EA044661B1 - Химерный рецептор антигена, направленный на антиген созревания b-клеток, кодирующая его нуклеиновая кислота, соответствующие экспрессионный вектор, клетка, композиция, применения и способы - Google Patents
Химерный рецептор антигена, направленный на антиген созревания b-клеток, кодирующая его нуклеиновая кислота, соответствующие экспрессионный вектор, клетка, композиция, применения и способы Download PDFInfo
- Publication number
- EA044661B1 EA044661B1 EA201990959 EA044661B1 EA 044661 B1 EA044661 B1 EA 044661B1 EA 201990959 EA201990959 EA 201990959 EA 044661 B1 EA044661 B1 EA 044661B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- cells
- acid sequence
- acid residues
- Prior art date
Links
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 title claims description 146
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 title claims description 120
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 title claims description 120
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 38
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 16
- -1 CELL Substances 0.000 title description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 328
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 175
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 113
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 72
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 53
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 43
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 30
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 28
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 24
- 101000738335 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Proteins 0.000 claims description 18
- 102100037906 T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Human genes 0.000 claims description 18
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 12
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 12
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 10
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 9
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 8
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 6
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 101100226902 Mus musculus Fcrlb gene Proteins 0.000 claims description 6
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 48
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 47
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 75
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 41
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 21
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 20
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 19
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 17
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 17
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 14
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 14
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 13
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 12
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 9
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 101100438956 Homo sapiens CD8A gene Proteins 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 5
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 5
- JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester Chemical compound C=1C(OC(=O)C)=CC=C2C=1OC1=CC(OC(C)=O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 4
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 101100112778 Homo sapiens CD247 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100166600 Homo sapiens CD28 gene Proteins 0.000 description 3
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- WOXWUZCRWJWTRT-UHFFFAOYSA-N 1-amino-1-cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(N)CCCCC1 WOXWUZCRWJWTRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 2
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000035990 intercellular signaling Effects 0.000 description 2
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- OCLLVJCYGMCLJG-CYBMUJFWSA-N (2r)-2-azaniumyl-2-naphthalen-1-ylpropanoate Chemical compound C1=CC=C2C([C@@](N)(C(O)=O)C)=CC=CC2=C1 OCLLVJCYGMCLJG-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- QFQYGJMNIDGZSG-YFKPBYRVSA-N (2r)-3-(acetamidomethylsulfanyl)-2-azaniumylpropanoate Chemical compound CC(=O)NCSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QFQYGJMNIDGZSG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BFNDLDRNJFLIKE-ROLXFIACSA-N (2s)-2,6-diamino-6-hydroxyhexanoic acid Chemical compound NC(O)CCC[C@H](N)C(O)=O BFNDLDRNJFLIKE-ROLXFIACSA-N 0.000 description 1
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- WAMWSIDTKSNDCU-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-azaniumyl-2-cyclohexylacetate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1CCCCC1 WAMWSIDTKSNDCU-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2CNC(C(=O)O)CC2=C1 BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 1-oxidanylurea Chemical compound N[14C](=O)NO VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- KNQHBAFIWGORKW-UHFFFAOYSA-N 2,3-diamino-3-oxopropanoic acid Chemical class NC(=O)C(N)C(O)=O KNQHBAFIWGORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001894 2,4,6-trinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C(C(*)=C(C([H])=C1[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- JINGUCXQUOKWKH-UHFFFAOYSA-N 2-aminodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCC(N)C(O)=O JINGUCXQUOKWKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXDGRBPZVQPESQ-QMMMGPOBSA-N 4-[(2s)-2-amino-2-carboxyethyl]benzoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 YXDGRBPZVQPESQ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 4-amino-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N)C=C1 CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GTVVZTAFGPQSPC-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 GTVVZTAFGPQSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 1
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 1
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100352418 Caenorhabditis elegans plp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108010008655 Epstein-Barr Virus Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N Fenclonine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091010847 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100022132 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101000824104 Homo sapiens High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000679851 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N L-homophenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC1=CC=CC=C1 JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000019569 Nodular lymphocyte predominant Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- LQSAMJNNDUNFPI-MBHQJZITSA-N ON[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O.C1(=CC=CC=C1)C([C@H](N)C(=O)O)O Chemical compound ON[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O.C1(=CC=CC=C1)C([C@H](N)C(=O)O)O LQSAMJNNDUNFPI-MBHQJZITSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 1
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000020385 T cell costimulation Effects 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- JINBYESILADKFW-UHFFFAOYSA-N aminomalonic acid Chemical compound OC(=O)C(N)C(O)=O JINBYESILADKFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000001446 anti-myeloma Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHFFFAOYSA-N ara-adenosine Natural products Nc1ncnc2n(cnc12)C1OC(CO)C(O)C1O OIRDTQYFTABQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150035354 araA gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 208000013056 classic Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000050320 human TNFRSF4 Human genes 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- QNRXNRGSOJZINA-UHFFFAOYSA-N indoline-2-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C(=O)O)CC2=C1 QNRXNRGSOJZINA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000002809 long lived plasma cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001350 reed-sternberg cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003885 sodium benzoate Drugs 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical class S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N tert-butylglycine Chemical compound CC(C)(C)C(N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-IMJSIDKUSA-N trans-3-hydroxy-L-proline Chemical compound O[C@H]1CC[NH2+][C@@H]1C([O-])=O BJBUEDPLEOHJGE-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N trans-4-Hydroxy-L-proline Natural products O[C@@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H tristrontium;diphosphate Chemical compound [Sr+2].[Sr+2].[Sr+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Description
Применения и способы
Настоящее изобретение было создано при поддержке Правительства под проектным номером ZIABC011417 Национальными институтами здравоохранения, Национальным институтом онкологии. Правительство обладает определенными правами на данное изобретение.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Заявка на данное изобретение выделена из заявки № 201491837 на выдачу евразийского патента на изобретение, поданной 15.03.2013 г., с испрашиванием приоритета по дате подачи заявки US 61/622,600, поданной 11.04.2012.
Данная патентная заявка претендует на приоритет предварительной патентной заявки США № 61/622,600, поданной 11 апреля 2012 г., которая включена в данный документ во всей ее полноте посредством ссылки.
Включение посредством ссылки материала, представленного в электронном виде
Включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки читаемый на компьютере список нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, представленный одновременно с данной заявкой и определенный следующим образом: один файл размером 42589 байт ASCII (Text) с названием 712361_ST25.TXT, созданный 14 марта 2013 г.
Уровень техники
Множественная миелома (ММ) представляет собой злокачественное заболевание, которое характеризуется накоплением клональных плазматических клеток (см., например, Palumbo et al., New England J. Med., 364(11):1046-1060 (2011) и Lonial et al., Clinical Cancer Res., 17(6):1264-1277 (2011)). Современные подходы к лечению ММ часто вызывают ремиссию, но почти все пациенты в конечном итоге страдают от рецидива и умирают (см., например, Lonial et al., выше, и Rajkumar, Nature Rev. Clinical Oncol., 8(8):479-491 (2011)). Было показано, что аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток вызывает иммуноопосредованное удаление клеток миеломы; тем не менее токсичность этого подхода является высокой, и некоторые пациенты излечиваются (см., например, Lonial et al., выше, и Salit et al., Clin. Lymphoma, Myeloma, and Leukemia, 11(3):247-252 (2011)). В настоящее время не существует клинически эффективных FDA-утвержденных способов лечения ММ моноклинальными антителами или аутологичными Т-клетками (см., например, Richardson et al., British J. Haematology, 154(6):745-754 (2011), и Yi, Cancer Journal, 15(6):502-510 (2009)).
