BR112019014814A2

BR112019014814A2 - Moduladores de canal de potássio

Info

Publication number: BR112019014814A2
Application number: BR112019014814-0A
Authority: BR
Inventors: Vasantrao Amrutkar Dipak; Foster Kelly; Amos Jacobsen Thomas; R. Jefson Martin; F. Keaney Gregg; Schreiber Larsen Janus; Sandager Nielsen Karin
Original assignee: Cadent Therapeutics, Inc.
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2020-02-27
Also published as: CO2019009060A2; US10351553B2; PL3571193T3; AR110770A1; TW201838985A; PT3571193T; WO2018136917A1; SI3571193T1; MY195123A; SG11201905893WA; CU20190066A7; CN110198935B; PH12019501678A1; CU24560B1; DK3571193T3; EP3571193B1; MX2019008682A; ES2906078T3; LT3571193T; JP2020504165A

Abstract

são fornecidos compostos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, que são úteis para tratar uma variedade de doenças, distúrbios ou condições, associados a canais de potássio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MODULADORES DE CANAL DE POTÁSSIO.

PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório N° US 62/449.270, depositado em 23 de janeiro de 2017, cujo conteúdo integral é aqui incorporado por referência.

ANTECEDENTES [0002] Dentre os canais iônicos, os canais de potássio sâo os mais predominantes e diversos, sendo encontrados em uma variedade de células animais, tais como tecido nervoso, muscular, glandular, imunológico, reprodutivo e epitelial. Esses canais permitem o fluxo de potássio dentro e/ou fora da célula sob certas condições. Estes canais são regulados, por exemplo, por sensibilidade ao cálcio, retenção de voltagem, segundos mensageiros, ligantes extracelulares e sensibilidade ao ATP.

[0003] A disfunção de canais de potássio e disfunçâo de outras causas que influenciam estes canais de potássio são conhecidas por gerar perda de controle celular, função fisiológica alterada e condições de doença. Devido à sua capacidade de modular a função do canal iônico e/ou recuperar a atividade dos canais iônicos, os moduladores do canal de potássio estão sendo utilizados no tratamento farmacológico de uma vasta gama de doenças patológicas e têm o potencial de abordar uma variedade ainda maior de indicações terapêuticas.

[0004] Os canais de potássio ativados por cálcio de pequena condutância (canal SK) são uma subfamília de canais de K⁺ ativados com Ca²⁺ e a família de canais SK contém 4 membros - SK1, SK2, SK3 e SK4 (muitas vezes referida como condutância intermediária). Os papéis fisiológicos dos canais SK foram especialmente estudados no sistema nervoso, onde, por exemplo, são reguladores chave da excitabilidade neuronal e da liberação de neurotransmissores, e na musculatu

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2/40 ra lisa, onde são cruciais na modulação do tônus vascular, broncotraqueal, musculatura uretral, uterina ou gastrointestinal.

[0005] De acordo com estas implicações, os moduladores de pequena molécula de canais iônicos de potássio podem ter o potencial para tratar uma grande variedade de doenças caracterizadas por disfunção de canais iônicos de potássio e disfunção de outras causas que influenciam estes canais de potássio.

SUMÁRIO [0006] São divulgados compostos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, e composições farmacêuticas dos mesmos, que são úteis no tratamento de doenças associadas à disfunção de canais iônicos de potássio e disfunção de outras causas que influenciam esses canais de potássio (Ver, por exemplo, Tabela 1).

[0007] Os compostos aqui descritos apresentaram uma ou mais das seguintes propriedades benéficas: alta solubilidade, alta fração livre cerebral, pouca ou nenhuma inibição de hERG, meia vida in vivo prolongada, boa biodisponibilidade, alta estabilidade microssomal he~ pática, permeabilidade, tal como permeabilidade de membrana artificial paralela (PAMPA) e/ou baixa inibição de Cyp. Ver, por exemplo, os dados comparativos nas Tabelas 2 e 3.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0008] A Figura 1 é um diagrama que ilustra o efeito do Composto 1 após a dosagem oral (PO) no tremor induzido por harmalina.

[0009] A Figura 2 apresenta a eficácia e resposta à dose do Composto 1 em percentagem de potência de movimento.

[00010] A Figura 3 mostra os efeitos do Composto 1 na irregularidade de disparo de células de Purkinje em fatias ex vivo de camundongos transgênicos SCA2 58Q.

[00011] A Figura 4 mostra os efeitos do Composto 1 na ataxia basal no modelo de camundongo de desequilíbrio de EA2.

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DESCRIÇÃO DETALHADA

1. Compostos [00012] São aqui fornecidos compostos da fórmula:

ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

2. Definições [00013] Como usado aqui, os termos indivíduo e paciente podem ser usados indistintamente, e significa um mamífero necessitado de tratamento, por exemplo, animais de companhia (por exemplo, cães, gatos e semelhantes), animais de fazenda (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, ovelhas, cabras e semelhantes) e animais de laboratório (por exemplo, ratos, camundongos, porquinhos da índia e semelhantes). Normalmente, o indivíduo é um humano que precisa de tratamento.

[00014] Quando a estereoquímica de um composto divulgado é denominada ou representada pela estrutura, o estereoisômero designado ou representado é pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 99,9% em peso puro em relação a todos os outros estereoisômeros. A percentagem em peso pura em relação a todos os outros estereoisômeros é a razão do peso de um estereoisômero em relação ao peso dos outros estereoisômeros. Quando um único enantiômero é denominado

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4/40 ou representado por estrutura, o enantiômero representado ou designado é pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 99,9% em peso opticamente puro. A percentagem de pureza óptica em peso é a razão entre o peso do enantiômero em relação ao peso do enantiômero mais o peso do seu isômero óptico.

[00015] Quando um composto divulgado é denominado ou representado pela estrutura sem indicar a estereoquímica, e o composto tem um centro quiral, deve ser entendido que o nome ou estrutura engloba um enantiômero de composto livre do isômero óptico e geométrico correspondente, uma mistura racêmica do composto e misturas enriquecidas em um enantiômero em relação ao seu isômero óptico correspondente.

[00016] Sais farmaceuticamente aceitáveis, bem como as formas neutras dos compostos aqui descritos estão incluídos. Para utilização em medicamentos, os sais dos compostos se referem a sais farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos. As formas de sal farmaceuticamente aceitável incluem sais acídicos/aniônicos ou básicos/catiônicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais básicos/catiônicos farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de sódio, potássio, cálcio, magnésio, dietanolamina, n-metil~D~glucamina, L-lisina, L-arginina, amônio, etanolamina, piperazina e trietanolamina. Os sais ácidos/aniônicos farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, o acetato, benzenossulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartarato, carbonato, citrato, dicloridrato, gluconato, glutamato, glicolil-anarsanilato, hexilresorcinato, bromidrato, cloridrato, malato, maleato, malonato, mesilato, nitrato, salicilato, estearato, succinato, sulfato, tartrato e tosilato.

[00017] O termo veículo, adjuvante ou transportador farmaceuticamente aceitável se refere a um veículo, adjuvante ou transportador não tóxico que não destrói a atividade farmacológica do composto com o qual é formulado. Os veículos, adjuvantes ou transportadores farma

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5/40 ceutlcamente aceitáveis que podem ser utilizados nas composições aqui descritas incluem, mas não se limitam a, trocadores iônicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina de soro humano, substâncias de tampão, tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas glicerídicas parciais de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, silica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, polietilenoglicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol e gordura de lã.

[00018] Os termos tratamento, tratar e tratando se referem a reverter, aliviar, reduzir a probabilidade de desenvolvimento, ou inibir o progresso de uma doença ou distúrbio, ou um ou mais sintomas dos mesmos, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser administrado após o desenvolvimento de um ou mais sintomas, isto é, tratamento terapêutico. Em outras modalidades, o tratamento pode ser administrado na ausência de sintomas. Por exemplo, o tratamento pode ser administrado a um indivíduo suscetível antes do início dos sintomas (por exemplo, à luz de uma história de sintomas e/ou à luz de fatores genéticos ou outros fatores de suscetibilidade), isto é, tratamento profilático. O tratamento também pode ser continuado após a resolução dos sintomas, por exemplo, para prevenir ou retardar sua recorrência.

[00019] O termo quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz inclui uma quantidade de um composto aqui descrito que irá induzir uma resposta biológica ou médica de um indivíduo.

