MX2014015262A - Formulacion de anticuerpos. - Google Patents

Abstract

Los anticuerpos anti-BAFFR se formulan como formulación líquida que comprende una alta concentración del ingrediente activo de anticuerpos para la entrega en un paciente sin altos niveles de agregación de anticuerpos. La composición farmacéutica acuosa puede incluir uno o más azúcares, un agente amortiguador, un surfactante, y/o un aminoácido libre.

Description

FORMULACIÓN DE ANTICUERPOS CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a una formulación farmaceutica de un anticuerpo contra BAFFR (receptor de BAFF), a un proceso para su preparación y a los usos de la formulación.

ANTECEDENTES El par BAFFR:BAFF está profundamente involucrado en la maduración de las células B de transición, para la supervivencia y la activación de las células B maduras, y para la conmutación de clase de isotipo en respuesta a antígenos dependientes de células T. BAFF y su receptor BAFFR también son importantes para la supervivencia y el crecimiento de células B malignas. Además, BAFFR normalmente no se expresa en células pre-B, pero recientemente se mostró expresado en células humana de ALL (leucemia linfoblástica aguda de linaje B) (Parameswaran, 2010, Cáncer Res. 70(1 1 ) 4346-4356). La eliminación de las células B auto-reactivas y el bloqueo de supervivencia/activación no apropiadas mediadas por los niveles BAFF de exceso en pacientes que sufren de trastornos autommunes o cáncer representa un objetivo terapéutico bien validado. Por lo tanto, un anticuerpo anti-BAFFR, en particular, un anticuerpo capaz de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y el bloqueo de la unión del ligando a BAFFR puede ofrecer un agente terapéutico eficaz en las enfermedades autoinmunes y neoplasias de células B.

Los anticuerpos contra BAFFR se conocen a partir de, por ejemplo, el documento WO 2010/007082 e incluyen anticuerpos que se caracterizan por que comprenden un dominio VH con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y un dominio VL con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. El anticuerpo MOR6654 es uno de estos anticuerpos (lgG1 kappa). Éste tiene la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 10. Este anticuerpo puede expresarse a partir de las SEQ ID NOs: 14 y 15, preferiblemente en una celula huésped que carece de la fucosil-transferasa, por ejemplo, en una línea celular de mamífero con un gen inactivo FUT8 (-/-), para proporcionar un anticuerpo anti-BAFFR no fucosilado funcional con ADCC mejorado. Este anticuerpo se conoce de aquí en adelante como MOR6654B. Las vías alternativas para producir anticuerpos no fucosilados son conocidas en la téenica.

Los anticuerpos terapéuticos se formulan típicamente ya sea en forma acuosa lista para la administración parenteral o en forma de liofilizados para la reconstitución con un diluyente adecuado antes de la administración.

La solicitud internacional PCT/EP201 1 /072248 da a conocer los liofilizados, que se pueden reconstituir para dar una solución con una alta concentración del ingrediente activo de anticuerpo y un bajo nivel de aglomeración de anticuerpos para suministro a un paciente. Las altas concentraciones de anticuerpos son útiles, ya que reducen el volumen de dosificación, que se debe entregar a un paciente. Los volúmenes de dosificación reducidos minimizan el tiempo necesario para suministrar una dosis fija al paciente.

Las composiciones farmaceuticas formuladas para contener alta concentración de anticuerpos pueden, sin embargo, tener una vida útil corta y los anticuerpos formulados pueden perder actividad biológica como resultado de inestabilidades químicas y físicas durante el almacenamiento. Entre otras, la aglomeración, la desamidación y la oxidación son conocidas por ser las causas más comunes de degradación de anticuerpos. Además, la aglomeración puede potencialmente conducir a un aumento de la respuesta inmune en pacientes, lo que lleva a problemas de seguridad. Por lo tanto la aglomeración de anticuerpos en composiciones farmacéuticas debe ser minimizada o prevenida.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones farmacéuticas nuevas y mejoradas que comprenden anticuerpos anti-BAFFR, formulados como para permitir una alta concentración de anticuerpos anti-BAFFR con ninguna o sustancialmente ninguna aglomeración de anticuerpos.

Es otro objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación de anticuerpo anti-BAFFR adecuada para administración subcutánea. La ventaja de la inyección subcutánea es que permite que el médico la pueda llevar a cabo en una corta intervención con el paciente. Además, el paciente puede ser entrenado para realizar la inyección subcutánea por sí mismo.

Este objetivo se cumple mediante las composiciones farmaceuticas acuosas de la presente invención.

Las composiciones acuosas de la invención comprenden alta concentración de anticuerpos anti-BAFFR, pero no o esencialmente no hay anticuerpos aglomerados y son por lo tanto particularmente adecuadas para administración subcutánea.

En una modalidad, la presente invención se refiere a composiciones acuosas que tienen un pH de 5.0-7.0 y que comprenden (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 18 a 165 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) un estabilizador, (iii) un agente regulador del pH, (iv) un tensoactivo, y opcionalmente, (v) un aminoácido.

En particular, la invención proporciona una composición acuosa que tiene un pH de 5.5- 5 y que comprende (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 18 a -165 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR 1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) Sacarosa, trehalosa o manitol como un estabilizador, (iii) Histidina, citrato o succinato como un agente regulador del pH , (iv) polisorbato 20, poloxámero 188 o hidroxipropil-b-ciclodextrina como un tensoactivo, y, opcionalmente, (v) arginina como un aminoácido.

En una modalidad, la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades comprende el anticuerpo anti-BAFFR en una concentración de entre 20 mg/ml y 150 mg/ml, particularmente de entre 80 mg/ml y 150 mg/ml, en particular de entre 100 mg/ml y 150 mg/ml.

En una modalidad, la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades comprende un azúcar como un agente estabilizante, en particular sacarosa, manitol o trehalosa, en una concentración de entre 80 mM y 300 mM , en particular de entre 120 mM y 270 mm , en particular de entre 120 mM y 220 mM.

En una modalidad, la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades comprende un tensoactivo, en particular polisorbato 20 o poloxámero 188, en una concentración de entre 0.01 % y 0.1 %, en particular de entre 0.02% y 0.06%.

En una modalidad, la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas formas de modalidad comprende un agente regulador del pH , particularmente histidina, citrato o succinato, en una concentración de entre 5 mM y 50 mM , en particular en una concentración de entre 15 mM y 25 mm, en particular de entre 18 mM y 22 mM , en particular de 20 mM.

En una modalidad, la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades comprende además un aminoácido, en particular arginina o arginina-HCI, en una concentración de entre 2 mM y 80 mM .

En una modalidad, la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades comprende sacarosa o trehalosa en una concentración de entre 1 10 mM y 250 mM .

En una modalidad específica, la presente invención proporciona una composición acuosa que tiene un pH de 5.5 a 6.5 y que comprende (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 18 a 165 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa, trehalosa o manitol 80 mM - 300 mM como un estabilizador, (iii) Histidina, citrato o succinato 5 mM - 50 mM como un agente regulador del pH, (iv) 0.01 % -0.1 % de polisorbato 20 o poloxámero 188, o hidroxipropil-b-ciclodextrina 1 mM - 3 mM como un tensoactivo, y, opcionalmente, (v) arginina 2 mM - 80 mM , particularmente arginina-HCI.

En otra modalidad especifica, la presente invención proporciona una composición acuosa que tiene un pH de 5.5 a 6.5 que comprende (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20 mg/ml - 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR 1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa, o trehalosa 1 10 mM - 250 mM como un estabilizador, (iii) histidina, citrato o succinato 15 mM - 20 mM como un agente regulador del pH, (iv) 0.02% - 0.06% de polisorbato 20 o poloxámero 188, o hidroxipropil-b-ciclodextrina 2 mM - 3 mM como un tensoactivo, y, opcionalmente, (v) arginina 2 mM - 80 mM , particularmente arginina-HCI.

En aún otra modalidad específica, la presente invención proporciona una composición acuosa que tiene un pH de 5.5 a 6.5 y que comprende (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20 mg/ml - 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR 1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa, o trehalosa 120 mM - 220 mM como un estabilizador, (iii) histidina, citrato o succinato 18 mM -22 mM como un agente regulador del pH , (iv) Hasta 0.02% - 0.06% de polisorbato 20 o poloxámero 188, o hidroxipropil-b-ciclodextrina 2.5 mM como un tensoactivo, y, opcionalmente, (v) arginina 2 mM - 80 mM , particularmente arginina-HCI.

En otra modalidad específica, la presente invención proporciona una composición acuosa que tiene un pH de 6.0 y que comprende (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa 220 mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH , (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo.

En otra modalidad específica, la presente invención proporciona una composición acuosa que tiene un pH de 6.0 y que comprende (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti- BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) trehalosa 220mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH , (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo.

En otra modalidad específica, la presente invención proporciona una composición acuosa que tiene un pH de 6.0 y que com prende (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa o trehalosa 120 mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH , (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo, y (v) arginina 50 mM, particularmente arginina-HCI.

En otra modalidad específica, la presente invención proporciona una composición acuosa que tiene un pH de 6.0 y que comprende (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa o trehalosa 220 mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH , y (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo.

En una modalidad, la invención se refiere a la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades, en donde el anticuerpo anti-BAFFR comprende un dominio VH con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y un dominio VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad de la invención, la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades, en donde el anticuerpo anti-BAFFR comprende una región de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; y una región de cadena ligera de la SEQ ID NO: 10.

En una modalidad, el anticuerpo anti-BAFFR es un anticuerpo anti-BAFFR no fucosilado.

La invención proporciona además un dispositivo de liberación que comprende la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades.

Este dispositivo de suministro puede ser proporcionado en forma de una jeringa precargada que comprende la composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para liberar un anticuerpo anti-BAFFR a un mam ífero, que comprende la etapa de administrar a dicho mamífero de una composición acuosa de la invención como se describe en este documento en las diversas formas de modalidades, en particular en forma de un dispositivo de liberación tal como una jeringa pre-cargada.

La presente invención proporciona además la composición o el dispositivo de suministro, o la jeringa pre-cargada de la invención como se describe en este documento en las diversas formas de modalidades, para el uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno que está mediada por el receptor de BAFF o que puede ser tratada eliminando o agotando las células B.

En particular, la composición farmacéutica o el dispositivo de liberación, o la jeringa pre-cargada de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades se pueden usar en el tratamiento de enfermedades autommunes, neoplasias de células B, tales como linfoma, leucemia o mieloma, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjógren o pénfigo vulgar.

La invención se basa, al menos en parte, en las propiedades de los anticuerpos formulados tales como MOR6654 y MOR6654B, que conservan una notable estabilidad y propiedades bioactivas cuando se formula en una alta concentración como una composición líquida (acuosa).

Como se usa en la presente, una composición farmacéutica "acuosa" es una composición adecuada para uso farmacéutico, en donde el vehículo acuoso es agua destilada. Una composición adecuada para uso farmacéutico puede ser estéril, homogénea y/o isotónica. Las composiciones farmacéuticas acuosas se pueden preparar ya sea directamente en una forma acuosa, por ejemplo, en una jeringa pre-cargada lista para su uso (las "formulaciones líquidas") o como un liofilizado para ser reconstituido poco antes del uso.

Como se usa en la presente, el término "composición farmacéutica acuosa" se refiere a la formulación líquida o formulación liofilizada reconstituida. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención son adecuadas para administración parenteral a un sujeto humano. En una modalidad específica, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención son adecuadas para administración subcutánea.

Como se utiliza en la presente, la expresión “administración parenteral” representar modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaraenoidea, e infusión intraespinal, epidural e intraesternal.

El uso de anticuerpos como el ingrediente activo de productos farmacéuticos es ahora generalizado, incluyendo los productos HERCEPTIN™ (trastuzumab), RITUXAN™ (rituximab), SYNAGIS™ (palivizumab), etc. Las técnicas para la purificación de anticuerpos terapéuticos a un grado farmacéutico son bien conocidas en la téenica.

La composición normalmente será por ejemplo, no pirogénica que contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis y, preferentemente, <0, 1 UE por dosis. La composición es preferentemente libre de gluten.

