(LGALS9)、脂质运载蛋白2(LCN2)和S100钙结合蛋白(S100A)，它们是抗菌肽基因；

选自由以下组成的组的一种或多种的表达增加：CXC基序趋化因子配体(CXCL)、C-C基序趋化因子配体(CCL)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)，它们是表皮或真皮细胞来源的炎性细胞因子基因；

表皮干细胞标志物KRT15的表达下调；和

金黄色葡萄球菌的定植。

在本说明书中，丝聚蛋白是在分化阶段由角质形成细胞表达的多种结构蛋白之一，参与确保从表皮的基底层向角质层的分化，并被用作皮肤保湿和皮肤膜功能的主要指标，因为它也可能构成天然保湿因子(NMF)的主要组分，而天然保湿因子对于保持皮肤组织中的水分至关重要。

在本说明书中，兜甲蛋白是在分化阶段由角质形成细胞表达的皮肤屏障蛋白之一。

在本说明书中，胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是一种与IL-7结构类似的细胞因子，表达于皮肤角质形成细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、肺成纤维细胞等中。TSLP激活树突状细胞以将辅助T细胞分化为Th2细胞，而Th2细胞的分化对于诱发特应性皮炎症状很重要。

如本文所用，金黄色葡萄球菌是指在特应性患者中增加并加剧特应性症状的致病菌。

在本说明书中，金黄色葡萄球菌可以以1×10¹至1×10²⁰CFU、1×10¹至1×10¹⁸CFU、1×10¹至1×10¹⁵CFU、1×10¹至1×10¹⁰CFU、1×10¹至1×10⁸CFU、1×10¹至1×10⁷CFU、1×10³至1×10²⁰CFU、1×10³至1×10¹⁸CFU、1×10³至1×10¹⁵CFU、1×10³至1×10¹¹CFU、1×10³至1×10⁹CFU、1×10³至1×10⁷CFU、1×10⁵至1×10²⁰CFU、1×10⁵至1×10¹⁵CFU、1×10⁵至1×10¹⁰CFU、或1×10⁵至1×10⁷CFU的浓度处理，但不限于此。

皮肤类器官可以在体内用于治疗受试者。本发明包括治疗受试者中的皮肤疾病的方法。如本发明中所公开的，该方法在一方面包括改善、治疗或缓解有此需要的受试者中的皮肤疾病的症状。该方法还包括施用有效治疗受试者的皮肤疾病的量的皮肤类器官。

治疗受试者的方法可以还包括皮肤类器官的施用或皮肤类器官的移植，并且在这种情况下，作为施用或移植的结果，受试者中的皮肤疾病的症状得到改善、治疗或缓解。改善、治疗或缓解可以是使用自然感官或人工装置可检测到的皮肤疾病或皮肤疾病的症状的任何变化。

可以使用本发明的方法治疗的皮肤疾病包括表现在皮肤上的疾病或病症，例如但不限于痤疮、特应性皮炎、皮肤疖、疔疮、荨麻疹、银屑病、脂溢性皮炎、接触性皮炎、皮肤变色、细菌性皮炎、真菌性皮炎、湿疹、水肿、幼儿急疹、毛囊炎、毛囊角化病、疣、光化性角化病、粟粒疹、干皮病、汗腺炎、瘢痕疙瘩疾病、过敏性皮炎、皮肤脓肿、神经性皮炎等。

本发明的皮肤类器官在药物组合物中的含量可以为1pg至30g w/v％，但不限于此。

本发明中的受试者不受限制，只要是任何脊椎动物即可，但可特别适用于人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴、猪、马、牛、绵羊、羚羊、狗和猫，并且可以优选是人。

在本发明中，“施用”是指通过任何合适的方法将本发明的药物组合物施用于患者，并且对于本发明组合物的施用途径，本发明组合物可以通过各种经口或肠胃外途径施用，只要本发明的组合物可以到达靶组织即可。

在本发明中，“预防”是指通过施用根据本发明的组合物而延缓皮肤疾病的所有作用，“治疗”是指通过施用根据本发明的药物组合物而改善或有益地改变皮肤疾病症状的所有作用，并且“改善”是指通过施用根据本发明的组合物降低与皮肤疾病相关的参数的所有作用，例如，通过施用根据本发明的组合物减轻症状的严重程度。

在本发明中，药物组合物可以还包含通常用于制备药物组合物的适当载体、适当辅料和适当稀释剂。

在本发明中，“载体”也称为载剂，是指有助于将蛋白质或肽添加到细胞或组织中的化合物，例如，二甲亚砜(DMSO)是常用的载体，其促进将许多有机物质引入生物体的细胞或组织中。

在本发明中，“稀释剂”被定义为在水中稀释的化合物，其不仅稳定感兴趣的蛋白质或肽的生物活性形式，而且还溶解蛋白质或肽。溶解在缓冲溶液中的盐在本领域中用作稀释剂。通常使用的缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水，因为其模拟人体体液的盐分条件。由于缓冲盐可以在以低浓度控制溶液的pH值，因此缓冲稀释剂很少会改变化合物的生物活性。如本文所用，可以向人类患者原样施用含壬二酸的化合物或作为与其它成分一起的药物组合物，如在联合疗法中，或与合适的载体和辅料混合。

另外，根据本发明的药物组合物可以通过常规方法分别配制成外用制剂的形式，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂，以及无菌注射溶液，并且可以包含在组合物中的载体、辅料和稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。在制备药物组合物时，使用稀释剂或辅料例如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂制备药物组合物。用于经口施用的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且固体制剂是通过将至少一种辅料例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等与该化合物混合而制备的。此外，除简单辅料外，还使用润滑剂如硬脂酸镁和滑石。用于口服施用的液体制剂对应于混悬剂、内服液、乳剂、糖浆剂等，并且液体制剂除了水和液体石蜡这些简单常用的稀释剂外，还可以包括各种辅料，例如，润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂的实例包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和混悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂酸脂、甘油明胶等。

本发明的药物组合物可以经口或肠胃外施用，优选肠胃外施用，并且在肠胃外施用的情况下，组合物可以通过肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射、局部施用、透皮施用等施用。

本发明的药物组合物的合适剂量可根据多种因素而变化，例如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别或疾病状况、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度和反应灵敏性。

本发明的药物组合物可以以单位剂量的形式制备，或者通过使用药学上可接受的载体和/或辅料根据本发明所属领域的普通技术人员可以容易地实施的方法配制而包含在大容量容器中来制备。在这种情况下，剂型也可以是在油性或水性介质中的溶液的形式、混悬剂或乳剂、提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式，并且本发明的药物组合物可以另外包含分散剂或稳定剂。

此外，本发明提供了一种用于特应性皮炎治疗剂的筛选方法，该方法包括用特应性皮炎治疗剂的候选材料处理皮肤类器官。

此外，本发明提供了皮肤类器官用于筛选特应性皮炎治疗剂的用途。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分。

在本发明中，组合物可以增加丝聚蛋白的表达，但不限于此。

此外，本发明提供了一种用于预防或改善特应性皮炎的食品组合物，包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗特应性皮炎的方法，该方法包括将包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分的药物组合物施用于有需要的受试者。

此外，本发明还提供了包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分的药物组合物用于预防或治疗特应性皮炎的用途。