3. Usos, Formulação e Administração [00020] Em algumas modalidades, os compostos e composições

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6/40 aqui descritos são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados à atividade de canais de potássio. Tais doenças e/ou distúrbios incluem, por exemplo, condições neurodegenerativas e neurológicas (por exemplo, doença de Parkinson, tremores, doença de Alzheimer, demência, ataxia lateral de esclerose amiotrófica, ansiedade, depressão, distúrbios do humor, deficiências em memória e atenção, perturbação bipolar, psicose, esquizofrenia, traumatismo cranioencefálico e narcoiepsia), doenças cardíacas e condições relacionadas (por exemplo, doença cardíaca isquêmica, doença coronariana, angina pectoris e espasmos da artéria coronária), doenças metabólicas e da bexiga (por exemplo, espasmos da bexiga, incontinência urinária, obstrução da saída da bexiga, disfunção gastrointestinal, síndrome do intestino irritável e diabetes), sintomas de abstinência associados à interrupção da dependência e outras condições associadas à modulação dos canais de potássio, como doenças respiratórias, epilepsia, convulsões, ataques, ausência de convulsões, espasmos, distúrbios renais (por exemplo, doença renal policística), disfunção erétil, diarréia, isquemia, isquemia cerebral, dismenorreia, doença de Reynaud, claudicação intermitente, síndrome de Sjorgren, arritmia, hipertensão, distrofia muscular miotônica, espasticidade, xerostomia, hiperinsulinemia, parto prematuro, calvície, câncer, imunossupressão, enxaqueca e dor. [00021] A presente divulgação também fornece um método para modular a atividade de um canal de potássio em um indivíduo, compreendendo a etapa de administrar um composto aqui descrito. Em outra modalidade, a presente divulgação fornece um método de modulação positiva de um canal SK2 em uma célula compreendendo a etapa de contatar a célula com um composto aqui descrito.

[00022] Em um aspecto, os compostos e composições fornecidos são usados para tratar tremores. Os tremores incluem, mas não se limitam a, tremores de repouso, ativos, posturais, cinéticos, de inten

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7/40 ção, específicos de tarefas e idiopáticos. Em um aspecto, os compostos e composições fornecidos são utilizados para tratar tremores posturais e ativos. Exemplos de tremores posturais e/ou ativos incluem tremor essencial, parkinsonismo induzido por fármacos, tremor neuropático e tremores induzidos por toxinas (por exemplo, abstinência de álcool ou exposição a metais pesados). Em um aspecto, os compostos e composições fornecidos são utilizados para tratar o tremor essencial. [00023] A presente divulgação fornece ainda um método de tratamento do tremor essencial em um indivíduo compreendendo a etapa de administrar um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável ou composição aqui descritos.

[00024] O tremor essencial é um dos distúrbios neurológicos mais comuns, afetando aproximadamente 0,9% da população geral. O tremor essencial é caracterizado por um tremor de ação dos membros superiores e, menos comumente, da cabeça, voz e tronco. Uma história familiar de tremor essencial pode ser identificada em aproximadamente metade dos pacientes, sugerindo um componente genético. Beber álcool geralmente reduz temporariamente o tremor.

[00025] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método de tratamento de uma doença ou condição selecionada a partir de uma doença neurodegenerativa, demência, doença cardíaca, sintomas de abstinência associados ao término de dependência, doença metabólica e doença da bexiga. Em outras modalidades, a presente divulgação fornece um método de tratamento de uma doença ou condição selecionada de ataxia, distonia, doença de Parkinson, isquemia, lesão cerebral traumática, esclerose lateral amiotrófica, hipertensão, aterosclerose, diabetes, arritmia, bexiga hiperativa e sintomas de abstinência causados pelo término do abuso de álcool e outras fármacos proibidas. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método de tratamento de ataxia. Em algumas modalida

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8/40 des, a presente divulgação fornece um método de tratamento de ataxia espinocerebelar.

[00026] A presente divulgação fornece composições farmaceuticamente aceitáveis compreendendo um composto aqui descrito; e um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser utilizadas para tratar uma ou mais das doenças e condições descritas acima.

[00027] As composições aqui descritas podem ser administradas oralmente, parentericamente, por pulverização de inalação, topicamente, retalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente ou através de um reservatório implantado. O termo parentérico, tal como aqui utilizado, inclui técnicas de injeção ou infusão subcutâneas, Intravenosas, intramusculares, intra-articulares, intrassinoviais, intraesternais, intrateçais, intra-hepáticas, intralesionais e intracranianas. Formas de dosagem líquidas, preparações injetáveis, formas de dispersão sólidas e formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de um composto estão aqui incluídas.

[00028] A quantidade de compostos fornecidos que podem ser combinados com materiais transportadores para produzir uma composição em uma forma de dosagem única variará dependendo do paciente a ser tratado e do modo particular de administração. Em algumas modalidades, as composições fornecidas podem ser formuladas de modo que uma dosagem entre 0,01 e 100 mg/kg de peso corporal/dia do composto fornecido, tal como, por exemplo, 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal/dia, possa ser administrada a um paciente que recebe estas composições.

[00029] Deve também ser entendido que uma dosagem específica e regime de tratamento para qualquer paciente em particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combi

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9/40 nação de fármacos, julgamento do médico assistente e gravidade da doença em particular a ser tratada. A quantidade de um composto fornecido na composição também dependerá do composto particular na composição.

EXEMPLIFICAÇÃO [00030] Os exemplos representativos que se seguem se destinam a ajudar a ilustrar a presente divulgação, e não se destinam a, nem devem ser interpretados como, limitativos do escopo da invenção.

N-(4,4-difluorociclo-hexil)-2-3-metil-1 H-pirazol-1 -il)-6morfolinopirimidin-4-amina

Etapa 1:

ci

(1 eq)

THF,-10°C-25°C, 16h

Etapa 1 50%

[00031] Um balão de fundo redondo equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com 4,6-dicloro-2-(metilsulfonil)pirimidina (20,0 g, 88,080 mmol, 1,0 eq) em tetra-hidrofurano a 10 °C e 3-metil-1H-pirazol (7,23 g, 88,080 mmol, 1,0 eq.) foi adicionado gota a gota durante um período de cinco minutos através de seringa. A mistura reacional foi agitada durante 16 horas a 25 °C e a conclusão da reação foi determinada por TLC. A mistura reacional foi dividida em porções entre água (500 mL) e acetato de etila (500 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexano como sistema solvente) para fornecer

4,6-dicloro-2-(3-metil~1 H-pirazoM~il)pirimidina (10,0 g, 43,85 mmol, 50% de rendimento) como uma forma branca sólida pura. MS (MH+):

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10/40 m/z - 229,1.

Etapa 2:

[00032] Um balão de fundo redondo equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com 2,4-dicloro~6-metilpiri~ midina (11,0 g, 48,24 mmol, 1,0 eq.), cloridrato de 4,4-difluorociclohexan-1-amina (9,89 g, 57,89 mmol, 1,2 eq.) e CS2CO3 (39,19 g, 120,61 mmol, 2,5 eq.) em acetonitrila (200 mL). A mistura reacional foi agitada durante cinco horas a 80 °C e a conclusão da reação foi determinada por TLC. A mistura reacional foi arrefecida até a temperatura ambiente e repartida entre água (100 mL) e acetato de etila (200 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer 0 produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexano como sistema solvente) para fornecer 6-cloro-N~(4,4-difluorociclo-hexil)-2-(3-metil~1 H-pirazol-l - i H) pirim i~ din-4-amina (11,0 g, 33,62 mmol, 71%) como um sólido esbranquiçado. MS (MH+): m/z = 328,1.

Etapa 3:

H EtsN «Φ

CH3CN. 8O*C.16h traps 3 (4 ~^^fí

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11/40 [00033] Um balão de fundo redondo equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com 6-doro-N-(4,4-difluorociclo-hexil)-2-(3~metil-1H-pirazol-1-il)pirimidin-4-amina (14,0 g, 42,79 mmol, 1,0 eq.), morfolina (14,91 mL, 171,19 mmol, 4,0 eq.) e trietilamina (23,89 mL, 171,19 mmol, 4,0 eq.) em acetonitrila (200 mL). A mistura reacional foi agitada durante 16 horas a 80 °C e a conclusão da reação foi determinada por TLC. A mistura reacional foi arrefecida até a temperatura ambiente e repartida entre água (100 mL) e acetato de etila (300 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexano como sistema solvente) para fornecer N~(4,4~difluorociclo~hexil)-2-(3-metil-1 H-pirazol-1 -il)~6~ morfollnopirimidln-4-amlna (1) (12,8 g, 33,84 mmol, 79% de rendimento) como um sólido esbranquiçado.

