BR112014024893B1

BR112014024893B1 - Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada que codifica um receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso, cars isolados ou purificados, vetores, métodos para destruir células cancerígenas e polinucleotídeo

Info

Publication number: BR112014024893B1
Application number: BR112014024893-1A
Authority: BR
Inventors: James Noble Kochenderfer
Original assignee: The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services
Priority date: 2012-04-11
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2021-03-30
Also published as: RU2650805C2; JP6359520B2; MX2014012222A; JP2018161140A; US10829769B2; IL263417B; US11066674B2; BR112014024893B8; US10829768B2; US11773396B2; AU2019203042B2; KR20200027047A; MX357823B; US10876123B2; KR20210032014A; JP2015513920A; US11377660B2; KR102086874B1; RU2018111462A3; CA2869562A1

Abstract

receptores de antígenos quiméricos direcionados a antígeno de maturação de célula b. a invenção proporciona uma sequência de ácido nucleico isolada e purificada que codifica um receptor de antígeno quimérico (car) direcionado contra antígeno de maturação de célula b (bcma). a invenção também proporciona células hospedeiras, tais como células t, ou células assassinas naturais (nk), que expressam o car, e métodos para destruição das células de mieloma múltiplo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA À PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 61/622.600, depositado em 11 de abril de 2012, que é incorporado por referência em sua totalidade aqui.

REFERÊNCIA POR INCORPORAÇÃO DE MATERIAL ELETRONICAMENTE SUBMETIDO

[0002] Incorporado por referência em sua totalidade aqui está uma listagem de nucleotídeo/sequência de aminoácido, legível por computador, submetida concorrentemente juntamente e identificada conforme segue: Um arquivo de 42.589 Byte ASCII (Texto) denominado "712361_ST25.TXT", criado em 14 de março de 2013.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] O mieloma múltiplo (MM) é uma malignidade caracterizada por um acúmulo de células de plasma clonal (ver, por exemplo, Palumbo et al., New England J. Med., 364(11): 1046-1060 (2011), e Lonial et al., Clinical Cancer Res., 17(6): 1264-1277 (2011)). As terapias atuais para MM frequentemente causam remissões, mas quase todos os pacientes eventualmente têm recaída e morrem (ver, por exemplo, Lonial et al., supra, e Rajkumar, Nature Rev. Clinical Oncol., 8(8): 479-491 (2011)). O transplante de célula tronco hematopoiética alogenéica tem se mostrado induzir eliminação mediada imune de células de mieloma; contudo, a toxicidade desta abordagem é alta, e poucos pacientes são curados (ver, por exemplo, Lonial et al., supra, e Salit et al., Clin. Lymphoma, Myeloma, e Leukemia, 11(3): 247-252 (2011)). Atualmente, não existem terapias de anticorpo monoclonal ou de célula T autóloga, aprovadas pelo FDA, clinicamente efetivas para MM (ver, por exemplo, Richardson et al., British J. Haematology, 154(6): 745-754 (2011), e Yi, Cancer Journal, 15(6): 502-510 (2009)).

[0004] A transferência adotiva de células T geneticamente modificadas para reconhecer antígenos associados a malignidade está se mostrando promissora como uma nova abordagem para tratamento de câncer (ver, por exemplo, Morgan et al., Science, 314(5796): 126129 (2006); Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008), Kershaw et al., Nature Reviews Immunology, 5(12): 928-940 (2005); e Pule et al., Nature Medicine, 14(11): 1264-1270 (2008)). As células T podem ser geneticamente modificadas para expressar receptores de antígenos quiméricos (CARs), que são proteínas de fusão compreendidas de uma fração de reconhecimento de antígeno e domínios de ativação de célula T (ver, por exemplo, Kershaw et al., supra, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), e Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol., 21(2): 215-223 (2009)).

[0005] Para as malignidades de linhagem de célula B, progresso extensive foi feito no desenvolvimento de abordagens de célula T adotiva que utilizam CARs de anti-CD19 (ver, por exemplo, Jensen et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation, 16: 1245-1256 (2010); Kochenderfer et al., Blood, 116(20): 4099-4102 (2010); Porter et al., The New England Journal of Medicine, 365(8): 725-733 (2011); Savoldo et al., Journal of Clinical Investigation, 121(5): 1822-1826 (2011), Cooper et al., Blood, 101(4): 1637-1644 (2003); Brentjens et al., Nature Medicine, 9(3): 279-286 (2003); e Kalos et al., Science Translational Medicine, 3(95): 95ra73 (2011)). As células T transduzidas por anti- CD19-CAR transferidas adotivamente têm curado leucemia e linfoma em camundongos (ver, por exemplo, Cheadle et al., Journal of Immunology, 184(4): 1885-1896 (2010); Brentjens et al., Clinical Cancer Research, 13(18 Pt 1): 5426-5435 (2007); e Kochenderfer et al., Blood, 116(19): 3875-3886 (2010)). Nos ensaios clínicos anteriores, as células T transferidas adotivamente transduzidas com CARs de anti-CD19 erradicadas normais e células B malignas em pacientes com leucemia e linfoma (ver, por exemplo, Kochenderfer et l., Blood, 116(20): 40994102 (2010); Porter et al., supra, Brentjens et al., Blood, 118(18): 48174828 (2011); e Kochenderfer et al., Blood, December 8, 2011 (epublication ahead of print (2012)). O CD19, contudo, é somente raramente expresso nas células de plasma malignas de mieloma múltiplo (ver, por exemplo, Gupta et al., Amer. J. Clin. Pathology, 132(5): 728-732 (2009); e Lin et al., Amer. J. Clin. Pathology, 121(4): 482-488 (2004)).

[0006] Desse modo, permanece uma necessidade de composições que possam ser usadas em métodos para tratar mieloma múltiplo. Esta invenção proporciona tais composições e métodos.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO

[0007] A invenção proporciona uma sequência de ácido nucleico isolada e purificada que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), no qual o CAR compreende uma fração de reconhecimento de antígeno e uma fração de ativação de célula T, e no qual a fração de reconhecimento de antígeno é direcionada contra Antígeno de Maturação de célula B (BCMA).

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DO(S) DESENHO(S)

[0008] As Figuras 1A e 1B são gráficos que representam os dados experimentais que ilustram o padrão de expressão de BCMA através de uma variedade de tipos de célula humana, conforme determinado usando PCR quantitativa. Os resultados são expressos como o número de cópias de cDNA de BCMA por 105 cópias de cDNA de actina.

[0009] As Figuras 2A a 2L são gráficos que representam os dados experimentais que ilustram que a expressão de BCMA de superfície de célula foi detectada em linhas de célula de mieloma múltiplo, mas não nos outros tipos de células, conforme descrito no Exemplo 1. Para todos os gráficos, a linha sólida representa coloração com anticorpos anti- BCMA, e a linha tracejada representa coloração com anticorpos de controle de isótipo combinado. Todos os gráficos foram cercados em células vivas.

[00010] A Figura 3A é um diagrama que representa um construto de ácido nucleico que codifica um CAR anti-BCMA. A partir do N-terminal para o C-terminal, o CAR anti-BCMA inclui um anti-BCMA scFv, as regiões de articulação e de transmembrana da molécula de CD8α, a porção citoplásmica da molécula de CD28, e a porção citoplásmica da molécula de CD3Z.

[00011] As Figuras 3B a 3D são gráficos que representam os dados experimentais que ilustram que o CAR anti-bcma1 CAR, o CAR anti- bcma2, e o CAR SP6 (descritos no Exemplo 2), são expressos na superfície de célula T. A coloração mínima de anti-Fab ocorreu em células não transduzidas (UT). Os gráficos são cercados de linfócitos de CD3+. Os números nos gráficos são as percentagens de células em cada quadrante.

[00012] As Figuras 4A a 4C são gráficos que representam os dados experimentais que ilustram as células T que expressam os CARs de anti-BCMA que retiram a granulação das células T em uma maneira específica de BCMA, conforme descrito no Exemplo 3. Os gráficos são cercados de linfócitos de CD3+ vivos. Os números nos gráficos são as percentagens de células em cada quadrante.

[00013] As Figuras 5A a 5D são gráficos que representam os dados experimentais que ilustram que as célula T que expressam os CARs de anti-BCMA retiram a granulação das células T em uma maneira específica de BCMA, conforme descrito no Exemplo 3. Os gráficos são cercados de linfócitos de CD3+ vivos. Os números nos gráficos são as percentagens de células em cada quadrante.

[00014] As Figuras 6A a 6C são gráficos que representam os dados experimentais que ilustram que as células T que expressam CARs de anti-BCMA produzem as citocinas IFNY, IL-2, e TNF em uma maneira específica de BCMA, conforme descrito no Exemplo 3. Os gráficos são cercados de linfócitos de CD3+ vivos. Os números nos gráficos são as percentagens de células em cada quadrante.

[00015] A Figura 7A é um gráfico que representa os dados experimentais que ilustram que as célula T que expressam o CAR de anti-bcma2 se proliferam especificamente em resposta ao BCMA. A Figura 6B é um gráfico que representa os dados experimentais que ilustram que as células T que expressam o CAR SP6não se proliferam especificamente em resposta ao BCMA.

[00016] As Figuras 7C e 7D são gráficos que representam os dados experimentais que ilustram que as célula T do Doador A que expressam o CAR de anti-bcma2 especificamente matam as linhas de célula de mieloma múltiplo H929 (Figura 6C) e RPMI8226 (Figura 6D) em um ensaio de citotoxicidade de quatro horas em várias razões de célula efetora: célula alvo. As células T transduzidas com o P6 CAR de controle negativo induzem níveis muito mais baixos de citotoxicidade em todas as razões efetoras: alvos. Para todas as razões efetoras: alvos, a citotoxicidade foi determinada em duplicata, e os resultados são revelados como a média +/- o erro padrão da média.

[00017] A Figura 8A é um gráfico que representa os dados experimentais que ilustram que o BCMA é expresso na superfície de células de mieloma múltiplo de medula óssea primária de Paciente 3 de Mieloma, conforme descrito no Exemplo 5. O gráfico é cercado de células de plasma de CD38alto CD56+, que compõem 40% das células de medula óssea.

[00018] A Figura 8B é um gráfico que representa os dados experimentais que ilustram que células T alogenéicas transduzidas com o CAR de anti-bcma2 de Doador C produzem IFNY após co-cultura com as células de medula óssea não manipuladas de Paciente 3 de Mieloma, conforme descrito no Exemplo 5. A Figura 7B também ilustra que as célula T a partir do mesmo doador alogenéico que expressa o CAR de anti-bcma2 produzem muito menos IFNY quando elas foram cultivadas com célula mononuclear de sangue periférico (PBMC) de Paciente 3 de Mieloma. Em adição, as células T do Doador C que expressam o CAR SP6 não reconhecem especificamente a medula óssea de Paciente 3 de Mieloma.

[00019] A Figura 8C é um gráfico que representa os dados experimentais que um plasmacitoma resectado de Paciente 1 de Mieloma consiste de 93% de células de plasma, e estas células de plasma primárias expressam BCMA, conforme revelado por citometria de fluxo para BCMA (linha sólida) e coloração de controle compatível com o isótipo (linha tracejada). O gráfico é cercado de células de plasma.

[00020] A Figura 8D é um gráfico que representa os dados experimentais que ilustram que as células T de Paciente 1 de Mieloma que expressam o CAR de anti-bcma2 produzem IFNy especificamente em resposta às células de plasmacitoma autólogas.

[00021] A Figura 8E é um gráfico que representa os dados experimentais que ilustram que as células T de Paciente 1 de Mieloma que expressam o CAR de anti-bcma2 matam especificamente as células de plasmacitoma autólogas em razões baixas de efetor para alvo. Em contraste, as célula T de Paciente 1 de Mieloma que expressam o CAR SP6 exibem baixos níveis de citotoxicidade contra células de plasmacitoma autólogas. Para todas as razões de efetor: alvo, a citotoxicidade foi determinada em duplicata, e os resultados são revelados como a média+/-o erro padrão da média.

[00022] A Figura 9A é um gráfico que representa os dados experimentais que ilustram que as células T transduzidas com o CAR de CAR anti-bcma2 podem destruir tumores de mieloma múltiplo estabelecidos em camundongos. A Figura 9B é um gráfico que representa a sobrevivência de camundongos suportando tumor tratados com células T que expressam o CAR de anti-bcma2, conforme comparado a controles.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00023] A invenção proporciona uma sequência de ácido nucleico isolada e purificada que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), no qual o CAR compreende uma fração de reconhecimento de antígeno e uma fração de ativação de célula T. Um receptor de antígeno quimérico (CAR) é uma proteína híbrida artificialmente construída, ou um polipeptídeo contendo um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo (por exemplo, um fragmento variável de cadeia simples (scFv)) ligado a domínio de sinalização de célula T ou a domínio de ativação de célula T. Os CARs têm a capacidade de redirecionar especificidade e reatividade de célula T em direção à um alvo selecionado em uma maneira não restrita-MHC-, explorando as propriedades de ligação de antígeno de anticorpos monoclonais. O reconhecimento de um antígeno não restrito-MHC dá às células T que expressam CARs a capacidade de reconhecer um antígeno independente do processamento de antígeno, desse modo, evitando um mecanismo maior de escape de tumor. Além disso, quando expressos em células T, os CARs vantajosamente não se dimerizam com cadeias alfa e beta de receptor de célula T endógena (TCR).

