CN104363920B - 抗体制剂 - Google Patents

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Abstract

抗BAFFR抗体配制成液体制剂，其包含高浓度的抗体活性成分用于向患者递送抗体而没有高水平的抗体聚集。水性药物组合物可包含糖、缓冲剂、表面活性剂和/或游离氨基酸中的一种或多种。

Description

抗体制剂
技术领域
本发明涉及针对BAFFR(BAFF受体)的抗体的药物制剂，用于制备它的方法和该制剂的应用。
背景
BAFFR：BAFF对对于参与过渡B细胞的成熟，对于成熟B细胞的生存和活化，以及对于响应于T细胞依赖性抗原的同种型类别转换都是至关重要的。BAFF及其受体BAFFR对于恶性B细胞的生存和生长也很重要。此外，BAFFR通常在前B细胞上不表达，但最近表明，在人ALL(B-系急性淋巴细胞白血病)细胞上表达(Parameswaran，2010，Cancer Res.70(11)4346-4356)。罹患自身免疫性病症或癌症的患者由过量BAFF水平介导的自身反应性B细胞的去除和不适当的存活/活化的阻断代表了充分验证的治疗目标。因此，抗BAFFR抗体，特别是能够有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和阻断结合BAFFR的配体的抗体可提供对自身免疫性疾病和B细胞瘤的有效治疗剂。
针对BAFFR的抗体从例如WO2010/007082中获知并包括表征为包含具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的VH结构域和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VL结构域的抗体。抗体MOR6654是一种这样的抗体(IgG1κ)。它具有SEQ ID NO：9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：10的轻链氨基酸序列。这一抗体可由SEQ ID NO：14和15来表达，优选在缺少岩藻糖基转移酶的宿主细胞中，例如在具有失活的FUT8(-/-)基因的哺乳动物细胞系中，以提供具有增强的ADCC的功能性的非岩藻糖基化抗BAFFR抗体。这种抗体在下文中被称为MOR6654B。生产非岩藻糖基化抗体的替代方法是本领域已知的。
治疗性抗体通常被配制成或者是水性形式以备肠胃外给药用或者是作为冻干物以在给药前与合适的稀释剂重构。
国际申请PCT/EP2011/072248公开了冻干物，其可以重构以得到具有高浓度的抗体活性成分和低水平的抗体聚集的溶液用于递送至患者。高浓度的抗体因为它们减少了必须被递送给患者的给药体积而是有用的。减少的给药体积将向患者递送固定剂量所花费的时间减至最低。
然而，配制成含有高浓度抗体的药物组合物可能具有短的贮存期限并且所配制的抗体可能会在储存期间由于化学和物理不稳定性而失去生物活性。其中，已知聚集、脱酰胺和氧化是抗体降解的最常见的原因。另外，聚集可以潜在地导致患者增加的免疫反应，从而导致安全性问题。因此，必须使在药物组合物中的抗体聚集最小化或防止它。
因此，本发明的目的是提供进一步的以及改良的药物组合物，其包含抗BAFFR抗体，配制以例如允许没有或基本上没有抗体聚集的高浓度的抗BAFFR抗体。
本发明的另一个目的是提供一种适合皮下给药的抗BAFFR抗体制剂。皮下注射的优点在于，它允许医生以对患者相当短的干预执行它。此外，可以训练患者自己执行皮下注射。
这一目标通过本发明的药物水性组合物得以满足。
本发明的水性组合物包含高浓度的抗BAFFR抗体，但没有或基本没有聚集的抗体，因而尤其适合皮下给药。
在一个实施方案中，本发明涉及一种具有pH为5.0-7.0的水性组合物，并且包含
(i)抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有18-165mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)稳定剂，
(iii)缓冲剂，
(iv)表面活性剂，和任选地，
(v)氨基酸。
特别是，本发明提供了一种具有pH为5.5-6.5的水性组合物，并且包含
(i)抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有18-165mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)蔗糖、海藻糖或甘露醇作为稳定剂，
(iii)组氨酸、柠檬酸盐或琥珀酸盐作为缓冲剂，
(iv)聚山梨酯20、泊洛沙姆188或羟丙基-β-环糊精作为表面活性剂，和任选地，
(v)精氨酸作为氨基酸。
在一个实施方案中，如本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物包含浓度在20mg/mL和150mg/mL之间，尤其是在80mg/mL和150mg/mL之间，尤其是在100mg/mL和150mg/mL之间的抗BAFFR抗体。
在一个实施方案中，如本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物包含糖作为稳定剂，尤其是蔗糖、甘露醇或海藻糖，其浓度在80mM和300mM之间，尤其是在120mM和270mM之间，尤其是在120mM和220mM之间。
在一个实施方案中，如本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物包含表面活性剂，尤其是聚山梨酯20或泊洛沙姆188，其浓度在0.01％和-0.1％之间，尤其是在0.02％和0.06％之间。
在一个实施方案中，如本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物包含缓冲剂，尤其是组氨酸、柠檬酸盐或琥珀酸盐，其浓度在5mM和50mM之间，尤其是浓度在15mM和25mM之间，尤其是在18mM和22mM之间，尤其是20mM。
在一个实施方案中，如本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物另外包含氨基酸，尤其是精氨酸或精氨酸-HCl，其浓度在2mM和80mM之间。
在一个实施方案中，如本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物包含浓度在110mM和250mM之间的蔗糖或海藻糖。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了具有pH为5.5-6.5的水性组合物，并且包含
(i)抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有18mg/mL-165mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)80mM-300mM蔗糖、海藻糖或甘露醇作为稳定剂，
(iii)5mM-50mM组氨酸、柠檬酸盐或琥珀酸盐作为缓冲剂，
(iv)0.01％-0.1％聚山梨酯20或泊洛沙姆188，或者1mM-3mM羟丙基-β-环糊精作为表面活性剂，和任选地，
(v)2mM-80mM精氨酸，尤其是精氨酸-HCl。
在另一具体实施方案中，本发明提供了具有pH为5.5-6.5的水性组合物，并且包含
(i)抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有20mg/mL-150mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)110mM-250mM蔗糖或海藻糖作为稳定剂，
(iii)15mM-25mM组氨酸、柠檬酸盐或琥珀酸盐作为缓冲剂，
(iv)高达0.02％-0.06％聚山梨酯20或泊洛沙姆188或者2mM-3mM羟丙基-β-环糊精作为表面活性剂，和任选地，
(v)2mM-80mM精氨酸，尤其是精氨酸-HCl。
在又另一个具体的实施方案中，本发明提供了具有pH为5.5-6.5的水性组合物，并且包含
(i)抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有20mg/mL-150mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)120mM-220mM蔗糖或海藻糖作为稳定剂，
(iii)18mM-22mM组氨酸、柠檬酸盐或琥珀酸盐作为缓冲剂，
(iv)高达0.02％-0.06％聚山梨酯20或泊洛沙姆188或者2，5mM羟丙基-β-环糊精作为表面活性剂，和任选地
(v)2mM-80mM精氨酸，尤其是精氨酸-HCl。
在另一具体实施方案中，本发明提供了具有pH为6.0的水性组合物，并且包含
(i)抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有150mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)220mM蔗糖作为稳定剂，
(iii)20mM组氨酸作为缓冲剂，
(iv)0.04％聚山梨酯20作为表面活性剂。
在另一具体实施方案中，本发明提供了一种具有pH为6.0的水性组合物，并且包含
(i)抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有150mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)220mM海藻糖作为稳定剂，
(iii)20mM组氨酸作为缓冲剂，
(iv)0.04％聚山梨酯20作为表面活性剂。
在另一具体实施方案中，本发明提供了具有pH为6.0的水性组合物，并且包含
(i)抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有150mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)120mM蔗糖或海藻糖作为稳定剂，
(iii)20mM组氨酸作为缓冲剂，
(iv)0.04％聚山梨酯20作为表面活性剂，和
(v)50mM精氨酸，尤其是精氨酸-HCl。
在另一具体实施方案中，本发明提供了具有pH为6.0的水性组合物，并且包含
(i)抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有20mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)220mM蔗糖或海藻糖作为稳定剂，
(iii)20mM组氨酸作为缓冲剂，和