Dados analíticos:

[00034] MS (MH+): m/z = 379,2; ¹H RMN (400 MHz, DMSO-D6): δ 8,41 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,07 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,25 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,53 (s, 1H), 3,9 (bs, 1H), 3,67 (t, J = 4,4 Hz, 4H), 3,49 (S, 4H), 2,23 (s, 3H), 2,23-1,97 (m, 3H), 1,92- 1,90 (m, 3H), 1,55-1,53 (m, 2H). ¹H RMN exibiu, via integração, 3 ressonâncias de prótons na região aromática e 1 ressonância ampla correspondendo ao próton com roca em N-18. Os prótons aromáticos foram observados como dois depletes e um singleto, indicando dois prótons adjacentes e um próton aromático isolado. Na região alifática, ressonâncias correspondentes a 20 prótons foram observadas, mostrando 1 singleto distinto. A integração destas ressonâncias correspondeu a duas ressonâncias de dupletodupleto acima do campo, uma com um próton multipleto parcialmente sobreposto, e quatro multipletos abaixo do campo, dois dos quais par

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12/40 cialmente sobrepostos. Os multipletos alifáticos acima do campo estão associados à porção morfolina da estrutura. Os multipletos abaixo do campo são divididos adicionalmente pela proximidade de CF2 a esses prótons. Na análise por LC/MS de alta resolução (HR), 0 ion pseudomolecular (Μ + Η⁺) foi observado a baixa tensão do fragmentador (70V) no modo de ions positivos ESI em m/z 379,20580. O outro ion proeminente observado a m/z 779,38575 é atribuível ao aduto do dimero na fonte 2M + Na⁺.

[00035] Os dados de ¹³C RMN revelaram 14 ressonâncias de carbono separadas e foram gerados a partir de um espectro de carbono ¹³C desacoplado, adquirido a 25 °C em CDCI3. As 14 ressonâncias são consistentes com a estrutura de 1 na qual quatro pares dos 18 carbonos são espectroscopicamente equivalentes. Observou-se que uma ressonância de carbono (C-12 a 77,05 ppm) estava parcialmente obscurecida pela ressonância de CHCh no espectro. A presença de um carbono nesta ressonância foi confirmada pela coleta de um espectro de ¹³C em CeDe; foi observada uma ressonância de 79,7 ppm sem interferência do pico do solvente, além de todas as outras ressonâncias observadas. Um trio (2J = 244 Hz) é observado na ressonância C-22 de 122,29, dois tripletos adicionais são observados a 31,53 ppm (C-21 e C-23, 3J = 24,93 Hz) e a 31,53 ppm (C-20 e C-24, 4J = 5,37 Hz). Cada um dos tripletos observados é consistente com a substituição F2 em C-22, e diminuindo a constante de acoplamento em relação ao flúor à medida que 0 número de ligações intervenientes aumenta.

[00036] A conectividade carbono-próton e a conectividade carbonocarbono (via correlações C-C-H de 2 e 3 ligações) da estrutura molecular foram confirmadas pela coleta de espectros de RMN 2D. A conectividade direta com C-H foi confirmada pelo HSQC e a conectividade de 2 e 3 ligações foi demonstrada pelo HMBC. As correlações cru

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13/40 zadas de curto e longo alcance (mais de 2 ou 3 ligações) são consistentes com as conexões esperadas da estrutura proposta. Finalmente, os dados de deslocamento químico observados atribuídos como mostrado acima foram consistentes com os desvios químicos de ¹H e ¹³C previstos por computador para a estrutura proposta.

N-(4,4-difluorociclo-hexil)-2-(3.5-dimetil-1H-pirazol-1 -il)-6-metoxipirimidin-4-amina

Etapa 1:

[00037] Um frasco de 5000 mL de fundo redondo, seco em chama, de quatro gargalos, equipado com uma lâmina de agitação revestida com teflon (5 cm) fixada com haste de vidro (gargalo 1), tampa (gargalo 2) e funil de adição com tampa (gargalo 3) e um adaptador de tubo U com entrada e saída de nitrogênio preenchido com óleo (gargalo 4), foi carregado com uma suspensão de hidreto de sódio (35,2 g, 880 mmol, 1 eq.) em diclorometano (1000 mL) foi adicionado 3,5-dimetilpirazol (84,6 g, 880 mmol, 1 eq.) a 0 °C e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente. Após 30 minutos, foi adicionada, gota a gota, 4,6-dicloro-2- (metilsulfonil)pirimidina (200 g, 880 mmol, 1 eq.) (dissolvido em diclorometano (1000 mL)) através de funil de decantação à mistura reacional a -78 °C. A mistura reacional foi agitada à mesma temperatura e a conclusão da reação foi determinada por TLC e UPLC. Após 2 h, a mistura reacional foi extinta com água a -78 °C e diluída com diclorometano. Após 5 minutos, o diclorometano foi decan

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14/40 tado e lavado com solução salina. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna utilizando acetato de etila e éter de pet como solvente para fornecer

4,6-dicloro-2-(3,5-dimetil-1 H-pirazol-1 -il)pirimidina (138 g, 567,71 mmol, 65%) como um sólido esbranquiçado. MS (MH+): m/z ··· 244,2.

Etapa 2:

[00038] Um frasco de 2000 mL, de fundo redondo, seco em chama, com três gargalos, equipado com barra de agitação revestida com teflon (5 cm), um septo (gargalo 1), tampa (gargalo 3) e condensador de refluxo equipado com adaptador de tubo de U de entrada e saída de gás nitrogênio preenchido com óleo (gargalo 2), foi carregado com uma solução de 4,6-dicloro-2-(3,5-dimetil-1 h-pirazol-1 -il) pirimidina (136 g , 559,4 mmol, 1 eq.) em acetonitrila (1500 mL) seguido de cloridrato de 4,4-difluorociclo-hexilamina (105,6 g, 615,4 mmol, 1,1 eq.) e N,N-dHSopropiletilamina (194,88 mL, 1118,8 mmol, 2 eq.). A mistura reacional foi aquecida a 80 °C durante 16 h. A conclusão da reação foi determinada por TLC e UPLC. A mistura reacional foi concentrada e o resíduo foi triturado com água (500 mL). O sólido resultante foi filtrado, lavado com éter de petróleo, seco sob vácuo para fornecer 6-cloro-N(4,4-difluorociclo-hexil)-2-(3,5-dimet!l-1 H-pirazol-1-il) pirimidin-4-amina (191 g, 556 mmol, > 95%) como um sólido esbranquiçado. MS (MH+): m/z = 342,0.

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[00039] Um frasco de 250 mL de fundo redondo, seco em chama, com três gargalos, equipado com uma barra de agitação revestida com teflon (2 cm), um septo (gargalo 1), tampa (gargalo 3) e condensador de refluxo equipado com nitrogênio adaptador de tubo de entrada de gás preenchido com óleo (gargalo 2), foi carregado com uma solução de 6-οΙθΓθ-Ν-(4,4-όΙ^οοΓοαοΙο-ΗθχίΙ)-2-(3,5-ά^ββΙ-1Η-ρΐΓ3ζοΙ-1··ίΙ)ρίΠmidin-4-amina (20 g, 58,51 mmol, 1 eq.) em metanol seguido por metóxido de sódio (21% em metanol, 5,37 g, 99,47 mmol, 1,7 eq.). A reação foi aquecida a 60 °C e a conclusão da reação foi determinada por TLC e UPLC. Após 5 h, a mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi diluído com acetato de etila, lavado com água e lavado com solução salina. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna utilizando acetato de etila em éter de petróleo como sistema solvente para fornecer N-(4,4-difluorociclo-hexil) -2(3,5-dimetil-1 H-pirazol-1 -il)~6~ metoxipirlmidin-4-amina (2) [16 g (11 g (99% pura) + 5 g (92% pura), 47,41 mmol, -80%) como um sólido branco. MS (MH+): m/z = 338,1. Dados Analíticos: ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,45 (bs, 1H), 6,06 (s, 1H), 5,72 (s, 1H), 4,01 (bs, 1H), 3,85 (s, 3H) 2,55 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 2,11-1,82 (m, 6H), 1,60-1,55 (m, 2H).