[00024] "Sequência de ácido nucleico" é pretendida para envolver um polímero de DNA ou de RNA, isto é, um polinucleotídeo, que pode ser de trançado único ou de trançado duplo, e que pode conter nucleotídeos não naturais ou alterados. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo", conforme aqui usados, se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ou ribonucleotídeos (RNA), ou desoxirribonucleotídeos (DNA). Estes termos se referem à estrutura primária da molécula, e, desse modo, incluem DNA de trançado duplo e de trançado único, e RNA de trançado duplo e de trançado único. Os termos incluem, como equivalentes, análogos de, ou RNA, ou DNA, produzidos de análogos de nucleotídeo e polinucleotídeos modificados, tais como, embora não limitados a, polinucleotídeos metilatados e/ou limitados.

[00025] Por "isolado" é significativo a remoção de um ácido nucleico de seu ambiente natural. Por "purificado" é significativo que um dado ácido nucleico, se um que tenha sido removido da natureza (incluindo DNA e mRNA genômicos), ou sintetizado (incluindo, cDNA), e/ou amplificado, sob condições de laboratório, aumentou de pureza, no qual "pureza" é um termo relativo, não "pureza absoluta". É para ser compreendido, contudo, que ácidos nucleicos e proteínas podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes, e ainda, para proposta prática, serem isolados. Por exemplo, os ácidos nucleico tipicamente são misturados com um transportador ou diluente aceitável quando usados para introdução nas células.

[00026] A sequência de ácido nucleico da invenção que codifica um CAR que compreende uma fração de reconhecimento de antígeno que é direcionada contra Antígeno de Maturação de célula B (BCMA, também conhecido como CD269). O BCMA é um membro da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (ver, por exemplo, Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192(1): 129-135 (2000), e Mackay et al., Annu. Rev. Immunol., 21: 231-264 (2003)). O BCMA se liga ao fator de ligação de célula B (BAFF) e a um ligante de indução de proliferação (APRIL) (ver, por exemplo, Mackay et al., supra, e Kalled et al., Immunological Reviews, 204: 43-54 (2005)). Entre as células não malignas, o BCMA foi reportado para ser expresso principalmente em células de plasma e subconjuntos de células B maturas (ver, por exemplo, Laabi et al., EMBO J., 11(11): 3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic acids Res., 22(7): 1147-1154 (1994); Kalled et al., supra; O’Connor et al., J. Exp. Medicine, 199(1): 91-97 (2004); e Ng et al., J. Immunol., 173(2): 807-817 (2004)). Os camundongos deficientes em BCMA são saudáveis, e têm números normais de células B, mas a sobrevivência de células de plasma de vida longa é prejudicada (ver, por exemplo, O’Connor et al, supra; Xu et al., Mol. Cell. Biol., 21(12): 4067-4074 (2001); e Schiemann et al., Science, 293(5537): 2111-2114 (2001)). O RNA do BCMA foi detectado universalmente em células de mieloma múltiplo, e a proteína de BCMA foi detectada na superfície de células de plasma de pacientes com mieloma múltiplo por vários investigadores (ver, por exemplo, Novak et al., Blood, 103(2): 689-694 (2004); Neri et al., Clinical Cancer Research, 13(19): 5903-5909 (2007); Bellucci et al., Blood, 105(10): 3945-3950 (2005); e Moreaux et al., Blood, 103(8): 3148-3157 (2004)).

[00027] A sequência de ácido nucleico da invenção que codifica um CAR que compreende uma fração de reconhecimento de antígeno contém um anticorpo monoclonal direcionado contra BCMA, ou uma porção de ligação de antígeno deste. O termo "anticorpos monoclonais", conforme aqui usado, se refere a anticorpos que são produzidos por um clone único de células B, e se ligam ao mesmo epítope. Em contraste, "anticorpos policlonais" se referem a uma população de anticorpos que são produzidos por células B diferentes, e se ligam a epítopes diferentes do mesmo antígeno. A fração de reconhecimento de antígeno do CAR codificado pela sequência de ácido nucleico da invenção pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de anticorpo. Um anticorpo completo tipicamente consiste de quatro polipeptídeos: duas cópias idênticas de um polipeptídeo de cadeia pesada (H), e duas cópias idênticas de um polipeptídeo de cadeia leve (L). Cada uma das cadeias pesadas contém uma região variável N-terminal (VH) e três regiões constantes C-terminais (CH1, CH2 e CH3), e cada cadeia leve contém uma região variável N-terminal (VL) e uma região constante C-terminal (CL). As regiões variáveis de cada par de cadeias leve e pesada formam o local de ligação de antígeno de um anticorpo. As regiões VH e VL têm a mesma estrutura geral, com cada região compreendendo quatro regiões de estrutura, cujas sequências são relativamente conservadas. As regiões de estrutura são ligadas por três regiões de determinação de complementaridade (CDRs). As três CDRs, conhecidas como CDR1, CDR2, e CDR3, formam a "região hipervariável" de um anticorpo, que é responsável pela ligação de antígeno.

[00028] Os termos "fragmento de um anticorpo", "fragmento de anticorpo", "fragmento funcional de um anticorpo", e "porção de ligação de antígeno", são usados intercambiavelmente aqui para significar um ou mais fragmentos ou porções de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (ver, geralmente, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). A fração de reconhecimento de antígeno do CAR codificado pela sequência de ácido nucleico da invenção pode conter qualquer fragmento de anticorpo de ligação de BCMA. O fragmento de anticorpo compreende, desejavelmente, por exemplo, uma ou mais CDRs, a região variável (ou porções desta), a região constante (ou porções desta), ou combinações destas. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a, (i) um fragmento Fab, que é um fragmento monovalente consistindo dos domínios de VL, VH, CL, e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, que é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fv consistindo dos domínios de VL e VH de um braço único de um anticorpo; (iv) um Fv (scFv) de cadeia simples, que é uma molécula monovalente consistindo dos dois domínios do fragmento Fv (isto é, VL e VH) ligada por um articulador sintético que capacita os dois domínios a serem sintetizados como uma cadeia de polipeptídeo simples (ver, por exemplo, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); e Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)) e (v) um diacorpo, que é um dímero de cadeias de polipeptídeo, no qual cada cadeia de polipeptídeo compreende um VH ligado a um VL por um articulador de peptídeo que é muito curto para permitir emparelhamento entre o VH e VL na mesma cadeia de polipeptídeo, acionando, desse modo, o emparelhamento entre os domínios complementares em cadeias de polipeptídeo de VH-VL diferentes, para gerar uma molécula dimérica tendo dois locais de ligação de antígeno funcionais. Os fragmentos de anticorpo são conhecidos na técnica, e são descritos em maiores detalhes em, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 2009/0093024 A1. Em uma concretização preferida, a fração de reconhecimento de antígeno do CAR codificado pela sequência de ácido nucleico da invenção compreende uma cadeia simples anti-BCMA Fv (scFv).

[00029] Uma porção de ligação de antígeno, ou fragmento de um anticorpo monoclonal, pode ser de qualquer tamanho, considerando-se que a porção se liga ao BCMA. Neste particular, uma porção de ligação de antígeno, ou fragmento do anticorpo monoclonal direcionado contra BCMA (também referido aqui como um "anticorpo monoclonal anti- BCMA"), desejavelmente compreende entre cerca de 5 e 18 aminoácidos (por exemplo, cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou uma faixa definida por qualquer dois dos valores precedentes).

[00030] Em uma concretização, a sequência de ácido nucleico da invenção codifica uma fração de reconhecimento de antígeno que compreende uma região variável de um anticorpo monoclonal anti- BCMA. A este respeito, a fração de reconhecimento de antígeno compreende uma região variável de cadeia leve, uma região variável de cadeia pesada, ou ambas uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo monoclonal anti- BCMA. Preferivelmente, a fração de reconhecimento de antígeno do CAR codificado por uma sequência de ácido nucleico da invenção compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo monoclonal anti-BCMA. As sequências de aminoácido de anticorpo monoclonal de cadeia pesada e leve que se ligam ao BCMA são reveladas em, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 2010/104949.

[00031] Em outra concretização, a sequência de ácido nucleico da invenção codifica um CAR que compreende uma sequência de sinal. A sequência de sinal pode estar posicionada no amino terminal da fração de reconhecimento de antígeno (por exemplo, a região variável do anticorpo anti-BCMA). A sequência de sinal pode compreender qualquer sequência de sinal adequada. Em uma concretização, a sequência de sinal é uma sequência de fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago humano (GM-CSF), ou uma sequência de sinal de CD8α.

[00032] Em outra concretização, o CAR compreende uma sequência de articulação. Um versado na técnica apreciará que uma sequência de articulação é uma sequência curta de aminoácidos que facilita a flexibilidade do anticorpo (ver, por exemplo, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)). A sequência de articulação pode estar posicionada entre a fração de reconhecimento de antígeno (por exemplo, um anti-BCMA scFv) e a fração de ativação de célula T. A sequência de articulação pode ser qualquer sequência adequada derivada ou obtida de qualquer molécula adequada. Em uma concretização, por exemplo, a sequência de articulação é derivada a partir da molécula de CD8α humana, ou de uma molécula de CD28.

[00033] A sequência de ácido nucleico da invenção codifica um CAR compreendendo uma fração de ativação de célula T. A fração de ativação de célula T pode ser qualquer fração adequada derivada obtida de qualquer molécula adequada. Em uma concretização, por exemplo, a fração de ativação de célula T compreende um domínio de transmembrana. O domínio de transmembrana pode ser qualquer domínio de transmembrana derivado ou obtido de qualquer molécula conhecida na técnica. Por exemplo, o domínio de transmembrana pode ser obtido ou derivado de uma molécula de CD8α, ou de uma molécula de CD28. A CD8 é uma glicoproteína de transmembrana que serve como um co-receptor para o receptor de célula T (TCR), e é expressa principalmente na superfície de células T citotóxicas. A forma mais comum de CD8 existe como um dímero composto de uma cadeia de CD8α e de CD8β. A CD28 é expressa nas células T, e proporciona sinais co-estimulatórios requeridos para ativação de célula T. A CD28 é o receptor para CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2). Em uma concretização preferida, a CD8α e CD28 são humanas.

[00034] Em adição ao domínio de transmembrana, a fração de ativação de célula T compreende adicionalmente domínio de sinalização de célula T intracelular (isto é, citoplásmico). O domínio de sinalização de célula T intracelular pode ser obtido ou derivado de uma molécula de CD28, uma molécula de CD3 zeta (Z), ou versões modificadas destas, uma cadeia gama de receptor Fc humano (FCRY), uma molécula de CD27, uma molécula OX40, uma molécula 4-1BB, ou outras moléculas de sinalização intracelular conhecidas na técnica. Conforme discutido acima, a CD28 é um marcador de célula T importante em co-estimulação de célula T. A CD3Z se associa com os TCRs para produzir um sinal e conter motivos de ativação à base de imunoreceptor de tirosina (ITAMs). 4-1BB, também conhecida como CD137, transmite um sinal co-estimulatório potente às células T, promovendo diferenciação e intensificação de sobrevivência de longo prazo de linfócitos T. Em uma concretização preferida, as CD28, CD3 zeta, 4-1BB, OX40, e CD27, são humanas.

[00035] O domínio de ativação de célula T do CAR codificado por uma sequência de ácido nucleico da invenção pode compreender qualquer um dos domínios de transmembrana antes mencionados e qualquer um ou mais dos domínios de sinalização de células T intracelulares antes mencionados em qualquer combinação. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico da invenção pode codificar um CAR compreendendo um domínio de transmembrana de CD28 e domínios de sinalização de células T intracelulares de CD28 e CD3 zeta. Alternativamente, por exemplo, a sequência de ácido nucleico da invenção pode codificar um CAR compreendendo um domínio de transmembrana de CD8α e domínios de sinalização de células T intracelulares de CD28, CD3 zeta, a cadeia gama de receptor Fc (FCRY), e/ou 4-1BB.

[00036] Em uma concretização, a sequência de ácido nucleico da invenção codifica um CAR que compreende, de 5’ a 3’, uma sequência de sinal de receptor de fator de estimulação de colônia de granulócito- macrófago (receptor de GM-CSF), um anti-BCMA scFv, as regiões de articulação e de transmembrana da molécula de CD8α humana, o domínio de sinalização de célula T citoplásmico da molécula de CD28 humana, e domínio de sinalização de célula T da molécula de CD3Z humana. Em outra concretização, a sequência de ácido nucleico da invenção codifica um CAR que compreende, de 5’ a 3’, uma sequência de sinal de CD8α humana, um anti-BCMA scFv, as regiões de articulação e de transmembrana da molécula de CD8α humana, os domínio de sinalização de célula T citoplásmico da molécula de CD28 humana, e domínio de sinalização de célula T da molécula de CD3Z humana. Em outra concretização, a sequência de ácido nucleico da invenção codifica um CAR que compreende, de 5’ a 3’, uma sequência de sinal de CD8α humana, um anti-BCMA scFv, as regiões de articulação e de transmembrana da molécula de CD8α humana, o domínio de sinalização de célula T citoplásmico da molécula de 4-1BB humana, e/ou o domínio de sinalização de célula T citoplásmico da molécula de OX40 humana, e domínio de sinalização de célula T da molécula de CD3Z humana. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico da invenção compreende ou consiste da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 3.

