BR112016009786B1 - compostos inibidores de indoleamina 2,3-dioxigenase e seus processos de síntese - Google Patents

Abstract

INIBIDORES DE INDOLEAMINA 2,3-DIOXIGENASE E SEU PROCESSO DE SÍNTESE. O presente pedido é dirigido a processos e intermediários para preparar 4-({2-[(aminossulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N'-hidroxi- 1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida, que é um inibidor da indolamina 2,3-dioxigenase, úteis no tratamento do câncer e outros distúrbios.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório US 61/901.689, depositado em 8 de novembro de 2013, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DE INVENÇÃO

[002] O presente pedido refere-se aos processos e intermediários para preparar 4-({2-[(aminossulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4- fluorofenil)-N'-hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida, que é um inibidor da indolamina 2,3-dioxigenase úteis no tratamento do câncer e outros distúrbios.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Triptofano (Trp) é um aminoácido essencial necessário para a biossíntese de proteínas, niacina e do neurotransmissor 5- hidroxitriptamina (serotonina). A enzima indolamina-2,3-dioxigenase (também conhecida como INDO ou IDO) catalisa a primeira etapa e taxa de limitação na degradação de L-triptofano a N-formil-quinurenina. Em células humanas, uma depleção de Trp resultante da atividade IDO é um proeminente mecanismo efetor antimicrobiana induzível por interferon gama (IFN-Y). A estimulação de IFN-y induz a ativação de IDO, o que leva a uma depleção de Trp, interrompendo, deste modo, o crescimento de agentes patogênicos intracelulares dependentes de Trp, tais como o Toxoplasma gondii e Chlamydia trachomatis. A atividade de IDO também tem um efeito antiproliferativo em muitas células tumorais, e a indução de IDO foi observada in vivo durante a rejeição de tumores alogeneicos, indicando um possível papel para esta enzima no processo de rejeição de tumor (Daubener, et al., 1999, Adv. Exp. Med. Biol., 467: 517-24; Taylor, et al., 1991, FASEB J., 5: 2516-22).

[004] Tem-se observado que as células HeLa co-cultivadas com linfócitos de sangue periférico (PBL), adquirem um fenótipo imuno- inibidor por meio de regulação positiva de atividade de IDO. Uma re- dução na proliferação de PBL por tratamento com interleucina-2 (IL2) parece que resulta da IDO liberada pelas células tumorais em resposta à secreção IFNG pelos PBLs. Este efeito foi revertido por tratamento com 1-metil-triptofano (1MT), um inibidor da IDO específico. Foi pro- posto que a atividade IDO em células tumorais pode servir para preju- dicar respostas antitumorais (Logan, et al., 2002, Immunology, 105: 478-87).

[005] Recentemente, um papel imuno-regulador da depleção de Trp tem recebido muita atenção. Várias linhas de evidência sugerem que IDO está envolvida na indução da tolerância imunológica. Estudos de gravidez de mamíferos, a resistência de tumores, infecções crôni- cas e doenças autoimunes têm mostrado que as células que expres- sam IDO podem suprimir respostas de células T e promovem a tole- rância. Catabolismo acelerado de Trp tem sido observado em doenças e distúrbios associados com a ativação imunológica celular, tais como infecção, malignidade, doenças autoimunes e AIDS, bem como duran- te a gravidez. Por exemplo, o aumento dos níveis de IFN e níveis ele- vados de metabolitos urinários de Trp tem sido observado em doenças autoimunes; tem sido postulado que a depleção sistêmica ou local de Trp que ocorre em doenças autoimunes podem estar relacionadas com a degeneração e sintomas wasting destas doenças. Em apoio a esta hipótese, foram observados níveis elevados de IDO em células isoladas a partir da sinóvia de articulações artríticas. Os IFNs também são elevados em pacientes com vírus da imunodeficiência humana (HIV) e níveis de IFN aumentados estão associadas a um prognóstico de piora. Assim, foi proposto que IDO é induzida cronicamente pelo vírus HIV, e é ainda aumentada por infecções oportunistas, e que a perda crônica de Trp inicia mecanismos responsáveis pela caquexia, demência e diarreia e, possivelmente, a imunossupressão dos pacien- tes com AIDS (Brown, et al., 1991, Adv. Exp. Med. Biol., 294: 425-35). Para este fim, foi recentemente mostrado que a inibição de IDO pode aumentar os níveis de células T específicas do vírus e, concomitante- mente, reduzir o número de macrófagos viralmente infectados em um modelo de camundongo de HIV (Portula et al., 2005, Blood, 106: 2382- 90).

[006] Acredita-se que IDO desempenhe um papel nos processos imunossupressores que evitam a rejeição do feto no útero. Mais de 40 anos atrás, observou-se que, durante a gravidez, o concepto de mamí- feros geneticamente díspares sobrevive apesar do que seria previsto pela imunologia de transplante de tecido (Medawar,1953, Symp. Soc. Exp. Biol. 7: 320-38). A separação anatômica da mãe e do feto e a imaturidade antigênica do feto não podem explicar totalmente a sobre- vida do enxerto fetal. Recente atenção tem-se centrado na tolerância imunológica da mãe. Porque IDO é expressa por células de sinciotro- foblasto humano e a concentração de triptofano sistêmica cai durante a gravidez normal, foi colocada a hipótese de que a expressão IDO na interface materno-fetal é necessária para evitar a rejeição imunológica dos aloenxertos fetais. Para testar esta hipótese, as camundongas grávidas (que transportam fetos singeneicos ou alogeneicos) foram expostas a 1MT, e foi observada uma rejeição de células T induzida rápida de todos conceptos alogeneicos. Assim, ao catabolizar triptofa- no, o concepto dos mamíferos parece suprimir a atividade de células T e defende-se contra a rejeição, e o bloqueio do catabolismo do tripto- fano durante a gravidez de murino permite que as células T maternas provoquem a rejeição de aloenxerto fetal (Munn, et al., 1998, Science, 281: 1191-3).

[007] Evidência adicional para um mecanismo de resistência imunológica tumoral baseada em degradação do triptofano por IDO vem da observação de que a maioria dos tumores humanos expres- sam constitutivamente IDO, e que a expressão de IDO por células tu- morais de camundongo imunogênico impede a sua rejeição por ca- mundongos previamente imunizados. Este efeito é acompanhado por uma falta de acumulação de células T específicas no local do tumor e pode ser parcialmente revertido por tratamento sistêmico de camun- dongos com um inibidor de IDO, na ausência de toxicidade evidente. Assim, sugeriu-se que a eficácia da vacinação terapêutica de doentes com câncer poderia ser melhorada pela administração concomitante de um inibidor de IDO (Uyttenhove et al., 2003, Nature Med., 9: 1269- 74). Também tem sido mostrado que o inibidor da IDO, 1-MT, pode sinergizar com agentes quimioterápicos para reduzir o crescimento de tumores em camundongos, sugerindo que a inibição de IDO pode também aumentar a atividade antitumoral de terapias citotóxicas con- vencionais (Muller et al., 2005, Nature Med., 11: 312-9).

[008] Um mecanismo que contribui para a falta de responsividade imunológica para tumores pode ser a apresentação de antígenos tu- morais por APCs hospedeiras tolerogênicas. Um subconjunto de célu- las humanas que expressam IDO apresentadoras de antígeno (APCs), que co-expressaram CD123 (IL3RA) e CCR6 e inibiram a proliferação de células T também foram descritos. Ambas as células dendríticas CD123 positivas maduras e imaturas suprimiram a atividade de células T, e essa atividade supressora da IDO foi bloqueada por 1MT (Munn, et al., 2002, Science, 297: 1867-70). Também tem sido demonstrado que linfonodos de drenagem de tumor em camundongos (TDLNs) con- têm um subconjunto de células dendríticas plasmocitoides (pDCs) que expressam constitutivamente níveis imunossupressores de IDO. Ape- sar de compreendendo apenas 0,5% de células de linfonodos, in vitro, estes pDCs potentemente suprimiram as respostas das células T aos antígenos apresentados pelos próprios pDCs e também, de uma forma dominante, suprimiram as respostas das células T aos terceiros antí- genos apresentados por APC não supressor. Dentro da população das pDCs, a maioria da atividade supressora mediada por IDO funcional segregada com um novo subconjunto das pDCs que co-expressam o marcador CD19 de linhagem B. Assim, se a hipótese de que a supres- são mediada por IDO por pDCs em TDLNs cria um microambiente lo- cal isto é potentemente supressor das respostas de células T antitu- morais hospedeiras (Munn, et al., 2004, J. Clin. Invest., 114(2): 280- 90).

[009] IDO degrada a fração indol do triptofano, serotonina e mela- tonina, e inicia a produção de metabolitos neuroativos e imunorregula- dores, conhecidas coletivamente como quinureninas. Ao esgotar lo- calmente triptofano e aumentando quinureninas pró-apoptóticas, IDO expressa por células dendríticas (DCs) pode afetar grandemente a proliferação de células T e sobrevivência. A indução de IDO em DCs pode ser um mecanismo comum de tolerância à deleção dirigida por células T reguladoras. Uma vez que tais respostas tolerogênicas po- dem ser esperadas para operar numa grande variedade de condições fisiopatológicas, metabolismo triptofano e produção de quinurenina podem representar uma interface crucial entre os sistemas imune e nervoso (Grohmann, et al., 2003, Trends Immunol., 24: 242-8). Nos estados de ativação imune persistente, disponibilidade de soro livre de Trp é diminuída e, como consequência da produção de serotonina re- duzida, as funções serotoninérgicas também podem ser afetadas (Wir- leitner, et al., 2003, Curr. Med. Chem., 10: 1581-91).

[0010] Curiosamente, a administração de interferon-a foi observa- da para induzir efeitos colaterais neuropsiquiátricos tais como, sinto- mas depressivos e alterações na função cognitiva. A influência direta sobre a neurotransmissão de serotonina pode contribuir para estes efeitos secundários. Além disso, porque a ativação IDO conduz a ní- veis reduzidos de triptofano, o precursor da serotonina (5-HT), IDO po- de desempenhar um papel eestes efeitos colaterais neuropsiquiátricos, reduzindo a síntese de 5-HT central. Além disso, os metabólitos de quinurenina, tais como 3-hidróxi-quinurenina (3-OH-KYN) e ácido qui- nolínico (QUIN) têm efeitos tóxicos sobre as funções cerebrais. 3-OH- KYN é capaz de produzir o estresse oxidativo, aumentando a produ- ção de espécies reativas de oxigênio (ROS), e QUIN pode produzir estimulação excessiva de receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) no hipocampo, o que leva à apoptose e atrofia do hipocampo. Ambos su- perprodução de ROS e atrofia do hipocampo causados por hiperesti- mulação de NMDA têm sido associados com a depressão (Wichers e Maes, 2004, J. Psychiatry Neurosci., 29: 11-17). Assim, a atividade de IDO pode desempenhar um papel na depressão.

[0011] Os inibidores de moléculas pequenas de IDO estão sendo desenvolvidos para tratar ou prevenir doenças relacionadas com a IDO tais como as descritas acima. Por exemplo, oxadiazol e outros inibido- res de IDO heterocíclicos são relatadas em US 2006/0258719 e US 2007/0185165. Publicação PCT WO 99/29310 relata métodos para alterar a imunidade mediada por células T que compreende alterar as concentrações extracelulares locais de triptofano e metabólitos de trip- tofano, utilizando um inibidor da IDO como 1-metil-DL-triptofano, ácido p-(3-benzofuranil)-DL-alanina, p-[3-benzo(b)tienil]-DL-alanina, e 6- nitro-L-triptofano) (Munn, 1999). Relatado em WO 03/087347, também publicado como patente Europeia 1501918, são métodos de prepara- ção de células apresentadoras de antígeno para aumentar ou reduzir a tolerância da célula T (Munn, 2003). Os compostos que têm atividade inibidora de indolamina-2,3-dioxigenase (IDO) são ainda relatados em WO 2004/094409; e Publicação de Pedido de Patente US 2004/0234623 refere-se aos métodos de tratamento de um sujeito com um câncer ou uma infecção pela administração de um inibidor da indo- lamina-2,3-dioxigenase em combinação com outras modalidades tera- pêuticas.

[0012] À luz dos dados experimentais indicando um papel para IDO na imunossupressão, a resistência do tumor e/ou rejeição, infec- ções crônicas, a infecção por HIV, AIDS (incluindo as suas manifesta- ções, tais como caquexia, demência e diarreia), doenças ou distúrbios autoimunes (tais como artrite reumatoide), e a tolerância imunológica e prevenção de rejeição fetal no útero , agentes terapêuticos destinados à supressão da degradação do triptofano por inibição da atividade de IDO são desejáveis. Os inibidores de IDO podem ser utilizados para ativar as células T e, por conseguinte, aumentar a ativação das células T, quando as células T são suprimidas por gravidez, malignidade ou um vírus tal como o HIV. A inibição da IDO também pode ser uma im- portante estratégia de tratamento para pacientes com doenças neuro- lógicas ou distúrbios neuropsiquiátricos como a depressão.

[0013] Devido à utilidade dos inibidores de IDO, existe uma neces- sidade para o desenvolvimento de novos processos para preparar os inibidores da IDO. Esta aplicação é dirigida a essa necessidade e ou- tras.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] O composto 4-({2-[(aminossulfonil)amino]etil}amino)-N-(3- bromo-4-fluorofenil)-N'-hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida ten- do a fórmula I:

é um inibidor da enzima indolamina-2,3-dioxigenase (também conhe- cida como IDO). O composto de Fórmula I, bem como a sua prepara- ção e utilização, tem sido descrito na Patente US 8.088.803, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Os intermediários e processos aqui proporcionados ajudam a satisfazer a necessidade contínua para o desenvolvimento de inibidores de IDO para o trata- mento de doenças graves.

[0015] O presente pedido proporciona, entre outros, intermediários e processos para a preparação de um composto de Fórmula I:

[0016] Por conseguinte, o presente pedido proporciona um pro- cesso compreendendo a reação de um composto de Fórmula F5:

com um aldeído de Fórmula F6:

para gerar um composto de Fórmula F7:

em que Pg1 é definido abaixo.

[0017] O presente pedido proporciona adicionalmente um proces- so compreendendo a reação de um composto de Fórmula F15:

com um composto de Fórmula F5 para proporcionar um composto de Fórmula F16:

em que R1 e R3 são definidos abaixo.

[0018] O presente pedido proporciona adicionalmente um proces- so compreendendo a reação de um composto de Fórmula F17:

com um composto de Fórmula F5 para proporcionar um composto de Fórmula F18:

em que R4 é definido abaixo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0019] Embora alguns dos processos etapas sejam ilustrados nos Esquemas abaixo, pretende-se as etapas individuais do processo po- dem ser reivindicadas individualmente ou em qualquer combinação (por exemplo, no Esquema I, etapas E, F, G, H, e I podem ser reivindi- cadas individualmente ou em combinação). Não se pretende que os processos sejam limitados a um processo global tendo cada etapa nosesquemas abaixo.

[0020] Assim, o esquema geral para a preparação do composto de Fórmula I está descrito no Esquema 1. Esquema 1

[0021] Por conseguinte, cesso compreendendo a reação de um composto de Fórmula F5:

com um aldeído de Fórmula F6:

em que Pg1 é um grupo protetor de amino, para gerar um composto de Fórmula F7:

[0022] Grupos de proteção de amino Pg1 podem ser usados para evitar reações indesejadas de um grupo amino durante a execução de uma transformação desejada. Grupos de proteção de amino permitem a ligação covalente fácil de um átomo de nitrogênio, bem como a cli- vagem seletiva do átomo de nitrogênio. “Grupos de proteção de ami- no” adequados, tais como alcoxicarbonila (tal como etoxicarbonila, terc butoxicarbonila (Boc), benzilxicarbonila (Cbz), 9- fluorenilmetilxicarbonila (Fmoc), e semelhantes), acila (tal como acetila (Ac), benzoíla (Bz), e semelhantes), sulfonila (tal como metanossulfoni- la, trifluorometanossulfonila, e semelhantes), arilalquila (tal como ben- zila, 4-metoxibenzila, difenilmetila, trifenilmetil (tritila), e semelhantes), alquenilalquila (tal como alila, prenila, e semelhantes), diarilmetilenila (tal como (C6H5)2C=N, e outros semelhantes), e silila (tais como o terc- butildimetilsilila, tri-isopropilsilila, e semelhantes), são conhecidos por um especialista na técnica. A química de grupos de proteção de amino pode ser encontrada em Wuts e Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., pp 696-926, John Wiley & Sons: New York, 2006, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0023] Em algumas modalidades, Pg1 é etoxicarbonila, terc- butoxicarbonila, benziloxicarbonila ou 9-fluorenilmetiloxicarbonila.

[0024] Em algumas modalidades, Pg1 é C 1-6 alcoxicarbonila.

[0025] Em algumas modalidades, Pg1 é terc-butoxicarbonila.

[0026] Os solventes apropriados para a Etapa E incluem, mas não estão limitados a, metanol ou tetra-hidrofurano (THF), acetonitrila e outros semelhantes. Solventes de hidrocarbonetos halogenados (ou seja, alcanos halogenados, tais como diclorometano, clorofórmio, di- cloroetano ou tetracloroetano) também podem ser usados.

[0027] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em um solvente componente compreendendo tetra-hidrofurano. Tal como aqui utilizado, um componente solvente pode referir-se a um solvente ou uma mistura de solventes. Em algumas modalidades, o componen- te solvente é um solvente orgânico. Em algumas modalidades, a refe- rida reação é realizada em um componente de solvente compreen- dendo um solvente de hidrocarboneto halogenado. Em algumas moda- lidades, o referido solvente hidrocarboneto halogenado é diclorometa- no.

[0028] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em um solvente componente compreendendo acetonitrila.

[0029] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em um componente de solvente compreendendo diclorometano e acetoni- trila.

[0030] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada na presença de um agente redutor.

[0031] O agente redutor pode ser qualquer composto capaz de reduzir um composto orgânico a um estado de oxidação inferior. A redução envolve geralmente a adição de átomos de hidrogênio ou a remoção de átomos de oxigênio de um grupo. Por exemplo, os aldeí- dos, tais como F6 podem ser reduzidos na presença de uma amina de Fórmula F5 (Etapa E, Esquema 1) pela adição de hidrogênio, seja sob a forma de gás de hidrogênio (H2) ou utilizando um reagente hidreto (tal como NaB(OAc)3H, NaBH 4, LiAlH4, e semelhantes); usando trife- nilfosfina; ou usando uma combinação de iodeto de sódio, clorotrime- tilsilano, e metanol. Em algumas modalidades, esta etapa pode ser realizada sob condições ácidas, na presença de um ácido (tal como o ácido trifluoroacético). Em algumas modalidades, esta etapa pode ser realizado a uma temperatura de cerca de -15°C a cerca de 30°C, por exemplo, de cerca de -15°C a cerca de 0°C, de cerca de -5°C a cerca de 5°C, de cerca de -5°C a cerca de 0°C, ou entre cerca de 0°C a cer- ca de 45°C.

[0032] Em algumas modalidades, o referido agente redutor é um agente redutor boro-hidreto (por exemplo, NaB(OAc)3H, NaBH4, ou outro agente redutor hidreto contendo boro).

[0033] Em algumas modalidades, referido agente redutor boro- hidreto é triacetoxiboro-hidreto de sódio.

[0034] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada na presença de ácido trifluoroacético.

[0035] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda desproteção do referido composto de Fórmula F7 para proporcionar um composto de Fórmula F8:

[0036] Agentes de desproteção amino úteis para esta etapa F são conhecidos dos especialistas na técnica, tais como aqueles em Wuts e Greene (acima). Em particular, os grupos descritos de proteção de amino acima podem ser convenientemente removidos utilizando diver- sos agentes de desproteção de amino disponíveis que são específicos para os vários grupos acima mencionados sem afetar outras porções desejadas do composto. O grupo terc butoxicarbonil pode ser removi- do (por exemplo, hidrolisado) a partir do átomo de nitrogênio, por exemplo, por tratamento com um ácido (tal como ácido clorídrico, áci- do trifluoroacético, ácido toluenossulfônico, e semelhantes); uma com- binação de reagentes (por exemplo, mistura de acetil cloreto e meta- nol) conhecida para gerar um ácido; ou um ácido de Lewis (por exem- plo, BF3^Et2O). O grupo benziloxicarbonil pode ser removido (por exemplo, hidrogenólise) a partir do átomo de nitrogênio, por exemplo, por tratamento com hidrogênio e um catalisador (tais como o paládio em carbono).