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N-(4,4-difluorociclo-hexil)-6-metóxi-2-(4-metiltiazol-2-il) pirimidin-4-amina

Etapa 1:

í. n-BuLi EtgO, -78 °C, 1,5 h

IL DMF, rt, 16 h

[00040] Um balão de fundo redondo com três gargalos equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com éter dietíHco (250 mL) e n-BuLi (241,98 mL, 604,96 mmol, 2,5 M em hexano) foi transferido a -78 °C. Uma solução de 4-metiltiazol (50,0 g, 504,13 mmol) em éter dietíHco (200 mL) foi adicionada durante um período de 30 minutos. A mistura reacional foi transformada em suspensão amarelo clara. Após 1,5 horas, adicionou-se DMF (58,54 mL, 756,20 mmol) e agitou-se à temperatura ambiente durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC. Depois de completada a reação, a mistura foi vertida em HCI aq. (400 mL, 4N) sob agitação e separou as duas camadas. A camada orgânica foi lavada com HCI aq. (2 x 80 mL, 4N). As camadas aq. combinadas foram basificadas lentamente com K2CO3 (pH 7) e extraídas com éter dietílico (3 x 150 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio e evaporadas até secura à temperatura ambiente sob vácuo para fornecer 4-metiltiazol-2-carbaldeído (60,0 g, bruto) como um líquido amarelo claro. Este material bruto foi utilizado na etapa seguinte sem mais purificação.

Etapa 2:

NH₂OH.HCI ----------------*

Piridina rt, 16 h 59% (2 etapas) [00041] Um frasco de fundo redondo

de dois gargalos equipado

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com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com 4metiltiazol-2-carbaldeído (60,0 g, bruto) em piridina (38,04 ml, 472,40 mmol). Cloridrato de hidroxilamina (32,82 g, 472,40 mmol) foi adicionado em porções durante um período de 15 minutos. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 h sob atmosfera de nitrogênio. O progresso da reação foi monitorado por TLC. Depois de completada a reação, a mistura foi vertida em água gelada e agitada durante 20 minutos, o sólido obtido foi filtrado e seco sob vácuo para fornecer oxima de 4-metiltiazol-2-carbaldeído (40,0 g, 281,69 mmol, 59% para duas etapas) como um sólido branco. MS (MH+): m/z = 143,0.

Etapa 3:

TFAA

Piridina

1,4-dioxano 0 °C-rt, 16 h [00042] Um balão de fundo redondo de dois gargalos equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com uma solução de oxima de 4-metiltiazol-2-carbaldeído (35,0 g, 246,44 mmol) e piridina (87,33 mL, 1084,35 mmol) em 1,4-dioxano (140 mL). Adicionou-se anidrido trifluoroacético (51,38 mL, 369,66 mmol) lentamente a -10 °C e deixou-se agitar à temperatura ambiente durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC. Depois de completada a reação, a mistura foi diluída com água (250 mL) e extraída com éter dietílico (3 x 350 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2 x 250 mL), salmoura (100 mL) secas sobre sulfato de sódio e concentradas sob pressão reduzida para fornecer 4-metiltiazol-2carbonitrila (35,0 g, bruto) como um líquido castanho claro. Este material bruto foi utilizado na etapa seguinte sem mais purificação. Dados analíticos: Ή RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,90 (s, 1H), 2,51 (s, 3H).

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Etapa 4:

NH₄CI NaOMe

MeOH rt, 16 h

HCI NH

[00043] Um frasco de fundo redondo com dois gargalos equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com 4metiltiazol-2-carbonitrila (35,0 g, bruto) em metanol (280 mL) e metóxido de sódio (16,77 g, 310,45 mmol) foi adicionado. Após agitação à temperatura ambiente durante 3 h, adicionou-se cloreto de amônio (30,19 g, 564,66 mmol) e agitou-se durante mais 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC. Após a conclusão da reação, a mistura foi filtrada e lavada com metanol. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e 0 resíduo foi triturado com éter dietílico (150 mL). O sólido formado foi filtrado e seco sob vácuo para fornecer cloridrato de 4-metiltiazol-2-carboximidamida (35,0 g, impuro) como um sólido esbranquiçado. Este material bruto foi utilizado na etapa seguinte sem mais purificação. MS (MH+): mz 142,0.

Etapa 5:

NaOEi (21%/EtOH)

EtOH, 80 °C, 2 h

[00044] Um balão de fundo redondo de dois gargalos equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com cloridrato de 4-metlltiazol“2-carboximidamida (35,0 g, bruto) em etanol (350 mL) e malonato de dietila (150,81 mL, 988,64 mmol). Etóxido de sódio (320 mL, 988,64 mmol, 21% em EtOH) foi adicionado gota a gota à temperatura ambiente e aquecido a 85 °C. Após 3 horas, a mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida. Adicionou-se água (20

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19/40 mL) e acidificou-se com HCI a 1,5 N (pH 2 a 3). O sólido obtido foi filtrado e seco sob vácuo para fornecer 2”(4-metntsazok2“H)pinmidína-

4,6-diol (29,0 g, impuro) como um sólido amarelo pálido. Este material bruto foi utilizado na etapa seguinte sem mais purificação. MS (MH+):

m/z = 210,0.

Etapa 6:

poci₃N,N-dietilanilina

100 °C, 2 h

32% (4 etapas)

[00045] Um balão de fundo redondo de dois gargalos equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com uma suspensão de 2-(4--metíltiazoh2--n) pirimidina-4,6-diol (29,0 g, bruto) e POCh (290 mL). Adicionou-se Ν,Ν-dietílanHina (37,84 mL, 235,85 mmol) à temperatura ambiente e aqueceu-se ap refluxo a 100 °C durante 2 horas. O progresso da reação foi monitorado por TLC. O excesso de POCh foi removido por destilação. O resíduo foi diluído com 500 mL de água fria, neutralizado com solução saturada de bicarbonate de sódio e extraído com éter dietílico (2 x 500 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (3 x 200 mL), salmoura (100 mL), secas sobre sulfato de sódio e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi triturado com n-pentano (100 mL). O sólido obtido foi filtrado e seco sob vácuo para fornecer 2-(4,6~dicloropirimidin2-il)-4-metiltiazol 7 (19,5 g, 79,59 mmol, 32% para quatro etapas) como um sólido amarelo claro. MS (MH+): m/z = 245,9.

Etapa 7:

C-S2CO3 ch₃cn °C, 16 h

84%

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20/40 [00046] Um balão de fundo redondo de dois gargalos equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com uma suspensão de 2-(4,6~dicloropirimidin-2-il)~4~metiltiazol (19,0 g, 77,56 mmol) e cloridrato de 4,4-difluorociclo-hexan-1-amina (13,30 g, 77,56 mmol) em acetonitrila (190 mL). Foi adicionado carbonato de cálcio (37,89 g, 116,34 mmol) e a mistura reacional foi aquecida a 80 °C durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC. A mistura reacional foi arrefecida até a temperatura ambiente, filtrada e o sólido foi lavado com acetato de etila (500 mL). O filtrado foi lavado com água (2 x 100 mL), salmoura (100 mL), seco sobre sulfato de sódio e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (60-120 de sílica-gel) eluída com 15% de EtOAc em hexano. As frações relevantes contendo o composto requerido foram combinadas e evaporadas até a secura sob pressão reduzida para fornecer 6-cloro-N-(4,4-difluorociclo-hexil)-2-(4-metiltiazol-2-il) pirimidln-4-amlna (22,5 g , 65,25 mmol, 84%) como um sólido esponjoso esbranquiçado. MS (MH+): m/z ·· 344,9.

Etapa 8:

NaOMe

MeOH 80 °C,16 h 87%

[00047] Um balão de fundo redondo de dois gargalos equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com 6-cloroN-(4,4-difluorociclo-hexil)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-amlna (27,0 g, 78,47 mmol) em metanol (450 mL). Metóxldo de sódio (21,19 g, 392,36 mmol) foi adicionado e aquecido a 80 °C por 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC. O excesso de metanol foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi diluído com solução aquosa a 10% de

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21/40 cloreto de amônio (100 mL) e extraído com acetato de etila (3 x 150 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2 x 100 mL), salmoura (100 mL), secas sobre sulfato de sódio e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (60-120 de sílica-gel) eluindo com 35 a 40% de EtOAc em hexano. As fracções relevantes contendo o composto alvo foram combinadas e evaporadas até à secura sob pressão reduzida para fornecer N-^Adifluorociclo-hexiO-ô-metóxi-^-^-metiltiazol-^-il) pirimidin-4-amina (3) (23,4 g, 68,82 mmol, 87%) como um sólido esbranquiçado. MS (MH+): m/z = 341,0. Dados Analíticos: ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ (7,41 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 5,81 (s, 1H), 3,87 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,08-1,89 (m, 6H), 1,61-1,52 (m, 2H).

