BR112014030820B1 - Composição aquosa, dispositivo de administração e seringa pré- carregada contendo uma formulação de anticorpo - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO AQUOSA E SEUS USOS, DISPOSITIVO DE DISTRIBUIÇÃO E SERINGA PRÉ-CARREGADA CONTENDO UMA FORMULAÇÃO DE ANTICORPOS. A presente invenção refere-se a anticorpos anti-BAFFR que são formulados como uma formulação líquida compreendendo uma alta concentração do princípio ativo anticorpo para distribuição para um paciente sem níveis altos de agregação do anticorpo. A composição farmacêutica aquosa pode incluir um ou mais açúcares, um agente tamponante, um tensoativo, e/ou um aminoácido livre.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a uma formulação farmacêutica de um anticorpo contra BAFFR (receptor de BAFF), a um processo para a preparação da mesma e aos usos da formulação.

Antecedentes

[002] O par BAFFR:BAFF está criticamente envolvido na maturação de células B transicionais, para sobrevivência e ativação de células B maduras, e para mudança de classe de isótipo em resposta a antígenos dependentes de células T. BAFF e seu receptor BAFFR também são importantes para a sobrevivência e o crescimento de células B malignas. Além disso, o BAFFR normalmente é expresso em pré-células B, mas recentemente verificou-se que ele é expresso em células ALL humanas (leucemia linfoblástica aguda de linhagem B) (Parameswaran, 2010, Cancer Res. 70(11) 4346-4356). A remoção de células B autorreativas e o bloqueio da sobrevivência/ativação inadequadas mediado pelos níveis excessivos de BAFF em pacientes que sofrem de distúrbios autoimunes ou câncer representa um objetivo terapêutico bem validado. Por conseguinte, um anticorpo anti-BAFFR, em particular um anticorpo capaz de citotoxicidade mediada por célu-las dependente de anticorpos (ADCC) e bloqueio da ligação do ligando ao BAFFR pode oferecer um agente terapêutico eficaz em doenças autoimunes e neoplasmas de células B.

[003] Anticorpos contra BAFFR são conhecidos através por exemplo do documento WO 2010/007082 e incluem anticorpos que se caracterizam por compreender um domínio VH com a sequência ami- noacídica de SEQ ID N°: 1 e um domínio VL com a sequência aminoa- cídica de SEQ ID N°: 2. O anticorpo é MOR6654 um desses anticorpos (IgG1 capa). Ele possui a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 9 de cadeia pesada e a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 10 de cadeia leve. Este anticorpo pode ser expresso a partir das SEQ ID Nos: 14 e 15, de preferência em uma célula hospedeira que não possui fu- cosil-transferase, por exemplo em uma linhagem celular mamífera com um gene inativo FUT8(-/-), para oferecer um anticorpo anti-BAFFR não fucosilado funcional com ADCC melhorada. Este anticorpo é doravante denominado MOR6654B. Maneiras alternativas de produzir anticorpos não fucosilados são conhecidas na literatura.

[004] Anticorpos terapêuticos são tipicamente formulados seja em forma aquosa pronta para administração parenteral seja como liofi- lizados para reconstituição com um diluente adequado antes da administração.

[005] O Pedido Internacional PCT/EP2011/072248 divulga liofili-zados, que podem ser reconstituídos para dar uma solução uma alta concentração do princípio ativo anticorpo e um baixo nível de agregação de anticorpos para administração para um paciente. Concentrações altas de anticorpo são úteis porque elas reduzem o volume de dosagem, que deve ser administrado para um paciente. Volumes de dosagem reduzidos minimizam o tempo que leva para administrar uma dose fixa para o paciente.

[006] As composições farmacêuticas formuladas de forma a conter uma concentração elevada de anticorpo podem, no entanto, ter vida útil curta e os anticorpos formulados podem perder sua atividade biológica como resultado de instabilidades químicas e físicas durante o armazenamento. Entre estas, sabemos que agregação, desamidação e oxidação são as causas mais comuns de degradação de anticorpos. Além disso, a agregação pode levar potencialmente a uma resposta imunológica aumentada nos pacientes, levando a problemas de segu rança. Assim sendo a agregação de anticorpos nas composições far-macêuticas deve ser minimizada ou prevenida.

[007] Constitui, portanto, um objetivo da presente invenção oferecer composições farmacêuticas melhoradas e adicionais compreendendo anticorpos anti-BAFFR, formuladas de forma a possibilitar uma concentração elevada de anticorpos anti-BAFFR com nenhuma ou substancialmente nenhuma agregação de anticorpos.

[008] Constitui um outro objetivo da presente invenção oferecer uma formulação de anticorpos anti-BAFFR adequada para administração subcutânea. A vantagem da injeção subcutânea é que ela permite que o profissional aplique a injeção em uma intervenção bem curta com o paciente. Além disso, o paciente pode ser treinado para ele mesmo aplicar a injeção subcutânea.

[009] Este objetivo é satisfeito pelas composições farmacêuticas aquosas da presente invenção.

[0010] As composições aquosas da invenção compreendem uma concentração elevada de anticorpos anti-BAFFR, mas nenhum ou es-sencialmente nenhum anticorpo agregado e são portanto particularmente adequadas para administração subcutânea. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a composições aquosas tendo um pH 5,0 a 7,0 e compreendendo (i) um anticorpo anti-BAFFR em que o anticorpo tem uma concentração de 18 a 165 mg/mL, e em que o referido anticorpo anti- BAFFR inclui as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID Nos: 3, 4 e 5 respectivamente, e as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID Nos: 6, 7 e 8, (ii) um estabilizante, (iii) um agente tamponante, (iv) um tensoativo, e, opcionalmente, (v) um aminoácido.

[0011] Em particular, a invenção oferece uma composição aquosa tendo um pH 5,5 a 6,5 e compreendendo (i) um anticorpo anti-BAFFR em que o anticorpo tem uma concentração de 18 a 165 mg/mL, e em que o referido anticorpo anti- BAFFR inclui as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID Nos: 3, 4 e 5 respectivamente, e as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID N>s: 6, 7 e 8, (ii) sacarose, trealose ou manitol como um estabilizante, (iii) histidina, citrato ou succinato como um agente tampo- nante, (iv) polissorbato 20, poloxâmero 188 ou hidroxipropil-b- ciclodextrina como um tensoativo, e, opcionalmente, (v) arginina como um aminoácido.

[0012] Em uma modalidade, a composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades compreende o anticorpo anti-BAFFR em uma concentração entre 20 mg/mL e 150 mg/mL, particularmente entre 80 mg/mL e 150 mg/mL, particularmente entre 100 mg/mL e 150 mg/mL.

[0013] Em uma modalidade, a composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades compreende um açúcar como um agente estabilizante, particularmente sacarose, manitol ou trealose, em uma concentração entre 80 mM e 300 mM, particularmente entre 120 mM e 270 mM, particularmente entre 120 mM e 220 mM.

[0014] Em uma modalidade, a composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades compreende um ten- soativo, particularmente polissorbato 20 ou poloxâmero 188, em uma concentração entre 0,01% e 0,1%, particularmente entre 0,02% e 0,06%.

[0015] Em uma modalidade, a composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades compreende um agente tamponante, particularmente histidina, citrato ou succinato, em uma concentração entre 5 mM e 50 mM, particularmente em uma concentração entre 15 mM e 25 mM, particularmente entre 18 mM e 22 mM, particularmente 20 mM.

[0016] Em uma modalidade, a composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades compreende adicionalmente um aminoácido, particularmente arginina ou arginina-HCl, em uma concentração entre 2 mM e 80 mM.

[0017] Em uma modalidade, a composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades compreende sacarose ou trealose em uma concentração entre 110 mM e 250 mM.

[0018] Em uma modalidade específica, a presente invenção ofere ce uma composição aquosa tendo um pH 5,5 a 6,5 e compreendendo (i) um anticorpo anti-BAFFR em que o anticorpo tem uma concentração de 18 mg/mL -165 mg/mL, e em que o referido anticorpo anti-BAFFR inclui as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID Nos: 3, 4 e 5 respectivamente, e as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID Nos: 6, 7 e 8, (ii) 80 mM a 300 mM de sacarose, trealose ou manitol como um estabilizante, (iii) 5 mM a 50 mM de histidina, citrato ou succinato como um agente tamponante, (iv) 0,01% a 0,1% de polissorbato 20 ou poloxâmero 188, ou 1 mM - 3 mM de hidroxipropil-b-ciclodextrina como um tensoativo, e, opcionalmente, (v) 2 mM a 80 mM de arginina, particularmente arginina- HCl.

[0019] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção oferece uma composição aquosa tendo um pH 5,5 a 6,5 compreen- dendo (i) um anticorpo anti-BAFFR em que o anticorpo tem uma concentração de 20 mg/mL a 150 mg/mL e em que o referido anticorpo anti-BAFFR inclui as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID Nos: 3, 4 e 5 respectivamente, e as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID N>s: 6, 7 e 8, (ii) 110 mM a 250 mM de sacarose ou trealose como um estabilizante, (iii) 15 mM a 25 mM de histidina, citrato ou succinato como um agente tamponante, (iv) até 0,02% a 0,06% de polissorbato 20 ou poloxâmero 188 ou 2 mM - 3 mM de hidroxipropil-b-ciclodextrina como um tensoa- tivo, e, opcionalmente, (v) 2 mM a 80 mM de arginina, particularmente arginina- HCl.

[0020] Em ainda uma outra modalidade específica, a presente in venção oferece uma composição aquosa tendo um pH 5,5 a 6,5 e compreendendo (i) um anticorpo anti-BAFFR em que o anticorpo tem uma concentração de 20 mg/mL a 150 mg/mL e em que o referido anticorpo anti-BAFFR inclui as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID Nos: 3, 4 e 5 respectivamente, e as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID Nos: 6, 7 e 8, (ii) 120 mM a 220 mM de sacarose ou trealose como um estabilizante, (iii) 18 mM a 22 mM de histidina, citrato ou succinato como um agente tamponante, (iv) até 0,02% a 0,06% de polissorbato 20 ou poloxâmero 188 ou 2,5 mM de hidroxipropil-b-ciclodextrina como um tensoativo, e opcionalmente (v) 2 mM a 80 mM de arginina, particularmente arginina- HCl.

[0021] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção oferece uma composição aquosa tendo um pH 6,0 e compreendendo (i) um anticorpo anti-BAFFR em que o anticorpo tem uma concentração de 150 mg/mL e em que o referido anticorpo anti-BAFFR inclui as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID Nos: 3, 4 e 5 respectivamente, e as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID Nos: 6, 7 e 8, (ii) 220 mM de sacarose como um estabilizante, (iii) 20 mM de histidina como um agente tamponante, (iv) 0,04% de polissorbato 20 como um tensoativo.

[0022] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção oferece uma composição aquosa tendo um pH 6,0 e compreendendo (i) um anticorpo anti-BAFFR em que o anticorpo tem uma concentração de 150 mg/mL e em que o referido anticorpo anti-BAFFR inclui as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID Nos: 3, 4 e 5 respectivamente, e as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID Nos: 6, 7 e 8, (ii) 220 mM de trealose como um estabilizante, (iii) 20 mM de histidina como um agente tamponante, (iv) 0,04% de polissorbato 20 como um tensoativo.