[0037] Em algumas modalidades, o agente de desproteção de amino é o ácido trifluoroacético. Em algumas modalidades, o agente de desproteção de amino contém ácido trifluoroacético e > 0,5% por volume de água, por exemplo, > 1,0% por volume de água,> 1,5% em volume de água,> 2,0% em volume de água, entre cerca de 2% a cer- ca de 10% em volume de água, entre cerca de 10% a cerca de 20% em volume de água, ou de cerca de 20% a cerca de 50% em volume de água. Em algumas modalidades, o agente de desproteção de ami- no pode ser uma mistura de ácido trifluoroacético e água numa razão volumétrica de cerca de 98: 2. Em algumas modalidades, o agente de desproteção de amino pode ser ácido clorídrico, opcionalmente em um solvente (por exemplo, água, THF, dioxano, acetato de etila, etc.). Em algumas modalidades, o componente solvente é acetato de etila. Em algumas modalidades, o agente de desproteção de amino pode ser ácido clorídrico, opcionalmente, em um solvente tal como um álcool (tal como isopropanol, metanol ou etanol). Solventes de hidrocarbone- to halogenado (por exemplo, diclorometano, clorofórmio, dicloroetano ou tetracloroetano) também podem ser usados. Em algumas modali- dades, a razão molar de ácido clorídrico e o composto de Fórmula F7 é cerca de 6,0, cerca de 5,0, cerca de 4,0, cerca de 3,0 cerca de 2,0, cerca de 1,0, ou cerca de 1,1. Em algumas modalidades, a Etapa F pode ser realizada a uma temperatura de cerca de -10°C a cerca de 60°C, por exemplo, de cerca de -10°C a cerca de 0°C, de cerca de 0°C a cerca de 25°C, de cerca de 25°C a cerca de 45°C, ou entre cerca de 45°C a cerca de 60°C.

[0038] Em algumas modalidades, referida desproteção compreen- de a reação do composto de Fórmula F7 com ácido clorídrico.

[0039] Em algumas modalidades, referida desproteção compreen- de a reação do composto de Fórmula F7 com ácido clorídrico em um componente solvente compreendendo isopropanol.

[0040] Em algumas modalidades, referida desproteção compreen- de a reação do composto de Fórmula F7 com ácido clorídrico em um componente de solvente compreendendo um solvente de hidrocarbo- neto halogenado.

[0041] Em algumas modalidades, o referido solvente hidrocarbo- neto halogenado é diclorometano.

[0042] Em algumas modalidades, a invenção compreende ainda a reação do referido composto de Fórmula F8, com Pg2-NH-SO2-X, na presença de uma base orgânica para gerar um composto de Fórmula F9:

em que:

[0043] Pg2 é um grupo protetor de amino; e

[0044] X é halo.

[0045] Em algumas modalidades, Pg2-NH-SO2Cl podem ser prepa- rados e imediatamente utilizado na reação com o composto de Fórmu- la F8. O grupo de proteção Pg2 pode ser selecionado de qualquer dos grupos de proteção conhecidos na técnica para a proteção de aminas ou de sulfonamidas (tais como os descritos acima para o Pg1). Em algumas modalidades, Pg2 pode ser um grupo alcoxicarbonila (tal co- mo o terc-butoxicarbonila).

[0046] Os solventes apropriados incluem, mas não estão limitados a, solventes de hidrocarbonetos halogenados tais como diclorometano e semelhantes. A base orgânica pode ser qualquer base que serve para neutralizar o HCl gerado durante a reação do composto de Fór- mula F8 e o cloreto de amino-sulfonil protegido. A base orgânica pode incluir aminas acíclicas terciárias tais como tri(C1-6)alquilamina (por exemplo, trietilamina, di-isopropiletilamina (DIPEA) e semelhantes), aminas terciárias cíclicas (por exemplo, N-metilpiperidina, 1,4- diazabiciclo[2,2]octano (DABCO) e semelhantes). Em algumas modali- dades, a base orgânica pode ser trietilamina. Em algumas modalida- des, esta etapa pode ser realizada a uma temperatura de cerca de - 15°C a cerca de 60°C, por exemplo, de cerca de -15°C a cerca de 0°C, de cerca de 0°C a cerca de 25°C, de cerca de 25°C a cerca de 45°C, ou entre cerca de 45°C a cerca de 60°C.

[0047] Em tais modalidades, a Pg2-NH-SO2Cl pode ser obtida pela reação de um álcool (tal como, etanol, terc-butil álcool e semelhantes) com isocianato de clorossulfonil (ClS(O)2NCO).

[0048] Em algumas modalidades, Pg2 é etoxicarbonila, terc- butoxicarbonila, benziloxicarbonila ou 9-fluorenilmetiloxicarbonila.

[0049] Em algumas modalidades, Pg2 é C1-6 alcoxicarbonila.

[0050] Em algumas modalidades, Pg2 é terc-butoxicarbonila.

[0051] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em um componente de solvente compreendendo um solvente de hidrocar- boneto halogenado.

[0052] Em algumas modalidades, o referido solvente hidrocarbo- neto halogenado é diclorometano.

[0053] Em algumas modalidades, a referida base orgânica com- preende um tri(C1-6)alquilamina.

[0054] Em algumas modalidades, a referida base orgânica é a trie- tilamina.

[0055] Em algumas modalidades, X é cloro.

[0056] Em algumas modalidades, a invenção compreende ainda desproteção do referido composto de Fórmula F9 para proporcionar um composto de Fórmula F10:

[0057] Em algumas modalidades, os agentes de desproteção ade- quados podem incluir aqueles descritos acima para a desproteção do composto de Fórmula F7.

[0058] Em algumas modalidades, referida desproteção compreen- de preparar reagir um composto de Fórmula F9 com ácido clorídrico. Em algumas modalidades, referida desproteção compreende reagir um composto de Fórmula F9 com ácido clorídrico em um componente de solvente que compreende um álcool. Em algumas modalidades, o re- ferido álcool é etanol. Em algumas modalidades, referida desproteção compreende reagir um composto de Fórmula F9 com ácido clorídrico em um componente de solvente que compreende acetato de etila.

[0059] Em algumas modalidades, a invenção compreende ainda a reação do referido composto de Fórmula F10 com uma base para dar um composto de Fórmula I:

[0060] Uma base pode ser utilizada para a conversão (por exem- plo, hidrólise) do anel de oxadiazolona em F10 para revelar a amido- xima no composto de Fórmula I, opcionalmente em um solvente (Etapa I, Esquema 1). A proteção da amidoxima como a oxadiazolona pode ser útil para evitar as reações adversas do grupo hidroxila ou daquele de amidoxima como um todo. A base pode ser uma base inorgânica tal como hidróxido de metal alcalino (por exemplo, NaOH, LiOH, KOH, Mg (OH)2, etc.); ou uma base orgânica tal como uma amina acíclica (por exemplo, trietilamina, di-isopropiletilamina (DIPEA), etc.) ou uma amina cíclica (por exemplo, pirrolidina, piperidina, etc). A base pode ser dis- ponibilizada sob a forma de uma resina (por exemplo, Amberlite® e semelhantes). Em algumas outras modalidades, a base pode ser for- necida sob a forma de uma solução em água (por exemplo, cerca de 0,5 N de solução, cerca de 1 N de solução, cerca de 1,5 N de solução, cerca de 2,5 N de solução, de cerca de 3 N a cerca de 5 N de solução, de cerca de 5 N a cerca de 10 N de solução). Em algumas modalida- des, a base é um hidróxido de metal alcalino (tal como, hidróxido de sódio). Em algumas modalidades, a base pode ser uma solução de 2 N NaOH em água. Em algumas modalidades, o solvente pode ser eta- nol ou tetra-hidrofurano (THF). Em algumas modalidades, o solvente pode ser uma mistura de etanol e água. Em algumas modalidades, a reação do composto de Fórmula F10 com uma base para gerar o composto de Fórmula I pode ser realizada a uma temperatura de cerca de -10°C a cerca de 60°C, por exemplo, de cerca de -10°C a cerca de 20°C, de cerca de 0°C a cerca de 30°C, de cerca de 0°C a cerca de 10°C, ou entre cerca de 0°C a cerca de 5°C.

[0061] Em algumas modalidades, a referida base compreende um hidróxido de metal alcalino.

[0062] Em algumas modalidades, referido hidróxido de metal alca- lino é hidróxido de sódio.

[0063] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em um componente de solvente que compreende tetra-hidrofurano, água e etanol.

[0064] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F5, po- de ser obtida numa sequência de etapas representadas no Esquema 2. A preparação do intermediário, 4-amino-N’-hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3- carboximidamida, foi descrito em J. Heterocycl. Chem. (1965), 2, 253, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade, e a sua con- versão para a cloro oxima F3 foi descrita em Synth. Commun. (1988), 18, 1427, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, a cloro oxima de Fórmula F3 pode ser acoplada a 3-bromo-4-fluoroanilina, opcionalmente em um solvente (tal como água), seguido por adição de bicarbonato de sódio, para fornecer uma amidoxima da Fórmula F4. A funcionalidade amido-oxima do composto de F4 pode em seguida ser convertida a uma oxadiazolona ou Fórmu- la F5 utilizando N,N-carbonildiimidazol (DCI) em um solvente (tal como acetato de etila, dioxano, THF e semelhantes), a temperaturas eleva- das tais como cerca de 50°C, cerca de 60°C, cerca de 70°C, cerca de 80°C, cerca de 90°C, ou cerca de 100°C. Esquema 2

[0065] Alternativamente, o composto de Fórmula F10 pode ser ob- tido através de uma sequência de etapas descrita no esquema 3. Esquema 3

[0066] Em algumas modalidades, o presente pedido proporciona um processo, que compreende a reação de um composto de Fórmula F15:

com um composto de Fórmula F5:

para gerar um composto de Fórmula F16:

em que:

[0067] cada R1 é, independentemente, um grupo protetor de ami- no; e

[0068] R3 é C1-6 alquila ou benzila.

[0069] Em algumas modalidades, R1 é C2-4alquenil-C1-3alquila ou fenil-C1-3alquila, em que o referido fenil-C1-3alquila é opcionalmente substituída por 1, 2, ou 3 independentemente selecionados gripos C1-4 alcóxi.

[0070] Em algumas modalidades, R1 é C2-4 alquenil-C1-3 alquila ou fenil-C1-3 alquila, em que referido fenil-C1-3 alquila é opcionalmente substituída by 1, 2, ou 3 grupos metóxi.

[0071] Em algumas modalidades, R1 é alila.

[0072] Em algumas modalidades, R1 é 4-metoxibenzila.

[0073] Em algumas modalidades, R3 é C1-6 alquila.

[0074] Em algumas modalidades, R3 é terc-butila.

[0075] Em algumas modalidades, R3 é C1-4 alquila.

[0076] Em algumas modalidades, R3 é butila.

[0077] Preferencialmente, a reação é realizada na presença de um agente redutor. O agente redutor pode ser qualquer composto capaz de reduzir um composto orgânico a um estado de oxidação inferior. Em algumas modalidades, o agente redutor pode ser o gás hidrogênio na presença de um catalisador ou um reagente hidreto (tal como NaB(OAc)3H, NaBH4, LiAlH4 e semelhantes); usando trifenilfosfina; ou usando uma combinação de iodeto de sódio, clorotrimetilsilano, e me- tanol. Em algumas modalidades, esta etapa pode ser realizada na pre- sença de um ácido tal como ácido trifluoroacético. Os solventes ade- quados para esta etapa incluem álcool isopropila, THF, dioxano, ou outros semelhantes. Em algumas modalidades, esta etapa pode ser realizada a uma temperatura de cerca de -15°C a cerca de 30°C, por exemplo, de cerca de -15°C a cerca de 0°C, de cerca de -5°C a cerca de 5°C, de cerca de -5°C a cerca de 0°C, de cerca de 0 a 5°C, ou entre cerca de 0°C a cerca de 45°C.

[0078] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em um solvente componente compreendendo tetra-hidrofurano.

[0079] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada na presença de um agente redutor.

[0080] Em algumas modalidades, o referido agente redutor é um agente redutor boro-hidreto.

[0081] Em algumas modalidades, referido agente redutor boro- hidreto é triacetoxiboro-hidreto de sódio.

[0082] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada na presença de ácido trifluoroacético.

[0083] Em algumas modalidades, a invenção compreende ainda desproteção do referido composto de Fórmula F16 para gerar um composto de Fórmula F10:

[0084] O tratamento de um composto F16 para substituir R1N com NH2 pode ser realizado por métodos para a desproteção de grupos de proteção de amino específicos conhecidos dos especialistas na técni- ca, tais como aqueles em Wuts e Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., pp 696-926, John Wiley & Sons: New York, 2006. Em algumas modalidades, quando R1 é alila, o agente de desproteção pode ser um catalisador de paládio (por exemplo, Pd(Ph3P)4, Pd/C, ou Pd(dba)DPPB). Em algumas modalidades, quan- do o R1 é 4-metoxibenzila, o agente de desproteção pode incluir um ácido orgânico (tal como o ácido trifluoroacético ou o ácido metanos- sulfônico, e outros semelhantes); um ácido inorgânico (tal como ácido clorídrico); hidrogênio e paládio; ou sódio em amônia líquida. A des- proteção pode ser realizada a uma temperatura de cerca de 30°C a cerca de 90°C, por exemplo, de cerca de 50°C a cerca de 100°C, ou entre cerca de 60°C a cerca de 80°C.

[0085] Em algumas modalidades, referida desproteção compreen- de preparar reagir um composto de Fórmula F16 com ácido trifluoroa- cético.

[0086] Em algumas modalidades, referida desproteção compreen- de reagir um composto de Fórmula F16 é com ácido clorídrico.

[0087] Composto F15 pode ser preparado por um processo de três etapas (Etapas J, K e L) a partir de clorossulfonilisocianato, como mos- trado no Esquema 4. Esquema 4

[0088] Por conseguinte, o presente pedido proporciona adicional- mente um processo em que o referido composto de Fórmula F15 é ob- tido por um processo que compreende o tratamento de um composto de Fórmula F14:

com um agente redutor para gerar o referido composto de Fórmula F15; em que R2 é C1-4alquila; e R3 é definido acima.

[0089] Em algumas modalidades, R2 é metila.

[0090] Em algumas modalidades, R2 é etila.

[0091] Em algumas modalidades, a redução pode ser realizada com hidreto de di-isobutilalumínio (DIBAL-H). Os solventes adequados incluem solventes hidrocarbonetos halogenados, tais como diclorome- tano, clorofórmio, dicloroetano, tetracloroetano, e semelhantes. Em algumas modalidades, a redução pode ser realizada a cerca da tempe- ratura ambiente, por exemplo, de cerca de -80°C a cerca de 30°C, de cerca de -78°C a cerca de 0°C, de cerca de 0°C a cerca de 30°C, ou de cerca de 25°C a cerca de 30°C.

[0092] Em algumas modalidades, o referido tratamento é realizado em um solvente de hidrocarboneto halogenado.

[0093] Em algumas modalidades, o referido solvente hidrocarbo- neto halogenado é diclorometano.

[0094] Em algumas modalidades, o referido agente de redução é hidreto de di-isobutilalumínio.

[0095] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula F14 é obtido por um processo que compreende a proteção de um composto de Fórmula F13:

com um ou mais agentes protetores de amino independentemente se- lecionados para gerar um composto de Fórmula F14.

[0096] O grupo de proteção R1 em F14 pode ser selecionado de entre os vários grupos de proteção de amino conhecidos na técnica (acima). Em algumas modalidades, o agente de proteção de amino é o brometo de alila ou cloreto de 4-metoxibenzila.

[0097] Em algumas modalidades, os referidos um ou mais agentes de proteção de amino são selecionados a partir de brometo de alila e cloreto de 4-metoxibenzila.

[0098] Em algumas modalidades, referida proteção é realizada na presença de uma base.

[0099] Em algumas modalidades, a referida base é carbonato de potássio.

[00100] Em algumas modalidades, referida proteção é realizada em um componente solvente compreendendo acetonitrila.

[00101] Em algumas modalidades, a preparação do composto de F13 pode ser obtida por tratamento de isocianato de clorossulfonila com um álcool R3OH (em que R3 é definido acima) e um éster de glici- na H2NCH2CO2R2, em que R2 é C1-4 alquila. Em algumas modalidades, esta etapa J é realizada na presença de um ácido orgânico (tal como ácido acético, ácido benzoico, ácido trifluoroacético). Os solventes adequados para esta etapa incluem diclorometano, clorofórmio, diclo- roetano, tetracloroetano, e semelhantes.

[00102] Em algumas modalidades, o presente pedido proporciona um composto de Fórmula F13:

em que:

[00103] R2 é C1-4 alquila; e

[00104] R3 é C1-6 alquila ou benzila.

[00105] Em algumas modalidades, R2 é metila.

[00106] Em algumas modalidades, R2 é etila.

[00107] Em algumas modalidades, R3 é C1-6 alquila.

[00108] Em algumas modalidades, R3 é terc-butila.

[00109] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F13 é etil-2- ((N-(terc-butoxicarbonil)sulfamoil)amino)acetato:

[00110] Em algumas modalidades, a invenção proporciona ainda um composto de Fórmula F14:

em que:

[00111] cada R1 representa, independentemente, um grupo de pro- teção de amino;

[00112] R2 é C1-4 alquila; e

[00113] R3 é C1-6 alquila ou benzila.

[00114] Em algumas modalidades, R1 é C2-4alquenil-C1-3alquila ou fenil-C1-3alquila, em que o referido fenil-C1-3alquila é opcionalmente substituída por 1, 2, ou 3 independentemente selecionados grupos C1-4 alcóxi.

[00115] Em algumas modalidades, R1 é alila.

[00116] Em algumas modalidades, R1 é 4-metoxibenzila.

[00117] Em algumas modalidades, R2 é metila.

[00118] Em algumas modalidades, R2 é etila.

[00119] Em algumas modalidades, R3 é C1-6 alquila.

[00120] Em algumas modalidades, R3 é terc-butila.

[00121] Em algumas modalidades, R3 é C1-4 alquila.

[00122] Em algumas modalidades, R3 é butila.

[00123] Em algumas modalidades, R3 é C1-4 alquila.

[00124] Em algumas modalidades, R3 é butila.

[00125] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F14 é etil-2- (alil(N-alil-N-(terc-butoxicarbonil)sulfamoil)amino)acetato:

[00126] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F14 é etil-2-(4-metoxibenzil(N-4-metoxibenzil-N-(terc- butoxicarbonil)sulfamoil)amino)acetato:

[00127] Em algumas modalidades, o presente pedido proporciona um composto de Fórmula F15:

em que:

[00128] ΠA no. R3 é C1-6 alquila ou benzila; e

[00129] cada R1 é, independentemente, um grupo protetor de ami-

[00130] Em algumas modalidades, R1 é C2-4alquenil-C1-3alquila ou fenil-C1-3alquila, em que o referido fenil-C1-3alquila é opcionalmente substituída por 1, 2, ou 3 independentemente selecionados gripos C1-4 alcóxi.

[00131] Em algumas modalidades, R1 é alila.

[00132] Em algumas modalidades, R1 é 4-metoxibenzila.

[00133] Em algumas modalidades, R3 é C1-6 alquila.

[00134] Em algumas modalidades, R3 é terc-butila.

[00135] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F15 é terc-butil alil{[alil(2-oxoetil)amino]sulfonil}carbamato:

[00136] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F15 é terc-butil(4-metoxibenzil){[(4-metoxibenzil)(2- oxoetil)amino]sulfonil}carbamato:

[00137] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um composto de Fórmula F16:

[00138] em que R3 é C1-6alquila ou benzila e cada R1 é, indepen- dentemente, um grupo de proteção de amino.

[00139] Em algumas modalidades, R1 é C2-4alquenil-C1-3alquila ou fenil-C1-3alquila, em que o referido fenil-C1-3alquila é opcionalmente substituída por 1, 2, ou 3 independentemente selecionados gripos C1-4 alcóxi.

[00140] Em algumas modalidades, R1 é alila.

[00141] Em algumas modalidades, R1 é 4-metoxibenzila.

[00142] Em algumas modalidades, R3 é C1-6 alquila.

[00143] Em algumas modalidades, R3 é terc-butila.