(S)-1-(6-((4,4-d ifluorociclo-hexil)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4ii)etan-1 -oi

Etapa 1:

EtO'

F

Etapa 1 ?£%·

[00048] Um tubo selado de 250 mL, equipado com uma barra de agitação revestida com teflon (2 cm), foi carregado com uma solução de 6-cloro-N-(4,4-difluorociclo-hexil)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4amina (4,9 g, 14,24 mmol, 1,0 eq.) e tributil(1 -etoxivinil) estanano (5,65 g, 15,66 mmol, 1,1 eq.) em N,N~dimetilformamida (60 mL). A mistura reacional foi desgaseificada utilizando gás de argônio durante 5 a 10 minutos, seguida pela adição de dicloreto de bis (trifeniifosfina)paládio (II) (0,2 g, 0,28 mmol, 0,02 eq.). A mistura reacional foi selada e aquecida a 80 °C durante 16 h (a conclusão da reação foi determinada por LCMS) e arrefecida até a temperatura ambiente. A mistura reacional

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22/40 foi diluída com água (300 mL) e extraída com acetato de etila (2 x 150 mL). Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e evaporados para fornecer um produto bruto como um sólido pegajoso castanho claro. O material bruto foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexano como sistema solvente) para dar N~(4,4~difluorociclo~hexil)-6-(1-etoxivlnil)~2~(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-amina (4,1 g, 10,78 mmol, 75%) como um sólido esbranquiçado. MS (MH+): m/z -381,0.

Etapa 2:

73% [00049] Um balão de fundo redondo equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com N-(4,4-difluorociclohexil)-6-(1-etoxivlnil)~2~(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-amina (9,0 g, 23,67 mmol, 1,0 eq.) em acetona (120 mL), seguida pela adição de solução aquosa de ácido clorídrico a 2 N (20 mL). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas e a conclusão da reação foi determinada por LCMS. A mistura reacional foi concentrada para remover a acetona, diluída com água gelada (100 mL), basificada com solução saturada de carbonato de sódio e extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e evaporados sob pressão reduzida para fornecer um produto bruto como um sólido pegajoso castanho claro. O material bruto foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila/hexano como sistema de solvente) para fornecer 1-(6-((4,4difluorociclo-hexil)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il) pirimidin-4-il)etan-1-ona (6,1 g, 17,32 mmol, 73%) como um sólido esbranquiçado. MS (MH+):

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23/40 m/z “· 353,0.

Etapa 3:

NsBHMíTS eq)

MeOH.-ICPC. ih :»

[00050] Um frasco de fundo redondo equipado com uma barra de agitação revestida com teflon foi carregado com 1- (6-((4,4-difluorocl· clo-hexil)amino)-2-(4-metiltiazol·2-il) pirimidin-4-il)etan-1-ona (5,6 g, 15,90 mmol, 1,0 eq.) em metanol (80 mL) a -10 °C, seguido por borohidreto de sódio (0,302 g, 7,95 mmol, 0,5 eq.). A mistura reacional foi agitada na mesma temperatura durante 1 hora e a conclusão da reação foi determinada por LCMS. A mistura reacional foi extinta com água e concentrada sob pressão reduzida para remover o metanol. O resíduo foi diluído com água gelada (100 mL) e extraído com acetato de etila (2 x 100 mL). Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e evaporados sob pressão reduzida para fornecer HS-C^Adifluorociclo-hexiQamino^-^-metiltiazol^-iQpirimidin4-il)etan-1 -ol 4 (5,5 g, 15,53 mmol, 97%) como um sólido esbranquiçado de mistura racêmica. MS (MH+): m/z = 355,0.

Etapa 4:

{composto racêmico)

HPLC quiral

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24/40 [00051] O composto racêmico 1 -(6-((4,4-difluorociclo-hexil)amino)~ 2-(4-metiltiazol-2-il) pirimidin-4-il)etan-1 -oi 4 (5,5 g) foi purificado por HPLC quiral (Coluna: Chiralpak~IC (250 * 20 * 5,0 μ); Fase móvel A: N~ hexano (0,1% DEA), fase móvel B: IPA:DCM (90:10) isocrática: 50:50 (A:B); Taxa de fluxo: 15,0 mL/min; 120/inj; Tempo de execução: 15 min) para produzir (5)-1-(6 -((4,4-difluorociclo-hexil)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il) pirimidin-4-il)etan~1 ~ol 5 (2,1 g, 5,93 mmol, 38%) como um sólido esbranquiçado a partir das frações de eiuição inicial (pico-1, RT = 4,24 minutos). MS (MH+): m/z = 355,0. ¹H RMN (400 MHz, DMSOd6): δ 7,59-7,57 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,37 (s, 1H), 6,64 (s, 1H) 5,37-5,36 (d, J - 4,4 Hz, 1H), 4,52-4,50 (t, J = 11,2 Hz, 5,6 Hz, 1H), 4,05 (bs, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,10-1,96 ( m, 6H), 1,62-1,59 (m, 2H), 1,35-1,33 (d, J = 6,4 Hz, 3H). Outro enantiômero: (R)-1-(6-((4,4-difluorociclo-hexil) amino)-2-(4-metiltiazol~2~il) pirimidin-4-il)etan-1 -ol 6 (2,05 g, 5,78 mmol, 37%) como um sólido esbranquiçado a partir das frações de eiuição secundárias (Pico 2, RT = 6,45 minutos). MS (MH+): m/z = 355,0. ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,60-7,59 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,37 (s, 1H), 6,64 (s, 1H), 5,38 (bs, 1H), 4,52-4,51 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 4,10 (bs, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,10-1,91 (m, 6H), 1,65-1,57 (m, 2H), 1,351,34 (d, J ~6,8 Hz, 3H).

2-(3-ciclopropil-1H-pirazol·1-il)-N-(4,4-difluorociclo-hexil)-6-morfolinopirimidin-4-amina

Etapa 1:

[00052] Um frasco de fundo redondo, de três gargalos, seco em

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25/40 chama, de 1000 mL, equipado com uma barra de agitação revestida com teflon (3 cm), um septo (gargalo 1), tampa (gargalo 3) e condensador de refluxo equipado com o adaptador de tubo em U preenchido com óleo (gargalo 2), foi carregado com uma solução de 4,6-dicloro-2(metiltio) pirimidina (150 g, 768,94 mmol, 1,0 eq.) em acetonitrila (1500 mL) seguido de cloridrato de 4,4-difluorociclo-hexilamina (158,35 g, 922,733 mmol) e carbonato de césio (526 g, 1614 mmol, 2,1 eq.). A mistura reacional foi aquecida a 75 °C durante 16 h. A mistura reacional foi filtrada para remover o carbonato de cálcio, depois o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer 210 g (93% de rendimento) de 6~cloro~N~(4,4~difluorociclo~hexil)-2-(metiltio)pirimidin~4~ amina como um sólido amarelo pálido. MS (MH+): m/z ™ 294,0.

Etapa 2:

[00053] Uma solução de 6-cloro-N-(4,4-difluorociclo-hexil)~2~(metil~ tio)pirimidin-4-amina (60 g, 204,24 mmol, 1,0 eq.) e morfolina (35,6 ml, 408,48 mmol, 2,0 eq.) em acetonitrila (600 mL) foi aquecida a 85 °C em um tubo selado durante 16 h. Após conclusão da reação, a mistura reacional foi concentrada e o resíduo resultante foi extinto com água gelada. O sólido obtido foi filtrado e lavado com água (500 mL), hexano (250 mL), seco sob alto vácuo para fornecer N~(4,4~difluorociclo~ hexil)-2- (metiltio)-6-morfolinopirimidin-4-amina como um sólido esbranquiçado (62 g, 88% de rendimento). MS (MH+): m/z = 345,2.

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Etapa 3:

[00054] Um frasco de 100 mL, de fundo redondo, seco em chama, com três gargalos, equipado com barra de agitação revestida com teflon (3 cm), um septos (gargalo 1), tampa (gargalo 3) e condensador de refluxo equipado com o adaptador de tubo em U preenchido com óleo (gargalo 2), foi carregado com uma solução de N-(4,4~difluorociclo-hexil)-2- (metiltio)-6-morfolino-pirimidin-4-amina (1 g, 2,90 mmol) em 15 mL de tetra-hidrofurano seguido por 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,1 g, 0,87 mmol, 0,3 eq.), trietilamina (1,2 mL, 8,71 mmol, 3,0 eq.) e anidrido Boc (3,16 g, 14,51 mmol, 5,0 eq.) então a mistura reacional foi aquecida a 80 °C durante 16 h. Depois de completada a reação, a mistura reacional foi extinta com água e extraída com acetato de etila (2 x 75 mL). A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para fornecer carbamato de (4,4-difluorociclohexil)(2- (metiltio)-6-morfolino-pirimidin-4-il)terc-butila como uma goma amarela (1,1 g, 85%). MS (MH+): m/z = 445,2.