[00037] A invenção proporciona adicionalmente um receptor de antígeno quimérico isolado e purificado (CAR) codificado por uma sequência de ácido nucleico da invenção.

[00038] A sequência de ácido nucleico da invenção pode codificar um CAR de qualquer comprimento, isto é, o CAR pode compreender qualquer número de aminoácidos, provido que o CAR retém sua atividade biológica, por exemplo, a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno, detectar células adoecidas em um mamífero, ou tratar ou prevenir doença em um mamífero, etc. Por exemplo, o CAR pode compreender 50 ou mais (por exemplo, 60 ou mais, 100 ou mais, ou 500 ou mais) aminoácidos, mas menos do que 1.000 (por exemplo, 900 ou menos, 800 ou menos, 700 ou menos, ou 600 ou menos) aminoácidos. Preferivelmente, o CAR é cerca de 50 a cerca de 700 aminoácidos (por exemplo, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 400, cerca de 550, ou cerca de 650 aminoácidos), cerca de 100 a cerca de 500 aminoácidos (por exemplo, cerca de 125, cerca de 175, cerca de 225, cerca de 250, cerca de 275, cerca de 325, cerca de 350, cerca de 375, cerca de 425, cerca de 450, ou cerca de 475 aminoácidos), ou uma faixa definida por qualquer dois dos valores precedentes.

[00039] Incluídas no escopo da invenção estão sequências de ácido nucleico que codificam porções funcionais do CAR aqui descritas. O termo "porção funcional", quando usado em referência a um CAR, se refere a qualquer parte ou fragmento do CAR da invenção, cuja parte ou fragmento retém a atividade biológica do CAR do qual ele é uma parte (o CAR de origem). As porções funcionais envolvem, por exemplo, aquelas partes de um CAR que retêm a capacidade de reconhecer células alvos, ou detectar, tratar, ou prevenir uma doença, a uma extensão similar, à mesma extensão, ou a uma extensão mais alta, como o CAR de origem. Em referência a uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR de origem, a sequência de ácido nucleico que codifica uma porção funcional do CAR pode codificar uma proteína compreendendo, por exemplo, cerca de 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95%, ou mais, do CAR de origem.

[00040] A sequência de ácido nucleico da invenção pode codificar uma porção funcional de um CAR que contém aminoácidos adicionais no terminal amino ou carbóxi da porção, ou em ambos terminais, cujos aminoácidos adicionais não são encontrados na sequência de aminoácido do CAR de origem. Desejavelmente, os aminoácidos adicionais não interferem com a função biológica da porção funcional, por exemplo, reconhecer células alvos, detectar câncer, tratar ou prevenir câncer etc.. Mais desejavelmente, os aminoácidos adicionais intensificam a atividade biológica do CAR, conforme comparado à atividade biológica do CAR de origem.

[00041] A invenção também proporciona sequências de ácido nucleico que codificam variantes funcionais do CAR antes mencionado. O termo "variante funcional", conforme aqui usado, se refere a um CAR, um polipeptídeo, ou uma proteína tendo identidade de sequência substancial ou significante, ou similaridade ao CAR codificado por uma sequência de ácido nucleico da invenção, cuja variante funcional retém a atividade biológica do CAR do qual ele é uma variante. As variantes funcionais envolvem, por exemplo, aquelas variantes do CAR aqui descritas (o CAR de origem) que retêm a capacidade de reconhecer as células alvos a uma extensão similar, à mesma extensão, ou à uma extensão mais alta, como o CAR de origem. Em referência a uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR de origem, a sequência de ácido nucleico que codifica uma variante funcional do CAR pode ser, por exemplo, cerca de 10% idêntica, cerca de 25% idêntica, cerca de 30% idêntica, cerca de 50% idêntica, cerca de 65% idêntica, cerca de 80% idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, ou cerca de 99% idêntica, à sequência de ácido nucleico que codifica o CAR de origem.

[00042] Uma variante funcional pode, por exemplo, compreender a sequência de aminoácido do CAR codificado por uma sequência de ácido nucleico da invenção com pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa. A frase "substituição de aminoácido conservativa" ou "mutação conservativa" se refere a substituição de um aminoácido por outro aminoácido com uma propriedade comum. Um modo funcional para definir propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as frequências normalizadas de mudanças de aminoácido entre proteínas correspondentes de organismos homólogos (Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). De acordo com tal análise, grupos de aminoácidos podem ser definidos onde os aminoácidos dentro de um grupo trocam preferencialmente entre si, e, portanto, se assemelham entre si muito em seu impacto na estrutura de proteína total (Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., supra). Exemplos de mutações conservativas incluem substituição de aminoácido de aminoácidos dentro dos sub- grupos acima, por exemplo, lisina por arginina, e vice versa, tal que uma carga positiva pode ser mantida ácido glutâmico por ácido aspártico, e vice versa, tal que uma carga negativa pode ser mantida; serina por treonina, tal que um -OH livre pode ser mantido; e glutamina por asparagina, tal que um -NH2 livre pode ser mantido.

[00043] Alternativamente ou adicionalmente, as variantes funcionais podem compreender a sequência de aminoácido do CAR de origem com pelo menos uma substituição de aminoácido mão-conservativa. "Mutações não conservativas" envolvem substituição de aminoácido entre grupos diferentes, por exemplo, lisina por triptofano, ou fenilalanina por serina, etc. Neste caso, é preferível para a substituição de aminoácido não conservativa não interferir com, ou inibir a atividade biológica da variante funcional. A substituição de aminoácido não conservativa pode intensificar a atividade biológica da variante funcional, tal que a atividade biológica da variante funcional é aumentada conforme comparada ao CAR de origem.

[00044] A sequência de ácido nucleico da invenção pode codificar um CAR (incluindo porções funcionais e variantes funcionais deste) que compreende aminoácidos no lugar de um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente. Tais aminoácidos sintéticos são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, ácido aminociclohexano carboxílico, norleucina, a-aminoácido n-decanóico, homoserina, S-acetilaminometil- citeína, trans-3- e trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4- nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, β -fenilserina β-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolina-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4- tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico, ácido aminomalônico, ácido aminomalônico monoamida, N’-benzil-N’-metil-lisina, N’,N’-dibenzil- lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentano carboxílico, ácido a-aminociclohexano carboxílico, ácido a-aminocicloheptano carboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbomano)-carboxílico, ácido a,y- diaminobutírico, ácido α,β-diaminopropi0nico, homofenilalanina, e a- terc-butilglicina.

[00045] A sequência de ácido nucleico da invenção pode codificar um CAR (incluindo porções funcionais e variantes funcionais deste) que é glicosilatado, amidatado, carboxilatado, fosforilatado, esterificado, N- acilatado, ciclizado via, por exemplo, uma ponte de dissulfeto, ou convertido em um sal de adição ácido e/ou, opcionalmente, dimerizado ou polimerizado, ou conjugado.

[00046] Em uma concretização preferida, a sequência de ácido nucleico da invenção codifica um CAR que compreende ou consiste da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 12.

[00047] A sequência de ácido nucleico da invenção pode ser gerada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, sequências de ácido nucleico, polipeptídeos, e proteínas, podem ser recombinantemente produzidos usando metodologia de DNA recombinante padrão (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994). Adicionalmente, uma sequência de ácido nucleico sinteticamente produzida que codifica o CAR pode ser isolada e/ou purificada de uma fonte, tal como uma planta, uma bactéria, um inseto, ou um mamífero, por exemplo, um rato, um humano etc.. Métodos de isolamento e purificação são bem conhecidos na técnica. Alternativamente, as sequências de ácido nucleico aqui descritas podem ser comercialmente sintetizadas. Neste particular, a sequência de ácido nucleico da invenção pode ser sintética, recombinante, isolada, e/ou purificada.

[00048] A invenção também proporciona um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica o CAR da invenção. O vetor pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um cosmídeo, um vetor viral (por exemplo, retroviral ou adenoviral), ou um fago. Vetores e métodos adequados de preparação de vetor são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., supra, e Ausubel et al., supra).

[00049] Em adição a uma sequência de ácido nucleico da invenção que codifica o CAR, o vetor preferivelmente compreende sequências de controle de expressão, tais como promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores de transcrição, locais de entrada de ribossoma interno (IRES), e similares, que proporcionam a expressão da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira. Sequências de controle de expressão exemplares são conhecidas na técnica e descritas em, por exemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

[00050] Um grande número de promotores, incluindo promotores constitutivos, indutíveis, e repressíveis, de uma variedade de fontes diferentes, são bem conhecidos na técnica. Fontes representativas de promotores incluem, por exemplo, vírus, mamífero, inseto, planta, levedura, e bactéria, e promotores adequados destas fontes são prontamente disponíveis, ou podem ser produzidos sinteticamente, baseado nas sequências publicamente disponíveis, por exemplo, de depositários, tais como o ATCC, bem como outras fontes comerciais ou individuais. Os promotores podem ser unidirecionais (isto é, transcrição iniciada em uma direção) ou bi-direcional (isto é, transcrição iniciada em qualquer uma direção 3’ ou 5’). Exemplos não limitativos de promotores incluem, por exemplo, o sistema de expressão bacterial T7, sistema de expressão bacterial pBAD (araA), o promotor de citomegalovírus (CMV), o promotor SV40, e o promotor RSV. Os promotores indutíveis incluem, por exemplo, o sistema Tet (Patentes dos Estados Unidos 5.464.758 e 5.814.618), o sistema indutível de Ecdysone (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996)), o sistema T-REXTM (Invitrogen, Carlsbad, CA), Sistema LACSWITCH™ (Stratagene, San Diego, CA), e o sistema de recombinase indutível Cre-ERT tamoxifen (Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); Patente dos Estados Unidos 7.112.715; e Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)).

[00051] O termo "intensificador", conforme aqui usado, se refere a uma sequência de DNA que aumenta a transcrição de, por exemplo, a sequência de ácido nucleico a qual é operavelmente ligada. Os intensificadores podem estar localizados muitas quilobases distantes a partir da região de codificação da sequência de ácido nucleico, e podem mediar a ligação de fatores regulatórios, padrões de metilação de DNA, ou mudanças na estrutura de DNA. Um grande número de intensificadores de fontes diferentes de uma variedade de fontes diferentes são bem conhecidos na técnica, e são disponíveis como, ou dentro dos polinucleotídeos clonados (de, por exemplo, depositários, tais como o ATCC, bem como outras fontes comerciais ou individuais). Um número de polinucleotídeos compreendendo promotores (tal como o promotor de CMV comumente usado) também compreende sequências de intensificador. Os intensificadores podem estar localizados à montante, dentro de, ou à jusante das sequências de codificação. O termo "intensificadores de Ig" se refere a elementos de intensificador derivados de regiões intensificadoras mapeadas dentro do local de imunoglobulina (Ig) (tais intensificadores incluem, por exemplo, os intensificadores 5’ de cadeia pesada (mu), intensificadores 5’ de cadeia leve (kappa), intensificadores kappa e mu intrônico, e intensificadores 3’ (ver, geralmente, Paul W.E. (ed), Fundamental Immunology, 3a Edição, Raven Press, New York (1993), páginas 353- 363; e Patente dos Estados Unidos 5.885.827).

[00052] O vetor também pode compreender um "gene marcador selecionável". O termo "gene marcador selecionável", conforme aqui usado, se refere a uma sequência de ácido nucleico que permite que as células que expressam a sequência de ácido nucleico para ser especificamente selecionada para, ou contra, na presença de um agente seletivo correspondente. Os genes marcadores selecionáveis são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente Internacional WO 1992/08796 e WO 1994/28143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980); e Patentes dos Estados Unidos 5.122.464 e 5.770.359.

[00053] Em algumas concretizações, o vetor é um vetor de expressão epissomal" ou "epissoma", que é capaz de replicar em uma célula hospedeira, e persiste como um segmento extracromossomal de DNA dentro da célula hospedeira na presença de pressão seletiva apropriada (ver, por exemplo, Conese et al., Gene Therapy, 11: 17351742 (2004)). Os vetores de expressão epissomal comercialmente representativos incluem, mas não são limitados a, plasmídeos epissomais que utilizam Epstein Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA1) e a origem de Epstein Barr Virus (EBV) de replicação (oriP). Os vetores pREP4, pCEP4, pREP7, e pcDNA3.1 de Invitrogen (Carlsbad, CA) e pBK-CMV de Stratagene (La Jolla, CA) representam exemplos não limitativos de um vetor epissomal que usa antígeno T e a origem SV40 de replicação em vista de EBNA1 e oriP.

