JP2023501496A - Ｆ１６イソインドール小分子を使用する固形腫瘍の治療のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、固形腫瘍、特に多形成膠芽腫（ＧＢＭ）のような脳腫瘍の治療のためのＦ１６イソインドール小分子を使用する方法を提供する。Ｆ１６イソインドールは、血管新生の抑制剤であり、かつ腫瘍血管系に拮抗することができる。本発明はまた、Ｆ１６イソインドール小分子を含む医薬組成物を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、癌治療の分野に包含され、一般的に、固形腫瘍をターゲットにした小分子を使用する治療、特に脳腫瘍の治療のためのＦ１６イソインドール小分子を使用する治療に関する。

より新しい治療戦略及び治療法を開発するために捧げられている有意な労力及び資源にも関わらず、癌は、依然として人類の致命的な病気に留まっており、世界中の何百万もの人々が毎年様々なタイプの癌で死亡する。この致命的な病気の最も広まっているタイプの１つは、小児の癌関連死の主な原因であり、かつ１５と３９歳の間の若者及び若い成人での癌関連死の３番目に最も一般的な原因である脳腫瘍である［参考文献１、２］。

共通の生物学的特徴を共有する脳腫瘍の１２個の主なグループ及び１００個よりも多いサブグループがある［参考文献３］。神経膠腫は、脳の支持組織から生じる全ての腫瘍を含み、かつ脳腫瘍の最も攻撃的な形態であり、全ての原発性脳腫瘍の２４．７％及び全ての悪性脳腫瘍の７４．６％を占める［参考文献４］。多形成膠芽腫（ＧＢＭ）は、米国で最も診断された形態の神経膠腫であり、かつ世界中で最も致命的なタイプである。集学的治療手法の使用にも関わらず、ＧＢＭは、非常に低い５％５年生存率及び診断後約１年平均生存率を有する［参考文献３、４］。一般的に、ＧＢＭは、悪性度ＩＶの神経膠腫として分類され、それを他の悪性度と区別する組織学的特徴の一部は、壊死の存在及び腫瘍の周りの血管成長の劇的増大である［参考文献５］。実際に、ＧＢＭは、その成長が、神経膠腫成長が腫瘍関連血管の発生に決定的に依存することを示した様々な前臨床研究によって支持されるように血管新生に依存するので、最も高度に血管新生された固形腫瘍のうちの１つである［参考文献４、６］。これに加えて、ＧＢＭ腫瘍血管系は、曲がりくねって超浸透性でありかつ基底膜の異常に増大した血管径及び厚みを有する密な血管網によって特徴付けられる。この異常な腫瘍血管系は、腫瘍低酸素症を高めて細胞毒性化学療法の送出を阻害し、従って治療の失敗の一因になると考えられている［参考文献５、７］。従って、腫瘍血管を拮抗させることは、脳腫瘍治療に対する、特にＧＢＭの治療に対する新しい戦略として出現している。

ＧＢＭに対して現在利用可能である治療のいくつかの形態は、多くの場合に非効果的であり、従って、ＧＢＭに対する予後は不良のままである。膠芽腫の現在の治療は、適用可能な時はいつでも手術を伴い、放射線及びテモゾロミド（ＴＭＺ）による化学療法がそれに続く。この治療戦略は、全体生存率の適度の増大を提供する［参考文献８］。前臨床及び臨床研究では、化学療法剤と併用した血管新生抑制剤の使用は、広範な癌型に対して有望な結果を示している［参考文献９－１２］。特に、抗血管新生剤は、ＧＢＭを治療するために現在徹底的に調査中であり、様々な予備研究は、有望な結果をもたらしている［参考文献１３－１５］。従って、いくつかの抗血管新生剤は、現在、単独療法での又は併用でのＧＢＭの治療に対して臨床試験中である［参考文献１６］。これまでのところ、ベバシズマブ（ＢＶＺ）、すなわち、抗血管新生効果を有するモノクローナル抗体は、再発ＧＭＢの治療に対してＦＤＡによって承認されている。ＢＶＺのＦＤＡ承認は、全体的な「客観的奏効率（ＯＲＲ）」の増大に基づくものであった。しかし、ＧＢＭ患者のＢＶＺ治療データの徹底分析は、全体生存率（ＯＳ）の改善を示さなかった［参考文献１７、１８］。単独療法に使用する時の血管新生抑制剤は、一般的に細胞成長抑制効果を提供することができ、最大治療効果は、これらの薬剤が細胞毒性化学療法剤と併用される場合に達成されることに言及する価値はある［参考文献１９、２０］。

脳腫瘍を治療する主な障害のうちの１つは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る治療剤の能力である［参考文献２１］。ＢＢＢを貫通することは、ＢＶＺ（～１５０ｋＤ Ｍ.Ｗ.）のような高分子量を有する薬剤に対して容易ではなく、ＧＢＭに対するＢＶＺ治療が最適送出及び治療結果を提供しない場合があることを意味することは公知である［参考文献２２、２３］。従って、最近の関心事は、ＢＢＢを横切って血管新生及び類似の過程を調整ことができる小分子の利用に向けてシフトしている。この関連では、新規化合物、すなわち、イソインドール（１，３－ジオキシ－２,３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－４－イル）－アミドが、Ｎｏｖａ Ｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＳＵ）で及びＦ１６として命名されたコードで開発された。米国特許第７，８７５，６０３号明細書、日本特許第５４３６５４４号明細書、及び韓国特許第１０－１５３８８２２号明細書を参照されたい。Ｆ１６化学構造（１９、実施例２の参考文献）：

Ｆ１６は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）内でＶＥＧＦＲ－２リン酸化の強い血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）結合及び抑制を示すだけでなく、Ｆ１６は、乳癌及び［参考文献２４］結腸直腸癌異種移植片を移植したマウスで有意なインビボ成長抑制も示している（データ非公開）。より重要なことに、前臨床薬物動態研究は、Ｆ１６がＢＢＢを横切って脳領域の中に蓄積する可能性があることを示している［参考文献２５］。更に、前臨床安全性試験からの結果は、Ｆ１６治療された実験動物が、パクリタキセル［参考文献２４］及びスニチニブ［参考文献２５］のような他のＦＤＡ承認抗癌剤で治療されたグループと比較して健康に留まることをこれまでのところ実証している。

小分子Ｆ１６（イソインドール）は、乳癌のような固形腫瘍内の新しい血管の発育に必要な血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を遮断することによって抗血管新生効果を発揮する（図１）。Ｒｕｍｂａｕｇｈ－Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈで行われた研究では、特許取得済み小分子Ｆ１６は、固形腫瘍に対抗する抗血管新生及びプロアポトーシス（プログラムされた細胞死）効果の両方を明らかにしている。この新規化合物は、細胞培養及びインビボ実験の両方で有望な抗癌効果を示し、かつ既存のＦＤＡ承認抗癌剤の一部と比較した時に比較的少ない毒性を明らかにした。乳癌異種移植片マウスモデルに関する研究は、Ｆ１６が、その抗血管新生特性及びその腫瘍抑制機能に起因して、一般的に使用される化学療法剤、すなわち、パクリタキセル（タキソール）と同等である有意な抗癌効果を有することを示した。更に、このマウスモデル研究では、Ｆ１６は、タキソールと比較して遥かに少ない毒性を示した。異種移植片研究でも、Ｆ１６は、単独で又はパクリタキセルとの併用療法として使用された時に腫瘍成長を抑制するのに効率的であることを実証した。Ｆ１６及びタキソールの両方がインビボ研究で併用治療に使用された時に、それは、腫瘍成長のほぼ８５％抑制をもたらしただけでなく、多くの場合にタキソール単独療法に関連付けられる有意な毒性を生じなかった。これらの研究の発見は、血管新生能力を有する癌を治療するための抗癌剤としてのＦ１６の使用を支持する実質的な証拠を提供した。皮下移植型異種移植片治療を用いた治療研究に加えて、Ｆ１６の組織分布が分析され、これは、組織の５０００ｎｇ／ｇの範囲の脳内の蓄積を示した（図２）。この研究は、Ｆ１６が脳腫瘍の治療に対して自身の生存及び成長のための血管新生能力を示す有用であると考えられるという考えによって本発明者を駆り立てた。

米国特許第７，８７５，６０３号明細書 日本特許第５４３６５４４号明細書 韓国特許第１０－１５３８８２２号明細書 米国特許第７，９３９，５５７ Ｂ２号明細書

本明細書に説明する発明的方法（及び組成物）は、膠芽腫の進行を遅延させる際にＦ１６のその抗血管新成及びプロアポトーシス機能を通じた有効性を示すので、それ（Ｆ１６）は、潜在的に、脳腫瘍、特にそれらの成長及び生存を可能にする血管新生能力を示すものの有効治療のための新しい手段を生成する基礎として使用することができる。

小分子Ｆ１６（イソインドール）は、有望な新しい癌治療の可能性を提供する。予備的インビトロ及びインビボ実験に基づいて、単層培養及び３Ｄ培養での細胞毒性効果が確認された。癌細胞の移動及び浸潤能力に対するＦ１６の効果に関して良好な理解を達成するために、スクラッチアッセイ、トランス－ウェル移動アッセイ、及び浸潤アッセイが実行された。癌転移中の抗血管新生特性と典型的に一致するＵ８７ＭＧ細胞の抗移動効果及び抗浸潤能力が、上述のアッセイを通して決定された。結果は、Ｕ８７ＭＧ細胞の浸潤能力が、Ｆ１６による治療の２４時間後に投与量依存方式で未治療対照細胞に対して有意に低下したことを確認した。結果は、ＦＤＡ承認薬物であるＴＭＺ（テモゾロミド）と比較された。これまでのところ、Ｆ１６は、結果に提示したように、細胞移動、並びに癌細胞浸潤に対する一貫した抑制効果を示しており、これは、ＴＭＺ効果よりもかなり良好である。プロアポトーシス遺伝子発現の変化も分析されており、Ｆ１６は、ＴＭＺよりも良好に細胞周期を抑制し、かつＵ８７ＭＧ細胞株にアポトーシスを誘導することができるように見えた。

膠芽腫の治療に対するＦ１６の有効性を評価しながら光学撮像を通して腫瘍成長抑制をモニタするために、ルシフェラーゼ遺伝子導入Ｕ８７ＭＧ－ｌｕｃ腫瘍細胞が確立された。最初に、腹腔内注射（ｉ.ｐ.）を使用してＵ８７ＭＧ－Ｌｕｃ細胞を注入することにより、異種移植片モデルが生成された。Ｆ１６、ＴＭＺ、及び両方の薬物の併用を用いて動物が治療された。Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ膠芽腫細胞株を用いた研究は、Ｆ１６化合物を用いて良好な結果を示している。腫瘍容積を低減するが、Ｆ１６は、治療期間中に体重を変えなかった。Ｆ１６治療された動物でのＲＢＣ、ＷＢＣ（図１４Ａ－Ｂ）、ヘモグロビンレベル、ヘマトクリットなどのような血液パラメータの分析（図１４Ｃ－Ｇ）は、毒性の兆候を示さなかった。血液化学分析中に肝臓のマーカを見ている間に、ＴＭＺは、それがＦ１６治療細胞内で正常に近く留まりながら、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）レベルを有意に上昇させていた。Ｆ１６及びＪＦＤの両方は、ＢＵＮ（血中尿素窒素）レベルの上昇を示さなかったが、これは、腎機能が両方の薬物の影響を受けなかったことを示唆したものである。同様に、血糖、カルシウム、リン、及びタンパク質レベルは、正常範囲に留まった（図１４Ｃ－Ｇ）。

皮下腫瘍モデルを用いた効果の試験を完了後に及びＦ１６の安全性を確認した後に、頭蓋骨内インプラント研究が開始された。頭蓋内実験では、Ｆ１６は、動物の５０％において脳の腫瘍成長を遮断することができた。これは、Ｆ１６がＢＢＢを横切って脳内のＵ８７ＭＧ派生腫瘍の成長を抑制することができたことを確認したものである。賦形剤として使用されたＫＰ（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標））は、Ｆ１６の脳送出を僅かに増大していたが、一部の副作用も引き起こしていたことも注目されている。

最も基本的な態様では、本発明は、悪性細胞の操作、特に、制御不能な成長を特徴とする悪性細胞内の相互作用の方法を提供する。

別の基本的態様では、本発明は、癌に対する新しい治療様式を提供する。

一般的態様では、本発明は、固形腫瘍、特に、以下に限定されないが血管新生能力を示す固形腫瘍として現れる癌の治療のための方法及び組成物を提供する。

一般的態様では、本発明は、癌、特に、以下に限定されないが神経膠腫のような脳腫瘍の治療の方法及び組成物を提供する。

態様では、本発明は、攻撃的及び／又は後期脳腫瘍、特に、以下に限定されないが多形成膠芽腫（ＧＢＭ）の治療の方法及び組成物を提供する。

態様では、本発明は、血管新生能力を有する固形腫瘍及び／又は脳腫瘍、特に、以下に限定されないがＧＢＭの治療のための医薬組成物を提供し、（その組成物）は、Ｆ１６（イソインドール）小分子を含む。用語「Ｆ１６」及び「イソインドール」は、本明細書では互換的に使用される。