此外，本发明提供了痤疮丙酸杆菌或其培养液用于生产用于预防或治疗特应性皮炎的药物的用途。

在本发明中，痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)是一种厌氧的革兰氏阳性菌，又名Propionibacterium acnes，对应于人皮肤和粘膜组织表面的正常菌群。Propionibacterium acnes是一种厌氧微生物，生长在毛囊内。

如本文所用，术语‘培养’是指以适当的人工控制的环境条件使微生物生长而进行的所有动作，并且本发明中是包括‘发酵’的概念。

‘痤疮丙酸杆菌’的细菌细胞不仅包括从培养基中获得的活细胞，还包括本领域技术人员已知的任何加工形式的乳酸菌，包括例如细菌裂解产物、干燥产物、冷冻产物等，但不限于此。此外，术语‘培养液’是包括‘发酵液’的含义，并且包括在液体培养基中培养的培养液本身，以及来自培养液的加工产物，例如通过过滤或离心上述培养液而除去菌株的滤液(经离心的上清液)。

本发明组合物中的痤疮丙酸杆菌或其培养液的含量可以根据疾病的症状、症状的进展程度、患者的状况等适当调整，并且可以为例如，0.0001至99.9重量％，或0.001至50重量％，但不限于此。含量比是基于除去溶剂的干燥量的值。

在本发明中，药物组合物的描述如上所述。

当本发明的痤疮丙酸杆菌或其培养液用作食品添加剂时，痤疮丙酸杆菌或其培养液可以原样添加或与其它食品或其它食品成分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。混合的活性成分的量可以根据使用目的(预防、健康或治疗)适当确定。通常，当制备食品或饮料时，本发明的痤疮丙酸杆菌或其培养液或其培养物可以基于原材料以15重量％或更少、或10重量％或更少的量添加。然而，在出于健康卫生目的或控制健康目的而长期服用时，量可低于上述范围，并且由于没有安全性问题，有效成分可以以超过上述范围的量使用。

食品的类型没有特别限制。可以向其添加该材料的食品的实例包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、坚果类、饼干类、披萨、方便面、其它面类、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料、维生素复合物等，包括典型意义上的所有健康功能食品。

根据本发明的健康饮料组合物可以含有各种香料或天然碳水化合物等作为如典型饮料中的附加成分。上述天然碳水化合物可以是单糖如葡萄糖和果糖，二糖如麦芽糖和蔗糖，多糖如糊精和环糊精，以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为甜味剂，可以使用天然甜味剂如奇异果甜蛋白和甜叶菊提取物、合成甜味剂如糖精和阿斯巴甜等。天然碳水化合物的比例通常为每100ml本发明的组合物约0.01至0.20g或约0.04至0.10g。

除上述成分外，本发明的组合物可以还包含各种营养素、维生素、电解质、香料、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。此外，本发明的组合物可以包含果肉以制备天然果汁、果汁饮料和植物饮料。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例不是很重要，但通常选择在每100重量份本发明的组合物中0.01至0.20重量份的范围内。

根据本发明的化妆品组合物的制剂可以是护肤乳液、皮肤柔软剂、爽肤水、收敛剂、乳液、乳乳液、保湿乳液、滋养乳液、按摩霜、滋养霜、喷雾、保湿霜、护手霜、护手乳液、粉底、精华液、滋养精华液、面膜、香皂、洁面泡沫、洁面乳液、洁面霜、洁面油、洁面膏、润肤露或身体清洁剂。

本发明的化妆品组合物可以进一步包括选自由以下组成的组的组合物：水溶性维生素、油溶性维生素、高分子肽、高分子多糖和鞘脂。

可以使用任何水溶性维生素，只要其可以掺入化妆品中即可，但是其实例包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、吡哆醇、盐酸吡哆醇、维生素B12、泛酸、烟酸、烟酰胺、叶酸、维生素C、维生素H等，并且它们的盐(盐酸硫胺素、抗坏血酸钠等)或它们的衍生物(抗坏血酸-2-磷酸钠盐、抗坏血酸-2-磷酸镁盐等)也包括在可用于本发明的水溶性维生素中。水溶性维生素可以通过诸如微生物转化方法、从微生物培养产物纯化、酶法或化学合成方法的常规方法获得。

可以使用任何油溶性维生素，只要其可以掺入化妆品中即可，但是其实例包括维生素A、胡萝卜素、维生素D2、维生素D3、维生素E(d1-α生育酚、d-α生育酚和d-α生育酚)等，并且它们的衍生物(抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸二棕榈酸酯、dl-α生育酚乙酸酯、dl-α生育酚维生素E乙酸酯、DL-泛醇、D-泛醇、泛酸醇乙基醚等)等也包括在本发明中使用的油溶性维生素中。油溶性维生素可以通过诸如微生物转化方法、从微生物培养产物纯化、酶法、化学合成方法的常规方法获得。

可以使用任何高分子肽，只要其可以与化妆品混合即可，但其实例包括胶原蛋白、水解胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、水解弹性蛋白、角蛋白等。高分子肽可以通过诸如从微生物的培养液中纯化、酶法或化学合成方法的常规方法纯化和获得，或通常可以从天然产物如猪、牛等的真皮和蚕的丝纤维中纯化并使用。

可以使用任何高分子多糖，只要其可以掺入化妆品中即可，但其实例包括羟乙基纤维素、黄原胶、透明质酸钠、硫酸软骨素、它们的盐(钠盐等)等。例如，通常可以从哺乳动物或鱼中纯化并使用硫酸软骨素、其盐等。

可以使用任何鞘脂，只要其可以掺入化妆品中即可，但其实例包括神经酰胺、植物鞘氨醇、糖鞘脂等。鞘脂通常可以通过常规方法从哺乳动物、鱼类、贝类、酵母、植物等中纯化，或可以通过化学合成方法获得。

如果需要，通常掺入化妆品中的其它成分也可以连同基本成分一起与本发明的化妆品组合物混合。

可以添加的其它混合成分的实例包括油脂成分、保湿剂、润肤剂、表面活性剂、有机和无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调节剂、醇、着色剂、香料、循环促进剂、清凉剂、止汗剂、纯净水等。

