JP2021505689A - プロバイオティクスに基づいた組成物及びその使用 - Google Patents
プロバイオティクスに基づいた組成物及びその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
1) 皮膚を冒す障害を防止、及び/又は処置することに寄与する;
2) 正常な治癒過程を促進する;並びに
3) 正常な再上皮化及び/又は瘢痕形成過程を促進及び/又は向上させる。
例として、本発明は以下の細菌株を使用して実証された:
- L.カゼイDG(登録商標)(ラクトバチルス・パラカゼイCNCM1-1572)
- L.パラカゼイLPC-S01
- L.カゼイDG(登録商標)+L.パラカゼイLPC-S01の1:1混合物。
ケラチノサイトを、細胞培養プレートのウェルに、5%CO2、37℃で播種し、コンフルエンス(すなわち、合計約105細胞)に達するまで増殖させた。播種率は、2.5×105細胞/0.32cm2(すなわち、7.8×105細胞/cm2の細胞密度)であった。実験のその時点で、培地を除去し、細胞を、抗生物質を含まない培地で洗浄し、その後、試験のために細菌を加え、その試験は、下記の異なるプロトコールに従って行った。
ウェルあたりのケラチノサイトの数を決定した後、L.パラカゼイの株を、MOI 1:10(ウェルあたり105細胞と細菌の106 CFU)で加えた。その株を、1:1比で、個々として、及び組合せの両方で、試験した。
ケラチノサイトの数を各ウェルについて決定した後、L.パラカゼイの株を、細胞へ1:1比で、個々として、及び組合せの両方で、加えた。
ウェルあたりのケラチノサイトの数を決定した後、P.アクネスと同時に、L.パラカゼイの株を(個々として、及び1:1比の両方で)加えた。細菌は、1:10の全体的MOI、及び1:1のプロバイオティクス:病原体比で加えられた。
ウェルあたりのケラチノサイトの数を決定した後、P.アクネスを加えた(MOI 1:10)。
この試験の結果は、個々として、及び組み合わせても取り入れられた株の、ケラチノサイトへ接着する能力を示した。特に、L.カゼイDG(登録商標)株は、L.パラカゼイLPC-S01の能力より大きい、ケラチノサイトへの接着の能力を示した。したがって、組合せについて観察された接着能力は、おそらく、L.カゼイDG(登録商標)株により提供された寄与に起因する。
上記で述べられたように、ケラチノサイトの単層を、最初、プロバイオティクスとの接触に曝露し、続いて、非接着細菌の除去後、P.アクネスとの接触に曝露し、その後、その非接着P.アクネスを洗浄により除去した;この後、P.アクネスの残留生存率を定量化した。
これらの試験中、P.アクネスと共インキュベートした場合、プロバイオティクスにより発揮される潜在的な競合阻害効果を評価することを目的として、P.アクネスのケラチノサイトへの接着の低減(もしあれば)を、細胞株のプロバイオティクス及び病原体での同時処理後、アセスメントした。
これらの試験中、P.アクネスのケラチノサイトへの接着におけるあらゆる低減を、その細胞株の病原体での前処理、及び引き続いての、非接着病原体の除去後のプロバイオティクスとのインキュベーション後に、アセスメントした。
プロバイオティクス株が、細菌リポポリサッカライド(LPS)の負の刺激に曝露されたヒトケラチノサイトによるサイトカインの遊離を調節する能力を有するかどうかを検証することを目的として、免疫調節試験を行った。
試験される株の、ケラチノサイトの免疫応答を刺激する能力を、上記のプロトコールに従って評価した。その試験の焦点を、サイトカイン(IL-8、IL-1ベータ、及びIL-10)を決定すること、及び2つのマーカー、COX-2及びNF-kBの活性化を評価することに当てた。
- IL1β: ケラチノサイトの上清1mlあたり少量ナノグラムの発現のレベル。プロバイオティクスとの接触は、(プロバイオティクスにより刺激されていないケラチノサイトの)ベースライン発現と比較してこのサイトカインの統計的に有意な低減を引き起こさなかった。L.パラカゼイLPC-S01は、L.カゼイDGと比較して、中程度にプラスの影響を示し、組合せのそれと同等であった。免疫応答を最大限にするためのケラチノサイトのLPSでの予備刺激の場合も、同様の考察が当てはまる。
- IL-10: ケラチノサイトの上清1mlあたりの数十pgの発現のレベル。プロバイオティクスとの接触は、(プロバイオティクスにより刺激されていないケラチノサイトの)ベースライン発現と比較してこのサイトカインの低減を引き起こした。L.パラカゼイLPC-S01は、L.カゼイDGと比較して中程度にプラスの影響を示し、組合せのそれと同等であった。免疫応答を最大限にするためのケラチノサイトのLPSでの予備刺激の場合も、同様の考察が当てはまる。