[00054] Outros vetores adequados incluem vetores de expressão de integração, que podem se integrar aleatoriamente no DNA da célula hospedeira, ou podem incluir um local de recombinação para capacitar a recombinação específica entre o vetor de expressão e o cromossomo da célula hospedeira. Tais vetores de expressão de integração podem utilizar as sequências de controle de expressão endógenas dos cromossomos da célula hospedeira para efetuar expressão da proteína desejada. Exemplos de vetores que se integram em uma maneira específica incluem, por exemplo, componentes do sistema flp-in de Invitrogen (Carlsbad, CA) (por exemplo, pcDNA™5/FRT), ou o sistema cre-lox, tal como pode ser encontrado nos pExchange-6 Core Vectors de Stratagene (La Jolla, CA). Exemplos de vetores que se integram aleatoriamente em cromossomos de célula hospedeira incluem, por exemplo, pcDNA3.1 (quando introduzidos na ausência de antígeno T) de Invitrogen (Carlsbad, CA), e pCI ou pFN10A (ACT) FLEXI™ de Promega (Madison, WI).

[00055] Vetores virais também podem ser usados. Vetores de expressão virais representativos incluem, mas não são limitados a, os vetores à base de adenovírus (por exemplo, o sistema Per.C6 à base de adenovírus disponível de Crucell, Inc. (Leiden, The Netherlands)), vetores à base de lentivírus (por exemplo, o pLP1 à base de lentiviral de Life Technologies (Carlsbad, CA)), e vetores retrovirais (por exemplo, o pFB-ERV plus pCFB-EGSH de Stratagene (La Jolla, CA)). Em uma concretização preferida, o vetor viral é um vetor de lentivírus.

[00056] O vetor compreendendo o ácido nucleico da invenção que codifica o CAR pode ser introduzido em uma célula hospedeira que é capaz de expressar o CAR assim codificado, incluindo qualquer célula procariótica ou eucariótica adequada. Células hospedeiras preferidas são aquelas que podem ser facilmente e seguramente crescidas, têm taxas de crescimento razoavelmente rápidas, têm sistemas de expressão bem caracterizados, e podem ser transformadas ou transfectadas facilmente e eficientemente.

[00057] Conforme aqui usado, o termo "célula hospedeira" se refere a qualquer tipo de célula que pode conter o vetor de expressão. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica, por exemplo, planta, animal, fungos, ou algas, ou pode ser uma célula procariótica, por exemplo, bactéria ou protozoário. A célula hospedeira pode ser uma célula cultivada, ou uma célula primária, isto é, diretamente isolada de um organismo, por exemplo, um humano. A célula hospedeira pode ser uma célula aderente, ou uma célula suspenda, isto é, uma célula que cresce em suspensão. As células hospedeiras adequadas são conhecidas na técnica, e incluem, por exemplo, células DH5α E. coli, células de ovário de hamster chinês, células VERO de macaco, células COS, células HEK293, e similares. Para proposta de amplificação ou replicação do vetor de expressão recombinante, a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, por exemplo, uma célula DH5a. Para a proposta de produção de um CAR recombinante, a célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero. A célula hospedeira, preferivelmente, é uma célula humana. A célula hospedeira pode ser de qualquer tipo de célula, pode ser originada de qualquer tipo de tecido, e pode ser de qualquer estágio de desenvolvimento. Em uma concretização, a célula hospedeira pode ser um linfócito de sangue periférico (PBL), uma célula mononuclear de sangue periférico (PBMC), ou uma assassina natural (NK). Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula assassina natural (NK). Mais preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula T. Métodos para seleção de células hospedeiras de mamífero adequadas e métodos para transformação, cultura, amplificação, classificação, e purificação de células, são conhecidos na técnica.

[00058] A invenção proporciona uma célula hospedeira isolada que expressa a sequência de ácido nucleico da invenção que codifica o CAR aqui descrito. Em uma concretização, a célula hospedeira é uma célula T. A célula T da invenção pode ser qualquer célula T, tal como uma célula T cultivada, por exemplo, uma célula T primária, ou uma célula T de uma linha de célula T cultivada, ou uma célula T obtida de um mamífero. Se obtida de um mamífero, a célula T pode ser obtida de numerosas fontes, incluindo, mas não limitadas a, sangue, medula óssea, nódulo linfático, o timo, ou outros tecidos ou fluidos. As células T podem também serem enriquecidas ou purificadas. A célula T preferivelmente é uma célula T humana (por exemplo, isolada de um humano). A célula T pode ser de qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo, mas não limitado a, uma célula T positiva dupla de CD4+/CD8+, uma célula T auxiliadora de CD4+, por exemplo, células Th1 e Th2, uma célula T de CD8+ (por exemplo, uma célula T citotóxica), uma célula de infiltração de tumor, uma célula T de memória, uma célula T naive, e similares. Em uma concretização, a célula T é uma célula T de CD8+, ou uma célula T de CD4+. As linhas de célula T são disponíveis de, por exemplo, a American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), e a German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), e incluem, por exemplo, células de Jurkat (ATCC TIB-152), células de Sup-T1 (ATCC CRL-1942), células de RPMI 8402 (DSMZ ACC-290), células de Karpas 45 (DSMZ ACC-545), e derivados destas.

[00059] Em outra concretização, a célula hospedeira é uma célula assassina natural (NK). As células NK são um tipo de linfócito citotóxico que desempenha um papel no sistema imune inato. As células NK são definidas como linfócitos granulares grandes, e constituem o terceiro tipo de células diferenciadas a partir do progenitor de linfóide comum que também dá ocorrência a linfócitos B e T (ver, por exemplo, Immunobiology, 5a ed., Janeway et al., eds., Garland Publishing, New York, NY (2001)). As células NK se diferenciam e maturam na medula óssea, nódulo linfático, baço, amígdalas, e timo. Em seguida a maturação, as células NK entram na circulação como linfócitos grandes com grânulos citotóxicos distintivos. As células NK são capazes de reconhecer e matar algumas células anormais, tais como, por exemplo, algumas células de tumor e células infectadas por vírus, e são pensadas serem importantes na defesa imune inata contra patogenias intracelulares. Conforme descrito acima com relação às células T, a célula NK pode ser qualquer célula NK, tal como uma célula NK cultivada, por exemplo, uma célula NK primária, ou uma célula NK de uma linha de célula NK cultivada, ou uma célula NK obtida de um mamífero. Se obtida de um mamífero, a célula NK pode ser obtida de numerosas fontes, incluindo, mas não limitadas a, sangue, medula óssea, nódulo linfático, o timo, ou outros tecidos ou fluidos. As células NK podem também serem enriquecidas ou purificadas. A célula NK, preferivelmente, é uma célula NK humana (por exemplo, isolada de um humano). As linhas de célula NK são disponíveis de, por exemplo, a American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), e incluem, por exemplo, células NK-92 (ATCC CRL-2407), células NK92MI (ATCC CRL-2408), e derivados destas.

[00060] A sequência de ácido nucleico da invenção que codifica um CAR pode ser introduzida em uma célula por "transfecção", "transformação", ou "transdução". "Transfecção", "transformação", ou "transdução", conforme aqui usado, se refere a introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos em uma célula hospedeira pelo uso de métodos físicos ou químicos. Muitas técnicas de transfecção são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio (ver, por exemplo, Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-dextran; eletroporação; transfecção mediada por lipossoma catiônico; bombardeio de micropartícula facilitado por partícula de tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); e co-precipitação de DNA com fosfato de estrôncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Vetores de fago ou virais podem ser introduzidos em células hospedeiras, após crescimento de partículas infeciosas em células de acondicionamento adequadas, muitas das quais são comercialmente disponíveis.

[00061] Sem estar ligado a uma teoria particular ou mecanismo, acredita-se que pela indução de uma resposta específica de antígeno contra BCMA, os CARs codificados por uma sequência de ácido nucleico da invenção proporcionam um ou mais dos seguintes: direcionamento e destruição de células de câncer que expressam BCMA, redução ou eliminação de células de câncer, facilitação de infiltração de células imunes ao(s) local(is) de tumor, e intensificação/extensão de respostas anti-cânceres. Desse modo, a invenção proporciona um método de destruição de células de mieloma múltiplo, que compreende contatar uma ou mais das células T isoladas antes mencionadas, ou células assassinas naturais, com uma população de células de mieloma múltiplo que expressam BCMA, pelo que o CAR é produzido e se liga à BCMA nas células de mieloma múltiplo, e as células de mieloma múltiplo são destruídas. Conforme aqui discutido, mieloma múltiplo, também conhecido como mieloma de célula de plasma ou doença de Kahler, é um câncer de células de plasma, que são um tipo de célula de sangue branca normalmente responsável pela produção de anticorpos (Raab et al., Lancet, 374: 324329 (2009)). O mieloma múltiplo afeta 1-4 por 100.000 pessoas por ano. A doença é mais comum em homens, e por razões ainda desconhecidas, é duas vezes mais comum em afroamericanos, como é em americanos caucasianos. O mieloma múltiplo é a malignidade hematológica menos comum (14%), e constitui 1% de todos os cânceres (Raab et al., supra). O tratamento de mieloma múltiplo tipicamente envolve quimioterapia de alta dose, seguida por transplante de célula tronco hematopoiética (alogenéica ou autóloga); contudo, uma alta taxa de recidiva é comum em pacientes de mieloma múltiplo que suportaram tal tratamento. Conforme discutido acima, o BCMA é altamente expresso por células de mieloma múltiplo (ver, por exemplo, Novak et al., supra; Neri et al., supra; Bellucci et al., supra; e Moreaux et al., supra).

[00062] Uma ou mais células T isoladas que expressam uma sequência de ácido nucleico da invenção que codifica o CAR anti-BCMA aqui descrito podem ser contatadas com uma população de células de mieloma múltiplo que expressam BCMA ex vivo, in vivo, ou in vitro. "Ex vivo" se refere a métodos conduzidos dentro de ou em células ou tecido em um ambiente artificial fora de um organismo com alteração mínima de condições naturais. Em contraste, o termo "in vivo" se refere a um método que é conduzido dentro de organismos vivos em seu estado normal, intacto, enquanto que um método "in vitro" é conduzido usando componentes de um organismo que foi isolado de seu contexto biológico usual. O método da invenção, preferivelmente, envolve componentes ex vivo e in vivo. Neste particular, por exemplo, as células T isoladas aqui descritas podem ser cultivadas ex vivo sob condições para expressar uma sequência de ácido nucleico da invenção que codifica o CAR anti- BCMA, e, em seguida, diretamente transferidas em um mamífero (preferivelmente, um humano) afetado pelo mieloma múltiplo. Tal método de transferência de célula é referido na técnica como "transferência de célula adotiva (ACT)", em que células derivadas imunes sejam passivamente transferidas em um novo hospedeiro recipiente para transferir a funcionalidade das células derivadas imunes doadoras ao novo hospedeiro. Os métodos de transferência de célula adotiva para tratar vários tipos de cânceres, incluindo cânceres hematológicos, tal como mieloma, são conhecidos na técnica, e revelados em, por exemplo, Gattinoni et al., Nat. Rev. Immunol., 6(5): 383-393 (2006); June, CH, J. Clin. Invest., 117(6): 1466-76 (2007); Rapoport et al., Blood, 117(3): 788-797 (2011); e Barber et al., Gene Therapy, 18: 509-516 (2011)).

[00063] A invenção também proporciona um método de destruição de células de linfoma de Hodgkin. O linfoma de Hodgkin (primeiramente conhecido como doença de Hodgkin) é um câncer do sistema imune que é marcado pela presença de um tipo de célula multinucleada denominadas células de Reed-Sternberg. Os dois maiores tipos de linfoma de Hodgkin incluem linfoma de Hodgkin clássico e linfoma de Hodgkin predominante de linfócito nodular. O linfoma de Hodgkin atualmente é tratado com terapia de radiação, quimioterapia, ou transplante de célula tronco hematopoiética, com a escolha de tratamento dependente da idade e do sexo do paciente, e do estágio, volume, e subtipo histológico da doença. A expressão de BCMA foi detectada na superfície de células de linfoma de Hodgkin (ver, por exemplo, Chiu et al., Blood, 109(2): 729-739 (2007)).

[00064] Quando as célula T ou células NK são administradas a um mamífero, as células podem ser alogenéicas ou autólogas ao mamífero. Nos métodos de administração "autólogo", as células (por exemplo, células tronco de formação de sangue, ou linfócitos) são removidas de um mamífero, armazenadas (e, opcionalmente, modificadas), e retornadas de volta ao mesmo mamífero. Nos métodos de administração "alogenéicos", um mamífero recebe as células (por exemplo, células tronco de formação de sangue, ou linfócitos) de um doador geneticamente similar, mas não idêntico. Preferivelmente, as células são autólogas ao mamífero.

[00065] As célula T ou células NK desejavelmente são administradas a um humano na forma de uma composição, tal como uma composição farmacêutica. Alternativamente, a sequência de ácido nucleico da invenção que codifica o CAR, ou um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica CAR, podem ser formulados em uma composição, tal como uma composição farmacêutica, e administrada a um humano. A composição farmacêutica da invenção pode compreender uma população de células T de células NK que expressam o CAR da invenção. Em adição a uma sequência de ácido nucleico da invenção, ou células hospedeiras que expressam o CAR da invenção, a composição farmacêutica pode compreender outros agentes farmaceuticamente ativos ou fármacos, tais como agentes quimioterapêuticos, por exemplo, asparaginase, busulfano, carboplatina, cisplatina, daunorubicina, doxorubicina, fluorouracila, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. Em uma concretização preferida, a composição farmacêutica compreende uma célula T isolada ou célula NK que expressam o CAR da invenção, mais preferivelmente, uma população de células T ou células NK que expressam o CAR da invenção.