油脂成分的实例包括酯基油脂、烃基油脂、硅基油脂、氟基油脂、动物油脂、植物油脂等。

酯基油脂的实例包括诸如三2-乙基己酸甘油酯、2-乙基己酸鲸蜡醇酯、肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸丁酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸乙酯、棕榈酸辛酯、异硬脂酸异鲸蜡醇酯、硬脂酸丁酯、亚油酸乙酯、亚油酸异丙酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异鲸蜡醇酯、肉豆蔻酸异硬脂醇酯、棕榈酸异硬脂醇酯、肉豆蔻酸辛基十二醇酯、异硬脂酸异鲸蜡醇酯、癸二酸二乙酯、己二酸二异丙酯、新戊酸异烷基酯、三(辛酸、癸酸)甘油酯、三2-乙基己酸三羟甲基丙烷、三异硬脂酸三羟甲基丙烷、四-2-乙基己酸季戊四醇、辛酸鲸蜡醇酯、月桂酸癸酯、月桂酸己酯、肉豆蔻酸癸酯、肉豆蔻酸肉豆蔻醇酯、肉豆蔻酸鲸蜡醇酯、硬脂酸十八醇酯、油酸癸酯、蓖麻油酸鲸蜡醇酯、月桂酸异硬脂醇酯、肉豆蔻酸异十三醇酯、棕榈酸异鲸蜡醇酯、硬脂酸辛酯、硬脂酸异鲸蜡醇酯、油酸异癸酯、油酸辛基十二醇酯、亚油酸辛基十二醇酯、异硬脂酸异丙酯、2-乙基己酸十六十八醇酯、2-乙基己酸硬脂醇酯、异硬脂酸己酯、乙二醇二辛酸酯、乙二醇二油酸酯、丙二醇二辛酸酯、二(辛酸、癸酸)丙二醇、丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二癸酸酯、新戊二醇二辛酸酯、三辛酸甘油酯、三(十一酸)甘油酯、三异棕榈酸甘油酯、三异硬脂酸甘油酯、新戊酸辛基十二醇酯、辛酸异硬脂醇酯、异壬酸辛酯、新癸酸己基癸酯、新癸酸辛基十二醇酯、异硬脂酸异鲸蜡醇酯、异硬脂酸异硬脂醇酯、异硬脂酸辛基癸酯、油酸聚甘油酯、异硬脂酸聚甘油酯、柠檬酸异鲸蜡醇酯、柠檬酸三异烷基酯、柠檬酸三异辛酯、乳酸月桂醇酯、乳酸肉豆蔻醇酯、乳酸鲸蜡醇酯、乳酸辛基癸酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、柠檬酸乙酰基三丁酯、柠檬酸三辛酯、苹果酸二异硬脂醇酯、羟基硬脂酸2-乙基己酯、琥珀酸二2-乙基己酯、己二酸二异丁酯、癸二酸二异丙酯、癸二酸二辛酯、胆甾醇硬脂酸酯、胆甾醇异硬脂酸酯、胆甾醇羟基硬脂酸酯、胆甾醇油酸酯、二氢胆甾醇油酸酯、植物甾醇异硬脂酸酯、植物甾醇油酸酯、12-硬脂酰羟基硬脂酸异鲸蜡醇酯、12-硬脂酰羟基硬脂酸硬脂醇酯、12-硬脂酰羟基硬脂酸异硬脂醇酯等的酯基油脂。

烃基油脂的实例包括诸如角鲨烯、液体石蜡、α-烯烃低聚物、异链烷烃、丝胶、石蜡、液体异链烷烃、聚丁烯、微晶蜡和凡士林等的烃基油脂。

硅基油脂的实例包括聚甲基硅酮、甲基苯基硅酮、甲基环聚硅氧烷、八甲基聚硅氧烷、十甲基聚硅氧烷、十二甲基环硅氧烷、二甲基硅氧烷·甲基鲸蜡氧基硅氧烷共聚物、二甲基硅氧烷·甲基硬脂氧基硅氧烷共聚物、烷基改性硅油、氨基改性硅油等的硅基油脂。

氟基油脂的实例包括全氟聚醚等。

动物或植物油脂的实例包括诸如鳄梨油、扁桃油、橄榄油、芝麻油、米糠油、新花油、大豆油、玉米油、菜籽油、杏仁油、棕榈仁油、棕榈油、蓖麻油、葵花籽油、葡萄籽油、棉籽油、棕榈油、夏威夷核油、小麦胚芽油、米胚芽油、乳木果油、月见草油、澳洲坚果油、草甸家用油、蛋黄油、牛脂、马油、貂油、深海鱼油、荷荷巴油、小烛树蜡、巴西棕榈蜡、液体羊毛脂和硬化蓖麻油的动物或植物油脂。

保湿剂的实例包括水溶性低分子量保湿剂、脂溶性低分子量保湿剂、水溶性聚合物、脂溶性聚合物等。

水溶性低分子量保湿剂的实例包括丝氨酸、谷氨酰胺、山梨糖醇、甘露糖醇、吡咯烷酮-羧酸钠、甘油、丙二醇、1,3-丁二醇、乙二醇、聚乙二醇B(聚合度n＝2或更高)、聚丙二醇(聚合度n＝2或更高)、聚甘油B(聚合度n＝2或更高)、乳酸、乳酸盐等。

脂溶性低分子量保湿剂的实例包括胆甾醇、胆甾醇酯等。

水溶性聚合物的实例包括羧乙烯基聚合物、聚天冬氨酸、黄芪胶、黄原胶、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、水溶性几丁质、壳聚糖、糊精等。

脂溶性聚合物的实例包括聚乙烯吡咯烷酮·二十烯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮·十六烯共聚物、硝化纤维素、糊精脂肪酸酯、高分子量硅酮等。

润肤剂的实例包括长链酰基谷氨酸胆甾醇酯、胆甾醇羟基硬脂酸酯、12-羟基硬脂酸、硬脂酸、松香酸、羊毛脂脂肪酸胆甾醇酯等。

表面活性剂的实例包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂等。

非离子表面活性剂的实例包括自乳化甘油单硬脂酸酯、丙二醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯(POE)脱水山梨糖醇脂肪酸酯、POE山梨糖醇脂肪酸酯、POE甘油脂肪酸酯、POE烷基醚、POE脂肪酸酯、POE硬化蓖麻油、POE蓖麻油、聚氧乙烯·聚氧丙烯(POE·POP)共聚物、POE·POP烷基醚、聚醚改性硅酮、烷醇酰胺月桂酸酯、烷基胺氧化物、氢化大豆磷脂等。

阴离子表面活性剂的实例包括脂肪酸皂、α-酰基磺酸盐、烷基磺酸盐、烷基烯丙基磺酸盐、烷基萘磺酸盐、烷基硫酸盐、POE烷基醚硫酸盐、烷基酰胺硫酸盐、烷基磷酸盐、POE烷基磷酸盐、烷基酰胺磷酸盐、烷酰基烷基牛磺酸盐、N-酰基氨基酸盐、POE烷基醚羧酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、烷基磺基乙酸钠、酰化水解胶原蛋白肽盐、全氟烷基酯磷酸盐等。

阳离子表面活性剂的实例包括烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基溴化铵、十六十八烷基三甲基氯化铵、双十八烷基二甲基氯化铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、二十二烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、二乙基氨基乙基酰胺硬脂酸酯、二甲基氨基丙基酰胺硬脂酸酯、羊毛脂衍生物季铵盐等。

两性表面活性剂的实例包括以下类型的两性表面活性剂：羧基甜菜碱、酰胺甜菜碱、磺基甜菜碱、羟基磺基甜菜碱、酰胺磺基甜菜碱、磷酸甜菜碱、氨基羧酸盐、咪唑啉衍生物和酰胺胺。

有机和无机颜料的实例包括无机颜料，例如硅酸、无水硅酸、硅酸镁、滑石、绢云母、云母、高岭土、三氧化二铁、粘土、膨润土、钛包覆云母、氯氧化铋、氧化锆、氧化镁、氧化锌、氧化钛、氧化铝、硫酸钙、硫酸钡、硫酸镁、碳酸钙、碳酸镁、氧化铁、群青蓝、氧化铬、氢氧化铬、胭脂红及它们的复合物；有机颜料，例如聚酰胺、聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、乙烯基树脂、尿素树脂、酚醛树脂、氟树脂、硅酮树脂、丙烯酸树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、聚碳酸酯树脂、二乙烯基苯·苯乙烯共聚物、蚕丝粉、纤维素、CI颜料黄和CI颜料橙；这些无机颜料和有机颜料的复合颜料等。