(iv)0.04％聚山梨酯20作为表面活性剂。
在一个实施方案中，本发明涉及如本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物，其中抗BAFFR抗体包含具有氨基酸SEQ ID NO：1的VH结构域和具有氨基酸SEQ ID NO：2的VL结构域。
在本发明的另一个实施方案中，如本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物，其中，抗BAFFR抗体包含SEQ ID NO：9的重链区和SEQ ID NO：10的轻链区。
在一个实施方案中，抗BAFFR抗体是非岩藻糖基化的抗BAFFR抗体。
本发明还提供一种递送装置，包含本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物。
这一递送装置可以以包含本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物的预填装注射器形式提供。
在一个实施方案中，本发明涉及一种向哺乳动物递送抗BAFFR抗体的方法，包括给予所述哺乳动物如本文在各实施方案所描述的本发明的水性组合物的步骤，尤其是以诸如预填装注射器的递送装置的形式。
本发明进一步提供了如本文在各实施方案所描述的本发明的组合物或递送装置，或预填装注射器，用于治疗由BAFF受体介导或可以通过杀死或消耗B细胞而治疗的疾病或病症。
具体地，如本文在各实施方案所描述的本发明的药物组合物或递送装置，或预填装注射器可用于治疗自身免疫疾病，B细胞瘤例如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，干燥综合征或寻常性天疱疮。
本发明至少部分地是基于，诸如MOR6654和MOR6654B的配制抗体的特性，其当以高浓度配制成液体(水性)组合物时保留显著的稳定性和生物活性特性。
如本文所使用的，“水性”药物组合物是适合于药物用途的组合物，其中水性载体是蒸馏水。适合于药物用途的组合物可以是无菌的、均质的和/或等渗的。水性药物组合物可直接制备成水性形式，例如即用式预填装注射器(“液体制剂”)，或者作为冻干物在即将使用前重构。
如本文所使用的，术语“水性药物组合物”指液体制剂或重构的冻干制剂。在某些实施方案中，本发明的水性药物组合物适合于肠胃外给药于人受试者。在一个具体的实施方案中，本发明的水性药物组合物适合于皮下给药。
如本文所使用的，短语“肠胃外给药”意指肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射以及输注。
抗体作为药物的有效成分的应用现在很广泛，包括产品HERCEPTINTM(曲妥单抗)，RITUXANTM(利妥昔单抗)，SYNAGISTM(帕利珠单抗)等。用于将治疗性抗体纯化至药用级的技术是本领域公知的。
该组合物通常将是无热原的，例如每剂量含＜1EU(内毒素单位，标准量度)，并优选每剂量＜0.1EU。该组合物优选是无谷蛋白的。
在具体的实施方案中，本发明的水性药物组合物展现出低至检测不到的水平的抗体聚集或降解，在制造、制备、运输和长期储存过程中极少甚至是没有生物活性损失，抗BAFFR抗体的浓度是至少约50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL或300mg/mL。
在一个方面，本发明涉及具有高浓度的抗BAFFR抗体的水性药物组合物。
本领域已知这样的高浓度水性药物组合物可以在注射前进行稀释，例如，如果特定的治疗性干预需要较低的抗体浓度或者当治疗包括儿童的较小体重患者时。适合的浓度可以是25mg/mL或10mg/mL。可选地，可以以这样的低浓度生产原始制剂。
如本文中使用的，术语“抗体”包括完整的抗体及其任意的抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。天然存在的“抗体”是包含由二硫键相互连接的至少2条重链(H)和2条轻链(L)的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个或四个结构域，取决于同种型：CH1、CH2、CH3和CH4。每条轻链包含轻链可变区(本文中简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。可以将VH和VL进一步细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其散布着更保守的、称作构架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)指保留了与抗原(例如，BAFFR的一部分)特异性结合能力的全长抗体或抗体的一个或多个片段。已显示可以通过全长抗体的片段执行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括Fab片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段、包含通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，1989Nature341：544-546)；和分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以用重组方法通过合成接头连接，所述接头使得它们成为一条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，1988Science 242：423-426和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此类单链抗体还意在被术语抗体的“抗原结合区域”涵盖。使用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。
本文所用的“分离的抗体”指抗体，其基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体，例如，特异结合人BAFFR的分离的抗体基本上无特异结合不同于BAFFR的抗原的抗体。然而，特异结合BAFFR的分离的抗体可以与其他抗原具有交叉反应性，如来自其他物种的BAFFR分子。此外，分离的抗体可以基本上无其他细胞物质和/或化学品。
本文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单分子组合物的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一的结合特异性和亲和力。
本文中使用的术语“人抗体”包括具有这样的可变区的抗体，所述可变区的构架和CDR区都源自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自此类人序列，例如，人种系序列或人种系序列的突变版本，或者含有源自人构架序列分析的共同构架序列的抗体，例如如Knappik等人(2000.J Mol Biol 296，57-86)中描述的。
可以使用普遍已知的编号方案定义免疫球蛋白可变结构域(例如CDR)的结构和位置，例如Kabat编号方案、Chothia编号方案、Kabat和Chothia的组合(AbM)等(参见例如，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health andHuman SerVices(1991)，编著Kabat等人；Al Lazikani等人，(1997)J.Mol.Bio.273：927948)。
贯穿本说明书中，互补决定区(“CDR”)根据Kabat定义来限定，只是除了CDRH1，CDRH1是用于这一CDR的由Kabat和Chothia定义的组合所限定的氨基酸段。
本发明的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。然而，如本文所用的，术语“人抗体”不意在包括这样的抗体，其中来自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被嫁接到人构架序列上。
术语“人单克隆抗体”指显示出单结合特异性的抗体，所述抗体具有的可变区中的构架区和CDR区都来自人序列。
本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从对于人免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤中分离的抗体，从被转化而表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如，从转染瘤分离的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和通过涉及将人免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接成其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区来自人种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施方案中，此类重组人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管来自并且涉及人种系VH和VL序列，但是可以不天然在体内存在于人抗体种系所有组成成分。
本文所用的“同种型”指重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgM、IgA、IgD、IgE和IgG如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
本文所用的“特异性结合BAFFR多肽”的抗体或“抗-BAFFR抗体”是指以100nM或更低、10nM或更低、1nM或更低的KD结合SEQ ID NO：13的人BAFFR多肽的抗体。“与不同于BAFFR的抗原交叉反应”的抗体是指以0.5x 10-8M或更小、5x 10-9M或更小，或2x 10-9M或更小的KD结合该抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体意指以1.5x 10-8M或更大的KD，或以5-10x 10-8M或1x 10-7M或更大的KD与该抗原结合的抗体。在一些实施方案中，不与抗原交叉反应的此类抗体在标准结合测定中显示出对于这些蛋白质的基本上检测不到的结合。