[00144] Em algumas modalidades, R3 é C1-4 alquila.

[00145] Em algumas modalidades, R3 é butila.

[00146] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F16 é terc-butil alil(N-alil-N-(2-(4-(4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro- 1,2,4-oxadiazol-3-il)-1,2,5-oxadiazol-3-ilamino)etil)sulfamoil)carbamato:

[00147] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F16 é (4-metoxibenzil)-(N-(4-metoxibenzil)-N-(2-(4-(4-(3-bromo-4-fluorofenil)- 5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il)-1,2,5-oxadiazol-3- ilamino)etil)sulfamoil)carbamato de terc-butila:

[00148] Esquema 5 delineia uma via alternativa para a preparação do composto de Fórmula F10. Esquema 5

[00149] O presente pedido também proporciona um processo com- preendendo a reação de um composto de Fórmula F17:

em que R4 é C1-6 alquila, C1-6 halogenoalquila, benzila, ou 9 H- fluoreno-9-ilmetila com um composto de Fórmula F5:

para gerar um composto de Fórmula F18:

[00150] Em algumas modalidades, R4 é terc-butila.

[00151] Em algumas modalidades, R4 é benzila.

[00152] Em algumas modalidades, R4 é etila.

[00153] Em algumas modalidades, R4 é C1-3 haloalquila.

[00154] Em algumas modalidades, R4 é 2,2,2-tricloroetila.

[00155] Em algumas modalidades, R4 é 9H-fluoren-9-ilmetila.

[00156] Nesta etapa Q, compostos F18 podem ser preparados, em algumas modalidades, por meio de reação F17 com o composto amina de Fórmula F5 na presença de um agente redutor.

[00157] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada na presença de um agente redutor.

[00158] O agente redutor pode ser qualquer composto capaz de reduzir um composto orgânico a um estado de oxidação inferior, por exemplo, por utilização de um organossilano, tal como tri(C1-3 al- quil)silano (por exemplo, trietilsilano); hidrogênio elementar ou utilizan- do um reagente hidreto (tal como NaB(OAc)3H, NaBH4, LiAlH4 e seme- lhantes); usando trifenilfosfina; ou usando uma combinação de iodeto de sódio, clorotrimetilsilano, e metanol. Em algumas modalidades, es- ta etapa pode ser realizada na presença de um ácido tal como ácido trifluoroacético. Os solventes adequados incluem, mas não estão limi- tados aos solventes de hidrocarboneto halogenados (por exemplo, di- clorometano, clorofórmio, dicloroetano ou tetracloroetano). Em algu- mas modalidades, o solvente de hidrocarboneto halogenado é 1,2- dicloroetano.

[00159] Em algumas modalidades, referido agente redutor é um or- ganossilano.

[00160] Em algumas modalidades, referido agente redutor é tri(C1-3 alquil)silano.

[00161] Em algumas modalidades, referido agente redutor é trietilsi- lano.

[00162] Em algumas modalidades, referida reação é realizada na presença de um ácido orgânico.

[00163] Em algumas modalidades, o referido ácido orgânico é o ácido trifluoroacético.

[00164] Em algumas modalidades, o referido ácido orgânico é o ácido metanossulfônico.

[00165] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em um componente de solvente compreendendo um solvente de hidrocar- boneto halogenado.

[00166] Em algumas modalidades, o referido solvente hidrocarbo- neto halogenado é diclorometano.

[00167] Em algumas modalidades, referido solvente de hidrocarbo- neto halogenado é 1,2-dicloroetano.

[00168] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda desproteção do referido composto de Fórmula F18 para gerar um composto de Fórmula F10:

[00169] Em algumas modalidades, métodos para a desproteção de determinados grupos de proteção de amina (tais como carbamatos) são conhecidos por um especialista na técnica, tais como aqueles em Wuts e Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., pp 696-926, John Wiley & Sons: New York, 2006. Por exemplo, o grupo terc-butoxicarbonila (por exemplo, quando R4 é terc-butila) pode ser removido (por exemplo, hidrolisado) a partir do átomo de nitrogê- nio, por exemplo, por tratamento com um ácido (tal como ácido clorí- drico, ácido trifluoroacético, ácido toluenossulfônico, e outros seme- lhantes); uma combinação de reagentes (por exemplo, mistura de ace- til cloreto e metanol) conhecido para gerar um ácido; ou um ácido de Lewis (por exemplo, BF3^Et2O). O grupo benzilxicarbonila (por exem- plo, quando R4 é benzila) pode ser removido (por exemplo, hidrogenó- lise) a partir do átomo de nitrogênio, por exemplo, por tratamento com hidrogênio e um catalisador (tais como o de paládio em carbono). Os grupos metoxicarbonila e etoxicarbonila (isto é, quando R4 é metila ou etila) podem ser removidos por tratamento com uma base inorgânica (tal como KOH ou K 2CO3); uma combinação de reagentes (por exem- plo, mistura de cloreto de acetila, iodeto de sódio e acetonitrila); ou por tratamento com um ácido (por exemplo, HBr, AcOH). O grupo 2,2,2- tricloroetoxicarbonil pode ser removido, por exemplo por tratamento com um catalisador (por exemplo, Zn/AcOH ou Cd/AcOH). Os solven- tes adequados para esta etapa incluem, mas não estão limitados a, metanol ou tetra-hidrofurano (THF), acetonitrila e outros semelhantes. Em algumas modalidades, o tratamento é realizado a uma temperatura de cerca de 30°C a cerca de 90°C, por exemplo, de cerca de 50°C a cerca de 100°C, ou entre cerca de 60°C a cerca de 80°C.

[00170] Em algumas modalidades, referida desproteção compreen- de a reação do composto de Fórmula F18 com zinco na presença de ácido acético.

[00171] Em algumas modalidades, dita desproteção é realizada em um componente solvente compreendendo tetra-hidrofurano.

[00172] Em algumas modalidades, o processo compreende adicio- nalmente a reação do referido composto de Fórmula F10 com uma ba- se para gerar um composto de Fórmula I:

[00173] Em algumas modalidades, a referida base compreende um hidróxido de metal alcalino.

[00174] Em algumas modalidades, referido hidróxido de metal alca- lino é hidróxido de sódio.

[00175] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em um componente de solvente que compreende tetra-hidrofurano, água e etanol.

[00176] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a conversão do referido composto de Fórmula F18 a um composto de Fórmula I:

em que a referida conversão compreende a combinação do composto de Fórmula F18 com uma base para formar uma primeira mistura. Em algumas modalidades, a base é N,N-bis(2-aminoetil)etano-1,2- diamina.

[00177] Em algumas modalidades, a conversão compreende ainda a adição de um ácido à primeira mistura. Em algumas modalidades, o referido ácido é um ácido forte aquoso. Em algumas modalidades, o referido ácido forte aquoso é o ácido clorídrico aquoso.

[00178] Em algumas modalidades, referida conversão é realizada de um componente de solvente que compreende tetra-hidrofurano e acetato de etila.

[00179] O presente pedido também proporciona um processo que compreende: i) reagir um composto de Fórmula F19:

com um composto de Fórmula F5:

na presença de trietilsilano e ácido metanossulfônico para gerar um composto de Fórmula F20:

e ii) converter o referido composto de Fórmula F20 a um composto de Fórmula I:

[00180] em que a referida conversão compreende combinar o refe- rido composto com a Fórmula F20 N,N-bis(2-aminoetil)etano-1,2- diamina. Em algumas modalidades, referida conversão compreende ainda a adição de ácido clorídrico aquoso após a referida combinação.

[00181] Composto F17 pode ser preparado por um processo de uma etapa (etapa P) a partir de clorossulfonilisocianato, como mostra- do no Esquema 6. Esquema 6

[00182] Em algumas modalidades, a preparação do composto de Fórmula F17 pode ser obtida por tratamento de clorossulfonilisocianato com 2,2-dimetoxietanamina e álcool R4OH (R4 é definido como acima), opcionalmente em um solvente (por exemplo, um solvente hidrocarbo- neto halogenado, tal como diclorometano, clorofórmio, dicloroetano, tetracloroetano). Em algumas modalidades, esta etapa realizada na presença de uma base. A base pode ser uma base orgânica tal como uma amina acíclica (por exemplo, trietilamina, di-isopropiletilamina (DIPEA), etc.) ou uma amina cíclica (por exemplo, pirrolidina, piperidi- na, etc); ou uma base inorgânica, tal como sais alcalinos (por exemplo, NaOH, LiOH, KOH, Mg(OH)2, etc.). Em algumas modalidades, a rea- ção é realizada em um solvente, por exemplo, um solvente hidrocar- boneto halogenado, tal como diclorometano, clorofórmio, dicloroetano, ou tetracloroetano.

[00183] Em algumas modalidades, o presente pedido proporciona adicionalmente um composto de Fórmula F17:

[00184] em que R4 é C1-6alquila, C1-6haloalquila ou benzila.

[00185] Em algumas modalidades, R4 é terc-butila.

[00186] Em algumas modalidades, R4 é benzila.

[00187] Em algumas modalidades, R4 é etila.

[00188] Em algumas modalidades, R4 é C1-3 haloalquila.

[00189] Em algumas modalidades, R4 é 2,2,2-tricloroetila.

[00190] Em algumas modalidades, R4 é 9H-fluoren-9-ilmetila.

[00191] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F17 é terc-butil-N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato.

[00192] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F17 é benzil-N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato.

[00193] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F17 é N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato de etila.

[00194] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F17 é N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato de 2,2,2-tricloroetila.

[00195] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F17 é N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato de (9H-fluoren-9-il)metila.

[00196] Em algumas modalidades, o presente pedido proporciona adicionalmente um composto de Fórmula F18:

[00197] em que R4 é C1-6alquila, C1-6haloalquila, ou benzila.

[00198] Em algumas modalidades, R4 é terc-butila.

[00199] Em algumas modalidades, R4 é benzila.

[00200] Em algumas modalidades, R4 é etila.

[00201] Em algumas modalidades, R4 é C1-3 haloalquila.

[00202] Em algumas modalidades, R4 é 2,2,2-tricloroetila.

[00203] Em algumas modalidades, R4 é 9H-fluoren-9-ilmetila.

[00204] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F18 é ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]- 1,2,5-oxadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de benzila:

[00205] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F18 é ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]- 1,2,5-oxadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de etila:

[00206] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F18 é ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]- 1,2,5-oxadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de 2,2,2- tricloroetila:

[00207] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula F18 é N-(2-((4-(4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3- il)-1,2,5-oxadiazol-3-il)amino)etil)sulfamoilcarbamato de (9H-fluoren-9- il)metila:

[00208] Tal como aqui utilizado, o termo “alquila”, quando utilizado isoladamente ou em conjunto com os termos parte adicional, refere-se a um grupo hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada, saturado, comportando de 1 a 6 átomos de carbono, 1 a 4 átomos de carbono, ou 1 a 3 átomos de carbono. Grupos alquila exemplares incluem meti- la, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, e semelhantes.

[00209] Tal como aqui utilizado, “alquenila” refere-se a um grupo alquil possuindo uma ou mais ligações duplas carbono-carbono. Em algumas modalidades, o referido grupo alquila tem de 2 a 6 átomos de carbono, 2 a 4 átomos de carbono, ou 2 a 3 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquenila incluem etenil (vinila), propenila, e se- melhantes.

[00210] Tal como aqui utilizado, “alquenilalquila” refere-se a um grupo de Fórmula aquil-alquenila. Em algumas modalidades, o grupo alila é alquenilalquila.

[00211] Tal como aqui utilizado, o termo “haloalquila”, quando utili- zado isoladamente ou em conjunto com uma porção adicional, refere- se a um grupo alquil substituído por um ou mais átomos de halogênio independentemente selecionados a partir de F, Cl, Br, e I. Grupos ha- loalquila exemplificativos incluem CF3, CHF2, CH2CF3, e semelhantes.

[00212] Tal como aqui utilizado, o termo “alcoxi” refere-se a um grupo -O-alquila. Em algumas modalidades, o grupo alquila tem 1 a 6 átomos de carbono, 1 a 4 átomos de carbono, ou 1 a 3 átomos de car- bono. Exemplos de grupos alcóxi incluem metóxi, etóxi, propóxi (por exemplo, n-propóxi e isopropoxi), t-butóxi, e semelhantes.

[00213] Tal como aqui utilizado, “trialquilamina” designa um átomo de nitrogênio substituído com três grupos independentemente selecio- nados de alquila. Em algumas modalidades, cada grupo alquila tem desde 2 até 6 átomos de carbono, 2 a 4 átomos de carbono, ou 2 a 3 átomos de carbono. Exemplos de grupos trialquilamina incluem trimeti- lamina, trietilamina, e semelhantes.

[00214] Tal como aqui utilizado, o termo “alcoxicarbonila” refere-se a um grupo de fórmula geral -C(O)-O-alquila. Em algumas modalida- des, o grupo alquila tem de 2 a 6 átomos de carbono, 2 a 4 átomos de carbono, ou 2 a 3 átomos de carbono. Exemplos de grupos alcoxicar- bonila incluem etoxicarbonila, terc-butoxicarbonila (Boc), e semelhan- tes.

[00215] Solventes de hidrocarboneto halogenados, referem-se aos alcanos halogenados, tais como diclorometano, clorofórmio, dicloroe- tano ou tetracloroetano, em que o alcano pode ser ramificado ou de cadeia linear tendo 1 a 12 átomos de carbono, 1 a 6 átomos de carbo- no, ou 1 a 4 átomos de carbono com um ou mais átomos de halo. Em algumas modalidades, o solvente de hidrocarboneto halogenado é um alcano clorado, de 1 a 12 átomos de carbono, 1 a 6 átomos de carbo- no, ou 1 a 4 átomos de carbono.

[00216] Em vários lugares na presente especificação, os substituin- tes dos compostos da invenção podem ser revelados em grupos ou em intervalos. Especificamente pretende-se que a invenção inclua to- dos e cada subcombinação individual dos membros de tais grupos e intervalos.

[00217] Pretende-se que os compostos da invenção sejam estáveis. Tal como aqui utilizado “estável” refere-se a um composto que é sufici- entemente robusto para sobreviver ao isolamento até um grau útil de pureza a partir de uma mistura de reação, e preferencialmente capaz de formulação em um agente terapêutico eficaz.

[00218] É adicionalmente preferido que certas características da invenção, que são, para clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, podem também ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da invenção que são, para brevidade, descritas no contexto de uma única modali- dade, podem também sejam fornecidas separadamente ou em qual- quer subcombinação adequada.

[00219] Os compostos da invenção pretendem ainda incluir todos os possíveis isômeros geométricos. Isômeros geométricos cis e trans dos compostos estão descritos e podem ser isolados como uma mistu- ra de isômeros ou como formas isoméricas separadas.

[00220] Os compostos da invenção também incluem as formas tau- toméricas. Formas tautoméricas resultam da troca de uma ligação simples com uma ligação dupla adjacente, juntamente com a migração concomitante de um próton.

[00221] Os compostos da invenção podem também incluir todos os isótopos de átomos que ocorrem nos intermediários ou compostos fi- nais. Os isótopos incluem os átomos que têm o mesmo número atômi- co, mas diferentes números de massa. Por exemplo, os isótopos de hidrogênio incluem o trítio e deutério.

[00222] Em algumas modalidades, os compostos da invenção, e os seus sais, são substancialmente isolados. Por “substancialmente iso- lado” entende-se que o composto é, pelo menos, parcial ou substanci- almente separado do ambiente no qual ele foi formado, ou detectado. A separação parcial pode incluir, por exemplo, uma composição enri- quecida no composto da invenção. A separação substancial pode in- cluir composições que contenham pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo me- nos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 99% em peso do compos- to da invenção, ou um sal do mesmo. Os métodos para isolar os com- postos e os seus sais são de rotina na técnica.

[00223] O presente pedido também inclui sais dos compostos aqui descritos. Tal como aqui utilizado, “sais” refere-se a derivados dos compostos revelados em que o composto parental é modificado atra- vés da conversão de um ácido existente ou porção de base para a sua forma de sal. Exemplos de sais incluem, mas não estão limitados a, ácido mineral (tal como HCl, HBr, H2SO4) ou ácido orgânico (tal como ácido acético, ácido benzoico, ácido trifluoroacético) sais de resíduos básicos, tais como aminas; alcalinos (tais como Li, Na, K, Mg, Ca) ou sais orgânicos (tais como trialquilamônio) de resíduos ácidos tais como ácidos carboxílicos; e semelhantes. Os sais do presente pedido de pa- tente podem ser sintetizados a partir do composto parente que contém uma unidade básica ou ácida por métodos químicos convencionais. Geralmente, esses sais podem ser preparados reagir as formas de ácido ou base livres destes compostos com uma quantidade estequi- ométrica da base ou ácido apropriada em água ou em um solvente or- gânico, ou numa mistura dos dois; geralmente, meios não aquosos como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol, ou acetonitrila (ACN) são preferidos.

[00224] O presente pedido também inclui sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui descritos. Os “sais farmaceuticamente aceitáveis” incluem um subconjunto de “sais” descritos acima que são sais convencionais não tóxicos do composto parental formados, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Lis- tas de sais adequados são encontradas em Remington’s Pharmaceuti- cal Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 e Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977), cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A frase “farmaceuticamente aceitável” é aqui empregada para referir aqueles compostos, formas materiais, composições, e/ou de dosagem que são, dentro do escopo do juízo médico, adequadas para utilização em con- tato com os tecidos de seres humanos e animais sem excessiva toxici- dade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma relação benefício/risco razoável.

[00225] Os processos aqui descritos podem ser monitorados de acordo com qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a formação do produto pode ser monitorada por meios es- pectroscópicos, tal como espectroscopia de ressonância magnética nuclear (por exemplo, 1H ou 13C), espectroscopia no infravermelho, espectrofotometria (por exemplo, UV-visível), ou espectrometria de massa; ou por cromatografia, tal como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia em camada fina. Os compostos obtidos pelas reações podem ser purificados por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, cromatografia (pressão média) sobre um adsorvente adequado (por exemplo, sílica-gel, alumi- na e outros semelhantes), HPLC ou cromatografia em camada fina preparativa; destilação; sublimação, trituração, ou recristalização. A pureza dos compostos, em geral, é determinada por meio de métodos físicos, tais como a medição do ponto de fusão (no caso de um sólido), obtendo-se um espectro de RMN, ou realizando uma separação por HPLC. Se o ponto de fusão diminui, se os sinais não desejados no espectro de RMN são diminuídos, ou se picos estranhos em um traça- do de HPLC são removidos, o composto pode ser referido como tendo sido purificado. Em algumas modalidades, os compostos são substan- cialmente purificados.

[00226] Preparação de compostos pode envolver a proteção e des- proteção de vários grupos químicos. A necessidade de proteção e desproteção, e a seleção de grupos de proteção apropriados podem ser prontamente determinadas por um especialista na técnica. A quí- mica de grupos de proteção pode ser encontrada, por exemplo, em Wuts e Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., John Wiley & Sons: New York, 2006, a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[00227] As reações dos processos aqui descritos podem ser reali- zadas em solventes adequados que podem ser facilmente seleciona- dos por um especialista na técnica da síntese orgânica. Os solventes adequados podem ser substancialmente não reativos com os materiais de partida (reagentes), os intermediários ou produtos nas temperatu- ras às quais as reações são realizadas, ou seja, temperaturas que po- dem variar desde a temperatura de congelamento do solvente até à temperatura de ebulição do solvente. Uma dada reação pode ser reali- zada em um solvente ou numa mistura de mais do que um solvente. Dependendo da etapa de reação, os solventes adequados para aquela etapa de reação particular podem ser selecionados. Os solventes apropriados incluem água, alcanos (tais como pentanos, hexanos, heptanos, ciclohexano, etc, ou uma mistura dos mesmos), solventes aromáticos (tais como benzeno, tolueno, xileno, etc), álcoois (tais co- mo metanol, etanol, isopropanol, etc), éteres (tais como éteres dialqui- la, metil terc-butil éter (MTBE), tetra-hidrofurano (THF), dioxano, etc), ésteres (tais como acetato de etila, acetato de butila, etc.), solventes de hidrocarbonetos halogenados (como diclorometano (DCM), cloro- fórmio, dicloroetano, tetracloroetano), dimetilformamida (DMF), dime- tilsulfóxido (DMSO), acetona, acetonitrila (ACN), hexametilfosforamida (HMPA) e N-metil pirrolidona (NMP). Tais solventes podem ser utiliza- dos em ambas suas formas úmidas ou anidras.