[00066] As células T ou células NK da invenção podem ser proporcionadas na forma de um sal, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Os sais de adição ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos minerais, tais como ácidos hidroclóricos, ácidos hidrobrômicos, ácidos fosfóricos, ácidos metafosfóricos, e ácidos sulfúricos, e ácidos orgânicos, tais como, ácido tartárico, ácido acético, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido benzóico, ácido glicólico, ácido glucônico, ácido succínico, e ácido arilsulfônico, por exemplo, ácido p-toluenosulfônico.

[00067] A escolha do transportador será determinada pela sequência de ácido nucleico da invenção particular, vetor, ou células hospedeiras, que expressam o CAR, bem como pelo método particular usado para administrar uma sequência de ácido nucleico da invenção, vetor, ou células hospedeiras, que expressam o CAR. Consequentemente, existe uma variedade de formulações adequadas da composição farmacêutica da invenção. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter conservantes. Os conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sódio, e cloreto de benzalcônio. Uma mistura de dois ou mais conservantes opcionalmente pode ser usada. O conservante ou misturas deste estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,0001% a cerca de 2% por peso da composição total.

[00068] Em adição, agentes de tamponamento podem ser usados na composição. Agentes de tamponamento adequados incluem, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fosfato de potássio, e vários outros ácidos e sais. Uma mistura de dois ou mais agentes de tamponamento opcionalmente podem ser usados. O agente de tamponamento ou misturas destes estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 4% por peso da composição total.

[00069] Os métodos para preparação de composições administráveis (por exemplo, parenteralmente administráveis) são conhecidos àqueles técnicos no assunto e são descritos em maiores detalhes em, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (1 de maio de 2005).

[00070] A composição compreendendo a sequência de ácido nucleico da invenção que codifica o CAR, ou células hospedeiras que expressam o CAR, pode ser formulada como um complexo de inclusão, tal como complexo de inclusão de ciclodextrina, ou como um lipossoma. Os lipossomas podem servir para direcionar as células hospedeiras (por exemplo, células T ou células NK), ou a sequência de ácido nucleico da invenção para um tecido particular. Os lipossomas também podem ser usados para aumentar a meia-vida de uma sequência de ácido nucleico da invenção. Muitos métodos são disponíveis para preparação de lipossomas, tais como aqueles descritos em, por exemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), e Patentes dos Estados Unidos 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028, e 5.019.369.

[00071] A composição pode empregar sistemas de distribuição de liberação de tempo liberado, de liberação retardada, e de liberação sustentada, tal que a distribuição da composição da invenção ocorre antes de, e com tempo suficiente para causar sensibilização do local a ser tratado. Muitos tipos de sistemas de distribuição de liberação são disponíveis e conhecidos àqueles técnicos no assunto. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas da composição, aumentando, desse modo, a conveniência ao indivíduo e ao médico, e podem ser particularmente adequados para certas concretizações da composição da invenção.

[00072] A composição desejavelmente compreende as células hospedeiras que expressam a sequência de ácido nucleico da invenção que codifica um CAR, ou um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico da invenção, em uma quantidade que é efetiva para tratar ou prevenir mieloma múltiplo, ou linfoma de Hodgkin. Conforme aqui usado, os termos "tratamento", "tratando", e similares, se referem a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico adequados. Preferivelmente, o efeito é terapêutico, isto é, o efeito cura parcialmente ou completamente uma doença e/ou sintoma adverso atribuível à doença. Para esta finalidade, o método da invenção compreende administrar uma "quantidade terapeuticamente efetiva" da composição compreendendo as células hospedeiras que expressam a sequência de ácido nucleico da invenção que codifica um CAR, ou um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente efetiva" se refere a uma quantidade efetiva, em dosagens, e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado terapêutico desejado. A quantidade terapeuticamente efetiva pode variar de acordo com fatores, tais como o estágio da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do CAR induzir uma resposta desejada no indivíduo. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente efetiva de CAR da invenção é uma quantidade que se liga ao BCMA em células de mieloma múltiplo, e as destrói.

[00073] Alternativamente, o efeito farmacológico e/ou fisiológico pode ser profilático, isto é, o efeito previne completamente ou parcialmente uma doença ou sintoma da mesma. Neste particular, o método da invenção compreende administrar uma "quantidade efetiva profilática" da composição compreendendo as células hospedeiras que expressam uma sequência de ácido nucleico da invenção que codifica um CAR, ou um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico da invenção, a um mamífero que é predisposto a mieloma múltiplo ou linfoma de Hodgkin. Uma "quantidade profilaticamente efetiva" se refere a uma quantidade efetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado profilático desejado (por exemplo, prevenção de começo de doença).

[00074] Uma quantidade típica de células hospedeiras administrada a um mamífero (por exemplo, um humano) pode ser, por exemplo, na faixa de um milhão a 100 bilhões de células; contudo, quantidades abaixo de ou acima desta faixa exemplar estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, a dose diária de células hospedeiras da invenção pode ser cerca de 1 milhão a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 5 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 1 bilhão de células, cerca de 5 bilhões de células, cerca de 20 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 bilhões de células, ou uma faixa definida por qualquer dois dos valores precedentes), preferivelmente cerca de 10 milhões a cerca de 100 bilhões de células (por exemplo, cerca de 20 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 milhões de células, cerca de 60 milhões de células, cerca de 70 milhões de células, cerca de 80 milhões de células, cerca de 90 milhões de células, cerca de 10 bilhões de células, cerca de 25 bilhões de células, cerca de 50 bilhões de células, cerca de 75 bilhões de células, cerca de 90 bilhões de células, ou uma faixa definida por qualquer dois dos valores precedentes), mais preferivelmente cerca de 100 milhões de células a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 120 milhões de células, cerca de 250 milhões de células, cerca de 450 milhões de células, cerca de 800 milhões de células, cerca de 350 milhões de células, cerca de 650 milhões de células, cerca de 900 milhões de células, cerca de 3 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 45 bilhões de células, ou uma faixa definida por qualquer dois dos valores precedentes).

[00075] A eficácia terapêutica ou profilática pode ser monitorada por avaliação periódica de pacientes tratados. Para administrações repetidas por vários dias ou mais longos, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que uma supressão desejada de sintomas de doença ocorra. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis, e estão dentro do escopo da invenção. A dosagem desejada pode ser distribuída por uma administração de massa única da composição, por administração de massa múltipla da composição, ou por administração por infusão contínua da composição.

[00076] A composição compreendendo as células hospedeiras que expressam a sequência de ácido nucleico que codifica CAR da invenção, ou um vetor compreendendo sequência de ácido nucleico que codifica CAR da invenção, pode ser administrado a um mamífero usando técnicas de administração padrões, incluindo, administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdermal, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, ou por supositório. A composição preferivelmente é adequada para administração parenteral. O termo "parenteral", conforme aqui usado, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal, e intraperitoneal. Mais preferivelmente, a composição é administrada a um mamífero usando distribuição sistêmica periférica por injeção intravenosa, intraperitoneal, ou subcutânea.

[00077] A composição compreendendo as células hospedeiras que expressam sequência de ácido nucleico que codifica CAR da invenção, ou um vetor compreendendo sequência de ácido nucleico que codifica CAR da invenção, pode ser administrada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, que podem ser co-administrados ao mamífero. Por "co-administração" é significativo administrar um ou mais agentes terapêuticos adicionais e a composição compreendendo as células hospedeiras da invenção, ou o vetor da invenção, suficientemente próximos em tempo tal que o CAR da invenção pode intensificar o efeito de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou vice versa. Neste particular, a composição compreendendo as células hospedeiras da invenção, ou o vetor da invenção, pode ser administrado primeiro, e os um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados em segundo lugar, ou vice versa. Alternativamente, a composição compreendendo as células hospedeiras da invenção, ou o vetor da invenção, e o um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados simultaneamente. Um exemplo de um agente terapêutico que pode ser co-administrado com a composição compreendendo as células hospedeiras da invenção, ou o vetor da invenção, é IL-2.

[00078] Uma vez que a composição compreendendo células hospedeiras que expressam sequência de ácido nucleico que codifica CAR da invenção, ou um vetor compreendendo sequência de ácido nucleico que codifica CAR da invenção, é administrado a um mamífero (por exemplo, a humano), a atividade biológica do CAR pode ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica. De acordo com o método da invenção, o CAR se liga ao BCMA nas células de mieloma múltiplo, e as células de mieloma múltiplo são destruídas. A ligação do CAR ao BCMA na superfície de células de mieloma múltiplo pode ser ensaiada usando qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, ELISA e citometria de fluxo. A capacidade do CAR destruir as células de mieloma múltiplo pode ser medida usando qualquer método adequado conhecido na técnica, tal como ensaios de citotoxicidade descritos em, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), e Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). A atividade biológica do CAR também pode ser medida por ensaio de expressão de certas citocinas, tais como CD107a, IFNY, IL-2, e TNF.

[00079] Um versado na técnica apreciará prontamente que a sequência de ácido nucleico que codifica CAR da invenção pode ser modificada em qualquer número de modos, tal que a eficiência terapêutica ou profilática do CAR seja aumentada através da modificação. Por exemplo, o CAR pode ser conjugado, ou diretamente, ou indiretamente, através de um articulador a uma fração alvo. A prática da conjugação de compostos, por exemplo, o CAR, para direcionamento de frações, é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995), e Patente dos Estados Unidos 5.087.616.

[00080] Os seguintes exemplos adicionalmente ilustram a invenção, mas, naturalmente, não devem ser construídos como de qualquer modo limitando o seu escopo. EXEMPLO 1

[00081] Este exemplo demonstra o padrão de expressão de BCMA em células humanas.

[00082] A reação de cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) foi realizada em um painel de amostras de cDNA de uma ampla faixa de tecidos normais incluídos no painel II de qPCR de Tecido Humano Maior (Origine Technologies, Rockville, MD) usando um prímer específico de BCMA e conjunto de sondas (Life Technologies, Carlsbad, CA). O cDNA das células de um plasmacitoma que foi ressecado de um paciente com mieloma múltiplo avançado foi analisado como um controle positivo. O RNA foi extraído a partir das células de plasmacitoma com um mini kit RNeasy (Qiagen, Inc., Valencia, CA), e cDNA foi sintetizado usando métodos padrões. Uma curva padrão para o qPCR do BCMA foi criada por diluição de um plasmídeo que codifica o cDNA do BCMA de comprimento total (Origine Technologies, Rockville, MD) em DNA transportador. A qPCR detecta precisamente números de cópia de 102 a 109 cópias de BCMA por reação. O número de cópias de cDNA de β- actina nos mesmos tecidos foi quantificado com um kit de Taqman β- actina prímer e sonda (Life Technologies, Carlsbad, CA). Uma curva padrão de β-actina foi criada por amplificação de diluições em série de um plasmídeo de β-actina. Todas as reações de qPCR foram efetuadas na máquina Roche LightCycler480 (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN).

[00083] Os resultados da análise de qPCR são representados nas Figuras 1A e 1B. 93% das células a partir da amostra de plasmacitoma foram células de plasma, conforme determinado por citometria de fluxo. A expressão de BCMA na amostra de plasmacitoma foi dramaticamente mais alta do que a expressão de BCMA em qualquer outro tecido. O cDNA do BCMA foi detectado em vários tecidos hematológicos, tais como células mononucleares de sangue periférico (PBMC), medula óssea, baço, nódulo linfático, e amígdala. Baixos níveis de cDNA de BCMA foram detectados em muitos órgãos gastrointestinais, tais como duodeno, reto, e estômago. A expressão de BCMA nos órgãos gastrointestinais pode ser o resultado de células de plasma e células B presentes em tecidos linfóides associados ao intestino, tais como a lamina propria e Peyer’s Patches (ver, por exemplo, Brandtzaeg, Immunological Investigations, 39(4-5): 303-355 (2010)). Os baixos níveis de cDNA de BCMA também foram detectados nas amígdalas e na traqueia. Os baixos níveis de cDNA de BCMA detectados na traqueia podem ser devido a presença de células de plasma na lamina própria da traqueia (ver, por exemplo, Soutar, Thorax, 31(2):158-166 (1976)).

[00084] A expressão de BCMA na superfície de vários tipos de célula foi adicionalmente caracterizada usando citometria de fluxo (ver Figuras 2A-2L), incluindo linhas de célula de mieloma múltiplo H929, U266, e RPMI8226. As linhas de célula de mieloma múltiplo H929, U266, e RPMI8226 todas expressam BCMA de superfície de célula. Em contraste, a linha de célula de sarcoma TC71, CCRF-CEM de linha de leucemia de célula T, e o 293T-17 de linha de célula de anti-BCMA não expressam BCMA de superfície de célula. As células hematopiéticas de CD34+ primárias, as células epiteliais de via aérea pequena primárias, as células epiteliais bronquiais primárias, e as células epiteliais intestinais primárias, todas carecem de expressão de BCMA de superfície de série.