別の態様では、本発明は、固形腫瘍及び／又は脳腫瘍、特に、以下に限定されないがＧＢＭの治療のための医薬組成物を提供し、（医薬組成物）は、医薬担体内に治療有効投与量のＦ１６を含む。「医薬担体」は、医薬の調製に有用なあらゆる不活性及び非毒性薬剤とすることができる。語句「治療有効投与量」又は「治療有効量」は、望ましい機能、例えば、悪性細胞内の血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）の抑制を達成するのに必要な組成物の量を指す。悪性細胞は、制御不能な成長を特徴とする細胞である。用語「悪性細胞」、「癌細胞」、及び「腫瘍細胞」は、本明細書では互換的に使用される。

態様では、治療有効投与量のＦ１６に加えて、医薬組成物は、治療有効投与量の化学療法剤、特に、以下に限定されないがテモゾロミド（ＴＭＺ）又はベバシズマブ（ＢＶＺ）又は類似の薬剤を含むことができる。

態様では、本発明は、以下に限定されないが脳腫瘍の悪性細胞のような悪性細胞を治療するためのＦ１６組成物を使用する様々な方法を提供する。これらの方法は、本明細書に説明するＦ１６組成物を与える段階と、組成物を悪性細胞に投与する段階とを含む。これらの方法は、以下に限定されないが、悪性細胞内でＶＥＧＦＲ－２を抑制する段階と、悪性細胞内でＶＥＧＦＲ－２のリン酸化を抑制する段階と、周囲組織の中への悪性細胞の移動及び浸潤を抑制する段階と、悪性細胞内で細胞周期を抑制する段階と、悪性細胞内で細胞周期を阻止する段階と、悪性細胞内でアポトーシスを誘導する段階とを含む。

別の態様では、本発明は、異常血管系を示す組織内で血管新生を抑制する及び／又は阻止する方法を提供する。この方法は、本明細書に説明するＦ１６組成物を与える段階と、異常血管系を示す組織に組成物を投与する段階とを含む。この方法は、高度に血管質の固形腫瘍に対する又は新しい血管を生成する能力を有するあらゆる腫瘍に対する治療として使用することができる。そのような腫瘍の非限定的な例は、脳腫瘍である。

更に別の態様では、本発明は、多形成膠芽腫（ＧＢＭ）を治療する方法をそれを必要とする被験者に提供する。この方法は、本明細書に説明するＦ１６組成物を与える段階と、組成物を被験者に投与する段階とを含む。用語「被験者」は、本明細書に説明する組成物、方法、及び／又は治療の使用から利益を得ることになるあらゆる人間又は動物を指す。被験者の好ましいが非限定的な例は、脳腫瘍を有する人間患者である。

この本発明の他の目的及び利点は、本発明のある一定の実施形態を例示的に列挙する以下の説明から明らかになるであろう。

本発明のより完全な理解は、その後の詳細説明と併せて考慮する時に添付図面を参照することによって得ることができる。図面に図示する実施形態は、本発明を例示することのみを意図し、かつ本発明を図示の実施形態に限定するように解釈すべきではない。

血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の受容体への結合を防止し、従って抗血管新生効果を達成する血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）へのＦ１６結合の機構の概略図である。 Ｆ１６の組織分布を示す棒グラフである。 細胞生存能力が、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（米国、ＭＯ、セントルイス所在のシグマ－アルドリッチ）、及びトリパンブルー色素排除方法（ＴＢＤＥ）を使用して評価され、ＩＣ_５０が、５０％抑制に必要である薬物の濃度である細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。 細胞生存能力が、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（米国、ＭＯ、セントルイス所在のシグマ－アルドリッチ）、及びトリパンブルー色素排除方法（ＴＢＤＥ）を使用して評価され、ＩＣ_５０が、５０％抑制に必要である薬物の濃度である細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。 細胞生存能力が、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（米国、ＭＯ、セントルイス所在のシグマ－アルドリッチ）、及びトリパンブルー色素排除方法（ＴＢＤＥ）を使用して評価され、ＩＣ_５０が、５０％抑制に必要である薬物の濃度である細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。 Ｆ１６又はＴＭＺを用いた治療中のＵ８７ＭＧ細胞の形態を示す画像である（細胞死の前）。 Ｆ１６又はＴＭＺを用いた治療中のＵ８７ＭＧ細胞の形態を示す画像である（細胞死の前）。 スクラッチアッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の移動能力を示す図である。 スクラッチアッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の移動能力を示す図である。 スクラッチアッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の移動能力を示す図である。 スクラッチアッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の移動能力を示す図である。 トランス－ウェルアッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の移動能力を示す図である。 トランス－ウェルアッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の移動能力を示す図である。 トランス－ウェルアッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の移動能力を示す図である。 トランス－ウェルアッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の移動能力を示す図である。 細胞浸潤アッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の浸潤能力を示す図である。 細胞浸潤アッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の浸潤能力を示す図である。 細胞浸潤アッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の浸潤能力を示す図である。 細胞浸潤アッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の浸潤能力を示す図である。 軟寒天コロニー形成アッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の足場非依存性成長に対するＦ１６、ＴＭＺ、及び併用の効果を示す図である。 軟寒天コロニー形成アッセイを使用するＵ８７ＭＧ細胞の足場非依存性成長に対するＦ１６、ＴＭＺ、及び併用の効果を示す図である。 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）分析を使用するＵ８７ＭＧ細胞内の遺伝子発現を示す図である。 ウェスタンブロット分析を使用するＵ８７ＭＧ細胞内のタンパク質発現を示す図である。 ウェスタンブロット分析を使用するＵ８７ＭＧ細胞内のタンパク質発現を示す図である。 ウェスタンブロット分析を使用するＵ８７ＭＧ細胞内のタンパク質発現を示す図である。 膠芽腫異種移植片動物モデルの発展から得られる結果を示す図である。 膠芽腫異種移植片動物モデルの発展から得られる結果を示す図である。 膠芽腫異種移植片動物モデルの発展から得られる結果を示す図である。 膠芽腫異種移植片動物モデルの発展から得られる結果を示す図である。 膠芽腫異種移植片動物モデルの発展から得られる結果を示す図である。 Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ細胞内のルシフェラーゼ信号の選択及び測定の結果を示す図である。 Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ細胞内のルシフェラーゼ信号の選択及び測定の結果を示す図である。 マウスの体重変化を記録した棒グラフである。 マウスの血液学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの血液学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの血液学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの血液学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの血液学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの血液学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの血液学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの血液学的パラメータを参照する表１を示す図である。 マウスの生化学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの生化学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの生化学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの生化学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの生化学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの生化学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの生化学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの生化学的パラメータを示す棒グラフである。 マウスの生化学的パラメータを参照する表２を示す図である。 マウス内のＦ１６によるＵ８７ＭＧ派生異種移植片腫瘍成長の抑制を証明するデータを示す図である。 マウス内のＦ１６によるＵ８７ＭＧ派生異種移植片腫瘍成長の抑制を証明するデータを示す図である。 マウス内のＦ１６によるＵ８７ＭＧ派生異種移植片腫瘍成長の抑制を証明するデータを示す図である。 マウス内のＦ１６によるＵ８７ＭＧ派生異種移植片腫瘍成長の抑制を証明するデータを示す図である。 （マウスの）生存率及び（マウス内の）毒性の徴候を示す図である。 （マウスの）生存率及び（マウス内の）毒性の徴候を示す図である。 微小血管密度評価の結果を示す画像である。 微小血管密度評価の結果を示す画像である。 微小血管密度評価の結果を示す画像である。 微小血管密度評価の結果を示す画像である。 微小血管密度評価の結果を示す画像である。 微小血管密度評価の結果を示す画像である。

本発明の原理の理解を容易にする目的で本明細書に例示する実施形態をここで以下に参照し、それを説明するのに特定の言語を以下に使用する。それにも関わらず、本発明の範囲の制限がそれによって意図されないことは理解されるであろう。説明する組成物及び方法のあらゆる代替及び更に別の修正は、本明細書に説明するような本発明の原理のあらゆる更に別の適用と共に、本発明が関連する当業者に通常は想起されるであろうと考えている。

多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、非常に低い５年生存率を有する最も攻撃的で致死的タイプの癌のうちの１つである。従って、ＧＢＭに対する有効な治療の開発が緊急に望ましい。ＧＢＭは高度に血管新生され、その成長は血管新生依存性であるので、血管新生抑制剤を使用することによる腫瘍血管新生の拮抗は、様々な評価段階を受けている有望な手法であるように思える。この関連では、新規小分子のＦ１６の集中的前臨床評価は、選択的に拮抗する血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）を通じて強力な抗血管新生及び抗腫瘍活性を示している。より重要なことに、Ｆ１６の組織分布分析による薬物動態評価は、Ｆ１６が血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って搬送され、神経毒性の徴候なく脳領域の中に蓄積されたことを示している。従って、腫瘍血管新生の抑制を通じて膠芽腫の進行を遅延させる際のＦ１６の有効性を決定するために、更に別の研究が行われた。インビトロ研究は、Ｕ８７ＭＧ細胞の移動及び浸潤の抑制を明らかに示し、ＴＭＺ（ＩＣ_５０２６μＭ対４３０μＭ）と比較してこれらの細胞に対する強力な細胞毒性効果を確認した。これに加えて、Ｆ１６は、競合的結合を通じてＶＥＧＦ受容体を抑制し、ＶＥＧＦＲ－２のリン酸化を遮断し、ｐ５３媒介経路を活性化することによって細胞周期阻止及びアポトーシスを誘導した。更に、皮下移植（ｓ．ｃ．）異種移植片モデルによるインビボ研究では、Ｆ１６治療は、腫瘍成長を遅延させる際に有効であることを示している。これまでのところ、結果は、Ｆ１６治療が実質的に細胞周期阻止を誘導して腫瘍縮小効果を引き起こすことができることを示唆している。Ｆ１６はまた、ＢＢＢを横切って脳に達することができ、従って、膠芽腫をターゲットとするための実行可能な薬剤として出現している。

実施例１：膠芽腫の異種移植片モデル
材料及び方法
細胞株及び試薬
Ｕ８７ＭＧ、すなわち、ヒト膠芽腫細胞株は、ＡＴＣＣ（米国、ＶＡ、マナサス)から購入され、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）内に維持された。細胞は、加湿培養器内で９５％の空気及び５％のＣＯ_２と共に３７℃で培養された。Ｕ８７ＭＧ細胞は、細胞通過が３～９であった時にアッセイに使用された。Ｆ１６及びＴＭＺ（米国、ＭＯ、セントルイス所在のシグマアルドリッチ）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）内で溶液として調製された。ＶＥＧＦＲ－２、ｐ－ＶＥＧＦＲ－２（Ｔｙｒ １１７５）、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＥＲＫ１／２、ｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ５３、ｐ２１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９に対する抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国マサチューセッツ州のダンバース）から購入された。これらの実験に使用する全ての他の化学物質は、研究等級のものであった。

細胞毒性アッセイ
細胞生存能力は、３－（４，５－ジメチルチアゾ－ル－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（米国、ＭＯ、セントルイス所在のシグマアルドリッチ）及びトリパンブルー色素排除方法（ＴＢＤＥ）を使用して評価された。ＭＴＴアッセイに対してＵ８７ＭＧ細胞は、ウェル当たり５×１０^３の密度の６ウェルプレートで培養され、２４時間にわたって５％のＣＯ_２の下で培養された。次に、細胞は、様々な濃度のＦ１６（０．１－１００μＭ）及びＴＭＺ（０．１－５００μＭ）で２４時間にわたって処置された。処置の終わりに、古い培地は吸引され、１０μＬのＭＴＴ（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬ）が各ウェルに追加され、細胞は、更に３時間にわたって３７℃で培養された。最後に、ＭＴＴ溶液が除去され、１００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が各ウェルに追加された。プレートは、１０分にわたって軌道攪拌器上で穏やかに回転されて沈殿物を完全に溶解させ、吸光度は、マイクロプレート読取器（米国、ＣＡ、サニーベール所在のＶｅｒｓａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して５７０ｎｍで測定された。ＴＢＤＥ法に対してＵ８７ＭＧ細胞は、ウェル当たり５×１０^４の密度で２４ウェルプレート内で培養され、４８時間にわたって５％のＣＯ_２下３７℃で培養された。次に、細胞は、様々な濃度のＦ１６（０．１－１００μＭ）及びＴＭＺ（１０－１０００μＭ）で処置された。処置の２４時間、４８時間、及び７２時間後に、各処置からの細胞懸濁液のアリコート（５０μＬ）が、１：１（ｖ／ｖ）容積の０．４％トリパンブルーと混合された。生細胞は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＴＣ２０（登録商標）自動細胞計数器（米国、ＣＡ、ハーキュリーズ）で数えられた。