En modalidades específicas, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención presentan niveles bajos o indetectables de aglomeración o degradación de anticuerpos, con muy poca o ninguna pérdida de la actividad biológica durante la fabricación, elaboración, transporte y largos períodos de almacenamiento, la concentración de los anticuerpos anti-anticuerpo BAFFR es al menos aproximadamente de 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, o 300 mg/ml.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica acuosa con alta concentración de anticuerpos anti-BAFFR.

Se sabe en la técnica que tales composiciones farmacéuticas acuosas de alta concentración pueden diluirse antes de la inyección, por ejemplo, si se requieren concentraciones más bajas de anticuerpos para las intervenciones terapéuticas específicas o cuando el tratamiento es para los pacientes de menor peso corporal, incluyendo los niños. Las concentraciones apropiadas pueden ser 25 mg/ml o 10 mg/ml. Alternativamente, la formulación original puede producirse con tal concentración baja.

El término "anticuerpo" como se refiere en el presente documento incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas simples de los mismos. Un "anticuerpo" de origen natural es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres o cuatro dominios, dependiendo del isotipo, CH1 , CH2, CH3 y CH4. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de antígeno"), tal como se utiliza en la presente, se refiere a la longitud completa o a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, una porción de BAFFR). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro del término “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1 ; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH 1 ; un fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, un fragmento dAb (Ward, (1989) Nature 341 : 544-546), que consta de un dominio VH y una región determinante de complementariedad aislada (CDR).

Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite hacerse como una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird, (1988) Science 242:423-426; y Huston, (1988) Proc Nati Acad. Sci. 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla tambien están destinados a estar comprendidos dentro del término "fragmento de anticuerpo". Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando téenicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan según la utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.

Un "anticuerpo aislado" como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas, por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a BAFFR humano está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen a antígenos distintos de BAFFR. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a BAFFR puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas BAFFR de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. Los términos “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” como se utilizan en la presente se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpos de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad de unión y afinidad para un epítopo particular.

La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, incluye anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones flanqueantes como CDR se derivan a partir de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante tambien se deriva de dichas secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de línea germinal humana, o versiones mutadas de las secuencias de la línea germinal humana o anticuerpos que contienen marco de secuencias de consenso derivadas de análisis de marco de secuencias humanas, por ejemplo, como se describe en Knappik, (2000. J Mol Biol 296, 57-86).

Las estructuras y ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulina, por ejemplo, CDRs, pueden definirse usando esquemas de numeración bien conocidos, por ejemplo, el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chothia, o una combinación de Kabat y Chothia (AbM) etc. (véase, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos EE.UU.(1991 ), eds Kabat et al.; Al Lazikani et al. (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948). A lo largo de esta especificación, la región determinante de la complementariedad ("CDR") se define de acuerdo con la definición de Kabat con la excepción de CDRH1 que es el tramo de aminoácidos definidos por una combinación de ambas definiciones de Kabat y de Chothia de esta CDR.

Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica al sitio in vitro o por mutación somática In vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en este documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en secuencias estructurales humanas.

El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una sola especificidad de unión que tienen regiones variables en las que tanto las regiones variables como las regiones CDR se derivan de secuencias humanas.

El término "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante, combinatoria de anticuerpos humanos, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica corte y empalme de la totalidad o una porción de un gen de inmunoglobulina humana, secuencias a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones variables y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagenesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con secuencias VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir de manera natural dentro del repertorio de anticuerpos de línea germinal humana in vivo.

Como se utiliza en la presente, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM, IgA, IgD, IgE y IgG tal como IgG 1 , lgG2, lgG3 o lgG4) que es proporcionada por los genes de región constante de cadena pesada.

Las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se utilizan indistintamente en la presente con el término “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno”.

Como se usa en la presente, un anticuerpo que "se une específicamente a polipéptido BAFFR" o un "anticuerpo anti-BAFFR" se refiere a un anticuerpo que se une a un polipéptido BAFFR humano de la SEQ ID NO: 13 con un KD de 100nM o menos, 10nM o menos, 1 nM o menos. Un anticuerpo que "reacciona de forma cruzada con un antígeno distinto de BAFFR" se refiere a un anticuerpo que se une a ese antígeno con una KD de 0.5 x 10 8 M o menos, 5 x 10 9 M o menos, o 2 x 10-9 M o menos. Un anticuerpo que "no reacciona de forma cruzada con un antígeno particular" pretende referirse a un anticuerpo que se une a ese antígeno, con una KD de 1.5 x 10 8 M o mayor, o una KD de 5-10 x 10 8 M o 1 x 10 7 M o mayor. En ciertas modalidades, tales anticuerpos que no reaccionan de forma cruzada con el antígeno exhiben esencialmente unión indetectable contra estas proteínas en ensayos de unión estándar.

En una modalidad, una alta concentración de un anticuerpo anti-BAFFR en la composición farmaceutica acuosa de la invención es al menos 50 mg/ml. En una modalidad, una alta concentración es al menos 100 mg/ml. En una modalidad, una alta concentración es al menos 150 mg/ml. En una modalidad, una alta concentración es al menos 200 mg/ml. En una modalidad, una alta concentración es al menos 250 mg/ml. En una modalidad, una alta concentración es al menos 270 mg/ml. En una modalidad, una alta concentración es al menos 300 mg/ml.

En una modalidad, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende entre 50 mg/ml y 300 mg/ml de un anticuerpo anti-BAFFR, por ejemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

En una modalidad, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende entre 75 mg/ml y 270 mg/ml de un anticuerpo anti-BAFFR, por ejemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

En una modalidad, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende entre 100 mg/ml y 250 mg/ml de un anticuerpo anti-BAFFR, por ejemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

En una modalidad, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende entre 100 mg/ml y 200 mg/ml de un anticuerpo anti-BAFFR, por ejemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

En una modalidad, la composición farmaceutica acuosa de la invención comprende 150 mg/ml de un anticuerpo anti-BAFFR, por ejemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

En una modalidad, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende 20 mg/ml de un anticuerpo anti-BAFFR, por ejemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

En una modalidad, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 1 10 mg/ml, aproximadamente 120 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 140 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 160 mg/ml, aproximadamente 170 mg/ml, aproximadamente 180 mg/ml, aproximadamente 190 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 210 mg/ml, aproximadamente 220 mg/ml, aproximadamente 230 mg/ml, aproximadamente 240 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 270 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml de un anticuerpo anti-BAFFR, por ejemplo, MOR6654, especialmente MOR6654B.

Además, las composiciones farmacéuticas acuosas de acuerdo con la invención como se describe en este documento en las diversas formas de modalidad son estables de tal manera que, incluso después de un almacenamiento durante 4 semanas a 2-8°C, menos de 5% , 4%, 3% , 2%, 1 % , 0.05% o 0.01 % del anticuerpo a nti -BAFFR total se agregan como se mide mediante SEC-HPLC.

Las composiciones farmaceuticas acuosas de acuerdo con la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades son estables de tal manera que, incluso después de un almacenamiento durante 2 meses a 2-8°C, menos de 5%, 4%, 3% , 2%, 1 % , 0,05% o 0.01 % del anticuerpo anti-BAFFR total se agregan como se mide mediante SEC-HPLC.

Las composiciones farmacéuticas acuosas pueden incluir, además del anticuerpo anti-BAFFR, componentes adicionales tales como uno o más de los siguientes: (i) un estabilizador, (ii) un agente regulador del pH; (iii) un tensoactivo, y (iv) un ácido amino libre. La inclusión de cada uno de tales componentes adicionales puede dar composiciones con baja aglomeración del anticuerpo anti-BAFFR.

Los estabilizador adecuado para utilizar con la invención puede actuar, por ejemplo, como los agentes potenciadores de la viscosidad, agentes de carga, agentes solubilizantes, y/o similares. El estabilizador puede ser iónico o no iónicos (por ejemplo, azúcares). Como azúcares que incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, por ejemplo, fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, por ejemplo, lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacáridos, por ejemplo, rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares, y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) y similares. Por ejemplo, el azúcar puede ser sacarosa, trehalosa, rafinosa, maltosa, sorbitol o manitol. El azúcar puede ser un alcohol de azúcar o un amino azúcar. La sacarosa es particularmente útil. Como estabilizador iónico se incluyen sales tales como NaCI o componentes de aminoácidos tales como arginina-HCI.

Los agentes reguladores del pH adecuados para utilizar con la invención incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos orgánicos tales como sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acetico o ácido itálico; Tris, clorhidrato de trometamina, o regulador de pH de fosfato. Además, los componentes aminoácidos también pueden utilizarse como agente regulador del pH. Tal componente aminoácido incluye sin limitación glicina e histidina. Un regulador de pH de histidina es particularmente útil.

Las composiciones farmacéuticas acuosas incluyen tal agente regulador del pH o agente de ajuste del pH para proporcionar un mejor control del pH . En una modalidad, la com posición farmacéutica acuosa de la invención tiene un pH entre 5.0 y 8.0, entre 5.0 y 7.0, entre 5.5 y 7.0, o entre 5.5 y 6.5. En una modalidad específica, una composición farmacéutica acuosa de la invención tiene un pH de 6.0 aproximadamente.

Como se usa en este documento, el término "tensoactivo" se refiere a sustancias orgánicas que tienen estructuras anfipáticas, es decir, que se compone de grupos de tendencias de solubilidad opuestas, típicamente una cadena hidrocarbonada soluble en aceite y un grupo iónico soluble en agua. Los tensioactivos pueden clasificarse, dependiendo de la carga de la fracción de superficie activa, en agentes aniónicos, catiónicos y dispersantes para diversas composiciones y preparaciones farmacéuticas de materiales biológicos.

Los tensoactivos adecuados para utilizar con la invención incluyen, pero no se limitan a, tensoactivos no iónicos, tensoactivos iónicos y tensoactivos de ion híbrido. Tensoactivos típicos para su uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, ésteres de sorbitán de ácidos grasos (por ejemplo, monocaprilato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán), trioleato de sorbitán, ésteres de ácidos grasos de glicerina (por ejemplo, monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina, monoestearato de glicerina), ésteres de poliglicerina de ácidos grasos (por ejemplo, monoestearato de decaglicerilo, diestearato de decaglicerilo, monolinoleato de decaglicerilo), ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno (por ejemplo monolaurato de sorbitán de polioxietileno, mono-oleato de sorbitán de polioxietileno, monoestearato de sorbitán de polioxietileno, monopalmitato de sorbitán de polioxietileno, trioleato de sorbitán de polioxietileno, triestearato de sorbitán polioxietileno), ésteres de ácidos grasos de sorbitol de polioxietileno (por ejemplo, tetraestearato de sorbitol de polioxietileno, tetraoleato de sorbitol de polioxietileno), ésteres de ácidos grasos de glicerina de polioxietileno (por ejemplo, polioxietileno monoestearato de glicerilo), ésteres de ácidos grasos de polietileng licol (por ejemplo, diestearato de polietilenglicol), éteres alquílicos de polioxietileno (por ejemplo, polioxietileno lauril éter), polioxipropileno polioxietileno éteres de alquilo (por ejemplo, polioxietileno polioxipropileno glicol, polioxietileno polioxipropileno propil éter, polioxietileno polioxipropileno cetil éter), polioxietileno alquilfenilo éteres (por ejemplo, nonilfenil éter de polioxietileno), aceites de ricino hidrogenados de polioxietileno (por ejemplo, aceite de ricino de polioxietileno, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno), derivados de cera de abeja de polioxietileno (por ejemplo, cera de abeja de polioxietilen sorbitol), derivados de lanolina de polioxietileno (por ejemplo, lanolina de polioxietileno), y amidas de ácidos grasos de polioxietileno (por ejemplo, amida de ácido esteárico de polioxietileno); sulfatos de C10-C18 alquilo (por ejemplo, cetil sulfato sódico, lauril sulfato sódico, oleil sulfato sódico), éter sulfato de polioxiet¡leno-C 0-C18 alquilo con un promedio de 2 a 4 moles de unidades de óxido de etileno añadidas (por ejemplo, lauril sulfato sódico de polioxietileno), y sales de éster de C1-C18 alquilo sulfosuccinato (por ejemplo, éster lauril sulfosuccinato sódico), y tensoactivos naturales tales como lecitina, glicerofosfolípido, esfingofosfolípidos (por ejemplo, esfingomielina), y ésteres de sacarosa de ácidos grasos C12-Ci8. Una composición puede incluir uno o más de estos tensoactivos. Tensoactivos preferidos son ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno, por ejemplo polisorbato 20, 40, 60 o 80. Polisorbato 20 (Tween 20) es particularmente útil.