[0023] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção oferece uma composição aquosa tendo um pH 6,0 e compreendendo (i) um anticorpo anti-BAFFR em que o anticorpo tem uma concentração de 150 mg/mL e em que o referido anticorpo anti-BAFFR inclui as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID Nos: 3, 4 e 5 respectivamente, e as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID Nos: 6, 7 e 8, (ii) 120 mM de sacarose ou trealose como um estabilizante, (iii) 20 mM de histidina como um agente tamponante, (iv) 0,04% de polissorbato 20 como um tensoativo, e (v) 50 mM de arginina, particularmente arginina-HCl.

[0024] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção oferece uma composição aquosa tendo um pH 6,0 e compreendendo (i) um anticorpo anti-BAFFR em que o anticorpo tem uma concentração de 20 mg/mL e em que o referido anticorpo anti-BAFFR inclui as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID Nos: 3, 4 e 5 respectivamente, e as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID Nos: 6, 7 e 8, (ii) 220 mM de sacarose ou trealose como um estabilizante, (iii) 20 mM de histidina como um agente tamponante, and (iv) 0,04% de polissorbato 20 como um tensoativo.

[0025] Em uma modalidade, a invenção refere-se à composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades, em que o anticorpo anti-BAFFR compreende um domínio VH com a sequência aminoacídica SEQ ID N°: 1 e um domínio VL com a sequência aminoacídica SEQ ID N°: 2.

[0026] Em uma outra modalidade da invenção, a composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades, em que o anticorpo anti-BAFFR compreende uma região de cadeia pesada de SEQ ID N°: 9 e uma região de cadeia leve de SEQ ID N°: 10.

[0027] Em uma modalidade, o anticorpo anti-BAFFR é um anticor po anti-BAFFR não fucosilado.

[0028] A invenção oferece ainda um dispositivo de administração compreendendo a composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades.

[0029] Este dispositivo de administração pode ser apresentado na forma de uma seringa pré-carregada compreendendo a composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades.

[0030] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para administrar um anticorpo anti-BAFFR para um mamífero, compreendendo a etapa de administrar ao referido mamífero uma composição aquosa da invenção descrita neste relatório nas várias modalidades, particularmente na forma de um dispositivo de administração tal como uma seringa pré-carregada.

[0031] A presente invenção oferece ainda a composição ou o dispositivo de administração, ou a seringa pré-carregada da invenção descritos neste relatório nas várias modalidades, para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio que é mediado pelo receptor de BAFF ou que pode ser tratado por eliminação ou depleção de células B.

[0032] Em particular, a composição farmacêutica ou o dispositivo de administração, ou a seringa pré-carregada da invenção descritos neste relatório nas várias modalidades podem ser usados no tratamento de doenças autoimunes, neoplasmas de células B, tais como linfo- ma, leucemia ou mieloma, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren ou pênfigo vulgar.

[0033] A invenção baseia-se, pelo menos em parte, nas propriedades de anticorpos formulados tais como MOR6654 e MOR6654B, que conservam estabilidade e propriedades bioativas extraordinárias quando formulados em uma alta concentração como uma composição líquida (aquosa).

[0034] Conforme usado neste relatório, uma composição farmacêutica "aquosa" é uma composição adequada para uso farmacêutico, em que o carreador aquoso é água destilada. Uma composição adequada para uso farmacêutico pode ser estéril, homogênea e/ou isotô- nica. Composições farmacêuticas aquosas podem ser preparadas seja diretamente em uma forma aquosa, por exemplo em uma seringa pré- carregada pronta para uso (as "formulações líquidas") ou como liofili- zados para serem reconstituídos imediatamente antes do uso.

[0035] Conforme usado neste relatório, o termo "composição farmacêutica aquosa" refere-se à formulação líquida ou à formulação liofi- lizada reconstituída. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas aquosas da invenção são adequadas para administração parenteral a um indivíduo humano. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas aquosas da invenção são adequadas para administração subcutânea.

[0036] Conforme usado neste relatório, a expressão "administração parenteral" significa um modo de administração que não administração entérica ou tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intrate- cal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsu- lar, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraestemal.

[0037] O uso de anticorpos como o princípio ativo de fármacos é atualmente muito comum, e inclui os produtos HERCEPTIN™ (trastuzumab), RITUXAN™ (rituximab), SYNAGIS™ (palivizumab), etc. Técnicas para purificação de anticorpos terapêuticos para um grau farmacêutico são bastante conhecidas na literatura.

[0038] A composição usualmente será não pirogênica, por exemplo contendo <1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e de preferência <0,1 EU por dose. A composição é de preferência sem glúten.

[0039] Em modalidades específicas, as composições farmacêuticas aquosas da invenção exibem níveis baixos a não detectáveis de agregação ou degradação de anticorpos, com muito pouca ou nenhuma perda das atividades biológicas durante a produção, preparação, transporte e longos períodos de armazenamento, a concentração do anticorpo anti-BAFFR sendo pelo menos cerca de 50 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, ou 300 mg/mL.

[0040] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica aquosa com alta concentração de anticorpos anti- BAFFR.

[0041] Sabe-se na técnica que tais composições farmacêuticas aquosas de alta concentração podem ser diluídas antes da injeção, por exemplo, se concentrações mais baixas de anticorpo forem necessárias para intervenções terapêuticas específicas ou quando tratando pacientes de menor peso corporal, inclusive crianças. Concentrações adequadas podem ser de 25mg/mL ou 10mg/mL. Alternativamente, a formulação original pode ser produzida com esta concentração mais baixa.

[0042] O termo "anticorpo" conforme usado neste relatório inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação a antígenos (i.e., "porção de ligação a antígenos") ou cadeias simples do mesmo. Um "anticorpo" de ocorrência natural é uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é compreendida de três ou quatro domínios, dependendo do isótipo, CH1, CH2, CH3 e CH4. Cada cadeia leve é compreendida de um região variável da cadeia leve (aqui abreviada VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs arranjadas a partir do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imuno- globulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[0043] O termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de antígeno"), conforme usado neste relatório, refere-se ao comprimento integral ou a um ou mais fragmentos de um anticorpo que conservam a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, uma porção de BAFFR). Já foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento integral. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de ligação a an- tígeno" de um anticorpo inclui um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ligação dissulfeto na região de articulação; um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um fragmento dAb (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste em domínio VH; e uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada.

[0044] Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando-se métodos recombinantes, por um ligador sintético que permite transformá-los em uma única cadeia proteica na qual as regiões VL e VH se juntam em par para formar moléculas monovalentes (conhecida como cadeia simples Fv (scFv); vide, por exemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; e Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples também são considerados abrangidos pelo termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos por técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas na técnica, e os fragmentos são rastreados quanto à sua utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos.

[0045] Um "anticorpo isolado", conforme usado neste relatório, refere-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes, por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao BAFFR humano é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antí- genos diferentes do BAFFR. Um anticorpo isolado que se liga especificamente ao BAFFR pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos, tais como moléculas de BAFFR de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos.

[0046] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" conforme usado neste relatório referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de uma única composição molecular. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade e afinidade de ligação para um epítopo particular.

[0047] O termo "anticorpo humano", conforme usado neste relatório, inclui anticorpos tendo regiões variáveis nas quais tanto as regiões estruturais quanto as regiões CDR são derivadas de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também será derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências da linhagem germinativa humana, ou versões mutadas de sequências da linhagem germinativa humana ou anticorpo contendo sequências estruturais de consenso derivadas a partir de análise de sequências estruturais humanas, por exemplo, como descrito por Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86).

[0048] As estruturas e localizações de domínios variáveis da imu-noglobulina, por exemplo, CDRs, podem ser definidas usando-se esquemas de numeração bastante conhecidos, por exemplo, o esquema de numeração de Kabat, o esquema de numeração de Chothia, uma combinação de Kabat e Chothia (AbM), etc. (vide, por exemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Al Lazikani et al. (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948). Em todo este relatório descritivo, a região determinante de complementaridade ("CDR") é definida segundo a definição de Kabat à exceção da CDRH1 que é o segmento de aminoácidos definido por uma combinação das definições de Kabat e Chothia para esta CDR.

[0049] Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos aminoacídicos não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado neste relatório, não se destina a incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linhagem germina- tiva de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, tenham sido enxertados em sequências estruturais humanas.

[0050] O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos apresentando uma única especificidade de ligação que possuem regiões variáveis nas quais tanto as regiões estruturais quanto as regiões CDR são derivadas de sequências humanas.

[0051] O termo "anticorpo humano recombinante", conforme usado neste relatório, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundon- go) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglo- bulina humana ou um hibridoma preparado a partir do mesmo, anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, a partir de um transfectoma, anticorpos isolados a partir de uma biblioteca combinatorial de anticorpos humanos recombinantes, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outra meio que envolva emenda de toda ou de uma porção de uma sequência de genes de imunoglobulina humana, a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recom- binantes possuem regiões variáveis nas quais as regiões estruturais e as regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mu- tagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humana é usado, à mutagênese somática in vivo) e assim as sequências aminoacídicas das regiões VH e VL dos anticorpos recombi- nantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas com as sequências VH e VL da linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente na repertório da linhagem germinativa do anticorpo humano in vivo.

[0052] Conforme usado neste relatório, "isótipo" refere-se à classe de anticorpos (por exemplo, IgM, IgA, IgD, IgE e IgG tal como IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é oferecida pelos genes da região constante de cadeia pesada.

[0053] As expressões "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas intercambia- velmente com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno" neste relatório.

[0054] Conforme usado neste relatório, um anticorpo que "se liga especificamente ao polipeptídio de BAFFR" ou um "anticorpo anti-BAFFR" refere-se a um anticorpo que se liga ao polipeptídio de BAFFR de SEQ ID N°: 13 com um KD de 100 nM ou menos, 10 nM ou menos, 1 nM ou menos. Um anticorpo que "reage cruzadamente com um antígeno que não o BAFFR" refere-se a um anticorpo que se liga àquele antígeno com um KD de 0,5 x 10-8 M ou menos, 5 x 10-9 M ou menos, ou 2 x 10-9 M ou menos. Um anticorpo que "não reage cruzadamente com um antígeno particular" refere-se a um anticorpo que se liga àquele antígeno com um KD de 1,5 x 10-8 M ou mais, ou um KD de 5 a 10 x 10-8 M ou 1 x 10-7 M ou mais. Em certas modalidades, tais anticorpos que não reage cruzadamente com o antígeno exibem ligação essencialmente não detectável contra essas proteínas em ensaios de ligação tradicionais.