Адоптивный перенос Т-клеток, генетически модифицированных для распознавания связанных со злокачественностью антигенов, выглядит обещающим в качестве нового подхода к лечению рака (см., например, Morgan et al., Science, 314(5796):126-129 (2006); Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2):251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4):299-308 (2008), Kershaw et al., Nature Reviews Immunology, 5(12):928-940 (2005); и Pule et al., Nature Medicine, 14(11):1264-1270 (2008)). Т-клетки могут быть генетически модифицированы для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR, chimeric antigen receptor), которые являются гибридными белками, состоящими из фрагмента распознавания антигена и доменов Т-клеточной активации (см., например, Kershaw et al., выше, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2):720-724 (1993), и Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol., 21(2):215-223 (2009)).
Для злокачественных образований В-клеточных линий был достигнут значительный прогресс в разработке адоптивных Т-клеточных подходов, которые используют анти-CD19-CAR (см., например, Jensen et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation, 16:1245-1256 (2010); Kochenderfer et al., Blood, 116(20):4099-4102 (2010); Porter et al., The New England Journal of Medicine, 365(8):725-733 (2011); Savoldo et al., Journal of Clinical Investigation, 121(5):1822-1826 (2011), Cooper et al., Blood, 101(4):16371644 (2003); Brentjens et al., Nature Medicine, 9(3): 279-286 (2003); и Kalos et al., Science Translational Medicine, 3(95):95ra73 (2011)). Адоптивно перенесенные Т-клетки, трансдуцированные анти-CD19-CAR, вылечили лейкемию и лимфому у мышей (см., например, Cheadle et al., Journal of Immunology, 184(4):18851896 (2010); Brentjens et al., Clinical Cancer Research, 13(18 Pt 1):5426-5435 (2007); и Kochenderfer et al., Blood, 116(19):3875-3886 (2010)). В ранних клинических испытаниях адоптивно перенесенные Т-клетки, трансдуцированные анти-CD19-CAR, удаляли нормальные и злокачественные В-клетки у пациентов с лейкемией и лимфомой (см, например, Kochenderfer et al., Blood, 116(20):4099-4102 (2010); Porter et al., supra, Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); и Kochenderfer et al., Blood, December 8, 2011 (электронная публикация перед печатью (2012).).
Тем не менее CD19 только в редких случаях экспрессируется на злокачественных плазматических клетках множественной миеломы (см., например, Gupta et al., Amer. J. Clin. Pathology, 132(5):728-732 (2009); и Lin et al., Amer. J. Clin. Pathology, 121(4):482-488 (2004)).
Таким образом, существует потребность в композициях, которые могут быть использованы в способах лечения множественной миеломы. Это изобретение предусматривает такие композиции и способы.
Сущность изобретения
Изобретение относится к химерному рецептору антигена (CAR), который содержит (а) одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), направленный против антигена созревания В-клеток (ВСМА), содержащий (i) CDR тяжелой цепи CDR1, (ii) CDR2 тяжелой цепи, (iii) CDR3 тяжелой цепи, (iv) CDR1
- 1 044661 лёгкой цепи, (v) CDR2 лёгкой цепи и (vi) CDR3 лёгкой цепи, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; (b) трансмембранный домен CD28 или CD8a и (с) один или более внутриклеточных доменов сигналинга Т-клеток, выделенных из белка, выбранного из группы, состоящей из CD28, CD3Z, FcRy, CD27, ОХ40 и белка 4-1ВВ.
Кроме того, изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR по изобретению.
В другом аспекте изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.
В еще одном аспекте изобретение относится к выделенной клетке, которая экспрессирует CAR по изобретению.
В еще одном аспекте изобретение относится к выделенной клетке, которая содержит выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.
В еще одном аспекте изобретение относится к выделенной клетке, которая содержит экспресснойный вектор по изобретению.
Выделенная клетка по изобретению может представлять собой Т-клетку или NK-клетку.
В еще одном аспекте изобретение относится к композиции, содержащей выделенную клетку по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу разрушения клеток множественной миеломы, который включает контактирование клеток множественной миеломы, экспрессирующих ВСМА, с одной или более чем одной из выделенных Т-клеток или NK-клеток по изобретению, где CAR экспрессируется и связывается с ВСМА на клетках множественной миеломы, и клетки множественной миеломы разрушаются.
В еще одном аспекте изобретение относится к применению CAR по изобретению при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.
В еще одном аспекте изобретение относится к применению выделенной нуклеиновой кислоты по изобретению при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.
В еще одном аспекте изобретение относится к применению экспрессионного вектора по изобретению при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.
В еще одном аспекте изобретение относится к применению выделенной клетки по изобретению при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.
В еще одном аспекте изобретение относится к применению композиции по изобретению при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1А и 1В представляют собой графики, на которых изображены экспериментальные данные, иллюстрирующие характер экспрессии ВСМА в различных типах человеческих клеток, определенный с помощью количественной ПЦР. Результаты выражены как число копий кДНК ВСМА на 105 копий кДНК актина.
Фиг. 2A-L представляют собой графики, на которых изображены экспериментальные данные, иллюстрирующие, что экспрессия ВСМА на клеточной поверхности была обнаружена на нескольких клеточных линиях миеломы, но не на других типах клеток, как описано в примере 1. Во всех графиках сплошная линия представляет окрашивание анти-ВСМА-антителами, а пунктирная линия представляет окрашивание контрольными антителами, подходящими по изотипу. На всех графиках клетки гейтировали по живым клеткам.
Фиг. 3А представляет собой схему, на которой изображена конструкция из нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-BCMA-CAR. В направлении с N-конца к С-концу анти-BCMA-CAR включает антиВСМА scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы CD8a, цитоплазматическую часть молекулы CD28 и цитоплазматическую часть молекулы CD3Z.
Фиг. 3B-D представляют собой графики, на которых изображены экспериментальные данные, иллюстрирующие, что анти-bcma1-CAR, анти-bcma2-CAR и SP6-CAR (описаны в примере 2) экспрессируются на поверхности Т-клеток. Минимальное анти-Fab-окрашивание произошло на нетрансдуцированных (UT, untransduced) клетках. На всех графиках клетки гейтировали по CD3+-лимфоцитам. Цифры на графиках являются процентами клеток в каждом квадранте.
Фиг. 4А-С представляют собой графики, на которых изображены экспериментальные данные, иллюстрирующие, что Т-клетки, экспрессирующие анти-BCMA-CAR, вызывают дегрануляцию Т-клеток ВСМА-специфическим образом, как описано в примере 3. На графиках клетки гейтировали по живым CD3+-лимфоцитам. Цифры на графиках являются процентами клеток в каждом квадранте.
Фиг. 5A-D представляют собой графики, на которых изображены экспериментальные данные, иллюстрирующие, что Т-клетки, экспрессирующие анти-BCMA-CAR, вызывают дегрануляцию Т-клеток ВСМА-специфическим образом, как описано в примере 3. На графиках клетки гейтировали по живым CD3+-лимфоцитам. Цифры на графиках являются процентами клеток в каждом квадранте.