[00085] Os resultados deste exemplo demonstram que BCMA é expresso na superfície de células de mieloma múltiplo, e tem um padrão de expressão restrito em tecidos normais. EXEMPLO 2

[00086] Este exemplo descreve a construção de uma sequência de ácido nucleico da invenção que codifica receptores de antígeno quimérico anti-BCMA (CARs).

[00087] As sequências de anticorpo de dois anticorpos camundongo- anti-humano-BCMA designadas como "C12A3.2" e "C11D5.3" foram obtidas da Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 2010/104949 (Kalled et al.). As sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve destes anticorpos foram usadas para designar fragmentos variáveis de cadeia simples (scFvs) tendo a seguinte estrutura geral:

[00088] região variável de cadeia leve - articulador - região variável de cadeia pesada.

[00089] O articulador tem a seguinte sequência de aminoácido: GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 7) (ver, por exemplo, Cooper et al., Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)).

[00090] As sequências de DNA que codificam dois receptores de antígeno quimérico foram designadas, cada uma da qual contém os seguintes elementos de 5’ a 3’: a sequência de sinal de CD8α, as regiões de scFv, de articulação, e de transmembrana de anti-BCMA antes mencionadas da molécula de CD8α humana, a porção citoplásmica da molécula de CD28, e a porção citoplásmica da molécula CD3Z. Um esquema destas sequências de ácido nucleico de codificação de CAR é colocado na Figura 3A. Os CARs que incorporam as regiões variáveis de C12A3.2 e C11D5.3 foram designados anti-bcma1 e anti- bcma2, respectivamente.

[00091] As sequências de DNA que codificam cinco receptores de antígenos quiméricos adicionais baseados no CAR anti-bcma2 acima descrito foram designadas, cada uma da qual contém sequências de sinal e domínios de ativação de célula T diferentes. Neste particular, o 8ss-CAR anti-bcma2 contém os seguintes elementos de 5’ a 3: a sequência de sinal de CD8α, regiões de scFv, de articulação e de transmembrana da molécula de CD8α humana, a porção citoplásmica da molécula de CD28, e a porção citoplásmica da molécula de CD3Z. O G-CAR anti-bcma2 contém os seguintes elementos de 5’ a 3’: a sequência de sinal de receptor de GM-CSF humano, as regiões de scFv, de articulação, e de transmembrana da molécula de CD8α humana, a porção citoplásmica da molécula de CD28, e a porção citoplásmica da molécula de CD3Z. O CAR anti-bcma2-BB contém os seguintes elementos de 5’ a 3’: a sequência de sinal de CD8α, as regiões de scFv, de articulação, e de transmembrana da molécula de CD8α humana, a porção citoplásmica da molécula de 4-1BB, e a porção citoplásmica da molécula de CD3Z. O CAR anti-bcma2-OX40 contém os seguintes elementos de 5’ a 3’: a sequência de sinal de CD8α, as regiões de scFv, de articulação, e de transmembrana da molécula de CD8α humana, a porção citoplásmica da molécula de OX40 (ver, por exemplo, Latza et al., European Journal of Immunology, 24: 677-683 (1994)), e a porção citoplásmica da molécula de CD3Z. O anti-bcma2-BBOX40 contém os seguintes elementos de 5’ a 3’: a sequência de sinal de CD8α, as regiões de scFv, de articulação, e de transmembrana da molécula de CD8α humana, a porção citoplásmica da molécula de 4-1BB, a porção citoplásmica da molécula de OX40, e a porção citoplásmica da molécula de CD3Z. Os elementos presentes em cada das sete sequências de CAR são colocados na Tabela 1.

[00092] As sequências usadas para CD8α, CD28, CD3Z, 4-1BB (CD137), e OX40 (CD134) foram obtidas a partir das bases de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) publicamente disponível.

[00093] As sequências de ácido nucleico que codificam CAR foram geradas usando métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos em, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunology, 32(7): 689-702 (2009), e Zhao et al., J. Immunology, 183(9): 5563-5574 (2009). A sequência de ácido nucleico que codifica cada CAR foi otimizada por códon e sintetizada usando tecnologia GeneArt™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) com locais de restrição apropriados.

[00094] As sequências que codificam o CAR anti-bcma1 e o CAR anti-bcma2s foram ligadas em um plasmídeo de vetor lentiviral designado pRRLSIN.cPPT.MSCV.coDMF5.oPRE (ver, por exemplo, Yang et al., J. Immunotherapy, 33(6): 648-658 (2010)). A porção de coDMF5 deste vetor foi substituída com as sequências de ácido nucleico que codificam CAR usando métodos padrões. Os dois vetores de CAR anti-BCMA resultantes foram denotados pRRLSIN.cPPT.MSCV.anti- bcma1.oPRE e pRRLSIN.cPPT.MSCV.anti-bcma2.oPRE. Um CAR de controle negativo contendo o SP6 scFv que reconhece o hapteno 2,4,6- trinitrofenil também foi construído (ver, por exemplo, Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(24): 10024-10028 (1989)). Este CAR foi referido como SP6. O CAR SP6 foi clonado no mesmo vetor lentiviral como os CARs anti-BCMA, e contém os mesmos domínios de sinalização como anti-bcma1 e anti-bcma2. O sobrenadante contendo lentivírus que codifica cada CAR foi produzido pelo protocolo descrito em Yang et al., supra. Especificamente, células de 293T-17 (ATCC CRL-11268) foram transfectadas com os seguintes plasmídeos: pMDG (que codifica a proteína envelope do vírus da estomatite vesicular), pMDLg/pRRE (que codifica proteínas de HIV Gag e Pol), pRSV-Rev (que codificam a proteína de RSV Rev), e plasmídeos que codificam os CARs anti-BCMA (ver, por exemplo, Yang et al., supra).

[00095] As sequências que codificam os CARs G-anti-bcma2, 8ss- anti-bcma2, anti-bcma2-BB, anti-bcma2-OX40, e anti-bcma2-BBOX40 foram cada ligada em um plasmídeo de vetor gamaretroviral designado MSGV (vetor de splice-gag à base de vírus de célula tronco de camundongo) usando métodos padrões, tais como aqueles descritos em, por exemplo, Hughes et al., Human Gene Therapy, 16: 457-472 (2005). Após os plasmídeos gamaretrovirais de codificação de CAR serem gerados, a replicação incompetente de retrovírus com o RD114 envelope foi produzida pela transfecção transiente de 293 células de acondicionamento base, conforme descrito em Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009).

[00096] A replicação incompetente de lentivírus e de retrovírus que codificam os CARs acima descritos foi usada para transduzir células T humanas. Para anti-bcma1 e anti-bcma2, as células T foram cultivadas conforme descrito anteriormente (ver, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)), e foram estimuladas com o anticorpo monoclonal anti-CD3 OKT3 (Ortho-Biotech, Horsham, PA) em meio AIM V™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) contendo 5% de soro AB humano (Valley Biomedical, Winchester, VA) e 300 unidades internacionais (IU)/mL de interleucina-2 (Novartis Diagnostics, Emeryville, CA). Trinta e seis horas após as culturas terem iniciado, as células T ativadas foram suspensas em sobrenadante lentiviral com sulfato de protamina e 300 IU/mL de IL-2. As células foram centrifugadas por 1 hora a 1200xg. As células T foram então cultivadas por três horas a 37°C. O sobrenadante foi então diluído 1:1 com meio de RPMI (Mediatech, Inc., Manassas, VA) +10% de soro bovino fetal (Life Technologies, Carlsbad, CA) e IL-2. As células T foram cultivadas no sobrenadante diluído durante a noite, e então retornadas para cultura em meio de AIM V™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) mais 5% de soro de AB humano com IL-2. As células T foram coloridas com anticorpos de cabra anti-camundongo-F(ab)2 policlonais etiquetados com biotin (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA), para detectar os CARs anti-BCMA. Altos níveis de expressão de superfície de célula dos CAR anti-bcma1, CAR anti-bcma2, e CAR SP6 nas células T transduzidas foram observados, conforme mostrado nas Figuras 3B- 3D.

[00097] Para os CARs G-anti-bcma2, 8ss-anti-bcma2, anti-bcma2- BB, anti-bcma2-OX40, e anti-bcma2-BBOX40, as células mononucleares de sangue periférico foram suspensas a uma concentração de 1x106 célula por mL em meio de célula T contendo 50 ng/mL do anticorpo monoclonal anti-CD3 OKT3 (Ortho, Bridgewater, NJ) e 300 IU/mL de IL-2. Polipeptídeo RETRONECTIN™ (Takara Bio Inc., Shiga, Japan), que é um polipeptídeo recombinante de fragmentos de fibronectina humana que se liga aos vírus e proteínas de superfície de célula, foi dissolvido a uma concentração de 11 μg/mL em solução de salina tamponada com fosfato (PBS), e dois mL do polipeptídeo RETRONECTIN™ em solução de PBS adicionados à cada cavidade de placas de 6 cavidades revestidas com cultura de não tecido (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey). As placas foram incubadas por duas horas à temperatura ambiente (RT). Após a incubação, a solução de RETRONECTIN™ foi aspirada, e 2 mL de uma solução de bloqueio consistindo de solução de sal balanceada de Hanks (HBSS) mais 2% de albumina de soro bovino (BSA) foram adicionados a cada cavidade revestida com RETRONECTIN™. As placas foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente (RT). A solução de bloqueio foi aspirada, e as cavidades foram enxaguadas com uma solução de HBSS+2,5% ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico) (HEPES). O sobrenadante retroviral foi rapidamente descongelado e diluído 1:1 em meio de célula T, e dois mL do sobrenadante diluído foram, em seguida, adicionados a cada cavidade revestida com RETRONECTIN™. Após adição dos sobrenadantes, as placas foram centrifugadas a 2000xg por 2 horas a 32°C. O sobrenadante foi, em seguida, aspirado a partir das cavidades, e 2x106 células T que tinham sido cultivadas com anticorpos OKT3 e IL-2 por 2 dias foram adicionados a cada cavidade. Quando as células T foram adicionadas às placas revestidas com retrovírus, as células T foram suspensas a uma concentração de 0,5x106 células por mL em meio de célula T mais 300 IU/mL de IL-2. Após as células T serem adicionadas a cada cavidade, as placas foram centrifugadas por 10 minutos a 1000xg. As placas foram incubadas a 37°C durante a noite. A transdução foi repetida no próximo dia. Após uma incubação de 18-24 horas, as células T foram removidas a partir das placas, e suspensas em meio fresco de célula T com 300 IU/mL de IL-2 a uma concentração de 0,5x106 células por mL, e cultivadas a 37°C e 5% de CO2. Altos níveis de expressão de superfície de célula de anti-bcma2-BBOX40, anti-bcma2-BB, e 8ss-anti- bcma2 nas células T tranduzidas foram observados.

[00098] Os resultados deste exemplo demonstram um método de produção da sequência de ácido nucleico que codifica CAR da invenção, e métodos de expressão do CAR na superfície de células T. EXEMPLO 3

[00099] Este exemplo descreve uma série de experimentos usados para determinar a especificidade do CAR da invenção para BCMA. Células

[000100] NCI-H929, U266, e RPMI8226 são todas linhas de célula de mieloma múltiplo de BCMA+ que foram obtidas de ATCC (ATCC Nos. CRL-9068, TIB-196, e CCL-155, respectivamente). A549 (ATCC No. CCL-185) é uma linha de célula de câncer de pulmão negativa de BCMA. TC71 é uma linha de célula de sarcoma negativa de BCMA. CCRF-CEM é uma linha de célula T negativa de BCMA (ATCC No. CCL- 119). BCMA-K562 são células de K562 (ATCC No. CCL-243) que foram transduzidas com uma sequência de ácido nucleico que codifica BCMA de comprimento total. NGFR-K562 são células de K562 que foram transduzidas com o gene que codifica fator de crescimento de nervo de baixa afinidade (ver, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy., 32(7):689-702 (2009)). Os linfócitos de sangue periférico (PBL) de três pacientes com mieloma múltiplo (isto é, Paciente 1 com Mieloma a 3) foram usados, como foram PBL de três outros indivíduos: Doador A, Doador B, e Doador C. Os Doadores A a C todos tinham melanoma. As células primárias de CD34+ foram obtidas de três doadores saudáveis normais. Uma amostra de células de plasmacitoma foi obtida do Paciente 1 com Mieloma, e uma amostra de medula óssea foi obtida do Paciente 3 com Mieloma. Todas as amostras de humano acima mencionadas foram obtidas de pacientes arrolados em ensaios clínicos aprovados pelo IRB no National Cancer Institute. As seguintes células epiteliais humanas primárias foram obtidas de Lonza, Inc. (Basel, Switzerland): células epiteliais de via aérea pequena, células epiteliais bronquiais, e células epiteliais intestinais. Interferon-Y e ELISA de TNF

[000101] Células positivas de BCMA ou células negativas de BCMA foram combinadas com células T transduzidas por CAR em cavidades em duplicata de uma placa de fundo redondo de 96 cavidades (Corning Life Sciences, Lowell, MA) em meio AIM V™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) + 5% de soro humano. As placas foram incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em seguida á incubação, ELISAs para IFNY e TNF foram realizados usando métodos padrões (Pierce, Rockford, IL).