在一个实施方案中，在本发明的水性药物组合物中的高浓度的抗BAFFR抗体为至少50mg/mL。在一个实施方案中，高浓度为至少100mg/mL。在一个实施方案中，高浓度为至少150mg/mL。在一个实施方案中，高浓度为至少200mg/mL。在一个实施方案中，高浓度为至少250mg/mL。在一个实施方案中，高浓度为至少270mg/mL。在一个实施方案中，高浓度为至少300mg/mL。
在一个实施方案中，本发明的水性药物组合物包含50mg/mL和300mg/mL之间的抗BAFFR抗体，例如MOR6654，尤其是MOR6654B。
在一个实施方案中，本发明的水性药物组合物包含75mg/mL和270mg/mL之间的抗BAFFR抗体，例如MOR6654，尤其是MOR6654B。
在一个实施方案中，本发明的水性药物组合物包含100mg/mL和250mg/mL之间的抗BAFFR抗体，例如MOR6654，尤其MOR6654B。
在一个实施方案中，本发明的水性药物组合物包含100mg/mL和200mg/mL之间的抗BAFFR抗体，例如MOR6654，尤其是MOR6654B。
在一个实施方案中，本发明的水性药物组合物包含150mg/mL的抗BAFFR抗体，例如MOR6654，尤其是MOR6654B。
在一个实施方案中，本发明的水性药物组合物包含20mg/mL的抗BAFFR抗体，例如MOR6654，尤其是MOR6654B。
在一个实施方案中，本发明的水性药物组合物包含约50mg/mL，约60mg/mL，约70mg/mL，约80mg/mL，约90mg/mL，约100mg/mL，约110mg/mL，约120mg/mL，约130mg/mL，约140mg/mL，约150mg/mL，约160mg/mL，约170mg/mL，约180mg/mL，约190mg/mL，约200mg/mL，约210mg/mL，约220mg/mL，约230mg/mL，约240mg/mL，约250mg/mL，约270mg/mL或约300mg/ml的抗BAFFR抗体，例如MOR6654，尤其是MOR6654B。
此外，根据如本文在各实施方案所描述的本发明的水性药物组合物是稳定的，从而即使在2-8℃储存4周后，通过SEC-HPLC测量，总的抗BAFFR抗体的小于5％、4％、3％、2％、1％、0.05％或0.01％聚集。
根据如本文在各实施方案所描述的本发明的水性药物组合物是稳定的，从而即使在2-8℃储存2个月后，通过SEC-HPLC测量，总抗BAFFR抗体的小于5％、4％、3％、2％、1％、0.05％或0.01％聚集。
所述水性药物组合物除了抗BAFFR抗体外，可包含另外的组分如下述一种或多种：(i)稳定剂；(ii)缓冲剂；(iii)表面活性剂；及(iv)游离氨基酸。包括每种这样的附加组分可以使得组合物具有抗BAFFR抗体的低聚集。
用于本发明的合适的稳定剂可以作用为，例如，粘度增强剂、填充剂、增溶剂和/或等等。该稳定剂可以是离子型或非离子型(例如，糖)。对于糖，它们包括但不限于，单糖，例如果糖，麦芽糖，半乳糖，葡萄糖，D-甘露糖，山梨糖等；二糖，例如乳糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖等；多糖，如棉子糖，松三糖，麦芽糖糊精，葡聚糖，淀粉等；和糖醇，如甘露醇，木糖醇，麦芽糖醇，乳糖醇，木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)等。例如，所述糖可以是蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖、山梨糖醇或甘露醇。所述糖可以是糖醇或氨基糖。蔗糖尤其有用。对于离子稳定剂，它们包括盐，如NaCl或氨基酸组分如精氨酸-HCl。
用于本发明的合适的缓冲剂包括但不限于，有机酸盐，如柠檬酸，抗坏血酸，葡糖酸，碳酸，酒石酸，琥珀酸，乙酸或苯二甲酸的盐；Tris，thomethamine盐酸盐，或磷酸盐缓冲液。此外，氨基酸组分也可以用作缓冲剂。这样的氨基酸组分包括但不限于甘氨酸和组氨酸。组氨酸缓冲液尤其有用。
所述水性药物组合物包括这样的缓冲剂或pH调节剂以提供改进的pH控制。在一个实施方案中，本发明的水性药物组合物具有在5.0和8.0之间、5.0和7.0之间、5.5和7.0之间，或5.5和6.5之间的pH。在一个具体的实施方案中，本发明的水性药物组合物具有约6.0的pH。
如本文所使用的，术语“表面活性剂”是指具有两亲结构的有机物质；即，它们由相反的溶解性倾向的基团所组成，通常是油溶性的烃链和水溶性的离子基团。取决于表面活性部分的电荷，可以将表面活性剂分类成阴离子活性剂、阳离子活性剂和分散剂用于各种药物组合物和生物材料制剂。
用于本发明的合适的表面活性剂包括，但不限于，非离子表面活性剂、离子表面活性剂和两性离子表面活性剂。典型的用于本发明的表面活性剂包括，但不限于，失水山梨糖醇脂肪酸酯(例如：失水山梨糖醇单辛酸酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯)，失水山梨糖醇三油酸酯、甘油脂肪酸酯(如甘油单辛酸酯，甘油单肉豆蔻酸酯，甘油单硬脂酸酯)，聚甘油脂肪酸酯(例如十甘油单硬脂酸酯，十甘油二硬脂酸酯，十甘油单亚油酸酯)，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(如聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇单硬脂酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇单棕榈酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇三油酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇三硬脂酸酯)，聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸，聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯)，聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯)，聚乙二醇脂肪酸酯(例如聚乙二醇二硬脂酸酯)，聚氧乙烯烷基醚(如聚氧乙烯月桂基醚)，聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(如聚氧乙烯聚氧丙烯二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚，聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚)，聚氧乙烯烷基苯基醚(如聚氧乙烯壬基苯基醚)，聚氧乙烯氢化蓖麻油(例如，聚氧乙烯蓖麻油，聚氧乙烯氢化蓖麻油)，聚氧乙烯蜂蜡衍生物(如聚氧乙烯山梨醇蜂蜡)，聚氧乙烯羊毛脂衍生物(例如，聚氧乙烯羊毛脂)，以及聚氧乙烯脂肪酸酰胺(例如，聚氧乙烯硬脂酸酰胺)；C10-C18烷基硫酸盐(例如，十六烷基硫酸钠，月桂基硫酸钠，油基硫酸钠)，聚氧乙烯C10-C18烷基醚硫酸盐，添加了平均2-4摩尔的环氧乙烷单元(例如，聚氧乙烯月桂基硫酸钠)，和C1-C18烷磺基琥珀酸酯盐(如十二烷基磺基琥珀酸酯钠)；和天然表面活性剂如卵磷脂，甘油磷脂，神经鞘磷脂(sphingophospholipid)(例如鞘磷脂)，和C12-Ci8脂肪酸的蔗糖酯。组合物可包括这些表面活性剂中的一种或多种。优选的表面活性剂是聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯如聚山梨酯20、40、60或80。聚山梨酯20(Tween 20)尤其有用。
用于本发明的合适的游离氨基酸包括但不限于，精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。优选的是包括碱性氨基酸即精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。如果组合物包括组氨酸，则这可作为缓冲剂和游离氨基酸两者作用，但是，当使用组氨酸缓冲液时，典型是包括非组氨酸游离氨基酸，例如包括组氨酸缓冲液和赖氨酸。氨基酸可以以其D-和/或L-型存在，但典型是L-型。氨基酸可以任何合适的盐存在，例如盐酸盐，如精氨酸-HCl。
其他考虑的可在本发明的水性药物组合物中利用的赋形剂包括，例如，调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质如磷脂或脂肪酸、甾类如胆固醇、蛋白质赋形剂如血清白蛋白(人血清白蛋白)，重组人白蛋白，明胶，酪蛋白、成盐相反离子如钠等等。这些和另外已知的药物赋形剂和/或适用于本发明制剂的添加剂本领域公知的，例如，列出于“The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等人编，AmericanPharmaceuticals Association(2003)；和Remington：the Science and Practice ofPharmacy，第21版，Gennaro编，Lippincott Williams &Wilkins(2005)”。
本发明的水性药物组合物除了抗BAFFR抗体外可包含另外的活性成分。进一步的药理学活性剂剂可包括，例如，化学治疗化合物。
靶疾病和病症
本发明的包含抗BAFFR抗体的本发明的水性药物组合物可以用于治疗、改善或预防多种疾病或病症。包含抗BAFFR抗体的药物组合物尤其可用于治疗BAFFR相关的病症如自身免疫性病症，例如，系统性红斑狼疮、干燥综合征、寻常性天疱疮、类风湿关节炎、多发性硬化和B细胞瘤，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)和B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
如本文所使用的，“BAFFR相关的病症”包括与异常的BLyS水平相关的或由其表征的病况和/或可以通过消耗或杀死B细胞来治疗的疾病或病况。这些包括但不限于，炎性病况、自身免疫性疾病、严重感染和器官或组织移植排斥。这些还包括B细胞瘤。
例如，包含抗BAFFR抗体的本发明的水性药物组合物可以用于治疗、改善或预防心脏、肺、心-肺结合、肝、肾、胰腺、皮肤或角膜移植的接受者，包括同种异体移植物排斥或异种移植排斥，以及用于预防移植物抗宿主病，如在骨髓移植后和器官移植相关的动脉硬化。此外，本发明的水性药物组合物对于实体器官移植和抗体介导的急性和慢性移植排斥是有用的。