Etapa 4:

[00055] Um balão de 100 mL de fundo redondo de gargalo único,

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27/40 ligado a um condensador de refluxo equipado com um adaptador de tubo em U de entrada e saída de gás nitrogênio preenchido com óieo, uma barra de agitação revestida com teflon (1 cm), foi carregado com uma solução de carbamato de (4,4-difluorociclo-hexil)(2-(metiltio)“6“ morfolínopirimidín4il)terc-butila (50 g, 112,47 mmol) em diclorometano (600 mL) seguido por ácido 3-cloroperbenzoico (ácido m-cloroperbenzoico) (58,2 g, 337,42 mmol, 3,0 eq.) a 0 °C. A mistura reacional foi lentamente aquecida até a temperatura ambiente e agitada durante 30 minutos. Após a conclusão da reação, a mistura reacional foi extinta com solução saturada de bicarbonato e extraída com diclorometano (2 x 250 mL). A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para fornecer carbamato de (4,4-difluorociclo-hexil)(2~(met!lsulfonil)6morfolinopirimidin4il)terCbutila como uma goma branca (52 g, 97% de rendimento). MS (MH+): m/z ™ 477,3.

Etapa 5:

[00056] Um balão de 100 mL de fundo redondo de gargalo único, ligado a um condensador de refluxo equipado com um adaptador de tubo em U de entrada e saída de gás nitrogênio preenchido com óieo, uma barra de agitação revestida com teflon (2 cm), foi carregado com uma solução de carbamato de (4,4-difluorociclo-hexil)(2-(metilsulfonil) 6~morfolinopirimidin--4il)terc-butila (0,9 g, 1,88 mmol) em acetonitrila (10 mL) seguido de 3-ciclopropil-IH-pirazol (0,3 g , 2,83 mmol, 1,5 eq.) e carbonato de césio (1,23 g, 3,77 mmol, 2,0 eq.). A mistura reacional foi aquecida a 80 °C durante 16 horas, e a conclusão da reação foi determinada por TLC e LCMS. A mistura reacional foi filtrada e o filtrado

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28/40 foi concentrado. O produto bruto foi purificado através de cromatografia em coluna utilizando 60-120 de sílica-gel com acetato de etila-éter de petróleo como sistema de solvente. O material isolado foi seco sob vácuo para fornecer carbamato de (2-(3-ciclopropil-1 H-pirazol-1 -il)-6morfolinopirimidin-4-il)(4,4-difluorociclo-hexil)terc-butila como um sólido esbranquiçado (0,8 g, 84%). MS (MH+): m/z ™ 505.

Etapa 6:

[00057] Um frasco de 100 mL de fundo redondo, seco em chama, com três gargalos, equipado com uma barra de agitação revestida com teflon (2 cm), um septo (gargalo 1), tampa (gargalo 3) e adaptador de tubo em U de entrada e saída de gás nitrogênio preenchido com óleo (gargalo 2), foi carregado com uma solução de carbamato de (2-(3ciclopro pi I-1 H-pirazol-1 -il)~6~morfolinopirimidin-4-il) (4,4-difluorociclohexil)terc-butila (1,2 g, 1,98 mmol, 1 eq.) em diclorometano (40 mL) seguido de ácido trifluoroacético (2,5 mL, 32,55 mmol, 16,4 eq.) a 0 °C. A mistura reacional foi lentamente aquecida até a temperatura ambiente e agitada na mesma temperatura durante 6 horas. A conclusão da reação foi determinada por TLC e UPLC. A mistura reacional foi concentrada e o resíduo resultante foi extinto com solução saturada de bicarbonate de sódio a 10%, extraída com acetato de etila (2 x 100 mL) e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. O produto bruto foi purificado através de cromatografia em coluna utilizando 60-120 de sílica-gel, acetato de etila-éter de petróleo como sistema de solvente. O sólido resultante foi seco sob vácuo para fornecer

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2-(3-ciclopropil-1 H-plrazol-1 -ll)-N-(4,4-difluorociclo-hexll)-6morfolinopirimidin-4-amina 7 (0,73 g, 90%). MS (MH+): m/z = 405. Dados analíticos: ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,39 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,14 (d, J = 2,80 Hz, 1H ), 5,53 (s, IH), 3,88 (s, IH), 3,69-3,67 (m, 4H), 3,50 (m, 4H), 1,99-1,90 (m, 7H), 1,561,54 (m, 2H), 0,93-0,89 (m, 2H), 0,72-0,71 (m, 2H).

ENSAIOS BIOLÓGICOS [00058] A atividade biológica foi determinada da seguinte forma. A corrente iônica através dos canais de K* ativados com Ca²⁺ de pequena condutância (canais SK, subtipo 2) foi medida usando a configuração de célula inteira da técnica de patch-damp em um patch-damp preparado usando HEK293 células de cultura de tecido expressando canais SK2 como descrito em Hougaard et aL, British Journal of Pharmacology 151, 655 a 665, 8 de maio de 2007, cujos ensinamentos inteiros são aqui incorporados por referência. Em um aspecto, um composto é definido como sendo um modulador alostérico positivo de SK (PAM) se o composto aumenta a corrente neste ensaio, por exemplo, se o valor de SC100 do composto for inferior ou igual a 10 μΜ conforme determinado por este ensaio. O valor SCwo é definido como sendo a concentração do composto que aumenta a corrente basal em 100%. [00059] O valor SC100 é dado na Tabela 1.

[00060] Ratos Sprague Dawley machos foram administrados com veículo, 10 ou 30 mg/kg de composto 1 por administração oral 30 minutos antes da injeção de harmalina para investigar o efeito terapêutico do composto 1 no tremor induzido por harmalina. Imediatamente após a injeção de harmalina, os animais foram colocados no aparelho de quantificação de tremor e os eventos de tremor foram quantificados durante 60 minutos. Um sinal de evento de tremor foi gerado quando uma pequena banda transmissora de metal encaixada na parte dianteira direita do animal se movia dentro do campo eletromagnético ge

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30/40 rado por uma antena de laço dentro do aparato de teste. As saídas do amplificador foram digitalizadas a uma taxa de amostragem de 1.000 Hz e o sinal foi processado e analisado usando o software LabView (National Instruments). Para minimizar o sinal do comportamento ambulatorial e a preparação, o sinal foi filtrado com um filtro de média móvel não ponderada de 128 ms, e eventos com amplitudes > 0,5 V e duração > 300 ms em duração foram contados como um evento de tremor. Os dados foram analisados em caixas de um minuto ao longo do teste e apresentados como a soma de eventos de tremor ao longo de todo o teste de 60 minutos. Como mostrado pela Figura 1, foi observada uma inibição significativa dos tremores a uma dose de 30 mg/kg de Composto 1.

[00061] A redução do tremor com o Composto 1 também foi demonstrada pela medição da frequência do tremor de corpo inteiro através de um acelerômetro de placa de força.

[00062] O tremor de corpo inteiro foi medido por um Monitor de Trem de San Diego Instruments (San Diego, Califórnia, EUA). Os animais foram pré-tratados com 3, 10 ou 30 mg/kg do Composto 1 por via oral 30 minutos antes da administração intraperitoneal de 5 mg/kg de harmalina. O tremor foi medido durante 30 minutos após a administração de harmalina e os dados foram analisados por transformada rápida de Fourier e reportados como um espectro de potência de frequência. A harmalina induziu um aumento significativo no espectro de potência em uma faixa de frequências entre 10 e 14 Hz. Nesta faixa, 3, 10 e 30 mg/kg, todos reduziram significativamente o tremor. Os dados foram ainda analisados calculando a percentagem de Potência de Movimento (% MP), definida como a potência na faixa de 9 a 13 Hz dividida pela potência total através do espectro (0 a 30 Hz) multiplicada por 100. Por esta análise, 3, 10 e 30 mg/kg reduziram significativamente o tremor induzido por harmalina (harmalina + veículo (n = 13);

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31/40 harmalina + 3 mg/kg de Composto 1 (n = 8), P < 0,01; 10 mg/kg de Composto 1 (n = 16) e 30 mg/kg de Composto 1 (n ~ 13), respectivamente, P < 0,05) (Figura 2).