有机粉末的实例包括金属皂，例如硬脂酸钙；烷基磷酸金属盐，例如十六烷基磷酸锌钠、月桂酰磷酸锌和月桂酰磷酸钙；酰基氨基酸多价金属盐，例如N-月桂酰-β-丙氨酸钙、N-月桂酰-β-丙氨酸锌和N-月桂酰甘氨酸钙；酰胺磺酸多价金属盐，例如N-月桂酰牛磺酸钙和N-棕榈酰牛磺酸钙；N-酰基碱性氨基酸，例如N-ε-月桂酰-L-赖氨酸、N-ε-棕榈酰赖氨酸、N-α-棕榈酰鸟氨酸、N-α-月桂酰精氨酸和N-α-硬化牛脂脂肪酸酰基精氨酸；N-酰基多肽，如N-月桂酰甘氨酰甘氨酸；α-氨基脂肪酸，例如α-氨基辛酸和α-氨基月桂酸；聚乙烯、聚丙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、二乙烯基苯·苯乙烯共聚物、四氟乙烯等。

紫外线吸收剂的实例包括对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酯、对氨基苯甲酸戊酯、对氨基苯甲酸辛酯、乙二醇水杨酸酯、水杨酸苯酯、水杨酸辛酯、水杨酸苄酯、水杨酸丁基苯基酯、水杨酸高孟酯、肉桂酸苄酯、对甲氧基肉桂酸2-乙氧基乙酯、对甲氧基肉桂酸辛酯、单(2-乙基己酸)二对甲氧基肉桂酸甘油酯、对甲氧基肉桂酸异丙酯、二异丙基·二异丙基肉桂酸酯混合物、尿刊酸、尿刊酸乙酯、羟基甲氧基二苯甲酮、羟基甲氧基二苯甲酮磺酸及它们的盐、二羟基甲氧基二苯甲酮、二羟基甲氧基二苯甲酮二磺酸钠、二羟基二苯甲酮、四羟基二苯甲酮、4-叔丁基-4'-甲氧基二苯甲酰甲烷、2,4,6-三苯胺基-p-(碳-2'-乙基己基-1'-氧基)-1,3,5-三嗪、2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑等。

杀菌剂的实例包括扁柏酚、三氯生、三氯羟基二苯醚、葡萄糖酸氯己定、苯氧乙醇、间苯二酚、异丙基甲基苯酚、薁、水杨酸、吡硫鎓锌、苯扎氯铵、光敏染料No.301、单硝基愈创木酚钠、十一碳烯酸等。

抗氧化剂的实例包括丁基羟基苯甲醚、没食子酸丙酯、异抗坏血酸等。

pH调节剂的实例包括柠檬酸、柠檬酸钠、苹果酸、苹果酸钠、富马酸、富马酸钠、琥珀酸、琥珀酸钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠等。

醇的实例包括高级醇如鲸蜡醇。

此外，除了上述成分之外还可以添加的混合成分不限于此，并且任何成分都可以在不损害本发明的目的和效果的范围内混合，但可以以基于总重量的0.01至5重量％或0.01至3重量％混合。

当本发明的制剂为洗剂、糊剂、霜剂或凝胶剂时，动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等可用作载体成分。

当本发明的制剂为散剂或喷雾剂时，乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末可用作载体成分，并且特别地当制剂为喷雾剂时，制剂可以包含抛射剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。

当本发明的制剂为溶液剂或乳剂时，溶剂、增溶剂或乳化剂用作载体成分，并且它们的实例包括水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、脂肪族甘油酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇脂肪酸酯。

当本发明的制剂为混悬剂时，液体稀释剂如水、乙醇或丙二醇，助悬剂如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄芪胶等可用作载体成分。

当本发明的制剂是含表面活性剂的清洁剂时，脂肪族醇硫酸盐、脂肪族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基氨基甜菜碱、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等可用作载体成分。

关于在本发明中使用的术语，考虑本发明中的功能选择当前广泛使用的通用术语，但是术语可以根据本领域技术人员的意图、先例、新技术的出现等而变化。此外，在特定情况下，也有申请人任意选择的术语，在这种情况下，其含义将在本发明具体实施方案的相应部分进行详细描述。因此，本发明所使用的术语不应仅仅定义为术语的简单名称，而应基于该术语的含义和本发明的总体内容来定义。

诸如第一和第二的术语可以用来描述各种组成元素，但是组成元素不受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个组成元素与另一个组成元素区分开来。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一组成元素可以被称为第二组成元素，类似地，第二组成元素可以被称为第一组成元素。该术语和/或包括多个相关列表项的组合，或多个相关列表项中的任意项。

在本发明的整个说明书中，当一个部分“包括(包含)”一个组成元素时，除非另有具体说明，这并不意味着排除另一组成元素，而是意味着还可以包括(包含)另一组成元素。在本发明的整个说明书中，程度术语如“约”或“基本上”等被用作表示相应的数值，或当自然制造和材料公差误差以描述的含义呈现时，用作接近数值的含义，并且用于防止无良侵权者非法使用包括为了帮助理解本发明而被说明为准确或绝对的数值的公开内容。

在本发明的整个说明书中，包括在马库什式表达式中的术语“其组合”是指选自由马库什式表达式中描述的组成元素组成的组的一种或多种的混合物或组合，并且意味着包括选自由上述组成元素组成的组的一种或多种。

在下文中，将建议有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例只是为了使本发明更容易理解，本发明的内容不受以下实施例的限制。

实施例

实施例1.通过现有方法构建三维皮肤类器官和构建的类器官的表征

实施例1-1.人诱导多能干细胞的培养

将源自健康受试者的诱导多能干细胞系(iPSC；CMC3)在补充有Y-27632(10μM)的Essential 8(Gibco)培养液中在没有支持细胞的情况下于包被有玻连蛋白(ThermoFisher)的培养皿中培养。每天更换培养液，使用ReLeSR^TM(Stem Cell Technology)以约5天为一个周期进行传代培养。

实施例1-2.用于利用人诱导多能干细胞系分化三维皮肤类器官的方法

基于公开了使用诱导多能干细胞系的现有皮肤类器官分化方案的文献(Lee,J.等人,Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stemcells.Nature 582,399-404(2020))培养皮肤类器官。将诱导多能干细胞集落使用ReLeSR^TM(Stem Cell Technology)分离成小细胞群，然后使用Accutase(ThermoFisher)分离成单细胞。对于胚状体形成，将1000个单细胞等分到U型底低附着96孔板(Corning)的每个孔中。使用补充有Y-27632(20μM)的Essential 8(Gibco)作为胚状体培养液。将单细胞培养2天，直至胚状体长至300至500μm的尺寸。在分化的第2天，将形成的胚状体转移到含有2％Matrigel(Matrigel；Corning)、10μM SB431542(Tocris)、4ng/ml FGF2(PeproTech)和15ng/ml BMP4(PeproTech)的培养液中用于非神经外胚层分化诱导。从第6天开始，将培养液中的200ng/ml FGF2和50μg/ml LDN193189(Tocris)添加到培养基中以诱导颅神经嵴细胞。此外，在第14天，将类器官转移到含有3ml用于皮肤类器官成熟的培养基的6孔板(低附着6孔板；Corning)中，并在轨道摇床(65rpm；Thermo Fisher)中培养皮肤类器官直至分析日。每3天更换培养基。用于皮肤类器官成熟的培养基包含在1:1比例的Advanced DMEM/F12和Neurobasal培养基中的1X GlutaMax^TM(Gibco)、0.5X B-27减去维生素1A(Gibco)、0.5XN2(Gibco)、补充剂、0.1mM 2-巯基乙醇(Gibco)和100μg/ml normocin(Invitrogen)。使用EVOS XL Core明场系统显微镜(Thermo Fisher)以x40放大倍数拍摄待分析的皮肤类器官。