Los aminoácidos libres adecuados para su uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, arginina, sina, histidina, ornitina, isoleucina, leucina, alanina, ácido glutámico, glicina o ácido aspártico. La inclusión de un aminoácido básico se prefiere es decir, arginina, Usina y/o histidina. Si una composición que incluye histidina, entonces esta puede actuar tanto como un agente regulador del pH como un aminoácido libre, pero cuando se utiliza un regulador de pH de histidina es típico incluir un aminoácido libre no-histidina por ejemplo, para incluir regulador de pH de histidina y Usina. Un aminoácido puede estar presente en su forma D y/o L, pero la forma L es típica. El aminoácido puede estar presente como cualquier sal adecuada, por ejemplo una sal de clorhidrato, tal como arginina-HCI.

Otros excipientes contemplados, que se pueden utilizar en las composiciones farmaceuticas acuosas de la invención incluyen, por ejemplo, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, lípidos tales como fosfolípidos o ácidos grasos, esteroides tales como colesterol, excipientes proteicos tales como albúmina de suero (albúmina de suero humano), albúmina humana recombinante, gelatina, caseína, contra-iones formadores de sales tales como sodio y similares. Estos excipientes farmacéuticos adicionales conocidos y/o aditivos adecuados para uso en las formulaciones de la invención son conocidos en la téenica, por ejemplo, como se indica en "The Handbook of Pharmaceutical Excipients, cuarta edición, Rowe et al., Eds. , American Pharmaceuticals Association (2003); y Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005).

Las composiciones farmaceuticas acuosas de la invención pueden incluir ingredientes activos adicionales, además de el anticuerpo anti-BAFFR.

Los agentes farmacológicos adicionales pueden incluir, por ejemplo, compuestos quimioterapéuticos.

Enfermedades y Trastornos Diana Las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención que comprenden anticuerpos anti-BAFFR se pueden utilizar para tratar, mejorar o prevenir una variedad de enfermedades o trastornos. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-BAFFR son particularmente útiles para el tratamiento de trastornos relacionados con BAFFR tales como trastornos autommunes, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjógren, pénfigo vulgar, la artritis reumatoide, esclerosis múltiple y neoplasias de células B tales como leucemia linfoblástica aguda (ALL) y de leucemia linfocítica crónica (CLL) de células B.

Como se usa en este documento, "un trastorno relacionado con BAFFR" incluye condiciones asociadas con o caracterizadas por niveles aberrantes de BLyS y/o enfermedades o condiciones que pueden ser tratadas por el agotamiento o eliminación de células B. Éstas incluyen, sin limitaciones, condiciones inflamatorias, enfermedades autoinmunes, infecciones graves, y rechazo de trasplantes de órganos o tejidos. Éstas incluyen además neoplasias de celulas B.

Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención que comprenden anticuerpos anti-BAFFR se pueden utilizar para tratamiento, mejora o prevención de los receptores de trasplantes de corazón, pulmón, corazón-pulmón combinado, hígado, riñón, páncreas, piel o córnea, incluyendo rechazo de alomjertos o rechazo de xenoinjertos, y para la prevención de la enfermedad de injerto-versus-huésped, tal como después del trasplante de médula ósea, arteriosclerosis asociada a trasplante de órganos. Además, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención son útiles en el trasplante de órganos sólidos y en el rechazo de trasplante agudo y crónico mediado por anticuerpos.

Las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención que comprenden anticuerpos anti-BAFFR son útiles para el tratamiento, prevención, o mejora de la enfermedad autoinmune y de estados inflamatorios, en particular estados inflamatorios con una etiología que incluye un componente autoinmune tal como artritis (por ejemplo artritis reumatoide, artritis crónica progresiva y artritis deformante) y enfermedades reumáticas, incluyendo condiciones inflamatorias y enfermedades reumáticas que involucran pérdida ósea, dolor inflamatorio, espondiloartropatías incluyendo espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artritis reactiva, artritis psoriásica, artritis y enterofática, hipersensibilidad (incluyendo tanto la hipersensibilidad de las vías respiratorias como hipersensibilidad dérmica) y alergias. Enfermedades autommunes específicas para las que pueden emplearse anticuerpos de la invención incluyen trastornos hematológicos autoinmunes (incluyendo por ejemplo anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos pura y trombocitopenia idiopática), hemofilia adquirida A, enfermedad de aglutininas frías, crioglobulinemia, púrpura trombocitopénica trombótica, síndrome de Sjógren, lupus eritematoso sistémico, trastornos musculares inflamatorios, policond ritis , esclerodermia, vasculitis tales como crioglobulinemia, vasculitis de vasos grandes, tales como arteritis de células gigantes, polimialgia reumática, vasculitis necrotizante, incluyendo vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrofílicos, arteritis de Takayasu, poliarteritis nodosa, púrpu ra de Henoch-Schonlein, y síndrome de Churg-Strauss, neuropatía mediada por IgM , espondartritis seronegativa, síndrome de opsoclono mioclono, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, vasculitis de autoantícuerpos citoplasmáticos anti-neutrofílicos (ANCA), hepatitis activa crónica, miastenia grave, psoriasis, síndrome de Steven-Johnson, pénfigo vulgar, foliacius pénfigo, prurito idiopático, enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino (incluyendo por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y síndrome de intestino irritable), oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, neuromielitis óptica, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo I), uveítis (anterior, intermedia y posterior, así como panuveítis), queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis vernal, fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriásica y glomerulonefritis (con y sin síndrome nefrótico, por ejemplo, incluyendo síndrome nefrótico idiopático o neuropatía de cambio mínimo), lupus nefrítico agudo, tumores, enfermedad inflamatoria de la piel y la córnea, miositis, aflojamiento de implantes óseos, trastornos metabólicos, tales como aterosclerosis, diabetes, y dislipidemia.

Las composiciones farmaceuticas acuosas de la invención también pueden ser útiles en la prevención, mejora o tratamiento de neoplasmas de células B. Ejemplos de tales enfermedades y condiciones incluyen, pero no se limitan a, los linfomas de células B no Hodgkin, tales como el linfoma linfocítico pequeño, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas, linfoma de células grandes difusas, y linfoma de Burkitt, leucemia linfoblástica aguda (ALL), precursor de la leucemia linfoblástica B, leucemia linfocítica crónica de células B (CLL) y mieloma múltiple. Otras neoplasias de células B se incluyen dentro del alcance de la invención. Administración a Pacientes Una composición farmacéutica de la invención puede administrarse a un paciente. La administración será típicamente por infusión o por medio de una jeringa. Por lo tanto, la invención proporciona un dispositivo de administración (por ejemplo, una jeringa) que incluye una composición farmacéutica de la invención (por ejemplo, jeringa precargada). Los pacientes recibirán una cantidad efectiva del anticuerpo anti-BAFFR como el ingrediente activo principal es decir, una cantidad que es suficiente para tratar, mejorar o prevenir la enfermedad o trastorno en cuestión. Los efectos terapéuticos pueden incluir también la reducción en síntomas físicos. La cantidad eficaz óptima y la concentración de anticuerpo para cualquier sujeto particular dependerá de diversos factores, incluyendo la edad, tamaño, salud y/o sexo del paciente, la naturaleza y la gravedad del trastorno, la actividad del anticuerpo particular, la tasa de su eliminación por el cuerpo, y también de cualquier posible producto terapéutico adicional administrado en combinación con el anticuerpo. La cantidad efectiva entregado para una situación dada puede ser determinada dentro del criterio de un médico. Para propósitos de la presente invención, una dosis efectiva puede ser de aproximadamente 0.005 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, o aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Los farmacéuticos con base en anticuerpos conocidos proporcionan orientación a este respecto, por ejemplo HERCEPTIN™ se administra con una dosis de carga inicial de 4 mg/kg de peso corporal y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg de peso corporal; RITUXAN™ se administra semanalmente a 375 mg/m2; SYNAGIS™ se administra por vía intramuscular a 15 mg/kg de peso corporal, etc. La invención proporciona un método para la entrega de un anticuerpo monoclonal a un mamífero, que comprende una etapa de administración al paciente de una composición farmacéutica de la invención.

La invención también proporciona formulaciones de la invención como se describe en este documento en las diversas modalidades para utilizar como medicamentos, por ejemplo para utilizar en la entrega de un anticuerpo a un mam ífero, o para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una o más de las enfermedades y trastornos descritos anteriormente.

El mamífero es preferiblemente un ser humano, pero también puede ser, por ejemplo, un caballo o una vaca o un perro o un gato. Los anticuerpos serán idealmente elegidos para comcidir con especies objetivo, por ejemplo un anticuerpo humano para la administración humana, un anticuerpo equmo para caballos, un anticuerpo canino para perros, etc. Si anticuerpos hospederos nativos no están disponibles entonces se puede lograr transferencia de la especificidad del anticuerpo de una especie a otra mediante la transferencia de residuos de CDR (y típicamente, además, uno o más residuos del marco) de un anticuerpo donante en un marco destinatario de la especie huésped, por ejemplo como en la humanización. Los anticuerpos equinizados, bovinizados, caninizados y felinizados son conocidos en la téenica. El anticuerpo se unirá a BAFFR desde las especies objetivo, pero también puede reaccionar de forma cruzada con BAFFR de otras especies.

La dosificación puede ser mediante un esquema de dosis única o un esquema múltiples dosis.

Los ingredientes para la formación de composiciones de la invención pueden ser suministrados en recipientes cerrados herméticamente.

Anticuerpo anti-BAFFR La invención se refiere a la formulación de los anticuerpos anti-BAFFR y más específicamente MOR6654 y MOR6654B.

Un anticuerpo adecuado que puede estar compuesto en las composiciones farmacéuticas de la invención es el anticuerpo recombinante humano MOR6654, caracterizado estructuralmente como se describe más adelante. La secuencia de aminoácidos VH de tal anticuerpo anti-BAFFR aislado se muestra en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos VL de tal anticuerpo anti-BAFFR aislado se muestra en la SEQ ID NO: 2. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de cadena pesada de dicho anticuerpo anti-BAFFR aislado se muestra en la SEQ ID NO: 9. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de cadena ligera de dicho anticuerpo anti-BAFFR aislado se muestra en la SEQ ID NO: 10. Otro ejemplo de secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de tales anticuerpos anti-BAFFR aislados son las codificadas por las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 12 respectivamente. Otro ejemplo de secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de los anticuerpos son las codificadas por las secuencias de ADN correspondientes contenidas en el plásmido pBW510 depositado por Novartis Pharma AG, Foro 1 , CH-4002 Basilea, Suiza, en DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemania el 29 de abril de 2009, con número de acceso DSM22542.

Otros anticuerpos anti-BAFFR que se pueden utilizar para preparar las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen anticuerpos anti-BAFFR, con aminoácidos que han sido mutados por supresión, inserción o sustitución de aminoácidos, sin embargo, no tienen más supresión, inserción o sustitución de 1 , 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en cualquiera de las regiones de cadena pesada o ligera descritas anteriormente. En una modalidad específica, tales cambios de aminoácidos sólo aparecen dentro de las regiones marco y/o constantes y las regiones CDR son 100% idénticas a las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 y las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6, 7, y 8, respectivamente; En una modalidad más específica, los cambios que se han hecho son solo sustituciones de aminoácidos conservadoras fuera de las regiones CDR.

Las sustituciones de aminoácidos conservadores son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la téenica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos fuera de las regiones CDR de un anticuerpo anti-BAFFR, pueden ser reemplazados por otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral, y el anticuerpo alterado puede ser probado para la función retenida, en particular, las mismas propiedades de unión a BAFFR.