[0055] Em uma modalidade, uma alta concentração de um anticorpo anti-BAFFR na composição farmacêutica aquosa da invenção é pelo menos 50 mg/mL. Em uma modalidade, uma alta concentração é pelo menos 100 mg/mL. Em uma modalidade, uma alta concentração é pelo menos 150 mg/mL. Em uma modalidade, uma alta concentração é pelo menos 200 mg/mL. Em uma modalidade, uma alta concentração é pelo menos 250 mg/mL. Em uma modalidade, uma alta concentração é pelo menos 270 mg/mL. Em uma modalidade, uma alta concentração é pelo menos 300 mg/mL.

[0056] Em uma modalidade, a composição farmacêutica aquosa da invenção compreende entre 50 mg/mL e 300 mg/mL de um anticorpo anti-BAFFR, por exemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

[0057] Em uma modalidade, a composição farmacêutica aquosa da invenção compreende entre 75 mg/mL e 270 mg/mL de um anticorpo anti-BAFFR, por exemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

[0058] Em uma modalidade, a composição farmacêutica aquosa da invenção compreende entre 100 mg/mL e 250 mg/mL de um anticorpo anti-BAFFR, por exemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

[0059] Em uma modalidade, a composição farmacêutica aquosa da invenção compreende entre 100mg/mL e 200mg/mL de um anticorpo anti-BAFFR, por exemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

[0060] Em uma modalidade, a composição farmacêutica aquosa da invenção compreende 150 mg/mL de um anticorpo anti-BAFFR, por exemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

[0061] Em uma modalidade, a composição farmacêutica aquosa da invenção compreende 20 mg/mL de um anticorpo anti-BAFFR, por exemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

[0062] Em uma modalidade, a composição farmacêutica aquosa da invenção compreende cerca de 50 mg/mL, cerca de 60 mg/mL, cerca de 70 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 90 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 110 mg/mL, cerca de 120 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 140 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 160 mg/mL, cerca de 170 mg/mL, cerca de 180 mg/mL, cerca de 190 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 210 mg/mL, cerca de 220 mg/mL, cerca de 230 mg/mL, cerca de 240 mg/mL, cerca de 250 mg/mL, cerca de 270 mg/mL ou cerca de 300 mg/mL de um anticorpo anti-BAFFR, por exemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

[0063] Além disso, as composições farmacêuticas aquosas de acordo com a invenção descritas neste relatório nas várias modalidades são estáveis de modo que, mesmo de armazenamento por 4 semanas a 2-8°C, menos de 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,05% ou 0,01% do anticorpo anti-BAFFR total são agregados segundo medido por SEC- HPLC.

[0064] As composições farmacêuticas aquosas de acordo com a invenção descritas neste relatório nas várias modalidades são estáveis de modo que, mesmo de armazenamento por 2 meses a 2 a 8°C, menos de 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,05% ou 0,01% do anticorpo anti-BAFFR total são agregados segundo medido por SEC-HPLC.

[0065] As composições farmacêuticas aquosas podem incluir, além do anticorpo anti-BAFFR, outros componentes tais como um ou mais dos seguintes: (i) um estabilizante; (ii) um agente tamponante; (iii) um tensoativo; e (iv) um aminoácido livre. A inclusão de cada um desses componentes adicionais pode resultar em composições com baixa agregação do anticorpo anti-BAFFR.

[0066] Estabilizantes adequados para uso com a invenção podem agir, por exemplo como agentes melhoradores da viscosidade, agentes de volume, agentes solubilizantes, e/ou similares. O estabilizante pode ser iônico ou não iônico (por exemplo açúcares). Como açúcares eles incluem, porém sem limitação, monossacarídeos, por exemplo, frutose, maltose, galactose, glucose, D-manose, sorbose entre outros; dissacarídeos, por exemplo lactose, sacarose, trealose, celobiose, entre outros; polissacarídeos, por exemplo rafinose, melezitose, malto- dextrinas, dextranas, amidos, entre outros; e alditóis, tais como mani- tol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) entre outros. Por exemplo, o açúcar pode ser sacarose, trealose, rafinose, maltose, sorbitol ou manitol. O açúcar pode ser um álcool de açúcar ou um amino açúcar. Sacarose é particularmente útil. Como estabilizante iônico eles incluem sais tais como NaCl ou componentes aminoacídicos tais como arginina-HCl.

[0067] Agentes tamponantes adequados para uso com a invenção incluem, porém sem limitação, sais de ácidos orgânicos tais como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico; tampão Tris, cloridrato de trometamina, ou fosfato. Além disso, componentes aminoacídicos também podem ser usados como agente tamponante. Tal componente aminoacídico inclui, porém sem limitação, glicina e histidina. Um tampão histidina é particularmente útil.

[0068] As composições farmacêuticas aquosas incluem tal agente tamponante ou agente de ajuste do pH para proporcionar controle melhorado do pH. Em uma modalidade, uma composição farmacêutica aquosa da invenção tem um pH entre 5,0 e 8,0, entre 5,0 e 7,0, entre 5,5 e 7,0, ou entre 5,5 e 6,5. Em uma modalidade específica, uma composição farmacêutica aquosa da invenção tem um pH cerca de 6,0.

[0069] Conforme usado neste relatório, o termo "tensoativo" refere-se a substâncias orgânicas tendo estruturas anfipáticas; i.e., elas são compostas de grupos com tendências de solubilidade opostas, tipicamente uma cadeia hidrocarboneto solúvel em óleo e um grupo iônico solúvel em água. Os tensoativos podem ser classificados, dependendo da carga da porção tensoativa, em agentes aniônicos, ca- tiônicos e dispersantes para várias composições farmacêuticas e preparações de materiais biológicos.

[0070] Tensoativos adequados para uso com a invenção incluem,porém sem limitação, tensoativos não iônicos, tensoativos iônicos e tensoativos zwiteriônicos. Tensoativos típicos para uso com a invenção incluem, porém sem limitação, ésteres de ácidos graxos com sor- bitan (por exemplo monocaprilato de sorbitan, monolaurato de sorbi- tan, monopalmitato de sorbitan), trioleato de sorbitan, ésteres de ácidos graxos com glicerina (por exemplo monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina, monoestearato de glicerina), ésteres de ácidos graxos com poliglicerina (por exemplo monoestearato de deca- gliceril, diestearato de decagliceril, monolinoleato de decagliceril), ésteres de ácidos graxos com polioxietileno e sorbitan (por exemplo fatty acid esters (e.g. sorbitan monolaurato de polioxietileno, sorbitan mono- oleato de polioxietileno, sorbitan monostearato de polioxietileno, sorbi- tan monopalmitato de polioxietileno, sorbitan trioleato de polioxietileno, sorbitan triestearato de polioxietileno), ésteres de ácidos graxos com polioxietileno e sorbitol (por exemplo sorbitol tetraestearato de polioxie- tileno, sorbitol tetraoleato de polioxietileno), ésteres de ácidos graxos com polioxietileno e glicerina (por exemplo gliceril monoestearato de polioxietileno), ésteres de ácidos graxos com polietileno glicol (por exemplo glicol diestearato de polietileno), alquil éteres de polioxietileno (por exemplo lauril éter de polioxietileno), alquil éteres de polioxietileno polioxipropileno (por exemplo polioxietileno polioxipropileno glicol, pro- pil éter de polioxietileno polioxipropileno, cetil éter de polioxietileno po- lioxipropileno), alquilfenil éteres de polioxietileno (por exemplo nonilfe- nil éter de polioxietileno), óleos de rícino hidrogenados com polioxieti- leno (por exemplo óleo de rícino com polioxietileno, óleo de rícino hi- drogenado com polioxietileno), derivados de cera de abelha com poli- oxietileno (por exemplo cera de abelha com polioxietileno sorbitol), derivados de lanolina com polioxietileno (por exemplo lanolina com poli- oxietileno), e amidas de ácidos graxos com polioxietileno (por exemplo amida de ácido esteárico com polioxietileno); C10-C18 alquil sulfatos (por exemplo cetil sulfato de sódio, lauril sulfato de sódio, oleil sulfato de sódio), C10-C18 alquil sulfato de polioxietileno com uma média de 2 a 4 moles de unidades óxido de etileno acrescentados (por exemplo polioxietileno lauril sulfato de sódio), e sais de ésteres de C1-C18 alquil sulfosuccinato (por exemplo éster de lauril sulfosuccinato de sódio); e tensoativos naturais tais como lecitina, glicerofosfolipídio, esfinogofos- folipídios (por exemplo esfingomielina), e sacarose ésteres de C12-C18 ácidos graxos. Uma composição pode incluir um ou mais desses ten- soativos. Tensoativos preferidos são ésteres de ácidos graxos com sorbitan e polioxietileno por exemplo polissorbato 20, 40, 60 ou 80. Po- lissorbato 20 (Tween 20) é particularmente útil.

[0071] Aminoácidos livres adequados para uso com a invenção incluem, porém sem limitação, arginina, lisina, histidina, ornitina, iso- leucina, leucina, alanina, glicina, ácido glutâmico ou ácido aspártico. A inclusão de um aminoácido básico é preferível, i.e., arginina, lisina e/ou histidina. Se uma composição inclui histidina então esta pode agir tanto como um agente tamponante quanto como um aminoácido livre, mas quando um tampão histidina é usado é típico incluir um aminoáci- do livre não histidina, por exemplo incluir tampão histidina e lisina. Um aminoácido pode estar presente em sua D- e/ou L-, mas a forma L- é típica. O aminoácido pode estar presente como qualquer sal adequado, por exemplo um sal de cloridrato, tal como arginina-HCl.

[0072] Outros excipientes contemplados, que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas aquosas da invenção incluem, por exemplo, agentes flavorizantes, agentes antimicrobianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, lipídios tais como fosfolipídios ou ácidos graxos, esteroides tais como colesterol, excipientes proteicos tais como albumina sérica (albumina sérica humana), albumina humana recombinante, gelatina, caseína, contraíons formadores de sal tais como sódio entre outros. Estes e excipientes e/ou aditivos farmacêuticos adicionais conhecidos adequados para uso nas formulações da invenção são conhecidos na literatura, por exemplo, como os listados em "The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th edition, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003); e Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 21th edition, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005).

[0073] As composições farmacêuticas aquosas da invenção podem incluir outros princípios ativos além do anticorpo anti-BAFFR. Outros agentes farmacológicos podem incluir, por exemplo, compostos quimioterapêuticos.

Doenças e distúrbios alvo

[0074] As composições farmacêuticas aquosas da invenção compreendendo anticorpos anti-BAFFR podem ser usadas para tratar, melhorar ou prevenir uma variedade de doenças ou distúrbios. Composi-ções farmacêuticas compreendendo anticorpos anti-BAFFR são parti-cularmente úteis para tratar distúrbios relacionados com BAFFR tais como distúrbios autoimunes, por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, pênfigo vulgar, artrite reumatoide, esclerose múltipla e neoplasmas de células B tais como leucemia linfoblástica aguda (ALL) e leucemia linfocítica crônica (CLL) de células B.

[0075] Conforme usado neste relatório, "um distúrbio relacionado com BAFFR" inclui condições associadas com ou caracterizadas por níveis aberrantes de BLyS e/ou doenças ou condições que podem ser tratadas por depleção ou eliminação de células B. Estas incluem, porém sem limitação, condições inflamatórias, doenças autoimunes, infecções severas, e rejeição de transplante de órgão ou tecido. Estas incluem ainda neoplasmas de células B.