- IL-8: ケラチノサイトの上清1mlあたり少量ナノグラムの発現のレベル。プロバイオティクスとの接触は、(プロバイオティクスにより刺激されていないケラチノサイトの)ベースライン発現と比較してこのサイトカインの低減を引き起こした。L.パラカゼイLPC-S01は、L.カゼイDGと比較して、プラスの影響を示し、組合せのそれと同等であった。免疫応答を最大限にするためのケラチノサイトのLPSでの予備刺激の場合、どちらのプロバイオティクスも、本サイトカインのコントロールにプラスに影響を及ぼす能力を示し、個々としてみなされたプロバイオティクス及び混合物のどちらについても同様の潜在能力があった。
- TSLP: ケラチノサイトの上清1mlあたり少量ナノグラムの発現のレベル。プロバイオティクスとの接触は、(プロバイオティクスにより刺激されていないケラチノサイトの)ベースライン発現と比較して本指標の低減を引き起こした。個々としてみなされての、及び組合せでのプロバイオティクス株は、この指標の発現を調整するのに効果的であることが示された。本指標は、アトピー性皮膚炎等のいくつかの皮膚病態において過剰発現しているため、かなり関心が高い。更に、このサイトカインは、ケラチノサイトと樹状細胞との間の機能的界面における重要なメディエータとみなされる。
プロバイオティクス株LPC-S01の、UV照射により引き起こされる損傷を低減させる能力を、完全3Dインビトロ再構築皮膚モデルにおいて評価し、その皮膚モデルは、真皮及び表皮のコンパートメントを再現し、したがって、真皮の細胞外マトリクスの改変及び生存可能な皮膚層の分化を研究することを可能にする(全層皮膚モデル)。本研究は、UV照射に応答したインフラマソームの活性化へのLPC-S01株の効果の評価に関連した。LPC-S01株を、3D皮膚モデルの表面に直接塗布し、一晩インキュベートし、その後、食塩水ですすいで、過剰な産物を除去した。組織を軽く引っ掻き、その後、通常の日光曝露を模倣するために1MED(最小紅斑生成性用量)のUVに曝露した。炎症の活性化を、UV照射への曝露から4時間後及び24時間後に試験した。食塩水で処理され、かつUV照射に曝露された組織を、陽性対照として使用した。食塩水を陰性対照として使用した。
処理の終わりに、組織を食塩水で洗浄し、10%ホルマリン中に固定した。各試料について、生物学的複製物(n=3)を、同じパラフィンブロック中に含ませ、2つの非連続5pm切片を切断し、収集した。組織切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織学的試料を、光学顕微鏡(20×及び40×倍率)で分析し、組織の形態学的変化及び細胞毒性効果を評価した。
NFkBを標識することは、細胞質から核へのそれの移行を評価することを可能にする;それの移行は、事実、炎症過程を活性化することができる。NFkBを、当技術分野において公知の免疫染色技術を用いて標識した。特に、一次抗NFkB(Abeam社)抗体及びフルオロフォアAlexa 555で染色された二次抗体、並びに細胞核を強調するためにDAPIでの対比染色を使用した。画像を、蛍光顕微鏡を40×倍率で用いて取得した。
抗体をELISAプレート上へ吸着させ、その後、試料をインキュベートした。二次抗体を加えて、「サンドイッチ」を形成させた。定量化は標準曲線に基づいた。データを、顕微分光測光法測定を用いて取得した。
UV照射への曝露から4時間後、未処理の組織(陽性対照)は、変化していない形態を示したが、表皮の下層において細胞がUV照射により損傷した。4時間後、LPC-S01株で処理された組織は、組織の形態若しくは一般的な構造における、又は下層表皮に存在する熱傷の損傷における、実質的な変化を示さなかった。UV照射への曝露から24時間後、組織は、熱傷による表皮の典型的な変化を示し、濃縮した核、変化を有する表皮及び真皮を示した。LPC-S01株の投与は、UV照射により誘発された組織において形態学的変化を防止することに改善を示さなかった。
Claims (9)
- 皮膚を冒す、好ましくは炎症型の、障害及び/若しくは病態の防止及び/若しくは処置における使用、並びに/又は前記障害/病態に関連した症状及び/若しくは影響の低減及び/若しくは処置における使用、並びに/又は創傷治癒過程及び/若しくは再上皮化過程及び/若しくは瘢痕形成過程を促進するための使用のためのプロバイオティクスを含む組成物であって、前記プロバイオティクスがラクトバチルス・パラカゼイDG(登録商標)CNCM1-1572株の細菌及び/又はラクトバチルス・パラカゼイLPC-S01 DSM26760株の細菌である、組成物。
- 前記皮膚を冒す障害及び/又は病態が、刺激作用及び擦過傷に関連した可能性がある皮膚炎、ざ瘡、感染症、皮膚炎症、紅斑、潰瘍、乾癬、アトピー性皮膚炎、耳炎、ひび割れ、瘻孔、痔核、進行中の炎症過程が存在する任意の他の皮膚障害若しくは病変、並びに/又はそれらの組合せ及び/若しくは合併症及び/若しくは転帰から選択される、請求項1に記載の組成物。