Los anticuerpos típicamente pueden ser glicosilados. Glicanos ligados a N unidos al dominio CH2 de una cadena pesada, por ejemplo, pueden influir en la unión de C1 q y FcR, y los anticuerpos aglicosilados pueden tener menor o diferente afinidad por estos receptores. La estructura de glucano tambien puede afectar la actividad, por ejemplo diferencias en muerte celular mediada por el complemento pueden ser vistas en función del número de azúcares de galactosa (0, 1 o 2) en el extremo de una cadena biantenaria de glicano. Los glicanos de un anticuerpo preferiblemente no conducen a una respuesta inmunogénica humana después de la administración.

Adicionalmente o alternativamente, un anticuerpo puede ser hecho que tenga un tipo de alteración de la glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado o no fucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosil o un anticuerpo que tiene estructuras GIcNAc de bisección aumentada. Tales patrones de glicosilación alterados han demostrado que aumentan la capacidad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de anticuerpos. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una celula huésped con la maqumarla de glicosilación alterada. Las células con maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la téenica y se pueden utilizar como células huésped para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención para producir con ello un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1 , 176,195 de Hang, describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente interrumpido, que codifica una fucosiltransferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en tal línea celular exhiben hipofucosilación o están desprovistos de residuos de fucosil. Por lo tanto, en una modalidad, los anticuerpos anti-BAFFR que se incluyen en las composiciones farmacéuticas de la invención se producen por expresión recombinante en una línea celular que exhiben patrón de hipofucosilación o no fucosilación, por ejemplo, una línea celular de mamífero con expresión deficiente del gen FUT8 que codifica la fucosiltransferasa.

Tal como se usa en la presente, el término MOR6654 abarca cualquier tipo de patrón de glicosilación. En una modalidad específica, las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-BAFFR que consiste en MOR6654 tal como se produce en una línea celular que exhibe un patrón de hipofucosilación o no fucosilación, tal como MOR6654B, que exhiben patrón de no fucosilación (desprovisto de residuos de fucosil). La publicación PCT WO 03/035835 por Presta describe una línea celular CHO variante, células Lecl3, con una capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos unidos por Asn (297), resultando también en la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields et al. , (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 por Umana et al. describe líneas celulares modificadas genéticamente para expresar glicosil transferasas modificadoras de glicoproteínas (por ejemplo, beta (1 ,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas presenten estructuras de GIcNAc de bisección aumentada que resulta en actividad ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Eureka Therapeutics describe, además células de mamíferos CHO genéticamente modificadas capaces de producir anticuerpos con un patrón de glicosilación de mamífero alterado desprovisto de residuos de fucosil (http://www.eurekainc.com/about_us/ companyoverview.html).

Alternativamente, los anticuerpos anti-BAFFR se pueden producir en levaduras u hongos filamentosos modificados para el patrón de glicosilación tipo mamífero y capaces de producir anticuerpos que carecen de fucosa como patrón de glicosilación (véase, por ejemplo EP1 297172B1 )..

Otra modificación de los anticuerpos anti-BAFFR en este documento contemplado por la invención es la pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo, aumentar la vida media biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado aldehido de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se adhieren al anticuerpo o fragmento del mismo. La pegilación puede realizarse por una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo).

Tal como se utiliza en la presente, el término "polietilenglicol" se pretende que abarque cualquiera de las formas de PEG que han sido utilizadas para derivar otras proteínas, tales como mono (C1 -C 10) alcoxi-o ariloxi polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo a ser pegilado es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para proteínas de pegilación se conocen en la téenica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase por ejemplo, el documento EP 0, 154,316 por Nishimura, Y EP 0 401 384 por Ishikawa).

Cualquier otra modificación post-traduccional natural o no natural de anticuerpos anti-BAFFR (por ejemplo MOR6654) se contempla además como modalidades específicas de anticuerpos anti-BAFFR que podrían ser utilizados para preparar las composiciones farmacéuticas de la invención.

Los anticuerpos se pueden preparar en una forma libre de los productos con los que, naturalmente se asocian. Los componentes contaminantes del ambiente natural de un anticuerpo incluyen materiales tales como enzimas, hormonas, u otras proteínas de la célula huésped.

EJEMPLOS Preparación de anticuerpos anti-BAFFR El anticuerpo MOR6654 se une específicamente a BAFFR y tambien se describe en la solicitud internacional publicada como WO201 0/007082. Es un anticuerpo kappa de lgG1 humana obtenido a través de presentación en fagos. Sus cadenas pesada y ligera consisten en la SEQ ID NOs: 9 y 10. Las Tablas 1 y 2 a continuación resumen las características de secuencia de MOR6654.

TABLA 1 : Breve descripción de las secuencias enlistadas en el listado de secuencias de la Tabla 2 TABLA 2 Lisado de Secuencias Ejemplos de Formulaciones Una formulación líquida de alta concentración de MOR6654B se deseaba y así se realizaron los estudios de formulación. Una formulación líquida que comprende un azúcar, un agente regulador del pH y un tensoactivo fue estable y pudo mantener altas concentraciones de anticuerpos.

El anticuerpo puede ser producido en celulas huésped de mamífero, tales como, una línea de células CHO transfectadas con vectores de expresión que llevan secuencias codificadoras de cadena pesada y ligera bajo promotores de expresión adecuados.

El anticuerpo se produce preferiblemente en una línea celular de mamífero, por ejemplo, una línea de células CHO, modificado mediante el uso de, por ejemplo, la teenología Potelligent™ (BioWa, Inc.) que conduce a la expresión deficiente del gen FUT8 que codifica la fucosiltransferasa. El anticuerpo resultante es no fucosilado y designado aquí como MOR6654B.

El desarrollo de una formulación líquida de MOR6654B en un frasco o una jeringa precargada consistió de dos estudios. Se realizó una primera selección para definir los excipientes de la formulación. En una segunda selección, la formulación seleccionada se confirmó en el empaque primario final.

Estabilidad y Plan Analítico Los siguientes métodos analíticos se realizaron: Ensayo UV, HPLC de Cromatografía de Exclusión por Tamaño, Dispersión de Luz Dinámica, HPLC de Cromatografía de Intercambio Catiónico, HPLC de Cromatografía de Fase Inversa, Analizador ALP, Turbidez, valor de pH, Osmolaridad, MFI (Imágenes de Micro-Flujo), Viscosidad, Color, Inspección Visual.

Determinación de Estabilidad La estabilidad se determinó además despues de someter las formulaciones a ciertas condiciones de estrés, incluyendo agitación, ciclos de congelación-descongelación y exposición prolongada a la luz (1 mes a 40°C).

Método Turbidimétrico La turbidez se midió por un método turbidimétrico.

Las mediciones con turbidímetro de las muestras se realizaron siguiendo el manual de operaciones (Modelo 2100AN Manual de Instrumentos, Número: 47901 -88, Nov. 2006, 2da Edición 2). Al comienzo del análisis la curva de calibración para el instrumento se comprobó mediante el análisis de 5 muestras de calibración, incluyendo el agua. Si los valores medidos por el instrumento se encontraban dentro del 5% del valor estándar, que pasó la curva de calibración. Si cualquiera de los estándares fallaron los criterios de aceptación del 5%, entonces el instrumento fue recalibrado siguiendo el manual de operaciones. Después de calibrar el instrumento, las muestras se cargaron en tubos de 11 mm de fondo plano y se analizaron.

Método de Cromatografía de Exclusión Por Tamaño (SEC) En el método SEC utilizado para analizar las formulaciones líquidas, se utilizaron los siguientes parámetros: Columna: TSKgel G3000SWXL Regulador de pH de Análisis: K-fosfato 150 mM, pH 6.5+/-0.1 Tasa de flujo: 0.4 ml/min Temperatura de la columna: 30°C Detección: 210 nm Volumen de inyección: 10 mI Temperatura de la Muestra 5°C aprox.

Tiempo de Ejecución: 40 minutos.

Tasa de muestreo de Datos: 1 .0 puntos/segundo (paso de cromeleon = 1 .0) Método HPLC de Cromatografía de Intercambio Catiónico El primer paso para el análisis de muestra utilizando el método CEX HPLC fue para diluir todas las formulaciones a 10 mg/ml utilizando agua. El segundo paso fue tomar la muestra diluida de 10 mg/ml y diluir nuevamente con la fase móvil A a 3 mg/ml. Luego la muestra se cargó en el HPLC y se analizó.

Fase móvil: Fosfato de sodio 25 mM, pH 6.5 Fase móvil B: Fosfato de sodio 25 mM, NaCI 250 mM, pH 6.5 Tasa de flujo: 1.0 ml/min Temperatura de Columna: 30°C +/-2°C Temperatura de la Muestra 5°C +/-2°C Volumen de inyección: 40 mI Tiempo de Ejecución (min): 60 Detección: 215 nm Gradiente: Metodo HPLV RP El método HPLC RP utilizado para analizar las muestras LB-120 se realizó siguiendo los siguientes parámetros del método RP. El gradiente en el protocolo de prueba resultó en la proteína siendo eluida en el volumen vacío de columna.

Parámetros del Método Información de Columna: PoroShell 300SB-C8 Fase móvil A: 90% (v/v) H20 / 10% (v/v) ACN / 0.1 % (v/v) TFA Fase móvil B: 10% (v/v) H20 / 90% (v/v) ACN / 0.1 % (v/v) TFA Tasa de flujo: 2 ml/min Temperatura de la columna: 80 °C Detección: 210 nm Volumen de inyección: 5 mL Temperatura de la Muestra 5 °C aprox.

Tiempo de Ejecución: 6 minutos.

Gradiente: Metodo MFI Todas las muestras de estabilidad se ensayaron utilizando un Instrumento de Imagen Simple de Micro-Flujo de Proteína (IMF), modelo 4200 DPA con una celda de flujo estándar de 100 mm (1.6 mm, SP3 con recubrimiento de silano, Cat # 4002-002-001 ) y un objetivo 5x. La versión de software para el Software MFI View System fue 2-R2.6.2.21.2171 .

La configuración de instrumento y características seleccionadas incluidas: Límite de Partículas Rechazadas -seleccionado Partículas de Llenado - seleccionado (excepto T0) Volumen de Muestra: 0.5 i Volumen de Purga: 0.15 mi Volumen de Muestra Aproximado: 0.30 mi (auto calculado) En el día de la prueba, ya sea tres (prueba individual) o cuatro (prueba por duplicado) jeringas por cada condición se combinaron en tubos Nunc individuales de 15 mi (catálogo # 339651 ). Todo el trabajo se realizó en una campana de flujo laminar y se ensayaron muestras M FI sin diluir.

La corrida de las secuencias consistió en correr primeramente los controles con agua antes de cada muestra y el patrón para asegurar que los niveles de partículas fueran los adecuados (típicamente se encuentran por debajo de 600 partículas/ml o menos de 1 % de las partículas de la muestra/ml). Los flujos de agua de 30 mi o más se utilizaron entre muestras diferentes y entre las muestras y los patrones antes de la medición de los niveles de partículas del fondo (lectura de los controles). Si los blancos no arrojaban resultados aceptables, se administraba un flujo adicional suficiente y se analizaba otro blanco. Se utilizó un flujo de 10 mi de agua limpia entre las muestras replicadas y entre los patrones replicados para eliminar adecuadamente la cantidad de burbujas de aire y reducir el número total de partículas. Se utilizó agua Millipore tipo directo-Q 1 para el análisis de los blancos y para el lavado (filtración de 0.22 mieras, calidad 18.2 MW). Se utilizaron puntas de barrera tipo Neptuno de 1000 mI para depositar las muestras en sus respectivos puertos de entrada.

Cada secuencia de muestra contenía un número serial del NIST ( National Institute of Standard and Technology - Instituto Nacional de Estándares y Teenología) que certificaba que contenían partículas de 5.0 mm, los patrones contenían 3000 partículas/ml mayores o iguales a 3 mm de tamaño (Cat # CC05, lote 39588, Exp. julio de 2012) para determinar la reproducibilidad durante la corrida. Se hizo una lista del comportamiento de los patrones en la Tabla 3.