- 2 044661
Фиг. 6А-С представляют собой графики, на которых изображены экспериментальные данные, иллюстрирующие, что Т-клетки, экспрессирующие анти-BCMA-CAR, продуцируют цитокины IFNy, IL-2 и TNF ВСМА-специфическим образом, как описано в примере 3. На графиках клетки гейтировали по живым CD3+-лимфоцитам. Цифры на графиках являются процентами клеток в каждом квадранте.
Фиг. 7А представляет собой график, который изображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что Т-клетки, экспрессирующие анти-bcma2-CAR, специфически пролиферируют в ответ на ВСМА.
Фиг. 7В представляет собой график, который изображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что Т-клетки, экспрессирующие SP6-CAR, не пролиферируют специфически в ответ на ВСМА.
Фиг. 7С и 7D представляют собой графики, на которых изображены экспериментальные данные, иллюстрирующие, что Т-клетки от донора А, экспрессирующие анти-bcma2-CAR, специфически убивают клеточные линии множественной миеломы Н929 (фиг. 6С) и RPMI8226 (фиг. 6D) в четырехчасовом анализе цитотоксичности при различных соотношениях эффектор: клетка-мишень. Т-клетки, трансдуцированные отрицательным контролем SP6-CAR, индуцируют гораздо более низкие уровни цитотоксичности во всех соотношениях эффектор: мишень. Для всех соотношений эффектор: мишень была определена цитотоксичность в двух повторах, и результаты представлены в виде среднего ±-стандартная ошибка среднего.
Фиг. 8А представляет собой график, который изображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что ВСМА экспрессируется на поверхности первичных клеток множественной миеломы костного мозга от пациента с миеломой 3, как описано в примере 5. На графике клетки гейтировали по CD38h,gh CD56+
-плазматическим клеткам, которые составляют до 40% клеток костного мозга.
Фиг. 8В представляет собой график, на котором изображены экспериментальные данные, иллюстрирующие, что аллогенные Т-клетки от донора С, трансдуцированные анти-bcma2-CAR, продуцируют IFNy после совместного культивирования с необработанными клетками костного мозга от пациента с миеломой 3, как описано в примере 5. Фиг. 8В также иллюстрирует, что Т-клетки от одного и того же аллогенного донора, экспрессирующие анти-bcma2-CAR, продуцируют гораздо меньше IFNy, когда они культивированы с мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) от пациента с миеломой 3. Кроме того, Т-клетки от донора С, экспрессирующие SP6-CAR, специфически не распознают костный мозг от пациента с миеломой 3.
Фиг. 8С представляет собой график, который изображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что плазмоцитома, резецированная у пациента с миеломой 1, состоит на 93% из плазматических клеток, и эти первичные плазматические клетки экспрессируют ВСМА, что показано с помощью проточной цитометрии на ВСМА (сплошная линия) и путем окрашивания изотипическим контролем (пунктирная линия). На всех графиках клетки гейтировали по плазматическим клеткам.
Фиг. 8D представляет собой график, который изображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что Т-клетки от пациента с миеломой 1, экспрессирующие анти-bcma2-CAR, продуцируют IFNy специфически в ответ на аутологичные клетки плазмоцитомы.
Фиг. 8Е представляет собой график, показывающий экспериментальные данные, иллюстрирующие, что Т-клетки от пациента с миеломой 1, экспрессирующие анти-bcma2-CAR, специфически убивают аутологичные клетки плазмоцитомы при низком соотношении эффектор: мишень.
Напротив, Т-клетки от пациента с миеломой 1, экспрессирующие SP6-CAR, демонстрируют низкие уровни цитотоксичности против аутологичных клеток плазмоцитомы. Для всех соотношений эффектор: мишень была определена цитотоксичность в двух повторах, и результаты представлены в виде среднего ±-стандартная ошибка среднего.
Фиг. 9А представляет собой график, который изображает экспериментальные данные, иллюстрирующие, что Т-клетки, трансдуцированные анти-bcma2-CAR, могут разрушать верифицированные опухоли множественной миеломы у мышей.
Фиг. 9В представляет собой график, который изображает выживание мышей с опухолями, получавших Т-клетки, экспрессирующие анти-bcma2-CAR, по сравнению с контрольной группой.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к химерному рецептору антигена, который содержит (а) одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), направленный против антигена созревания В-клеток, содержащий (i) CDR тяжелой цепи CDR1, (ii) CDR2 тяжелой цепи, (iii) CDR3 тяжелой цепи, (iv) CDR1 лёгкой цепи, (v) CDR2 лёгкой цепи и (vi) CDR3 лёгкой цепи, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; (b) трансмембранный домен CD28 или CD8a и (с) один или более внутриклеточных доменов сигналинга Т-клеток, выделенных из белка, выбранного из группы, состоящей из CD28, CD3Z, FcRy, CD27, ОХ40 и белка 4-1ВВ.
Кроме того, изобретение относится к выделенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный рецептор антигена (CAR), где CAR содержит фрагмент распознавания антигена и фрагмент Т-клеточной активации. Химерный рецептор антигена (CAR) является искусственно создан
- 3 044661 ным гибридным белком или полипептидом, содержащим антигенсвязывающий домен антитела (например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)), связанный с Т-клеточным сигналингом или доменами Т-клеточной активации. CAR имеют возможность перенаправлять Т-клеточную специфичность и реактивность на выбранную мишень МНС-неограниченным образом, используя антигенсвязывающие свойства моноклональных антител. МНС-неограниченное распознавание антигена дает Т-клеткам, экспрессирующим CAR, способность распознавать антиген независимо от процессинга антигена, таким образом минуя главный механизм избегания опухоли. Более того, при экспрессии в Т-клетках CAR преимущественно не димеризуются с альфа- и бета-цепями эндогенного Т-клеточного рецептора (TCR).
Понятие последовательности нуклеиновой кислоты охватывает полимеры ДНК или РНК, т.е. полинуклеотиды, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и которые могут содержать неприродные или измененные нуклеотиды.
Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид, используемые в данном описании, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, рибонуклеотидов (РНК) или дезоксирибонуклеотидов (ДНК). Эти термины относятся к первичной структуре молекулы, и, таким образом, включают дву- и одноцепочечную ДНК, а также дву-и одноцепочечную РНК. Термины включают, в качестве эквивалентов, аналоги РНК или ДНК, изготовленные из нуклеотидных аналогов и модифицированных полинуклеотидов, таких как, но не ограничиваясь ими, метилированные и/или кэппированные полинуклеотиды.
Под выделенной подразумевается удаление нуклеиновой кислоты из ее природной среды. Тем не менее, следует понимать, что нуклеиновые кислоты и белки могут быть собраны в состав с разбавителями или адъювантами и по-прежнему для практических целей быть выделены. Например, нуклеиновые кислоты, как правило, смешивают с приемлемым носителем или разбавителем, когда используют их для введения в клетки.
Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует CAR, который содержит фрагмент распознавания антигена, направленный против антигена созревания В-клеток (ВСМА, также известного как CD269). ВСМА является членом суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли (см., например, Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192(1):129-135 (2000), и Mackay et al., Annu. Rev. Immunol., 21:231-264 (2003)). ВСМА связывает фактор В-клеточной активации (BAFF) и лиганд, индуцирующий пролиферацию (APRIL) (см., например, Mackay et al., см. выше, и Kalled et al., Immunological Reviews, 204:43-54 (2005)). Сообщалось, что среди доброкачественных клеток ВСМА экспрессируется в основном в плазматических клетках и субпопуляции зрелых В-клеток (см., например, Laabi et al., EMBO J., 11(11):3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22(7):1147-1154 (1994); Kalled et al., выше; O'Connor et al., J. Exp. Medicine, 199(1):91-97 (2004); и Ng et al., J. Immunol., 173(2):807-817 (2004)). Мыши, дефицитные по ВСМА, здоровы и имеют нормальное число В-клеток, но выживание долгоживущих плазматических клеток нарушается (см., например, O'Connor et al, выше; Xu et al., Mol. Cell. Biol., 21(12):4067-4074 (2001); и Schiemann et al., Science, 293(5537):2111-2114 (2001)). РНК ВСМА была обнаружена повсеместно в клетках множественной миеломы, а белок ВСМА был обнаружен на поверхности плазматических клеток от пациентов с множественной миеломой несколькими исследователями (см., например, Novak et al., Blood, 103(2):689-694 (2004); Neri et al., Clinical Cancer Research, 13(19):5903-5909 (2007); Bellucci et al., Blood, 105(10):3945-3950 (2005); и Moreaux et al., Blood, 103(8):3148-3157(2004)).
Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует CAR, который содержит фрагмент распознавания антигена, содержащий моноклональное антитело, направленное против ВСМА, или его антигенсвязывающую часть. Термин моноклональные антитела, используемый в данном документе, относится к антителам, которые продуцируются одним клоном В-клеток и связываются с одним и тем же эпитопом. Напротив, поликлональные антитела относятся к популяции антител, которые продуцируются различными В-клетками и связываются с различными эпитопами одного и того же антигена. Фрагмент распознавания антигена в CAR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, может быть целым антителом или фрагментом антитела. Целое антитело, как правило, состоит из четырех полипептидов: двух идентичных копий полипептида тяжелой (Н) цепи и двух идентичных копий полипептида легкой (L) цепи. Каждая из тяжелых цепей содержит одну Nконцевую вариабельную (VH) область и три С-концевые константные (CH1, CH2 и CH3) области, а каждая легкая цепь содержит одну N-концевую вариабельную (VL) область и одну С-концевую константную (CL) область. Вариабельные области каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют сайт связывания антигена с антителом. Области VH и VL имеют одинаковую общую структуру, при этом каждая область содержит четыре каркасные области, последовательности которых относительно консервативны. Каркасные области соединены тремя определяющими комплементарность областями (CDR). Три CDR, известные как CDR1, CDR2 и CDR3, образуют гипервариабельную область антитела, которая отвечает за связывание антигена.
Термины фрагмент антитела, функциональный фрагмент антитела и антигенсвязывающий фрагмент используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения одного или более чем одного фрагмента или части антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (см., в целом, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)). Фрагмент распознавания антигена в CAR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, может
- 4 044661 содержать любой фрагмент ВСМА-связывающего антитела. Желательно, чтобы фрагмент антитела содержал, например, одну или более чем одну CDR, вариабельную область (или ее части), константную область (или ее части) или их комбинации. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваясь ими, (i) Fab-фрагмент, который представляет собой моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент, который представляет собой бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов одного плеча антитела; (iv) одноцепочечный Fv (scFv), который представляет собой одновалентную молекулу, состоящую из двух доменов Fv-фрагмента (т.е. VL и VH), соединенных синтетическим линкером, который позволяет синтезировать два домена в виде одной полипептидной цепи (см., например, Bird et al., Science, 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988); и Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)); и (v) двойное антитело, представляющее собой димер полипептидных цепей, где каждая полипептидная цепь содержит VH, соединенный с VL пептидным линкером, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание VH и VL на одной и той же полипептидной цепи, тем самым обеспечивая спаривание комплементарных доменов различных VH-VL полипептидных цепей для образования димерной молекулы, имеющей два функциональных антигенсвязывающих участка. Фрагменты антител известны в данной области и описаны более подробно, например, в публикации патентной заявки США 2009/0093024 А1. В предпочтительном воплощении фрагмент распознавания антигена в CAR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержит одноцепочечный анти-BCMA-Fv (scFv).
Антигенсвязывающая часть или фрагмент моноклонального антитела может иметь любой размер при условии, что эта часть связывается с ВСМА. В этом отношении антигенсвязывающая часть или фрагмент моноклонального антитела, направленного против ВСМА (также называемого здесь моноклональным анти-ВСМА-антителом), желательно, содержит от примерно 5 до 18 аминокислот (например, примерно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или в диапазоне, определенном любыми двумя из указанных выше значений).
В одном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует фрагмент распознавания антигена, который содержит вариабельную область моноклонального антиВСМА-антитела. В этом отношении фрагмент распознавания антигена содержит вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, или и вариабельную область легкой цепи, и вариабельную область тяжелой цепи моноклонального анти-ВСМА-антитела. Предпочтительно, фрагмент распознавание антигена в CAR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, включает вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи моноклонального анти-ВСМА-антитела. Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела, которое связывается с ВСМА, раскрыты, например, в публикации международной патентной заявки WO 2010/104949.
В другом воплощении последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует CAR, который включает сигнальную последовательность. Сигнальная последовательность может быть расположена на аминоконце фрагмента распознавания антигена (например, вариабельная область антиВСМА-антитела). Сигнальная последовательность может содержать любую подходящую сигнальную последовательность. В одном воплощении сигнальная последовательность представляет собой последовательность рецептора человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) или сигнальную последовательность CD8a.
В другом воплощении CAR содержит шарнирную последовательность. Специалисту в данной области будет понятно, что шарнирная последовательность является короткой последовательностью аминокислот, которая облегчает гибкость антитела (см., например, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2):89-99 (2004)). Шарнирная последовательность может быть расположена между фрагментом распознавания антигена (например, анти-BCMA-scFv) и фрагментом Т-клеточной активации. Шарнирная последовательность может быть любой подходящей последовательностью, полученной из любой подходящей молекулы. В одном воплощении, например, шарнирная последовательность получена из молекулы человеческого CD8a или молекулы CD28.
Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует CAR, содержащий фрагмент Т-клеточной активации. Фрагмент Т-клеточной активации может быть любым подходящим фрагментом, полученным из любой подходящей молекулы. В одном воплощении, например, фрагмент Т-клеточной активации содержит трансмембранный домен. Трансмембранный домен может быть любым трансмембранным доменом, полученным из любой молекулы, известной в данной области. Например, трансмембранный домен может быть получен из молекулы CD8a или из молекулы CD28. CD8 является трансмембранным гликопротеином, который выступает в качестве корецептора Т-клеточного рецептора (TCR) и экспрессируется в основном на поверхности цитотоксических Т-клеток. Наиболее распространенная форма CD8 существует в виде димера, состоящего из цепей CD8a и CD8e. CD28 экспрессируется на Т-клетках и обеспечивает костимулирующие сигналы, необходимые для активации Т-клеток. CD28 является рецептором для CD80 (В7.1) и CD86 (В7.2). В предпочтительном воплощении CD8a и CD28
- 5 044661 являются человеческими.