结果，如图1所示，在第60天至第70天观察到毛囊。分层上皮存在于类器官的内层，并被外部真皮和皮下层包围。

此外，如图2所示，皮肤类器官在140天内生长到直径为5mm或更大，并包括各种色素(图2顶部)或白化毛囊(图2底部)。通过现有皮肤类器官分化方法(Lee等人,2020)构建的类器官具有圆形聚集体的形状，并具有由内而外(Inside-out)的形态。

实施例1-3.荧光免疫组织化学染色

在对通过现有培养方法(Lee的人,2020)分化的皮肤类器官进行冷冻切片后，通过荧光染色确认了皮肤标志物表达和分层结构。首先，将形成的皮肤类器官用4％ PFA固定，然后在30％蔗糖溶液中脱水。脱水完成后，将类器官在明胶/蔗糖溶液中冷冻，并通过使用低温恒温仪冷冻切片至约10至12μm的厚度来制备切片。将冷冻切片在封闭缓冲液中在室温封闭1时，封闭缓冲液由PBS中的5％正常氯血清、0.5％牛血清白蛋白、0.25％鱼明胶和0.3％TritonX-100组成。一抗在封闭缓冲液中稀释，并在4℃孵育过夜。然后将切片用PBS洗涤3次，并在室温与封闭缓冲液中的二抗共孵育1小时。将切片用PBS洗涤3次，并且将细胞核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。最后，将切片用PBS洗涤一次并用荧光封固介质(DAKO)封固。通过荧光染色分析确认通过现有方法培养的皮肤类器官的分化标志物，并通过冷冻切片染色法确认形成和结构。使用的一抗如下：抗KRT5(1:500；abcam；ab52635)、抗KRT10(1:100；Santa Cruz Biotechnology；sc-23877)、抗KRT17(1:100；Santa CruzBiotechnology；sc-393091)、抗丝聚蛋白(1:100；Santa Cruz Biotechnology；sc-66192)、抗波形蛋白(1:100；Santa Cruz Biotechnology；sc-6260)、抗COL3A胶原蛋白3(1:100；Santa Cruz Biotechnology；sc-27124)、抗兜甲蛋白(1:500；abcam；ab85679)、抗金黄色葡萄球菌(1:100；Santa Cruz Biotechnology；sc-58038)、抗PDGFRα(1:250；Cell SignalingTechnology；3164S)、抗Melan A(1:250；abcam；ab51061)、抗TSLP(1:250；abcam；ab47943)、抗Lipid Tox(1:200；Invitrogen；H34477)、抗密封蛋白4(1:200；Invitrogen；32-9400)、抗KRT15(1:200；Invitrogen MA5-11344)、抗p63(1:250；abcam；ab735)、抗TFAP(1:50；SantaCruz Biotechnology；sc-12726)、抗COL2A1(1:50；Millipore；ab261)、抗纤连蛋白(1:100；abcam；ab6328)、抗S100α(1:50；Santa Cruz Biotechnology；sc-53438)、抗E-钙粘蛋白(1:250；abcam；ab1416)。

如图3A所示，在通过现有方法分化的皮肤类器官中确认了表皮祖细胞(TFAP+KRT5+)和真皮祖细胞(TFAP+PDGFRα+)的形成和结构。

如图3B所示，在培养67天和87天的皮肤类器官毛囊中确认了Sox2+真皮乳头细胞的表达。第67天在分化的皮肤类器官中观察到透明软骨的分化。

此外，如图3C所示，发现S100α+软骨细胞和Coll2A1产生软骨。

接下来，通过冷冻切片染色法研究了通过现有方法培养的皮肤类器官中的分层表皮层形成和结构时间线。

如图4所示，在第33、46、67、87和140天的皮肤类器官中确认了成熟表皮蛋白的表达。可以看出，在培养33天的皮肤类器官中表达了KRT5+和KRT14+基底层，并且在约第46天，首次在表面上皮细胞中观察到表达KRT10的棘状角质形成细胞。在分化67天后，出现了分别表达兜甲蛋白和丝聚蛋白的角质化表皮层。

即，现有的皮肤类器官构建方法表现出以下分化表达特征。1)构建的类器官具有圆形聚集体的形状，并且具有由内而外的形态。分层的上皮存在于类器官的内层，并且被外部真皮和皮下层包围。2)在3D皮肤类器官的最内核观察到成熟的角化表皮层。3)确认了表皮和真皮层分化标志物，并且通过冷冻切片染色法确认了皮肤附属物如毛囊构成细胞和真皮乳头细胞以及透明软骨的形成和结构。4)上皮层角化的最终成熟在约第70天开始。

因此，本发明人对现有三维皮肤类器官培养方法进行了改良，以高效构建三维分层的皮肤类器官，并且形成类似于真实人皮肤的皮肤类器官。在本发明中，通过应用气液界面(ALI)培养方法从人多能干细胞构建三维气液界面-皮肤类器官模型(ALI-皮肤类器官)。ALI培养方法是一种广泛应用于皮肤组织培养的方法，通过促进表皮层化并使表皮层暴露于空气而接近于体内皮肤分化过程。

实施例2.通过Wnt信号传导通路激活构建ALI-皮肤类器官

本发明人通过Wnt信号传导通路激活(0.5至8μM Wnt激动剂(CHIR-99021))实验确认了Wnt信号传导通路对皮肤类器官的影响。

首先，基于实施例1-2的方法构建皮肤类器官，但调整了一些步骤。从第6天开始，将200ng/ml FGF2和50μg/ml LDN193189(Tocris)添加到培养液中以诱导颅神经嵴细胞。此外，在第6天将0.5至8μM Wnt激动剂(CHIR-99021)添加到培养基中以激活Wnt信号传导通路(参见图5)。在培养的第14天，将类器官转移至含有3ml用于皮肤类器官成熟的培养基的6孔板(低附着6孔板；Corning)，并在轨道摇床(65rpm；Thermo Fisher)中培养皮肤类器官直至分析日。每3天更换培养基。使用EVOS XL Core明场系统显微镜(Thermo Fisher)以x40放大倍数拍摄待分析的皮肤类器官。

如图6和7所示，由于在分化的第6天向培养液中添加0.5至8μM CHIR-99021(一种Wnt激动剂)，与通过现有方法产生的皮肤类器官相比，类器官的尺寸显著增加。

此外，如图7所示，在未用CHIR-99021(CHIR(-))处理的根据现有培养方法的组中，在第38天、第65天和第85天的皮肤类器官中分化了软骨(红色圆圈表示软骨)。然而，确认了用CHIR-99021处理的Wnt激活皮肤类器官体积增大并分化为球形囊肿，其中未形成软骨，表明Wnt激活显著抑制了软骨的形成，软骨是皮肤类器官中不需要的成分。