Tabla 3. Resumen del análisis de los patrones numerados según el NIST utilizando MFI El tamaño individual de las partículas se determinó mediante el empleo de una tecnica simple de medición de proteínas conocida como Diámetro Circular Equivalente (DCE). El DCE de un objeto se expresa en micrones y representa el diámetro de una esfera que ocupa la misma área de superficie bidimensional como la partícula.

La plataforma del producto de M FI convierte el área de un objeto en un valor de DCE usando las propiedades de conversión de las téenicas para evitar el error inherente que implica el llevar a cabo los cálculos directos basados en la medición de las dimensiones. Las técnicas de conversión se basan en un mapeo de todo el rango de tamaños del instrumento utilizando esferas trazables de poliestireno de acuerdo con el INST. Aunque la conversión se basa en esferas de poliestireno, la afirmación de los vendedores es que la operación única de la plataforma del producto MFI garantizará que los resultados obtenidos a partir del instrumento son insensibles respecto de las propiedades de las partículas de material. Por lo tanto, el instrumento no requiere calibración frente a tipos de muestras específicas para su correcto funcionamiento.

Método colorimétrico El color de la muestra fue analizado mediante un procedimiento de análisis estándar. El valor del color de cada muestra está registrado en la definición de color de la Farmacopea Europea (FE) (Tabla 4). Como un ejemplo, desde B1 hasta B9 es como se define a la escala de color café que se define en la Farmacopea Europea.

Tabla 4. Rango de color de la Farmacopea Europea Evaluación de la fotoestabilidad Las jeringas que contienen cada una de las cuatro formulaciones F1 -F4 como se describe en la Tabla 16 fueron sometidas a pruebas de fotoestabilidad. En general, se colocaron doce jeringas (tres por cada formulación) en la superficie de una caja cubierta con papel de impresora en blanco a una distancia de 3.5 pulgadas por debajo de la fuente de la lámpara. Las jeringas se colocaron en orden numérico como sigue (1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4) a alrededor de 1 pulgada (2.54 cm) de distancia. Las jeringas de los extremos (1 y 4) estuvieron cada una a 5 pulgadas de los extremos de la lámpara.

Las fuentes de luz fueron dos lámparas fluorescentes blancas frías (cada una GE Ecolux F20T12-CW-ECO, 20W) y dos lámparas fluorescentes de UV cercano cada una con distribuciones espectrales entre 320-400 nm, y 20 W. El tiempo de exposición a temperatura ambiente fue de 14 días para las lámparas fluorescentes blancas frías y de 88 horas para las lámparas de UV cercano.

Estudios de Agitación Se retiraron tres jeringas de cada una de las diferentes formulaciones a ser evaluadas de las condiciones de refrigeración y se agruparon en tubos cónicos de Nunc de 15 mi y fueron fijados individualmente a la plataforma de un agitador orbital Científico MaxQThermo 2000 y se agitaron a 150 rpm durante 24 horas bajo condiciones ambientales de luz y de temperatura.

Estudios de ciclos de congelación - descongelación (C/D) Se retiraron jeringas de cada una de las diferentes formulaciones a ser evaluadas de las condiciones de refrigeración y se agruparon en tubos cónicos de Nunc de 15 mi. Las muestras agrupadas se sometieron entonces a 5 ciclos de congelación (-20°C) y descongelación (usando agua a temperatura ambiente).

ESTUDIO I: Primer registro de formulaciones líquidas Se realizó un análisis de formulación inicial para una formulación líquida de MOR6654B por ejemplo, se hicieron pruebas de los diferentes reguladores del pH, estabilizantes, excipientes y valores de pH. Tambien se evaluaron unas pocas formulaciones para ganar experiencia en la selección del embalaje primario y para ganar experiencia en la estabilidad de la formulación líquida MOR6654B en los diferentes tipos de PFS (jeringas pre-llenadas).

Preparación de las muestras Las formulaciones fueron obtenidas utilizando un fármaco (MOR6654B) obtenido a partir de la línea celular CHO que expresa el anticuerpo monoclonal afucosilado a una concentración de 160 g/L en agua. El fármaco MOR6654B fue mezclado con una cantidad adecuada de una solución diluida de excipiente, filtrada estéril, depositada asépticamente en frascos estériles de vidrio de 1 mi o 6 mi PFS (volumen de llenado 0.7 mi) (volumen de llenado 3.6 mi) y reguladas con reguladores del pH lyo de Daikyo D21 -7S V10-F7-3WRS RB2-TR. Todas las formulaciones evaluadas tenían 100 g/L de MOR6654B.

Tabla 5: Lista de Formulaciones, Primer análisis de formulaciones líquidas de OR6654B (100 g/L) PP (empaque primario); HPbCD (hidroxipropil-b-ciclodextrina) ) i I i ! I 1 Resultados Las Tablas de Resultados para Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC-HPLC) Tabla 6. Pureza mediante Cromatografía de exclusión por tamaño de muestras bajo estres de congelamiento y descongelamiento Productos de Pico Productos de Formulación Aglomeración Principal Degradación 0.52 99.38 0.10 0.59 99.31 0.10 3 0.51 99.39 0.10 Productos de Pico Productos de Formulación Aglomeración Principal Degradación 4 0.62 99.29 0.08 5 0.62 99.29 0.10 6 1 .92 97.94 0.13 7 1.26 98.66 0.08 8 0.53 99.36 0.10 9 0.56 99.35 0.10 10 0.64 99.28 0.08 11 1 .75 98.15 0.10 12 0.56 99.38 0.07 13 0.51 99.40 0.09 14 0.72 99.19 0.08 15 0.56 99.35 0.09 16 0.56 99.36 0.09 Tabla 7. Pureza mediante Cromatografía de Exclusión por Tamaño de muestras bajo estrés de agitación Productos de Pico Productos de Formulación Aglomeración Principal Degradación 1 0.51 99.37 0.12 2 0.60 99.31 0.09 3 0.52 99.38 0.10 4 0.68 99.23 0.09 5 0.73 99.16 0.1 1 6 0.70 99.18 0.12 7 0.65 99.25 0.10 d 0.54 99.35 0.1 1 9 0.53 99.37 0.10 10 0.64 99.27 0.09 1 1 0.64 99.25 0.10 12 0.58 99.30 0.13 13 0.53 99.37 0.10 14 0.62 99.25 0.13 15 0.57 99.31 0.12 Productos de Pico Productos de Formulación Aglomeración Principal Degradación 16 0.58 99.30 0.12 Tabla 8. Pureza mediante Cromatografía de Exclusión por Tamaño de muestras bajo estres térmico (40°C) Productos de Pico Productos de Formulación Aglomeración Principal Degradación 1.09 95.84 3.07 2 1.05 95.93 3.02 3 1 .13 95.72 3.15 1.34 95.22 3.44 5 2.06 94.06 3.88 6 1 .58 94.77 3.65 7 1.33 95.75 2.92 8 1.13 95.75 3.12 9 0.90 95.89 3.21 10 1.24 95.78 2.98 Productos de Pico Productos de Formulación Aglomeración Principal Degradación 11 1 .45 95.48 3.07 12 1.14 95.81 3.05 13 1 .02 95.90 3.08 14 1 .21 95.63 3.17 15 1 .32 94.75 3.92 16 1.51 93.56 4.93 TABLA 9. Pureza por Cromatografía de Exclusión por Tamaño para tO, y muestras de estabilidad a 5°C Prod. de Prod. de Prod. de Pro. de Prod. de Prod. de ForAgióme- Agióme- Agióme- Degra- Degra- Degra-ma ración ración ración dación dación dación 3 meses a 6 meses a 3 meses a 6 meses TO TO 5°C 5°C 5°C a 5°C 0.46 0.53 0.54 0.1 0.09 0.12 0.54 0.62 0.61 0.09 0.07 0.1 1 Prod. de Prod.de Prod.de Pro.de Prod. de Prod. de For- Aglome- Agióme- Agióme- DegraDegraDegrama ración ración ración dación dación dación 3 meses a 6 meses a 3 meses a 6 meses T0 T0 5°C 5°C 5°C a 5°C 3 0.46 0.56 0.53 0.09 0.09 0.12 4 0.61 0.77 0.76 0.08 0.07 0.12 5 0.59 0.79 0.76 0.1 0.08 0.13 6 0.63 0.75 0.69 0.08 0.08 0.14 7 0.59 0.67 0.57 0.08 0.05 0.1 1 8 0.5 0.59 0.48 0.1 0.08 0.12 9 0.5 0.57 0.47 0.1 0.08 0.12 10 0.6 0.67 0.51 0.08 0.06 0.12 1 1 0.57 0.71 0.55 0.09 0.08 0.12 12 0.52 0.61 0.45 0.09 0.06 0.13 13 0.51 0.57 0.42 0.11 0.05 0.1 1 14 0.55 0.65 0.49 0.07 0.04 0.13 15 0.51 0.61 0.43 0.1 0.09 0.13 Prod. de Prod. de Prod. de Pro. de Prod. de Prod. de For- Aglome- Aglome- Aglome- Degra- Degra- Degra ma ración ración ración dación dación dación 3 meses a 6 meses a 3 meses a 6 meses TO TO 5°C a 5°C 16 0.53 0.64 0.44 0.09 0.07 0.14 TABLA 10. P ureza por Cromatografía de Exclusión por Tamaño para tO, y muestras de estabilidad a 25°C Prod. de Prod. de Prod. de Prod. de Prod. de Prod. de For- Aglome- Agióme- Agióme- Degra- DegraDegrama ración ración ración dación dación dación 3 meses a 6 meses a 3 meses a 6 meses No. T0 T0 25°C 25°C 25°C a 25°C 1 0.46 0.8 0.56 0.1 1.41 2.47 2 0.54 0.91 0.54 0.09 1.37 2.3 3 0.46 0.78 0.58 0.09 1.26 2.44 4 0.61 1.12 0.81 0.08 1.43 2.62 5 0.59 1.39 1.19 0.1 1 .6 2.73 6 0.63 1.1 0.83 0.08 1 .42 2.7 Prod. de Prod.de Prod. de Prod.de Prod.de Prod.de For- Aglome- Agióme- Agióme- Degra- Degra- Degrama ración ración ración dación dación dación 3 meses a 6 meses a 3 meses a 6 meses No. T0 T0 25°C 25°C 25°C a 25°C 7 0.59 0.97 0.57 0.08 1 .23 2.18 8 0.5 0.79 0.52 0.1 1 .34 2.36 9 0.5 0.75 0.29 0.1 1 .27 2.23 10 0.6 0.92 0.5 0.08 1.26 2.22 1 1 0.57 1.06 0.67 0.09 1 .31 2.23 12 0.52 0.84 0.54 0.09 1 .28 2.39 13 0.51 0.84 0.47 0.1 1 1.32 2.33 14 0.55 0.94 0.51 0.07 1 .4 2.38 15 0.51 0.94 0.77 0.1 1.55 3.32 16 0.53 1.08 0.93 0.09 1.82 3.42 TABLA 11. Variantes de Carga mediante Cromatografía de Intercambio Catiónico de Muestras bajo Estres de Congelamiento y Descongelamiento Form. Variantes Acidas Pico Principal Variantes Básicas 1 5.18 65.42 29.40 2 5.10 66.21 28.69 3 4.97 66.01 29.01 4 5.27 65.34 29.40 5 5.35 64.79 29.86 6 5.23 65.78 28.99 7 5.38 65.60 29.02 8 5.24 67.21 27.55 9 5.02 64.24 30.74 10 5.56 65.18 29.26 1 1 5.50 65.04 29.45 12 5.19 66.32 28.49 13 5.45 65.06 29.49 14 5.43 66.04 28.54 15 5.33 66.18 28.49 16 5.24 66.1 1 28.65 TABLA 12. Variantes de Carga mediante cromatografía de Intercambio catiónico de muestras bajo estres de agitación Form. Variantes Acidas Pico Principal Variantes Básicas 1 5.09 66.35 28.56 2 5.03 66.83 28.13 3 5.05 66.98 27.97 4 5.07 66.60 28.33 5 5.17 65.47 29.36 6 5.34 66.70 27.97 7 5.36 66.63 28.01 8 5.1 1 66.95 27.94 9 4.78 66.45 28.77 10 4.99 67.25 27.76 11 5.12 66.21 28.67 12 5.21 67.18 27.60 13 5.41 66.40 28.19 14 5.05 67.29 27.66 Form. Variantes Acidas Pico Principal Variantes Básicas 15 5.14 66.70 28.16 16 5.15 66.84 28.01 TABLA 13. Variantes de carga mediante cromatografía de intercambio catiónico bajo estrés térmico (40°C) Form. Variantes Acidas Pico Principal Variantes Básicas 1 13.41 59.24 27.35 2 12.00 61 .63 26.37 3 14.43 58.54 27.03 4 13.59 60.20 26.21 5 14.40 58.18 27.42 6 15.36 58.63 26.01 7 14 83 58 99 26 18 8 14.10 59.34 26.55 9 12.70 58.92 28.38 10 15.17 58.64 26.19 1 1 14.09 58.86 27.05 Form. Variantes Acidas Pico Principal Variantes Básicas 12 14.31 59.15 26.54 13 14.54 58.97 26.49 14 12.22 61 .15 26.62 15 15.01 58.21 26.79 16 16.54 56.43 27.03 TABLA 14. Variantes de carga mediante cromatografía de intercambio catiónico para tO, y muestras de estabilidad a 5°C Varían- Varían- Varían- VarianVarían- Varian¬ Forma tes tes tes tes tes tes Acidas Acidas Acidas Básicas Básicas Básicas 3 meses 6 meses 3 meses 6 meses No. T0 T0 a 5°C a 5°C a 5°C a 5°C 1 4.19 6.13 14.43 30.56 25.39 20.14 2 4.73 5.66 14.35 30.18 26.33 20.81 3 4.73 6.33 14.9 29.48 26.66 20.48 4 4.76 5.71 14.08 29.71 26.16 21 .53 5 4.8 5.91 14.47 30.69 27.66 20.82 Varían- Varían- Varían- Varían- Varían- Varian¬ Forma tes tes tes tes tes tes Acidas Acidas Acidas Básicas Básicas Básicas 3 meses 6 meses 3 meses 6 meses No. T0 T0 a 5°C a 5°C a 5°C a 5°C 6 4.97 6.22 15.73 29.1 26.14 21.2 7 4.68 5 5 14.33 29.15 25.69 21.45 8 4.75 5.99 14.98 29.12 25.91 20.77 9 4.71 5.54 14.13 30.48 25.89 21 .24 10 4.78 5.83 14.55 29.38 26.1 1 21 .12 11 4.89 5.82 14.04 30.24 26.39 21 .3 12 4.74 6.2 14.52 28.29 25.8 20.98 13 5.04 6.26 16.13 30.22 25.75 21.43 14 5.02 5.7 14.62 28 86 25 26 21.38 15 5.02 5.9 16.87 29 02 25 81 22.59 16 5.17 6.01 16.92 29.07 25.48 22.52 Tabla 15. Variantes de carga mediante cromatografía de intercambio catiónico para tO, y muestras de estabilidad a 25°C Varían- Varían- Varían- Varían- Varían- Varian¬ Forma tes tes tes tes tes tes Acidas Acidas Acidas Básicas Básicas Básicas 3 meses 6 meses 3 meses 6 meses No. TO TO a 25°C a 25°C a 25°C a 25°C 1 4.19 7.75 27.71 30.56 24.44 21 .16 2 4.73 6.81 22.26 30.18 25.64 20.38 3 4.73 6.81 24.95 29.48 24.38 20.28 4 4.76 8.02 24.73 29.71 24.96 20 5 4.8 7.67 28.55 30.69 23.86 21.46 6 4.97 7.36 25.94 29.1 24.86 18.62 7 4.68 7.05 31.1 29.15 23.96 20.23 8 4.75 7.85 27.67 29.12 24.73 20.93 9 4.71 7.72 29.52 30.48 24.65 19.3 10 4.78 7.87 27.61 29.38 24.76 20.33 11 4.89 8.7 36.3 30.24 23.58 19.85 12 4.74 7.24 25.53 28.29 24.91 20.58 13 5.04 7.41 24.77 30.22 24.14 19.91 Varían- Varían- VarianVarían- Varían- Varian¬ Forma tes tes tes tes tes tes Acidas Acidas Acidas Básicas Básicas Básicas 3 meses 6 meses 3 meses 6 meses No. T0 T0 a 25°C a 25°C a 25°C a 25°C 14 5.02 7.75 29.63 28.86 25.37 21.95 15 5.02 8.09 28.7 29.02 24.56 20.01 16 5.17 8.18 32.26 29.07 24.94 22.16 Resumen de Resultados, primera selección de formulación líquida Dieciseis formulaciones del anticuerpo monoclonal, MOR6654B, se colocaron en estabilidad hasta seis meses a 5°C y 25°C. Además, las mismas formulaciones se sometieron a estrés de agitación, ciclos repetidos de congelamiento/descongelamiento y estrés térmico (1 mes a 40°C). Se utilizó una amplia variedad de métodos analíticos biofísicos y bioquímicos para determinar si había diferencias entre las formulaciones en términos de estabilidad. Los datos SEC señalaron una diferencia en estabilidad entre las formulaciones probadas. En las muestras de estrés en agitación, la formulación 5 (pH 7 sin tensoactivo) mostró un mayor aumento de los productos de aglomeración, lo que demuestra el efecto beneficioso de polisorbato. Se registró un aumento más severo en el producto de la aglomeración ante estrés de congelamiento y descongelamiento en las formulaciones de cloruro de sodio y manitol.