[00228] Resolução de misturas racêmicas de compostos pode ser realizada por qualquer um dos numerosos métodos conhecidos na técnica. Um método exemplar inclui recristalização fracionada utilizan- do um “ácido de resolução quiral”, que é um ácido orgânico opticamen- te ativo, que forma um sal. Os agentes de resolução adequados para os métodos de recristalização fracionada são, por exemplo, ácidos op- ticamente ativos, tais como as formas D e L de ácido tartárico, ácido diacetiltartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido mandélico, ácido máli- co, ácido láctico ou os diferentes ácidos canforsulfônicos opticamente ativos. Resolução de misturas racêmicas também pode ser realizada através de eluição em uma coluna carregada com um agente de reso- lução opticamente ativo (por exemplo, dinitrobenzoilfenilglicina). A composição do solvente de eluição adequado pode ser determinada por um especialista na técnica.

Métodos de Uso

[00229] O composto de fórmula I pode inibir a atividade da enzima indolamina-2,3-dioxigenase (IDO). Por exemplo, o composto de Fór- mula I pode ser utilizado para inibir a atividade da IDO na célula ou em um indivíduo com necessidade de modulação do enzima por adminis- tração de uma quantidade inibidora do composto de Fórmula I.

[00230] Os compostos de Fórmula I podem ser utilizados em méto- dos de inibir a degradação do triptofano em um sistema que contém células que expressam IDO tal como um tecido, organismo vivo, ou cultura de células. Em algumas modalidades, o presente pedido pro- porciona métodos de alterar (por exemplo, aumentando os níveis de triptofano) extracelulares em um mamífero por administração de uma quantidade eficaz do composto de Fórmula I. Métodos de medição dos níveis de triptofano e de degradação do triptofano são de rotina na técnica.

[00231] Os compostos de Fórmula I podem ser utilizados em méto- dos de inibição da imunossupressão, tais como a imunossupressão mediada por IDO em um paciente por administração ao paciente de uma quantidade eficaz do composto de Fórmula I. A imunossupressão mediada por IDO tem sido associada com, por exemplo, cânceres, crescimento do tumor, metástase, infecção viral, replicação viral, etc.

[00232] Os compostos de Fórmula I também podem ser utilizados em métodos de tratamento de doenças associadas com a atividade ou expressão, incluindo a atividade anormal e/ou sobre-expressão, de IDO em um indivíduo (por exemplo, paciente), por administração ao indivíduo em necessidade de tal tratamento de uma quantidade tera- peuticamente eficaz ou dose do composto da Fórmula I ou uma com- posição farmacêutica do mesmo. Exemplos de doenças podem incluir qualquer doença, distúrbio ou condição que está diretamente ou indire- tamente ligada a expressão ou a atividade da enzima IDO, tais como sobre-expressão ou atividade anormal. Uma doença associada a IDO também pode incluir qualquer doença, distúrbio ou condição que pode ser prevenida, melhorada, ou curada por modulação da atividade da enzima. Exemplos de doenças associadas a IDO incluem o câncer, infecção viral, tal como infecção por HIV, infecção por HCV, depres- são, distúrbios neurodegenerativos tais como a doença de Alzheimer e doença de Huntington, trauma, cataratas relacionadas com a idade, o transplante de órgãos (por exemplo, rejeição de transplante de ór- gãos), e doenças autoimunes, incluindo a asma, artrite reumatoide, esclerose múltipla, inflamação alérgica, doença inflamatória do intesti- no, psoríase e lúpus sistêmico eritematoso. Exemplos de cânceres tra- táveis pelos métodos aqui incluem o câncer do cólon, de pâncreas, da mama, da próstata, do pulmão, cérebro, ovário, colo do útero, testícu- los, renal, cabeça e pescoço, linfoma, leucemia, melanoma, e outros semelhantes. O composto de Fórmula I também pode ser útil no trata- mento da obesidade e isquemia.

[00233] Tal como aqui utilizado, o termo “célula” pretende se referir a uma célula que é in vitro, ex vivo ou in vivo. Em algumas modalida- des, uma célula ex vivo pode ser parte de uma amostra de tecido exci- sada a partir de um organismo tal como um mamífero. Em algumas modalidades, uma célula in vitro pode ser uma célula de uma cultura de células. Em algumas modalidades, uma célula in vivo é uma célula viva em um organismo, tal como um mamífero.

[00234] Tal como aqui utilizado, o termo “contatar” refere-se à jun- ção de frações indicadas em um sistema in vitro ou um sistema in vivo. Por exemplo, “contatar” a enzima IDO com o composto de Fórmula I inclui a administração do composto de Fórmula I a um indivíduo ou pa- ciente, tal como um humano, tendo IDO, bem como, por exemplo, in- troduzindo o composto de Fórmula I numa amostra contendo uma pre- paração celular ou purificada contendo a enzima IDO.

[00235] Tal como aqui utilizado, os termos “indivíduo” ou “paciente”, utilizados indiferentemente, referem-se a qualquer animal, incluindo mamíferos, preferencialmente camundongos, ratos, outros roedores, coelhos, cães, gatos, suínos, bovinos, ovinos, cavalos, ou primatas, e mais preferencialmente seres humanos.

[00236] Tal como aqui utilizada, a frase “quantidade terapeutica- mente eficaz” refere-se à quantidade de composto ativo ou agente farmacêutico que provoca a resposta biológica ou medicinal do tecido, sistema, animal, indivíduo ou ser humano que está sendo procurada por um investigador, veterinário, um médico ou outro clínico.

[00237] Tal como aqui utilizado, o termo “tratar” ou “tratamento” re- fere-se a 1) prevenção da doença; por exemplo, prevenção de uma doença, condição ou distúrbio em um indivíduo que pode estar predis- posto à doença, condição ou distúrbio mas ainda não sofre ou apre- senta a patologia ou sintomatologia da doença; 2) inibição da doença; por exemplo, inibição de uma doença, condição ou distúrbio em um indivíduo que sofre ou exibe a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (ou seja , interrompendo o desenvolvimento adi- cional da patologia e/ou sintomatologia), ou 3) melhora da doença; por exemplo, melhora de uma doença, condição ou distúrbio em um indi- víduo que sofre ou apresenta a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (ou seja, revertendo a patologia e/ou sintomato- logia).

Terapia de combinação

[00238] Um ou mais agentes farmacêuticos ou métodos de trata- mento adicionais, tal como, por exemplo, agentes antivirais, agentes quimioterápicos ou outros agentes anticâncer, potencializadores do sistema imunológico, imunossupressores, radiação, vacinas antitumo- rais e antivirais, terapia de citocinas (por exemplo, IL2, GM-CSF, etc.), e/ou inibidores de tirosina quinase podem ser utilizados em combina- ção do composto de Fórmula I para o tratamento de doenças, distúr- bios ou condições associadas com IDO. Os agentes podem ser com- binados com o composto da Fórmula I numa forma de dosagem única, ou os agentes podem ser administrados simultaneamente ou sequen- cialmente como formas de dosagem separadas.

[00239] Os agentes antivirais adequados contemplados para utiliza- ção em associação ao composto de Fórmula I podem compreender nucleosídeos e nucleotídeos inibidores da transcriptase reversa (NRTIs), inibidores não nucleosídeos da transcriptase reversa (NNR- TIs), inibidores de protease e outras drogas antivirais.

[00240] Exemplos de NRTIs adequados incluem zidovudina (AZT); didanosina (ddl); zalcitabina (ddC); stavudina (d4T); lamivudina (3TC); abacavir (1592U89); adefovir dipivoxil [bis(POM)-PMEA]; lobucavir (BMS-180194); BCH-10652; emitricitabina [(-)-FTC]; beta-L-FD4 (tam- bém chamado beta-L-D4C e chamado beta-L-2',3'-dicleóxi-5-fluoro- citideno); DAPD, ((-)-beta-D-2,6,-diamino-purina dioxolano); e lodeno- sina (FddA). NNRTIs adequados típicos incluem nevirapina (BI-RG- 587); delaviradina (BHAP, U-90152); efavirenz (DMP-266); PNU- 142721; AG-1549; MKC-442 (1-(etóxi-metil)-5-(1-metiletil)-6- (fenilmetil)-(2,4 (1H,3H)-pirimidinodiona); e (+)-calanolida A (NSC- 675451) e B. Os inibidores de protease adequados típicos incluem sa- quinavir (Ro 31-8959); ritonavir (ABT-538); indinavir (MK-639); nelfna- vir (AG-1343); amprenavir (141W94); lasinavir (BMS-234475); DMP- 450; BMS-2322623; ABT-378; e AG-1 549. Outros agentes antivirais incluem hidroxiureia, ribavirina, IL-2, IL-12, pentafusida e Projeto Yis- sum N.° 11607.

[00241] Quimioterápicos adequados ou outros agentes anticâncer incluem, por exemplo, agentes de alquilação (incluindo, sem limitação, mostardas de nitrogênio, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosoureias e triazenos), tais como a mostarda de uracila, clormetina, ciclofosfamida (CytoxanTM), ifosfamida, melfalano, clorambucila, pipo- bromano, trietileno-melamina, trietilenotiofosforamina, bussulfano, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina, e temozolomida.

[00242] No tratamento do melanoma, os agentes adequados para utilização em combinação com o composto de Fórmula I incluem: da- carbazina (DTIC), opcionalmente, juntamente com outras drogas de quimioterapia tais como carmustina (BCNU) e cisplatina; o “regime de Dartmouth,” que consiste em DTIC, BCNU, cisplatina e tamoxifeno; uma combinação de cisplatina, vinblastina, e DTIC; ou temozolomida. Compostos de acordo com a invenção também podem ser combina- dos com drogas de imunoterapia, incluindo citocinas, tais como alfa interferon, interleucina 2, e fator de necrose tumoral (TNF) no trata- mento de melanoma.

[00243] O composto de Fórmula I pode também ser utilizado em combinação com a terapia de vacina para o tratamento de melanoma. Vacinas antimelanoma são, em alguns aspectos, semelhantes às va- cinas antivirais que são utilizadas para evitar doenças causadas por vírus, tais como poliomielite, sarampo, e caxumba. As células de me- lanoma enfraquecidas ou partes de células de melanoma chamados antígenos podem ser injetadas em um paciente para estimular o sis- tema imunológico do organismo para destruir células de melanoma.

[00244] Os melanomas que estão confinados aos braços ou pernas podem também ser tratados com uma combinação de agentes, inclu- indo o composto de Fórmula I, utilizando uma técnica de perfusão de membro isolado hipertérmico. Este protocolo de tratamento separa temporariamente a circulação do membro envolvido do resto do corpo e injeta doses elevadas de quimioterapia na artéria que alimenta o membro, proporcionando assim altas doses para a área do tumor, sem expor os órgãos internos para estas doses que de outro modo poderi- am causar efeitos colaterais graves. Normalmente, o fluido é aquecido a 102° a 104°F. Melfalano é a droga mais usada nest e procedimento quimioterapia. Isso pode ser administrado com outro agente chamado de fator de necrose tumoral (TNF) (ver seção sobre as citocinas).

[00245] Quimioterápico adequado ou outros agentes anticâncer in- cluem, por exemplo, antimetabólitos (incluindo, sem limitação, antago- nistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores da adenosina desaminase), tais como metotrexato, 5- fluorouracila, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina, e gemcitabina.

[00246] Quimioterápicos adequados ou outros agentes anticâncer incluem ainda, por exemplo, certos produtos naturais e seus derivados (por exemplo, alcaloides da vinca, antibióticos antitumorais, enzimas, linfocinas e epipodofilotoxinas), tais como vinblastina, vincristina, vin- desina, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epiru- bicina, idarubicina, ARA-C, o paclitaxel (TAXOLTM), mitramicina, deso- xicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginase, interferons (especialmen- te IFN-a), etoposídeo, e teniposídeo.

[00247] Outros agentes citotóxicos incluem navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosfami- da, e droloxafina.

[00248] Também adequados são os agentes citotóxicos, tais como epidofilotoxina; uma enzima antineoplásica; um inibidor de topoisome- rase; procarbazina; mitoxantrona; complexos de coordenação de plati- na, tais como cisplatina e carboplatina; modificadores da resposta bio- lógica; inibidores de crescimento; agentes terapêuticos antihormonais; leucovorina; tegafur; e fatores de crescimento hematopoiéticos.

[00249] Outros agentes anticancerígenos incluem anticorpos tera- pêuticos tais como trastuzumab (Herceptin), anticorpos para moléculas co-estimuladoras, tais como CTLA-4, 4-1BB e DP-1, ou anticorpos pa- ra as citocinas (IL-10, TGF-β, etc.).

[00250] Outros agentes anticancerígenos também incluem aqueles que bloqueiam a migração de células imunológicas, tais como antago- nistas de receptores de quimioquinas, incluindo CCR2 e CCR4.

[00251] Outros agentes anticancerígenos também incluem aqueles que aumentam o sistema imunológico, tais como adjuvantes ou trans- ferência adoptiva de células T.

[00252] Vacinas anticâncer incluem células dendríticas, peptídeos sintéticos, vacinas de DNA e os vírus recombinantes.

[00253] Os métodos para a administração segura e eficaz da maio- ria destes agentes quimioterápicos são conhecidos dos especialistas na técnica. Além disso, a administração é descrita na literatura pa- drão. Por exemplo, a administração de muitos dos agentes quimiote- rápicos é descrita em "Physicians' Desk Reference" (PDR, por exem- plo, 1996 edition, Medical Economics Company, Montvale, NJ), a di- vulgação da qual é aqui incorporada por referência como se apresen- tada na sua totalidade.

Formulações Farmacêuticas e formas de dosagem

[00254] Quando empregado como produtos farmacêuticos, o com- posto de Fórmula I pode ser administrado na forma de composições farmacêuticas que é uma combinação do composto de Fórmula I e um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser preparadas de um modo bem conhecido na técnica farmacêutica, e podem ser administrados por uma variedade de vias, dependendo de se o tratamento é local ou sistêmico desejado e sobre a área a ser tra- tada. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica e às mem- branas mucosas, incluindo intranasal, vaginal e retal), pulmonar (por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica), ocu- lar, oral ou parenteral. Métodos para liberação ocular podem incluir a administração tópica (colírios), subconjuntival, injeção periocular ou intravítrea ou introdução de cateter balão ou inserções oftálmicas ci- rurgicamente colocadas no saco conjuntival. A administração parente- ral inclui a administração intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intra- peritoneal, ou intramuscular ou infusão; ou intracraniana, por exemplo, administração intratecal ou intraventricular. A administração parenteral pode estar na forma de uma dose em bolus único, ou pode ser, por exemplo, por uma bomba de perfusão contínua. As composições far- macêuticas e as formulações para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, su- positórios, sprays, líquidos e pós. Os veículos farmacêuticos convenci- onais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes podem ser necessários ou desejáveis.

[00255] As composições farmacêuticas contendo o composto de Fórmula I podem ser preparadas em combinação com um ou mais car- readores farmaceuticamente aceitáveis. Na fabricação das composi- ções da invenção, o ingrediente ativo é normalmente misturado com um excipiente, diluído por um excipiente ou encerrado dentro de um tal carreador, na forma de, por exemplo, uma cápsula, sachê, papel, ou outro recipiente. Quando o excipiente serve como um diluente, ele po- de ser um material sólido, semissólido, ou líquido, que atua como um veículo, carreador ou meio para o ingrediente ativo. Assim, as compo- sições podem estar na forma de comprimidos, pílulas, pós, pastilhas, sachês, hóstias, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um sólido ou em um meio líquido), unguentos con- tendo, por exemplo, até 10% em peso do composto ativo, cápsulas de gelatina mole e dura, supositórios, soluções injetáveis estéreis, e pós embalados estéreis.

[00256] Ao preparar uma formulação, o composto ativo pode ser moído para gerar o tamanho de partícula apropriado antes de combi- nar com os outros ingredientes. Se o composto ativo for substancial- mente insolúvel, ele pode ser moído para um tamanho de partícula in- ferior a 200 mesh. Se o composto ativo é substancialmente solúvel em água, o tamanho de partícula pode ser ajustado por moagem para proporcionar uma distribuição substancialmente uniforme na formula- ção, por exemplo, cerca de 40 mesh.

[00257] Alguns exemplos de excipientes adequados incluem lacto- se, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma de acácia, fos- fato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulo- se microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope, e metil- celulose. As formulações podem adicionalmente incluir: agentes lubri- ficantes tais como talco, estearato de magnésio, e óleo mineral; agen- tes molhantes; agentes emulsionantes e suspensores; agentes de conservação tais como metila e propilhidro-benzoatos; agentes edulco- rantes; e agentes aromatizantes. As composições da invenção podem ser formuladas de modo a proporcionar uma liberação rápida, susten- tada ou retardada do ingrediente ativo após administração ao paciente empregando procedimentos conhecidos na técnica.

[00258] As composições podem ser formuladas numa forma de do- sagem unitária, contendo cada dosagem de cerca de 5 a cerca de 100 mg, mais usualmente cerca de 10 a cerca de 30 mg, do ingrediente ativo. O termo “formas de dosagem unitárias” refere-se às unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para sujei- tos humanos e outros mamíferos, contendo cada unidade uma quanti- dade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente farmacêutico adequado.

[00259] O composto ativo pode ser eficaz numa ampla gama de do- sagem e é geralmente administrado numa quantidade farmaceutica- mente eficaz. Será entendido, no entanto, que a quantidade do com- posto realmente administrada geralmente será determinada por um médico, em função das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real admi- nistrado, a idade, peso, e resposta do paciente individual, a gravidade dos sintomas do paciente, e semelhantes.

[00260] Para preparar composições sólidas tais como comprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com um excipiente farmacêu- tico para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogênea do composto de Fórmula I. Quando se refe- rindo à estas composições de pré-formulação como homogêneas, o ingrediente ativo é tipicamente disperso uniformemente por toda a composição de modo que a composição pode ser prontamente subdi- vidida em formas de dosagem unitárias igualmente eficazes tais como comprimidos, pílulas e cápsulas. Esta pré-formulação sólida é então subdividida em formas de dosagem unitárias do tipo descrito acima contendo desde, por exemplo, de 0,1 a cerca de 500 mg do ingredien- te ativo do presente pedido de patente.

[00261] Os comprimidos ou pílulas contendo o composto de Fórmu- la I podem ser revestidos ou manipulados de outro modo para propor- cionar uma forma de dosagem proporcionando a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender um componente de dosagem interna e de dosagem externa, estando o último na forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componen- tes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permitir que o componente in- terno passe intacto para o duodeno ou para ser retardado na libera- ção. Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas ou revestimentos entéricos, incluindo tais materiais um número de áci- dos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais tais como goma-laca, álcool cetílico, e acetato de celulose.

[00262] As formas líquidas nas quais os compostos e composições do presente pedido de patente podem ser incorporadas para adminis- tração por via oral ou por injeção incluem soluções aquosas, xaropes adequadamente aromatizados, suspensões aquosas ou oleosas e emulsões aromatizadas com óleos comestíveis tais como óleo de se- mente de algodão, óleo de sésamo, óleo de coco, ou óleo de amen- doim, bem como elixires e veículos farmacêuticos semelhantes.

[00263] As composições para inalação ou insuflação incluem solu- ções e suspensões em solventes farmaceuticamente aceitáveis, aquo- sos ou orgânicos, ou suas misturas, e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes adequados farmaceuticamente aceitáveis tal como foi acima descrito. Em algumas modalidades, as composições são administradas pela via respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico. Composições podem ser nebulizadas por uti- lização de gases inertes. As soluções nebulizadas podem ser respira- das diretamente do dispositivo nebulizador ou o dispositivo nebulizador pode ser ligado a uma máscara facial, ou máquina de respiração de pressão positiva intermitente. Composições em solução, suspensão, ou pó podem ser administradas por via oral ou nasalmente a partir de dispositivos que liberam a formulação de um modo apropriado.

[00264] A quantidade de composto ou composição administrada a um paciente variará dependendo do que está sendo administrado, da finalidade da administração, tal como profilaxia ou terapia, o estado do paciente, do modo de administração, e semelhantes. Em aplicações terapêuticas, as composições podem ser administradas a um paciente que já sofre de uma doença numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente os sintomas da doença e suas compli- cações. As doses eficazes irão depender da condição a ser tratada a doença, bem como pelo julgamento do médico assistente dependendo de fatores tais como a gravidade da doença, a idade, peso e do estado geral do paciente, e semelhantes.