实施例3.通过Wnt信号传导通路激活的ALI-皮肤类器官的软骨相关基因标志物表 达的确认

作为用于评估基因表达的方法，裂解细胞并使用裂解缓冲液提取基因，并使用RT-PCR量化基因表达。为了评估基因表达，使用RNeasy试剂盒(Qiagen，目录号74106)分离总RNA，并根据制造商的说明使用逆转录酶III(Thermo Fisher Scientific，目录号4368814)制备cDNA。使用SRBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific，目录号A25776)进行实时PCR，并使用Step One Plus Real-time PCR系统(Applied Biosystems)进行检测。将基因表达相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达进行归一化。使用对COL2A、ACAN和SOX9 mRNA具有特异性的引物评估基因表达的程度。引物的具体序列如下表1所示。

[表1]

如图8所示，确认了与未经CHIR-99021处理的组(CHIR(-))相比，在经CHIR-99021处理的皮肤类器官(CHIR(+))中软骨表达标志物COL2A、ACAN和SOX9的基因表达水平显著降低。

实施例4.利用气液界面(ALI)培养方法的源自人诱导多能干细胞的皮肤类器官的 构建和表征

实施例4-1.利用气液界面(ALI)培养方法的皮肤类器官的构建

将实施例2的皮肤类器官培养约40天至100天后，使用Dumont#3镊子(FineScience Tools)和弹簧剪刀(Fine Science Tools)将类器官切割成4个均匀尺寸，并通过将皮肤类器官铺展在胶原蛋白(Corning)包被的transwell培养插入物(孔径0.4μm，12孔板；Corning)上进行培养，使得真皮层和表皮层分别暴露于胶原蛋白侧和空气。ALI-皮肤类器官在100％湿度条件培养箱中用皮肤成熟培养基在气液界面再培养3至4周，然后在干燥条件(0％湿度条件培养箱)培养2至6天使分层上皮层成熟。用于构建ALI皮肤类器官的方法如图9所示。

实施例4-2.利用气液界面(ALI)培养方法的皮肤类器官的表征：组织学结构确认

进行H&E染色和油红O染色以确认皮肤类器官的组织结构。H&E染色方法如下。将类器官用4％福尔马林固定，然后用酒精脱水，用二甲苯清洁，然后包埋在石蜡中。将类器官冷冻切片至12μm的厚度以制备切片，将切片用苏木精和伊红染色，然后在光学显微镜(Olympus Ix70)下观察。

油红O染色方法如下。将类器官用4％福尔马林固定，然后冷冻切片至12μm的厚度以制备切片。将制备的切片用油红O染色液(0.5g(Sigma Aldrich)在100ml异丙醇中)染色15分钟，用苏木精染色，然后在光学显微镜(Olympus 1x70)下观察。

如图10A所示，观察到本发明的ALI-皮肤类器官不仅表现出比通过现有方法培养的皮肤类器官更类似于真实皮肤的形态，而且极大改善了毛囊的生长。

此外，如图10B所示，本发明的ALI-皮肤类器官在组织学上发展为连续的上皮结构，形成表面具有正常的网状编织图案的成熟的分层上皮层，而现有的全皮肤类器官显示分层上皮，但这些层位于类器官内部，并被外部真皮和皮下层包围，因此呈现出与真实皮肤组织不同的由内而外的形态。因此，确认了本发明的ALI-皮肤类器官更适合作为代表真实皮肤组织的皮肤模型。

此外，如图11所示，确认了在通过本发明的ALI培养方法构建的ALI-皮肤类器官中，皮下脂肪层分化为类似于真实皮肤的真皮层下侧，并且观察到也分化出在毛囊周围发育的皮脂腺。

此外，如图12所示，可以看出在通过本发明的ALI培养方法构建的ALI-皮肤类器官中形成了发育好的人毛囊结构。还观察到毛囊隆起干细胞、皮脂腺、头球、毛干等均有明显表达。这表明ALI皮肤类器官不仅生长并表达让人联想到人皮肤结构的毛囊，而且也表现出与现有的类器官相比显著改善的毛囊形态。

此外，如图13A所示，本发明在干燥条件培养0、2、4或6天以用于皮肤角质形成细胞成熟的ALI-皮肤类器官表现出与皮肤组织类似的形态。

此外，如图13B中的H&E染色结果所示，在最后干燥条件培养第4天和第6天的ALI皮肤类器官中观察到成熟角质形成细胞(红色染色区域)的分化。

实施例4-3.利用气液界面(ALI)培养方法的皮肤类器官的表征：荧光免疫组织化学染色

使用实施例1-3的荧光免疫组织化学染色方法，在本发明的ALI-皮肤类器官中确认了多种皮肤相关因子的表达。

如图14所示，在本发明的ALI-皮肤类器官中，表达了成熟表皮和成熟棘层标志物KRT10，并且还观察到表皮角质层标志物兜甲蛋白和丝聚蛋白的分化。

此外，如图15所示，在本发明的ALI-皮肤类器官中，可以确认在细长的毛囊中观察到真皮乳头和黑素细胞的表达，并且还存在KRT15+毛囊隆起干细胞。此外，观察到毛干的外鞘在ALI皮肤类器官中表达。这表明本发明的ALI-皮肤类器官表现出改善的毛囊生长和表达，让人联想到人皮肤结构。

此外，如图16所示，在本发明的ALI-皮肤类器官中，观察到在干燥条件培养的第4天或第6天的ALI-皮肤类器官中开始出现成熟表皮的角质层标志物兜甲蛋白和丝聚蛋白的分化。

此外，如图17所示，确认了在本发明的最后阶段在干燥条件培养6天的ALI-皮肤类器官中分化了真皮层标志物胶原蛋白3(COL3)和波形蛋白(VMT)。

此外，如图18所示，在本发明的最后阶段在干燥条件培养6天的ALI-皮肤类器官中，通过Lipid tox确认了皮下层和皮脂腺脂肪细胞的表达。

实施例5.通过用金黄色葡萄球菌感染对特应性皮炎建模

实施例5-1.通过用金黄色葡萄球菌感染对特应性皮炎建模：组织学结构的确认

金黄色葡萄球菌是皮肤感染的常见原因，它通常存在于特应性患者的皮肤上，但不会出现在健康人的皮肤上。为了对特应性皮炎建模，检查了接种时金黄色葡萄球菌是否穿透皮肤类器官的表皮层，并使用ALI-皮肤类器官研究了表皮金黄色葡萄球菌的定植。

基于实施例4，使用金黄色葡萄球菌菌株ATCC 29213感染培养3至4周的ALI皮肤类器官。将混悬液以100x g离心10分钟，并以根据混悬液在600nm处的吸光度计算的1×10¹⁰CFU/ml、1×10⁹CFU/ml和1×10⁸CFU/ml的浓度重悬于磷酸盐缓冲盐水中。接下来，将1μl细菌混悬液在37℃和5％ CO₂条件接种到ALI皮肤类器官上，持续24小时。然后，根据实施例1-3的荧光免疫组织化学染色方法，确认了金黄色葡萄球菌、基底上皮层标志物KRT5、细胞增殖标志物Ki67、角质层标志物丝聚蛋白和兜甲蛋白、基底上皮层标志物KRT14、棘层标志物KRT10和皮肤表皮干细胞标志物KRT15和p63。此外，通过TUNEL分析确认细胞死亡。