- UV照射、UV-A及び/又はUV-Bから皮膚、好ましくは唇及び/又は結膜を遮蔽するための、好ましくは、UV照射、UV-A及び/又はUV-Bへの曝露に起因/関係する損傷及び/又は影響を防止及び/又は軽減するための、より好ましくは、皮膚老化を防止及び/又は軽減するための、プロバイオティクスを含む組成物の使用。
- 細菌、真菌、酵母、及びそれらの組合せから選択される微生物を更に含み、微生物が、好ましくは、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、バチルス属、プロピオニバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、アエロコッカス属、及びエンテロコッカス属から選択される少なくとも1つの属に属する細菌であり、微生物が、好ましくは、ラクトバチルス属に属する細菌である、請求項1若しくは2に記載の使用のための組成物、又は請求項3に記載の使用。
- ラクトバチルス属の細菌が、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロリティカス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・アリメンタリウス、ラクトバチルス・アビアリウス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・セロビオサス、ラクトバチルス・コリニフォルミス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・カルバータス、ラクトバチルス・デルブレッキイ、ラクトバチルス・ファルシミニス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガリナルム、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ヒルガルディイ、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ケフィリ、ラクトバチルス・ムコーサエ、ラクトバチルス・パニス、ラクトバチルス・コリノイデス、ラクトバチルス・パラプランタラム、ラクトバチルス・ペントーサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ポンティス、ラクトバチルス・ロイテリー、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・サケイ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・サンフランシセンシス、及びそれらの組合せから選択される少なくとも1つの種に属する、請求項4に記載の使用のための組成物又は使用。
- ビフィドバクテリウム属の細菌が、B.アニマーリス、B.ビフィダム、B.ブレーベ、B.インファンティス、B.ロングム、B.アドレスセンティス、B.カテヌラツム、B.アンギュラツム、B.アステロイデス、B.ボウム、B.コエリナム、B.コリネフォルメ、B.クニクリ、B.デンティコレンス、B.デンティウム、B.ガリクム、B.ガリナルム、B.インディカム、B.イノピナータ、B.ラクティス、B.マグヌム、B.メリシカム、B.ミニマム、B.シュードカテヌラツム、B.シュードロングム、B.プロラム、B.ルミナンティウム、B.サエクラレ、B.サーチレ、B.サーマシドフィルム、B.サーモフィルム、及びB.ツルミエンスから選択され、より好ましくは、バチルス・クラウシイ、バチルス・サブティリス、バチルス・コアグランス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ハロデュランス、バチルス・チューリンギエンシス、バチルス・インソライタス、及びバチルス・マリヌスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はプロピオニバクテリウム属の細菌が、P.シャーマニイ、P.アクネス、P.オーストラリエンス、P.アビダム、P.シクロヘキサニカム、P.フリューデンレイッヒイ、P.グラヌローサム、P.ジェンセニイ、P.ミクロアエロフィラム、P.プロピオニカム、及びP.ソエニイから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はストレプトコッカス属の細菌が、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・アガラクティアエ、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス・カニス、ストレプトコッカス・コンステラタス、ストレプトコッカス・ダウネイ、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ、ストレプトコッカス・エクイナス、ストレプトコッカス・フェルス、ストレプトコッカス・インファンタリウス、ストレプトコッカス・イニアエ、ストレプトコッカス・インターメディウス、ストレプトコッカス・ミレリ、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・オリスラッティ、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・ペロリス、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・シュードニュ
ーモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ラッティ、ストレプトコッカス・チグリヌス)、ストレプトコッカス・サングイニス、ストレプトコッカス・ソブリナス、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトコッカス・ユベリス、ストレプトコッカス・ベスティブラリス、ストレプトコッカス・ビリダンス、及びストレプトコッカス・ズーエピデミカスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はラクトコッカス属の細菌が、L.チュンガンゲンシス、L.フォモセンシス、L.フジエンシス、L.ガルビエアエ、L.ラクティス、L.ピスシウム、L.プランタラム、L.ラフィノラクティス、及びL.タイワンエンシスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はアエロコッカス属の細菌が、A.ウリナエ、A.サンギュニコーラ、A.クリステンセニイ、A.スイス、A.ウリナエクイー、及びA.ウリナエホミニスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又はエンテロコッカス属の細菌が、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス、エンテロコッカス・ヒラエ、エンテロコッカス・マロドーラツス、エンテロコッカス・モラビエンシス、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・シュードアビウム、エンテロコッカス・ラフィノーサス、及びエンテロコッカス・ソリタリウスから選択される少なくとも1つの種に属し、並びに/又は酵母が、サッカロミセス属、より好ましくは、サッカロミセス・セレビシア種及び/又はサッカロミセス・ブラウディ種に属する、請求項4に記載の使用のための組成物又は使用。 - 前記微生物が、生きている、又は死滅している、又は間欠滅菌されている(tyndallized)、又は溶菌液及び/若しくは抽出物の形態である、又は細菌の産物の形態である、又は上清の形態である、又は好ましくは、その代謝産物、代謝バイオプロダクト、ポストバイオティクス、細胞壁及び成分、エキソポリサッカライド、並びに好ましくはリボソーム及び糖タンパク質、グルカン及び他のポリサッカライド等の免疫賦活剤誘導体、リポポリサッカライド、及び上清の任意の成分から選択される免疫原性成分を含有する化合物から選択される、派生物の形態である、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のための組成物又は使用。
- 前記微生物、好ましくは前記細菌が、106〜1011微生物単位の間、より好ましくは、108〜109微生物単位の間の範囲の量で存在し、前記量が、好ましくは、1日あたりの量/用量(一日量)である、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のための組成物又は使用。
- 局所的使用のための、好ましくは、クリーム剤、ゲル剤、オイル剤、乳濁液剤、スプレー剤、ガーゼ、パッチ剤、絆創膏、ローション剤、ムース剤、軟膏剤、ペースト剤、又は即時調製のための液体製剤の形態である、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための組成物又は使用。
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SILVIA BALZARETTI; ET AL: "THE VAGINAL ISOLATE LACTOBACILLUS PARACASEI LPC-S01 (DSM 26760) IS SUITABLE FOR ORAL ADMINISTRATION", FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, vol. 6, JPN5021004322, 15 September 2015 (2015-09-15), pages 1 - 13, ISSN: 0005032597 * |
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