本发明的包含抗BAFFR抗体的水性药物组合物可用于治疗、预防或改善自身免疫性疾病和炎性病况，特别是具有包括自身免疫组分的病因的炎性病况，如关节炎(例如类风湿性关节炎，慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)和变形性关节炎)和风湿性疾病，包括涉及骨损失的炎性病况和风湿性疾病，炎性疼痛，脊椎关节病(spondyioarhropathies)包括强直性脊椎炎，赖特综合征，反应性关节炎，银屑病关节炎，和enterophathics关节炎，超敏反应(包括呼吸道超敏反应和皮肤超敏反应)和变态反应。本发明的抗体可应用的特定的自身免疫疾病包括自身免疫性血液学病症(包括例如溶血性贫血，再生障碍性贫血，纯红细胞性贫血和特发性血小板减少)，获得性血友病A，冷凝集素疾病，冷球蛋白血症，血栓性血小板减少性紫癜，干燥综合征，系统性红斑狼疮，炎性肌肉病症，多发性软骨炎，硬皮病，脉管炎如冷球蛋白血症，大血管血管炎，如巨细胞动脉炎，风湿性多肌痛，坏死性血管炎，包括抗嗜中性白细胞胞质抗体相关性脉管炎，Takayasu’s动脉炎，结节性多动脉炎，Henoch-Schonlein紫癜，和丘-斯综合征，IgM介导的神经病，血清阴性spondarthritis，斜视眼阵挛-肌阵挛综合征，韦格纳肉芽肿病，皮肌炎，抗嗜中性白细胞胞质自身抗体(ANCA)脉管炎，慢性活动性肝炎，重症肌无力，银屑病，Steven-Johnson综合征，寻常性天疱疮，落叶型天疱疮，特发性口炎性腹泻，自身免疫性炎性肠病(包括如溃疡性结肠炎，克罗恩病和肠易激综合症)，内分泌性眼病，格雷夫斯病，结节病，多发性硬化，视神经脊髓炎，原发性胆汁性肝硬化，幼年型糖尿病(I型糖尿病)，眼色素层炎(前、中和后以及全葡萄膜炎)，干燥性角膜结膜炎和春季角结膜炎，肺间质纤维化，银屑病关节炎和肾小球肾炎(伴有和不伴有肾病综合征，例如包括特发性肾病综合征或微小病变肾病)，急性肾炎狼疮，肿瘤，皮肤和角膜的炎性疾病，肌炎，骨植入物松动，代谢性病症，如动脉粥样硬化，糖尿病和血脂异常。
本发明的水性药物组合物也可用于预防、改善或治疗B细胞瘤。这样的疾病和病况的实例包括但不限于，B细胞非霍奇金淋巴瘤，如小淋巴细胞淋巴瘤，lymphoplasmacytoid淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤，滤泡型淋巴瘤，粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤，弥漫型大细胞淋巴瘤，和伯基特淋巴瘤；急性淋巴细胞白血病(ALL)，前体B成淋巴细胞性白血病；B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)和多发性骨髓瘤。其它的B细胞瘤涵盖在本发明的范围内。
患者给药
本发明的药物组合物可以给予患者。给药通常是通过输注或通过注射器。因此，本发明提供了一种递送装置(例如注射器)，其包括本发明的药物组合物(例如，预填装注射器)。患者将接受有效量的抗BAFFR抗体作为主要活性成分，即足以治疗、改善或预防目的疾病或病症的量。治疗效果也可包括减少生理症状。用于任何特定受试者的抗体的最佳有效量和浓度将取决于多种因素，包括患者的年龄、体重(size)、健康和/或性别，病况的性质和程度，特定抗体的活性，身体对其清除率，并且也包括与所述抗体组合给予的任何可能的其它治疗。对于给定情况所递送的有效量可以在临床医师的判断范围内来确定。对于本发明的目的来说，有效剂量可为约0.005mg/kg至约50mg/kg，或约0.05mg/kg至约10mg/kg。已知的基于抗体的药物在这方面提供了指导，例如HERCEPTINTM以4mg/kg体重的初始负荷剂量给予以及2mg/kg体重的每周维持剂量；RITUXANTM每周以375mg/m2给予；SYNAGISTM以15mg/kg体重肌内给予；等等。
本发明提供了向哺乳动物递送单克隆抗体的方法，包括向患者给予本发明的药物组合物的步骤。
本发明还提供了如本文在各实施方案所描述的本发明的制剂，用作药物，例如，用于向哺乳动物递送抗体，或用于治疗、预防或改善上述疾病和病症中的一种或多种。
哺乳动物优选是人，但也可以是，例如，马或牛或狗或猫。这些抗体将理想被选择以匹配目标物种例如用于人类给药的人抗体，用于马的马抗体，用于狗的犬抗体等。如果天然宿主抗体是不可获得的，则可以通过来自供体抗体的CDR残基(通常，还有一个或多个框架残基)向来自宿主物种的接受者框架的转移来实现从一个物种到另一个的抗体特异性转移，例如以人源化。马的、牛的、犬科动物的和猫科动物的抗体是本领域已知的。抗体将结合来自目标物种的BAFFR，但它也可与来自其他物种的BAFFR交叉反应。
剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。
用于形成本发明的组合物的成分可以密闭容器提供。
抗BAFFR抗体
本发明涉及抗BAFFR抗体并且更具体地MOR6654和MOR6654B的制剂。
可包括在本发明的药物组合物中的一种合适的抗体是人重组抗体MOR6654，在结构上，其特征如下面进一步描述。这样的分离的抗BAFFR抗体的VH氨基酸序列示出于SEQ IDNO：1。这样的分离的抗BAFFR抗体的VL氨基酸序列示出于SEQ ID NO：2。这样的分离的抗BAFFR抗体的全长重链氨基酸序列的实例示出于SEQ ID NO：9。这样的分离的抗BAFFR抗体的全长轻链氨基酸序列的实例示出于SEQ ID NO：10。这样的分离的抗BAFFR抗体的重链和轻链氨基酸序列的另一实例是分别由SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的核苷酸序列编码的那些。抗体的重链和轻链氨基酸序列的另一实例是由质粒pBW510中所含的相应DNA序列所编码的那些，质粒pBW510由Novartis Pharma AG，Forum 1，CH-4002Basel，Switzerland，于2009年4月29日保藏于DSMZ，Inhoffenstrasse 7B，38124Braunschweig，德国，保藏编号是DSM22542。
可以用于制备本发明的药物组合物的其他抗BAFFR抗体包括抗BAFFR抗体，其氨基酸已经通过氨基酸缺失、插入或取代发生突变，但在上述的重链或者轻链区具有不超过1、2、3、4或5个氨基酸缺失、插入或取代。在具体的实施方案中，这样的氨基酸改变似乎仅在框架区和/或恒定区出现并且CDR区与SEQ ID NO：3，4和5的重链CDR1，CDR2和CDR3以及与SEQID NO：6，7和8的轻链CDR1，CDR2和CDR3区分别是100％相同的。在一个更具体的实施方案中，已作出的改变是仅在CDR区外的保守氨基酸取代。
保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的那些。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。因此，抗BAFFR抗体的CDR区外的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以测试改变的抗体的保留功能，特别是与BAFFR相同的结合特性。
抗体一般可以被糖基化。连接于重链的CH2结构域的N-连接的聚糖，例如，可以影响C1q和FcR结合，并且无糖基化的抗体可对这些受体具有较低的或不同的亲和力。聚糖结构也可以影响活性例如可以根据在聚糖的双触角链的末端的半乳糖的糖数量(0、1或2)看出补体介导的细胞死亡的差异。抗体的聚糖优选在给药后不会导致人免疫原性应答。
另外或可选地，抗体可以制备成具有改变类型的糖基化，例如具有减少量的或没有岩藻糖基残基的低岩藻糖基化(hypofucosylated)或非岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。此类改变的糖基化模式已显示出提高抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)能力。此种碳水化合物修饰可以通过，例如，在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体而实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域已经进行过描述并且可以用作表达本发明的重组抗体的宿主细胞，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP1,176,195描述了具有功能被破坏的编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因的细胞系，使得在这样的细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化或者是缺乏岩藻糖基残基。因此，在一个实施方案中，包括在本发明的药物组合物中的抗BAFFR抗体是通过在展现出低岩藻糖基化或非岩藻糖基化模式的细胞系中重组表达而产生的，例如，具有编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因的缺陷表达的哺乳动物细胞系。
如本文所使用的，术语MOR6654涵盖任何类型的糖基化模式。在一个具体的实施方案中，药物组合物包括由展现出低岩藻糖基化或非岩藻糖基化模式的细胞系生产的MOR6654组成的抗BAFFR抗体，例如MOR6654B，其展现出非岩藻糖基化模式(缺乏岩藻糖基残基)。Presta的PCT公开文本WO03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖结合到Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields，R.L.等人，2002J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开文本WO99/54342描述了被改造为表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如，β(1，4)-N乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在该经改造的细胞系中表达的抗体展现出增加的二等分GlcNac结构，导致抗体的ADCC活性提高(也参见Umana等人，1999Nat.Biotech.17：176-180)。Eureka Therapeutics进一步描述了遗传改造的CHO哺乳动物细胞，其能产生缺乏岩藻糖基残基的具有改变的哺乳动物糖基化模式的抗体(http：//www.eurekainc.com/about_us/companyoverview.html)。或者，可以在被改造用于哺乳动物样糖基化模式并且能够产生缺乏岩藻糖作为糖基化模式的抗体的酵母或丝状真菌中生产抗BAFFR抗体(参见例如EP1297172B1)。