形態学的観察
Ｕ８７ＭＧ細胞は、６ウェル培養プレート内で７０％－８０％密集度まで成長させた。次に、様々な濃度のＦ１６（０．１－１００μＭ）及びＴＭＺ（１０－１０００μＭ）が培地に追加された。処置の２４時間後に、形態学的変化が、ライカ顕微鏡（１００倍の倍率）で記録された。少なくとも各処置ウェルから３視野を撮影して細胞形態の変化を見た。

移動アッセイ
Ｕ８７ＭＧ細胞の移動能力は、スクラッチ及びトランス－ウェルアッセイの両方を使用して決定された。スクラッチアッセイに対して単層のＵ８７ＭＧ細胞は、８０％集密度に近い６ウェルプレート上で成長した。殺菌した２００μＬチップを使用して、単一直線スクラッチが各ウェルで行われた。ウェルは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、様々な濃度のＦ１６（０．１－２０μＭ）及びＴＭＺ（１０－４００μＭ）を含有する成長培地で補充された。画像は、スクラッチ後１２時間及び２４時間でライカ顕微鏡を使用して撮影された。トランス－ウェル移動アッセイに対して８μｍ孔隙サイズを有する６．５ｍｍトランス－ウェルプレートのポリカーボネート膜インサート（米国、ＮＹ、コーニング）が使用された。初期平衡期間の後に、ＦＢＳなしの１００μＬの基礎培地で懸濁した５ｘ１０^４細胞は、トランス－ウェルインサートの上側区画に追加され、様々な濃度のＦ１６（０．１－２０μＭ）及びＴＭＺ（１０－４００μＭ）に露出された。下側チャンバは、１０％のウシ胎児血清で補充された６００μＬのＥＭＥＭ培地で充填された。次に、トランス－ウェルプレートは、２４時間にわたって５％ＣＯ_２下で３７℃で培養され、多孔質膜を横切ってＵ８７ＭＧ細胞の移動を可能にした。上部チャンバ上の非移動細胞は、綿棒で穏やかに除去された。チャンバの底部の移動細胞は、７０％エタノール内で固定されて２０分にわたって室温でクリスタルバイオレットにより染色された。次に、トランス－ウェルインサートは、過剰な色素が除去されるまで蒸留水で濯がれ、次に、トランス－ウェルインサートが乾燥することを可能にした。ウェル当たり５つの異なる視野が、１０倍の倍率を使用してライカ顕微鏡（米国、ＩＬ、ＤＭＩ ３０００ Ｂ）で撮影され、膜に浸透した細胞の数は、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（米国、ＭＤ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）を使用して数えられた。

浸潤アッセイ
上述の細胞移動アッセイは、多孔質膜を横切る細胞の数を測定するが、細胞浸潤アッセイは、Ｍａｔｒｉｇｅ（登録商標）のような細胞外基質を通る細胞の動きをモニタする。Ｕ８７ＭＧ細胞の細胞浸潤アッセイは、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ基質（米国、ＮＹ、コーニング）で事前に被覆されたＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＢｉｏＣｏａｔＴＭ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）浸潤チャンバを使用して実行された。２４－ウェル膜インサートの８μｍの孔隙は、単一細胞が浸潤することを可能にする。成長培地によるＭａｔｒｉｇｅｌの再水和後に、ＦＢＳなしの５００μＬの基礎培地に懸濁された５ｘ１０^４の細胞は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＢｉｏＣｏａｔＴＭ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）インサートの上側チャンバに追加され、様々な濃度のＦ１６（０．１－２０μＭ）及びＴＭＺ（１０－４００μＭ）に露出された。下側チャンバは、ウシ胎児血清で補充された７５０μＬのＥＭＥＭ培地で充填された。次に、アッセイプレートは、２４時間にわたって５％ＣＯ_２下で３７度Ｃで培養され、多孔質膜を横切るＵ８７ＭＧ細胞の浸潤を可能にした。上側チャンバに残っている非浸潤細胞は、綿棒で穏やかに除去された。チャンバの底部に見出された浸潤細胞は、７０％エタノール内で固定され、２０分にわたって室温でクリスタルバイオレットにより染色された。次に、インサートは、過剰な色素が除去されるまで蒸留水で濯がれて乾燥させた。ウェル当たり５つの異なる視野は、ライカ顕微鏡（１０倍の倍率）で撮影され、膜に浸透した細胞の数は、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して数えられた。

軟寒天コロニー形成アッセイ
このアッセイは、ＥＭＥＭを含有する０．６％アガロースで被覆した６ウェルプレート内で行われた。０．３％の低溶融アガロースを含有するＥＭＥＭに懸濁されたＵ８７ＭＧの５０００個の細胞が、各ウェルの固化０．６％アガロースに追加された。細胞は、Ｆ１６（１０及び２０μＭ）、ＴＭＺ（２００及び４００μＭ）及び両方（Ｆ１６の２０μＭ＋ＴＭＺの４００μＭ）の併用で処置された。２週間後に、細胞は、ＰＢＳで洗浄され、１５分にわたってメタノールで固定され、１５分にわたって０．００５％のクリスタルバイオレットで染色された。ウェル当たり５つの異なる視野は、ライカ顕微鏡（２．５倍の倍率）で撮影され、コロニーの数が数えられた。３つの独立した実験が、各アッセイに対して行われた。

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）分析
ＲＴ－ＰＣＲ分析に対して、全体ＲＮＡは、製造業者の指示によるＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（米国、ＣＡ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ）を使用して処置及び非処置Ｕ８７ＭＧ細胞から抽出された。ＲＴ－ＰＣＲ反応混合物（５０μＬ）は、１ｘＡＭＶ／Ｔｆｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．２ｍＭのｄＮＴＰ_Ｓ、順及び逆プライマーの１μＭ各々（表１に列挙）、及び各Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ及びＡＭＶ逆転写酵素の０．１ｕ／μＬから構成される。この反応から得られるＲＴ－ＰＣＲ生成物は、非変異原性蛍光ＤＮＡ色素を含有する１．５％のアガロースゲル（米国、ＰＡ、ラドナー所在のＶＷＲ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で電気泳動された。ｃＤＮＡバンドは、生体撮像システム（米国、ＣＡ、アップランド所在のＵＶＰ）を使用して可視化されて撮影された。ＲＴ－ＰＣＲ生成物は、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用してバンド強度を測定することによって比較された。

ウェスタンブロット分析
細胞溶解物及び細胞上清の両方からのタンパク質を使用して、ウェスタンブロッティングを行なった。処置の２４時間後に、Ｕ８７ＭＧ細胞は、プロテアーゼ抑制剤カクテル（米国テキサス州のダラス所在のＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を含有するＲＩＰＡ（放射線免疫沈降アッセイ）溶解バッファを使用して対照グループ及び治療グループの両方から抽出された。上清収集に対して細胞培養培地は、４℃で５分にわたって５０００ｒｐｍでは分離されて遠心分離され、細胞残屑を除去した。遠心分離後に、細胞培養培地は、４℃で１５分にわたって４，０００ｒｐｍでは１０ｋＤａの分画分子量限界で、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（登録商標）を使用して濃縮された。総タンパク質含有量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ法（米国、ＩＬ、ロックフォード所在のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定された。タンパク質分離に対してドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の５－１２％が、Ｌａｅｍｍｌｉによって説明されるように調整された［参考文献２６］。等量のタンパク質サンプルが、装填されて電気泳動を受け、次に、ニトロセルロース膜（米国、ＰＡ、ピッツバーグ所在のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移送された。５％の脱脂粉乳溶液で遮断した後に、膜は、適したＶＥＧＦＲ－２、ｐ－ＶＥＧＦＲ－２（Ｔｙｒ １１７５）、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＥＲＫ１／２、ｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ５３、ｐ２１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の１次抗体（１：１０００希釈）を用いて調べられた。膜は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素に接合されてＬｕｍｉＧＬＯ、化学発光、基質システム（米国のＫＰＬ ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して開発された２次抗体を用いてその後に培養された。負荷対照として、β－アクチンウェスタンブロットが分析に使用された。タンパク質バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して定量化された。

動物モデル
膠芽腫異種移植片モデルは、約２５ｇの重さの８－１０週齢の雄の無胸腺ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウス（米国、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ）を使用して開発された。全ての動物は、病原体のない食物及び水への自由なアクセスにより湿度及び温度（２２℃、１２：１２時間の明暗周期）の環境制御条件下で病原体のない換気ケージに収容された。全ての動物のケア及び実験は、米国フロリダ州のフォートローダーデール所在のＮｏｖａ Ｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＳＵ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の指針及び承認に従って実行された。動物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤバイオサイエンス）と混合された１００μＬのＰＢＳに懸濁された４ｘ１０^６のＵ８７ＭＧ膠芽腫癌細胞で各マウスの右脇腹の中に皮下注射された。３週間後に、マウスが十分に触知可能な腫瘍を発症すると、これらは、ランダムに４つのグループに分けられ、すなわち、グループＩは未処置の対照であり、グループＩＩはＦ１６（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置され、グループＩＩＩはテモゾロミド（５０ｍｇ／ｋｇ）で処置され、グループＩＶはＦ１６（１００ｍｇ／ｋｇ）及び３時間後にテモゾロミド（５０ｍｇ／ｋｇ）で処置された。実験マウスは、１６日の期間にわたって２日に１回処置された。処置の終わりに、腫瘍は単離され、次に、腫瘍の長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）が測定され、式：ＴＶ＝１／２×（Ｌ×Ｗ^２）により腫瘍容積（ＴＶ）を計算した。Ｆ１６及びＴＭＺ処置の腫瘍抑制効果を決定するために、抑制比（ＩＲ）は、式：ＩＲ（％）＝［１－(Σ治療グループ内のＴＶ／対照グループ内のＴＶ)×１００を使用して計算された。処置の終わりに、対照グループ及び実験グループの全ての動物は屠殺され、腫瘍は切除されて重さを量られた。

統計分析
本明細書で提供するデータは、少なくとも３つの独立した実験からの平均±ＳＤ値を表している。統計分析は、一元配置分散分析を使用して実行され、平均間の差は、ターキーの多重比較試験によって試験された。ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であると考えられた。Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ（Ｍａｃ ＯＳ Ｘバージョン７．０ｂ）を使用してグラフを発生させ、統計分析を実行した。

結果
Ｕ８７ＭＧ細胞生存能力に対するＦ１６及びＴＭＺの効果
ＭＴＴアッセイ及びＴＢＤＥを使用してＵ８７ＭＧ細胞の成長に対するＦ１６の抑制効果が確認された。様々な濃度のＦ１６（０．１－１００μＭ）及びＴＭＺ（０．１－５００μＭ）による処置の２４時間後のＭＴＴアッセイで得られる生細胞のパーセンテージを図３Ａに示している。Ｕ８７ＭＧ細胞の成長は、濃度依存方式でＦ１６処置後に有意に減少した。培養の２４時間後に、Ｕ８７ＭＧ細胞生存能力の５０％減少は、Ｆ１６の２６±４μＭ及びＴＭＺの４３０±１０μＭの濃度で得られることが見出された。これに加えて、ＴＢＤＥ法が、ＭＴＴ結果を確認するために実行された。Ｕ８７ＭＧ細胞の成長は、濃度及び時間依存的にＦ１６処置後に有意に減少した。２４、４８、及び７２時間にわたるＦ１６（１００μＭ）による処置後のＵ８７ＭＧ細胞死の最大パーセンテージは、それぞれ５８％、８２％、及び９５％であった（図３Ｂ）。２４、４８、及び７２時間にわたるＴＭＺ（１０００μＭ）による処置後のＵ８７ＭＧ細胞死の最大パーセンテージは、それぞれ６８％、９５％、及び８２％であった（図３Ｃ）。

細胞形態を濃度依存方式で変化させたＦ１６
細胞死に加えて、Ｆ１６は、濃度依存方式で細胞死に先行してＵ８７ＭＧ細胞の細胞形態の変化を誘導することができた（図４Ａ）。従って、Ｆ１６がＵ８７ＭＧ細胞内で細胞移動及び浸潤を抑制する可能性があることが提案された。２４時間にわたって１０及び２０μＭのＦ１６で処置した時にＵ８７ＭＧ細胞の有意な死がなく、同時に形態学的変化が観察されたという観察を考慮して、これらの濃度が更に別の研究に対して選択された。同様に、そのＩＣ５０値を下回った２００及び４００μＭのＴＭＺが更に別の研究に対して選択された。予想通り、Ｆ１６及びＴＭＺの両方は、Ｕ８７ＭＧ細胞の細胞形態を変化させ、それぞれ１００μＭ及び１０００μＭまで濃度依存的効果を示した（図４Ｂ）。