В дополнение к трансмембранному домену фрагмент Т-клеточной активации также содержит внутриклеточный (т.е. цитоплазматический) домен сигналинга Т-клеток. Домен межклеточного сигналинга Т-клеток может быть получен из молекулы CD28, молекулы CD3 дзета (ζ) или их модифицированных версий, из человеческой гамма-цепи Fc-рецептора (FcRy), молекулы CD27, молекулы ОХ40, молекулы 4-1ВВ или других молекул внутриклеточного сигналинга, известных в данной области. Как обсуждалось выше, CD28 представляет собой Т-клеточный маркер, важный для костимуляции Т-клеток. CD3Z ассоциирует с TCR, чтобы сформировать сигнал, и содержит иммунорецепторные активирующие тирозинсодержащие повторы (ITAM). 4-1ВВ, также известный как CD137, передает мощный костимулирующий сигнал на Т-клетки, усиливая дифференцировку и повышая долгосрочное выживание Т-лимфоцитов. В предпочтительном воплощении CD28, CD3Z, 4-1ВВ, ОХ40 и CD27 являются человеческими.
Домен Т-клеточной активации CAR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, может содержать любой из вышеупомянутых трансмембранных доменов и любой один или более чем один из вышеупомянутых доменов межклеточного сигналинга Т-клеток в любой комбинации. Например, последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать CAR, содержащий трансмембранный домен CD28 и внутриклеточные домены Т-клеточного сигналинга CD28 и CD3Z. Альтернативно, например, последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать CAR, содержащий трансмембранный домен CD8a и внутриклеточные домены Т-клеточного сигналинга CD28, CD3Z, гамма-цепи Fc-рецептора (FcRy) и/или 4-1ВВ.
В одном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует CAR, который содержит в направлении от 5' к 3' сигнальную последовательность рецептора гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рецептора GM-CSF), анти-BCMA-scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы человеческого CD8a, цитоплазматический домен Т-клеточного сигналинга молекулы человеческого CD28 и домен Т-клеточного сигналинга молекулы человеческого CD3Z. В другом воплощении последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует CAR, который содержит в направлении от 5' к 3' сигнальную последовательность человеческого CD8a, анти-BCMA-scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы человеческого CD8a, цитоплазматический домен Т-клеточного сигналинга молекулы человеческого CD28 и домен Т-клеточного сигналинга молекулы человеческого CD3Z. В другом воплощении последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует CAR, который содержит в направлении от 5' к 3' сигнальную последовательность человеческого CD8a, анти-BCMA-scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы человеческого CD8a, цитоплазматическую область Т-клеточного сигналинга человеческой молекулы 4-1ВВ и/или цитоплазматическую область Т-клеточного сигналинга молекулы человеческого ОХ40, и домен Т-клеточного сигналинга молекулы человеческого CD3Z. Например, последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
Изобретение также относится к выделенному или очищенному химерному рецептору антигена (CAR), кодируемому последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать CAR любой длины, т.е. CAR может содержать любое число аминокислот, при условии, что CAR сохраняет свою биологическую активность, например, способность специфически связываться с антигеном, обнаруживать больные клетки у млекопитающих или лечить или предотвращать заболевание у млекопитающего и т.д. Например, CAR может содержать 50 или более (например, 60 или более, 100 или более, или 500 или более аминокислот), но меньше 1000 (например, 900 или менее, 800 или менее, 700 или менее, или 600 или менее) аминокислот. Предпочтительно, CAR имеет от примерно 50 до примерно 700 аминокислот (например, примерно 70, примерно 80, примерно 90, примерно 150, примерно 200, примерно 300, примерно 400, примерно 550 или примерно 650 аминокислот), от примерно 100 до примерно 500 аминокислот (например, примерно 125, примерно 175, примерно 225, примерно 250, примерно 275, примерно 325, примерно 350, примерно 375, примерно 425, примерно 450 или примерно 475 аминокислот) или в диапазоне, определяемом любыми двумя из указанных выше значений.
В объем данного изобретения включены последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют функциональные части CAR, описанные в данном документе.
Термин функциональная часть, используемый в отношении к CAR, относится к любой части или фрагменту CAR согласно изобретению, где часть или фрагмент сохраняет биологическую активность того CAR, частью которого он является (родительского CAR). Функциональные части охватывают, например, те части CAR, которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени или обнаруживать, излечивать или предотвращать заболевание в подобной степени, в той же степени или в большей степени, чем родительский CAR.
Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать функциональную часть CAR, которая содержит дополнительные аминокислоты на амино- или карбоксиконце этой части или на обоих концах, где дополнительные аминокислоты не найдены в аминокислотной последо
- 6 044661 вательности родительского CAR. Желательно, чтобы дополнительные аминокислоты не мешали биологической функции функциональной части, например, распознаванию клетки-мишени, обнаружению рака, лечению или профилактике рака и т.д. Более предпочтительно, чтобы дополнительные аминокислоты повышали биологическую активность CAR по сравнению с биологической активностью родительского CAR.
Данное изобретение также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим функциональные варианты вышеупомянутого CAR. Термин функциональный вариант, используемый в данном документе, относится к CAR, полипептиду или белку, имеющему существенную или значительную идентичность или сходство последовательности с CAR, закодированным последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, при этом функциональный вариант сохраняет биологическую активность CAR, вариантом которого она является. Функциональные варианты охватывают, например, те варианты CAR, описанные в данном документе (родительский CAR), которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени в подобной степени, в той же степени или в большей степени, чем родительский CAR.
Функциональный вариант может, например, включать аминокислотную последовательность CAR, закодированную последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, по меньшей мере с одной консервативной аминокислотной заменой. Фраза консервативная аминокислотная замена или консервативная мутация относится к замене одной аминокислоты другой аминокислотой с общими свойствами. Функциональным способом определить общие свойства у отдельных аминокислот является анализ нормированных частот аминокислотных замен в соответствующих белках гомологичных организмов (Schulz, G.E. and Schirmer, R.H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). Согласно таким анализам могут быть определены группы аминокислот, где аминокислоты в пределах группы заменяются преимущественно друг на друга, и поэтому наиболее похожи друг на друга по их влиянию на общую структуру белка (Schulz, G.E. and Schirmer, R.H., см. выше). Примеры консервативных мутаций включают аминокислотные замены аминокислот внутри подгрупп, описанных выше, например лизина на аргинин, и наоборот, таким образом, чтобы положительный заряд мог быть сохранен; глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, и наоборот, таким образом, чтобы отрицательный заряд мог быть сохранен; серина на треонин таким образом, чтобы свободный -ОН мог быть сохранен; и глутамина на аспарагин таким образом, чтобы свободный -NH2 мог быть сохранен.
Альтернативно или дополнительно, функциональные варианты могут включать аминокислотную последовательность родительского CAR по меньшей мере с одной неконсервативной аминокислотной заменой. Неконсервативные мутации включают замены аминокислот из различных групп, например, лизина на триптофан или фенилаланина на серин и т.д. В этом случае для неконсервативной аминокислотной замены предпочтительно, чтобы она не мешала или не ингибировала биологическую активность функционального варианта. Неконсервативная аминокислотная замена может повысить биологическую активность функционального варианта, так что биологическая активность функционального варианта увеличивается по сравнению с родительским CAR.
Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать CAR (в том числе его функциональные части и функциональные варианты), который включает синтетические аминокислоты вместо одной или более чем одной природной аминокислоты. Такие синтетические аминокислоты известны в данной области и включают, например, аминоциклогексанкарбоновую кислоту, норлейцин, α-амино-n-декановую кислоту, гомосерин, S-ацетиламинометилцистеин, транс-3- и транс-4гидроксипролин, 4-аминофенилаланин, 4-нитрофенилаланин, 4-хлорофенилаланин, 4-карбоксифенилаланин, β-фенилсерингидроксифенилаланин, β-фенилглицин, α-нафтилаланин, циклогексилаланин, циклогексилглицин, индолин-2-карбоновую кислоту, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, аминомалоновую кислоту, моноамид аминомалоновой кислоты, N'-бензил-N'-метиллизин, N',N'-дибензиллизин, 6-гидроксилизин, орнитин, α-аминоциклопентанкарбоновую кислоту, а-аминоциклогексанкарбоновую кислоту, а-аминоциклогептанкарбоновую кислоту, а-(2-амино-2-норборнан)карбоновую кислоту, α,γ-диаминомасляную кислоту, α,β-диаминопропионовую кислоту, гомофенилаланин и а-трет-бутилглицин.
Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать CAR (в том числе его функциональные части и функциональные варианты), который гликозилирован, амидирован, карбоксилирован, фосфорилирован, этерифицирован, N-ацилирован, циклизован, например, через дисульфидный мостик, или превращен в кислотно-аддитивную соль и/или, возможно, димеризован, полимеризован или конъюгирован.
В предпочтительном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует CAR, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть получена с использованием способов, известных в данной области. Например, последовательности нуклеиновой кислоты,
- 7 044661 полипептиды и белки могут быть получены рекомбинантным путем с использованием стандартных методик рекомбинантной ДНК (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994). Кроме того, синтетически полученная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, может быть выделена и/или очищена из источника, такого как растение, бактерия, насекомое или млекопитающее, например, крыса, человек и т.д. Способы выделения и очистки хорошо известны в данной области. Альтернативно, последовательности нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, могут быть синтезированы коммерческим образом. В этом отношении последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть синтетической, рекомбинантной, выделенной и/или очищенной.
Данное изобретение также относится к вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR согласно изобретению. Вектор может быть, например, плазмидой, космидой, вирусным вектором (например, ретровирусным или аденовирусным) или фагом. Подходящие векторы и способы получения векторов хорошо известны в данной области (например, Sambrook et al., см. выше, и Ausubel et al., см. выше).
В дополнение к последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей CAR, вектор предпочтительно содержит последовательности, контролирующие экспрессию, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы транскрипции, внутренние сайты посадки рибосомы (IRES) и т.п., которые обеспечивают экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Иллюстративные последовательности, контролирующие экспрессию, известны в данной области и описаны, например, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).
Большое число промоторов из множества различных источников, включая конститутивные, индуцибельные и репрессируемые промоторы, хорошо известны в данной области. Типичными источниками промоторов являются, например, вирусы, млекопитающие, насекомые, растения, дрожжи и бактерии, и подходящие промоторы из этих источников легко доступны или могут быть получены синтетическим путем на основании общедоступных последовательностей, например, из депозитариев, таких как АТСС, а также из других коммерческих или личных источников. Промоторы могут быть однонаправленными (т.е. инициировать транскрипцию в одном направлении) или двунаправленными (т.е. инициировать транскрипцию либо в 3'-, либо в 5'-направлении). Неограничивающие примеры промоторов включают, например, систему бактериальной экспрессии Т7, систему бактериальной экспрессии pBAD (araA), промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40 и промотор RSV. Индуцируемые промоторы включают, например, систему Tet (патенты США № 5464758 и 5814618), индуцируемую систему экдизона (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:3346-3351 (1996)), систему T-REX™ (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), систему LACSWITCH™ (Stratagene, Сан-Диего, Калифорния) и систему тамоксифен-индуцируемой рекомбиназы Cre-ERT (Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27:4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28:e99 (2000); патент № США 7112715; и Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308:123-144 (2005)).
Термин энхансер, используемый в данном документе, относится к последовательности ДНК, которая повышает транскрипцию, например, последовательности нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Энхансеры могут быть расположены за много тысяч пар нуклеотидов в стороне от кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты и могут опосредовать связывание регуляторных факторов, паттерны метилирования ДНК или изменения в структуре ДНК. Большое число энхансеров из множества различных источников хорошо известны в данной области и доступны в виде или внутри клонированных полинуклеотидов (например, из таких депозитариев как АТСС, а также других коммерческих или личных источников). Большое число полинуклеотидов, содержащих промоторы (например, часто используемый промотор CMV), также содержат энхансерные последовательности. Энхансеры могут быть расположены выше, в пределах или ниже кодирующих последовательностей. Термин энхансеры Ig относится к энхансерным элементам, полученным из энхансерных областей, картированных в пределах иммуноглобулинового (Ig) локуса (такие энхансеры включают, например, 5'-энхансеры тяжелой цепи (мю), 5'-энхансеры легкой цепи (каппа), интронные энхансеры каппа и мю и 3'-энхансеры (см. в целом Paul W.E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363; и патент № США 5885827).
Вектор также может содержать ген селективного маркера. Термин ген селективного маркера, используемый в данном документе, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая позволяет клеткам экспрессировать последовательность нуклеиновой кислоты, чтобы быть специфически выбранными в пользу него или против, в присутствии соответствующего селективного агента. Подходящие селективные маркерные гены известны в данной области и описаны, например, в международных патентных заявках WO 1992/08796 и WO 1994/28143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981); Santerre et al., Gene, 30:147 (1984); Kent et al., Science, 237:901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11:223 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl.
- 8 044661
Acad. Sci. USA, 48:2026 (1962); Lowy et al., Cell, 22:817 (1980); и патентах США № 5122464 и 5770359.
В некоторых воплощениях вектор является эписомальным экспрессионным вектором или эписомой, которая способна к репликации в клетке-хозяине и сохраняется в качестве внехромосомного сегмента ДНК в клетке-хозяине в присутствии соответствующего селективного давления (см., например, Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004)). Типичные коммерчески доступные эписомальные экспрессионные вектора включают, но не ограничиваясь ими, эписомальные плазмиды, которые используют ядерный антиген вируса Эпштейна-Барр 1 (EBNA1) и сайт начала репликации (oriP) вируса ЭпштейнаБарр (EBV). Векторы pREP4, pCEP4, pREP7 и pcDNA3.1 от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) и pBK-CMV от Stratagene (Ла Джолла, Калифорния) являются неограничивающими примерами эписомального вектора, который использует Т-антиген и сайт начала репликация SV40 вместо EBNA1 и oriP.