El resultado de este primer estudio puede resumirse como sigue: El pH preferido es 6.0 El estabilizador no iónico probado, Trehalosa, es benéfico para la estabilidad de la formulación. El polisorbato 20 es benéfico para la estabilidad de la formulación evitando la formación de agregados.

ESTUDIO II: Segunda selección de formulaciones líquidas Formulación de anticuerpos anti-BAFFR Se evaluaron tres formulaciones (F1 , F2, y F3) de MOR6654B con una alta concentración de anticuerpos de 150 mg/ml y una formulación con una concentración de anticuerpo más baja de 20 mg/ml (F4) para la estabilidad. Las cuatro formulaciones F1 , F2, F3 y F4 se cargaron en una jeringa de vidrio siliconizado de 1.0 mi e incluyeron regulador de pH, azúcar, tensoactivo y aminoácido libre como se muestra en la Tabla 16.

TABLA 16. Composición de formulaciones experimentales Las muestras de cada formulación se prepararon y ensayaron para la estabilidad a tres temperaturas diferentes. Las cuatro formulaciones líquidas se colocaron bajo condiciones experimentales de almacenamiento y se ensayaron para la estabilidad tras el almacenamiento a 2°C-8°C en puntos de tiempo 0 (t0), y 2 meses (t2), 25°C en puntos de tiempo 0 (t0), y 2 meses (t2), 40°C en puntos de tiempo 0 (t0), y 2 meses (t2).

Además de almacenamiento a diversas temperaturas, las formulaciones se sometieron a una serie de condiciones de estres, tales como la exposición prolongada a la luz, agitación y múltiples ciclos de congelación-descongelación (F/T). Cada muestra se analizó utilizando una variedad de métodos.

Resultados y discusión, segunda detección de formulación Todas las cuatro formulaciones se ensayaron al mismo tiempo, dependiendo de la condición de estrés. En el punto de tiempo cero (tO), las mediciones se realizaron por duplicado, al igual que las mediciones efectuadas después de dos meses (t2). Todas las demás muestras sólo se analizaron con replicas individuales. Los resultados más relevantes se reportan a continuación.

Nefelometría La nefelometría es un método turbidimétrico utilizado para detectar la presencia de agregados solubles o para indicar opalescencia. La salida está en la lista en términos de unidades nefelométricas de turbiedad (NTU).

TABLA 17. Unidades nefelométricas de turbidez (NTUs)) para formulaciones MOR6654B almacenadas a 40°C durante un máximo de dos meses.

Los resultados de nefelometría muestran que la proteína es bastante estable de manera física, sin cambio aparente incluso después de dos meses a 40°C.

Sin ser sorprendente, el almacenamiento a temperaturas más bajas no produjo ningún cambio apreciable en los niveles NTU para cualquiera de las formulaciones (Tabla 18). No está claro porqué la formulación 3 exhibe un número más alto de NTUs.

TABLA 18. Unidades nefelométricas de turbidez (NTUs)) para formulaciones MOR6654B almacenadas a 40°C o 25°C durante dos meses.

TABLA 19. Unidades nefelométricas de turbiedad (NTUs)) para formulaciones de MOR6654B sometidas a estrés de agitación (agit.), múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento (F/T), y exposición prolongada a la luz (foto).

Por último, la nefelometría de las muestras sometidas a condiciones de estrés, tales como agitación, múltiples ciclos F/T, y exposición prolongada a la luz reveló sólo pequeños cambios en cualquiera de las formulaciones para cualquiera de las condiciones de estrés. Por ejemplo, la formulación 1 mostró un incremento de alrededor de 1 .5 NTU ante agitación y 1 NTU aprox. ante estrés F/T. Por comparación, el aumento de la formulación 2 fue menos de 1 NTU para cualquiera de estas condiciones de estrés. Del mismo modo, la formulación 4 de menor concentración, que también contiene sacarosa, muestra un ligero aumento de alrededor de 1 NTU ante agitación.

Mediciones de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) Cromatografía de Exclusión Por Tamaño (SEC) Se realizaron tres tipos de análisis de HPLC para estas muestras, comenzando con Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC). Hay una clara pérdida de monómero tal como se mide mediante SEC para las muestras almacenadas a 40°C durante uno o dos meses (Tabla 20).

TABLA 20. Pureza (en términos de porcentaje de monómero) mediante SEC-HPLC para muestras MOR6654B almacenadas a 40°C durante un máximo de dos meses.

Hay una perdida de alrededor de 7% - 8% de monómero tal como se mide mediante SEC para muestras almacenadas a 40°C durante uno o dos meses.

TABLA 21. P ureza (en términos de porcentaje de monómero) mediante SEC-HPLC SEC para muestras MOR6654B almacenadas a 4°C y 25°C durante dos meses.

Para muestras almacenadas a temperatura más baja, no hay perdida de monómero a 4°C y sólo una pequeña pérdida de aprox. 1 % a 25°C. Al considerar los efectos de las condiciones de estrés, hay una ligera disminución en todas las formulaciones tras la agitación y los ciclos de congelamiento y descongelamiento, pero hay una diferencia real entre las formulaciones. Tras la fotolisis, también hay una pequeña disminución en el contenido de monómero. Una vez más, las diferencias entre las formulaciones no son fácilmente evidentes.

TABLA 22. Unidades nefelométricas de turbiedad (NTUs)) para formulaciones de MOR6654B sometidas a estrés de agitación (agit.), múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento, y exposición prolongada a la luz (foto).

Mientras que un examen del contenido total de monómeros es útil, puede ser más útil tener en cuenta el perfil general de estabilidad. Las siguientes tablas han sido preparadas para resumir el porcentaje de cada pico observado en cada sitio. Para mayor comodidad, los picos se ordenan por su tiempo de retención relativo (RRT) para eliminar ligeras variaciones en tiempos de ejecución.

Tabla 23. Perfil general de estabilidad, medido mediante cromatografía de exclusión por tamaño para muestras de MOR6654B almacenadas a 40°C durante un máximo de dos meses.

No hubo ningún pico agregado de alto peso molecular detectado a tO (Tabla 23), y sólo tres impurezas encontradas, incluyendo el pico a TRR 0.88, que es presumiblemente un oligómero de algún tipo. Tras el almacenamiento a 40°C durante un mes o dos meses, hay una disminución sustancial en el contenido de monómero, con la mayoría de los productos de degradación de elución más tardía que el pico principal (Tabla 23). Esto indica que la fragmentación es más problemática que la aglomeración para estas formulaciones.