Ｕ８７ＭＧ細胞内の移動を抑制したＦ１６
Ｕ８７ＭＧ細胞の移動に対するＦ１６の抗血管新生特性及び効果を更に確認するために、一般的に使用されるスクラッチアッセイ（創傷治癒アッセイ）が実行された。結果は、Ｆ１６が濃度依存方式でＵ８７ＭＧ細胞の移動能力を有意に抑制することができたことを示した（図５Ａ－Ｂ）。スクラッチ後１２時間及び２４時間後に、移動は、細胞が２０μＭのＦ１６で処置された時に観察されず、これは、Ｆ１６がＵ８７ＭＧ細胞移動を抑制する強い能力を有することを明確に示している。しかし、４００μＭのＴＭＺで処置した細胞は、スクラッチ後１２時間まで移動の抑制を示したが、これらは、その後に移動し始めた（図５Ｃ－Ｄ）。同様に、Ｆ１６は、トランス－ウェル移動アッセイから得られる結果によって示すように、細胞移動に対して一貫した抑制効果を示している。２４時間にわたって２０μＭのＦ１６で処置したＵ８７ＭＧ細胞の約８０％は、Ｆ１６の強力な抗移動効果を示す未処置の細胞と比較して上側区画に捕捉された（図６Ａ－Ｂ）。結果的に、Ｕ８７ＭＧ細胞の約８０％は、未処置の細胞と比較して４００μＭのＴＭＺで処置する時に上側区画に捕捉された（図６Ｃ－Ｄ）。

Ｕ８７ＭＧ細胞内の浸潤を抑制したＦ１６
Ｆ１６が細胞埋浸潤能力を弱めるか否かを決定するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）浸潤アッセイが、トランス－ウェルプレートを使用して行われた。結果は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基質を通じて浸潤するＵ８７ＭＧ細胞が、未処置の対照細胞に対してＦ１６による処置の２4時間後に濃度依存方式で有意に減少したことを示した（図７Ａ－Ｂ）。図７Ａ－Ｂに示すように、Ｆ１６は、細胞侵襲能力を有意に低減した。しかし、遥かに高濃度（４００μＭ）では、類似の結果がＴＭＺ処置でも得られ、これは、ＴＭＺが濃度依存方式でＵ８７ＭＧ細胞の浸潤能力を僅かに抑制することができることを確認した（図７Ｃ－Ｄ）。

Ｕ８７ＭＧ細胞内の足場非依存性成長を低減したＦ１６
Ｕ８７ＭＧ細胞の足場非依存性成長に対するＦ１６の効果を探査するために、軟寒天コロニー形成アッセイが実行された。結果は、足場非依存コロニーの数が未処置の対照細胞と比較してＦ１６で処置した後で有意に減少したことを示した（図８Ａ－Ｂ）。同様に、類似の結果は、ＴＭＺ及び併用（Ｆ１６＋ＴＭＺ）処置で得られる（図８Ａ－Ｂ）。しかし、Ｆ１６（２０μＭ）及びＴＭＺ（４００μＭ）と比較して併用（Ｆ１６の２０μＭ＋ＴＭＺの４００μＭ）では有意な減少はない。

ＲＴ－ＰＣＲを使用するＵ８７ＭＧ細胞内の遺伝子発現の決定
発見を更に強化するために、図９は、Ｕ８７ＭＧ処置及び未処置細胞内で選択された遺伝子の発現レベルを示している。ＲＴ－ＰＣＲを通じて得られるバンド強度の違いは、対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの違いを示している。ＶＥＧＦＲ－２及びＡＫＴ ｍＲＮＡレベルは、対照と比較してＴＭＺ（４００μＭ）及びＦ１６＋ＴＭＺ併用（２０及び４００μＭ）では下方調整された。興味深いことに、ｐ５３及びＢａｘ ｍＲＮＡレベルは、ＴＭＺ（２００及び４００μＭ）及びＦ１６＋ＴＭＺ併用処置細胞と共にＦ１６（１０及び２０μＭ）処置細胞内で有意に上方調整された。更に、ｐ２１のｍＲＮＡレベルの僅かな上昇は、対照と比較してＦ１６及びＴＭＺ処置細胞で観察された。特に、Ｂｃｌ２、ＭＭＰ－２、及びＭＭＰ－９のｍＲＮＡレベルは、Ｆ１６、ＴＭＺを用いた個々の処置で及び同じく併用処置で有意に下方調整された。

ＶＥＧＦＲ－２リン酸化及び下流シグナリングの抑制
以前の研究は、ＶＥＧＦＲ－２活性化の防止が、腫瘍進行に重要な役割を果たす血管新生過程を有意に制限する可能性があることを明確に示している［参考文献２７］。ＶＥＧＦＲ－２の活性型であるホスホ－ＶＥＧＦＲ－２（Ｔｙｒ１１７５）のレベルは、Ｆ１６処置後に有意に減少した（図１０Ａ）。更に、ＶＥＧＦＲ－２の重要な分子下流ターゲットであるＳｅｒ４７３部位でのｐ－ＡＫＴ発現も、Ｕ８７ＭＧ細胞内でＦ１６によって有意に抑制された（図１０Ａ）。これらの結果は、Ｆ１６が、ＡＫＴ依存性細胞生存率を減衰する機能を有したことを示している。同様に、類似の結果は、ＴＭＺ及び併用（Ｆ１６＋ＴＭＺ）処置で得られる。

細胞周期阻止及びアポトーシスを誘導したＦ１６
細胞周期阻止及びアポトーシスにおけるＦ１６の役割をより良く理解するために、タンパク質ｐ５３、ｐ２１、Ｂａｘ、及びＢｃｌ２の発現が分析された。十分に確立された腫瘍抑制遺伝子であるＰ５３の発現は、Ｆ１６処置及び併用処置後に上方調整されたが、ＴＭＺ単独による処置後の発現レベルのより少ない増大を示した（図１０Ｂ）。これに加えて、ｐ２１発現は、Ｆ１６及び併用処置後に有意に上方調整された（図１０Ｂ)。驚くべきことに、ｐ２１の発現は、ＴＭＺ処置で有意に下方調整された（図１０Ｂ）。更に、Ｂａｘ発現はまた、Ｆ１６、ＴＭＺ、及び併用処置後に増大したが、Ｂｃｌ２の発現は、同じ処置で抑制された（図１０Ｂ）。これらの発見は、ｐ５３が、Ｕ８７ＭＧ細胞内でｐ２１及びＢａｘ依存性経路を通じて細胞周期阻止及びアポトーシスを誘導することを示唆する。

ＥＲＫ１／２、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、及び細胞浸潤に対するＦ１６の効果
ＥＲＫ１／２は、広範囲の細胞活動及び生理学的過程を制御する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼの重要な亜科である。ｐ－ＥＲＫ１／２の発現は、Ｆ１６、ＴＭＺ、及び併用処置後に上方調整された（図１０Ｃ）。更に、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９発現は、Ｆ１６処置後に下方調整された（図１０Ｃ）。これらの結果は、細胞浸潤の抑制をもたらしたＭＭＰ－２の下方調整発現に寄与するように見える持続的な方法でＥＲＫ１／２を活性化するＦ１６の能力を示している。興味深いことに、類似の結果は、ＴＭＺ及び併用処置でも得られる。

Ｆ１６によるＵ８７ＭＧ派生異種移植片腫瘍成長の抑制
Ｆ１６のインビボ腫瘍成長抑制効果を更に調査するために、Ｕ８７ＭＧ細胞を使用する皮下膠芽腫異種移植片モデルが、材料及び方法節で上述のように確立された。以前の研究は、Ｕ８７ＭＧ異種移植片モデルが、膠芽腫の前臨床試験に利用可能な最も広く利用されている実験モデルのうちの１つであると考えられることを示している［参考文献２８、２９］。従って、腫瘍が完全に確立された状態で、マウスは、上述のように４つのグループにランダム化され、１６日にわたってＦ１６、ＴＭＺ、及びＦ１６＋ＴＭＺ併用で腹腔内処置された。切除された腫瘍の代表的な写真は図１１Ａに示されている。結果は、Ｕ８７ＭＧ腫瘍を移植したマウスが、それぞれ１６日にわたるＦ１６（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＴＭＺ（５０ｍｇ／ｋｇ）、及びＦ１６（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭＺ（５０ｍｇ／ｋｇ）による処置後に腫瘍成長の５８％、５３％、及び７０％抑制を示すことを明らかに示した（図１１Ｂ）。興味深いことに、Ｆ１６単独療法の腫瘍成長抑制効果は、Ｆ１６グループでは毒性の兆候なく、示した投与量でＴＭＺに匹敵した。しかし、ＴＭＺとのＦ１６の併用、すなわち、膠芽腫癌の処置の標準的なケアは、Ｆ１６（５８％）又はＴＭＺ（５３％）のいずれの単独療法と比較しても腫瘍容積（７０％）のそれほど有意な減少を生じなかった。

実験マウスの体重の変化も処置期間中に検査された（図１１Ｃ）。以前の実験と一致してＦ１６処置は、処置に使用された投与量（１００ｍｇ／ｋｇ）で良好な忍容性を示している。しかし、体重減少、全身衰弱、腹水の蓄積のような毒性の症状は、ＴＭＺグループ、並びにＴＭＺグループの動物のうちの１匹を失った併用グループで処置の１週間後に観察された。処置期間の終わりに、腫瘍は、比較のために切除された。図１１Ｄに示すように、腫瘍重量は、対照グループと比較してＦ１６及びＴＭＺ、並びに併用治療グループでは有意に低かった。ＩＲ％は、方法の節に説明して図１１Ｅに示したように計算された。

議論
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）の予後は不良に留まっており、利用可能な処置オプションは、患者生存率の僅かに有意な増大を伴うごく僅かな利益を現在提供するに過ぎない。新たに診断されたＧＢＭの患者に対する現在のケアの標準は、放射線プラステモゾロミド（ＴＭＺ）のような化学療法剤による細胞毒性療法のコースに続いて外科的切除である［参考文献３０］。放射線療法へのＴＭＺの追加は、放射線療法単独の平均生存率の１２か月と比較して２．６か月だけ全平均生存率（合計１４．６か月）を延ばす［参考文献３１］。しかし、ＴＭＺ投与は、遺伝毒性、骨髄抑制、催奇形性、及び重度の腸損傷のような重篤な毒性に臨床的に関連付けられる［参考文献３２］。以前の研究は、一般的にいくつかの他の細胞毒性化学療法剤と同様に、ＴＭＺが、多くの場合に２次癌の発現に関連付けられた正常細胞に対する細胞毒性効果を保有することを報告している［参考文献３３］。ＴＭＺに関連付けられた全てのこれらの欠点は、科学者にＧＢＭの処置のためのより有効な処置オプションを開発するように促している。更に、ＧＢＭで見出されたＶＥＧＦの高い発現も、予後不良に関連しており、これは、ＧＢＭを処置するのに適切な薬剤として血管新生抑制剤を評価する論理的な理論的根拠を提供している。この関連では、その受容体へのＶＥＧＦ結合を競合的に遮断し、ＨＵＶＥＣでＶＥＧＦＲ－２（Ｔｙｒ１１７５）のリン酸化を誘導するリガンドを遮断し、かつインビトロ抗血管新生活性を示す新規小分子であるＦ１６が本発明者によって見出された。上述のＶＥＧＦＲ－２特異的結合剤は、内皮細胞の成長、移動、及び管形成を抑制することが示された［参考文献２４］。

最初は、ＶＥＧＦＲ－２は、内皮細胞内で高レベルで限定的に発現するに過ぎないと考えられた。しかし、ここ数年で行われたいくつかの研究は、膠芽腫細胞のような特定の癌細胞も、比較的高レベルでＶＥＧＦＲ－２を発現することを明らかにしている［参考文献３４］。興味深いことに、Ｕ８７ＭＧ細胞株は、ＴＭＺ処置に向けた高感度で高レベルのＶＥＧＦＲ－２［参考文献３４］を発現する膠芽腫細胞株のうちの１つである［参考文献３５]。それに起因して、Ｕ８７ＭＧ細胞株は、膠芽腫を表すモデルとして選択され、Ｆ１６の有効性を標準ＴＭＺと試験して比較された。初期実験は、ＭＴＴ及びＴＢＤＥアッセイを使用してＵ８７ＭＧ膠芽腫癌細胞に対してＦ１６及びＴＭＺの抗成長効果を比較することに向けられた。インビトロ実験では、Ｆ１６は、ＴＭＺ（４３０μＭ）のＩＣ_５０値（図３Ａ）よりも１５倍低かった２６μＭのＩＣ_５０を有するＵ８７ＭＧ細胞に対してより高い効能を示している。データは、文献［参考文献３６－３８］で報告されたＴＭＺ（１７２－７００μＭ）のＩＣ_５０値に一致する。更に、ＴＢＤＥ法を使用してＵ８７ＭＧで細胞毒性を誘導する際にＦ１６の濃度及び時間依存性効果も、ＭＴＴアッセイで達成されたＩＣ_５０決定を確認した。そればかりか、Ｕ８７ＭＧ細胞の足場非依存性成長（固体表面上で独立に成長する細胞の能力）に対するＦ１６及びＴＭＺの効果が、軟寒天コロニー形成アッセイを使用して試験された［参考文献３９］。軟寒天内のＵ８７ＭＧ細胞のインビトロコロニー形成は、対照と比較してＦ１６及びＴＭＺによって有意に抑制され（図８Ａ－Ｂ）、これは、Ｕ８７ＭＧ細胞の足場非依存性成長を抑制するＦ１６の能力を確認した。