[00265] As composições administradas a um paciente podem ser na forma de composições farmacêuticas descritas acima. Estas com- posições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização con- vencionais, ou podem ser esterilizadas por filtração. As soluções aquosas podem ser embaladas para utilização tal qual, ou liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com um veículo aquoso es- téril antes da administração. O pH das preparações compostas tipica- mente será entre 3 e 11, mais preferencialmente de 5 a 9 e mais prefe- rencialmente de 7 a 8. Será entendido que a utilização de certos dos excipientes, carreadores ou estabilizantes anteriores resultará na for- mação de sais farmacêuticos.

[00266] A dosagem terapêutica do composto de fórmula I pode va- riar de acordo com, por exemplo, a utilização particular para a qual o tratamento é feito, o modo de administração do composto, a saúde e condição do paciente, e o julgamento da prescrição médica. A propor- ção ou a concentração do composto de Fórmula I numa composição farmacêutica pode variar dependendo de um número de fatores, inclu- indo a dosagem, as características químicas (por exemplo, hidrofobici- dade) e a via de administração. Por exemplo, o composto de Fórmula I pode ser proporcionado numa solução aquosa de tampão fisiológico contendo cerca de 0,1 a cerca de 10% p/v do composto para adminis- tração parenteral. Algumas faixas de doses típicas são de cerca de 1 μg/kg a cerca de 1 g/kg de peso corporal por dia. Em algumas modali- dades, o intervalo de dosagem é de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia. A dosagem é provavelmente de- pendente de tais variáveis como o tipo e extensão da progressão da doença ou distúrbio, o estado geral de saúde do paciente particular, da eficácia biológica relativa do composto selecionado, da formulação do excipiente, e sua via de administração. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas in vitro ou sistemas de teste em modelo animal.

[00267] O composto de Fórmula I também pode ser formulado em combinação com um ou mais ingredientes ativos adicionais, que po- dem incluir qualquer agente farmacêutico, tais como agentes antivirais, vacinas, anticorpos, potencializadores do sistema imunológico, imu- nossupressores, agentes anti-inflamatórios e outros semelhantes.

[00268] O presente pedido também inclui kits farmacêuticos úteis, por exemplo, no tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios associados a IDO, obesidade, diabetes e outras doenças aqui referi- das que incluem um ou mais recipientes que contêm uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto de Fórmula I. Tais kits podem incluir ainda, se desejado, um ou mais dos vários componentes do kit farmacêutico convencio- nais, tais como, por exemplo, recipientes com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, recipientes adicionais, etc., como será prontamente evidente para os especialistas na técnica. Instruções, como bulas ou como rótulos, indicando as quantidades dos componen- tes a serem administradas, guias para a administração, e/ou diretrizes para misturar os componentes, podem também ser incluídas no kit.

EXEMPLOS

[00269] A invenção será descrita em maiores detalhes por meio de exemplos específicos. Os exemplos seguintes são oferecidos para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar a invenção de qualquer manei- ra. Os especialistas na técnica reconhecerão facilmente uma varieda- de de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir essencialmente os mesmos resultados.

[00270] Exemplo 1. Síntese de 4-({2- [(Aminossulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N'- hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida

[00271] Etapa A: 4-Amino-N'-hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3- carboximidamida (2)

[00272] Malononitrila [Aldrich, produto# M1407] (320,5 g, 5 mol) foi adicionada a água (7 L), pré-aquecida a 45°C e agitada a 45°C durante 5 min. A solução resultante foi resfriada em um banho de gelo e nitrito de sódio (380 g, 5,5 mol, 1,1 equiv.) foi adicionado. Quando a tempe- ratura atingiu 10°C, foi adicionado ácido clorídrico 6 N (55 mL). Uma reação moderadamente exotérmica seguiu-se com temperatura atin- gindo 16°C. Após 15 min o banho frio foi removido e a mistura de rea- ção foi agitada durante 1,5 h a 16-18°C. A mistura de reação foi resfri- ada até 13°C e cloridrato de hidroxilamina aquosa a 50% (990 g, 15 mol, 3,0 equiv.) foi adicionada toda de uma vez. A temperatura subiu para 26°C. Quando a reação exotérmica baixou o banho frio foi remo- vido e a agitação foi continuada durante 1 h a 26-27°C, em seguida foi lentamente levada ao refluxo. O refluxo foi mantido durante 2 h e, em seguida, a mistura de reação foi deixada resfriar gradualmente durante a noite. A mistura de reação foi agitada em um banho de gelo e ácido clorídrico 6 N 800 ml ) foi adicionado em porções ao longo de 40 min para ajustar a pH 7,0. A agitação foi continuada no banho de gelo a 5°C. O precipitado foi coletado por filtração, bem lavado com água e seco em um forno de vácuo (50°C) para gerar o produto desejado (644 g, 90%) como um sólido esbranquiçado. 13C RMN (75 MHz, CD3OD): δ 156,0, 145,9, 141,3; C3H5N5O2 (MW 143,10), LCMS (EI) m/e 144,0 (M+ + H).

[00273] Etapa B: Cloreto de 4-Amino-N-hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3- carboximidoila (3)

[00274] 4-Amino-N'-hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida (422 g, 2,95 mol) foi adicionada a uma mistura de água (5,9 L), ácido acéti- co (3 L) e ácido clorídrico 6 N (1,475 L, 3,0 equiv.) e a suspensão foi agitada a 42- 45°C até se obter uma solução límpida. Foi adicionado cloreto de sódio (518 g, 3,0 equiv.) e esta solução foi agitada em um banho de gelo/água/metanol. Uma solução de nitrito de sódio (199,5 g, 0,98 equiv.) em água (700 ml) foi adicionada durante 3,5 h enquanto mantendo a temperatura abaixo de 0°C. Após a adição estar completa, a agitação foi continuada no banho de gelo durante 1,5 h e, em segui- da, a mistura de reação foi deixada aquecer até 15°C. O precipitado foi coletado por filtração, bem lavado com água, tomado em acetato de etila (3,4 L), tratado com sulfato de sódio anidro (500 g) e agitado em temperatura ambiente durante 1 h. Esta suspensão foi filtrada através de sulfato de sódio (200 g) e o filtrado foi concentrado em um evapo- rador rotativo. O resíduo foi dissolvido em éter metil terc-butila (5,5 L), tratado com o carvão vegetal ativado (40 g), agitado em temperatura ambiente durante 40 min e filtrado através de Celite. O solvente foi removido em um evaporador rotativo e o produto resultante foi seco em um forno de vácuo (45oC) para gerar o produto desejado (256 g, 53,4%) como forma de um sólido esbranquiçado. 13C RMN (100 MHz, CD3OD) δ 155,8, 143,4, 129,7; C3H3ClN4O2 (MW 162,53), LCMS (EI) m/e 163/165 (M+ + H).

[00275] Etapa C: 4-Amino-N-(3-bromo-4-fíuorofenil)-N'-hidróxi-1,2,5- oxadiazol-3-carboximidamida (4)

[00276] Cloreto de 4-Amino-N-hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3- carboximidoíla (33,8 g, 208 mmol) foi misturado com água (300 mL). A 60°C, 3-bromo-4-fluoroanilina (Sigma-Aldrich) (43,6 g, 229 mmol, 1,1 equiv.) foi adicionado à suspensão com agitação por 10 min. Uma so- lução de bicarbonato de sódio (26,3 g, 313 mmol, 1,5 equiv.) em água (300 mL) foi adicionada durante 15 min com agitação a 60°C. Depois de se agitar 20 min, LCMS indicou a conclusão da reação. A mistura de reação foi então resfriada até em temperatura ambiente e extraída com acetato de etila (2 x 300 mL). A solução de acetato de etila com- binada foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para gerar o produto desejado (65 g, 99%) como um sólido esbranquiçado, o qual foi utilizado na reação subsequente sem purificação adicional. C9H7BrFN5O2 (MW 316,09), LCMS (EI) m/e 316/318 (M+ + H).

[00277] Etapa D: 3-(4-Amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4- fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4H)-ona (5)

[00278] Uma mistura de 4-amino-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N '- hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida (65,7 g, 208 mmol), N,N- carbonildiimidazol (Sigma-Aldrich) (50,6 g, 312 mmol, 1,5 equiv.), e acetato de etila (750 mL) foi aquecida a 60°C e agitada durante 20 min. LCMS indicou que a reação completou. A reação foi resfriada até a temperatura ambiente, lavada com ácido clorídrico 1 N (2 x 750 mL), seca sobre sulfato de sódio, e concentrada. O produto em bruto foi tri- turado com uma mistura de diclorometano, acetato de etila, e éter die- tílico para gerar o produto desejado (60,2 g, 85%) como um sólido es- branquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,05 (m, 1H), 7,69 (m, 1H), 7,57 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 6,58 (s, 2H); C10H5BrFN5O3 (MW 342,08), LCMS (EI) m/e 342/344 (M+ + H).

[00279] Etapa E: [2-({4-[2-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-2,5-di-hidro- 1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3-il}amino)etil]carbamato de terc- butila(7)

[00280] A uma solução de ácido trifluoroacético (20,0 ml) e tetra- hidrofurano (10,0 mL) foi adicionado triacetoxiboro-hidreto de sódio (10,59 g, 49,97 mmol, 10,0 equiv.) em porções, com agitação, sob ni- trogênio. Esta mistura foi agitada durante 10 min em temperatura am- biente e depois resfriada até -5°C. Uma solução de 3-(4-amino-1,2,5- oxadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4 H)-ona (1,71 g, 5,0 mmol) e (2-oxoetil)carbamato de terc-butila (Sigma-Aldrich) (1,99 g, 12,5 mmol, 2,5 equiv.) em THF (15,0 mL) foi adicionada sob gotejamento durante 30 min com agitação, mantendo a temperatura abaixo de 0°C. A reação foi agitada a -5 até 0°C e porções adicionais de (2-oxoetil)carbamato de terc-butila (0,20 g, 1,2 mmol, 0,24 equiv.) em THF (1,0 mL) foram adicionados em gotas em 20 min, 40 min com intervalos de 4h. HPLC indicou que a reação completou após 5,25 h. A mistura de reação foi vertida em bicarbonato de sódio resfriado com gelo (500 mL) e esta solução foi agitada em temperatura ambiente du- rante a noite. O precipitado foi coletado por filtração e lavado com sal- moura. O resíduo resultante foi misturado com heptano (40 mL) e éter dietílico (40 mL) e agitado em temperatura ambiente durante 5 h. O precipitado foi coletado por filtração, lavado com éter dietílico e seco em um forno de vácuo para gerar o produto desejado (1953 mg, 80,5%) como um sólido esbranquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,08 (m, 1H), 7,71 (m, 1H), 7,59 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 6,94 (m, 1H), 6,52 (m, 1H), 3,32 (m, 2H), 3,15 (m, 2H), 1,36 (s, 9H); C1yH18BrFN6O5 (MW 485,26); LCMS (EI) m/e 507/509 (M+ + Na).

[00281] Etapa F: Cloridrato de 3-{4-[(2-Aminoetil)amino]-1,2,5- oxadiazol-3-il}-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4H)-ona (8)

[00282] Método A (preparado a partir de [2-({4-[2-(3-bromo-4- fluorofenil)-5-oxo-2,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]carbamato de terc-butila; Etapa E):

[00283] A um balão de 500 mL foi carregado [2-({4-[2-(3-bromo-4- fluorofenil)-5-oxo-2,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]carbamatode tert-butila (20 g, 41,2 mmol) e isopropanol (255 mL). A pasta foi agitada em temperatura ambiente. Gás de clore- to de hidrogênio (7,55 g, 207 mmol, 5,0 equiv.) foi adicionada à pasta com um tubo de vidro abaixo da superfície ao longo de 16 min. Acetato de etila (111 mL) foi em seguida adicionado ao lote e a reação foi aquecida a 43 oC e agitada durante 7,5 h. O lote foi resfriado a 19 o C e acetato de etila (44 mL) foi adicionado. A pasta foi filtrada e o resí- duo resultante foi lavado com acetato de etila (2 x 55 mL). O sólido iso- lado foi seco sob pressão reduzida a 45oC durante 15 h para gerar o produto desejado (16,61 g, 95,5% de rendimento) como um sólido es- branquiçado a branco. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,11 (bs, 3H), 7,78 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,59 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 6,74 (t, 1H, J = 6,1 Hz), 3,50 (m, 2H), 3,02 (m, 2H); C12H11BrClFN6O3, (MW 421,61; C12H10BrFN6O3 para base livre, MW 385,15), LCMS (EI) m/e 385/387 (M+ + H).

[00284] Método B (preparado diretamente a partir de 3-(4-Amino- 1,2,5-oxadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4H)- ona; Etapa D):

[00285] Triacetoxiboro-hidreto de sódio (2,33 g, 11,0 mmol, 11,0 equiv.) foi misturado com ácido trifluoroacético (12,0 mL, 155,8 mmol, 155,8 eq.). A solução resultante foi misturada em temperatura ambien- te durante 30 min. Uma solução de 3-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)-4- (3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4H)-ona (5, 0,342 g, 1,0 mmol) e (2-oxoetil)carbamato de terc-butila (Sigma-Aldrich) (1,04 g, 6,51 mmol, 6,5 equiv.) em diclorometano (10,0 mL) e acetonitrila (6,0 mL) foi agitada sob N2. Esta solução foi resfriada até -5°C e a solução de triacetoxiboro-hidreto de sódio e ácido trifluoroacético foi adicionada sob gotejamento ao longo de 5 min. A reação foi agitada em tempera- tura ambiente durante 4 h. HPLC e LC-MS (M+ - Boc + H: 385/387, padrão de brometo) indicou uma relação entre o produto desejado e o material de partida foi 4 para 1. A mistura foi concentrada e diluída com diclorometano (10 mL). A solução foi resfriada a 0°C e 4 N hidró- xido de sódio foi adicionado lentamente, mantendo a temperatura a 0- 5°C para ajustar o pH para 8-9. A camada aquosa foi extraída com di- clorometano (3 x 10 mL). A solução de diclorometano combinada foi lavada com bicarbonato de sódio e salmoura, seca sobre sulfato de sódio e concentrada. O resíduo em bruto foi então dissolvido em diclo- rometano (6,0 mL) e a solução resultante foi resfriada a 0°C. Ácido clo- rídrico 4 N em dioxano (3,0 mL) foi adicionado sob gotejamento a 0- 5°C. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 20 min. O precipitado foi coletado por filtração, lavado com éter dietílico, e seco em vácuo para gerar o produto desejado (289 mg, 54%) como um só- lido esbranquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,11 (bs, 3H), 7,78 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,59 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 6,74 (t, 1H, J = 6,1 Hz), 3,50 (m, 2H), 3,02 (m, 2H); C12H11BrClFN6O3, (MW 421,61; C12H10BrFN6O3 para base livre, MW 385,15), LCMS (EI) m/e 385/387 (M+ + H).

[00286] Etapa G: ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de terc-Butila (9)

[00287] Um reator de vidro de 20-L foi carregado com cloridrato de 3-{4-[(2-aminoetil)amino]-1,2,5-oxadiazol-3-il}-4-(3-bromo-4-fluorofenil)- 1,2,4-oxadiazol-5(4H)-ona (1200 g, 2,846 mol) e diclorometano (6,5 L) em temperatura ambiente. Trietilamina (950 g, 9,39 mol, 3,3 equiv.) foi adicionada ao lote durante 7 minutos. O lote foi então resfriado até - 14,6oC.

[00288] Um frasco de fundo redondo de 5 L foi carregado com terc- butanol (253 g, 3,41 mol, 1,2 equiv.) e diclorometano (2,6 L). A solução foi resfriada até 0,9oC. A esta solução foi adicionado clorosulfonil isoci- anato (463 g, 3,27 mol, 1,15 equiv.) durante 43 minutos enquanto mantendo a temperatura do lote abaixo de 10oC. A solução resultante de (clorosulfonil)carbamato de terc-butila foi mantida a 3 - 5oC por 1 h.

[00289] A solução de (clorosulfonil)carbamato de terc-butila foi adi- cionada ao reator ao longo de 73 min enquanto mantendo a tempera- tura do lote abaixo de 0oC. O lote foi em seguida aquecido a 10oC ao longo de 1 h e foi, em seguida, agitado a 10 - 14oC durante 1 h. A água (4,8 L) foi adicionada ao lote e a mistura de reação extinta foi agitada em temperatura ambiente durante 14,5 h. O lote foi deixado assentar e as fases separaram. A solução de diclorometano foi isolada mantida no reator e foi carregada com ácido acético (513 g) durante 25 minutos para precipitar o produto. A pasta resultante foi agitada a 20oC durante 2,5 h. O produto foi isolado por filtração e lavado com diclorometano (1,8 L). O produto foi seco sob pressão reduzida (-30 inHg) a 45oC du- rante 16 h para gerar o produto desejado (1342 g, 83,5% de rendimen- to) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,90 (s, 1 H), 8,08 (dd, J = 6,2, 2,5 Hz, 1 H), 7,72 (m, 1 H), 7,59 (t, J = 8,6 Hz, 1 H), 6,58 (t, J = 5,7 Hz, 1 H), 3,38 (dd, J = 12,7, 6,2 Hz, 2 H), 3,10 (dd, J = 12,1, 5,9 Hz, 2 H), 1,41 (s, 9 H). C17H19BrFN7O7S (MW 564,34), LCMS (EI) m/e 585,9/587,9 (M+ + Na).

[00290] Etapa H: N-[2-({4-[4-(3-Bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3-il}amino)etil]sulfamida (10)

[00291] A um frasco de 20-L contendo ({[2-({4-[4-(3-bromo-4- fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de terc-butila (1200 g, 2,126 mol) foi adicionado etanol (12 L) a 20oC. A mistura resultante foi agita- da em temperatura ambiente e carregada com cloreto de hidrogênio gasoso (472 g, 12,9 mol, 6,07 equiv.). O lote foi aquecido a 50oC e a temperatura foi mantida durante 3 h até conclusão da reação. O sol- vente foi removido por destilação sob vácuo a 33-39oC e 6 kg de desti- lado foi coletado. Acetato de etila (6,8 L, 6,1 kg) foi adicionada ao lote e destilada para coletar 5,1 kg de destilado. Acetato de etila (7,2 L, 6,48 kg) foi adicionada ao lote e destilado para coletar 5,1 kg de desti- lado. Acetato de etila (2,4 L, 2,14 kg) foi adicionada ao lote para ajus- tar a relação de solventes. 1H RMN indicava que a proporção molar de acetato de etila para etanol foi de 1,0: 0,1. A solução foi aquecida até 65oC. n-Heptano (4,1 kg) foi adicionado à solução a 60-65oC ao longo de 43 min. A pasta resultante foi agitada a 65 oC durante 1 h. A pasta foi resfriada até 20oC ao longo de 2,5 h e agitada a essa temperatura durante 15 h. O produto foi coletado por filtração e lavado com n - heptano (2,42 L). O produto foi seco sob pressão reduzida a 45oC du- rante 65 h para gerar o produto desejado (906 g, 91,8% de rendimen- to) como um sólido esbranquiçado. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,08 (dd, J = 6,2) 7,72 (m, 1 H), 7,59 (t, J = 8,7 Hz, 1 H), 6,67 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 6,55 (s, 2H) 6,52 (t, J = 6,0 Hz, 1 H), 3,38 (dd, J = 12,7, 6,3 Hz, 2 H), 3,11 (dd, J = 12,3, 6,3 Hz, 2H); C12H11BrFN7O5S (MW 464,23), LCMS (EI) m/e 485,8/487,8 (M+ - C5H8O2 + Na).