Другие подходящие векторы включают интегрирующие экспрессионные векторы, которые могут случайным образом интегрировать в ДНК клетки-хозяина, или могут включать сайт рекомбинации для включения специфической рекомбинации между экспрессионным вектором и хромосомой клеткихозяина. Такие интегрирующие экспрессионные векторы могут использовать эндогенные последовательности, контролирующие экспрессию хромосом клетки-хозяина, чтобы осуществить экспрессию желаемого белка. Примеры векторов, которые интегрируют сайт-специфическим образом, включают, например, компоненты системы Flp-ln от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) (например, pcDNA™5/FRT), или системы Cre-lox, такие, как могут быть найдены в pExchange-6 Core Vectors от Stratagene (Ла Джолла, Калифорния). Примеры векторов, которые случайным образом интегрируют в хромосомы клеткихозяина, включают, например, pcDNA3.1 (при введении в отсутствие Т-антигена) от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) и pCI или pFNIOA (ACT) FLEXI™ от Promega (Мадисон, Висконсин).
Также могут использоваться вирусные векторы. Типичные вирусные экспрессионные векторы включают, но не ограничиваясь ими, векторы на основе аденовирусов (например, система Per.C6 на основе аденовируса от Crucell, Inc. (Лейден, Нидерланды)), векторы на основе лентивируса (например, pLP1 на основе лентивируса от Life Technologies (Карлсбад, Калифорния)) и ретровирусные векторы (например, pFB-ERV плюс pCFB-EGSH от Stratagene (La Jolla, CA)). В предпочтительном воплощении вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.
Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту согласно изобретению, кодирующую CAR, может быть введен в клетку-хозяина, которая способна экспрессировать CAR, закодированный таким образом, включая любую подходящую прокариотическую или эукариотическую клетку. Предпочтительными клетками-хозяевами являются те, которые могут быть легко и надежно выращены, имеют достаточно быстрые темпы роста, имеют хорошо охарактеризованные системы экспрессии и могут быть трансформированы или трансфицированы легко и эффективно.
Используемый в данном документе термин клетка-хозяин относится к любому типу клеток, которые могут содержать экспрессионный вектор. Клетка-хозяин может быть эукариотической клеткой, например, клеткой растения, животного, гриба или водоросли, или может быть прокариотической клеткой, например, бактерией или простейшим. Клетка-хозяин может быть культивированной клеткой или первичной клеткой, т.е. выделенной непосредственно из организма, например, человека. Клетка-хозяин может быть прикрепленной клеткой или суспендированной клеткой, т.е. клеткой, которая растет в суспензии. Подходящие клетки-хозяева известны в данной области и включают, например, клетки DH5a E. coli, клетки яичников китайского хомячка, клетки обезьяны VERO, клетки COS, клетки НЕК293 и т.п. Для амплификации или репликации рекомбинантного экспрессионного вектора клетка-хозяин может быть прокариотической клеткой, например клеткой DH5a. Для получения рекомбинантного CAR клеткахозяин может быть клеткой млекопитающего. Клетка-хозяин предпочтительно является клеткой человека. Клетка-хозяин может быть клеткой любого типа, может происходить из любого типа ткани и может находиться на любой стадии развития. В одном воплощении клетка-хозяин может быть лимфоцитом периферической крови (PBL), мононуклеарной клеткой периферической крови (РВМС) или натуральным киллером (NK). Предпочтительно клетка-хозяин является натуральным киллером (NK). Более предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой Т-клетку. Способы выбора подходящих клеток-хозяев млекопитающих и способы трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и очистки клеток известны в данной области.
Данное изобретение относится к выделенной клетки-хозяину, которая экспрессирует последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующую CAR, описанный в данном документе. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой Т-клетку. Т-клеток согласно изобретению может быть любой Т-клеткой, такой как культивированная Т-клетка, например первичная Т-клетка, или Т-клетка из культивированной Т-клеточной линии, или Т-клеткой, полученной от млекопитающего. Если Т-клетка получена от млекопитающего, то она может быть получена из различных источников, включая, но не ограничиваясь ими, кровь, костный мозг, лимфатические узлы, вилочковую железу или другие ткани или жидкости. Т-клетки также могут быть обогащены или очищены. Т-клетка предпочтительно представляет собой Т-клетку человека (например, выделенную из человека). Т-клетка может находиться на любой стадии развития, включая, но не ограничиваясь ими, CD4+/CD8+ дважды положительную
- 9 044661
Т-клетку, CD4+ Т-хелперную клетку, например клетку Th1 и Th2, CD8+ Т-клетку (например, цитотоксическую Т-клетку), клетку, инфильтрирующую опухоль, Т-клетку памяти, наивную Т-клетку и т.п. В одном воплощении Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку или CD4+ Т-клетку. Т-клеточные линии могут быть получены, например, из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, Вирджиния) и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), и включают, например, клетки Jurkat (АТСС TIB-152), клетки Sup-Π (АТСС CRL-1942), клетки RPMI 8402 (DSMZACC-290), клетки Karpas 45 (DSMZ АСС-545) и их производные.
В другом воплощении клетка-хозяин представляет собой натуральный киллер (NK). NK-клетки являются типом цитотоксического лимфоцита, который играет определенную роль во врожденной иммунной системе. NK-клетки определяются как большие гранулярные лимфоциты и представляют собой третий вид клеток, дифференцирующихся из общего лимфоидного предшественника, который также дает В- и Т-лимфоциты (см., например, Immunobiology, 5th ed., Janeway et al., eds., Garland Publishing, New York, NY (2001)). NK-клетки дифференцируются и созревают в костном мозге, лимфатических узлах, селезенке, миндалинах и тимусе. После созревания NK-клетки вступают в кровоток в виде больших лимфоцитов с отдельными цитотоксическими гранулами. NK-клетки способны распознавать и убивать аномальные клетки, такие как, например, некоторые опухолевые клетки и инфицированные вирусом клетки, и, по-видимому, играют важную роль во врожденной иммунной защите от внутриклеточных патогенов. Как описано выше в отношении Т-клеток, NK-клетка может быть любой NK-клеткой, такой как культивированная NK-клетка, например, первичная NK-клетка или NK-клетка из культивируемой NK-клеточной линии, или NK-клеткой, полученной от млекопитающего. Если NK-клетка получена от млекопитающего, то она может быть получена из различных источников, включая, но не ограничиваясь ими, кровь, костный мозг, лимфатические узлы, вилочковую железу или другие ткани или жидкости. NK-клетки также могут быть обогащены или очищены. NK-клетка предпочтительно представляет собой NK-клетку человека (например, выделенную из человека). NK-клеточные линии могут быть получены, например, из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, Вирджиния) и включают, например, клетки NK-92 (АТСС CRL-2407), клетки NK92MI (АТСС CRL-2408), а также их производные.
Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующая CAR, может быть введена в клетку путем трансфекции, трансформации или трансдукции. Понятия трансфекции, трансформации или трансдукции, используемые в данном документе, относятся к введению одного или более чем одного экзогенного полинуклеотида в клетку-хозяина с помощью физических или химических способов. Многие методики трансфекции известны в данной области и включают, например, копреципитацию ДНК фосфатом кальция (см., например, Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-декстран; электропорацию; опосредованную катионными липосомами трансфекцию; бомбардировку микрочастицами, облегченную частицами вольфрама (Johnston, Nature, 346:776-777 (1990)); и копреципитацию ДНК фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7:2031-2034 (1987)). Фаговые или вирусные векторы могут быть введены в клетки-хозяева после роста инфекционных частиц в подходящих упаковывающих клетках, многие из которых коммерчески доступны.