Ｕ８７ＭＧ細胞内でＦ１６誘導細胞毒性を媒介する基礎になる分子機構を研究するために、Ｆ１６処置後のＶＥＧＦＲ－２のリン酸化が研究された。ＶＥＧＦＲ－２は、細胞成長及び移動を調整するＴｙｒ１１７５を含む７つのリン酸化部位を有する［参考文献４０］。結果は、Ｆ１６処置後のＵ８７ＭＧ細胞内のｐ－ＶＥＧＦＲ－２（Ｔｙｒ１１７５）のレベルで有意な抑制を示した（図１０Ａ）。最近の研究も、ＶＥＧＦＲ－２との競合的結合を通じてＦ１６の拮抗作用を確認している［参考文献２４］。

Ｆ１６によるＶＥＧＦＲ－２リン酸化の遮断の結果として、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路、すなわち、細胞生存率及び細胞周期の進行を容易にするのに重要な役割を果たすＶＥＧＦＲ－２の下流ターゲットのうちの１つが探査された［参考文献４０、４１］。以前の研究は、ＡＫＴの活性化が、プロアポトーシス遺伝子の発現を容易にする転写因子を妨げ、抗アポトーシス遺伝子の転写を高めることによってアポトーシスを抑制することに関与していることを示している［参考文献４１、４２］。更に、ＡＫＴは、ｐ５３の負のレギュレータであるマウス二重マイニュート２（ＭＤＭ２）のリン酸化によって間接的にｐ５３媒介アポトーシスを抑制することが示された［参考文献４３］。他方で、ＡＫＴリン酸化の抑制は、ｐ５３媒介経路を通じて癌細胞死及びアポトーシスを容易にすることが示された［参考文献４１、４３］。従って、結果は、Ｆ１６が、Ｓｅｒ４７３部位でＡＫＴリン酸化の抑制及びｐ５３経路の活性化を通じて細胞死を容易にし、最終的にＰ２１及びＢａｘの上方調整によって細胞周期阻止及びアポトーシスを誘導することができることを示唆した。予想通り、Ｆ１６は、ｐ５３、ｐ２１、Ｂａｘの発現を誘導し、２４時間処置後にＢｃｌ２の発現を低減することができた（図１０Ｂ）。これらの結果は、Ｆ１６が、ＡＫＴが媒介するＵ８７ＭＧ細胞の生存率を抑制することができ、ｐ５３経路の活性化を通じてアポトーシスを誘導することを明らかに示している。

ＧＢＭ細胞の明確な病理学的特徴は、正常な脳組織を含有する周囲に広範にわたって浸潤するそれらの能力である［参考文献４４］。ＧＢＭ細胞浸潤は、典型的には、ＭＭＰによる細胞外基質（ＥＣＭ）の分解から始まる複雑な多段過程であり、これは、癌細胞が原発腫瘍から移動して２次移動を形成することを可能にする［参考文献４４、４５］。多くの研究は、ＭＭＰ－９と共にＭＭＰ－２が、Ｕ８７ＭＧを含む様々なヒト膠芽腫細胞株で高度に発現されることを報告している［参考文献４６－４８］。ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の両方は、基底膜の最も豊富な成分であるＩＶ型コラーゲンを分解する。従って、コラーゲンの分解は、ほとんどの癌の移動性進行の開始に対して重要な段階である［参考文献４６］。従って、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９発現の下方調整は、ＧＢＭ細胞移動及び浸潤の抑制と密接に関連付けられる［参考文献４８］。Ｕ８７ＭＧ細胞による結果は、Ｆ１６がＩＣ_５０値よりも小さい濃度で移動及び浸潤の両方を有意に抑制したことを明らかに示した（図５Ａ－Ｂ、６Ａ－Ｂ、及び７Ａ－Ｂ）。移動及び浸潤を遮断しながら、Ｆ１６処置は、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の発現も下方調整した（図１０Ｃ）。更に、多くのヒト膠芽腫癌細胞内で腫瘍細胞浸潤を抑制するＥＲＫ１／２シグナリングの持続的活性化を報告しているいくつかの研究は、Ｕ８７ＭＧ細胞［参考文献４９］及びヒト前立腺癌細胞［参考文献５０］を含む。ＥＲＫ１／２酵素は、細胞型及び活性様式に応じて細胞成長、アポトーシス、及び浸潤を調整するのに実質的な役割を有することを示す分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼの重要な亜科である［参考文献５１－５３］。ＥＲＫ１／２の一時的活性化（＜１５分の刺激）は、癌細胞の成長、移動、及び浸潤を誘導する可能性があることが示されている。他方で、反対の効果は、ＥＲＫ１／２［参考文献５３－５５］の持続的活性化（＞１５分の刺激）で観察され（図１０Ｃ）、Ｕ８７ＭＧ細胞をＦ１６及びＴＭＺで処置した後に得られる結果に一致するように見える。

インビトロ結果を支持するために、インビボモデルを使用して膠芽腫進行を遅延させる際にＦ１６の有効性が考慮された。皮下膠芽腫異種移植片モデル（無胸腺ヌードマウスを使用して、Ｆ１６、ＴＭＺ、及び併用でこれらを処置する）が成功裏に確立された。インビボの結果は、Ｆ１６が、Ｆ１６処置を使用するＶＥＧＦＲ－２遮断が膠芽腫癌成長を遅延させる際に有効であることを示唆する異種移植片腫瘍成長を有意に抑制したことを示す（図１１Ｂ）。ＴＭＺ単独で処置したマウスとは異なり、１６日までのＦ１６処置は、毒性の兆候を示さず［参考文献２４、２５］、これは、本発明者の研究室で様々な癌モデルに対して行われた以前の研究と一致している。予想外に、Ｆ１６とＴＭＺとの併用で処置したマウスは、単独療法で処置したマウスと比較して腫瘍容積の減少で有意差を示さなかった（図１１Ｂ）。更に、毒性及び非忍容性を増大する兆候は、併用グループで観察された。そのような毒性は、より少ないＴＭＺ投与量を使用する場合又は２つの薬剤の投与の間隔を長くした場合に減少する可能性がある。

実施例１の結論として、インビトロ及びインビボの結果は、Ｕ８７ＭＧ細胞の生存率、移動、及び浸潤を抑制する際のＦ１６処置の高い効能を明確に明らかにしている。ＴＭＺと比較してＦ１６は、ＩＣ_５０２６μＭでＵ８７ＭＧ細胞に対して強力な細胞毒性を有し（図３Ａ）、マウス内でより良好な忍容性を有する。Ｆ１６はまた、異種移植片移植無胸腺ヌードマウス内の腫瘍成長を遅延させることによって強い抗癌効果を示している。

実施例２：膠芽腫の頭蓋内モデル
Ｆ１６で有望な結果が得られるが、実施例１は、薬物処置に反応した皮下異種移植片モデルで単一細胞株を使用する。従って、頭蓋内脳腫瘍異種移植片のような別のインビボモデルの利用は、ＧＢＭに対してその処置効果に更に別の検証を提供することになる。従って、実施例２の主なフォーカスは、頭蓋内ＧＢＭ異種移植片モデルを使用して膠芽腫進行を遅延させる際にＦ１６の有効性を決定すること、及びＫＰ製剤でＦ１６の忍容性を評価してヌードマウスを使用してその安全性プロファイルを確立することであった。

癌は、より新しい処置戦略及び診断法のために開発されている多大な労力及び資源が充てられるにも関わらず、世界中で第２の主な死因のままである［参考文献１］。毎年何百万人もの人々が世界中で癌と診断され、これらの患者の生存率は、主として後期で非常に低くなっている。癌型の中でも、多形成膠芽腫（ＧＢＭ）は、予後不良で脳腫瘍の最も攻撃的で致命的なタイプのうちの１つであり、僅か５％未満の患者が診断後５年生存するに過ぎない［参考文献２］。実施例１で上述のように、新たに診断されたＧＢＭの患者に対するケアの現在の標準は、それが適用可能な時はいつでも、放射線プラステモゾロミド（ＴＭＺ）のような化学療法のコースに続いて外科的切除である［参考文献３］。ＴＭＺの追加は、補助放射線療法がそれに続く外科的減量と比較して１２．１～１４．６か月の全体生存率（ＯＳ）の僅かな増大を提供する［参考文献４、５］。しかし、ＴＭＺ投与は、抵抗力を進展させ、臨床的に遺伝毒性、催奇形性、骨髄抑制、及び重度の腸損傷のような重篤な毒性に関連付けられる［参考文献６］。従って、ＧＢＭに対するより有効かつ安全な処置の開発が緊急に必要である。

ＧＢＭの決定的な特徴のうちの１つは、豊富かつ異常な血管系である［参考文献７］。正常な脳血管系とは異なり、ＧＢＭ血管系は、混乱し、不十分に接続され、蛇行して顕著な内皮成長に関連付けられ、低酸素症の領域をもたらす［参考文献８］。更に、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管浸透性、血管径、及び内皮壁及び基底膜厚の異常の増大と共にＧＢＭで上昇する［参考文献９、１０］。ＧＢＭに見られるＶＥＧＦの高い発現も、予後不良に関連付けられ、これは、ＧＢＭを処置するのに適切な薬物として血管新生抑制剤を評価する論理的根拠を提供する［参考文献１１］。

前臨床及び臨床研究では、化学療法剤との併用での血管新生抑制剤の使用は、広範囲の癌型に対して有望な結果を示している［参考文献１２－１５］。近年、血管新生抑制剤の使用は、ＧＢＭで起こる顕著な血管新生により、膠芽腫処置のための新しい戦略として出現している。これまでのところ、ベバシズマブ（ＢＶＺ）は、再発性ＧＢＭの処置に対してＦＤＡによって承認されている唯一の抗血管新生薬である。しかし、ＢＶＺ処置は全体生存率（ＯＳ）の改善をもたらしておらず、ＦＤＡの承認は、全客観的奏効率（ＯＲＲ）の増大に基づいていた［参考文献１６、１７］。

上述のように、脳腫瘍を処置する主要な課題のうちの１つは、血液脳関門（ＢＢＢ）の存在である。ＢＢＢは選択性が高い関門であり、この関門を横切るのは大きい分子に対しては容易ではなく、小さい（４００－５００Ｄａ未満の分子量）親油性分子が必要である［参考文献１８］。従って、最近の関心事は、ＢＢＢを横切って血管新生及び類似の過程を調整することができる小分子の探査へシフトする。この関連では、新規小分子（分子量３０１．２ｇ／モル）であるＦ１６は、インビトロ及びインビボモデルの両方で選択択的に拮抗する血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）を通じて強力な抗血管新生及び抗腫瘍活性を示している［参考文献１９］。更に重要なことに、前臨床薬物動態研究は、Ｆ１６がＢＢＢを横切って脳領域の中に蓄積する可能性があることを示している［参考文献２０］。従って、実施例１では、Ｕ８７ＭＧ膠芽腫細胞の成長、血管新生、及び移動能力を抑制するためのＦ１６の直接効果（高レベルのＶＥＧＦＲを発現することが公知）が試験された。インビトロ研究は、Ｕ８７ＭＧ細胞の移動及び浸潤に対するＦ１６の強力な抑制効果を確認し、テモゾロミド（ＩＣ_５０４３０μＭ）処置と比較してＵ８７ＭＧ細胞に対する強力な細胞毒性効果（ＩＣ_５０２６μＭ）を示した。これに加えて、Ｆ１６は、競合的結合を通じてＶＥＧＦＲ－２のリン酸化を抑制し、Ｕ８７ＭＧ細胞内でｐ５３経路を活性化することによって細胞周期阻止及びアポトーシスを誘導した。更に、異所的に移植した異種移植片モデルによるインビボ結果は、Ｆ１６が、Ｕ８７ＭＧ膠芽腫細胞株を移植したマウス内の腫瘍成長を有意に抑制することができるという事実を確認するものである。

実施例２は、頭蓋内脳腫瘍異種移植片のような別のインビボモデルを利用してＧＢＭに対するＦ１６処置効果に更に別の検証を提供する。従って、実施例２の主なフォーカスは、頭蓋内ＧＢＭ異種移植片モデルを使用して膠芽腫進行を遅延させる際にＦ１６の有効性を決定すること、及びＫＰ製剤でＦ１６の忍容性を評価し、マウスモデルを使用してその安全性プロファイルを確立することであった。

材料及び方法
細胞株及び試薬
Ｕ８７ＭＧ、すなわち、ヒト膠芽腫細胞株は、ＡＴＣＣ（米国、ＶＡ、Ｍａｎａｓｓａｓ)から購入され、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）で維持された。細胞は、加湿培養器内で９５％の空気及び５％のＣＯ_２と共に３７℃で培養された。Ｕ８７ＭＧ細胞は、細胞通過が３～９であった時にアッセイに使用された。Ｆ１６及びＴＭＺ（米国、ＭＯ、セントルイス所在のＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）内で溶液として調製された。これらの実験に使用する全ての他の化学物質は、研究等級のものであった。