本发明所考虑的本文中的抗BAFFR抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。抗体可以被聚乙二醇化，以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体聚乙二醇化，可在一个或多个PEG基团适合结合至抗体或抗体片段的条件下，通常将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物进行反应。聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。
如本文所使用的，术语“聚乙二醇”旨在涵盖任何已被用于衍生其他蛋白质的PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP 0154 316和Ishikawa等人的EP0401384。
抗BAFFR抗体(例如MOR6654)的任何其它天然或非天然的翻译后修饰被进一步意图作为可用于制备本发明的药物组合物的抗BAFFR抗体的具体实施方案。
抗体可以以不含与它们自然地相关联的产品的形式来制备。抗体的天然环境的污染物组分包括材料，如酶、激素或其他宿主细胞蛋白质。
实施例
制备抗BAFFR抗体
抗体MOR6654特异性结合BAFFR并且也描述于以WO2010/007082公开的国际申请。它是通过噬菌体展示获得的人IgG1κ抗体。其重链和轻链由SEQ ID NO：9和10组成。下表1和表2总结了MOR6654的序列特征。
表1：对在表2的序列表中列出的序列的简要说明
表2：序列表
制剂的实例
MOR6654B的高浓度液体制剂是希望的并因此进行了配制研究。包含糖、缓冲剂和表面活性剂的液体制剂是稳定的，并能保持高的抗体浓度。
抗体可在哺乳动物宿主细胞中生产，例如转染了在适合的表达启动子下，携带重链和轻链编码序列的表达载体的CHO细胞系。
抗体优选在哺乳动物细胞系中生产，例如通过使用，例如，PotelligentTM技术(BioWa的公司)进行修饰从而导致编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因缺陷表达的CHO细胞系。所得抗体是非岩藻糖基化的并且在本文中被称为MOR6654B。
在小瓶或预填装注射器中的液体MOR6654B制剂的研发由两项研究组成。进行第一次筛选以限定在所述制剂中的赋形剂。在第二次筛选中在最终的原始包装中确认所选的制剂。
稳定性和分析计划
进行下列分析方法：UV测定、尺寸排阻层析HPLC、动态光散射、阳离子交换层析HPLC、反相层析HPLC、ALP分析仪、浊度、pH值、重量渗透压摩尔浓度、MFI(微-流成像)、粘度、颜色、目视检查。
稳定性测定
在使所述制剂经受包括搅拌、冻融循环和长时间暴露于光(40℃，1个月)的一定胁迫条件后，进一步测定稳定性。
比浊法
通过比浊法测定浊度。
按照下列操作手册进行样品的浊度计测量(Model 2100AN Instrument Manual，Number：47901-88，Nov.2006，第2版)。在分析开始时，通过分析包括水的5个校准样品来检查仪器的校准曲线。如果由仪器测得的值均在标准值的5％范围内，那么校准曲线合格。如果有任何的标准没有通过5％的验收标准，那么按照操作手册重新校准仪器。在仪器通过校准后，将样品装载于11mm平底测试试管并进行分析。
尺寸排阻层析(SEC)法
在用于分析液体制剂的SEC法中，使用以下的方法参数：
柱：TSK凝胶G3000SWXL
分析缓冲液：150mM K-磷酸，pH 6.5+/-0.1
流速：0.4mL/min
柱温度：30℃
检测：210nm
注射体积：10μl
样品温度：约5℃
运行时间：40分钟
数据采样率：1.0点/秒(Chromeleon步骤＝1.0)
阳离子交换层析(CEX)HPLC法
使用CEX HPLC法分析样品的第一步是使用水将所有制剂稀释至10mg/mL。第二步骤是取10mg/mL经稀释的样品并用流动相A再次稀释至3mg/mL。然后将样品加载到HPLC并分析。
流动相A：25mM磷酸钠，pH 6.5
流动相B：25mM磷酸钠，250mM NaCl，pH 6.5
流速：1.0mL/min
柱温度：30℃+/-2℃
样品温度：5℃+/-2℃
注射体积：40μl
运行时间(min)：60
检测：215nm
梯度：
时间 ％A ％B
0 100 0
46 0 100
51 0 10
52 100 0
60 100 0
RP HPLC法
按照下面的RP方法参数进行用于分析LB-120样品的RP HPLC法。在测试方案中的梯度导致蛋白质躲避在柱空隙体积中。
方法参数
柱信息：Poroshell 300SB-C8
流动相A：90％(v/v)H2O/10％(v/v)ACN/0.1％(v/v)TFA
流动相B：10％(v/v)H2O/90％(v/v)ACN/0.1％(v/v)TFA
流速：2mL/min
柱温度：80℃
检测：210nm
注射体积：5μL
样品温度：约5℃
运行时间：6分钟
梯度：
时间 ％A ％B
0 90 10
5 75 25
5.1 90 10
6 90 10
MFI法
使用蛋白质简单微流成像(MFI)仪器，型号DPA4200，具有标准的100μm的流动池(1.6mm，具有硅烷涂层的SP3，目录#4002-002-001)和5倍物镜，测试所有样品的稳定性。MFIView System Software的软件版本是2-R2.6.2.21.2171。
仪器设置和所选特征包括：
边缘颗粒排斥-选择
填充颗粒-选择(除了T0)
样品体积：0.5mL
清洗体积：0.15mL
大约样品体积：0.30mL(自动计算)
在测试那天，将每种条件下三个(单一测试)或四个(一式两份测试)注射器合并到单独的15mL Nunc管(目录#339651)。所有工作都在层流通风厨中进行并且不经稀释就检测MFI样品。
运行顺序由在每一样品和标准前运行水空白组成，以确保颗粒的背景水平合乎情理(通常低于600颗粒/mL或少于1％的样品颗粒/mL)。测量背景颗粒水平(空白)之前，在不同的样品之间和样品与标准之间使用30mL或更多的冲水。如果空白是不可接受的，那么进行额外的冲洗并运行另一空白。在重复样品和重复标准之间使用10mL冲水以充分地清除系统的气泡并减少颗粒。使用Millipore Direct-Q 1型水用于空白和冲洗(0.22μm过滤，18.2MΩ质量)。Neptune Barrier 1000μl Tips用于将样品递送到样品入口。
每个样品顺序都包含许多NIST(国家标准和技术研究院)认证的5.0μm颗粒标准(其包含大小上大于或等于3μm 3000颗粒/mL(目录#CC05，批号39588，保质期2012年7月))以在运行过程中确定可再现性。该标准的性能列于表3中。
表3.使用MFI对NIST颗粒标准的分析总结
单个颗粒尺寸通过使用被称为等效圆直径(ECD)的蛋白质简单测量技术来确定。物体的ECD由微米表示并代表了与该球作为颗粒占据相同二维表面积的球的直径。MFI产品平台使用专有的转换技术将物体的面积转换成ECD值，以避免在执行基于视野的尺寸进行直接计算所固有的误差。转换技术是基于使用NIST可追踪的聚苯乙烯珠来绘图整个仪器的尺寸范围。虽然转换是基于聚苯乙烯珠，但供应商称MFI产品平台的特有操作将保证从仪器获得的结果对于颗粒材料的特性是不敏感的。因此，该仪器不需要为了正常操作而对特定的样品类型进行校准。
比色法
使用标准测试程序分析样品颜色。每种样品的颜色值按欧洲药典(EP)颜色定义记录(表4)。一个实例，B1至B9是按欧洲药典定义的褐色色度。
表4.欧洲药典的色范围
从 至 说明
Y7 Y1 黄色色度
B9 B1 褐色色度
BY7 BY1 褐色-黄色色度
GY7 GY1 绿色-黄色色度
R7 R1 红色色度
耐光性测试
将如表16中描述的含有四种制剂F1-F4每种的注射器进行耐光性测试。总体而言，在灯源下，将12个注射器(每种制剂三个)置于一个覆盖有3.5英寸的白色打印纸的表面上。将注射器按下面的数字顺序(1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4)放置，分开约1英寸。两端的注射器(1和4)各离开灯的端部5英寸。
光源是两个冷白色荧光灯(GE Ecolux F20T12-CW-ECO，各20W)和两个近UV荧光灯(光谱分布从320至400nm，各20W)。在环境温度下的暴露时间对于冷白荧光灯为14天而对于近UV灯为88小时。
搅拌研究
将待测试的不同制剂的各自三个注射器从冷冻条件拿出并且合并到15mL Nunc锥形管中并且单独地固定到Thermo Scientific MaxQ2000定轨摇床的平台上，在环境光和温度条件下，在150rpm下搅拌24小时。
冻融(F/T)循环研究
将待测试的不同制剂的各自注射器从冷冻条件拿出并且合并到15mL Nunc锥形管中。然后将合并的样品进行5个冷冻(-20℃)和融化(使用环境温度下的水)循环。
研究I：第一次液体制剂筛选
设定MOR6654B液体制剂的初始制剂筛选，测试例如不同的缓冲液、稳定剂、赋形剂和pH值。也调查了一些制剂以获得对于初级包装选择的经验和获得MOR6654B液体制剂在不同类型的PFS(预填装注射器)中的稳定性的经验。
样品的制备
所述制剂是使用从表达无岩藻糖基化的单克隆抗体的CHO细胞系得到的原料药(MOR6654B)在水中浓缩至160g/L而生产的。MOR6654B原料药与适量的赋形剂稀释液混合，无菌过滤，无菌填充到灭菌1mL PFS(0.7mL填充体积)或6mL玻璃小瓶(3.6mL填充体积)中并用Daikyo D21-7S V10-F7-3WRS RB2-TR lyo瓶塞堵塞。测试的所有制剂均为100g/L的MOR6654B。
表5：制剂列表，MOR6654B的第一次液体制剂筛选(100g/L)
PP(初级包装)；HPbCD(羟丙基-β-环糊精)
结果
尺寸排阻层析(SEC-HPLC)的结果的表格
表6：在冻融胁迫中，SEC样品的纯度
表7：在振荡胁迫中，SEC样品的纯度
表8：在热胁迫(40℃)中，SEC样品的纯度
表11：在冻融胁迫中，CEX样品的电荷变体
表12：在振荡胁迫中，CEX样品的电荷变体
表13：在热胁迫(40℃)中，CEX样品的电荷变体
表14：对于t0，通过CEX的电荷变体，以及在5℃的样品稳定性
表15：对于t0，通过CEX的电荷变体，以及在25℃的样品稳定性
结果总结，第一次液体制剂筛选