[00292] Etapa I: 4-({2-[(Aminossulfonil)amino]etil}amino)-N-(3- bromo-4-fluorofenil)-N'-hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida (11)

[00293] A um reator de vidro de 20-L foi adicionada N-[2-({4-[4-(3- bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5- oxadiazol-3-il}amino)etil]sulfamida (799,4 g, 1,72 mol) e THF (3,2 L). A solução resultante foi agitada a 20oC durante 7 min. e, em seguida, carregada com água (1,6 L). O lote foi resfriado a 2oC e foi carregado com 30% em peso de solução de hidróxido de sódio (475 mL, 666,4 g, 4,99 mol, 2,9 equiv.) ao longo de 8 minutos. O lote foi aquecido a 20oC e a temperatura foi mantida durante 16 h. O lote foi então carregado com metil terc-butil éter (8,0 L) ao longo de 23 minutos. A água (2,7 L) foi adicionada e o lote foi resfriado a cerca de 0oC. O lote foi em segui- da carregado com 85% em peso de ácido fosfórico (370,7 g, 3,22 mol, 1,9 equiv.) ao longo de 9 minutos. O lote foi aquecido a 20oC e agitado durante 1 h. O lote foi deixado assentar e as fases foram separadas. A camada orgânica foi retida no reator e carregada com água (2,9 L) e 85% em peso de ácido fosfórico (370.7g, 3,22 mol) e agitada a 20 oC durante 1 h. O lote foi deixado assentar e as fases foram separadas. A camada orgânica foi retida no reator e carregada com água (3,2 L) e agitada a 20oC durante 1 h. O lote foi deixado assentar e as fases fo- ram separadas. A solução orgânica foi retida no reator e destilada sob pressão reduzida a 20oC para remover 3,4 kg de destilado. O etanol (4,8 L) foi carregado para o lote e a mistura foi destilada até um volu- me de 3,2 L. Este processo de destilação foi repetido mais uma vez. O etanol (0,6 L) foi adicionado ao lote para ajustar o volume do lote a 4 L. O lote foi agitado a 20oC durante 16 h e, em seguida, carregado com água (6,39 L). A pasta resultante foi agitada a 20oC durante 5 h. O produto foi coletado por filtração e foi lavado duas vezes com uma mis- tura de etanol (529 mL) e água (1059 mL). O produto foi seco sob pressão reduzida a 45oC durante 65 h para gerar o produto desejado (719,6 g, 95,4%) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, DMSO- d6): δ 11,51 (s, 1 H), 8,90 (s, 1 H), 7,17 (t, J = 8,8 Hz, 1 H), 7,11 (dd, J = 6,1, 2,7 Hz, 1 H), 6,76 (m, 1 H), 6,71 (t, J = 6,0 Hz, 1 H), 6,59 (s, 2 H), 6,23 (t, J = 6,1 Hz, 1 H), 3,35 (dd, J = 10,9, 7,0 Hz, 2 H), 3,10 (dd, J = 12,1, 6,2 Hz, 2 H); C11H13BrFN7O4S (MW 438,23), LCMS (EI) m/e 437,9/439,9 (M+ + H).

[00294] Exemplo 2. Preparação alternativa de N-[2-({4-[4-(3- Bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5- oxadiazol-3-il}amino)etil]sulfamida

[00295] Etapa 1: {[(terc-butoxicarbonil)-amino]sulfonil}aminoacetato de Etila (13)

[00296] Uma solução de clorossulfonilisocianato (Sigma-Aldrich) (5,0 mL, 57,4 mmol) em diclorometano (100 mL) foi resfriada a 0°C. Terc-butil álcool (4,26 g, 57,4 mmol, 1,0 equiv.) foi adicionado dicloro- metano (100 mL) através de um funil de adição. Esta solução foi agi- tada a 0°C durante 30 min. Cloridrato de glicina etil éster (8,82 g, 63,2 mmol, 1,1 equiv.) foi adicionado seguido por adição sob gotejamento de trietilamina (20,0 mL, 144 mmol, 2,5 equiv.) a 0°C. Esta mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 4 h. A reação foi diluída com diclorometano (100 mL) e lavada com ácido clorídrico 0,1 N e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada para gerar o produto desejado (13,2 g, 81,4%) como um produto bruto sólido esbranquiçado, o qual foi utilizado na reação sub- sequente sem purificação adicional. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 10,88 (s, 1H), 8,07 (t, 1H, J = 6,1 Hz), 4,08 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 3,78 (d, 2H, J = 6,1 Hz), 1,40 (s, 9H), 1,18 (t, 3H, J = 7,1 Hz).

[00297] Etapa 2a. (alil{[alil(terc- butoxicarbonil)amino]sulfonil}amino)acetato de Etila (14a)

[00298] ({[(terc-butoxicarbonil)amino] sulfonil}aminoacetato de Etila (1,0 g, 3,54 mmol) foi misturado com carbonato de potássio (2,45 g, 17,7 mmol, 5,0 equiv.) e acetonitrila (23,0 mL) sob N 2 em temperatura ambiente. Brometo de alila (1,84 mL, 21,2 mmol, 6,0 equiv.) foi adicio- nado sob gotejamento. Esta mistura de reação foi aquecida a 70°C e agitada a essa temperatura durante 14 h. HPLC e LCMS indicaram a conclusão da reação. A reação foi filtrada e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi dissolvido em diclorometano e lavado com bicarbonato de sódio e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de só- dio e concentrada para gerar o produto desejado (1,11 g, 87%) na forma em bruto sólido esbranquiçado, o qual foi utilizado na reação subsequente sem purificação adicional. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 5,75 (m, 2H), 5,20 (m, 4H), 4,12 (m, 6H), 3,89 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,18 (t, 3H, J = 8,7 Hz).

[00299] Etapa 2b. [{[(terc-butoxicarbonil)(4- metoxibenzil)amino]sulfonil}(4-metoxibenzil)amino]acetato de Etila (14b)

[00300] ({[(terc-butoxicarbonil) amino]sulfonil}amino)acetato de Etila (1,00 g, 4,0 mmol) foi misturado com N, N -dimetilformamida (DMF, 6,0 mL) e agitado em temperatura ambiente. Iodeto de sódio (0,01 g, 0,1 mmol, 0,025 equiv.), carbonato de potássio (2,40 g, 20 mmol, 5,0 equiv.) e para-metoxibenzil cloreto (2,64 mL, 19,5 mmol, 4,875 equiv.) foram adicionados à mistura. Esta reação foi aquecida até 80°C e agi- tada a 80°C durante 2 h. LCMS indicou a conclusão da reação. A rea- ção foi resfriada até em temperatura ambiente e filtrada através de Ce- lite. O leito de Celite foi lavado com diclorometano e os filtrados orgâ- nicos combinados foram concentrados. O resíduo concentrado foi dis- solvido em diclorometano (20 mL) e lavado com bicarbonato de sódio (5 x 12 mL) e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada. O resíduo foi purificado sobre sílica-gel (0 - 40% de gradiente de eluição acetato de etila/hexano) para gerar o produto desejado (1,39 g, 80%) como um sólido esbranquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 7,22 (m, 2H), 7,14 (m, 2H), 6,88 (m, 4H), 4,64 (s, 2H), 4,33 (s, 2H), 4,03 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 3,92 (s, 2H), 3,72 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 1,39 (s, 9H), 1,14 (t, 3H, J = 7,1 Hz).

[00301] Etapa 3a. terc-butil alil{[alil(2- oxoetil)amino]sulfonil}carbamato (15a)

[00302] Uma solução de (alil{[alil( terc- butoxicarbonil)amino]sulfonil}amino)acetato de etila (1,11 g, 3,05 mmol) em diclorometano (15 mL) a -78 °C sob N2 foi tratada com 1,0 M de hidreto de di-isobutilalumínio em diclorometano (3,66 mL, 3,66 mmol, 1,2 equiv.). A mistura de reação foi agitada a -78 °C durante 1 h e, em seguida, extinta com metanol (1,5 mL) e tratada com uma solu- ção saturada de tartarato de potássio e sódio (65 ml). Esta solução foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A camada aquo- sa foi então extraída com diclorometano (3 x 20 mL). A solução de di- clorometano combinada foi lavada com salmoura, seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada para gerar o produto desejado (0,62 g, 64%) como um óleo incolor espesso em bruto, o qual foi utilizado na reação subsequente sem purificação adicional. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 9,45 (s, 1H), 5,76 (m, 2H), 5,18 (m, 4H), 4,15 (m, 4H), 3,72 (m, 2H), 1,43 (s, 9H).

[00303] Etapa 3b. (4-metoxibenzil){[(4-metoxibenzil)(2- oxoetil)amino]sulfonil}carbamato de terc-butila (15b)

[00304] Uma solução de [{[(terc -butoxicarbonil)(4- metoxibenzil)amino]sulfonil}(4-metoxibenzil)amino]acetato de etila (5,30 g, 10 mmol) em diclorometano (20,0 ml) a - 78 °C sob atmosfera de N2 foi tratada com 1,0 M de hidreto de di-isobutilalumínio em diclo- rometano (12,2 ml, 12,2 mmol, 1,22 equiv.). A mistura de reação foi agitada a -78°C durante 3 h. A reação foi então extinta com metanol (3 mL) e tratada com diclorometano (100 mL) e uma solução saturada de tartarato de potássio e sódio (150 mL). Esta solução foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A camada aquosa foi então ex- traída com diclorometano (3 x 20 mL). A solução de diclorometano combinada foi lavada com salmoura, seca sobre sulfato de sódio e concentrada. O resíduo foi então purificado sobre sílica-gel (0-30% gradiente de eluição acetato de etila/hexano) para gerar o produto de- sejado (3,45 g, 71%) como um sólido esbranquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 9,24 (s, 1H), 7,23 (m, 4H), 6,88 (m, 4H), 4,68 (s, 2H), 4,31 (s, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,72 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 1,40 (s, 9H).

[00305] Etapa 4a. terc-butil alil(N-alil-N-(2-(4-(4-(3-bromo-4- fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il)-1,2,5-oxadiazol-3- ilamino)etil)sulfamoil)carbamato (16a)

[00306] A um frasco de 50 mL foi adicionado triacetoxiboro-hidreto de sódio (1,06 g, 5,0 mmol, 1,0 equiv.), ácido trifluoroacético (TFA, 2,0 mL, 26 mmol) e tetra-hidrofurano (THF, 1,0 mL) em temperatura ambi- ente. Esta mistura foi resfriada a - 5°C sob N2 e agitada a 0 -5°C du- rante 10 min. A esta solução foi adicionado 3-(4-amino-1,2,5- oxadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4 H)-ona (0,171 g, 5,0 mmol; Etapa D) e terc-butil alil{[alil(2- oxoetil)amino]sulfonil}carbamato (0,398 g, 2,5 mmol, 0,5 equiv.) em THF (1,5 mL) sob gotejamento a 0-5°C durante 5 min. A mistura de reação resultante foi agitada sob N 2 a 0-5°C. Nos pontos de tempo de 20 min, 40 min, e 2,5 h, uma solução de terc-butil alil{[alil(2- oxoetil)amino]sulfonil}carbamato (0,040 g, 0,125 mmol, 0,25 equiv.) em THF (0,20 mL) foi adicionada sob gotejamento a 0-5°C. Em 2,5 h, uma solução de triacetoxiboro-hidreto de sódio (0,211 g, 1,0 mmol, 0,2 equiv) em ácido trifluoroacético (TFA, 1,5 mL, 9,5 mmol) foi adicionada a 0-5°C. A reação foi aquecida até em temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura de reação foi então vertida para uma solu- ção saturada resfriada com gelo de carbonato de sódio (50 mL) e ex- traída com diclorometano (3 x 20 mL). Os extratos de diclorometano combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de só- dio, e concentrados. O resíduo foi então purificado em sílica-gel (0- 75% gradiente de eluição acetato de etila/hexano) para gerar o produ- to desejado (0,239 g, 74,2%) como um sólido esbranquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,07 (m, 1H), 7,71 (m, 1H), 7,58 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 6,62 (m, 1H), 5,77 (m, 2H), 5,19 (m, 4H), 4,17 (m, 2H), 3,89 (m, 2H), 3,44 (m, 2H), 3,38 (m, 2H), 1,42 (s, 9H); C23H27BrFN7O7S (MW 644,47), LCMS (EI) m/e 544/546 (M+ - Boc + H).

[00307] Etapa 4b. N-(2-(4-(4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il)-1,2,5-oxadiazol-3-ilamino)etil)-N-(4- metoxibenzil)sulfamoil(4-metoxibenzil)carbamato de terc-butila (16b)

[00308] A um frasco de 50 mL foram adicionados triacetoxiboro- hidreto de sódio (0,50 g, 2,37 mmol, 4,74 equiv.), ácido trifluoroacético (TFA, 1,0 mL, 13 mmol) e tetra-hidrofurano em temperatura ambiente. Esta mistura foi resfriada a 0 -5°C sob atmosfera de N2 e agitada a 0- 5°C durante 10 min. A esta solução foi adicionado (4-metoxibenzil){[(4- metoxibenzil)(2-oxoetil)amino]sulfonil}carbamato de terc-butila (0,40 g, 0,84 mmol, 1,68 equiv) e 3-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)-4-(3-bromo- 4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4 H)-ona (0,17 g, 0,50 mmol; Etapa D) em tetra-hidrofurano (THF, 1,50 mL) a 0 -5°C. A reação foi agitada a 0- 5°C durante 45 min e uma solução de (4-metoxibenzil){[(4- metoxibenzil)(2-oxoetil)amino]sulfonil}carbamato de terc-butila (0,12 g, 0,20 mmol, 0,4 equiv.) em THF (0,50 mL) foi então adicionada a 0- 5°C. Depois de agitar a 0-5°C durante 1 h, a mistura de reação foi gradualmente aquecida até em temperatura ambiente com agitação. Em pontos de tempo de 2,5 h e 4,5 h, o ácido trifluoroacético (0,25 mL) foi adicionado. Em 5 h, uma solução de (4-metoxibenzil) {[(4- metoxibenzil)(2-oxoetil)amino]sulfonil}carbamato de terc-butila (0,060 g, 0,1 mmol, 0,2 equiv.) em THF (0,20 mL) foi adicionada. Em 6,5 h, uma solução de triacetoxiboro-hidreto de sódio (0,060 g, 0,24 mmol, 0,48 equiv.) em ácido trifluoroacético (0,25 mL) foi adicionada. HPLC indicou que cerca de 4% de 3-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)-4-(3- bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4 H)-ona como material de parti- da (da Etapa D) ainda restava. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. HPLC indicou a conclusão da reação. A mistura de reação foi vertida para uma solução saturada res- friada com gelo de carbonato de sódio (50 mL) e a mistura foi extraída com diclorometano (3 x 20 mL). Os extratos de diclorometano combi- nados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio, e concentrados. O resíduo foi então purificado sobre sílica-gel (0-30% gradiente de eluição acetato de etila/hexano) para gerar o produto de- sejado (0,33 g, 82,5%) como um sólido esbranquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,06 (m, 1H), 7,69 (m, 1H), 7,57 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 7,22 (m, 4H), 6,87 (m, 4H), 6,48 (m, 1H), 4,72 (s, 2H), 4,36 (s, 2H), 3,70 (S, 6H), 3,39 (m, 2H), 3,31 (m, 2H), 1,37 (s, 9H); CssHssBrFNyOgS (MW 804,64), LCMS (EI) m/e 826/828 (M+ - Boc + Na).

[00309] Etapa 5: N-[2-({4-[4-(3-Bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3-il}amino)etil]sulfamida (10)

[00310] A um frasco de 25 ml foi adicionado {[[2-({4-[4-(3-bromo-4- fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil](4-metoxibenzil)amino]sulfonil}(4-metoxibenzil)carbamato de terc-butila (40,2 mg, 0,050 mmol) em ácido trifluoroacético (TFA, 0,50 mL, 6,5 mmol) em temperatura ambiente. Esta mistura de reação foi aquecida a 70°C sob N2 e agitada durante 1 h. HPLC indicou que a reação completou. A mistura de reação foi resfriada até em tempera- tura ambiente e o TFA foi evaporado. O TFA residual foi removido por tratamento com diclorometano (3 x 10 mL) seguido por evaporação em vácuo. O resíduo foi depois triturado com diclorometano e metanol pa- ra gerar o produto desejado (20 mg, 87%) como um produto bruto só- lido esbranquiçado. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,08 (dd, J = 6,2, 2,5 Hz, 1 H), 7,72 (m, 1 H), 7,59 (t, J = 8,7 Hz, 1 H), 6,67 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 6,55 (s, 2H) 6,52 (t, J = 6,0 Hz, 1 H), 3,38 (dd, J = 12,7, 6,3 Hz, 2 H), 3,11 (dd, J = 12,3, 6,3 Hz, 2H); C12H11BrFN7O5S (MW 464,23), LCMS (EI) m/e 487,8/489,8 (M+ + Na).

[00311] Exemplo 3. Preparação alternativa de N-[2-({4-[4-(3- Bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5- oxadiazol-3-il)amino)etil]sulfamida

[00312] Etapa 1a. N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato de terc- butila (17a)

[00313] Uma solução de clorossulfonilisocianato (11,32 g, 80 mmol) em diclorometano (120 mL) foi resfriada a 0 °C. T erc-butil álcool (7,65 mL, 80,0 mmol, 1,0 equiv.) foi adicionado através de um funil de adi- ção. A mistura foi agitada a 0 °C durante 1,5 h. A esta mistura, uma solução de aminoacetaldeído dimetil acetal (8,76 mL, 80,0 mmol, 1,0 equiv.) e trietilamina (TEA, 33,4 mL, 240 mmol, 3,0 equiv.) em cloreto de metileno (DCM 120,0 mL) foi adicionada sob gotejamento através um funil de adição. A reação foi aquecida até em temperatura ambien- te e agitada durante a noite. A reação foi tratada com ácido clorídrico 0,1 N e a camada orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre sulfa- to de sódio e concentrada para gerar o produto desejado (15,6 g, 68,5%) como um produto bruto sólido esbranquiçado, o qual foi usado para a reação subsequente sem outra purificação: 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 10,84 (s, 1H), 7,62 (t, 1H, J = 6,0 Hz), 4,38 (t, 1H, J = 5,5 Hz), 3,24 (s, 6H), 2,96 (dd, 2H, J = 5,8 Hz), 1,41(s, 9H).

[00314] Etapa 1b. Benzil-N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato (17b)

[00315] Uma solução de clorossulfonilisocianato (16,26 g, 114,9 mmol) em diclorometano (100 mL) foi resfriada a 0°C. O álcool benzíli- co (12.44g, 115.0 mmol, 1,0 equiv.) foi adicionado através de um funil de adição. A mistura foi agitada a 0°C durante 0,5 h. À esta mistura foi adicionada uma mistura de aminoacetaldeído dimetil acetal (13,25 g, 126,0 mmol, 1,1 equiv.) e trietilamina (TEA, 17,4 g, 172 mmol, 1,5 equiv.) sob gotejamento através de um funil de adição a abaixo de 15°C. A reação foi aquecida até em temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura de reação foi tratada com ácido clorídrico 0,5 N (100 mL) e a fase orgânica coletada foi lavada com salmoura, seca sobre sulfato de sódio e concentrada em vácuo para gerar o pro- duto desejado (23,5 g, 64,3%) como um produto bruto sólido esbran- quiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,29 (s, 1H), 7,90 (t, 1H, J = 6,0 Hz), 7,37 (m, 5H), 5,12 (s, 2H), 4,35 (t, 1H, J = 5,5 Hz), 3,21 (s, 6H), 2,97 (dd, 2H, J = 5,8 Hz).

[00316] Etapa 1c. N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato de Etila (17c)

[00317] Uma solução de clorossulfonilisocianato (11,32 g, 80 mmol) em diclorometano (120 mL) foi resfriada a 0°C. Etanol (4,67 mL, 80,0 mmol, 1,0 equiv.) foi adicionado através de um funil de adição. A mis- tura foi agitada a 0°C durante 1,5 h. À esta mistura foi adicionada uma solução de aminoacetaldeído dimetil acetal (8,76 mL, 80,0 mmol, 1,0 equiv.), trietilamina (TEA, 33,4 mL, 240 mmol, 3,0 equiv.) em dicloro- metano (DCM, 120,0 mL) sob gotejamento por meio de funil de adição a 0°C. A reação foi aquecida até em temperatura ambiente e agitada durante a noite. A reação foi tratada com ácido clorídrico 0,1 N e a fa- se orgânica coletada foi lavada com salmoura, seca sobre sulfato de sódio e concentrada em vácuo para gerar o produto desejado (11,2 g, 55%) como um produto bruto esbranquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,13 (s, 1H), 7,81 (t, 1H, J = 6,0 Hz), 4,37 (t, 1H, J = 5,5 Hz), 4,09 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 3,23 (s, 6H), 2,97 (dd, 2H, J = 5,8 Hz), 1,19 (t, 3H, J = 7,1 Hz).