Ｕ８７ＭＧ細胞ルシフェラーゼ遺伝子導入（ｐｃＤＮＡ３．１－Ｌｕｃ）
異種移植片撮像実験に対して細胞株を開発する目的のために、９０－９５％の集密度（６ウェルプレート）を有するＵ８７ＭＧ細胞株が、リポフェクタミン２０００による導入に使用された。導入の日に、細胞は、どのような抗生物質もなしに新鮮な培地で補充された。導入過程に対して複合体Ａ（１００μＬの無血清培地内の１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１－Ｌｕｃ＋１５μｌのＰＬＵＳ試薬）及び複合体Ｂ（１００μｌの無血清培地内の１２μｌのリポフェクタミン２０００）は、個別に調製されて室温で１５分にわたって培養された。複合体Ａ及びＢは、組み合わされて室温で更に１５分にわたって培養された。この溶液（２００μＬ）は、８００μＬの適した培地（血清及び抗生物質を含まない）を含有する固定した細胞に追加され、３７℃で５％ＣＯ_２培養器内で更に５時間にわたって培養された。更に、抗生物質を含まない２０％の血清を含有する１ｍＬの成長培地が、導入ウェルに追加され、培養は、安定した導入を可能にするために別の７２時間にわたって継続された（Ｕ－８７ＭＧ細胞を用いて）。

Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ細胞内のルシフェラーゼ信号の測定
培養ルシフェラーゼ遺伝子の導入細胞（Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ細胞）を測定するために、本発明者は、０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤ－ルシフェリン（米国のＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にリン酸緩衝生理食塩水を追加することにより、様々な細胞数（１ｘ１０^４－３ｘ１０^５）でルシフェラーゼ信号を撮像した。Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ細胞は、室温でＤ－ルシフェリンと共に培養後１０分に撮像された。ルシフェラーゼ信号の測定は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｘｔｒｅｍｅ ＩＩ（米国マサチューセッツ州のビレリカ所在のＢｒｕｋｅｒ）を使用して分析された。

動物モデル
忍容性研究に対して体重約２５ｇの８－１０週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された（米国のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ）。頭蓋内研究に対して体重約２５ｇの８－１０週齢の雌無胸腺ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスが使用された（米国のＴａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。全ての動物は、病原体のない食物及び水へのフリーアクセスと共に湿度及び温度（２２℃、１２：１２時間の明暗周期）の環境制御条件下で病原体のない換気ケージに収容された。全ての動物のケア及び実験は、米国フロリダ州のフォートローダーデール所在のＮｏｖａ Ｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＳＵ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の指針及び承認に従って実行された。

薬物調製
Ｆ１６（１００ｍｇ／ｋｇ）は、１０％のＤＭＳＯ＋９０％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒＥＬ（ＫＰ）に溶解された。ＴＭＺ（５０ｍｇ／ｋｇ）は、１０％のＤＭＳＯ＋９０％のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解された。全ての薬物は、予定の注射前に新たに調製された［参考文献２１］。注射の総量は、腹腔内投与された全ての実験に関して１００μＬ／マウスであった。

実験手順
忍容性研究に対してＢＡＬＢ／ｃマウスは、４つの異なる治療グループにランダムに割り当てられた（図１５：表１）。処置期間の終わりに、全てのマウスから血液サンプルが採取され、マイアミ大学（米国フロリダ州のマイアミ市）にあるＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙに送られて血液学的及び生化学的パラメータを分析した。

頭蓋内研究に対して膠芽腫異種移植片モデルは、無胸腺ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスを使用して開発された。簡単には、マウスは、全身麻酔（１００ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注射）下に置かれ、定位固定デバイスに位置決めされた。～１ｃｍの中央切開が行われ、穿頭孔は、頭蓋骨の右線条体（前頂に対して１．０ｍｍ前方で２.０ｍｍ横方向）にドリルで孔を開けられた。その後に、ｌｕｃレポーター遺伝子を発現するＵ８７ＭＧ細胞（３μＬのＰＢＳ中２×１０^５細胞）は、３ｍｍの深さの１μＬ／分の速度で１０μｌのハミルトンシリンジを使用して注射された。注射が終了すると、針は、２分にわたって所定位置に保たれ、次に、ゆっくり取り外され、孔は、殺菌骨ワックスで密封された。切開部は閉じられ、三重抗生物質軟膏が付加された。腫瘍細胞移植の１週間後に、マウスは、ランダムに５グループ（各グループでｎ＝５）に分けられた：すなわち、１）ＰＢＳ中のＤＭＳＯで処置された対照、２）ＫＰ中のＤＭＳＯで処置された対照、３）Ｆ１６（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置された対照、４）テモゾロミド（５０ｍｇ／ｋｇ）で処置された対照及び５）Ｆ１６（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置されてテモゾロミド（５ｍｇ／ｋｇ）で３時間後に処置された対照。腫瘍インプラントのない１又は２以上のグループは、陰性対照として研究に追加された（ｎ＝５）。実験マウスは、３週間にわたって週当たり２回処置された。処置が終了した後に、マウスは、これらが重篤な病気を示すまでどのような処置もなく維持され、次に、ＥｕｔｈａｎｅｘＣＯ_２スマートボックスを使用して安楽死させられた。安楽死させたマウスの脳及び腫瘍は、組織学及び免疫組織化学（ＩＨＣ）研究のために単離された。

インビボの生物発光撮像
生物発光撮像（ＢＬＩ）を使用して、頭蓋内異種移植片での腫瘍成長を評価して確認した。ＢＬＩは、ＢＬＩの概念に基づく前臨床インビボ研究に対して設計された感度の良い光学Ｘ線機器であるＢｒｕｋｅｒ Ｘｔｒｅｍｅを使用してインビボで行われた。簡単には、マウスは、体重１５０ｍｇ／ｋｇの投与量で生理食塩水に溶解したＤ－ルシフェリン（シグマ）を腹腔内に注射された。注射直後に、マウスは、イソフルランで麻酔され、一連の生物発光画像は、ルシフェリンが洗い落とされる時間まで約２０分にわたって３分取得間隔で得られる。ピークＢＬＩ強度を有する画像は、光子数の単位で定量化に使用された。

組織学及び免疫組織化学
腫瘍組織学及び腫瘍に対する実験薬物の効果を評価する組織学的分析が実行された。脳組織中の外科的に切除された腫瘍は、１Ｘ ＰＢＳで濯がれ、組織学及びＩＨＣ調製のために血液を除去した。各実験グループからのサンプルは、１０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で固定され、フロリダ大学のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅに発送され、更に別の組織学及びＩＨＣ調製のためにサンプルが処置された。顕微鏡画像及びデータを施設から受け入れた。ＩＨＣのサンプルは、１次マウスモノクローナル抗ＣＤ３１抗体（１：１００希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ.Ｉｎｃ.）で培養され、２次抗体ビオチン標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（１：５００；日本の東京のニチレイ）が、ＤＡＢ染色キットを使用して実行された。切片は、ヘマトキシリンで対比染色された。Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオジン）染色に対して、サンプルは、ハリスのヘマトキシリン溶液、続いてフロリダ大学のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅのエオジン溶液で染色された。

統計分析
ここに提供するデータは、少なくとも３つの独立した実験からの平均±ＳＤ値を表している。統計分析は、一元配置分散分析を使用して実行され、平均の間の差は、ターキーの多重比較試験によって試験された。ｐ＜０．０５の値は統計的に有意であると考えられた。Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ（Ｍａｃ ＯＳ Ｘバージョン７．０ｂ）を使用してグラフを発生させ、統計分析を実行した。

結果
Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ細胞内のルシフェラーゼ信号の選択及び測定
選択に対して、細胞は、様々な濃度のＧ４１８抗生物質（０．１－０．８ｍｇ／ｍＬ）で１４日にわたって処置された。抗生物質選択の後に、細胞は、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（米国のＰｒｏｍｅｇａ)を使用してルシフェラーゼ発現に関して検査された。０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８抗生物質で処置したＵ８７ＭＧ細胞は、最大発光を発生させた。ルシフェラーゼ導入光学撮像は、腫瘍異種移植片での抗癌治療に対する反応をモニタすることを可能にした。これに加えて、固定したＵ８７ＭＧ－ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ画像は、細胞数が増大する時にＢＬＩ信号の着実な増大を示した（図１２Ａ－Ｂ）。

毒性評価
Ｆ１６、ＴＭＺ及びＦ１６＋ＴＭＺ併用毒性プロファイルを評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用する包括的毒性研究が実行された。ＫＰを注射したマウスは、対照として使用された。全ての薬物は、４週間にわたって週２回ｉ.ｐ.注射として投与された。独立した毒性評価、血清生化学、死後の肉眼検査、及び主要臓器の病理組織学的検査は、フロリダ州マイアミの大学のＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔで実行された。

処置期間中に、マウスの体重の変化が毎週点検され、体重の有意な変動は観察されなかった（図１３）。同様に、マウスは、一般的な行動、身体的外観、痙攣、薬物誘導性下痢、唾液分泌、及び死亡率に関してモニタされた。一般的に、Ｆ１６処置は、毒性の観察可能な徴候がないことに関連付けられた。しかし、感度又は不快感の一部の症状は、注射した直後にＦ１６、併用、及び対照（ＫＰ）グループで気付かれ、次に、症状は翌日消失した。同じ症状は対照グループでも見られ、Ｆ１６は良好な忍容性が示されており、毒性又は不快感の兆候は全ての以前の動物実験で観察されなかったので、ＫＰは、これらの症状の理由として疑われる。

完全血球計算（ＣＢＣ）は、ヘモグロビン（ＨＢ）、ヘマトクリット、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、赤血球数（ＲＢＣ）、及び白血球数（ＷＢＣ）のレベルを測定するために実行された。ＨＢ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、及びＭＣＶのレベルは、様々な治療グループで有意に変化しなかった（図１５：表１）。ヘマトクリット及びＲＢＣの僅かな増大は、Ｆ１６及びＴＭＺ治療グループでは観察されたが、ＫＰ及びＦ１６＋ＴＭＺ治療グループでは観察されなかった（図１５：表１）。これらの結果は、貧血、血小板減少症、又は好中球減少症をもたらす骨髄抑制の徴候を示さない（図１５：表１）。ＷＢＣ計数の分析は、ＫＰ、Ｆ１６、及びＦ１６＋ＴＭＺ治療グループで有意な変化を示さなかったが、ＴＭＺ処置マウスは、ＷＢＣ計数の有意な増大を示した（図１５：表１）。

総タンパク質レベルは、タンパク質代謝に対する処置計画の影響を評価するために分析された。有意な変化は、全ての治療グループの総タンパク質レベルで観察されなかった（図１７：表２）。

主要臓器機能の評価
肝機能の評価は、ＡＬＴのレベルを測定することによって達成された。ＡＬＴの有意な上昇は、ＴＭＺ治療グループで観察された（図１７：表２）。更に、腎機能は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチン、及びＢＵＮ／クレアチン比のレベルを測定することによって評価された。ＢＵＮの有意な変化は、ＫＰ及びＴＭＺ治療グループで検出されなかった。しかし、ＢＵＮレベルの有意な低下は、Ｆ１６及びＦ１６＋ＴＭＺ治療グループで観察された（表２）。図１７（表２）に示すように、クレアチン及びＢＵＮ／クレアチンレベルの比の有意な変化は、全ての治療グループで見出されなかった。これに加えて、膵臓に対するＦ１６の効果も、必須のエネルギ源であるグルコースを測定することによって評価された。有意な変化は、全ての治療グループでは血糖で観察されなかった（図１７：表２）。

Ｆ１６によるＵ８７ＭＧ派生異種移植片腫瘍成長の抑制
Ｆ１６のインビボ腫瘍成長抑制効果を更に調査し、皮下モデルによる前の研究を確認するために、Ｕ８７ＭＧ細胞を使用する頭蓋内膠芽腫異種移植片モデルが、材料及び方法節で上述のように確立された。Ｕ８７ＭＧ－ｌｕｃ細胞は、マウスの脳の中に移植され、腫瘍成長がＢＬＩでモニタされた。細胞移植の１週間後に、動物は、５つのグループ（対照－ＰＢＳ、対照－ＫＰ、Ｆ１６、ＴＭＺ、Ｆ１６＋ＴＭＺ）にランダムに分けられた。腫瘍成長は、毎週ＢＬＩでモニタされ、５グループからの代表的なマウスが図１８Ａに示されている。結果は、Ｆ１６処置マウスのＢＬＩ信号強度が対照マウスよりも６０％低かったことを明らかに示した（図１８Ｂ）。しかし、ＴＭＺ及び併用処置マウスのＢＬＩ信号強度は、５グループの中で最も低かった（図１８Ｂ）。これらの結果は、単独療法又は併用療法のいずれのＦ１６の投与も腫瘍成長を低減したことを示したが、ＴＭＺ処置は、Ｆ１６が細胞減少性ではなくて細胞静止性であるので予想されるＦ１６処置よりも効率的であった。更に、マウスの死後に、腫瘍を有する脳は切除され、次に、脳腫瘍の長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）が測定され、ＴＶ＝１／２×（Ｌ×Ｗ^２）の式により腫瘍容積（ＴＶ）を計算した（図１８Ｃ）。安楽死前の無胸腺ヌードマウス及び安楽死後の同じマウスから腫瘍を切除した脳は、図１８Ｄに示されている。