[0076] Por exemplo, as composições farmacêuticas aquosas da invenção compreendendo anticorpos anti-BAFFR podem ser usadas para o tratamento, a melhora ou a prevenção de receptores de transplante de coração, pulmão, coração e pulmão combinados, fígado, rim, pâncreas, pele ou córnea, incluindo rejeição de aloenxerto ou rejeição de xenoenxerto, e para a prevenção da doença do enxerto versus hospedeiro, tal como subsequente a transplante de medula óssea, e arteriosclerose associada a transplante de órgão. Além disso, as composições farmacêuticas aquosas da invenção são úteis de transplante de órgão sólido e na rejeição de transplante aguda e crônica mediada por anticorpos.

[0077] As composições farmacêuticas aquosas da invenção compreendendo anticorpos anti-BAFFR são úteis para o tratamento, a prevenção, ou a melhora de doenças autoimunes e de condições inflamatórias, em particular condições inflamatórias incluindo uma etiologia que inclui um componente autoimune tal como artrite (por exemplo artrite reumatoide, artrite crônica progressiva e artrite deformante) e do- enças reumáticas, incluindo condições inflamatórias e doenças reumáticas que envolvem perda óssea, dor inflamatória, espondiloartropatias incluindo espondilite alquilosante, síndrome de Reiter, artrite reativa, artrite psoriáticas, e artrite enterofática, hipersensibilidade (incluindo hipersensibilidade das vias aéreas e hipersensibilidade dérmica) e alergias. Doenças autoimunes específicas para quais os anticorpos da invenção podem ser empregados incluem distúrbios hematológicos autoimunes (incluindo por exemplo anemia hemolítica, anemia aplási- ca, anemia pura de células vermelhas e trombocitopenia idiopática), hemofilia A adquirida, doença da aglutinina fria, crioglobulinemia, púrpura trombocitopênico trombótica, síndrome de Sjogren, lúpus eritema- toso sistêmico, distúrbios musculares inflamatórios, policondrite, escle- rodermia, vasculite tal como crioglobulinemia, vasculitide de vasos grandes tais como arterite de células gigantes, polimialgia reumática, vasculitide necrotizante, incluindo vasculite associada a anticorpos an- ti-citoplasma de neutrófilos, artetire de Takayasu, poliarterite nodosa, púrpura de Henoch-Schonlein, e síndrome de Churg-Strauss, neuropa- tia mediada por IgM, espondarterite soronegativa, síndrome de opsoclonia mioclonia, granulomatose de Wegener, dermatomiosite, vasculi- te associada a autoanticorpos anti-citoplasma de neutrófilos (ANCA), hepatite ativa crônica, miastenia grave, psoríase, síndrome de Steven- Johnson, pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, espru idiopático, doença au- toimune do intestino inflamado (incluindo por exemplo colite ulcerativa, doença de Crohn e síndrome do intestino irritado), oftalmopatia endó- crina, doença de Grave, sarcoidose, esclerose múltipla, neuromielite óptica, cirrose biliar primária, diabetes juvenil (diabetes melito tipo I), uveíte (anterior, intermediária e posterior assim como panuveíte), cera- toconjuntivite seca e ceratoconjuntivite primaveril, fibrose pulmonar intersticial, artrite psoriática e glomerulonefrite (com e sem síndrome nefrótica, por exemplo incluindo síndrome nefrótica idiopática ou ne- fropatia de alteração mínima), lúpus nefrítico agudo, doenças inflamatórias de pele e de córnea, miosite, afrouxamento de implantes ósseos, distúrbios metabólicos, tais como aterosclerose, diabetes, e dis- lipidemia.

[0078] As composições farmacêuticas aquosas da invenção também podem ser úteis na prevenção, na melhora ou no tratamento de neoplasmas de células B. Exemplos de tais doenças e condições incluem, porém sem limitação, linfomas não Hodgkin de células B, tais como linfoma linfocítico pequeno, linfoma linfoplasmacitoide linfoma de células do manto, linfoma folicular, linfoma de tecido linfoide associado à mucosa, linfoma difuso de grandes células, e linfoma de Burkitt; leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfoblástica de células B precursoras; leucemia linfocítica crônica de células B (CLL), e mieloma múltiplo. Outros neoplasmas de células B estão abrangidos pelo escopo da invenção.

Administração ao paciente

[0079] Uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada a um paciente. A administração será feita tipicamente por infusão ou via uma seringa. Assim sendo, a invenção oferece um dispositivo de administração (por exemplo uma seringa) incluindo uma composição farmacêutica da invenção (por exemplo, uma seringa pré- carregada). Os pacientes receberão uma quantidade eficaz do anticorpo anti-BAFFR como o princípio ativo principal, i.e., uma quantidade que é suficiente para tratar, melhorar, ou prevenir a doença ou distúrbio em questão. Os efeitos terapêuticos também podem incluir uma redução nos sintomas físicos. A quantidade eficaz ideal e a concentração de anticorpo para indivíduo em particular vão depender de vários fatores, que incluem a idade, o tamanho, a saúde e/ou o sexo do paciente, a natureza e a extensão da condição, a atividade do anticorpo particular, a taxa de sua depuração pelo corpo, e também de quais- quer outros possíveis terápicos administrados em combinação com o anticorpo. A quantidade eficaz administrada para uma situação dada pode ser determinada a critério médico. Para os efeitos da presente invenção, uma dose eficaz pode variar de cerca de 0,005 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, ou de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Os fármacos conhecidos à base de anticorpos oferecem orientação neste sentido, exemplo HERCEPTIN™ é administrada com uma dose de carga inicial de 4 mg/kg de peso corporal e uma dose de manutenção semanal de 2 mg/kg de peso corporal; RITUXAN™ é administrado uma vez por semana a 375 mg/m2; SYNAGIS™ é administrado por via intramuscular a 15 mg/kg de peso corporal; etc.

[0080] A invenção oferece um método para administrar um anticorpo monoclonal para um mamífero, compreendendo uma etapa de administrar ao paciente uma composição farmacêutica da invenção.

[0081] A invenção também oferece formulações da invenção já descritas neste relatório nas várias modalidades para uso como medicamentos por exemplo para na administração de um anticorpo para um mamífero, ou para uso no tratamento, na prevenção ou na melhora de uma ou mais das doenças e distúrbios descritos acima.

[0082] O mamífero é de preferência um ser humano mas também pode ser, por exemplo, um cavalo ou uma vaca ou um cachorro ou um gato. Os anticorpos serão escolhidos de forma ideal para coincidir com a espécie alvo, por exemplo um anticorpo humano para administração ao homem, um anticorpo equino para cavalos, um anticorpo canino para cachorros etc. Se anticorpos hospedeiros nativos não estiverem disponíveis então a transferência da especificidade do anticorpo de uma espécie para outra pode ser obtida por transferência de resíduos de CDR (e tipicamente, adicionalmente, um ou mais resíduos estruturais) de um anticorpo do doador para a estrutura do receptor da espécie hospedeira por exemplo na humanização. Anticorpos equinizados, bovinizados, caninizados e felinizados são conhecidos na literatura. O anticorpo vai ligar-se ao BAFFR da espécie alvo, mas também pode reagir cruzadamente com o BAFFR de outras espécies.

[0083] A dosagem pode ser por um programa de dose única ou por um programa de múltiplas doses.

[0084] Os ingredientes para formar composições da invenção podem ser apresentados em recipientes hermeticamente vedados.

O anticorpo anti-BAFFR

[0085] A invenção refere-se à formulação de anticorpos anti-BAFFR e mais especificamente MOR6654 e MOR6654B.

[0086] Um anticorpo adequado que pode estar compreendido nas composições farmacêuticas da invenção é o anticorpo recombinante humano MOR6654, estruturalmente caracterizado como descrito mais adiante. A sequência aminoacídica da VH de tal anticorpo anti-BAFFR isolado está mostrada na SEQ ID N°: 1. A sequência aminoacídica da VL de tal anticorpo anti-BAFFR isolado está mostrada na SEQ ID N°: 2. Um exemplo da sequência aminoacídica de cadeia pesada de comprimento integral de tal anticorpo anti-BAFFR isolado está mostrado na SEQ ID N°: 9. Um exemplo da sequência aminoacídica de cadeia leve de comprimento integral de tal anticorpo anti-BAFFR isolado está mostrado na SEQ ID N°: 10. Um outro exemplo de sequências aminoacídi- cas das cadeias pesada e leve de tais anticorpos anti-BAFFR isolados são aquelas codificadas pelas sequências nucleotídicas de SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12, respectivamente. Um outro exemplo de sequências aminoacídicas das cadeias pesada e leve de anticorpos são aquelas codificadas pelas sequências de DNA correspondentes no plasmí- dio pBW510 depositado pela Novartis Pharma AG, Forum 1, CH-4002 Basel, Suíça, em DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha em 29 de abril de 2009 com número de acesso DSM22542.

[0087] Outros anticorpos anti-BAFFR que podem ser usados para preparar as composições farmacêuticas da invenção incluem anticorpos anti-BAFFR, com aminoácidos que foram mutados por deleção, inserção ou substituição de aminoácidos, mas não possuem mais de 1, 2, 3, 4 ou 5 deleções, inserções ou substituições de aminoácidos em qualquer das regiões de cadeia pesada ou de cadeia leve descritas acima. Em uma modalidades específica, tais alterações aminoacídicas só vão aparecer nas regiões estruturais e/ou nas regiões constante e as regiões CDR são 100% idênticas às regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID N°: 3, 4 e 5 e às regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID N°: 6, 7, e 8, respectivamente. Em uma modalidade mais específica, as alterações que foram feitas são apenas substituições aminoacídicas conservativas fora das regiões CDR.

[0088] Substituições aminoacídicas conservativas são aquelas nas quais o resíduo aminoacídico é substituído por um resíduo aminoacídi- co tendo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos amino- acídicos tendo cadeias laterais semelhantes já foram definidas na literatura. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares inalteradas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, me- tionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim sendo, um ou mais resíduos aminoacídicos fora das regiões CDR de um anticorpo anti-BAFFR po-dem ser substituídos por outros resíduos aminoacídicos da mesma família de cadeia lateral, e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função conservada, em particular as mesmas propriedades de li-gação ao BAFFR.

[0089] Os anticorpos podem ser tipicamente glicosilados. Glicanas N-ligadas presas ao domínio CH2 de uma cadeia pesada, por exemplo, podem influenciar a ligação de C1q e FcR, e anticorpos aglicosilados podem ter afinidade mais baixa ou diferente para esses receptores. A estrutura do tipo glicana também pode afetar a atividade, por exemplo diferenças na morte celular mediada pelo complemento pode ser vistas dependendo do número de açúcares galactose (0, 1 ou 2) no terminal de uma cadeia biantenária da glicana. As glicanas de um anticorpo de preferência não levam a uma resposta imunogênica humana depois da administração.