[00318] Etapa 1d. N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato de 2,2,2- tricloroetila (17d)

[00319] Uma solução de clorossulfonilisocianato (6,96 mL, 80 mmol) em diclorometano (120 mL) foi resfriada a 0°C. 2,2,2- tricloroetanol (7,67 mL, 80,0 mmol, 1,0 equiv.) foi adicionado por meio de funil de adição a 0°C. Esta mistura foi agitada a 0°C durante 1,5 h. À esta mistura foi então adicionada uma solução de aminoacetaldeído dimetil acetal (8,76 mL, 80,0 mmol, 1,0 equiv.) e trietilamina (TEA, 33,4 mL, 240 mmol, 3,0 equiv.) em diclorometano (DCM, 120,0 mL) adicio- nada sob gotejamento através de um funil de adição a 0°C. A reação foi aquecida até em temperatura ambiente e agitada em temperatura ambiente durante a noite. A reação foi tratada com ácido clorídrico 0,1 N e a fase orgânica coletada foi lavada com salmoura, seca sobre Na 2 SO 4, e concentrada para gerar o produto desejado ( 28,01 g, 97%) como um produto bruto sólido esbranquiçado, o qual foi utilizado na reação subsequente sem purificação adicional. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,79 (s, 1H), 8,08 (t, 1H, J = 5,9 Hz), 4,90 (s, 2H), 4,37 (t, 1H, J = 5,5 Hz), 3,23 (s, 6H), 3,00 (dd, 2H, J = 5,7 Hz).

[00320] Etapa 2a. ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de Terc-butila (18a)

[00321] Uma mistura de 3-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)-4-(3- bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4H)-ona (103 mg, 0,302 mmol, 1,5 equiv.; Etapa D) e N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato de terc- butila (57,2 mg, 0,201 mmol) em diclorometano (1,0 mL) foi agitada sob N2 em temperatura ambiente. A esta mistura foi adicionado ácido trifluoroacético (0,50 mL, 6,5 mmol) e trietilsilano (80,2 mL, 0,502 mmol, 2,5 equiv.) sob gotejamento. Esta mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. HPLC indicou uma conversão de aproximadamente 30%. A mistura de reação foi resfriada até 0°C e neutralizada com bicarbonato de sódio saturado até pH ~ 8. A mistura foi extraída em acetato de etila (3 x 10 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de só- dio e concentrados. O resíduo foi purificado por TLC preparativa (50% acetato de etil/hexano) para gerar o produto desejado (27,5 mg, 29,5%) como um sólido esbranquiçado. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): δ 10,90 (s, 1H), 8,08 (dd, J = 6,2, 2,5Hz, 1H), 7,72 (m, 1H), 7,59 (t, J = 8,6Hz, 1H), 6,58 (t, J = 5,7Hz, 1H), 3,38 (dd, J = 12,7, 6,2Hz, 2H), 3,10 (dd, J = 12,1, 5,9Hz, 2H), 1,41 (s, 9H). C17H19BrFN7O7S (MW 564,34), LCMS (EI) m/e 485,8/487,8 (M+ - C5H8O2 + Na).

[00322] Etapa 2b. ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de Benzila (18b)

[00323] Uma mistura de 3-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)-4-(3- bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4H)-ona (68 mg, 0,20 mmol; da Etapa D) e {[(2,2-dimetoxietil)amino]sulfonil}carbamato de benzila (191 mg, 0,60 mmol, 3,0 equiv.) em 1,2-dicloroetano (3,0 mL) foi res- friada a 0°C. A esta mistura foi adicionado ácido trifluoroacético (1,0 mL, 13,0 mmol) etrietilsilano (105 μL, 0,66 mmol, 3,3 equiv.) sob gote- jamento. Esta mistura de reação foi agitada a 0°C durante 2 h. HPLC indicou a conclusão da reação. A mistura de reação foi resfriada até 0°C e neutralizada com bicarbonato de sódio saturado até pH ~ 8 e a mistura de reação neutralizada foi extraída com EtOAc (3 x 10 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio e concentrados. O resíduo foi em seguida agi- tado numa mistura de heptano e éter dietílico durante a noite. Os sóli- dos foram coletados por filtração, lavados com heptano e secos em vácuo para gerar o produto desejado (125 mg, 99% ) como um produto bruto sólido esbranquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,31 (s, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,87 (m, 1H), 7,68 (m, 1H), 7,56 (m, 1H), 7,32 (m, 5H), 6,54 (m, 1H), 5,07 (s, 2H), 3,29 (m, 2H), 3,09 (m, 2H); C20H17BrFN7O7S (MW 598,36), LCMS m/e 598/600 (M+ + H).

[00324] Etapa 2c. ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etilamino}sulfonil)carbamato de Etila (18c)

[00325] Uma mistura de 3-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)-4-(3- bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4 H)-ona (68 mg, 0,20 mmol; da Etapa D) e {[(2,2-dimetoxietil)amino]sulfonil}carbamato de etila (154 mg, 0,600 mmol, 3,0 equiv.) em 1,2-dicloroetano (2,50 mL, 31,7 mmol) was foi agitada a 0°C. A esta mistura foi adicionado ácido trifluoroacé- tico (1,00 mL, 13,0 mmol) e trietilsilano (105 μL, 0,66 mmol, 3,3 equiv.) = sob gotejamento. A mistura de reação foi agitada a 0°C durante 3 h. HPLC indicou uma conversão de 97,5% para o produto desejado. A mistura de reação foi resfriada até 0°C e neutralizada com bicarbonato de sódio saturado até pH ~ 8. A mistura foi extraída em acetato de etila (3 x 10 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio e concentrados. O resíduo foi agitado numa mistura de heptano e éter dietílico durante a noite. Os sólidos foram coletados por filtração, lavados com heptano para gerar o produto desejado (95 mg, 88%) como um produto bruto sólido es- branquiçado. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,18 (s, 1H), 8,08 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,59 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 6,56 (s, 1H), 4,04 (d, 2H, J = 7,2 Hz), 3,35 (m, 2H), 3,11 (m, 2H), 1,15 (t, 3H, J = 7,2 Hz); C15H15BrFN7O7S (MW 536,29), LCMS (EI) m/e 536/538 (M+ + H).

[00326] Etapa 2d. ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de 2,2,2-Tricloroetila (18d)

[00327] Uma suspensão de 3-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-il)-4-(3- bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4 H)-ona (5, 0,680 g, 1,99 mmol) e {[(2,2-dimetoxietil)amino]sulfonil}carbamato de 2,2,2-tricloroetila (17d, 2,22 g, 6,17 mmol, 3,1 equiv.) em diclorometano (DCM, 6,0 mL) foi agitada em temperatura ambiente. A esta mistura foi adicionado trietilsilano (1,27 mL, 7,95 mmol, 4,0 equiv.) e uma solução de ácido trifluoroacético (TFA, 3,0 mL, 39,0 mmol) em diclorometano (DCM, 2,0 mL), mantendo a temperatura da reação abaixo de 30°C. A mistura de reação se tornou homogênea após 5 min com agitação em temperatu- ra ambiente e foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. HPLC indicou a conclusão da reação. A reação foi filtrada e o precipitado foi suspenso numa mistura de diclorometano e heptano (razão de diclo- rometano para heptano foi de 1 para 9, em volume). A suspensão foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. O precipitado foi coletado por filtração e lavado com diclorometano a 10% em heptano e seco em vácuo para gerar o produto desejado (1,15 g, 90,4%) como um sólido esbranquiçado, o qual foi utilizado na reação subsequente sem purificação adicional. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,85 (s, 1H), 8,07 (m, 2H), 7,70 (m, 1H), 7,57 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 6,56 (m, 1H), 4,88 (m, 2H), 3,37 (m, 2H), 3,16 (m, 2H); C15H12BrCl3FN7O7S (MW 639,62), LCMS (EI) m/e 638/640/642 (M+ + H).

[00328] Etapa 3. N-[2-({4-[4-(3-Bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3-il}amino)etil]sulfamida (10)

[00329] Uma solução de ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo- 4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de 2,2,2-tricloroetila (320 mg, 0,50 mmol; da Etapa Q, Método D) em tetra-hidrofurano (THF, 4,0 mL) foi agitada em temperatura ambiente. Ácido acético (0,30 mL, 5,3 mmol) e flocos de zinco (160 mg, 2,5 mmol, 5,0 equiv.) foram adicio- nados sequencialmente. Esta mistura de reação foi agitada em tem- peratura ambiente durante 3 h. HPLC indicou a conclusão da reação. A mistura de reação foi filtrada através de Celite e a Celite foi lavada com THF. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo e o resíduo resultante foi dissolvido em acetato de etila (20 mL). A solução de ace- tato de etila foi lavada com carbonato de sódio saturado e salmoura, seca sobre sulfato de sódio e concentrada. O material em bruto foi cristalizado a partir de acetato de etila e éter dietílico para gerar o pro- duto desejado (147 mg, 63%) como um sólido esbranquiçado.

[00330] Example 4. Preparação alternativa de 4-({2- [(Aminossulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N'- hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida

[00331] Etapa 1. N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato de (9H- fluoren-9-il)metila

[00332] Em um frasco de fundo redondo de 2 L com 4 pescoços seco em forno foi carregado 9-fluorenilmetanol (50,0 g, 255 mmol) e DCM anidro (382 mL) em temperatura ambiente. A pasta resultante foi resfriada em um banho de gelo a cerca de 0 - 5°C. UUma solução de clorossulfonilisocianato (CSI, 23,0 mL, 264 mmol) em DCM anidro (127 mL) foi adicionada sob gotejamento à suspensão através de um funil de adição durante 22 minutos, mantendo a temperatura da mistura de reação a <5°C. A mistura resultante foi agitada a 0 - 5°C durante 1,75 h, produzindo uma pasta branca espessa. Uma solução de aminoace- taldeído dimetil acetal (27,9 ml, 255 mmol) em DCM anidro (382 mL) e 4-metilmorfolina (84,0 mL, 764 mmol) foi adicionada à mistura a cerca de 0 - 5°C ao longo de 71 minutos. A mistura de reação resultante foi, em seguida, agitada no banho de gelo durante 1,5 horas. Quando a HPLC mostrou que a reação estava completa, a mistura de reação foi acidificada pela adição sob gotejamento de um ácido fosfórico 1,0 M (H3PO4, aq., 640 ml) durante 22 minutos para um pH de 1-2. Água (300 mL), EtOAc (2150 mL) e heptano (250 mL) foram então adiciona- dos e a mistura resultante foi agitada durante 10 minutos. As duas fa- ses foram separadas e a fase orgânica foi lavada sequencialmente com água (500 ml), heptano (300 mL) e água (2 x 500 mL) e secas sobre MgSO4. O filtrado foi concentrado sob vácuo até a secura. Os sólidos resultantes foram novamente dissolvidos em EtOAc (600 mL) a 65°C e a solução quente foi filtrada em um balão de fundo redondo limpo de 3 L. O filtrado foi resfriado até temperatura ambiente e agita- do durante 2,5 h antes de heptano (1200 ml) ser então adicionado através um funil de adição durante 80 min. Depois de se agitar durante a noite em temperatura ambiente, a mistura foi, em seguida, resfriada em um banho de gelo durante 1 h. Os sólidos resultantes foram cole- tados por filtração, lavados com EtOAc a 25%/heptano (250 mL), e se- cos durante a noite a cerca de 40 - 45°C sob vácuo para gerar {[(2,2- dimetoxietil)amino]sulfonil}carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila (91,3 g, 88% de rendimento) como um pó branco. 1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 11,43 (s, 1H), 7,98 - 7,85 (m, 3H), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,43 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 7,33 (td, J = 7,4, 1,1 Hz, 2H), 4,44 - 4,33 (m, 3H), 4,33 - 4,22 (m, 1H), 3,23 (s, 6H), 2,99 (t, J = 5,8 Hz, 2H) ppm.

[00333] Etapa 2. ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di- hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de 9H-Fluoren-9-ilmetila

[00334] A uma suspensão agitada de 3-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3- il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-5(4H)-ona (10,00 g, 29,23 mmol) em DCM (160 mL) foi adicionado ácido metanossulfônico (Me- SO3H, 8,46 g, 88,04 mmol) e trietilsilano (Et3SiH, 8,37 g, 71,96 mmol) em temperatura ambiente ao longo de 10 minutos para gerar uma pas- ta. 9H-fluoren-9-ilmetil{[(2,2-dimetoxietil)amino]sulfonil}carbamato sóli- do (12,25 g, 30,14 mmol) foi adicionado em porções (1 g/3 - 4 minu- tos; ao longo de 1 h) enquanto mantendo a temperatura interna a me- nos de cerca de 20°C utilizando um banho-maria. Após a adição, a mistura resultante foi agitada a cerca de 13 a 22°C durante 3 dias. Trietilsilano (Et3SiH, 0,1755 g, 1,51 mmol) adicional e 9H-fluoren-9- ilmetil{[(2,2-dimetoxietil)amino]sulfonil}carbamato (0,3082 g, 0,76 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada em tempe- ratura ambiente durante um adicional de 23 h. Foi adicionado álcool isopropílico (IPA, 15 mL) e a mistura resultante foi agitada em tempe- ratura ambiente durante 1 h. Heptano (100 mL) foi adicionado e a mis- tura foi agitada em temperatura ambiente durante um adicional de 2 h. Os sólidos foram coletados por filtração, lavados com IPA/heptano (1/5; 2 x 30 mL) e heptano (2 x 30 mL), e secos sob vácuo para gerar ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo-4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3- il]-1,2,5-oxadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato de 9H- fluoren-9-ilmetila como um sólido branco (18,30 g, rendimento de 91,1%). 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 11,44 (s, 1H), 8,07 (dd, J = 6,2, 2,5 Hz, 1H), 7,90 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,72 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,71 (ddd, J = 8,9, 4,3, 2,6 Hz, 1H), 7,57 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1H), 7,40 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,31 (td, J = 7,4, 1,0 Hz, 2H), 6,55 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,35 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 4,25 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 3,39 (q, J = 6,4 Hz, 2H), 3,15 (q, J = 6,3 Hz, 2H); 13C RMN (126 MHz, DMSO-d6) δ 159,03 (d, J = 248,7 Hz), 156,61 (s), 155,22 (s), 151,55 (s), 148,67 (s), 143,29 (s), 140,68 (s), 133,82 (s), 133,39 (s), 130,05 (d, J = 8,5 Hz), 128,54 (d, J = 3,2 Hz), 127,73 (s), 127,07 (s), 125,24 (s), 120,11 (s), 117,42 (d, J = 24,0 Hz), 108,19 (d, J = 22,5 Hz), 66,70 (s), 46,17 (s), 43,34 (s), 40,79 (s) ppm; 19F RMN (376 MHz, DMSO-d6) δ -103,99 - -107,39 (m) ppm.

[00335] Etapa 3. 4-({2-[(Aminossulfonil)amino]etil}amino)-N-(3- bromo-4-fluorofenil)-N'-hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida

[00336] Em um balão de fundo redondo de 4 pescoços de 1 L foi carregado 9H-fluoren-9-ilmetil({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-oxo- 4,5-di-hidro-1,2,4-oxadiazol-3-il]-1,2,5-oxadiazol-3- il}amino)etil]amino}sulfonil)carbamato (25,0 g, 36,4 mmol) e THF ani- dro (250 mL) em temperatura ambiente para produzir uma solução homogênea. A solução foi então resfriada a 0 - 5°C em um banho de gelo antes de N,N-bis(2-aminoetil)etano-1,2-diamina (114 mL, 728 mmol) ser adicionado sob gotejamento durante 35 minutos através um funil de adição. O funil de adição foi lavado com THF anidro (50 mL) e o enxague foi adicionado à mistura de reação. O banho frio foi removido e a mistura de reação foi gradualmente aquecida até a tem- peratura ambiente e agitado em temperatura ambiente durante 2,5 h. EtOAc (400 mL) foi adicionado e a mistura resultante foi transferida para um balão de fundo redondo de 4 pescoços de 2 L e resfriada a cerca de 0 - 5°C em um banho de gelo. Uma solução de 2,0 M de HCl aquoso (400 mL, 800,0 mmol) foi adicionada sob gotejamento através um funil de adição, enquanto mantendo a temperatura interna abaixo de 10°C. As duas fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (200 mL). As frações orgânicas foram combinadas e resfri- adas a cerca de 6-7°C. Uma solução de 2,0 M de HCl aquoso (200,0 mL, 400,0 mmol) foi adicionada sob gotejamento à fração orgânica fria, mantendo a temperatura interna abaixo de 10°C. As duas fases foram separadas e a fase orgânica foi lavada com água (2 x 400 mL), seca sobre MgSO4, e concentrada sob pressão reduzida para um xarope amarelo claro. O xarope foi dissolvido em EtOAc (60,0 mL) para gerar uma solução homogênea. À solução foi adicionada uma solução de DCM (250,0 mL) e terc-butil metil éter (TBME, 100,0 mL) sob goteja- mento. A pasta resultante foi agitada durante a noite em temperatura ambiente, em seguida, resfriada em um banho de gelo durante 1 h. Os sólidos foram coletados por filtração, lavados com uma solução fria de 250 ml de gelo de DCM (150 mL) e TBME (100 mL), e secos sob vácuo para gerar 14,4 g do produto bruto pretendido sob a forma de sólidos brancos.

[00337] O produto em bruto foi dissolvido em EtOAc (140,0 mL) a 60°C e a solução quente foi filtrada. O filtrado foi resfriado até em tem- peratura ambiente antes de heptano (100,0 mL) ser adicionado sob gotejamento durante 55 min. A mistura resultante foi então agitada du- rante a noite em temperatura ambiente. Os sólidos foram coletados por filtração, lavados com uma mistura 2: 1 de heptano e EtOAc (75 mL), e secos sob vácuo a 40 - 50 oC até peso constante, para gerar 4- ({2-[(aminossulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N'- hidróxi-1,2,5-oxadiazol-3-carboximidamida (12,9 g, 81% de rendimen- to) como um sólido branco.

[00338] Exemplo A: Ensaio de enzima indolamina 2,3- dioxigenasae (IDO) humana

[00339] Indolamina 2,3-dioxygenasae (IDO) humana com um tag His N-terminal foi expressa em E. coli e purificada até homogeneidade. IDO catalisa a clivagem oxidativa do anel de pirrol de núcleo indol do triptofano para gerar N’-formilquinurenina. Os ensaios foram realiza- dos em temperatura ambiente, tal como descrito na literatura utilizando 95 nM de ido e 2 mM de D-Trp, na presença de ascorbato a 20 mM, 5 μM azul de metileno e 0,2 mg/mL de catalase em 50 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,5). As velocidades iniciais de reação foram registradas continuamente seguindo o aumento de absorbância a 321 nm devido à formação de N'-formilquinurenina (Ver: Sono, M., et al., 1980, J. Biol. Chem. 255, 1339-1345). O composto de Fórmula I foi testado no ensaio do Exemplo A e verificado por ter um IC50 de <200 nm.

[00340] Exemplo B: Determinação da atividade inibidora em en- saio baseado em células HeLa de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) ensaio/quinurenina

[00341] As células HeLa (#CCL-2) foram obtidas a partir da Ameri- can Type Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e mantidas rotineiramente em meio mínimo essencial (Eagle) com 2 mM de L- glutamina e BSS de Earle ajustado para conter 1,5 g/L bicarbonato de sódio, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 1 mM piruvato de sódio e soro bovino fetal a 10% (todos da Invitrogen). As células foram man- tidas a 37oC numa incubadora umidificada fornecida com 5% de CO 2. O ensaio foi realizado como se segue: As células HeLa foram semea- das numa placa de cultura de 96 poços a uma densidade de 5 x 10 3 por poço e cultivadas durante a noite. No dia seguinte, IFN- Y (50 ng/mL de concentração final) e as diluições em série dos compostos (num volume total de 200 μL de meio de cultura) foram adicionados a células. Após 48 horas de incubação, 140 μL do sobrenadante por po- ço foi transferido para uma nova placa de 96 poços. 10 μL de 6,1 N de ácido tricloroacético (# T0699, Sigma) foi misturado a cada poço e in- cubado a 50°C durante 30 minutos para hidrolisar N-formilquinurenina produzido pela indolamina 2,3-dioxigenase para quinurenina. A mistura de reação foi então centrifugada durante 10 min a 2500 rpm para re- mover sedimentos. 100 μL do sobrenadante por poço foram transferi- dos para outra placa de 96 poços e misturados com 100 μL de 2% (p/v) p-dimetilaminobenzaldeído (#15647-7, Sigma-Aldrich) em ácido acético. A cor amarela derivado da quinurenina foi medida a 480 nm utilizando um leitor de microplacas SPECTRAmax 250 (Molecular De- vices). L-quinurenina (# K8625, Sigma) foi utilizada como padrão. Os padrões (240, 120, 60, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,87 μM) foram preparados em 100 μL de meio de cultura e misturados com igual volume de 2 % (p/v) p-dimetilaminobenzaldeído. A percentagem de inibição a concen- trações individuais foram determinadas e foram obtidos os valores mé- dios de duplicados. Os dados foram analisados por meio de regressão não-linear para gerar valores de IC50 (Prism GraphPad). Veja: Ta- kikawa O, et al., 1988, J. Biol. Chem., 263(4): 2041-8.