[000102] As células T transduzidas com o CAR anti-bcma1 ou CAR anti-bcma2 produziram grandes quantidades de IFNY quando elas foram cultivadas durante a noite com a linha de célula de expressão de BCMA BCMA-K562, mas as células T transduzidas por CAR somente produziram níveis antecedentes de IFNY quando elas foram cultivadas com a linha de célula de controle negativo de NGFR-K562, conforme indicado na Tabela 2 (todas as unidades são pg/mL de IFNy. Tabela 2

1 As células efetoras foram células T de um paciente com mieloma múltiplo (Paciente 2 com Mieloma). As células T foram transduzidas com o CAR indicado, ou não transduzido esquerdo. 2 * As células alvos indicadas foram combinadas com as células efetoras por uma incubação durante a noite, e um IFNY ELISA foi realizado. Petição 870200153557, de 07/12/2020, pág. 54/80

[000103] As células T que expressam os CARs 8ss-anti-bcma2, anti- bcma2-BB, e anti-bcma2-OX40, produzem IFNY especificamente em resposta a células alvos de BCMA+ quando as células T e células alvos foram co-cultivadas durante a noite, conforme indicado na Tabela 3 (todas as unidades são pg/mL de IFNy. Tabela 3

[000104] As células T transduzidas com CARs anti-BCMA produziram grandes quantidades de IFNy quando elas foram cultivadas durante a noite com linhas de célula de mieloma múltiplo que expressam BCMA. Em contraste, os CARs anti-BCMA produzem quantidades muito mais baixas de IFNy quando eles foram cultivados com uma variedade de linhas de célula negativa de BCMA. Comparadas com as células T transduzidas com o CAR anti-bcma1, as células T transduzidas com o CAR anti-bcma2, e variantes destas (isto é, 8ss-anti-bcma2, anti- bcma2-BB, e anti-bcma2-OX40), produziram mais IFNy quando cultivadas com células positivas de BCMA, e menos IFNy quando cultivadas com células negativas de BCMA.

[000105] As células T transduzidas com as variantes de CAR anti- bcma2 produziram TNF especificamente em resposta a células alvos de BCMA+ quando as células T e células alvos foram co-cultivadas durante a noite, conforme indicado na Tabela 4 (todas as unidades são pg/mL de fator de necrose de tumor (TNF)). Tabela 4

[000106] Devido às células T transduzidas com o CAR anti-bcma2 e variantes deste exibirem reconhecimento levemente mais forte e mais específico de células que expressam BCMA do que células T transduzidas com o CAR anti-bcma1, somente as variantes de CAR anti-bcma2 e CAR anti-bcma2 foram usadas nos seguintes experimentos. Ensaio de CD107a

[000107] Duas populações de células T foram preparadas em dois tubos separados. Um tubo continha células de BCMA-K562, e o outro tubo continha células de NGFR-K562. Ambos os tubos também continham células T transduzidas com as variantes de o CAR anti- bcma2 e CAR anti-bcma2, 1 mL de meio AIM V ™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) + 5% de soro humano, uma concentração titulada de um anticorpo anti-CD107a (eBioscience, Inc., San Diego, CA; clone eBioH4A3), e 1 μL de Golgi Stop (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Todos os tubos foram incubados a 37°C por quatro horas e, em seguida, coloridos para expressão de CD3, CD4, e CD8.

[000108] As células T transduzidas com CAR de três indivíduos diferentes regularam ascendentemente CD107a especificamente em resposta a estimulação com células alvos que expressam BCMA (ver Figuras 4A-4C). Isto indica a ocorrência de degranulação específica de BCMA das células T, que é um pré-requisito para citotoxicidade mediada por perforin (ver, por exemplo, Rubio et al., Nature Medicine, 9(11): 1377-1382 (2003)). Em adição, as células T que expressam as variantes de CAR anti-bcma2 8ss-anti-bcma2, anti-bcma2-BB, anti- bcma2-OX40 se degranulam em uma maneira específica de BCMA quando estimuladas com células alvos in vitro, conforme mostrado nas Figuras 5A-5D. Ensaio de coloração de citocina intracelular (ICCS)

[000109] Uma população de células de BCMA-K562 e uma população de células de NGFR-K562 foram preparadas em dois tubos separados, conforme descrito acima. Ambos os tubos também continham células T transduzidas com o CAR anti-bcma2 do Paciente 2 com Mieloma, 1 mL de meio AIM V (Life Technologies, Carlsbad, CA) + 5% de soro humano, e 1 μL de Golgi Stop (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Todos os tubos foram incubados a 37°C por seis horas. As células foram coloridas na superfície com anticorpos anti-CD3, anti-CD4, e anti-CD8. As células foram permeabilizadas, e coloração intracelular foi conduzida por IFNY (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, clone B27), IL-2 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, clone MQ1-17H12), e TNF (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, clone MAb11) pelas seguintes instruções do kir Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

[000110] Grandes populações de células T transduzidas com o CAR anti-bcma2 do Paciente 2 com Mieloma especificamente produziram as citocinas IFNY, IL-2, e TNF em uma maneira específica de BCMA após as seis horas de estimulação com células alvos que expressam BCMA, conforme mostrado nas Figuras 6A-6C. Ensaios de proliferação

[000111] A capacidade das células T transduzirem com o CAR anti- bcma2 para proliferarem quando estimuladas com células alvos que expressam BCMA, foi avaliada. Especificamente, 0,5x106 de células de BCMA-K562 irradiadas, ou 0,5x106 de células de NGFR-K562 irradiadas, foram co-cultivadas com 1x106 de células T totais que foram transduzidas com, ou o CAR anti-bcma2, ou o SP6 CAR. As células T foram etiquetadas com carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE) (Life Technologies, Carlsbad, CA), conforme descrito em Mannering et al., J. Immunological Methods, 283(1-2): 173-183 (2003). O meio usado nas co-culturas foi meio AIM V™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) + 5% de soro AB humano. IL-2 não foi adicionado ao meio. Quatro dias após iniciação, as células vivas em cada co-cultura foram contadas com azul-trypan para exclusão de célula morta. A citometria de fluxo foi, em seguida, realizada por coloração das células T com anticorpos de BCMA de cabra-anti-humano etiquetados com biotina policlonal (R&D Systems, Minneapolis, MN), seguido por estreptavidina (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), anticorpo anti- CD38 (eBioscience, Inc., San Diego, CA), e anticorpo anti-CD56 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). A análise dos dados de citometria de fluxo foi realizada pelo uso do software FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OU).

[000112] As células T que expressam o CAR anti-bcma2 exibiram uma maior diluição de CFSE quando cultivadas com as células de BCMA- K562 do que quando cultivadas com células de NGFR-K562 de controle negativo, conforme mostrado na Figura 7A. Estes resultados indicam que as células T transduzidas com o CAR anti-bcma2 especificamente proliferam quando estimuladas com células alvos que expressam BCMA. Em contraste, não existe diferença significante na diluição de CFSE quando as células T que expressam o CAR SP6 foram cultivadas com, ou células alvos de BCMA-K562, ou células alvos de NGFR-K562 (ver Figura 7B), que demonstra uma falta de proliferação específica de BCMA pelas células T que expressam CAR SP6.

[000113] No começo dos ensaios de proliferação, 0,8x106 células T que expressam o CAR anti-bcma2 foram cultivadas com, ou células de BCMA-K562, ou células de NGFR-K562. Após 4 dias de cultura, 2,7x106 de células T que expressam o CAR anti-bcma2 estavam presentes nas culturas contendo células de BCMA-K562, enquanto que somente 0,6x106 células T que expressam o CAR anti-bcma2 estavam presentes nas culturas contendo células de NGFR-K562. Este aumento específico de BCMA no número absoluto de células T que expressam o CAR anti- bcma2 indica que estas célula Ts proliferam em resposta ao BCMA.

[000114] Os resultados deste exemplo demonstram que as células T que expressam o CAR da invenção exibem produção, degranulação e proliferação de citociona específica de BCMA. EXEMPLO 4

[000115] Este exemplo demonstra que as células T que expressam o CAR anti-BCMA da invenção podem destruir linhas de célula de mieloma múltiplo.

[000116] Os ensaios de citotoxicidade foram realizados para determinar se as células T transduzidas com o CAR anti-bcma2 descritas nos Exemplos 2 e 3 podem destruir as linhas de célula de mieloma múltiplo (MM) que expressam BCMA. Especificamente, a citotoxicidade de células alvos foi medida por comparação da sobrevivência de células alvos que expressam BCMA (isto é, linhas de célula de mieloma múltiplo H929 e RPMI8226) relativa à sobrevivência de células de CCRF-CEM de controle negativo usando um ensaio descrito em, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), e Hermans et al., J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004).

[000117] Aproximadamente 50.000 células alvos que expressam BCMA e 50.000 células de CCRF-CEM foram combinadas nos mesmos tubos com números diferentes de células T transduzidas por CAR. As células de controle negativo de CCRF-CEM foram etiquetadas com o corante fluorescente 5-(e-6)-(((4- clorometil)benzoil)amino)tetrametilrodamina (CMTMR) (Life Technologies, Carlsbad, CA), e as células alvos que expressam BCMA foram etiquetadas com CFSE. Em todos os experimentos, a citotoxicidade de células T efetoras que foram transduzidas com o CAR anti-bcma2 foi comparada à citotoxicidade de células T efetoras de controle negativo a partir dos mesmos indivíduos que foram transduzidos com o CAR SP6. As co-culturas foram estabelecidas em tubos de teste estéreis de 5 mL (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) em duplicata nas seguintes razões de célula T:célula alvo: 20,0:1, 7:1, 2:1, e 0,7:1. As culturas foram incubadas por quatro horas a 37°C. Imediatamente após a incubação, 7-amino-actinomicina D (7AAD; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) foi adicionada. As percentagens de células alvos vivas que expressam BCMA e células de controle negativo de CCRF-CEM vivas foram determinadas para cada co-cultura de célula T/célula alvo.

[000118] Para cada co-cultura de célula T/célula alvo, a percentagem de sobrevivência de células alvos que expressam BCMA relativa às células de controle negativo de CCRF-CEM foi determinada pela divisão da percentagem das células que expressam BCMA pela percentagem das células de controle negativo de CCRF-CEM. A percentagem de sobrevivência corrigida de células alvos que expressam BCMA foi calculada pela divisão da percentagem de sobrevivência de células alvos que expressam BCMA em cada co-cultura de célula T/célula alvo pela razão da percentagem de células alvos que expressam BCMA:percentagem de células de controle negativo de CCRF-CEM em tubos contendo somente células alvos que expressam BCMA e células de controle negativo de CCRF-CEM sem células T efetoras. Esta correção foi necessária para contar a variação no início dos números de célula, e para morte espontânea da célula alvo. A citotoxicidade foi calculada conforme segue:

[000119] % de citotoxicidade de células alvos que expressam BCMA = 100 - % de sobrevivência corrigida de célula alvos que expressam BCMA.

[000120] Os resultados do ensaio de citotoxicidade são mostrados nas Figuras 7C e 7D. As células T transduzidas com o CAR anti-bcma2 especificamente matam as linhas de célula de mieloma múltiplo que expressam BCMA H929 e RPMI8226. Em contraste, as células T transduzidas com o CAR SP6 exibem níveis muito mais baixos de citotoxicidade contra estas linhas de célula.

[000121] Os resultados deste exemplo demonstram que a sequência de ácido nucleico da invenção que codifica um CAR anti-BCMA pode ser usada em um método de destruição de linhas de célula de mieloma múltiplo. EXEMPLO 5

[000122] Este exemplo demonstra que as células T que expressam o CAR anti-BCMA da invenção podem destruir as células de mieloma múltiplo primárias.

[000123] As células de mieloma múltiplo primárias descritas no Exemplo 2 foram avaliadas para expressão de BCMA, bem como para produção, degranulação e proliferação de citocina específica de BCMA usando os métodos acima descritos.

[000124] A expressão de BCMA da superfície da célula foi detectada em quatro amostras de mieloma múltiplo primário, bem como em células de mieloma múltiplo de medula óssea primárias do Paciente 3 com Mieloma (ver Figura 8A). As células de plasma de expressão de BCMA produzem 40% das células na amostra de medula óssea do Paciente 3 com Mieloma. As células T alogenéicas transduzidas com o CAR anti- bcma2 do Doador C produziram IFNY após co-cultura com as células do Paciente 3 com Mieloma de medula óssea não manipuladas, conforme mostrado na Figura 8B. As células T transduzidas com CAR anti-bcma2 a partir do mesmo doador alogenéico produziram muito menos IFNY quando elas foram cultivadas com célula mononuclear de sangue periférico (PBMC) do Paciente 3 com Mieloma. Em adição, as células T transduzidas com CAR SP6 do Doador C não reconhecem especificamente a medula óssea do Paciente 3 com Mieloma. Foi reportado anteriormente que PBMC normal não contém células que expressam BCMA (ver, por exemplo, Ng et al., J. Immunology, 173(2): 807-817 (2004)). Para confirmar esta observação, a PBMC do Paciente 3 foi avaliada para expressão de BCMA por citometria de fluxo. A PBMC do Paciente 3 não contém células que expressam BCMA, aparte de uma pequena população de células de CD56+CD38high que produzem aproximadamente 0,75% da PBMC. Esta população possivelmente consiste de circulação de células de mieloma múltiplo.