[0090] Adicionalmente ou alternativamente, é possível fazer um anticorpo que tenha um tipo de glicosilação alterado, tal como um anticorpo hipofucosilado ou não fucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduo fucosial ou nenhum resíduo fucosil ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac bissecantes aumentadas. Já foi demonstrado que tais padrões de glicosilação alterados aumentam a capacidade de cito- toxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC) dos anticorpos. Tais modificações de carboidratos podem ser feitas, por exemplo, por expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com mecanismo de glicosilação alterado. Células com um mecanismo de glicosilação alterado já foram descritas na literatura e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais são expressos anticorpos re- combinantes da invenção para assim produzir um anticorpo com glico- silação alterada. Por exemplo, o documento EP 1.176.195 de Hang et al. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma fucosil transferase, de modo que os anticorpos expressos em tal linhagem celular exibem hipofucosilação ou são destituídos de resíduos fucosil. Por conseguinte, em uma modalidade, os anticorpos anti-BAFFR que são incluídos nas composi- ções farmacêuticas da invenção são produzidos por expressão recom- binante em uma linhagem celular que exibe um padrão de hipofucosi- lação ou de não fucosilação, por exemplo, uma linhagem celular mamífera com expressão deficiente do gene FUT8 codificando fucosil- transferase.

[0091] Conforme usado neste relatório, o termo MOR6654 abrange qualquer tipo de padrão de glicosilação. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas compreendem um anticorpo anti- BAFFR consistindo em MOR6654 produzido em uma linhagem celular que exibe um padrão de hipofucosilação ou de não fucosilação, tal como MOR6654B, que exibe um padrão de não fucosilação (destituído de resíduos fucosil). A Publicação PCT WO 03/035835 de Presta descreve uma variante da linhagem celular CHO, células Lecl3, com capacidade reduzida de prender fucose a carboidratos Asn(297)-ligados, resultando também na hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (vide também Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). A Publicação PCT WO 99/54342 de Umana et al. descreve linhagens celular modificadas geneticamente para ex-pressar glicosil transferases modificadoras de glicoproteínas (por exemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) para que anticorpos expressos nas linhagens celulares modificadas geneticamente exibam estruturas GlcNac bissecantes aumentadas que resulta em uma atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (vide também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180). Eureka Therapeutics descreve ainda células CHO de mamífero geneticamente modificadas capazes de produzir anticorpos com padrão de glicosilação de mamífero alterado destituído de resíduos fucosil (http://www.eurekainc.com/about us/ companyoverview.html). Alterna-tivamente, os anticorpos anti-BAFFR podem ser produzidos em leveduras ou fungos filamentosos modificados geneticamente para um pa- drão de glicosilação semelhante ao de mamífero e capaz de produzir anticorpos sem fucose como padrão de glicosilação (vide por exemplo o documento EP1297172B1).

[0092] Uma outra modificação dos anticorpos anti-BAFFR que é contemplada pela invenção é a peguilação. Um anticorpo pode ser pe- guilado, por exemplo, para aumentar a meia-vida biológica (por exemplo sérica) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, deve ser tipicamente reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou um derivado tipo aldeído de PEG, em condições nas quais um ou mais grupos PEG ficam presos ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A peguilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou por uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativo (ou um polímero hidrossolúvel reativo análogo).

[0093] Conforme usado neste relatório, o termo "polietileno glicol" destina-se a abranger qualquer uma das formas de PEG que são usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcoxi- ou ariloxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilação de proteínas são conhecidos na literatura e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Vide, por exemplo, o documento EP 0 154 316 de Nishimura et al. e o documento EP 0 401 384 de Ishikawa et al.

[0094] Qualquer outra modificação pós-translacional natural ou não natural de anticorpos anti-BAFFR (por exemplo MOR6654) é ainda comtemplada como modalidades específicas de anticorpos anti- BAFFR que poderiam ser usados para preparar as composições farmacêuticas da invenção.

[0095] Os anticorpos podem ser preparados em uma forma livre de produtos aos quais eles associar-se-iam naturalmente. Componen-tes contaminantes do ambiente natural de um anticorpo incluem materiais tais como enzimas, hormônios ou outras proteínas de células hospedeiras.

EXEMPLOS Preparação de anticorpos anti-BAFFR

[0096] O anticorpo MOR6654 liga-se especificamente ao BAFFR e também está descrito no pedido internacional publicado como WO2010/007082. Ele é um anticorpo IgG1 capa humano obtido via exibição de fagos. Suas cadeias pesada e leve consistem nas SEQ ID Nos: 9 e 10. As Tabelas 1 e 2 abaixo resumem as características das sequências do MOR6654.Tabela 1: Breve descrição das sequências listadas na listagem de sequências da Tabela 2

Tabela 2: Listagem de sequências

Exemplos de formulações

[0097] Uma formulação líquida de alta concentração de MOR6654B era desejada e por isso estudos de formulação foram rea-lizados. Uma formulação líquida compreendendo um açúcar, um agente tamponante e um tensoativo foi estável e conseguiu manter concen-trações elevadas de anticorpo.

[0098] O anticorpo pode ser produzido em células hospedeiras mamíferas, tais como uma linhagem de células CHO transfectada com vetores de expressão carregando sequências codificadoras das cadeias pesada e leve sob promotores de expressão adequados.

[0099] O anticorpo é de preferência produzido em uma linhagem celular mamífera, por exemplo uma linhagem de células CHO, modificada pelo uso, por exemplo, da tecnologia Potelligent™ (BioWa, Inc.) levando à expressão deficiente do gene FUT8 codificando fucosiltrans- ferase. O anticorpo resultante é não fucosilado e designado MOR6654B neste relatório.

[00100] O desenvolvimento de uma formulação líquida de MOR6654B em um frasco ou em uma seringa pré-carregada consistiu em dois estudos. Um primeiro crivo foi feito para definir os excipientes na formulação. Em um segundo crivo a formulação selecionada foi confirmada no acondicionamento primário final.

Estabilidade e plano analítico

[00101] Os seguintes métodos de análise foram efetuados: ensaio de UV, cromatografia de exclusão de tamanho HPLC, espalhamento de luz dinâmico, cromatografia de troca catiônica HPLC, cromatografia em fase reversa HPLC, analisador ALP, turvação, valor do pH, osmo- lalidade, MFI (imageamento de microfluxo), viscosidade, cor, inspeção visual.

Determinação da estabilidade

[00102] A estabilidade foi ainda determinar depois de se submeter as formulações a certas condições de estresse que incluíram agitação, ciclos de congelamento-descongelamento e exposição prolongada à luz (1 mês a 40°C).

Método turbidimétrico

[00103] A turvação foi medida por um método turbidimétrico.

[00104] As medições no turbidímetro para as amostras foram feitas seguindo-se o manual operacional (Model 2100AN Instrument Manual, Number: 47901-88, Nov. 2006, Edition 2). No início da análise a curva de calibração para o instrumento foi verificada analisando-se 5 amostras de calibração, inclusive água. Se os valores medidos pelo instrumento estivessem dentro de 5% do valor padrão, então a curva de ca- libração era aprovada. Se alguns dos padrões não estivessem dentro do critério de aceitação de 5%, então o instrumento era recalibrado seguindo-se o manual operacional. Depois de o instrumento passar pela calibração, as amostras foram carregadas em tubos de ensaio de fundo plano de 11 mm e analisadas.

Método de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)

[00105] No método SEC usado para analisar as formulações líquidas, os seguintes parâmetros do método foram usados: Coluna: TSKgel G3000SWXL Tampão de análise: 150 mM fosfato de K, pH 6,5 +/- 0,1 Taxa de fluxo: 0,4 mL/min Temperatura da coluna: 30°C Detecção: 210 nm Volume de injeção: 10 ul Temperatura da amostra: aproximadamente 5°C Tempo de operação: 40 minutos Taxa de amostragem dos dados: 1,0 pontos/segundo (etapa Chromeleon = 1,0)

Método de cromatografia de troca catiônica (CEX) HPLC

[00106] A primeira etapa para a análise das amostras usando o mé todo CEX HPLC era diluir todas formulações até 10 mg/mL usando água. A segunda etapa era pegar a amostra diluída a 10 mg/mL e diluir novamente com a fase móvel A até 3 mg/mL. A amostra era então carregada na HPLC e analisada. Fase móvel A: 25 mM de fosfato de sódio, pH 6,5 Fase móvel B: 25 mM de fosfato de sódio, 250 mM de NaCl, pH 6,5 Taxa de fluxo: 1,0 mL/min Temperatura da coluna: 30°C +/- 2°C Temperatura da amostra: 5°C +/- 2°C Volume de injeção: 40 ul Tempo de operação (min): 60 Detecção: 215 nm Gradiente:

Método de RP HPLC

[00107] O método de RP HPLC usado para analisar as amostras de LB-120 foi efetuado seguindo-se os seguintes parâmetros do método de RP. O gradiente no protocolo de resultado resultou no fato de a proteína ser eluída no volume vazio da coluna. Parâmetros do método Informação sobre a coluna: PoroShell 300SB-C8 Fase móvel A: 90% (v/v) de H2O / 10% (v/v) de ACN / 0,1% (v/v) de TFA Fase móvel B: 10% (v/v) de H2O / 90% (v/v) de ACN / 0,1% (v/v) de TFA Taxa de fluxo: 2 mL/min Temperatura da coluna: 80 °C Detecção: 210 nm Volume de injeção: 5 μL Temperatura da amostra: aproximadamente 5 °C Tempo de operação: 6 minutos Gradiente:

Método de MFI

[00108] Todas as amostras de estabilidade foram testadas usando- se um instrumento de imageamento de microfluxo "Protein Simple" ("Protein Simple Micro-Flow Imaging") (MFI), modelo DPA 4200 com uma célula de fluxo de 100 μm padrão (1,6 mm, SP3 com revestimento de silano, cat# 4002-002-001) e uma objetiva 5x. A versão do software para MFI View System Software foi 2-R2.6.2.21.2171. A configuração do instrumento e as características selecionadas inclu-íam: Rejeição de partículas com aresta - selecionado Partículas de carga - selecionado (exceto T0) Volume de amostra: 0,5 mL Volume de purga: 0,15 mL Volume aproximado de amostra: 0,30 mL (calculado auto-maticamente)

[00109] No dia do teste, ou três (teste único) ou quatro (teste em duplicata) seringas para cada condição foram reunidas em tubos Nunc individuais de 15 mL (Catálogo # 339651). Todo o trabalho foi realizado em uma câmara de fluxo laminar e amostras de MFI foram testadas na forma não diluída.

[00110] As sequências operacionais consistiam em examinar brancos de água antes de cada amostra e padrão para certificar-se de que os níveis de referência das partículas corretos (tipicamente abaixo de 600 partículas/mL ou menos de 1% de partículas da amostra/mL). Jatos de água de 30 mL ou mais foram usados entre amostras diferentes e entre amostras e padrões antes de serem medidos os níveis de partícula de referência (brancos). Se os brancos não fossem aceitáveis, jatos adicionais eram esguichados e um outro branco era examinado. Jatos de água de 10 mL foram usados entre amostras replicadas e padrões replicados para remover adequadamente do sistema as bolhas de ar e reduzir as partículas. Água Millipore Direct-Q tipo 1 foi usada para os brancos e os jatos (0,22 μm filtrada, qualidade 18,2 MQ). Bicos Neptune Barrier de 1000 μl foram usados para transportar a amostra até o orifício de entrada de amostras.