[00063] Em conjunto, estes dados mostram que o Composto 1 reduz significativamente o tremor induzido por harmalina medido por dois desenhos experimentais diferentes.

[00064] A extensão em que os compostos modulam os canais SK2 /n vivo é expressa como % de SK2 SCwo, que é a razão entre a concentração do fármaco livre no cérebro e a potência medida do composto no canal SK2. É calculado do seguinte modo: Cfb = Cmb x BFF, em que Cmb é a concentração do composto medida por espectrometria de massa de cromatografia líquida a partir de cérebros coletados imediatamente após o registo de tremores (Tabela 1, Concentração de Cérebro Medido). Cfb é a quantidade de composto livre não complexado com proteína e, portanto, livre para interagir com o canal SK2 (Tabela 1, Concentração Cerebral Livre Calculada). BFF é a fração livre média do composto conforme medido por diálise de equilíbrio em experiências separadas (concentração de teste de 1 nM incubada em 10% de homogeneizado de tecido cerebral de rato durante 5 horas a 37 °C) (Tabela 1, Fração Livre do Cérebro). O fármaco livre no cérebro disponível para interagir com os canais SK2 (Cfb) é obtido pela multiplicação do nível cerebral total medido (Cmb) pela fração livre média (BFF).

[00065] A quantidade de composto livre é então expressa em termos da sua potência em relação ao canal SK2, como se segue:% SK2 SCwo = Cfb/SK2 SCwo x 100, em que SK2 SCwo (Tabela 1, SK2 SCwo) é o valor medido da potência do composto nos canais SK2 e % SK2 SCwo (Tabela 1, % SK2 SCwo) é a concentração cerebral livre (Cfb) normalizada para SK2 SCwo. Os valores são apresentados na Tabela 1.

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Tabela 1

Composto	Dose minimamente eficaz (mg/Kg)	Concentração cerebral medida (μΜ)	Fração livre cerebral medida
1	30	1,3	0,065

Tabela 1 - continuação-

Composto	Concentração cerebral livre calculada (μΜ)	SK2 SCioo medido (μΜ)	% SK2 SCioo calculado
1	0,08	0,5	16

Efeito na Irregularidade de Queima de Células de Purkinje em Fatias

Ex Vivo de Ratos Transgênicos SCA2 58Q [00066] Em fatias cerebelares de camundongos SCA2 58Q, neurônios Purkinje exibem disparo caótico, mensurável como um aumento no coeficiente de variação do intervalo entre picos (ISI CV), uma medida da regularidade do intervalo de disparo entre os potenciais de ação. A diferença no ISI CV entre camundongos do tipo selvagem (N = 8) e SCA2 58Q (N = 11) está Ilustrada na Figura 3 (P < 0,005). Também foi demonstrada, a aplicação sequencial do banho de 1 (N = 11) ou 3 μΜ (N = 10) o Composto 1 reverteu parcialmente o aumento no ISI CV observado em fatias cerebelares de camundongos SCA2 58Q de onze meses de idade (P < 0,05). Estes dados indicam que o Composto 1 regulariza o disparo de Purkinje, restaurando parcialmente o intervalo entre entre picos neste modelo de camundongo de Ataxia Espinocerebelar.

Avaliação do efeito do composto no modelo de camundongo de desequilíbrio de Ataxia Episódica 2 (EA2) [00067] O Composto 1 demonstrou eficácia em modelos animais validados de ataxia hereditária (EA2) e ET (tremor induzido por harmalina). Para testar se o Composto 1 pode aliviar a ataxia em um modelo de doença, ele foi avaliado no modelo de camundongos de desequilíbrio de EA2. Esses camundongos apresentam uma ataxia basal que

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33/40 surge da irregularidade na ativação do marca-passo de Purkinje devido a uma mutação de perda de função nos canais P/Q Ca²⁺ (a mesma proteína mutada na SCA6), que causa a Ataxia Episódica 2 (EA2). Os animais foram avaliados no aparelho de fundo de haste paralela que conta automaticamente o número de vezes que o pé do animal desliza através das hastes de metal uniformemente espaçadas e a distância total que o animal percorre. A ataxia basal foi então expressa como a Razão de Ataxia, que é o número total de patas divididas pela distância total que o animal percorre em centímetros. O aumento da Razão de Ataxia entre camundongos do tipo selvagem e EA2 está ilustrado na Figura 4.

[00068] Neste estudo, camundongos EA2 (8 a 10 meses; n - 18) foram injetados Intraperltonealmente com o Composto 1 ou veículo 30 minutos antes de serem colocados no aparelho de piso paralelo da haste. Os animais foram avaliados em um desenho de estudo cruzado com cada animal recebendo ambos veículo e 10 mg/kg do Composto

1. Três dias foram permitidos entre as doses para a lavagem do composto. Na dose administrada neste estudo, o Composto 1 inverteu totalmente o aumento na Razão de Ataxia observada em EA2 versus camundongos do tipo selvagem. Estes dados indicam que o Composto 1 restaura o desempenho normal nesta medida da função motora em um modelo de ataxia cerebelar hereditária.

Vantagens comparativas [00069] Os estudos seguintes ilustram vantagens técnicas adicionais dos compostos aqui divulgados.

[00070] Os testes de solubilidade aquosa (solubilidade cinética) dos compostos foram realizados em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4), medida pelo método de agitação em balão. Neste ensaio, a solução de reserva de DMSO do composto de teste adicionada ao tampão seguido por equilíbrio (agitação), filtração e determinação da

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34/40 quantidade solúvel por HPLC-UV. As condições utilizadas no ensaio estão resumidas abaixo. Os resultados são mostrados na Tabela 2 e na Tabela 3.

- Concentração de compostos: 200 μΜ com 1% de DMSO (n = 2)

- Tampão aquoso: Sistema de tampão fosfato 0,05 M pH 7,4

- Período de equilíbrio: 16 horas à temperatura ambiente (>23 °C) com agitação

- Preparação da amostra: filtração

-Análise: HPLC-UV

- Compostos de referência: cafeína (alta solubilidade) e dietilestilbestrol (baixa solubilidade) [00071] O perfil de estabilidade metabólica dos compostos foi realizado em microssomas hepáticos. Neste ensaio, o composto de teste é incubado com microssomas hepáticos na presença de NADPH durante 2 pontos de tempo a 37 °C. No final da incubação, a reação é extinta com acetonitrila contendo padrão interno e o restante do composto remanescente é determinado por LC-MS/MS. As condições utilizadas no ensaio estão resumidas abaixo. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

- Tempo de incubação: 0 e 30 minutos a pH 7,4, 37 °C

- Concentração de ensaio: 1 μΜ em 0,02% de DMSO a pH 7,4 (n = 2)

- Concentração de NADPH no ensaio: 1 mM

- Concentração de proteínas no microssoma hepático no ensaio: 0,5 mg/ml

- Análise: LC-MS/MS

- Dados relatados: % do remanescente do composto principal (% PCR)

- Compostos de referência para alta e baixa folga estão incluídos

- Espécie testada: camundongo, rato, cão, macaco e humano [00072] Os compostos aqui descritos foram testados quanto à inibição de CYP através de 5 isoformas (3A4, 2D6, 2C9, 2C19 e 1A2).

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Neste ensaio, os substratos específicos de isoforma GYP são incubados com microssomas de fígado humano (HLM) na presença de compostos de teste e a formação de metabolites é determinada. A percentagem de inibição da formação de metabolites a diferentes concentrações do composto de teste é calculada e a IC50 é determinada. As condições utilizadas no ensaio estão resumidas abaixo. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

- Concentração de fármaco de teste (inibidor): 8 concentrações diferentes (100 μΜ a 0,005 μΜ)

- Matriz: Microssoma Hepático Humano (Invitrogen, life technologies)

- Substratos de sonda específicos serão utilizados para as isoformas, conforme abaixo:

- CYP3A4: Midazolam

- CYP2D6: Bufuralol

- CYP2C9: diclofenaco

- CYP2C19: Mefinltoína

- CYP1A2: fenacetina

- Cofatores: NADPH (final 1 mM no ensaio)

- Análise de Amostra: LC-MS/MS (metabolites)

- Inibidores específicos de referência incluídos em todos os ensaios (Cetoconazol/Quinidina/Sulfafenazol/ Ticlopidina/Furafilina)

- Tampão: Tampão fosfato de potássio (100 mM) pH 7,4

- Nível de DMSO no ensaio: 0,1%

- Análise de dados: % de inibição sobre 0 controle [00073] Os compostos foram testados em um ensaio hERG de canal de potássio cardíaco. O hERG é responsável por uma corrente retificadora de atraso rápido (IKr) nos ventrículos humanos. A inibição da IKr é a causa mais comum de prolongamento do potencial de ação cardíaca por fármacos não cardíacos. Ver, por exemplo, Brown, A.M. e Rampe, D. (2000). Drug-induced long QT syndrome: is HERG the root

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36/40 of all evil? Pharmaceutical News 7, 15 a 20.