Para las muestras calentadas a 25°C durante dos meses, hay muy poca pérdida de monómero (<1 %) (Tabla 24). Esto sugiere que la energía de activación aparente de la vía de degradación principal es bastante grande, lo que sería coherente con la degradación hidrolítica. Los mismos dos picos de fragmentación se ven a RRT 1 .07 y 1.22, con el pico en 1 .07 un poco más grande en todas las muestras. De hecho, el RTT 1.22 es tan pequeño en las formulaciones 1 y 2, que éstas no se integraron en corridas. De lo contrario, sólo hay diferencias más pequeñas entre las formulaciones almacenadas a 25°C cuando se ensaya por SEC.

Tabla 24. Perfil general de estabilidad, medido por SEC para muestras de MOR6654B almacenadas a 25°C durante dos meses.

Para muestras almacenadas a 4°C durante dos meses, no hay prácticamente ninguna pérdida de monómero vista mediante cromatografía de exclusión por tamaño en cualquiera de los sitios (Tablas 23). Las cantidades de oligómero son casi idénticas para todas las formulaciones.

Cuando se examinan las diferentes condiciones de estrés (agitación, F/T, y pruebas de fotoestabilidad), poca degradación se observa por SEC. La agitación parece causar ninguna degradación química apreciable y ligeros aumentos en los niveles de oligómeros, al igual que ciclos repetidos de congelamiento y descongelamiento. Todas las formulaciones realizan más o menos lo mismo. Tras la exposición a la luz, los análisis SEC indican altos niveles de fragmentación para la formulación 3 (Tabla 26).

Tabla 25. Perfil general de estabilidad, medido por cromatografía de exclusión por tamaño para muestras de MOR6654B almacenadas a 4°C durante dos meses.

Tabla 26. Perfil general de estabilidad medido mediante cromatografía de exclusión por tamaño para formulaciones de MOR6654B sometidas a estres de agitación (agit ), múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento (F/T), y exposición prolongada a la luz (foto).

RP HPLC RP HPLC proporciona información sobre la degradación química que pueda estar ocurriendo en la proteína.

Como la degradación química parece estar ocurriendo en OR6654B, el análisis RP HPLC podría ser bastante informativo.

En tO, todas las cuatro formulaciones tienen una pureza de cerca de 99.9% por HPLC RP.

Despues de un mes de almacenamiento a 40°C, la pureza se reduce a aprox. 96%, a pesar de que la pureza era notablemente mayor para la formulación de 4. La disparidad de estos valores cuestiona si este valor es correcto (Tabla 27).

A los dos meses, todas las cuatro formulaciones han disminuido a alrededor de 94%, con pocas, si las hay, diferencias entre las formulaciones.

TABLA 27. Pureza de las formulaciones MOR6654B determinada por RP HPLC después de almacenamiento a 40°C durante hasta dos meses Tabla 28. Pureza de las formulaciones MOR6654B determinada por RP HPLC despues de almacenamiento a 4°C o 25°C durante dos meses El almacenamiento a 25°C durante dos meses produce una disminución en la pureza según RP HPLC a ~ 96.5% (Tabla 28). La pureza para las muestras almacenadas a 4°C no era tan diferente, con purezas cerca de 97%. Nuevamente, todas las formulaciones se comportaron de manera similar.

Al someter a condiciones de estrés, la pureza también disminuye. Para los estudios de agitación y congelamiento y descongelamiento, la pureza es de 97-98% aproximadamente para todas las formulaciones. Sin embargo, tras la exposición a la luz hay una mayor extensión de degradación. Las formulaciones de 150 mg/ml disminuyen a aproximadamente 94%, mientras que la formulación de 20 mg/ml disminuye todo el tiempo a <90%.

Tabla 29. Pureza determinada por RP HPLC de formulaciones OR6654B sometidas a estrés de agitación (agit.), múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento, y exposición prolongada a la luz (foto).

Al igual que con SEC, es útil examinar la aparición de productos de degradación, así como considerar la perdida del pico principal. Para las muestras almacenadas a 40°C, el perfil de degradación se resume en la Tabla 30. Sólo una impureza se ve en tO, pero múltiples especies se observan tras el almacenamiento a temperatura elevada. Parece que la pureza relativamente alta vista para la formulación 4 en el instante t1 se debía simplemente a no ver el pico a RRT 1 .19 (Tabla 30). En general, hay muy poca diferencia entre cualquiera de las cuatro formulaciones con respecto a perfil de estabilidad general tal como se mide por RP HPLC.

Tabla 30. Perfil de degradación de las formulaciones MOR6654B determinado por RP HPLC después de almacenamiento a 40°C durante un mes (negrilla) y dos meses (cursiva) Para muestras almacenadas a 25°C, hay dos productos de degradación principales que se eluyen después del pico principal (Tabla 31 ). El perfil de estabilidad para las cuatro formulaciones es esencialmente el mismo a 25°C cuando se ensaya usando RP HPLC. Del mismo modo, existe un perfil de degradación similar para las muestras almacenadas a 4°C (Tabla 32).

Tabla 31. Perfil de degradación de las formulaciones MOR6654B determinado por RP HPLC después de almacenamiento a 25°C durante tO y dos meses Tabla 32. Perfil de degradación de las formulaciones MOR6654B determinado por RP HPLC despues de almacenamiento a 4°C durante hasta dos meses Cuando las muestras se someten a agitación, sólo un producto de degradación aparece y los niveles son similares en todas las muestras (Tabla 33). La Formulación 4 parece ligeramente menos estable que las otras tres, posiblemente debido a la menor concentración de proteína. Los ciclos repetidos de congelamiento y descogelamiento también causan algún daño modesto como se ve por RP HPLC, con el perfil similar al observado para la agitación. Esto se ve repetidamente a lo largo del estudio, lo que indica que la sensibilidad interfacial de esta proteína puede verse si se hace una prueba o la otra. No parece haber una necesidad de llevar a cabo ambos para evaluar la sensibilidad global al estrés interfacial. Por último, la exposición a la luz crea algunas especies de elución temprana, que son probablemente fragmentos. De las cuatro formulaciones, los niveles de estas especies son más altos para la formulación 3 (Tabla 33).

Tabla 33. Perfil de degradación determinado por RP HPLC de formulaciones MOR6654B sometidas a estrés de agitación (agit), múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento (F/T), y exposición prolongada a la luz (foto).

Cromatografía de Intercambio Catiónico (CEX HPLC) El tercer metodo de HPLC utilizado para evaluar la estabilidad de las cuatro formulaciones MOR6654B es la cromatografía de intercambio catiónico (CEX). Este método está destinado a identificar los productos de degradación que difieren en carga del compuesto precursor. Inicialmente, todas las cuatro formulaciones muestran un amplio pico principal que comprende aproximadamente 98% del área total del pico (Tabla 34). Tras el almacenamiento a 40°C durante un mes, la pureza principal disminuye a aproximadamente 96%, con la formulación 4 que tiene una pureza ligeramente más alta (Tabla 34). Después de dos meses a 40°C, esta se ha reducido adicionalmente a aproximadamente 95%, con la formulación 1 , que muestra la más alta pureza.

Tabla 34. Pureza según lo determinado por HPLC de intercambio catiónico de las formulaciones MOR6654B después del almacenamiento a 40°C durante hasta dos meses Tabla 35. La pureza según lo determinado por CEX HPLC de las formulaciones MOR6654B despues del almacenamiento a 40°C durante hasta dos meses Para las formulaciones MOR6654B almacenadas durante dos meses a 25°C, la pureza disminuye de> 98% a 97%, con la formulación 4 siendo ligeramente, pero sólo un poco, más estable (Tabla 35). Cuando se almacena a 4°C durante la misma cantidad de tiempo, hay una cierta perdida en la pureza, similar a la que se vio con los datos de RP HPLC. Una vez más, no es claro por qué hay más o menos tanta degradación en las muestras a 4°C como a 25°C, pero la medida de la degradación es pequeña y todas las formulaciones MOR6654B se comportan aproximadamente, igual.

Tabla 36. Pureza determinada por CEX HPLC de formulaciones MOR6654B sometidas a estrés de agitación (agit), múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento (F/T), y exposición prolongada a la luz (foto).

Tras la agitación de ciclos repetidos de congelamiento / descongelamiento, hay una cierta pérdida basada en CEX HPLC, con todas las cuatro formulaciones comportándose igual (Tabla 36). La exposición prolongada a la luz produce muy poco daño por CEX HPLC, en contraste con lo que se ha visto con SEC y RP HPLC (Tablas 26 y 29, respectivamente). Esto sugiere que los productos de degradación generados por la luz no se diferencian en términos de carga del compuesto original.

Reducción de Electroforesis Capilar (RCE-SDS) El método de electroforesis capilar aquí permite observar la magnitud de los daños a la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC) del anticuerpo en forma independiente. Además, esto puede proporcionar una estimación de la cantidad de la proteína que no es LC y HC intacta, como se indica por el contenido no LC/HC. En tO, hay aproximadamente 25% LC y 70% HC en área de pico, no para corregir las diferencias en tamaño (Tabla 37), con el resto (~ 5%) explicado como especies no-LC/HC (Tabla 38).

Tabla 37. Porcentaje de LC y HC como se determinó por rCE-SDS en formulaciones MOR6654B almacenadas a 40°C durante hasta dos meses Despues de almacenamiento durante un mes a 40°C, las cantidades relativas de LC y HC han cambiado, con LC ahora representando ~27 % y HC entre 62 y 68% (Tabla 37). Esto indica que HC se está perdiendo. Esto se refleja en un marcado aumento en la cantidad de especies no LC/HC (Tabla 38), donde estas cantidades casi se han duplicado desde los niveles de pre- almacenamiento.

Tabla 38. Porcentaje de especies no LC/HC como se determinó por rCE-SDS en formulaciones MOR6654B almacenadas a 40°C durante hasta dos meses Al cabo de dos meses, hay aproximadamente 10% (o más) de las especies no LC/HC. Estos datos sugieren que la formulación 4 es más robusta, con el menor aumento porcentual en los niveles non LC/HC.

Tabla 39. Porcentaje de LC y HC como se determinó por rCE-SDS en formulaciones MOR6654B almacenadas a 4°C durante dos meses Cuando las muestras se almacenan a 4°C, todavía hay una cierta degradación vista por RCE-SDS, a medida que los niveles LC se elevan de ~ 25% a ~27% (Tabla 39). En este caso, la formulación 2 es la más estable con un pequeño aumento en las cantidades de las especies non LC/HC.

Tabla 40. Porcentaje de LC y HC como se determinó por rCE-SDS en formulaciones MOR6654B almacenadas a 25°C durante dos meses Cuando se almacena a 25°C durante dos meses, hay un aumento comparable en LC y la disminución del contenido de HC (Tabla 40). Los niveles de especies no LC/HC aumentan, pero casi tanto como para las muestras 40°C. De estos, la formulación 3 parece tener la estabilidad más pobre, pero las diferencias son pequeñas.

Tabla 41. Porcentaje de LC y HC según se determinó por rCE-SDS en formulaciones MOR6654B sometidas a estrés de agitación (agit.), múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento (F/T), y exposición prolongada a la luz (foto).

El último conjunto de muestras a ser analizadas por rCE-SDS fue aquel sometido a las tres diferentes condiciones de estrés (Tabla 41 ). Cuando las muestras se agitan o se exponen a ciclos de congelamiento y descongelamiento, no hay un aumento apreciable en especies no-LC/HC para cualquiera de las cuatro formulaciones MOR6654B. Esto es consistente con los otros hallazgos, que MOR6654B en estas formulaciones no es muy sensible al estrés interfacial. También refuerza la idea de que estas dos pruebas proporcionan evaluaciones comparables de la estabilidad interfacial. La exposición prolongada a la luz dio lugar a una cierta pérdida de HC y el aumento de los niveles no LC/HC (Cuadro 41 ). De estas formulaciones, la formulación 4 mostró los mayores cambios. Imágenes de Microflujo (MFI) En los últimos años ha habido un mayor enfoque en los niveles de partículas sub-visibles en los productos proteicos inyectables.