生存率及び毒性の徴候
賦形剤－ＰＢＳ、賦形剤－ＫＰ、Ｆ１６、ＴＭＺ、及び併用処置後の神経膠腫異種移植片によるマウスの生存率が調べられた。Ｆ１６で処置された担腫瘍マウスは、それぞれ３４日及び３６日の平均生存率を有する賦形剤－ＰＢＳ及び賦形剤－ＫＰで処置されたマウスと比較して３９日の平均生存率を有する生存時間の有意な増大を示した（図１９Ａ）。更に、ＴＭＺ及び併用グループのマウスの６０％は、４７日の平均生存率で移植後５０日まで生存した（図１９Ｂ）。しかし、ＴＭＺ及び併用グループから切除された脳は、脆弱で損傷を受けていた。

実験マウスの体重の変化は、実験の終わりまで移植の日から毎週調べられた（図１９Ｂ）。以前の実験と一致して、Ｆ１６処置は、処置に使用された投与量（１００ｍｇ／ｋｇ）で良好な忍容性が示された。体重の有意な変化は、賦形剤で処置されたマウスと比較してＦ１６、ＴＭＺ、及び併用で処置したマウス内では観察されなかった。

微小血管密度評価
異種移植片脳及び腫瘍は、切除されてＩＨＣ分析に供された。Ｆ１６、ＴＭ、及びＦ１６とＴＭＺの併用処置腫瘍セクションでの膠芽腫マーカＣＤ３１の発現は、対照グループから抽出された腫瘍と比較された（図２０Ａ－Ｆ）。対照－ＰＢＳ及び対照－ＫＰ腫瘍セクションでは、ＣＤ３１は高レベルで発現され、これは、ＧＢＭの指数関数的成長が血管新生に関連付けられることを示している（図２０Ｂ－Ｃ）。対照的に、ＣＤ３１発現の有意な減少は、Ｆ１６処置がインビボで血管新生を実質的に遮断したことを示す対照及びＴＭＺ腫瘍セクションと比較してＦ１６腫瘍セクションで観察された（図２０Ｄ－Ｅ）。この結果は、異種移植片腫瘍の血管密度を低減することを通じて発揮されるＦ１６の抗腫瘍活性がより顕著で有用であったことを示している。

議論
上述のように、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）処置は、一般的に１年よりも長く生存しないＧＢＭ患者の低い生存率によって証明されるように非常に困難である［参考文献２２］。ＧＢＭ患者に対する現在の標準処置は多様であり、これは、腫瘍質量の広範な外科的切除から始まる。その後に、患者は、放射線療法（ＲＴ）及びテモゾロミド（ＴＭＺ）との併用化学療法を受ける。実際に、ＴＭＺプラスＲＴ処置計画は、それが、ＲＴのみの１２か月と比較して平均全体生存率が２．６か月だけ増大して１４．６か月に延長させるので最も有効であると考えられ、２年生存する患者のパーセンテージは、１０．４％から２６．５％に増大する［参考文献４］。残念ながら、ＴＭＺ処置患者の６０－７５％は、ＴＭＺ処置に反応せず、患者の５０％よりも多くは、腫瘍進行の６か月後に処置に失敗している［参考文献２３、２４］。この反応の欠点は、ＧＢＭ細胞内のＯ６－メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）及び／又はＤＮＡ損傷修復システムの過剰発現による［参考文献２５］。更に、ＴＭＺ処置患者の１５－２０％は、有意な毒性を発症し、これは、処置の阻止をもたらす可能性がある［参考文献２３］。ＴＭＺに関連付けられた全てのこれらの欠点は、科学者がより有効な処置オプションを開発することを促している。この関連では、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）又はその下流のシグナリング経路をターゲットにする新しい処置戦略は、標準処置への追加として有望な結果をもたらしている［参考文献２６］。

血管新生に対する腫瘍成長及び移動の依存性は、癌を処置するのに抗血管新生手法を使用するという考えを支持する。更に、血管新生抑制剤は、患者の生活の質を改善し、いくつかの進行期の癌の無増悪生存率（ＰＦＳ）及び／又は全体生存率（ＯＳ）を延ばすことが臨床的に証明されており、これは、科学者がＧＢＭ処置のために血管新生抑制剤を使用して研究するように促している。２００９年に、ＢＶＺは、再発ＧＢＭ処置に対してＦＤＡによって承認された［参考文献２７］。実際に、再発ＧＢＭ処置に対するＢＶＺの使用は、ＯＳを改善することに失敗したが、ＰＦＳを改善した［参考文献１７、２８］。更に、血管新生抑制剤は、既存の血管系の正常化を通じて血管浸透性を低減することによって脳腫瘍に関連付けられた頭蓋内圧を緩和するのに有用であることが提案されている［参考文献２９］。残念ながら、ＧＢＭ処置に対する血管新生抑制剤の使用は、血管新生抑制剤が血液脳関門（ＢＢＢ）をほとんど横切ることができないこと［参考文献３０］、及び一部の血管新生抑制剤がこれらの臨床的利益を制限する激しい毒性に関連付けられること［参考文献３１］の２つのハードルに直面する。従って、毒性がほとんどないか又は全くないＢＢＢを横切ることができる新しい血管新生抑制剤を開発することが決定的に必要である。

２０１１年に、Ｆ１６、すなわち、新しい抗血管新生剤が、米国特許第７，９３９，５５７ Ｂ２号明細書に開示された。Ｆ１６は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）内で血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化の強い結合及び抑制を示しただけでなく、ＧＩ－１０１Ａ（乳癌）異種移植片及びＣｏｌｏ－３２０ＤＭ（結腸癌）異種移植片を移植したマウス内でも有意なインビボ腫瘍成長抑制を示した［参考文献１９］。これに加えて、前臨床薬物動態学的研究は、単回ｉ.ｐ.投与後のマウスの主要臓器内でＦ１６の実質的な堆積を示した［参考文献２０］。それは、注射１２時間後でのＦ１６濃度が、肝臓及び腎臓と比較して脳で最も高かったという予想外の発見であった。脳内のＦ１６の濃度は、血漿内で観察された濃度の近くになり、これは、それぞれ肝臓及び腎臓よりも１．３倍及び６．１倍を超えるものであった。この結果は、Ｆ１６がＢＢＢを横切って容易に搬送され、臨床行動毒性の証拠なしに脳領域の中にゆっくり蓄積されることを示している。実際に、親油性及び分子量である２つの重要な因子は、あらゆる薬物のＢＢＢ浸透を容易にするのに重要な役割を果たす［参考文献３２］。これらの判断基準と一致して、Ｆ１６は、ＢＢＢの浸透を説明することができる親油性がより高くて小さい分子量（３０１．２ｇ／モル）を有する。全てのこれらの結果は、本発明者にＧＢＭの処置でのＦ１６の有効性を試験することを促した。

一般的に、処置関連毒性は、癌治療に対して臨床的に利用可能な薬剤の最も一般的な限界のうちの１つである。肝毒性及び腎毒性は、血管新生抑制剤を含む化学療法剤に関連付けられた一般的な毒性である。この毒性研究では、ＴＭＺで処置したマウスは、ＡＬＴの増大によって証明されたように肝毒性の兆候を示した（図１７：表２）。結果はまた、げっ歯類モデルでのＴＭＺの以前の報告と一致している［参考文献２４］。ヒトでは、ＴＭＺ処置は、肝毒性に加えて、好中球減少症及び血小板減少症を含む骨髄抑制に関連付けられる［参考文献３３］。安全性評価研究からの以前の結果は、Ｆ１６処置の実験動物が、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）及びタキソールのような他のＦＤＡ承認の化学療法薬で処置されたグループと比較して健康のままでいることを示している［参考文献２０］。同様に、現在の研究では、Ｆ１６は、実験動物で死亡事象がなく良好な忍容性が示された。更に、実験グループでは、体重、食物摂取、又は行動に有意な変化はなかった（図１３）。Ｆ１６がたとえ脳に蓄積されたとしても、認知変化の兆候は、治療グループでは観察されなかった。更に、重要な臓器機能を反映している生化学的パラメータの評価は、Ｆ１６処置後に肝臓、腎臓、及び膵臓の損傷関連生体マーカレベルの兆候も示さなければ上昇も示さなかった。

ヒト癌細胞を使用する異種移植片モデルは、腫瘍学分野に途方もない利益を提供する。最初に、異所性と呼ばれる皮下異種移植片モデルは、腫瘍異種移植片を確立するのに前臨床手順をそれが速くて廉価で容易に再生可能であるので最も一般的に使用している［参考文献３４、３５］。しかし、異所性モデルで治癒的である一部の投薬計画は、人間の病気に有意な効果を持たないことが一貫して注目されている。従って、重点は、頭蓋内脳腫瘍の異種移植片のような同所性の異種移植片確立へシフトしている。同所性モデルでは、腫瘍異種移植片は、癌が発症する同じ解剖学的部位又は臓器の中に移植され、これは、腫瘍－宿主相互作用に対して適した位置、処置の部位特異的依存性、及び遺伝子の臓器特異的発現を研究する機能、及び抗癌剤に対して十分な前臨床試験を提供することになる［参考文献３５、３６］。更に、腫瘍進行及び移動は、ほとんどの状況で新しい血管の形成に依存することが公知である［参考文献３７］。同様に、腫瘍微小環境での生化学的不均衡は、成長因子の継続的な分泌を通じて病理学的血管新生及び腫瘍成長進行に寄与する［参考文献３８］。

適した腫瘍微小環境で腫瘍成長を模倣するために、頭蓋内ＧＢＭ異種移植片モデルが確立され、これは、腫瘍血管新生の臨床的特徴のより良好な表現を提供し、ヒト脳内の現実の状況により関係がある。結果は、Ｆ１６が異種移植片腫瘍成長を有意に抑制し（図１８Ｂ）、平均生存率を延ばした（図１９Ａ）ことを示し、Ｆ１６処置を使用するＶＥＧＦＲ－２遮断が、膠芽腫癌成長を遅延させる際に有効であることを示唆している。以前のインビトロ及びインビボ研究（皮下異種移植片、実施例１）では、Ｆ１６効果は、ＴＭＺ効果に匹敵した。しかし、頭蓋内異種移植片モデルでは、ＴＭＺは、Ｆ１６がＴＭＺのように細胞減少性ではなく細胞静止性であるので予想されるＦ１６（６０％）と比較して遥かによく腫瘍抑制（９９％）を示している。結果の違いの背後の別の考えられる理由は、ＢＢＢに浸透した後に脳に到達する薬物濃度の違いということである。全ての薬物濃度は、インビトロモデルが使用される時に癌細胞に達しており、実質的な薬物濃度は、皮下異種移植片モデルが使用される時に腫瘍部位に達する。逆に、脳への薬物送出は、ＢＢＢの存在による親油性及び小分子量のようないくつかの因子によって影響される。ＴＭＺは、それが分子量１９４．１５ｇ／モルの親油性小分子であるので、ＢＢＢを容易に横切ることができる［参考文献３９］。以前の研究は、ラットとサルを使用してＴＭＺのＣＮＳの中への浸透を試験し、脳内のＴＭＺのレベルが、有意である血漿濃度の約３０－４０％であることを示している［参考文献４０］。紛れもなく、ＴＭＺ及び併用治療グループは、Ｆ１６治療グループよりも長生きした。しかし、ＴＭＺ及び併用グループから切除した脳は、脆弱で損傷を受けており、これは、ＴＭＺ処置が周囲の正常組織に影響を与え、最終的に死を引き起こしていることを意味する。本発明者の観察に一致して、最近の研究は、ＴＭＺ処置が、正常な脳組織の細胞外基質構造に影響を及ぼして病気の進行をもたらす可能性があると結論付けた［参考文献４１］。

Ｆ１６は、血管新生の抑制を通じて実質的に媒介される抗腫瘍活動である［参考文献１９］。ＩＨＣの結果は、生体マーカとしてＣＤ３１発現を使用してＦ１６のインビボ抗血管新生活性を確認し、腫瘍組織内で内皮細胞の存在を示している［参考文献４２］。予想通り、Ｆ１６処置は、腫瘍微小血管密度の有意な減少を表す低レベルのＣＤ３１発現に関連付けられた（図２０Ｄ）。

実施例２に対する結論として、インビボの結果は、腫瘍成長の抑制及びＵ８７ＭＧ－ｌｕｃ細胞を頭蓋内に移植したマウスの平均生存率の延長においてＦ１６処置の高い効能を明確に証明した。ＴＭＺと比較して、Ｆ１６は、有意な前臨床又は実験室毒性の証拠なくマウスで良好な忍容性が示された。ＫＰ製剤の使用は、ＰＢＳ製剤と比較して４０％だけＦ１６の脳内送出を改善しており［データは示さず］、ＫＰ調製は、それをより長期間使用した時により重篤な副作用に至る場合があるいくつかの高血圧反応を引き起こした［参考文献４３］。最後に、これらの発見は、ＧＢＭ処置のための新しい手段を提供し、これは、彼らの全体生存率を延ばすことによって非常に多くの患者の利益になり、彼らの生活の質を改善することができると考えられる。