将单克隆抗体，MOR6654B的十六种制剂，在5℃和25℃下针对稳定性放置长达六个月。另外，将相同的制剂进行搅拌胁迫、重复F/T循环和热胁迫(40℃，1个月)。使用各种各样的生物物理和生物化学分析方法来确定制剂之间是否在稳定性方面存在差异。SEC数据指出了在所测试的制剂之间的稳定性差异。在振荡胁迫的样品中，制剂5(pH 7，没有表面活性剂)显示出聚集产物的更高增加，证明了聚山梨酯的有益效果。在甘露醇和氯化钠制剂的冻融胁迫中记录了聚集产物的更严重的增加。
该第一次研究的结果可以总结如下：优选的pH是6.0。所测试的非离子型稳定剂海藻糖对于制剂稳定性是有益的。聚山梨酯20防止形成聚集物而对于制剂的稳定性是有益的。
研究II：第二次液体制剂筛选
抗BAFFR抗体的制剂
对三种具有150mg/mL的高抗体浓度的MOR6654B的制剂(F1、F2和F3)和一种具有20mg/mL的低抗体浓度的制剂(F4)评价稳定性。将四种制剂F1、F2、F3和F4装入1.0mL硅化玻璃注射器中，并包括如表16所示的缓冲液、糖、表面活性剂和游离氨基酸。
表16：实验制剂的组成
MOR6654B 缓冲液 糖 表面活性剂 氨基酸
F1 150mg/mL 20mM组氨酸；6.0 220mM蔗糖 0.04％聚山梨酯20 -
F2 150mg/mL 20mM组氨酸；6.0 220mM海藻糖 0.04％聚山梨酯20 -
F3 150mg/mL 20mM组氨酸；6.0 120mM蔗糖 0.04％聚山梨酯20 50mM精氨酸-HCl
F4 20mg/mL 20mM组氨酸；6.0 220mM蔗糖 0.04％聚山梨酯20 -
制备每一制剂的样品并在三种不同温度下测试其稳定性。将四种液体制剂按以下条件储存后放置在实验储存条件下并测试稳定性
2℃-8℃，在时间点0(T0)，和2个月(t2)
25℃，在时间点0(T0)，和2个月(t2)
40℃，在时间点0(T0)，1个月(t1)和2个月(t2)
除了储存在不同温度下，制剂经受若干胁迫条件，如长时间暴露于光、搅拌和多个冻融(F/T)循环。使用多种方法分析每个样品。
结果与讨论，第二次制剂筛选
根据胁迫条件，同时测试所有四种制剂。在时间点零(t0)，一式两份测量，在两个月(t2)后进行同样测量。所有其它样品仅仅单一重复进行分析。更相关的结果报告如下。
比浊法
比浊法是一种用于检测可溶性聚集物的存在或指示乳光的浊度分析法。结果是以比浊法浊度单位(NTUs)列出的。
表17：对于储存在40℃达两个月的MOR6654B制剂的比浊法浊度单位(NTUs))
t0 40℃，1个月 40℃，2个月
F1 5.16/5.26 6.19 4.00/4.07
F2 4.63/4.39 4.99 4.12/3.95
F3 8.94/8.54 9.60 8.34/8.33
F4 3.54/3.63 4.39 3.40/3.39
比浊法结果表明，该蛋白质物理上相当稳定，甚至在40℃两个月后仍没有明显的变化。
并不令人惊讶的是，对于任何制剂，储存在较低温度下也不产生NTU水平的任何可观的变化(表18)。不清楚为何制剂3显示出较高NTU数。
表18：对于储存在4℃或25℃2个月的MOR6654B制剂的比浊法浊度单位(NTU)
t0 2-8℃，2个月 25℃，2个月
F1 5.16/5.26 4.56/4.48 4.10/3.65
F2 4.63/4.39 5.56/4.09 3.43/3.39
F3 8.94/8.54 8.11/7.95 9.57/8.55
F4 3.54/3.63 3.43/3.47 2.98/2.76
表19：对于经受搅拌胁迫(搅拌)、多个F/T循环(F/T)和长时间暴露于光(光)的MOR6654B制剂的比浊法浊度单位(NTU)
t0 搅拌 F/T 光
F1 5.16/5.26 6.72 6.28 4.02
F2 4.63/4.39 5.22 5.26 3.91
F3 8.94/8.54 9.58 9.18 8.59
F4 3.54/3.63 4.48 4.22 3.15
最后，经受胁迫条件下，如搅动、多个F/T循环以及长时间暴露于光的样品的比浊法揭示了对于任何胁迫条件，任何制剂只有很小的变化。例如，制剂1表明经搅拌增加约1.5NTU以及经F/T胁迫增加约1NTU。通过比较，制剂2对于每种胁迫条件的增加小于1NTU。同样地，也含有蔗糖的较低浓度的制剂4经搅拌显示约1NTU的略微上升。
高压液相层析(HPLC)测量
尺寸排阻层析(SEC)
对这些样品进行三种HPLC分析，从尺寸排阻层析(SEC)开始。对于在40℃下储存一个月或两个月的样品，通过SEC测量，单体明显减少(表20)。
表20：在40℃储存达两个月的MOR6654B样品通过SEC-HPLC的纯度(按单体百分数计)
t0 40℃，1个月 40℃，2个月
F1 99.74/99.78 92.71 92.08/92.27
F2 99.64/99.60 93.51 92.39/92.61
F3 99.77/99.76 93.26 92.43/92.32
F4 99.67/99.53 93.80 93.58/92.87
在40℃储存一个月或两个月的样品通过SEC测定，有约7％-8％的单体损失。
表21：在4℃和25℃储存两个月的MOR6654B样品通过SEC-HPLC SEC的纯度(按单体百分数计)
t0 2-8℃，2个月 25℃，2个月
F1 99.74/99.78 99.62/99.63 99.35/99.58
F2 99.64/99.60 99.61/99.59 99.50/99.35
F3 99.77/99.76 99.58/99.57 99.18/99.26
F4 99.67/99.53 99.60/99.57 99.26/99.42
对于储存在较低温度下的样品，在4℃没有单体损失，在25℃只有约1％的小量损失。当考虑胁迫条件的影响时，对于所有制剂，在搅拌和F/T循环时稍微下降，但在制剂之间没有真正的区别。在光解时，单体含量也有小量下降。同样，制剂之间的差别不是很明显。
表22：对于经受搅拌胁迫(搅拌)、多个F/T循环(F/T)和长时间暴露于光(光)的MOR6654B制剂的比浊法浊度单位(NTU)
t0 搅拌 F/T 光
F1 99.74/99.78 99.29 98.86 98.94
F2 99.64/99.60 99.04 98.96 98.86
F3 99.77/99.76 98.85 98.98 98.44
F4 99.67/99.53 99.01 98.93 98.68
尽管整体的单体含量的检测是有帮助的，但考虑整体稳定性曲线可能更为有用。准备了下表以汇总在每个点观察到的每个峰的百分比。为方便起见，通过峰的相对保留时间(RRT)对峰排序以去除运行时间的微小变化。
表23：在40℃储存达两个月的MOR6654B样品通过SEC测量的整体稳定性曲线
RRT
制剂 Rep 时间点 0.81 0.84 0.88 0.91 0.95 1.00 1.07 1.22 1.38 1.58
制剂1 1 0 0.13 99.74 0.04 0.09
2 0 0.14 99.78 0.03 0.04
制剂2 1 0 0.31 99.64 0.05
2 0 0.33 99.60 0.07
制剂3 1 0 0.17 99.78 0.05 0.05
2 0 0.19 99.77 0.05
制剂4 1 0 0.12 99.71 0.17
2 0 0.17 99.59 0.07 0.17
制剂1 1 1 1.12 92.85 5.35 0.68
制剂2 1 1 1.10 93.98 4.43 0.49
制剂3 1 1 0.90 0.07 93.61 4.84 0.58
制剂4 1 1 0.78 94.70 4.03 0.49
制剂1 1 2 0.16 0.18 92.08 6.40 1.18
2 2 0.17 0.21 92.27 6.31 1.05
制剂2 1 2 0.44 92.39 6.05 1.12
2 2 0.19 0.25 92.61 5.94 1.01
制剂3 1 2 0.14 0.20 92.43 6.27 0.96
2 2 0.17 0.19 92.32 6.27 1.05
制剂4 1 2 0.30 0.18 93.58 4.79 1.15
2 2 0.29 0.18 92.87 5.39 1.26
在t0(表23)未检测到高分子量聚集物的峰，并且只发现三种杂质，包括在RRT0.88的峰，这大概是某种类型的低聚物。在40℃储存1个月或两个月时，单体含量明显降低，大部分降解产物比主峰的洗脱晚(表23)。这表明，对于这些制剂，片段化比聚集更成问题。
对于在25℃下加热两个月的样品，单体损失很少(＜1％)(表24)。这表明，用于主要降解途径的表观活化能相当大，这与水解降解相一致。在RRT1.07和1.22看到相同的两个片段化的峰，其中所有样品中在1.07的峰大很多。事实上，RRT1.22在制剂1和2中非常小，以致于它们没有被整合到运行中。否则，当通过SEC测试时，在25℃储存的制剂之间只有最小的差异。
表24：在25℃储存达两个月的MOR6654B样品通过SEC测量的整体稳定性曲线
RRT
制剂 Rep 时间点 0.81 0.88 0.91 0.96 1.00 1.07 1.22 1.38 1.58
25C
制剂1 1 0 0.13 99.74 0.04 0.09
2 0 0.14 99.78 0.03 0.04
制剂2 1 0 0.31 99.64 0.05
2 0 0.33 99.60 0.07
制剂3 1 0 0.17 99.78 0.05 0.05
2 0 0.19 99.77 0.05
制剂4 1 0 0.12 99.71 0.17
2 0 0.17 99.59 0.07 0.17
制剂1 1 2 0.33 99.35 0.32
2 2 0.13 99.58 0.29
制剂2 1 2 0.29 99.50 0.21
2 2 0.34 99.35 0.31
制剂3 1 2 0.47 99.18 0.31 0.03
2 2 0.41 99.26 0.29 0.03
制剂4 1 2 0.40 99.26 0.33 0.01
2 2 0.35 99.42 0.21 0.02
对于在4℃储存两个月的样品，在任何点都没有通过SEC看到单体的可视化的损失(表23)。低聚物的量对于所有制剂几乎是相同的。
当检测不同胁迫条件(搅动、F/T和耐光性测试)时，通过SEC看见极小的降解。搅拌似乎没有造成可察觉的化学降解并且低聚物水平稍有增加，这在重复F/T循环中相同。所有制剂表现大致相同。当暴露于光时，SEC分析表明制剂3的较高的片段化水平(表26)。
表25：在4℃储存达两个月的MOR6654B样品通过SEC测量的整体稳定性曲线
RRT
制剂 Rep 时间点 0.81 0.84 0.88 0.91 1.00 1.07 1.22 1.38 1.58
4C
制剂1 1 0 0.13 99.74 0.04 0.09
2 0 0.14 99.78 0.03 0.04
制剂2 1 0 0.31 99.64 0.05
2 0 0.33 99.60 0.07