Como resultado, se han desarrollado un número de diferentes métodos analíticos. Uno de los más conocidos es la formación de imágenes de microflujo (MFI). Esta téenica se utilizó para medir el contenido de partículas sub-visibles (en términos de partículas por mi) dentro de los diferentes rangos de tamaño. Mientras que se recogieron los datos de hasta 100 mm en términos de tamaño, se presentan sólo los datos de hasta 25 pm. La reproducibilidad de los datos IFM es muy buena. La desviación estándar relativa promedio para mediciones por duplicado es de aproximadamente 5% .

Tabla 42. Contenido de sub-visible (en partículas/ml) según se mide usando IMF para formulaciones MOR6654B almacenadas a 40°C durante un mes (en negrilla) y dos meses (en cursiva). Las muestras en el instante t1 no se probaron por duplicado. De lo contrario, los valores reportados son promedios ± una desviación estándar.

A menudo, los datos resumidos del MFI reportados únicamente para el conteo total de partículas (en partículas por mi), pero esto puede ser engañoso, ya que los números están dominados por las partículas que se cuentan en el rango de tamaño 1 -2 pm. En este rango de tamaño, el aceite de silicona y las burbujas de aire son prominentes, y sesgan el conteo de partículas alejándolo de las partículas formadas en base a proteínas. Mientras se proporcionan estos números, lo mejor es mirar las partículas mayores de 2 pm, posiblemente superiores a 5 mm de tamaño. Además, para las muestras que reportan promedios y desviaciones estándar, estos son los resultados de corridas de duplicado.

Cuando se almacena a 40°C, el recuento de partículas sub visibles aumenta para todas las formulaciones (Tabla 42). De particular interés es la formulación 4, en donde el número total de partículas es inferior a 5.000 partículas por mi en tO, mucho menos que para la otra concentración más alta, las formulaciones. Después de un mes, todas las formulaciones ahora superan 20.000 partículas por mi, aunque el aumento para la formulación 3 es bastante pequeño (Tabla 42). A los dos meses, sólo la formulación 2 es inferior a 30.000 partículas por mi. La diferencia es aún más sorprendente para las partículas de 2-5 pm (donde esta formulación contiene menos de 5.000 partículas por mi) y 5-10 mm, donde los niveles son inferiores a 1 .000 partículas por mi, con sólo la formulación 1 cerca en términos de la cantidad total de partículas sub-visibles presentes.

Tabla 43. Contenido de sub-visible (en partículas/ml) según se mide usando IMF para formulaciones MOR6654B almacenadas a 25°C durante dos meses (en negrilla). Los valores reportados son promedios ± una desviación estándar.

Cuando las muestras MOR6654B se almacenan a 25°C durante dos meses, hay un aumento en las partículas sub-visibles en todas las formulaciones, aunque el aumento en la formulación 1 es muy pequeño (Tabla 43). Para la formulación 1 , sólo hay un modesto aumento de las partículas de 5 a 10 mm en tamaño. De lo contrario, no hay prácticamente ningún cambio. Mientras tanto, hay un aumento considerable en todas las otras formulaciones, especialmente en los intervalos de tamaño de 2 a 25 pm . En particular, las formulaciones 3 y 4 muestran aumentos significativos en la mayoría de los rangos de tamaños de los contenedores.

Para formulaciones MOR6654B almacenadas a 4°C durante dos meses hay poco cambio en los niveles de partículas sub-visibles. La formulación 1 muestra sólo un pequeño aumento de las partículas de 5-10 mm, con una ligera disminución en todos los otros intervalos de tamaño. Formulación 2 muestra sólo pequeños aumentos en los diferentes rangos de tamaño, mientras que la formulación 3 muestra una pequeña disminución en los niveles totales de partículas. En comparación, la formulación 4, que comenzó con una carga de partículas sub-visible muy baja (apenas por encima de la del agua pura), muestra un aumento significativo en las partículas por mi en todos los rangos de tamaño.

Cuando las formulaciones MOR6654B están sometidas a las condiciones de estres de agitación, ciclos de congelamiento y descongelamiento y exposición a la luz, hay grandes aumentos sólo para las muestras de fotoestabilidad (Cuadro 44). Tanto la agitación como los ciclos de congelamiento y descongelamiento causan sólo de pequeños a modestos aumentos en los niveles de partículas, sobre todo si se ignoran las partículas por debajo de 2 mm . Por otra parte, la exposición prolongada a la luz provoca que la formación de partículas sub-visibles se incremente notablemente (Cuadro 44). Esto es particularmente cierto para las formulaciones 3 y 4. En comparación, la formulación 1 muestra casi ningún cambio en la carga global de partículas sub-visibles.

Tabla 44. Contenido sub-visible (en partículas/ml) según se mide usando IMF para formulaciones MOR6654B sometidas a estres de agitación (en negrilla), múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento (en cursiva), y exposición prolongada a la luz (subrayado). Los valores reportados para tO son promedios ± una desviación estándar.

His (histidina); P20 (polisorbato 20); Arg (arginina) Colorimetría El último metodo analítico que se utilizó en este estudio de estabilidad fue la colorimetría. En tO, las cuatro formulaciones todas muestran un color marrón (Tabla 45), con una intensidad de color ligeramente diferente para la formulación más diluida (formulación 4). La incubación a 40°C durante uno o dos meses conduce a poco cambio en el color, aunque la formulación 4 muestra algunos cambios pequeños (Tabla 45). Cuando se almacena a temperaturas más bajas, hay poco o ningún cambio en el color (tabla 46). Cuando se somete a cualquiera de las condiciones de estres, el color sigue siendo el mismo (Tabla 47).

Tabla 45. El color de las formulaciones MOR6654B se almacenó a 40°C durante hasta dos meses Tabla 46. El color de las formulaciones MOR6654B almacenadas a 4°C y 25°C durante cero y dos meses Tabla 7. El color de las formulaciones MOR6654B sometidas a estrés de agitación (agit.), múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento (F/T), y exposición prolongada a la luz (foto).

RESUMEN Se utilizó una amplia variedad de métodos analíticos biofísicos y bioquímicos para determinar si había diferencias entre las formulaciones en términos de estabilidad. Entre las formulaciones seleccionadas para la segunda selección, poca diferencia se observó utilizando muchas de las téenicas analíticas. Sólo el almacenamiento a 40°C y la exposición prolongada a la luz causaron cualquier cantidad significativa de degradación. Mientras que todas las cuatro formulaciones fueron muy similares en términos de su perfil de estabilidad, la formulación 1 (150 mg/ml MOR6654B, sacarosa 220 mM, histidina 20 mM, 0,04% polisorbato 20, pH 6.0) mostró la menor propensión a degradarse en general según lo determinado por esta batería de métodos analíticos. La formulación 1 fue más estable en condiciones de estrés térmico y luz, menos propensa a la degradación y también fue más estable en términos de formación de partículas en el rango de partículas sub-visibles.

Claims (31)

REIVINDICACIONES

1. Una composición acuosa que tiene un pH de 5.0-7.0 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 18 a 165 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) un estabilizador, (iii) un agente regulador del pH, (iv) un tensoactivo, y opcionalmente, (v) un aminoácido.

2. La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 5.5-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 18 a 165 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) Sacarosa, trehalosa o manitol como un estabilizador, (iii) Histidina, citrato o succinato como un agente regulador del pH, (iv) polisorbato 20, poloxámero 188 o hidroxipropil-b-ciclodextrina como un tensoactivo, y, opcionalmente, (v) arginina como un aminoácido.

3. La composición acuosa de la reivindicación 1 o reivindicación 2 que comprende un anticuerpo anti-BAFFR en una concentración entre 20 mg/ml y 150 mg/ml.

4. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende sacarosa, manitol o trehalosa, en una concentración de entre 80 mM y 300 mM .

5. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende polisorbato 20 o poloxámero 188, en una concentración de entre 0.01 % y 0.1 % .

6. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende histidina, citrato o succinato, en una concentración de entre 5 mM y 50 mM.

7. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende arginina, particularmente arginina-HCI, en una concentración de entre 2 mM y 80 mM.

8. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende o trehalosa, en una concentración de entre 1 10 mM y 250 mM.

9. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende o trehalosa, en una concentración de entre 120 mM y 220 mM .

10. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende polisorbato 20 en una concentración de entre 0.02% y 0.06%.

1 1 . La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende histidina en una concentración de entre 15 mM y 25 mM.

12. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende arginina, particularmente arginina-HCI, en una concentración de entre 18 mM y 22 mM .

13. La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 5.5-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 18 a 165 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR 1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa, trehalosa o manitol 80 mM - 300 mM como un estabilizador, (iii) Histidina, citrato o succinato 5 mM - 50 mM como un agente regulador del pH, (iv) 0.01 % -0.1 % de polisorbato 20 o poloxámero 188, o hidroxipropil-b-ciclodextrina 1 mM - 3 mM como un tensoactivo, y, opcionalmente, (v) arginina 2 mM - 80 mM , particularmente arginina-HCI.

14. La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 5.5-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20 mg/ml - 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa, o trehalosa 1 10 mM - 250 mM como un estabilizador, (iii) histidina, citrato o succinato 15 mM -25 mM como un agente regulador del pH , (iv) 0.02% -0.06% de polisorbato 20 o poloxámero 188, o hidroxipropil-b-ciclodextrina 2 mM - 3 mM como un tensoactivo, y, opcionalmente, (v) arginina 2 mM -80 mM , particularmente arginina-HCI.

15. La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 5.5-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20 mg/ml - 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa, o trehalosa 120 mM - 220 mM como un estabilizador, (iii) histidina, citrato o succinato 18 mM - 22 mM como un agente regulador del pH , (iv) Flasta 0.02% - 0.06% de polisorbato 20 o poloxámero 188, o hidroxipropil-b-ciclodextrina 2.5 mM como un tensoactivo, y, opcionalmente, (v) arginina 2 mM - 80 mM , particularmente arginina-HCI.

16. La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 6.0-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti- BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa 220 mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH, (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo.

17. La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 6.0-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti- BAFFR incluye CDR 1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) trehalosa 220mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH , (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo.

18. La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 6.0-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo a nti - BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa 120 mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH , (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo, y (v) arginina 50 mM , particularmente arginina-HCI.

19. La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 6.0-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 150 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) trehalosa 120 mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH, (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo, y (v) arginina 50 mM , particularmente arginina-HCI.

20. La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 6.0-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) sacarosa 220 mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH, y (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo.

21 . La composición acuosa de la reivindicación 1 que tiene un pH de 6.0-6.5 y que comprende: (i) un anticuerpo anti-BAFFR en el que el anticuerpo tiene una concentración de 20 mg/ml, y en el que dicho anticuerpo anti-BAFFR incluye CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, (ii) trehalosa 220mM como un estabilizador, (iii) histidina 20mM como un agente regulador del pH, y (iv) 0.04% de polisorbato 20 como un tensoactivo.

22. La composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo anti-BAFFR comprende un dominio VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y un dominio VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

23. La composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo anti-BAFFR comprende una región de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; y una región de cadena ligera de la SEQ ID NO: 10.

24. La composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo anti-BAFFR es no fucosilado.

25. Un dispositivo de suministro que comprende la composición acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -24.

26. Un jeringa pre-cargada que comprende la composición acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -24.

27. Un método para la entrega de un anticuerpo anti-BAFFR a un mamífero, que comprende la etapa de administrar a dicho mam ífero una composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones 1 -24.

28. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones 1 -24, o el dispositivo de administración de la reivindicación 25, o la jeringa pre-cargada de la reivindicación 26, para usar en el tratamiento de una enfermedad o trastorno que es mediado por el receptor de BAFF o que se puede tratar al eliminar o agotar las células B.

29. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones 1 -24, o el dispositivo de administración de la reivindicación 25, o la jeringa pre-cargada de la reivindicación 26, para su uso en el tratamiento de una enfermedad autommune.

30. La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones 1 -24, o el dispositivo de administración de la reivindicación 25, o la jeringa pre-cargada de la reivindicación 26, para su uso en el tratamiento de un neoplasma de células B, tal como linfoma, leucemia o mieloma.

31 . La composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones 1 -24, o el dispositivo de administración de la reivindicación 25, o la jeringa pre-cargada de la reivindicación 26, para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, síndrome de Sjógren, o pénfigo vulgar.