[00111] Cada sequência de amostras continha um número NIST (National Institute of Standard and Technology) de padrões de partículas de 5,0 μm certificados contendo 3000 partículas/mL maiores ou iguais a 3 μm de tamanho (Cat# CC05, Lote 39588, Exp. Julho 2012) para determinar a reprodutibilidade durante o ciclo. O desempenho dos padrões está listado na Tabela 3.Tabela 3. Resumo da análise de padrões de partículas NIST por MFI

[00112] O tamanho das partículas individuais foi dei terminado usan- do-se a técnica de medição "Protein Simples" conhecida como Diâmetro Circular Equivalente (ECD). O ECD de um objeto é expresso em microns e representa o diâmetro de uma esfera que ocupa a mesma área superficial bidimensional que a partícula. A plataforma de produto do MFI converte a área de um objeto em um valor de ECD usando técnicas de conversão patenteadas para evitar o erro inerente à realização de cálculos diretos baseados no campo de visão. As técnicas de conversão baseiam-se em um mapeamento de toda a faixa de tamanho instrumento usando glóbulos de poliestireno traçáveis NIST. Embora a conversão baseie-se em glóbulos de poliestireno, a alegação dos fornecedores é que a operação única da plataforma de produtos de MFI garantirá que os resultados obtidos a partir do instrumento são insensíveis às propriedades do material das partículas. Assim sendo, o instrumento não requer calibração contra tipos de amostras específicas para operar de forma apropriada.

Método Colorimétrico

[00113] A cor das amostras foi analisada usando-se um procedimento de teste tradicional. O valor da cor para cada amostra está registrado na definição de cores da Farmacopeia Europeia (EP) (Tabela 4). Um exemplo, B1 para B9 é a escala de cor marrom definida na Farmacopeia Europeia. Tabela 4. Faixa de cor para a Farmacopeia Europeia

Teste de Fotoestabilidade

[00114] Seringas contendo cada uma das quatro formulações F1 a F4 descritas na Tabela 16 foram submetidas ao teste de fotoestabili- dade. Ao todo, doze seringas (três para cada formulação) foram colocadas sobre a superfície de uma caixa coberta com papel de impressão branco 8,89 cm (3,5 polegadas) abaixo da fonte de luz. As seringas foram colocadas em ordem numérica da seguinte maneira (1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4) a cerca de 2,54 cm (1 polegada) de distância. As seringas das extremidades (1 e 4) estavam, cada uma delas, a 12,7 cm (5 polegadas) das extremidades da lâmpada.

[00115] As fontes de luz eram duas lâmpadas fluorescentes brancas frias (GE Ecolux F20T12-CW-ECO, 20W cada) e duas lâmpadas fluorescentes perto do UV com distribuições espectrais de 320 a 400 nm, 20W cada. O tempo de exposição à temperatura ambiente foi 14 dias para as lâmpadas fluorescentes brancas frias e 88 horas as lâmpadas perto do UV.

Estudos de Agitação

[00116] Três seringas para cada uma das diferentes formulações a serem testadas foram retiradas das condições de refrigeração e reunidas em tubos cônicos Nunc de 15 mL e individualmente presos à plataforma de um agitador orbital Thermo Scientific MaxQ 2000 e agitados a 150 rpm por 24 horas em condições de luz e temperatura ambientes.

Estudos de Ciclos de Congelamento-Descongelamento (F/T

[00117] Seringas para cada uma das diferentes formulações a serem testadas foram retiradas das condições de refrigeração e reunidas em tubos cônicos Nunc de 15 mL. As amostras reunidas foram então submetidas a 5 ciclos de congelamento (-20°C) e descongelamento (usando água à temperatura ambiente).

ESTUDO I: Primeiro crivo de formulações líquidas

[00118] Um crivo inicial de formulações para uma formulação líquida de MOR6654B foi montado testado por exemplo diferentes tampões, estabilizantes, excipientes e valores do pH. Algumas formulações também foram investigadas a título de encontrar a seleção da embalagem primária e a título de descobrir a estabilidade da formulação líquida de MOR6654B nos diferentes tipos de PFS (seringas pré- carregadas).

Preparação das amostras

[00119] As formulações foram produzidas com a substância medi-camentosa (MOR6654B) obtida a partir de uma linhagem celular CHO expressando o anticorpo monoclonal afucosilado superconcentrado a 160 g/L em água. A substância medicamentosa MOR6654B foi misturada com uma quantidade apropriada de uma solução diluída de exci- pientes, filtrada estéril, introduzida assepticamente em PFS de 1 mL estéreis (0.7 mL volume de preenchimento) ou em frascos de vidro de 6 mL (3.6 mL volume de preenchimento) e tampados com tampas Daikyo D21-7S V10-F7-3WRS RB2-TR lyo. Todas as formulações testadas continham 100 g/L de MOR6654B. Tabela 5: Lista de formulações, primeiro crivo de formulações líquidas de MOR6654B (100 g/L) PP (acondicionamento primário); HPbCD (hidroxipropil-b-ciclodextrina)

Resultados Tabela de resultados para cromatografia de exclusão de tamanho (SEC-HPLC) Tabela 6 Pureza por SEC amostras em estresse de congelamento descongelamento

Tabela 7. Pureza por SEC amostras em estresse de agitação

Tabela 8. Pureza por SEC amostras em estresse térmico (40°C)

Tabela 9: Pureza por SEC para t0, e estabilidade das amostras a 5°C

Tabela 10: Pureza por SEC para t0, e estabilidade das amostras a 25°C

Tabela 11: Variantes de carga por CEX amostras em estresse de con-gelamento descongelamento

Tabela 12: Variantes de carga por CEX amostras em estresse de agi-tação

Tabela 13: Variantes de carga por CEX amostras em estresse térmico (40°C)

Tabela 14: Variantes de carga por CEX para t0, e estabilidade das amostras a 5°C

Tabela 15: Variantes de carga por CEX para t0, e estabilidade das amostras a 25°C

Resumo dos resultados, primeiro crivo das formulações líquidas

[00120] Dezesseis formulações do anticorpo monoclonal, MOR6654B, foram colocadas m estabilidade por até seis meses a 5°C e 25°C. Além disso, as mesmas formulações foram submetidas a estresse de agitação, repetidos ciclos de F/T e estresse térmico (1 mês a 40°C). Uma grande variedade de métodos de análise biofísica e bioquímica foi usada para determinar se havia diferenças entre as formulações em termos de estabilidade. Os dados de SEC apontaram para uma diferença em estabilidade entre as formulações testadas. Nas amostras com estresse de agitação, a formulação 5 (pH 7 sem tensoa- tivo) mostrou um aumento maior em produtos de agregação, compro- vando o efeito benéfico do polissorbato. Um aumento mais severo em produtos de agregação foi registrado sob estresse de congelamento descongelamento nas formulações com manitol e cloreto de sódio.

[00121] O resultado deste primeiro estudo pode ser resumido da seguinte maneira: O pH preferido é 6.0. O estabilizante não iônico testado, trealose, é benéfico para a estabilidade da formulação. Polissor- bato 20 é benéfico para a estabilidade da formulação prevenindo a formação de agregados.

ESTUDO II: Segundo crivo de formulações líquidas Formulação de anticorpos anti-BAFFR

[00122] Três formulações (F1, F2, e F3) de MOR6654B com uma alta concentração de anticorpos de 150 mg/mL e uma formulação com uma concentração de anticorpos mais baixa de 20 mg/mL (F4) foram avaliadas quanto à estabilidade. As quatro formulações F1, F2, F3 e F4 foram introduzidas em uma seringa de vidro siliconizado de 1.0 mL e incluíam tampão, açúcar, tensoativo e aminoácido livre como mostrado na Tabela 16.Tabela 16: Composição de formulações experimentais

[00123] Amostras de cada formulação foram preparadas e testadas quanto à estabilidade em três temperaturas diferentes. As quatro for-mulações líquidas foram colocadas em condições experimentais de armazenamento e testadas quanto à estabilidade subsequente a ar- mazenamento a 2°C a 8°C nos instantes 0 (t0), e por 2 meses (t2) 25°C nos instantes 0 (t0) e por 2 meses (t2) 40°C nos instantes 0 (t0), 1 (t1) e por 2 meses (t2)

[00124] Além do armazenamento a várias temperaturas, as formulações foram submetidas a inúmeras condições de estresse, tais como exposição prolongada à luz, agitação e múltiplos ciclos de congela- mento-descongelamento (F/T). Cada amostra foi analisada por vários métodos.

Resultados e discussão, segundo crivo das formulações

[00125] Todas as quatro formulações foram testadas ao mesmo tempo, dependendo da condição de estresse. No instante zero (t0), as medições foram feitas em duplicata, assim como as medições feitas depois de dois meses (t2). Todas as outras amostras só foram analisadas com um único espécime. Os resultados mais relevantes estão apresentados abaixo.

Nefelometria

[00126] Nefelometria é um método turbidométrico para detectar a presença de agregados solúveis ou indicar opalescência. O resultado está listado em termos de unidades de turvação nefelométrica (NTUs). Tabela 17: Unidades de turvação nefelométrica (NTUs) ) para formu-lações de MOR6654B armazenadas a 40°C por até dois meses.

[00127] Os resultados de nefelometria mostram que a proteína é bastante estável fisicamente, sem alteração aparente menos depois de dois meses a 40°C.

[00128] Não surpreendentemente, o armazenamento a temperaturas mais baixas tampouco produziu qualquer alteração significativa nos níveis de NTU para qualquer das formulações (Tabela 18). Por quê a formulação 3 exibe um número mais alto de NTUs não está claro.Tabela 18: Unidades de turvação nefelométrica (NTUs) ) para formu-lações de MOR6654B armazenadas a 4°C ou 25°C por dois meses.

Tabela 19: Unidades de turvação nefelométrica (NTUs) ) para formu-lações de MOR6654B submetidas a estresse de agitação (agit), múltiplos ciclos de F/T (F/T), e exposição prolongada à luz (foto).

[00129] Finalmente, nefelometria das amostras submetidas a condições de estresse, tais como agitação, múltiplos ciclos de F/T, e exposição prolongada à luz revelou apenas pequenas alterações em qualquer uma das formulações para qualquer uma das condições de estresse. Por exemplo, a formulação 1 mostrou um aumento de cerca de 1,5 NTU ao ser agitada e aproximadamente 1 NTU ao estresse de F/T. A título de comparação, o aumento na formulação 2 foi menor que 1 NTU para qualquer condição de estresse. Da mesma forma, a formulação 4 de concentração mais baixa, que também contém sacarose, mostra um leve aumento de cerca de 1 NTU ao ser agitada.