制剂3 1 0 0.17 99.78 0.05 0.05
2 0 0.19 99.77 0.05
制剂4 1 0 0.12 99.71 0.17
2 0 0.17 99.59 0.07 0.17
制剂1 1 2 0.32 99.62 0.06
2 2 0.32 99.63 0.05
制剂2 1 2 0.34 99.61 0.05
2 2 0.35 99.59 0.06
制剂3 1 2 0.35 99.58 0.07
2 2 0.36 99.57 0.07
制剂4 1 2 0.34 99.60 0.05
2 2 0.37 99.57 0.06
表26：对于经受搅拌胁迫(搅拌)、多个F/T循环(F/T)和长时间暴露于光(光)的MOR6654B制剂通过SEC测量的整体稳定性曲线
RRT
制剂 Rep 时间点 0.81 0.88 0.95 1.00 1.07 1.22 1.29 1.38 1.40 1.58
制剂1 1 0 0.13 99.74 0.04 0.09
2 0 0.14 99.78 0.03 0.04
制剂2 1 0 0.31 99.64 0.05
2 0 0.33 99.60 0.07
制剂3 1 0 0.17 99.78 0.05 0.05
2 0 0.19 99.77 0.05
制剂4 1 0 0.12 99.71 0.17
2 0 0.17 99.59 0.07 0.17
制剂1 1 搅拌 0.69 99.31
制剂2 1 搅拌 0.94 99.06
制剂3 1 搅拌 0.98 98.89 0.11 0.02
制剂4 1 搅拌 0.85 99.15
制剂1 1 F/T 0.94 98.85 0.20
2 F/T 0.94 98.91 0.15
制剂2 1 F/T 0.90 98.96 0.13
2 F/T 0.90 99.00 0.09
制剂3 1 F/T 0.92 98.99 0.09
2 F/T 0.92 98.99 0.09
制剂4 1 F/T 0.79 99.09 0.12
2 F/T 0.79 99.09 0.10
制剂1 1 光 0.77 98.94 0.25 0.04
2 光 0.80 98.92 0.25 0.04
制剂2 1 光 0.87 98.86 0.24 0.03
2 光 0.90 98.84 0.24 0.03
制剂3 1 光 0.61 0.26 98.44 0.09 0.57 0.03
2 光 0.62 0.25 98.49 0.10 0.52 0.02
制剂4 1 光 0.91 98.68 0.36 0.05
2 光 0.95 98.56 0.44 0.05
RP HPLC
RP HPLC提供蛋白质可能发生化学降解的信息。
由于MOR6654B似乎会发生化学降解，RP HPLC分析可能相当信息广泛。
在t0，通过RP HPLC测得所有四种制剂具有接近99.9％的纯度。
在40℃储存一个月后，纯度下降到约96％，但制剂4的纯度明显更高。这些值的差异令人怀疑这个值是否正确的问题(表27)。
在两个月时，所有四种制剂下降到约94％，制剂之间即使存在差异也很小。
表27：在40℃储存达两个月后，通过RP HPLC测定的MOR6654B制剂的纯度
表28：在4℃或25℃储存达两个月后，通过RP HPLC测定的MOR6654B制剂的纯度
在25℃储存两个月产生通过RP HPLC测得的纯度下降到～96.5％(表28)。在4℃储存的样品的纯度没有什么不同，纯度近97％。再次，所有四种制剂表现类似。
在经受胁迫条件下，纯度也降低。对于搅拌和F/T研究，所有制剂的纯度是约97-98％。然而，在暴露于光时，降解程度更高。150mg/mL的制剂减少到约94％，而20mg/mL制剂一路降低至＜90％。
表29：对于经受搅拌胁迫(搅拌)、多个F/T循环(F/T)和长时间暴露于光(光)的MOR6654B制剂通过RP HPLC测定的纯度
对于SEC，它有助于研究降解产品的外观，以及考虑主峰的损失。对于储存在40℃的样品，其降解曲线总结在表30中。在t0时只看到一种杂质，但在升高的温度储存时观察到多个种类。似乎在t1时对制剂4看到的相对高的纯度只是因为在RRT1.19没有看到峰(见表30)。总体而言，对于按照RP HPLC测量来绘制的整体稳定性曲线，四种制剂任何之间的差异非常小。
表30：在40℃储存一个月(粗体)和两个月(斜体)后，通过RP HPLC测定的MOR6654B制剂的降解曲线(profile)
对于储存在25℃的样品，在主峰后洗脱两种主要降解产物(表31)。当使用RP HPLC测定时，所有四种制剂在25℃的稳定性曲线本质上相同。同样地，对于储存在4℃的样品有相似的降解曲线(表32)。
表31：在25℃储存t0和两个月后，通过RP HPLC测定的MOR6654B制剂的降解曲线
表32：在4℃储存达两个月后，通过RP HPLC测定的MOR6654B制剂的降解曲线
制剂 Rep 时间点 0.67 0.76 0.86 0.93 1.00 1.11 1.16 1.19
4C
制剂1 1 0 0.14 99.86
2 0 0.11 99.89
制剂2 1 0 0.11 99.89
2 0 0.21 99.79
制剂3 1 0 0.12 99.88
2 0 0.11 99.89
制剂4 1 0 0.15 99.85
2 0 0.16 99.84
制剂1 1 2 0.25 96.92 2.20 0.63
2 2 0.24 96.85 2.34 0.58
制剂2 2 2 0.17 97.12 1.87 0.83
2 2 0.23 96.99 1.95 0.83
制剂3 1 2 0.16 96.88 2.96
2 2 0.17 96.99 2.84
制剂4 1 2 0.23 96.81 2.20 0.76
2 2 0.16 97.07 2.06 0.71
当样品进行搅拌时，仅出现一种降解产物并且水平在所有样品中相似(表33)。制剂4似乎比其它三种稍不稳定，这可能是由于较低的蛋白质浓度。通过RP HPLC看出，重复F/T循环也导致一些适度损伤，其曲线类似于对搅拌所观察到的。这在整个研究中反复看到，表明这种蛋白质的界面敏感性无论在进行一种测试还是另一种测试时都可以看到。似乎不必要两种测试都进行来评估对于界面胁迫的整体敏感性。最后，暴露于光产生了一些早期洗脱种类，其有可能是片段。在四种制剂中，这些种类的水平在制剂3中更高(表33)。
表33：对于经受搅拌胁迫(搅拌)、多个F/T循环(F/T)和长时间暴露于光(光)的MOR6654B制剂通过RP HPLC测定的降解曲线
制剂 Rep 条件 0.68 0.75 0.87 0.93 0.96 1.00 1.10 1.16 1.24 1.29
搅拌
制剂1 1 t0 0.14 99.86
2 0.11 99.89
制剂2 1 t0 0.11 99.89
2 0.21 99.79
制剂3 1 t0 0.12 99.88
2 0.11 99.89
制剂4 1 t0 0.15 99.85
2 0.16 99.84
制剂1 1 搅拌 0.10 98.07 1.83
2 0.12 96.96 2.92
制剂2 1 搅拌 0.29 97.52 2.20
2 0.13 97.40 2.47
制剂3 1 搅拌 0.10 98.14 1.76
2 0.11 97.64 2.25
制剂4 1 搅拌 0.11 96.79 3.10
2 0.11 96.68 3.21
制剂1 1 F/T 0.17 99.31 0.51
2 0.23 96.96 2.81
制剂2 1 F/T 0.26 97.94 1.80
2 0.27 97.40 2.33
制剂3 1 F/T 0.17 96.68 3.15
制剂4 1 F/T 0.12 97.11 2.78
2 0.10 97.48 2.42
制剂1 1 光 0.01 0.62 1.17 94.47 3.73
2 0.01 0.63 1.42 96.93 1.02
制剂2 2 光 0.01 0.65 1.52 94.45 3.38
2 0.01 0.68 1.56 94.08 3.68
制剂3 1 光 0.03 1.36 0.62 94.82 3.17
2 0.03 1.40 0.87 93.98 3.73
制剂4 1 光 0.24 0.98 6.05 89.51 3.23
2 0.25 0.93 5.45 89.69 3.68
阳离子交换层析(CEX HPLC)
用来评价四种MOR6654B制剂的稳定性第三种HPLC法是阳离子交换(CEX)层析。此方法的目的是确定来自母体化合物的电荷不同的降解产物。最初，所有的四种制剂显示出广阔的主峰，其包含约98％的总峰面积(表34)。在40℃储存1个月时，主峰减少到约96％，制剂4具有稍高的纯度(表34)。在40℃两个月后，这进一步降低到约95％，制剂1显示出最高的纯度。
表34：在40℃储存达两个月后，MOR6654B制剂通过CEX HPLC测定的纯度
t0 t1 t2
制剂No [蛋白质]mg/mL CEX CEX CEX
1 150 蔗糖 98.30 98.28 96.76 95.76 95.69
2 150 海藻糖 98.35 98.28 96.62 95.17 95.31
3 150 蔗糖/Arg 98.34 98.26 96.62 94.75 94.89
4 20 蔗糖 98.30 98.22 97.31 95.39 95.13
表35：在4℃和25℃储存达两个月后，MOR6654B制剂通过CEX HPLC测定的纯度
t0 t2 4C t2 25C
制剂No [蛋白质]mg/mL CEX CEX CEX
1 150 蔗糖 98.30 98.28 97.29 97.70 97.09 97.36
2 150 海藻糖 98.35 98.28 97.45 97.35 97.31 97.20
3 150 蔗糖/Arg 98.34 98.26 97.33 97.45 97.36 97.35
4 20 蔗糖 98.30 98.22 97.05 97.38 97.42 97.46
对于在25℃储存两个月的MOR6654B制剂，纯度从＞98％降至～97％，制剂4稍微，但仅仅是稍微，更稳定(表35)。当在4℃储存相同时间量时，纯度有一些损失，类似于通过RPHPLC数据看到的。再次，并不清楚为何在4℃样品与在25℃下降解大体相同，但是降解程度很小并且所有的MOR6654B制剂表现得大致相同。
表36：对于经受搅拌胁迫(搅拌)、多个F/T循环(F/T)和长时间暴露于光(光)的MOR6654B制剂通过CEX HPLC测定的纯度
在重复F/T循环的搅动时，基于CEX HPLC存在一些损失，所有四种制剂表现相同(表36)。相比通过SEC和RP HPLC(分别是表26和29)所见，通过CEX HPLC测得长时间暴露于光产生了非常少的伤害。这表明，由光所产生的降解产物就来自母体化合物的电荷而言没有什么不同。