[00074] Células HEK-293 foram estavelmente transfectadas com cDNA de hERG. Os transfectantes estáveis foram selecionados por coexpressâo com o gene de resistência a G418 incorporado no plasmídeo de expressão. A pressão de seleção foi mantida incluindo G418 no meio de cultura. As células foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco/Mistura de Nutrientes F-12 (D MEM/F-12) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina G sádica, 100/mL de sulfato de estreptomicina e 500 pg/mL de G418. Registros de cultura celular são mantidos em arquivo no Charles River Laboratories.

[00075] As células foram transferidas para a câmara de gravação e superfundidas com solução de controle de veículo. A solução de pipeta para as gravações de células inteiras foi (composição em mM): aspartato de potássio, 130; MgCb, 5; EGTA, 5; ATP, 4; HEPES, 10; pH ajustado a 7,2 com KOH. A solução de pipeta foi preparada em lotes, dividida em alíquotas, armazenada congelada e uma nova alíquota descongelada a cada dia. As pipetas de adesivo foram feitas a partir de tubos capilares de vidro usando um extrator de micropipeta P 97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Um amplificador de grampo de remendo comercial foi usado para gravações de célula inteira. Antes da digitalização, os registros atuais eram filtrados em baixa passagem em um quinto da frequência de amostragem.

[00076] A inibição da corrente hERG no início e estado estacionário foi medida usando um padrão de pulso com amplitudes fixas (prépulso: 20 mV por 2 s; pulso de teste: -50 mV por 2 s) repetido em intervalos de 10 s, a partir de um potencial de retenção de --80 mV. A corrente de cauda de pico foi medida durante a etapa de 2 s para -50 mV.

[00077] Uma concentração de artigo de teste foi aplicada a cada

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37/40 célula (η ™ 3). A corrente máxima foi medida durante a rampa de teste. Um estado estacionário foi mantido por pelo menos 30 segundos antes da aplicação do artigo de teste ou controle positivo. A corrente máxima foi medida até que um novo estado estacionário fosse alcançado. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

[00078] Os dados de biodisponibilidade oral foram coletados em ratos como se segue. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

- Cepa de ratos/sexo: Sprague Dawley/Masculino

- Idade/peso corporal: 6 a 8 semanas/250 a 300 g

- No. de animais por grupo: n = 3

- Total No. de grupos: 2 (1mpk IV e 10mpk PO)

- Via de administração: Oral (PO)/lntravenosa (IV)

- Volume de dosagem: Intravenoso (2 ml/kg) e Oral (10 ml/kg)

- Veículos de formulação: formulações padrão ou sugeridas pelo Patrocinador

- Níveis de dose (IV e Oral): 1 mg/kg; intravenosa e 10 mg/kg; oral ou como sugerido

- Jejum/alimentação: A dose oral será realizada com animais em jejum durante a noite

- Frequência de dosagem: dose única

- Pontos temporais para a coleta de sangue: (57 amostras de plasma para análise)

- IV - 10 pontos (pré-dose; 5 minutos; 15 minutos; 30 minutos; 1 h; 2 h;

h; 6 h; 8 h; 24 h) [n = 3 ratos]

- PO - 9 pontos (pré-dose; 15 minutos; 30 minutos; 1 h; 2 h; 4 h; 6 h; 8 h; 24 h) [n ™ 3 ratos]

- Coleta de amostras de sangue: cânula da veia jugular

- Antícoagulante: 0,2% K2 EDTA

- Análise de amostras pelo método bioanalítico de grau de descoberta desenvolvido para estimativa do composto de teste no plasma usando

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38/40 sistemas LC-MS/MS.

Tabela 2

	„F \| i ^R A X Ά Λι X Ν' 'N N Composto 1	ην'Άχ ô H₃C'^N^V'V-CI-I₃ H₃C; ~~ Comparador A	ι·τΆ qAA-v*, Comparador B
Potência de SK2 (SC_W0)^a	400 nM	1380 nM	5800 nM
Fração livre cerebral³	6,1%	1,2%	NA
Solubilidade cinética (mg/mL)	0,074	0,017	NA
Estabilidade miorossomal do fígado'	Camundongo	47%	1%	NA
Rato	60%	1%	NA
Cachorro	54%	2%	NA
Macaco	46%	1%	NA
Humano	84%	50%	NA
Inibição de Cyp1A2 (iC_₀)	> 10 uM	640 nM	NA
Inibição de Cyp3A4 (IC₅₀)	> 10 uM	> 10 uM	NA
Inibição de Cyp2D6 (IC₅₀)	> 10 uM	790 nM	NA
Inibição de hERG (IC₅₀)	> 10uM	> 10 uM	NA
Biodisponibilidade oral^§	81%	5%	NA

SC100 = Concentração que produz a duplicação da corrente do canal ^a Pequena discrepância em número quando comparada com a tabela anterior devido a diferenças insignificantes nas médias obtidas de experimentos posteriores, t % restante em 1 hora § 10 mg/kg PO, 0,5 mg/kg IV em ratos [00079] Como mostrado pelos dados na Tabela 2 acima, 0 Composto 1 é 3 vezes mais potente no SK2 e depois no Comparador A e mais de 14 vezes mais potente no SK2 e depois no Comparador B. O Composto 1 também tem melhor solubilidade, maior BFF, maior esta

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39/40 bilidade microssomal e maior biodisponibilidade oral do que o Comparador A. Uma melhoria global em BFF e solubilidade em relação ao Comparador A e derivado fenila do Composto C também foi demonstrada através dos compostos aqui descritos como mostrado na Tabela 3. O Composto 1 é reproduzido de cima para facilidade de comparação. Tabela 3

	Fração livre cerebral	Solubilidade cinética(mg/mL)
^431 N O^J Comparador C	0,16%	0,001
Γ Π ~ Λ A ,N p N N __ Composto 1	6,1%	0,074
F Η N íl N _XÃ.. AÃ. „n MeO N N -x _cH₃ h₃c Composto 2	2,76%	0,031
F /\à__F A., MeO N T' \„... sA Composto 3	2,69%	0,0709

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40/40

	Fração livre cerebral	Solubilidade cinética(mg/mL)
F Λ OH S~# Composto 5	4,20%	0,0803
F /V-F Á oh s-/ Composto 6	4,31%	0,0667
_ F ( y-F Ç N N N V-Z O-Y 'ssj Composto 7	1,55%	0,0497

[00080] Embora tenha sido descrito um número de modalidades desta invenção, é evidente que os exemplos básicos podem ser alterados para fornecer outras modalidades que utilizam os compostos e métodos desta invenção. Por conseguinte, será reconhecido que o escopo desta invenção deve ser definido pelas reivindicações anexas em vez de pelas modalidades específicas que foram representadas a título de exemplo.

[00081] O conteúdo de todas as referências (incluindo referências de literatura, patentes emitidas, pedidos de patente publicados e pedidos de patente copendentes) citados ao longo deste pedido são aqui expressamente incorporados na sua totalidade por referência. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados são concedidos com o significado vulgarmente conhecido por uma pessoa versada na técnica.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto caracterizado pelo fato de ter a fórmula:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um composto como definido na reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
3. Método de tratamento de uma doença ou condição responsive à modulação do canal de potássio ativado por cálcio de pequena condutância (canal SK) em um indivíduo com necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar um composto como definido na reivindicação 1 ao indivíduo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou a composição como definida na reivindicação 2.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é resposta à modulação do canal SK2.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é selecionada de uma doença neurodegenerativa, demência, doença cardíaca, sintomas de absti

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2/2 nência associados ao término da dependência, doença metabólica e doença da bexiga.
6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é selecionada de ataxia, distonia, tremores, doença de Parkinson, isquemia, lesão cerebral traumática, esclerose lateral amiotrófica, hipertensão, aterosclerose, diabetes, arritmia, bexiga hiperativa e sintomas de abstinência causados pelo término do abuso de álcool e outros fármacos proibidas.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é tremor essencial.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é ataxia.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é ataxia espinocerebelar.