Medições por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)

[00130] Três tipos de análises por HPLC foram feitas para estas amostras, começando com a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Há uma nítida perda de monômero medida por SEC para as amostras armazenadas a 40°C por um ou dois meses (Tabela 20).Tabela 20: Pureza (em termos de percentagem de monômeros) por SEC-HPLC para amostras de MOR6654B armazenadas a 40°C por até dois meses.

[00131] Há uma perda de cerca de 7% a 8% de monômero medida por SEC para as amostras armazenadas a 40°C por um ou dois meses.Tabela 21: Pureza (em termos de percentagem de monômeros) por SEC-HPLC SEC para amostras de MOR6654B armazenadas a 4°C e 25°C por dois meses.

[00132] Para as amostras armazenadas a uma temperatura mais baixa, não houve perda de monômero a 4°C e somente uma pequena perda de aproximadamente 1% a 25°C. Quando levando em consideração os efeitos das condições de estresse, houve uma pequena redução em todas as formulações ao serem agitadas e passarem por ciclos de F/T, mas nenhuma diferença real entre as formulações. Com a fotólise, também houve uma pequena redução no teor de monôme- ros. Mais uma vez, as diferenças entre as formulações não são facilmente aparentes.Tabela 22: Unidades de turvação nefelométrica (NTUs) para formulações de MOR6654B submetidas a estresse de agitação (agit), múltiplos ciclos de F/T (F/T), e exposição prolongada à luz (foto).

[00133] Embora um exame do teor de monômeros totais seja útil, pode ser mais útil considerar o perfil geral de estabilidade. As tabelas a seguir foram preparadas resumindo a percentagem de cada pico observado em cada sítio. A título de conveniência, os picos estão ordenados por seu tempo de retenção relativa (RRTs) para eliminar leves variações nos tempos de operação.Tabela 23. Perfil geral de estabilidade medido por SEC para amostras de MOR6654B armazenadas a 40°C por até dois meses.

[00134] Não houve picos de agregados de alto peso molecular de-tectados em t0 (Tabela 23), e apenas três impurezas encontradas, in-cluindo no pico em RRT 0.88, que é presumivelmente um oligômero de algum tipo. Com o armazenamento a 40°C por um mês ou dois meses, ocorre uma redução substancial no teor de monômero, com a maioria dos produtos de degradação eluindo depois do pico principal (Tabela 23). Isto indica que a fragmentação é mais problemática que a agregação para essas formulações.

[00135] Para as amostras aquecidas a 25°C por dois meses, houve muito pouca perda de monômero (< 1%) (Tabela 24). Isto sugere que a energia de ativação aparente para a rota de degradação primária é bastante alta, o que seria consistente com degradação hidrolítica. Os mesmos dois picos de fragmentação são vistos em RRT 1,07 e 1,22, com o pico em 1,07 sendo um pouco maior em todas as amostras. De fato, a RRT 1,22 é tão pequena nas formulações 1 e 2, que elas não foram integradas nas partidas. Por outro lado, há apenas as menores diferenças entre as formulações armazenadas a 25°C quando analisadas por SEC. Tabela 24. Perfil geral de estabilidade medido por SEC para amostras de MOR6654B armazenadas a 25°C por dois meses.

[00136] Para as amostras armazenadas a 4°C por dois meses, não há virtualmente nenhuma perda em monômero vista por SEC em qualquer dos sítios (Tabelas 23). As quantidades de oligômero são praticamente idênticas para todas as formulações.

[00137] Quando as diferentes condições de estresse são examinadas (agitação, F/T, e teste de fotoestabilidade), pouca degradação é vista por SEC. Agitação não parece causar qualquer degradação química apreciável e leves aumentos nos níveis de oligômero, assim como ocorre com repetidos ciclos de F/T. Todas as formulações têm aproximadamente o mesmo desempenho. Com a exposição à luz, as análises por SEC indicam níveis de fragmentação mais altos para a formulação 3 (Tabela 26).Tabela 25. Perfil geral de estabilidade medido por SEC para amostras de MOR6654B armazenadas a 4°C por dois meses.

Tabela 26. Perfil geral de estabilidade medido por SEC para formulações de MOR6654B submetidas a estresse de agitação (agit), múlti-plos ciclos de F/T (f/t), e exposição prolongada à luz (foto).

RP HPLC

[00138] RP HPLC oferece informações sobre a degradação química que pode estar ocorrendo na proteína.

[00139] Como degradação química parece ocorrer em MOR6654B, a análise por RP HPLC poderia oferece muitas informações.

[00140] Em t0, todas as quatro formulações têm um pureza perto de 99,9% por RP HPLC.

[00141] Depois de um mês armazenamento a 40°C, a pureza diminui para aproximadamente 96%, embora a pureza tenha sido acentua- damente mais alta para a formulação 4. A disparidade desses valores coloca em questionamento se este valor está correto (Tabela 27).

[00142] Em dois meses, todas as quatro formulações haviam dimi- nuído para cerca de 94%, com poucas, quando houve, diferenças entre as formulações.Tabela 27: Pureza de formulações de MOR6654B determinada por RP HPLC depois de armazenamento a 40°C por até dois meses

Tabela 28. Pureza de formulações de MOR6654B determinada por RP HPLC depois de armazenamento a 4°C ou 25°C por dois meses

[00143] O armazenamento a 25°C por dois meses produz uma diminuição na pureza por RP HPLC para ~96,5 % (Tabela 28). A pureza para as amostras armazenadas a 4°C não foi diferente, com purezas próximas a 97%. Mais uma vez, todas as quatro formulações tiveram desempenho similar.

[00144] Ao serem submetidas a condições de estresse, a pureza também diminui. Para os estudos de agitação e de F/T, a pureza foi de cerca de 97 a 98% para todas as formulações. No entanto, com a exposição à luz ocorre uma extensão de degradação maior. As formulações a 150 mg/mL diminuem para cerca de 94% ao passo que a formulação a 20 mg/mL diminui até <90%.Tabela 29. Pureza determinada por RP HPLC de formulações de MOR6654B submetidas a estresse de agitação (agit), múltiplos ciclos de F/T (F/T), e exposição prolongada à luz (foto).

[00145] Assim como com SEC, é útil examinar o aspecto dos produtos de degradação bem como considerar a perda no pico principal. Para as amostras armazenadas a 40°C, o perfil de degradação está resumido na Tabela 30. Somente uma impureza foi vista em t0, mas várias espécies foram observadas com o armazenamento à temperatura elevada. Parece que a pureza relativamente alta vista para a formulação 4 em t1 deveu-se simplesmente a não ter se observado o pico em RRT 1,19 (Tabela 30). No geral, houve muito pouca diferença entre qualquer uma das quatro formulações em relação ao perfil de estabilidade geral medido por RP HPLC.Tabela 30. Perfil de degradação de formulações de MOR6654B de-terminado por RP HPLC depois de armazenamento a 40°C por um mês (negrito) e dois meses (itálico)

[00146] Para as amostras armazenadas a 25°C, há dois produtos de degradação primários que eluem depois do pico principal (Tabela 31). O perfil de estabilidade para todas as quatro formulações é essencialmente o mesmo a 25°C quando analisado por RP HPLC. Da mesma forma, há um perfil de degradação similar para as amostras armazenadas a 4°C (Tabela 32).Tabela 31. Perfil de degradação de formulações de MOR6654B de-terminado por RP HPLC depois de armazenamento a 25°C por t0 e dois meses

Tabela 32. Perfil de degradação de formulações de MOR6654B determinado por RP HPLC depois de armazenamento a 4C por até dois meses

[00147] Quando as amostras são submetidas à agitação, aparece apenas um produto de degradação e os níveis são semelhantes em todas as amostras (Tabela 33). A formulação 4 parece ligeiramente menos estável que as outras três, possivelmente devido à mais mais baixa de proteínas. Repetidos ciclos de F/T também causa um dano um tanto modesto segundo observado por RP HPLC, com o perfil similar àquele visto para agitação. Isto foi visto repetidamente durante o estudo, indicando que a sensibilidade interfacial desta proteína pode vista quando feito um teste ou o outro. Não parece ser necessário conduzir ambos para avaliar a sensibilidade geral ao estresse interfacial. Finalmente, a exposição à luz engrada algumas espécies de elui- ção prematuras, que provavelmente são fragmentos. Das quatro for-mulações, os níveis dessas espécies foram mais altos para a formulação 3 (Tabela 33). Tabela 33. Perfil de degradação determinado por RP HPLC de formulações de MOR6654B submetidas a estresse de agitação (agit), múltiplos ciclos de F/T (F/T), e exposição prolongada à luz (foto).

Cromatografia de troca catiônica (CEX HPLC)

[00148] O terceiro método de HPLC para avaliar a estabilidade das quatro formulações de MOR6654B é cromatografia de troca catiônica (CEX). Este método destina-se a identificar produtos de degradação que diferem em termos de carga do composto parental. Inicialmente, todas as quatro formulações apresentam um pico principal largo que compreende cerca de 98% da área de pico total (Tabela 34). Com o armazenamento a 40°C por um mês, a principal diminui para cerca de 96%, com a formulação 4 tendo uma pureza ligeiramente mais alta (Tabela 34). Depois de dois meses a 40°C, esta diminuiu ainda para cerca de 95%, com a formulação 1 mostrando a pureza mais alta.Tabela 34. Pureza determinada por CEX HPLC das formulações de MOR6654B depois de armazenamento a 40°C por até dois meses

Tabela 35. Pureza determinada por CEX HPLC das formulações de MOR6654B depois de armazenamento a 4C e 25C por dois meses

[00149] Para formulações de MOR6654B armazenadas por dois meses a 25°C, a pureza diminui de > 98% para ~97%, com a formulação 4 sendo ligeiramente, mas apenas ligeiramente, mais estável (Tabela 35). Quando armazenadas a 4°C pelo mesmo período de tempo,ocorre um pouco de perda na pureza, semelhante àquela que foi ob-servada com os dados de RP HPLC. Mais uma vez, não está claro porque aproximadamente tanta degradação nas amostras a 4°C como nas amostras a 25°C, mas a extensão de degradação é pequena e todas as formulações de MOR6654B comportam-se aproximadamente da mesma maneira.Tabela 36. Pureza determinada por CEX HPLC das formulações de MOR6654B submetidas a estresse de agitação (agit), múltiplos ciclos de F/T (F/T), e exposição prolongada à luz (foto).

[00150] Com a agitação de repetidos ciclos de F/T, ocorre alguma perda com base em CEX HPLC, com todas as quatro formulações tendo o mesmo desempenho (Tabela 36). Exposição prolongada à luz produziu muito pouco dano por CEX HPLC, ao contrário do que havia sido observado com SEC e RP HPLC (Tabelas 26 e 29, respectivamente). Isto sugere que os produtos de degradação gerados por luz não diferem em termos de carga do composto parental.