如图19所示，通过免疫染色分析确认了，在接种有金黄色葡萄球菌的ALI皮肤类器官的表皮和真皮中均检测到金黄色葡萄球菌。确认了金黄色葡萄球菌从表皮层沿毛囊显著感染到ALI皮肤类器官的真皮层，并引起定植。

此外，如图20所示，可以看到在接种有金黄色葡萄球菌的ALI皮肤类器官的真皮层中细胞死亡水平升高，并且由于KRT5的表达水平显著降低，观察到经接种的ALI皮肤类器官的表皮和真皮层的结构损伤。

此外，如图21所示，由于接种有金黄色葡萄球菌的ALI皮肤类器官的表皮层中丝聚蛋白和兜甲蛋白的表达水平显著降低，因此观察到皮肤屏障受损。

此外，如图22所示，在接种有金黄色葡萄球菌的ALI-皮肤类器官中，由于确认了基底上皮层标志物KRT14显著降低，同时特应性皮炎角质形成细胞的TSLP表达显著增加，因此已确认充分诱导了特应性皮炎的症状。

此外，如图23所示，确认了在接种有金黄色葡萄球菌的ALI皮肤类器官中，皮肤表皮干细胞标志物KRT15和p63的表达水平显著降低。

此外，如图24所示，已确认在接种有金黄色葡萄球菌的ALI皮肤类器官中，皮肤屏障聚集蛋白标志物密封蛋白4(CLDN4)和KRT5显著减少。

实施例5-2.通过用金黄色葡萄球菌感染对特应性皮炎建模：使用RNA测序进行基 因表达变化分析

使用RNA测序分析方法以便比较并评估根据实施例5-1的方法用1×10⁶CFU金黄色葡萄球菌处理的ALI皮肤类器官(n＝3)和未处理的ALI皮肤类器官(对照；n＝3)之间的基因表达。首先，使用实施例3的基因提取方法提取基因。使用Macrogen Inc.(Seoul,Korea)的Illumina测序平台和方案进行基因质量检查、逆转录和测序。差异表达的基因被定义为表达变化>2倍且调整后的P值<0.05的基因。随后，使用Gene Ontology和KEGG数据库进行功能注释和基因集富集分析。在鉴定的46427个基因中，排除了26458个基因，它们每一百万个映射的前导转录本的每千个碱基至少有0个片段，并且有19969个基因要进行差异表达基因(DEG)分析。

如图25A和25B所示，在ALI-皮肤类器官表面接种金黄色葡萄球菌后18小时，通过RNA测序分析方法比较并分析基因表达的变化。在用金黄色葡萄球菌处理的ALI皮肤类器官和未处理的对照之间的生物复制之间显示了许多基因表达的显著差异，并且在4255个差异表达基因(DEG)中，通过接种金黄色葡萄球菌，有2162个基因高表达，2093个基因低表达。

如图25C所示，在用金黄色葡萄球菌处理的ALI-皮肤类器官中，发现了与皮肤屏障功能相关的基因如丝聚蛋白(FLG)、晚期角质化包膜(LCE)和兜甲蛋白的表达与对照相比显著降低。

此外，如图25D所示，作为RNA测序分析的结果，确认了在用金黄色葡萄球菌处理的ALI皮肤类器官中角质形成细胞分化相关基因如KRT和KRTAP的表达显著低于对照中的表达。

此外，本发明人阐明了宿主细胞对细菌感染的反应，包括细菌识别、抗菌肽(AMP)产生和炎症信号。如图25E所示，在RNA测序分析结果中，确认了用金黄色葡萄球菌处理的ALI皮肤类器官中的主要抗菌肽(AMP)相关基因如防御素β(Defb)、肽聚糖识别蛋白2(Pglyrp2)、toll样受体1和2(TLR1和TLR2)、半乳糖凝集素9(Lgals9)、脂质运载蛋白2(Lcn2)和S100钙结合蛋白(S100A)的表达与对照相比有所增加。

此外，如图25F所示，确认了炎性细胞因子相关基因如CXC基序趋化因子配体(CXCL)、CC基序趋化因子配体(CCL)、TSLP、白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)的表达显著增加。

实施例6.痤疮丙酸杆菌对用金黄色葡萄球菌感染的ALI-皮肤类器官的治疗效果 的确认

在实施例5所示的结果中，确认了感染有金黄色葡萄球菌的ALI-皮肤类器官充分地模拟了特应性皮炎的特征。因此，在实施例6中，研究了共培养在健康人皮肤中发现的共生微生物群是否能够预防或减少特应性皮炎表型。痤疮丙酸杆菌是健康人体皮肤上最常见的共生微生物之一。因此，研究了使用痤疮丙酸杆菌的微生物组治疗剂对预防特应性皮炎和皮肤屏障功能的治疗效果。

基于实施例4将培养3-4周的ALI-皮肤类器官在干燥条件培养4天，然后基于实例5将痤疮丙酸杆菌以1×10⁹CFU/ml的浓度混悬于磷酸盐缓冲盐水中。接下来，在37℃和5％CO₂条件将1μl细菌混悬液接种到ALI皮肤类器官上，持续48小时。在用痤疮丙酸杆菌预处理48小时后，基于实施例5将金黄色葡萄球菌以1×10⁹CFU/ml的浓度混悬于磷酸盐缓冲盐水中。在37℃和5％ CO₂条件用1μl金黄色葡萄球菌混悬液接种经痤疮丙酸杆菌预处理的ALI-皮肤类器官，持续18小时，并在干燥条件进行培养。类器官未接种(0，对照)，或接种有仅金黄色葡萄球菌(SA)1×10⁶、痤疮丙酸杆菌(CA)1×10⁶CFU+SA 1×10⁶CFU或CA 1×10⁷CFU+SA 1×10⁶CFU。ALI-皮肤类器官培养方法和痤疮丙酸杆菌接种方法如图26A所示。

接种后，对负责皮肤屏障功能的关键蛋白丝聚蛋白进行免疫染色，以检查痤疮丙酸杆菌是否具有保护用金黄色葡萄球菌感染的ALI皮肤类器官的皮肤屏障的作用。通过实施例1-3的荧光免疫组织化学染色方法分析并确认了上皮层标志物KRT5(CK5)和关键皮肤屏障蛋白丝聚蛋白。

如图26B所示，用仅1×10⁶金黄色葡萄球菌处理的ALI-皮肤类器官中的丝聚蛋白表达显著降低。相反，与用仅金黄色葡萄球菌处理的ALI-皮肤类器官相比，用1×10⁶CFU痤疮丙酸杆菌预处理的ALI-皮肤类器官具有显著增加的丝聚蛋白表达水平。这些结果表明，痤疮丙酸杆菌降低了由用金黄色葡萄球菌感染引起的皮肤屏障破坏，并提供了防止金黄色葡萄球菌定植的保护机制。因此，作为健康人皮肤中发现的共生微生物群之一的痤疮丙酸杆菌对金黄色葡萄球菌介导的皮肤屏障破坏和细胞损伤显示出显著的预防和治疗作用，因此有望用作特应性皮炎的治疗剂。