[00342] Exemplo C: Determinação do efeito de inibidores de IDO sobre a proliferação de células T que é suprimida por células dendríticas expressando IDO

[00343] Os monócitos foram coletados a partir de células mononu- cleares periféricas humanas por leucoforese. Os monócitos foram en- tão semeados a uma densidade de 1 x 106 células/poço numa placa de 96 poços, utilizando meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 2 mM de L-glutamina (todos da Invitrogen). As célu- las aderentes foram mantidas na placa após cultura durante a noite a 37°C. Monócitos aderentes foram em seguida estimulados durante 5-7 dias com 100 ng/mL de GM-CSF (# 300-03, PeproTech) e 250 ng/ml de IL-4 (# 200-04, PeproTech), seguido por ativação com 5 μg/mL de LPS a partir de Salmonella typhimurium (# 437650, Sigma) e 50 ng/mL de IFN-Y (# 285-SE, R & D Systems) por mais 2 dias para indu- zir maturação de células dendríticas.

[00344] Depois da ativação de células dendríticas, o meio foi substi- tuído com RPMI 1640 completo suplementado com 100-200 U/ml de IL-2 (# CYT-209, ProSpec-Tany TechnoGene) e 100 ng/ml de anticor- po anti-CD3 (# 555336, PharMingen), células T (2-3 x 105 célu- las/poço), e diluições em série de compostos de IDO. Após incubação durante mais 2 dias, a proliferação de células T foi medida por um en- saio de incorporação de BrdU, utilizando um kit de proliferação celular colorimétrico de ELISA seguindo as instruções do fabricante (# 1647229, Roche Molecular Biochemicals). As células foram cultivadas continuamente durante 16-18 horas em presença de solução de mar- cação a 10 μM de BrdU. Em seguida, o meio de marcação foi removi- do, e 200 μL por poço de FixDenat foi adicionado às células e incuba- do durante 30 minutos em temperatura ambiente. A solução de FixDe- nat foi removida e 100 μL/poço de solução de trabalho anticorpo con- jugado anti-BrdU-POD foi adicionado. A reação foi realizada durante 90 minutos em temperatura ambiente. O conjugado de anticorpo foi então removido, e as células foram lavadas três vezes com 200 μL/poço solução de lavagem. Finalmente, 100 μL/poço de solução de substrato foi adicionado e os resultados foram obtidos utilizando um leitor de microplacas (Spectra Max Plus, Molecular Devices) durante o desenvolvimento da cor. Obtiveram-se várias leituras, em vários pon- tos de tempo para garantir que os dados estavam dentro do intervalo linear. Os dados foram rotineiramente obtidos a partir de experimentos replicados, e os controles apropriados foram incluídos. Veja: Terness P, et al. 2002, J. Exp. Med., 196(4): 447-57; e Hwu, P, et al. 2000, J. Immunol., 164(7): 3596-9.

[00345] Exemplo D: Teste IN VIVO de inibidores de IDO para a atividade antitumoral

[00346] A eficácia antitumoral in vivo pode ser testada utilizando protocolos de aloenxerto/xenoenxerto de tumor modificados. Por exemplo, foi descrito na literatura que a inibição de IDO pode ser si- nérgica com quimioterapia citotóxica em camundongos imunocompe- tentes (Muller, A.J., et al. 2005, Nat. Med. 11:312-319). Esta sinergia foi demonstrada ser dependente de células T por comparação dos efeitos sinérgicos de um inibidor da IDO investigacional em modelos de xenoenxerto de tumor de murino (por exemplo, B16 e variantes re- lacionados, TC-26, LLC) cultivadas em camundongos singênicos imu- nocompetentes ao observado em camundongos singênicos tratados com anticorpos neutralizantes anti-CD4, ou os mesmos tumores cres- cidos em camundongos imunocomprometidos (por exemplo, nu/nu).

[00347] O conceito de efeitos antitumorais diferenciais em camun- dongos imunocompetentes versus imunocomprometidos pode também permitir o teste de inibidores de IDO investigacionais como agentes individuais. Por exemplo, tumores LLC crescem bem em sua cepa hospedeira singênica, C57BL/6. No entanto, se estes camundongos são tratados com o inibidor da IDO 1-MT (versus placebo) a formação de tumores é significativamente retardada, o que implica que a inibição da IDO foi inibitória de crescimento (Friberg, M., et al. 2002, Int. J. Cancer 101:151-155). Seguindo esta lógica, pode-se examinar a eficá- cia de inibição IDO no modelo de tumor LLC xenoenxerto crescido em camundongos imunocompetentes C57Bl/6 e comparar os efeitos de inibidores de IDO no crescimento do tumor LLC em camundongos nus ou SCID (ou camundongos C57B1/6 tratados com anticorpos que neu- tralizam a atividade de células T). À medida que os efeitos de alívio da atividade supressora imune mediada por IDO de tumor provavelmente irá diferir dependendo do potencial imunogênico de diferentes modelos de tumor, as modificações genéticas podem ser feitas para as células tumorais para aumentar o seu potencial imunogênico. Por exemplo, a expressão de GM-CSF em células B16.F10 aumenta o seu potencial imunogênico (Dranoff, G., et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:3539-3543). Como tal, em alguns modelos de tumor (por exemplo B16.F10) pode-se gerar um [poli]clones que expressam proteínas es- timuladoras imunológicas, tais como GM-CSF e testar os efeitos inibi- dores do crescimento de inibidores de IDO contra tumores estabeleci- dos a partir destas células de tumor em ambos os camundongos imu- nocompetentes e imunocomprometidos.

[00348] Uma terceira via para avaliar a eficácia de inibidores IDO in vivo emprega modelos de aloenxerto/xenoenxerto de tumor murino ‘pré-imunização’. Nestes modelos, os camundongos imunocompeten- tes são sensibilizados para um antígeno ou antígenos específicos de tumor para imitar uma vacinação terapêutica antitumoral. Isto prepara os camundongos para uma resposta antitumoral mediada pelo sistema imunológico quando os camundongos foram subsequentemente desa- fiados com linhagens de células tumorais de murinas (tendo antígenos tumorais semelhantes aos utilizados para a imunização) em experi- mentos de xenoenxerto. A expressão da IDO demonstrou diminuir a resposta antitumoral e permitir que xenoenxertos cresçam mais rapi- damente. De modo importante, o crescimento de tumores neste mo- delo é inibido pelo inibidor da IDO 1-MT (Uyttenhove, C., et al. 2003, Nat. Med. 9:1269-1274). Este modelo é particularmente atraente uma vez que a atividade IDO é permissiva para o crescimento do tumor P815 e inibição específica da IDO deve, portanto, ser inibidora do crescimento.

[00349] Por último, a imunização terapêutica pode ser utilizada para avaliar o impacto de inibidores de IDO in vivo. Por exemplo, foi de- monstrado usando células B16-BL6 que pode-se desafiar camundon- gos Blk/6 com uma injeção intravenosa de células de tumor, seguido de tratamento com um peptídeo imunogênico bem caracterizado (por exemplo, TRP-2) expresso pelas células tumorais (Ji, et al., 2005, J. Immunol, 175: 1456-63). De modo importante, modificadores do siste- ma imunológico, tais como o anticorpo anti-CTL-4, podem melhorar as respostas a tais vacinações terapêuticas. O impacto de inibidores de IDO pode ser avaliado de um modo semelhante a imunização peptídi- ca tumoral com ou sem inibidor de IDO. A eficácia é avaliada pela so- brevivência dos animais (tempo para a morbidade) ou pela medição de metástases tumorais aos pulmões e/ou em outros órgãos em interva- los de tempo definidos.

[00350] Em qualquer um/todos os modelos acima mencionados, pode também ser possível medir diretamente e/ou indiretamente o número e/ou a atividade das células imunes reativas tumorais. Os mé- todos para a medição do número e/ou a atividade das células imunes reativas tumorais estão bem estabelecidas e podem ser realizadas usando técnicas familiares daquelas especialistas na técnica (Current Protocols in Immunology, Vol. 4, Coligan, J. E., et al.; Immunotherapy of Cancer, Human Press, 2006, Disis, M.L. e references therein). Con- ceitualmente, uma redução dos efeitos imunossupressores de IDO po- de resultar em números aumentados ou reatividade de células imunes específicas de tumor. Além disso, a inibição de IDO pode aumentar ainda mais o número ou a reatividade das células imunes de tumor reativo quando combinado com outros agentes terapêuticos, por exemplo, agentes quimioterápicos e/ou imunomoduladores (por exem- plo, anticorpos anti-CTLA4).

[00351] Todos os experimentos de aloenxerto/xenoenxerto podem ser realizados utilizando técnicas padrão de tumores (revisto por Cor- bett, et al., Em Cancer Drug Discovery e Development: Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, e Ap- proval, 2nd Ed. Teicher, B.A. e Andrews, P.A., Gumana Press Inc.: To- towa, NJ, 2004). A clonagem e a introdução de genes (por exemplo IDO, GM-CSF) em linhagens celulares tumorais podem ser realizadas usando técnicas familiares daqueles especialistas na técnica (revisto em Sambrook, J. e Russel, D., Molecular Cloning: A laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, 2001).

[00352] Exemplo E: Teste IN VIVO de inibidores de IDO em mo- delo de encefalite do vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) 1. Isolamento das células e a infecção viral

[00353] Os monócitos e PBL podem ser obtidos por elutriação por centrifugação em contra-corrente de pacotes de leucofereses de doa- dores soronegativos para HIV-1, 2 e hepatite B. Os monócitos são cul- tivados em cultura em suspensão, utilizando frascos de Teflon em meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM, Sigma-Aldrich) suple- mentado com 10% de soro inativado por calor humano agrupado, 1% de glutamina, 50 μg/gentamicina mL, 10 μg/mL de ciprofloxacina (Sig- ma), e 1000 U/ml de fator estimulador de colônias de macrófagos re- combinante humano altamente purificado. Após sete dias em cultura, MDM estão infectados com o HIV-1ADA em multiplicidade de infecção de 0,01. 2. Camundongos Hu-PBL-NOD/SCID HIVE

[00354] Camundongos NOD/C.B-17 SCID de quatro semanas de idade podem ser comprados (Jackson Laboratory). Os animais são mantidos em gaiolas microisoladoras estéreis sob condições isentas de agentes patogênicos. Todos os animais são injetados por via intra- peritoneal com anti-CD122 de rato (0,25 mg/camundongo) três dias antes do transplante de PBL e duas vezes com anticorpos asialo-GM1 de coelho (0,2 mg/camundongo) (Wako) um dia antes e três dias após a injeção de PBL (20 x 106 células/camundongo). Células MDM infec- tadas com HIV-1ADA (3 x 105 células em 10 μL) são injetadas por via intracraniana (i.c.) oito dias após a reconstituição de PBL gerando ca- mundongos hu-PBL-NOD/SCID HIVE. Imediatamente após injeção i.c. de MDM infectados com HIV-1 os camundongos hu-PBL-NOD/SCID HIVE são implantados por via subcutânea (s.c) com controle (veículo) ou pellets de compostos (14 ou 28 dias de liberação lenta, Innovative Research). Os experimentos iniciais foram concebidos para confirmar a indução de CTL específicos de vírus nos animais hu-PBL-NOD/SCID HIVE tratados com compostos IDO. Isto é confirmado por coloração com tetrâmero e análises neuropatológicas de eliminação de MDM do tecido cerebral. Em seguida, o ensaio é concebido para analisar a re- constituição de linfócitos humanos, as respostas imunológicas humo- rais, e alterações neuropatológicas. Nestes experimentos, os animais foram sangrados no dia 7 e sacrificados aos 14 e 21 dias após a ad- ministração de injeção i.c. de MDM humano. O sangue coletado em tubos contendo EDTA é utilizado para citometria de fluxo e o plasma é utilizado para a detecção de HIV-1 p24 utilizando ELISA (Beckman Coulter™). Os anticorpos específicos para o HIV-1 são detectados por ensaios de Western blot de acordo com as instruções do fabricante (kit Cambridge Biotech HIV-1 Western blot, Calypte Biomedical). Quanti- dades semelhantes de anticorpos específicos do vírus são detectadas no controle e animais tratados com composto. Um total de três experi- mentos independentes pode ser realizado utilizando três doadores di- ferentes de leucócitos humanos. 3. FACScan de sangue periférico e baço em hu PBL-NOD/SCID HIVE

[00355] Análise de FACS de duas cores pode ser realizada em sangue periférico em 1-3 semanas e os esplenócitos na semana 2 e 3 após administração de injeção i.c. de MDM humano. As células são incubadas com Abs monoclonais conjugados com fluorocromo (mAb) para CD4, CD8, CD56, CD3, IFN-Y humanos (eBioscience) durante 30 min a 4°C. Para avaliar a resposta imunológica celular, coloração in- tracelular de IFN-y é realizada em combinação com anti-CD8 humano e anti-CD45 de camundongo conjugado com FITC para excluir células murinas. Para determinar CTL específico de Ag, coloração de tetrâme- ro conjugado com aloficocianina para o HIV-1gag (p17 (aa77-85) SLYNTVATL, SL-9) e HIV-1pol [(aa476-485) ILKEPVHGV, IL-9] é reali- zada em esplenócitos estimulados com fitohemaglutinina/interleucina-2 (PHA/IL-2). As células são coradas segundo a recomendação do NIH/National Institute of Allergy e Infections Disease, National Tetra- mer Core Facilities. Os dados foram analisados com um FACS Cali- burTM usando software CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry System). 4. Análises histopatológicas e de imagem

[00356] O tecido cerebral é coletado nos dias 14 e 21 após injeção i.c. de MDM, fixado em paraformaldeído a 4% tamponado com fosfato e embebido em parafina ou congelado a -80oC para uso posterior. Se- ções coronais de blocos embebidos são cortadas de modo a identificar o local da injeção. Para cada camundongo, seções seriais 30-100 (5- μm de espessura) são cortadas a partir do local da injeção MDM hu- mano e 3-7 lâminas (10 seções afastadas) são analisadas. Seções do cérebro são desparafinadas com xileno e hidratadas em gradientes de álcoois. A coloração imunohistoquímica segue um protocolo indireto de base, utilizando a recuperação de antígeno por aquecimento a 95 ° C em 0,01 mol/L de tampão citrato durante 30 min para a recuperação de antígeno. Para identificar as células humanas no cérebro do rato, o mAb para vimentina (1:50, clone 3B4, DAKO Corporation), que identifi- ca todos os leucócitos humanos é usado. MDM humano e linfócitos CD8+ são detectados com anticorpos CD68 (diluição 1:50, clone KP 1) e CD8 (diluição 1:50, clone 144B), respectivamente. As células infec- tadas por vírus são marcadas com mAb para HIV-1 p24 (1:10, clone Kal-1, todos da Dako). As células microgliais de murinos reativas são detectadas com um anticorpo Iba-1 (1:500, Wako). Expressão de IDO humana (huIDO) é visualizada com Abs obtidos a partir do Departa- mento de Farmacologia Celular, Instituto de Pesquisa Central, Escola de Medicina da Universidade de Hokkaido, Sapporo, Japão. Os anti- corpos primários são detectados com os anticorpos secundários bioti- nilados apropriados e visualizados com complexos de avidina-biotina (kit Vectastain Elite ABC, Vector Laboratories) e polímero de dextrano acoplado à peroxidase de rábano (HRP) (EnVision, DAKO Corpora- tion). As seções imunocoradas são contrastadas com hematoxilina de Mayer. As seções a partir do qual o anticorpo primário é eliminado ou irrelevante isotipo IgG é incorporado servindo como controles. Dois observadores independentes de forma cega contam os números de linfócitos CD8+, MDM CD68+ e células HIV-1 p24+ em cada seção de cada camundongo. Exame ao microscópio óptico é realizado com um microscópio Nikon Eclipse 800 (Nikon Instruments Inc). Análise semi- quantitativa para Iba1 (percentagem da área ocupada por imunocolo- ração) é realizada por análise de imagem assistida por computador (Imagem-Pro®Plus, Media Cybernetics) como previamente descrito. 5. Análise estatística

[00357] Os dados podem ser analisados usando Prism (Graph Pad) com teste de Student t- para comparações e ANOVA. Valores-p <0,05 foram considerados significativos. 6. Referência

[00358] Poluektova LY, Munn DH, Persidsky Y, e Gendelman HE (2002). Generation of cytotoxic T cells against virus-infected human brain macrophages in a murine model of HIV-1 encephalitis. J. Immu- nol. 168(8):3941-9.

[00359] Várias modificações da invenção, além das aqui descritas, serão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações destinam-se também a estar dentro do es- copo das reivindicações anexas. Cada referência, incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, e publicações, citados no presente pe- dido de patente são aqui incorporadas por referência na sua totalida- de.

Claims (21)

1. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende reagir um composto de Fórmula F17:

em que R4 é C1-6 alquila, C1-6 haloalquila, benzila, ou 9 H- fluoreno-9-ilmetila com um composto de Fórmula F5:

na presença de trietilsilano para gerar um composto de Fórmula F18:

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R4 é terc-butila.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R4 é benzila.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R4 é etila.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R4 é 2,2,2-tricloroetila.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita reação é realizada na presença de trietilsilano e ácido trifluoroacético.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a desproteção do referido composto de Fórmula F18 para gerar um composto de Fórmula F10:

em que a referida desproteção compreende a reação do composto de Fórmula F18 com zinco na presença de ácido acético.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda reagir o referido composto de Fórmula F10 com uma base para gerar um composto de Fórmula I:

em que a dita base é hidróxido de sódio.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R4 é 9H-fluoren-9-ilmetila.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida reação é realizada na presença de trietilsilano e ácido metanossulfônico.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a conversão do referido composto de Fórmula F18 a um composto de Fórmula I:

em que a referida conversão compreende a combinação do composto de Fórmula F18 com uma base para formar uma primeira mistura, em que a dita base é N,N-bis(2-aminoetil)etano-1,2-diamina e ainda, a adição de ácido clorídrico aquoso à referida primeira mistura.

12. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula F17:

em que R4 é haloalquila C1-6, benzila, ou 9H-fluoreno-9-ilmetila.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é selecionado de: benzil sulfamoilcarbamato de N-(2,2-dimetoxietila), N-(2,2-dimetoxietil) sulfamoilcarbamato de 2,2,2-tricloroetila; e N-(2,2-dimetoxietil)sulfamoilcarbamato de (9H-fluoren-9- il)metila.

14. Composto, caracterizado pelo fato de que é terc-butil sulfamoilcarbamato N-(2,2-dimetoxietil) ou etil sulfamoilcarbamato de N-(2,2- dimetoxietila).

15. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende: i) reagir um composto de Fórmula F19:

com um composto de Fórmula F5:

na presença de trietilsilano e ácido metanossulfônico para gerar um composto de Fórmula F20:

ii) converter o referido composto de Fórmula F20 a um composto de Fórmula I:

em que a referida conversão compreende combinar o referido composto de Fórmula F20 com N,N-bis(2-aminoetil)etano-1,2-diamina.

16. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula F18:

em que R4 é benzila, etila, C1-3 haloalquila, 2,2,2-tricloroetila ou 9H-fluoren-9-ilmetila.

17. Composto, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que R4 é benzila.

18. Composto, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que R4 é etila.

19. Composto, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que R4 é haloquila C1-3.

20. Composto, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que R4 é 2,2,2-tricloroetila.

21. Composto, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que R4 é 9H-fluoren-9-ilmetil.