Eletroforese capilar redutora (rCE-SDS)

[00151] O método de eletroforese capilar permite aqui verificar a extensão do dano causado à cadeia leve (LC) e à cadeia pesada (HC) do anticorpo de forma independente. Além disso, ele também pode oferecer uma estimativa de quanto da proteína não é LC e HC intactas, conforme indicado pelo teor de não LC/HC. Em t0, há aproximadamente 25% de LC e 70% de HC por área de pico, sem correção para as diferenças de tamanho (Tabela 37), o restante (~5 %) sendo con-tado como espécies não LC/HC (Tabela 38).Tabela 37. Percentagem de LC e HC determinada por rCE-SDS em formulações de MOR6654B armazenadas a 40°C por até dois meses

[00152] Depois de armazenamento por um mês a 40°C, as quantidades relativas de LC e HC foram alteradas, com LC respondendo agora por ~27% e HC entre62 e 68 % (Tabela 37). Isto indica que HC está sendo perdido. Isto reflete-se em um aumento acentuado na quantidade de espécies não LC/HC (Tabela 38), em que essas quantidades praticamente dobraram em relação aos níveis de pré- armazenamento.Tabela 38. Percentagem de espécies não LC/HC determinada por rCE-SDS em formulações de MOR6654B armazenadas a 40°C por até dois meses

[00153] Ao final de dois meses, há cerca de 10% (ou mais) das espécies não LC/HC. Estes dados sugerem que a formulação 4 é a mais robusta, com o menor aumento percentual nos níveis de não LC/HC.Tabela 39. Percentagem de LC e HC determinada por rCE-SDS em formulações de MOR6654B armazenadas a 4°C por dois meses

[00154] Quando as amostras são armazenadas a 4°C, ainda há alguma degradação vista por rCE-SDS, já que os níveis de LC aumentam de ~25% para ~27% (Tabela 39). Neste caso, a formulação 2 é a mais estável com pouco aumento nas quantidades das espécies não LC/HC.Tabela 40. Percentagem de LC e HC determinada por rCE-SDS em formulações de MOR6654B armazenadas a 25°C por dois meses

[00155] Quando armazenadas a 25°C por dois meses, houve um aumento equiparável em LC e uma diminuição no teor de HC (Tabela 40). Os níveis de espécies não LC/HC aumentou, mas praticamente tanto quanto para as amostras a 40°C. Destas, a formulação 3 parece ter a estabilidade mais pobre, mas as diferenças são pequenas.Tabela 41. Percentagem de LC e HC determinado por rCE-SDS em formulações de MOR6654B submetidas a estresse de agitação (agit), múltiplos ciclos de F/T (F/T), e exposição prolongada à luz (foto).

[00156] O conjunto final de amostras a serem analisadas por rCE- SDS foi daquelas submetidas a três condições de estresse diferentes (Tabela 41). Quando as amostras são agitadas ou expostas a ciclos de F/T, não ocorre aumento apreciável nas espécies não LC/HC para nenhuma das quatro formulações de MOR6654B. Isto é consistente com os outros achados, de que o MOR6654B nessas formulações não é muito sensível a estresse interfacial. Também reforça a ideia de que esses dois testes oferecem avaliações equiparáveis de estabilidade interfacial. Exposição prolongada à luz resultou em alguma perda de HC e em aumento nos níveis de LC/HC (Tabela 41). Destas formulações, a formulação 4 mostrou as maiores alterações.

Imageamento de microfluxo (MFI)

[00157] Nestes últimos tem havido uma maior atenção nos níveis de partículas visíveis em produtos proteicos injetáveis. Como resultado, foram desenvolvidos vários métodos de análise diferentes. Um dos mais amplamente conhecidos é o imageamento de microfluxo (MFI). Esta técnica foi usada para medir o teor de partículas subvisíveis (em termos de partículas por mL) em diferentes intervalos de tamanhos. Embora tenham sido coletados dados até 100 um em termos de tamanho, apenas os dados até 25 um estão apresentados. A reprodutibili- dade dos dados de MFI é muito boa. O desvio padrão relativo médio para medidas em duplicata é de cerca de 5%.Tabela 42. Teor subvisível (em partículas/mL) medido usando MFI para formulações de MOR6654B armazenada a 40°C por um mês (em negrito) e dois meses (em itálico). As amostras em t1 não foram anali-sadas em duplicata. De resto, os valores reportados são médias ± um desvio padrão.

[00158] Com frequência, os dados resumidos para MFI reportam apenas a contagem de partículas totais (em partículas por mL), mas esta pode ser uma ilusão, já que os números são dominados por partículas sendo contadas no intervalo de tamanhos de 1 a 2 um. Neste intervalo de tamanhos, o óleo de silicone e as bolhas de ar são proeminentes, e destorcem a contagem das partículas à base de proteínas. Embora esses números sejam apresentados, é melhor olhar para as partículas maiores que 2 um, possivelmente maiores que 5 um de ta- manho. Também, para amostras apresentando médias e desvios padrão, estes são os resultados de partidas em duplicata.

[00159] Quando armazenadas a 40°C, a contagem de partículas subvisíveis aumenta para todas as formulações (Tabela 42). Digna de nota particular é a formulação 4, em que a contagem de partículas totais é menor que 5000 partículas por mL em t0, muito mais baixa que para as outras formulações de concentração mais alta. Depois de um mês, todas as formulações agora ultrapassam 20000 partículas por mL, embora o aumento para a formulação 3 seja bastante pequeno (Tabela 42). Em dois meses, somente a formulação 2 tem menos de 30000 partículas por mL. A diferença é ainda mais gritante para partículas de 2 a 5 um (em que esta formulação contém menos de 5000 partículas por mL) e 5-10 um, em que os níveis são mais baixos que 1000 partículas por mL, com somente a formulação 1 estando perto em termos da quantidade total de partículas subvisíveis presentes.Tabela 43. Teor subvisível (em partículas/mL) medido usando MFI para formulações de MOR6654B armazenadas a 25°C por dois meses (em negrito). Os valores reportados são médias ± um desvio padrão.

[00160] Quando amostra de MOR6654B são armazenadas a 25°C por dois meses, ocorre um aumento nas partículas subvisíveis em todas as formulações, embora o aumento na formulação 1 seja muito pequeno (Tabela 43). Para a formulação 1, ocorre apenas um aumento modesto nas partículas de 5 a 10 um de tamanho. Fora isso, virtualmente não ocorrem alterações. Entrementes, ocorre um aumento considerável em todas as outras formulações, especialmente no intervalo de 2 a 25 um. Em particular, as formulações 3 e 4 mostram aumentos significativos na maioria dos depósitos de intervalos de tamanho.

[00161] Para formulações de MOR6654B armazenadas a 4°C por dois meses houve pouca alteração nos níveis de partículas subvisí- veis. A formulação 1 mostra apenas um pequeno aumento nas partículas de 5 a 10 mm, com uma leve redução em todos os outros intervalos de tamanho. A formulação 2 mostra apenas pequenos aumentos nos diferentes intervalos de tamanho, ao passo que a formulação 3 apresenta pequenas reduções nos níveis de todas as partículas. A título de comparação, a formulação 4, que começou com uma carga de partículas subvisíveis muito baixo (mal acima aquela de água pura), mostra um aumento significativo na partícula por mL em todos os intervalos de tamanho.

[00162] Quando as formulações de MOR6654B são submetidas às condições de estresse de agitação, ciclos de F/T e exposição à luz, ocorrem grandes aumentos somente para as amostras de fotoestabili- dade. (Tabela 44). Tanto a agitação como os ciclos de F/T causam somente aumentos pequenos a modestos nos níveis de partículas, es-pecialmente se ignorarmos as partículas abaixo de 2 um. Por outro lado, exposição prolongada à luz faz com que a formação de partícu- las subvisíveis aumente consideravelmente (Tabela 44). Isto é particu-larmente verdade para as formulações 3 e 4. A título de comparação, a formulação 1 praticamente não mostra alteração na carga das partículas subvisíveis como um todo. Tabela 44. Teor subvisível (em partículas/mL) medido usando MFI para formulações de MOR6654B submetidas a estresse de agitação (em negrito), múltiplos ciclos de F/T (em itálico), e exposição prolongada à luz (sublinhado). Os valores reportados para t0 são médias ± um desvio padrão.

Colorimetria

[00163] O último método de análise que foi usado neste estudo estabilidade foi colorimetria. Em t0, todas as quatro formulações apresentaram um cor marrom (Tabela 45), com uma intensidade levemente diferente para a formulação mais diluída (formulação 4). Incubação a 40°C por um ou dois meses levou à pouca alteração na cor, embora a formulação 4 mostre apenas pequenas alterações (Tabela 45). Quando armazenadas a temperaturas mais baixas houve pouca, se alguma, alteração na cor (Tabela 46). Quando submetidas a qualquer uma das condições de estresse, a cor também permaneceu a mesma (Tabela 47).Tabela 45. Cor das formulações de MOR6654B armazenadas a 40°C por até dois meses

Tabela 46. Cor das formulações de MOR6654B armazenadas a 4°C e 25°C por zero e dois meses

Tabela 47. Cor das formulações de MOR6654B su bmetidas a esl resse de agitação (agit), múltiplos ciclos de F/T (F/T), e exposição prolongada à luz (foto).

Resumo

[00164] Uma ampla variedade de métodos de análise biofísica e bioquímica foi usada para determinar se havia diferenças entre as formulações em termos de estabilidade. Entre as formulações selecionadas para o segundo crivo, pouca diferença foi vista usando muitas das técnicas de análise. Somente armazenamento a 40°C e exposição prolongada à luz causou alguma quantidade significativa de degradação. Embora todas as quatro formulações fossem muito semelhantes em termos de seu perfil de estabilidade, a formulação 1 (150 mg/mL de MOR6654B, 220mM de sacarose, 20 mM de histidina, 0,04% de polis- sorbato 20, pH 6.0) mostrou a mínima propensão a degradar completamente segundo determinado por esta bateria de métodos analíticos. A formulação 1 foi mais estável em condições de estresse térmico e luminoso, menos tendente à degradação e também foi mais estável em termos de formação de partículas na faixa subvisível.

Claims (6)

1. Composição aquosa, caracterizada pelo fato de que possui um pH de 6,0 e compreende: (i) um anticorpo anti-BAFFR não fucosilado, em que o anticorpo tem uma concentração de 150 mg/mL e em que o referido anticorpo anti-BAFFR compreende uma região de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e uma região de cadeia leve de SEQ ID NO: 10, (ii) 220 mM de sacarose como um estabilizador, (iii) 20 mM de histidina como agente tamponante, e (iv) 20 a 0,04% de polissorbato como surfactante.

2. Dispositivo de administração, caracterizado pelo fato de que compreende a composição aquosa de acordo com a reivindicação 1.

3. Seringa pré-carregada, caracterizada pelo fato de que compreende a composição aquosa de acordo com a reivindicação 1.

4. Composição aquosa de acordo com a reivindicação 1, ou o dispositivo de administração de acordo com a reivindicação 2, ou a seringa pré-cheia de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença autoimune.

5. Composição aquosa de acordo com a reivindicação 1, ou o dispositivo de administração de acordo com a reivindicação 2, ou a seringa pré-cheia de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um neoplasma de células B, tal como linfoma, leucemia ou mieloma.

6. Composição aquosa, de acordo com a reivindicação 1, ou dispositivo de administração, de acordo com a reivindicação 2, ou seringa pré-cheia, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, hepatite crônica ativa ou pênfigo vulgaris.