总之，与通过现有方法产生的皮肤类器官相比，通过本发明的Wnt信号传导通路激活产生的皮肤类器官显著增大了类器官的尺寸，并抑制了软骨的形成，软骨是皮肤类器官中不需要的成分。此外，已观察到本发明的ALI-皮肤类器官形成了结构与真实皮肤中的结构类似的皮肤细胞、附属物、神经细胞、脂肪细胞等，并且表现出与通过现有培养方法构建的皮肤类器官相比极大改善的毛囊生长。此外，本发明的特应性皮炎类器官模型模拟了特应性皮炎的特征，如皮肤屏障受损、上皮细胞来源的细胞因子增加、表皮干细胞表达下调以及金黄色葡萄球菌的良好定植，因此有望有效地用作特应性皮炎治疗剂的筛选模型。

此外，使用本发明的特应性皮炎模型，确认了作为人类共生菌的痤疮丙酸杆菌通过减少由于金黄色葡萄球菌感染引起的皮肤屏障破坏并提供防止金黄色葡萄球菌定植的保护机制而能够有效地用作微生物组治疗剂。由以上结果，预期痤疮丙酸杆菌能够用于治疗特应性皮炎。

对本发明的上述描述是为了说明的目的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或本质特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其它特定形式。因此，应当理解，上述实施方案在所有方面仅是示例性的而不是限制性的。

[工业适用性]

本发明人已确认，用Wnt激动剂处理在第6天不仅显著增加了类器官的尺寸，而且抑制了软骨的形成，软骨是皮肤类器官的不需要的组分。已观察到本发明的ALI-皮肤类器官形成了结构与真实皮肤中的结构类似的皮肤细胞、附属物、神经细胞、脂肪细胞等，并表现出与通过现有培养方法构建的皮肤类器官相比极大改善的毛囊生长，并且已确认形成了结构与真实皮肤中的结构类似的类器官。此外，由于用金黄色葡萄球菌处理以构建特应性皮炎模型，产生了对特应性皮炎特征的良好模拟，例如皮肤屏障受损、上皮来源的细胞因子增加、皮肤屏障功能相关基因表达下调、角质形成细胞分化相关基因表达下调、抗菌肽基因表达增加、表皮和真皮细胞来源细胞因子基因表达增加、表皮干细胞表达下调、引起金黄色葡萄球菌定植等。因此，预期本发明的皮肤类器官可有利地用作真实皮肤模型和特应性皮炎模型，因此具有工业实用性。

同时，使用本发明的特应性皮炎模型，确认了痤疮丙酸杆菌，作为微生物组治疗剂的有益人类共生菌，减少了由于金黄色葡萄球菌感染引起的皮肤屏障破坏，并提供了一种防止金黄色葡萄球菌定植的保护机制。因此，痤疮丙酸杆菌能够通过对金黄色葡萄球菌介导的皮肤屏障破坏和细胞损伤的显著预防和治疗作用而有效地用于治疗特应性皮炎，因此具有工业实用性。

<110> 康干细胞生物科技有限公司

<120> 用人多能干细胞来源的皮肤类器官进行特应性皮炎建模

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Claims (32)

1.一种用于从人多能干细胞构建皮肤类器官的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在Wnt激动剂的存在下培养多能干细胞来源的类器官；

(b)将步骤(a)的培养产物在用于皮肤类器官成熟的培养基中培养40天或更久；和

(c)切割步骤(b)的培养产物并且在气液界面培养经切割的培养产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Wnt激动剂为CHIR-99021。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在培养多能干细胞的第5至7天添加所述Wnt激动剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述用于皮肤类器官成熟的培养基包含一种或多种选自由以下组成的组的组分：GlutaMax^TM、2-巯基乙醇、B-27、N2和normocin。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在进行步骤(a)之前包括以下步骤：

(1)培养多能干细胞的胚状体；

(2)诱导所述胚状体分化为非神经外胚层；和

(3)诱导所述非神经外胚层分化为颅神经嵴样细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(1)在Y-27632的存在下进行。

7.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(2)在SB431542、FGF2和BMP4的存在下进行。

8.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(3)在FGF2和LDN193189的存在下进行。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的培养进行5天至14天。

10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的培养进行40天至100天。

11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的培养进行3周至4周。

12.根据权利要求1所述的方法，还包括(d)将步骤(c)的培养产物在干燥条件培养1至10天。

13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(d)用于所述皮肤类器官的角质层成熟。

14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括将步骤(b)的培养产物切割成四个均匀尺寸，和

培养步骤(b)的培养产物，使得胶原蛋白包被的transwell培养插入物上的真皮层和表皮层分别暴露于胶原蛋白侧和空气。

15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的所述气液界面培养在所述用于皮肤类器官成熟的培养基中进行。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮肤类器官具有抑制的软骨形成。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮肤类器官的直径为2至20mm。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮肤类器官具有位于所述表皮层下方的真皮层和皮下脂肪层。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮肤类器官表达选自由以下组成的组的一种或多种：角蛋白5(KRT5)、KRT10、KRT15、KRT17、兜甲蛋白、丝聚蛋白、SRY-Box转录因子2(SOX2)和melan-A。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

21.一种用于构建皮肤类器官的方法，所述方法包括用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)处理通过权利要求1所述的方法构建的皮肤类器官，其中所述皮肤类器官为特应性皮炎的皮肤模拟模型。

22.通过权利要求21所述的方法构建的皮肤类器官，其中所述皮肤类器官为特应性皮炎的皮肤模拟模型。

23.根据权利要求22所述的皮肤类器官，其中所述皮肤类器官具有选自由以下特征组成的组的一种或多种特征：

皮肤真皮层中的细胞死亡增加；

选自由以下组成的组的一种或多种的表达下调：KRT5、KRT10、丝聚蛋白、兜甲蛋白和密封蛋白4，它们是皮肤表皮屏障相关标志物；

角质形成细胞分化基因KRT或KRTAP的表达降低；

选自由以下组成的组的一种或多种的表达增加：β-防御素、肽聚糖识别蛋白2(PGLYRP2)、toll样受体1(TLR1)、TLR2、半乳糖凝集素9(LGALS9)、脂质运载蛋白2(LCN2)和S100钙结合蛋白(S100A)，它们是抗菌肽基因；

选自由以下组成的组的一种或多种的表达增加：CXC基序趋化因子配体(CXCL)、C-C基序趋化因子配体(CCL)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)，它们是表皮或真皮细胞来源的炎性细胞因子基因；

表皮干细胞标志物KRT15的表达下调；和

金黄色葡萄球菌的定植。

24.一种用于特应性皮炎治疗剂的筛选方法，所述方法包括用特应性皮炎治疗剂的候选材料处理根据权利要求22所述的皮肤类器官。

25.一种用于预防或治疗特应性皮炎的药物组合物，包含痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)或其培养液作为活性成分。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述组合物增加丝聚蛋白的表达。

27.一种用于预防或改善特应性皮炎的食品组合物，包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分。

28.一种用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分。

29.根据权利要求22所述的皮肤类器官用于筛选特应性皮炎治疗剂的用途。

30.一种用于预防或治疗特应性皮炎的方法，所述方法包括将包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分的药物组合物施用于有需要的受试者。

31.包含痤疮丙酸杆菌或其培养液作为活性成分的药物组合物用于预防或治疗特应性皮炎的用途。

32.痤疮丙酸杆菌或其培养液用于生产用于预防或治疗特应性皮炎的药物的用途。