[000125] Um plasmacitoma resectado do Paciente 1 com Mieloma consistiu de 93% de células de plasma, e estas células de plasma primárias expressam BCMA, conforme mostrado na Figura 8C. As células T do Paciente 2 com Mieloma produziram IFNY quando cultivadas com as células de plasmacitoma não manipuladas alogenéicas do Paciente 1 com Mieloma. As células T do Paciente 2 com Mieloma não produziram quantidades significantes de IFNy quando cultivadas com PBMC do Paciente 1 com Mieloma. As células T do Paciente 2 com Mieloma que foram transduzidas com o CAR SP6 não produzem quantidades significantes de IFNy quando elas foram cultivadas com, ou células de plasmacitoma, ou PBM do Paciente 1 com Mieloma. A PBMC do Paciente 1 com Mieloma não expressa BCMA, conforme medido por citometria de fluxo.

[000126] As células T do Paciente 1 com Mieloma, que receberam oito ciclos anteriores de terapia de mieloma, foram bem sucedidamente cultivadas e transduzidas com um vetor de lentivírus que codifica o CAR anti-bcma2. Oito dias após as culturas serem iniciadas, a expressão do CAR anti-bcma2 foi detectada em 65% das células T. As células T do Paciente com Mieloma 1 que expressam o anti-bcma2 produz IFNY especificamente em resposta às células de plasmacitoma autólogas (Figura 8D). As células T do Paciente 1 com Mieloma que expressam o CAR SP6 não reconhecem células de plasmacitoma autólogas. As células T que expressam o CAR anti-bcma2 e as células T que expressam o CAR SP6 não reconhecem PBMC autólogo. As células T de Paciente 1 com Mieloma que expressam o CAR anti-bcma2 também especificamente matam células de plasmacitoma autólogas em baixas razões de efetor para alvo. Em contraste, as células T do Paciente 1 com Mieloma que expressam o CAR SP6 exibiram baixos níveis de citotoxicidade contra células de plasmacitoma autólogas (Figura 8E).

[000127] Os resultados deste exemplo demonstram que o CAR anti- BCMA da invenção pode ser usado em um método de destruição de células de mieloma múltiplo primárias. EXEMPLO 6

[000128] Este exemplo demonstra que as células T que expressam os CARs anti-BCMA da invenção podem destruir tumores estabelecidos nos camundongos.

[000129] Os camundongos NDG imunodeficientes (NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, Jackson Laboratory) foram injetados intradermalmente com 8x106 de células de RPMI8226. Os tumores foram permitidos crescerem por 17 a 19 dias, e, em seguida, os camundongos receberam infusões intravenosas de 8x106 de células T humanas que foram transduzidas com, ou o CAR anti-bcma2, ou o CAR SP6. Os tumores foram medidos com compassos de 3 em 3 dias. O comprimento mais longo e o comprimento perpendicular ao comprimento mais longo foram multiplicados para obter o tamanho do tumor (área) em mm2. Quando o comprimento mais longo alcançou 15 mm, os camundongos foram sacrificados. Os animais estudados foram aprovados pelo National Cancer Institute Animal Care and Use Committee.

[000130] Os resultados deste exemplo são mostrados nas Figuras 9A e 9B. Por volta do dia 6, os camundongos tratados com células T transduzidas por anti-bcma2 mostraram uma redução no tamanho do tumor, e os tumores foram erradicados no dia 15. Em adição, todos os camundongos tratados com células T transduzidas por anti-bcma2 sobreviveram 30 dias pós infusão de célula T.

[000131] Os resultados deste exemplo demonstram que o CAR anti- BMCA da invenção pode destruir as células de mieloma múltiplo in vivo.

[000132] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente, e patentes, aqui citados, são, desse modo, incorporados, por referência à mesma extensão como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada para ser incorporada por referência, e foram colocados em sua totalidade aqui.

[000133] O uso dos termos "um" e "uma" e "o", e referentes similares, no contexto de descrever a invenção (especialmente no contexto das seguintes reivindicações), são para serem construídos para cobrir ambos o singular e o plural, a menos que, de outro modo, aqui indicado, ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo", e "contendo", são para serem construídos como termos abertos (isto é, significando "incluindo, mas não limitado a"), a menos que de outro modo notado. A recitação de faixas de valores aqui são meramente pretendidas para servirem como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, a menos que de outro modo indicado aqui, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fossem individualmente recitados aqui. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo aqui indicado, ou, de outro modo, claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") aqui proporcionado, é pretendido meramente para melhor esclarecer a invenção, e não impõe uma limitação no escopo da invenção, a menos que, de outro modo, reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser construída como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial à prática da invenção.

[000134] As concretizações preferidas desta invenção são aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido aos inventores para efetuar a invenção. Variações destas concretizações preferidas podem se tornar aparentes àqueles técnicos no assunto após leitura da descrição precedente. Os inventores, exceto os técnicos no assunto, empregam tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada, de outro modo, do que conforme especificamente aqui descrita. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes da matéria objeto recitada nas reivindicações aqui em anexo, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as variações possíveis destes é envolvida pela invenção, a menos que de outro modo aqui indicado, ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.

Claims

1. Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada, caracterizado pelo fato de que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende (a) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno direcionado contra o antígeno de maturação de células B (BCMA); (b) um domínio transmembrana selecionado do grupo que consiste em: um domínio transmembrana CD28 e um domínio transmembranar CD8α; e (c) um domínio de sinalização de células T intracelular isolado de uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: CD8 alfa, CD28, CD27, OX40 e 4-1BB; e (d) um domínio de sinalização de células T intracelular de CD3Z ou FcRY .

2. Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um anticorpo monoclonal direcionado contra BCMA, ou um fragmento de ligação de antígeno deste.

3. Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de um anticorpo monoclonal direcionado contra BCMA.

4. Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que um ou mais domínios de sinalização de célula T são derivados de uma proteína selecionada do grupo que consiste em: uma proteína CD8-alfa humana, uma proteína CD28 humana, uma proteína CD3-zeta humana, uma proteína FCRY humana, uma proteína CD27, uma proteína OX40, uma proteína 4-1BB humana, versões modificadas de qualquer das precedentes, ou qualquer combinação das precedentes.

5. Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o um ou mais domínios de sinalização de células T são derivados de uma proteína 4-1BB humana.

6. Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o um ou mais domínios de sinalização de células T são derivados de uma proteína 4-1BB humana e uma proteína CD3-zeta humana.

7. Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) a (i) região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDR) 1, (ii) CDR2 da cadeia pesada, (iii) CDR3 da cadeia pesada, (iv) CDR1 da cadeia leve, (v) CDR2 da cadeia leve, e (vi) CDR3 da cadeia leve de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; ou (b) a (i) região variável da cadeia pesada e (ii) região variável da cadeia leve de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

8. Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico isolada ou purificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. CAR isolado ou purificado, caracterizado pelo fato de que é codificado pela sequência de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

11. CAR isolado ou purificado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 12.

12. CAR, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal direcionado contra BCMA, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

13. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo monoclonal direcionado contra BCMA.

14. CAR, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo que consiste em: um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento variável de cadeia única (scFv) e um diabody.

15. CAR, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno compreende um scFv.

16. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios de sinalização intracelular de células T são isolados de uma proteína selecionada do grupo que consiste em: CD28, CD3Z, FcRY, CD27, OX40 e proteína 4-1BB.

17. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreenderem um domínio intracelular de sinalização de células T CD28.

18. CAR, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que um ou mais domínios de sinalização intracelulares de células T compreendem ainda um domínio intracelular de sinalização de células T CD3Z.

19. CAR, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem um domínio intracelular de sinalização de células T OX40.

20. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem um domínio intracelular de sinalização de células T FCRY.

21. CAR, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem ainda um domínio intracelular de sinalização de células T CD3Z.

22. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem um domínio intracelular de sinalização de células T CD27.

23. CAR, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem ainda um domínio intracelular de sinalização de células T CD3Z.

24. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem um domínio intracelular de sinalização de células T OX40.

25. CAR, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem ainda um domínio intracelular de sinalização de células T de CD3Z.

26. CAR, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem ainda um domínio intracelular de sinalização de células T de 4-1BB.

27. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem um domínio intracelular de sinalização de células T de 4-1BB.

28. CAR, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou mais domínios intracelulares de sinalização de células T compreendem ainda um domínio intracelular de sinalização de células T CD3Z.

29. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um polipeptídeo de sequência sinal.

30. CAR, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de sequência sinal é um polipeptídeo de sequência sinal de fator estimulador de colônias de macrófagos e de granulócitos (GM-CSF) ou um polipeptídeo de sequência de sinal CD8α.

31. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um domínio hinge.

32. CAR, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o domínio hinge é um domínio hinge CD8α ou um domínio hinge CD28.

33. Método para destruir células cancerígenas, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de células cancerígenas que expressam BCMA com uma ou mais células T isoladas que expressam o CAR, como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 32, em que o CAR é produzido e se liga ao BCMA nas células cancerígenas e as células cancerígenas são destruídas, em que as células cancerígenas estão in vitro.

34. Método para destruir células cancerígenas, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de células cancerígenas que expressam BCMA com uma ou mais células NK isoladas que expressam o CAR, como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 32, em que o CAR é produzido e se liga ao BCMA nas células cancerígenas e as células cancerígenas são destruídas, em que as células cancerígenas estão in vitro.

35. Uso da sequência de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, do vector, como definido na reivindicação 9, ou do CAR, como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 32, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para a destruição de células cancerígenas.

36. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, ou uso, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que as células cancerígenas são células de mieloma múltiplo ou células de linfoma de Hodgkin.

37. CAR, caracterizado pelo fato de que compreende: um polipeptídeo de sequência de sinal; um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno direcionado contra BCMA; um domínio hinge CD8α ou um domínio hinge CD28; um domínio transmembrana CD8α ou um domínio transmembrana CD28; um domínio de sinalização de célula T intracelular de 4-1BB e/ou um domínio de sinalização de célula T intracelular OX40 e/ou um domínio de sinalização de célula T intracelular CD28; e um domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

38. CAR, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo de sequência de sinal; o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno direcionado contra BCMA; o domínio hinge CD8α; o domínio transmembrana CD8α; o domínio de sinalização de células T intracelulares de 4-1BB; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

39. CAR, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo de sequência sinal; o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno direcionado contra BCMA; o domínio hinge CD8α; o domínio transmembrana CD8α; o domínio de sinalização intracelular de células T OX40; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

40. CAR, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo de sequência sinal; o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno direcionado contra BCMA; o domínio hinge CD8α; o domínio transmembrana CD8α; o domínio de sinalização intracelular de células T CD28; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

41. CAR, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo de sequência sinal; o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno direcionado contra BCMA; o domínio hinge CD8α; o domínio transmembrana CD28; o domínio de sinalização intracelular de células T CD28; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

42. CAR, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo de sequência sinal; o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno direcionado contra BCMA; o domínio hinge CD28; o domínio transmembrana CD28; o domínio de sinalização intracelular de células T CD28; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

43. CAR, caracterizado pelo fato de que compreende: um polipeptídeo de sequência sinal CD8α; um scFv dirigido contra BCMA; um domínio hinge CD8α ou um domínio hinge CD28; um domínio transmembrana de CD8α ou um domínio hinge de CD28; um domínio de sinalização de célula T intracelular de 4-1BB e/ou um domínio de sinalização de célula T intracelular OX40 e/ou um domínio de sinalização de célula T intracelular CD28; e um domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

44. CAR, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende: o polipeptídeo de sequência sinal CD8α; o scFv dirigido contra BCMA; o domínio hinge CD8α; o domínio transmembrana CD8α; um domínio de sinalização intracelular de células T de 4-1BB; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

45. CAR, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende: o polipeptídeo de sequência sinal CD8α; o scFv dirigido contra BCMA; o domínio hinge CD8α; o domínio transmembrana CD8α; o domínio de sinalização intracelular de células T OX40; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

46. CAR, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende: o polipeptídeo de sequência sinal CD8α; o scFv dirigido contra BCMA; o domínio hinge CD8α; o domínio transmembrana CD8α; o domínio de sinalização intracelular de células T CD28; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

47. CAR, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende: o polipeptídeo de sequência sinal CD8α; o scFv dirigido contra BCMA; o domínio hinge CD8α; o domínio transmembrana CD28; o domínio de sinalização intracelular de células T CD28; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

48. CAR, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende: o polipeptídeo de sequência sinal CD8α; o scFv dirigido contra BCMA; o domínio hinge CD28; o domínio transmembrana CD28; o domínio de sinalização intracelular de células T CD28; e o domínio de sinalização intracelular de células T CD3Z.

49. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o CAR, como definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 48.

50. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que compreende ribonucleotídeos.

51. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica o CAR, como definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 48.

52. Vetor, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que é um vetor viral.

53. Vetor, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor retroviral.

54. Vetor, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o vetor retroviral é um vetor gama retroviral.

55. Vetor, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o vetor retroviral é um vetor lentiviral.