还原性毛细管电泳(rCE-SDS)
此处的毛细管电泳法允许人们观察单独对于抗体的轻链(LC)和重链(HC)的损伤程度。另外，它可以通过非LC/HC量所指示的，提供多少蛋白质是不完整的LC和HC的估计。在t0，有峰面积为约25％的LC和70％的HC，未对尺寸的差异进行校正(表37)，余量(～5％)被计为非LC/HC种类(表38)。
表37.在40℃储存达两个月的MOR6654B制剂中通过rCE-SDS测定的LC和HC的百分比
在40℃储存一个月后，LC和HC的相对量改变，LC现在占～27％而HC占62和68％之间(表37)。这表明HC损失。这反映为非LC/HC种类的量显著增加(见表38)，这些量已经接近储存前水平的双倍。
表38：在40℃储存达两个月的MOR6654B制剂中通过rCE-SDS测定的非LC/HC种类的百分比
t0 t1 t2
制剂No [蛋白质] 非LC/HC 非LC/HC 非LC/HC
1 150 蔗糖 5.2 9.3 9.9
2 150 海藻糖 4.8 8.4 11.2
3 150 蔗糖/Arg 5.8 9.6 9.9
4 20 蔗糖 7.3 5.2 9.0
在两个月结束时，有约10％(或更多)的非LC/HC物种。这些数据表明，制剂4是最稳健的，具有在非LC/HC水平的最小百分比的增加。
表39.在4℃储存两个月的MOR6654B制剂中通过rCE-SDS测定的LC和HC的百分比
当将样品储存在4℃时，通过rCE-SDS看到仍有一些降解，因为LC水平从～25％上升至～27％(表39)。在这种情况下，制剂2最稳定，非LC/HC种类的量几乎没有增加。
表40：在25℃储存两个月的MOR6654B制剂中通过rCE-SDS测定的LC和HC的百分比
当在25℃储存两个月时，LC可比较的增加而HC含量减少(表40)。非LC/HC种类水平也增加，但几乎与4℃的样品一样多。在这些中，制剂3似乎具有最差的稳定性，但差异很小。
表41.对于经受搅拌胁迫(搅拌)、多个F/T循环(F/T)和长时间暴露于光(光)的MOR6654B制剂通过rCE-SDS测定的LC和HC的百分比
由rCE-SDS分析的最后组样品是经受了三种不同的胁迫条件的那些(表41)。当样品被搅拌或暴露于F/T循环时，对于四种MOR6654B制剂中任一种都没有非LC/HC物种的明显增加。这与其他的研究结果一致，即MOR6654B在这些制剂中对于界面胁迫不是非常敏感。这也强化了这两个测试提供了界面的稳定性的相当的评估的想法。长时间暴露于光导致HC的某些损失以及非LC/HC水平的上升(表41)。在这些制剂中，制剂4显示出最大的变化。
微流成像(MFI)
在过去的几年里，对于可注射蛋白产物的亚可见颗粒水平的关注增加。结果是，已经开发了许多不同的分析方法。其中最广为人知的是微流成像(MFI)。这项技术被用于测量不同尺寸范围内的亚可见颗粒含量(以每mL的颗粒计)。虽然就尺寸而言收集的数据达100um，仅呈现了达25um的数据。MFI的数据的再现性非常好。一式两份测量的平均相对标准偏差为约5％。
表42.使用MFI对储存在40℃一个月(粗体)和两个月(斜体)的MOR6654B制剂测量的亚可见含量(颗粒/mL)。样品在t1时没有一式两份测试。另外，报告的数值是平均值±1标准偏差
通常，为MFI汇总的数据只报道了总颗粒计数(每mL的颗粒)，但是这可能会产生误导，因为该数字是以在1-2微米大小的范围计数的颗粒占主。在这个尺寸范围内，硅油和气泡突出，使计数偏离基于蛋白质的颗粒。尽管提供这些数值，最好是看尺寸大于2um，可能的化，大于5um的颗粒。另外，对于报告了平均值和标准偏差的样品，这些都是一式两份操作的结果。
当储存在40℃时，所有制剂的亚可见颗粒计数升高(表42)。特别值得注意的是制剂4，其中的总颗粒计数在t0时每mL小于5000颗粒，比其他更高浓度的制剂低得多。1个月后，所有的制剂已经超过每mL 20000颗粒，尽管制剂3的增加相当小(表42)。在两个月时，只有制剂2每mL少于30000颗粒。对于2-5um(其中这一制剂包含每mL少于5000颗粒)和5-10um(其中水平为每mL少于1000颗粒)的颗粒的差异更加惊人，就存在的亚可见颗粒的总量而言，只有制剂1接近。
表43：使用MFI对储存在25℃两个月(黑体)的MOR6654B制剂测量的亚可见含量(颗粒/mL)。报告的数值是平均值±一标准偏差
当MOR6654B样品在25℃储存两个月时，所有制剂的亚可见颗粒增加，只是制剂1增加非常小(表43)。对于制剂1，在尺寸为5到10um的颗粒只有适度的增加。另外，实质上没有变化。同时，所有其它制剂都有大小相当的增加，尤其是在2至25um的尺寸范围。特别是，制剂3和4在大多数尺寸范围段显示出显著增加。
对于在4℃储存两个月的MOR6654B制剂，亚可见颗粒水平的有极少改变。制剂1显示出了5-10mm颗粒只有很小的增加，在所有其它尺寸范围时稍微减小。制剂2显示出在不同的尺寸范围仅少量增加，而制剂3在整体颗粒水平展现出小的减小。相比之下，开始具有非常低的亚可见颗粒承载(勉强高于纯水)的制剂4在所有尺寸范围显示出每mL的颗粒显著增加。
当MOR6654B制剂经受搅拌、F/T循环和光暴露的胁迫条件时，只对耐光性样品存在大的增加(表44)。搅拌和F/T循环两者都造成颗粒水平小到适度增加，尤其是如果忽略小于2um的颗粒时。另一方面，长时间光暴露确实会造成亚可见颗粒的形成至相当多的增加(表44)。这对于制剂3和4而言尤其如此。相比之下，制剂1显示出整个亚可见颗粒承载几乎没有变化。
表44.使用MFI对经受搅拌胁迫(黑体)、多个F/T循环(斜体)和长时间暴露于光(下 划线)的MOR6654B制剂测量的亚可见含量(颗粒/mL)。对于t0报告的数值是平均值±一标准偏差。
His(组氨酸)；P20(聚山梨酯20)；Arg(精氨酸)
比色法
在这一稳定性研究中使用的最后一个分析方法是比色法。在t0，四种制剂都显示出褐色(表45)，对于更稀释的制剂(制剂4)稍有不同的颜色强度。在40℃温育一至两个月导致颜色变化很少，只是制剂4确实显示出一些小的变化(表45)。当储存在较低温度时，颜色变化即使有也很小(表46)。当经受任何的胁迫条件时，颜色也保持不变(表47)。
表45：在40℃储存达两个月，MOR6654B制剂的颜色
表46：在4℃和25℃储存零和两个月，MOR6654B制剂的颜色
表47：经受搅拌胁迫(搅拌)、多个F/T循环(F/T)以及长时间暴露于光(光)，MOR6654B制剂的颜色
总结
使用多种的生物物理和生物化学分析方法来确定制剂之间在稳定性方面是否存在差异。在选择用于第二次筛选的制剂中，使用许多分析技术几乎没见到差别。只有储存在40℃和长时间暴露于光时造成了任何显著量的降解。虽然所有四种制剂在它们的稳定性曲线方面非常相似，但通过这一组分析法所测得，制剂1(150mg/mL MOR6654B，220mM蔗糖，20mM组氨酸，0.04％聚山梨酯20，pH 6.0)显示出最少的整体降解的倾向。制剂1在热和光胁迫条件下更稳定，不易降解，并且在亚可见范围的颗粒形成方面也更稳定。

Claims (14)

1.水性组合物，其具有6.0的pH并且包含
(i)低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有150mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)220mM蔗糖作为稳定剂，
(iii)20mM组氨酸作为缓冲剂，
(iv)0.04％聚山梨酯20作为表面活性剂和任选地，
(v)2mM至80mM的精氨酸或精氨酸-HCl。
2.水性组合物，其具有6.0的pH并且包含
(i)低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有150mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)220mM海藻糖作为稳定剂，
(iii)20mM组氨酸作为缓冲剂，
(iv)0.04％聚山梨酯20作为表面活性剂和任选地，
(v)2mM至80mM的精氨酸或精氨酸-HCl。
3.水性组合物，其具有6.0的pH并且包含
(i)低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗BAFFR抗体，其中所述抗体具有150mg/mL的浓度，并且其中所述抗BAFFR抗体包含分别是SEQ ID NO：3、4和5的重链CDR1、CDR2和CDR3，以及SEQ ID NO：6、7和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)120mM蔗糖作为稳定剂，
(iii)20mM组氨酸作为缓冲剂，
(iv)0.04％聚山梨酯20作为表面活性剂，和
(v)50mM精氨酸或精氨酸-HCl。
4.前述权利要求中的任一项的水性组合物，其中所述低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗BAFFR抗体包含具有氨基酸SEQ ID NO：1的VH结构域和具有氨基酸SEQ ID NO：2的VL结构域。
5.权利要求1-3中的任一项的水性组合物，其中所述低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗BAFFR抗体包含SEQ ID NO：9的重链区和SEQ ID NO：10的轻链区。
6.递送装置，其包含根据权利要求1-5中任一项的水性组合物。
7.预填装注射器，其包含根据权利要求1-5中任一项的水性组合物。
8.根据权利要求1-5中任一项的水性组合物的用途，其用于制备用于向哺乳动物递送低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗BAFFR抗体的递送装置或预填装注射器或药物。
9.根据权利要求1-5中任一项的水性组合物的用途，其用于制备治疗由BAFF受体介导的疾病或病症的递送装置或预填装注射器或药物。
10.根据权利要求9所述的用途，其中由BAFF受体介导的疾病或病症是一种通过杀死或消耗B细胞而治疗的疾病或病症。
11.根据权利要求9所述的用途，其中由BAFF受体介导的疾病或病症是自身免疫疾病。
12.根据权利要求9所述的用途，其中由BAFF受体介导的疾病或病症是B细胞瘤。
13.根据权利要求12所述的用途，其中B细胞瘤是B细胞淋巴瘤、B细胞白血病或B细胞骨髓瘤。
14.根据权利要求9所述的用途，其中由BAFF受体介导的疾病或病症是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、干燥综合征、肺间质纤维化或寻常性天疱疮。
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