結論
本明細書に開示した発見は、血管新生能力を有する固形癌の治療のための特に多形成膠芽腫（ＧＢＭ）のような脳腫瘍の治療のための新しい手段を提供する。そのような新規治療は、彼らの全体生存率を延ばすことによって非常に多くの患者の利益になり、及び／又は彼らの生活の質を改善することができると考えられる。

本明細書に説明する全ての特許及び文献は、本発明が関係する当業者のレベルを示している。全ての特許及び文献は、各個々の文献が引用によって組み込まれることが具体的かつ個々に示された場合と同じ程度に引用によって本明細書に組み込まれている。本発明の特定の形態を例示しているが、本明細書に説明して図示する特定の形態又は配置に限定するように意図していないことは理解されるものとする。本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができ、本発明は、本明細書に図示して説明するものに限定されると考えるべきではないことは当業者に明らかであろう。当業者は、本発明が目的を実行して言及した目的及び利点、並びにそれに固有のものを得るようになっていることを容易に認識するであろう。本明細書に説明するＦ１６を使用する組成物及び方法は、現在の好ましい実施形態の代表であり、かつ例示的であるように意図しており、範囲の制限として意図されない。本発明の精神に包含されるその変更及び他の使用は、当業者に想起されるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、最終的に特許請求するような本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定すべきではないことを理解しなければならない。実際に、当業者に明らかである本発明を行うための説明したモードの様々な修正は、本発明の範囲内であるように意図している。

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発表
1. Mohammad Algahtani1, Khalid Alhazzani2, Thiagarajan Venkatesan, Ali Alaseem, Sivanesan Dhandayuthapani and Appu Rathinavelu (2019), Direct cytotoxic effect of a novel anti-angiogenic drug F16 towards U87MG glioblastoma cell line, Presented at the AACR Annual Meeting 2019, March 29 - April 3 Atlanta, GA.
2. Mohammad Algahtani, Khalid Alhazzani, Sivanesan Dhandayuthapani, Thanigaivelan Kanagasabai, Appu Rathinavelu, (2017) F16 is a novel new candidate for brain tumors, Presented at Cancer Research and Targeted Therapy (CRT) Oct 26-28, Miami FL, USA.
3. Sivanesan Dhandayuthapani, Thanigaivelan Kanagasabai, Khadija Cheema and Appu Rathinavelu (2017), Bioavailability, pharmacokinetics and safety profile of a novel anti-angiogenic compound JFD in pre-clinical models. Presented at the AACR Annual Meeting 2017, April 1-5 Washington, DC.
4. Thanigaivelan Kanagasabai, Khalid Alhazzani, Thiagarajan Venkatesan, Sivanesan Dhandayuthapani, Ali Alaseem, Appu Rathinavelu (2017), impact of MDM2 inhibition on cell cycle regulation through Aurora Kinase B-CDK1 axis in prostate cancer cells, Presented at the Annual Conference of the American Association for Cancer Research (AACR) April 1-5, Washington, D.C., USA.
5. Ali Alaseem, Thiagarajan Venkatesan, Thanigaivelan Kanagasabai, Khalid Alhazzani, Saad Alobid, Priya Dondapati, Appu Rathinavelu (2017), increased MMPs activity in MDM2 overexpressing cancer cell lines, Presented at the Annual Conference of the American Association for Cancer Research (AACR) April 1-5, Washington, D.C., USA
6. Thiagarajan Venkatesan, Ali Alaseem, Khalid Alhazzani, Thanigaivelan Kanagasabai, Appu Rathinavelu (2017), Effects of histone deacetylase (HDAC) inhibitor on gene expression in MDM2 transfected prostate cancer cells, Presented at the Annual Conference of the American Association for Cancer Research (AACR) April 1-5, Washington, D.C., USA
7. Khalid Alhazzani, Ali Alaseem, Thiagarajan Venkatesan, Appu Rathinavelu (2017), Angiogenesis-related gene expression profile of a novel antiangiogenic agent F16 in human vascular endothelial cells, Presented at the Annual Conference of the American Association for Cancer Research (AACR) April 1-5, Washington, D.C., USA
8. Saad Ebrahim Alobid, Thiagarajan Venkatesan, Ali Alaseem, Khalid Alhazzani, Appu Rathinavelu (2017), analysis of human hypoxia related miRNA in MDM2 transfected prostate cancer cells, Presented at the Annual Conference of the American Association for Cancer Research (AACR) April 1-5, Washington, D.C., USA
9. Mohammad Algahtani, Khalid Alhazzani, Thiagarajan Venkatesan, Appu Rathinavelu (2017), apoptosis pathway-focused gene expression profiling of a novel VEGFR2 inhibitor, Presented at the Annual Conference of the American Association for Cancer Research (AACR) April 1-5, Washington, D.C., USA0.
10. Paramjot Kaur, Sivanesan Dhandayuthapani, Shona Joseph, Syed Hussain, Miroslav Gantar, Appu Rathinavelu. Evaluation of the cell surface binding of phycocyanin and associated mechanisms causing cell death in prostate cancer cells. Presented at the American Association for Cancer Research (AACR) 2017 Apr 1-4; Washington DC, USA
11. Khalid Alhazzani, Sivanesan Dhandayuthapani, Khadijah Cheema, Thanigaivelan Kanagasabai, Ali Alaseem, Thiagarajan Venkatesan, Appu Rathinavelu (2016), Pharmacokinetic and Safety Profile of a Novel Anti-angiogenic Agent F16 with High Levels of Distribution to the Brain. Presented in: 2016 AAPS Annual Meeting and Exposition at Colorado, Denver, on Nov 16th 2016.
12. Thanigaivelan Kanagasabai, Sivanesan Dhandayuthapani, Khalid Alhazzani, Ali Alaseem and Appu Rathinavelu (2016), The pharmacodynamics profile and tissue distribution of a novel anti-angiogenic compound JFD in pre-clinical models. Presented in: Molecular and Cellular Basis of Breast Cancer Risk and Prevention at Tampa, Florida on Nov, 12th - 15th 2016.
13. Appu Rathinavelu (2016), Novel VEGFR2 Inhibitors for Treating Solid Tumors and Brain Metastasis (2016), Presented at the International Conference on Cancer Research and Targeted Therapy, in Baltimore, Maryland on October 21-23 of 2016.
14. Thanigaivelan Kanagasabai, Rohin Chand, Amy Aman Kaur, Sivanesan Dhandayuthapani, Olena Bracho, Appu Rathinavelu. MDM2 stabilizes and induces HIF-1α levels during reoxygenation of cancer cells. Presented at the Annual Conference of the American Association for Cancer Research (AACR), April 16-20, New Orleans, LA., USA
15. Thiagarajan Venkatesan, Ali Alaseem, Aiyavu Chinnaiyan, Sivanesan Dhandayuthapani, Thanigaivelan Kanagasabai, Khalid Alhazzani, Priya Dondapati, Saad Alobid, Umamaheswari Natarajan, Ruben Schwartz, Appu Rathinavelu (2018). MDM2 Overexpression Modulates the Angiogenesis-Related Gene Expression Profile of Prostate Cancer Cells. Cells, 2018, 7(5), 41.
16. Appu Rathinavelu, Thanigaivelan Kanagasabai, Sivanesan Dhandayuthapani, Khalid Alhazzani (2018), The anti-angiogenic and pro-apoptotic effects of a small molecule JFD-WS in in vitro and breast cancer xenograft mouse model. Oncology Reports. Published online on: February 9, 2018, Pages:1711-1724; https://doi.org/10.3892/or.2018.6256
17. Rathinavelu. A, Alhazzani. K, Dhandayuthapani. S and Kanagasabai. T. (2017) Anti-cancer effects of F16 - A novel vascular endothelial growth factor receptor specific inhibitor, Tumor Biology, Nov; 39 (11):1010428317726841. https://doi: 10.1177/1010428317726841.

Claims (45)

1. Ｆ１６を備える固形腫瘍の治療のための組成物。
2. 前記固形腫瘍は、血管新生能力を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記固形腫瘍は、脳腫瘍であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
4. 前記固形腫瘍は、脳腫瘍であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
5. 前記脳腫瘍は、多形成膠芽腫（ＧＢＭ）であることを特徴とする請求項３又は請求項４に記載の組成物。
6. 固形腫瘍の治療のための医薬組成物であって、
   医薬担体内の治療効果のある投与量のＦ１６、
   を備えることを特徴とする医薬組成物。
7. 固形腫瘍が、血管新生能力を有することを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
8. 治療効果のある投与量の化学療法剤を更に備えることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記化学療法剤は、テモゾロミド（ＴＭＺ）又はベバシズマブ（ＢＶＺ）又は類似の薬剤であることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
10. 脳腫瘍の治療のための医薬組成物であって、
    医薬担体内の治療効果のある投与量のＦ１６、
    を備えることを特徴とする医薬組成物。
11. 多形成膠芽腫（ＧＢＭ）の治療のための医薬組成物であって、
    医薬担体内の治療効果のある投与量のＦ１６、
    を備えることを特徴とする医薬組成物。
12. 治療効果のある投与量の化学療法剤を更に備えることを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 前記化学療法剤は、テモゾロミド（ＴＭＺ）又はベバシズマブ（ＢＶＺ）又は類似の薬剤であることを特徴とする請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 悪性細胞内の血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）を抑制する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記悪性細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
15. 異常血管系を示す組織内の血管新生を抑制する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    異常血管系を示す前記組織に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
16. 悪性細胞内の血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）のリン酸化を抑制する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記悪性細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
17. 周囲組織の中への悪性細胞の浸潤及び移動を抑制する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記悪性細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
18. 悪性細胞内の細胞周期を抑制する又は細胞周期阻止を誘導する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記悪性細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
19. 悪性細胞内のアポトーシスを誘導する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記悪性細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
20. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内の血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）を抑制することによって治療する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記脳腫瘍の前記悪性細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
21. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内の血管新生を抑制することによって治療する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記脳腫瘍の前記悪性細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
22. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内の血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）のリン酸化を抑制することによって治療する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記脳腫瘍の前記悪性細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
23. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を周囲組織の中への該脳腫瘍の悪性細胞の浸潤及び移動を抑制することによって治療する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記脳腫瘍細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
24. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内の細胞周期を抑制する又は細胞周期阻止を誘導することによって治療する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記脳腫瘍細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
25. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内のアポトーシスを誘導することによって治療する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記脳腫瘍細胞に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
26. 前記脳腫瘍は、多形成膠芽腫（ＧＢＭ）であることを特徴とする請求項２０から請求項２５のいずれかに記載の方法。
27. 治療を必要とする被験者内の多形成膠芽腫（ＧＢＭ）を治療する方法であって、
    Ｆ１６を含む組成物を与える段階と、
    前記被験者に前記組成物を投与する段階と、
    を備えることを特徴とする方法。
28. 与えられる前記組成物は、化学療法剤を更に備えることを特徴とする請求項２０から請求項２７のいずれかに記載の方法。
29. 前記化学療法剤は、テモゾロミド（ＴＭＺ）又はベバシズマブ（ＢＶＺ）又は類似の薬剤であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
30. 悪性細胞内の血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）を抑制する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
31. 異常血管系を示す組織内の血管新生を抑制する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
32. 悪性細胞内の血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）のリン酸化を抑制する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
33. 周囲組織の中への悪性細胞の浸潤及び移動を抑制する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
34. 悪性細胞内の細胞周期を抑制する又は細胞周期阻止を誘導する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
35. 悪性細胞内のアポトーシスを誘導する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
36. 治療を必要とする被験者内の多形成膠芽腫（ＧＢＭ）を治療する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
37. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内の血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）を抑制することによって治療する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
38. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内の血管新生を抑制することによって治療する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
39. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内の血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）のリン酸化を抑制することによって治療する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
40. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を周囲組織の中への該脳腫瘍の悪性細胞の浸潤及び移動を抑制することによって治療する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
41. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内の細胞周期を抑制する又は細胞周期阻止を誘導することによって治療する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
42. 治療を必要とする被験者内の脳腫瘍を該脳腫瘍の悪性細胞内のアポトーシスを誘導することによって治療する方法に使用するためのものであることを特徴とする請求項６から請求項１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
43. 請求項３７から請求項４２のいずれか１項に記載の前記医薬組成物の使用であって、
    前記脳腫瘍は、多形成膠芽腫（ＧＢＭ）である、
    ことを特徴とする使用。
44. 請求項３６から請求項４２のいずれか１項に記載の前記医薬組成物の使用であって、
    前記医薬組成物は、化学療法剤を更に備える、
    ことを特徴とする使用。
45. 前記化学療法剤は、テモゾロミド（ＴＭＺ）又はベバシズマブ（ＢＶＺ）又は類似の薬剤であることを特徴とする請求項４４に記載の前記医薬組成物の使用。

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