Без связи с конкретной теорией или механизмом, полагают, что, вызывая антигенспецифический ответ против ВСМА, CAR, кодируемые последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, вызывают одно или более чем одно из следующих явлений: нацеливание и разрушение ВСМАэкспрессирующих раковых клеток, уменьшение или устранение раковых клеток, облегчение инфильтрации мест(а) опухоли иммунными клетками и усиление/удлинение противораковых ответов. Таким образом, изобретение предлагает способ разрушения клеток множественной миеломы, который включает контактирование одной или более чем одной из вышеупомянутых выделенных Т-клеток или натуральных киллеров с популяцией клеток множественной миеломы, которые экспрессируют ВСМА, где CAR образуется и связывается с ВСМА на клетках множественной миеломы, и клетки множественной миеломы разрушаются. Как обсуждалось в данном документе, множественная миелома, также известная как миелома плазматических клеток или болезнь Келлера, представляет собой рак плазматических клеток, которые являются одним из видов белых кровяных клеток, в норме отвечающих за продукцию антител (Raab et al., Lancet, 374:324-329 (2009)). Множественная миелома поражает 1-4 человека на 100000 человек в год. Заболевание чаще встречается у мужчин, и по неизвестным до сих пор причинам в два раза чаще у афроамериканцев, чем у американцев европеоидной расы. Множественная миелома является наиболее редким общегематологическим злокачественным заболеванием (14%) и составляет 1% от всех случаев рака (Raab et al., см. выше). Лечение множественной миеломы обычно включает химиотерапию в высоких дозах с последующей трансплантацией (аллогенной или аутологичной) гемопоэтических стволовых клеток; тем не менее, высокая частота рецидивов является общим признаком пациентов с множественной миеломой, которые прошли такое лечение. Как обсуждалось выше, ВСМА экспрессируется на высоком уровне клетками множественной миеломы (см., например, Novak et al., выше; Neri et al., выше; Bellucci et al., выше; и Moreaux et al., выше).
Одна или более чем одна выделенная Т-клетка, экспрессирующая последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующую анти-ВСМА CAR, описанный в данном документе, может
- 10 044661 контактировать с популяцией клеток множественной миеломы, которые экспрессируют ВСМА ex vivo, in vivo или in vitro. Ex vivo относится к способам, проводимым в или на клетках или ткани в искусственной среде вне организма с минимальным изменением природных условий. Напротив, термин in vivo относится к способу, который проводится в живых организмах в их нормальном, неповрежденном состоянии, в то время как способ in vitro проводится с использованием компонентов организма, которые были извлечены из своего обычного биологического окружения. Способ согласно изобретению предпочтительно включает компоненты ex vivo и in vivo. В связи с этим, например, выделенные Т-клетки, описанные выше, могут быть культивированы ex vivo в условиях, подходящих для экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей анти-BCMA-CAR, а затем непосредственно перенесены млекопитающему (предпочтительно, человеку), страдающему от множественной миеломы. Такой способ переноса клеток в данной области называют адоптивным переносом клеток (ACT), где полученные иммунные клетки пассивно переносят новому реципиенту, чтобы передать новому хозяину функциональные возможности иммунных клеток, полученных от донора. Способы адоптивного переноса клеток для лечения различных видов рака, в том числе гематологических раков, таких как миелома, известны в данной области и описаны, например, в Gattinoni et al., Nat. Rev. Immunol., 6(5): 383-393 (2006); June, CH, J. Clin. Invest., 117(6):1466-76 (2007); Rapoport et al., Blood, 117(3):788-797 (2011); и Barber et al., Gene Therapy, 18:509-516 (2011)).
Данное изобретение также предусматривает способ разрушения клеток лимфомы Ходжкина. Лимфома Ходжкина (ранее известная как болезнь Ходжкина) представляет собой рак иммунной системы, который отличается присутствием типа многоядерных клеток, называемых клетками Рида-Штернберга. Два основных типа лимфомы Ходжкина включают классическую лимфому Ходжкина и узловую лимфому Ходжкина с преобладанием лимфоцитов. Лимфому Ходжкина в настоящее время лечат путем лучевой терапии, химиотерапии или трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, выбирая способ лечения в зависимости от возраста и пола пациента и стадии, объема и гистологического подтипа заболевания. Экспрессия ВСМА была обнаружена на поверхности клеток лимфомы Ходжкина (см., например, Chiu et al., Blood, 109(2):729-739 (2007)).
Когда Т-клетки или NK-клетки вводят млекопитающему, то эти клетки могут быть аллогенными или аутологичными для этого млекопитающего. В аутологичных способах введения клетки (например, кроветворные стволовые клетки или лимфоциты) удаляются из организма млекопитающего, сохраняются (и, возможно, модифицируются) и возвращаются обратно тому же млекопитающему. В аллогенных способах введения млекопитающее получает клетки (например, кроветворные стволовые клетки или лимфоциты) от генетически подобного, но не идентичного донора. Предпочтительно клетки являются аутологичными млекопитающему.
Т-клетки или NK-клетки предпочтительно вводятся человеку в форме композиции, такой как фармацевтическая композиция. Альтернативно, последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующая CAR, или вектор, содержащий кодирующую CAR последовательность нуклеиновой кислоты, могут быть составлены в композицию, такую как фармацевтическая композиция, и введены человеку. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать популяцию Т-клеток или NK клеток, которые экспрессируют CAR согласно изобретению. В дополнение к последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению или к клеткам-хозяевам, которые экспрессируют CAR согласно изобретению, фармацевтическая композиция может содержать другие фармацевтически активные агенты или препараты, такие как химиотерапевтические агенты, например аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевину, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т.п. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция содержит выделенную Т-клетку или NK-клетку, экспрессирующую CAR согласно изобретению, более предпочтительно популяцию Т-клеток или NK-клеток, которые экспрессируют CAR согласно изобретению.
Т-клетки или NK-клетки согласно изобретению могут быть предоставлены в форме соли, например, фармацевтически приемлемой соли. Подходящие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли включают соли, полученные из минеральных кислот, таких как соляная, бромистоводородная, фосфорная, метафосфорная, азотная и серная кислоты, а также из органических кислот, таких как винная, уксусная, лимонная, яблочная, молочная, фумаровая, бензойная, гликолевая, глюконовая, янтарная и арилсульфокислоты, например п-толуолсульфокислота.
Выбор носителя будет определяться частично конкретной согласно изобретению последовательностью нуклеиновой кислоты, вектором или клетками-хозяевами, экспрессирующими CAR, а также конкретным способом, используемым для введения последовательности нуклеиновой кислоты, вектора или клеток-хозяев, экспрессирующих CAR, согласно изобретению. Соответственно, существует множество приемлемых составов фармацевтической композиции данного изобретения. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. Возможно, может быть использована смесь двух или более консервантов. Консервант или его смеси, как правило, присутствуют в количестве от примерно 0,0001 до примерно 2% от общего веса композиции.
- 11 044661
Кроме того, в композиции могут быть использованы буферные агенты. Подходящие буферные агенты включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. Возможно, может быть использована смесь двух или более буферных агентов. Буферный агент или его смеси, как правило, присутствуют в количестве от примерно 0,001 до примерно 4% от общего веса композиции.
Способы получения вводимой (например, вводимой парентеральным путем) композиции известны специалистам в данной области и описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams &Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).
Композиция по изобретению или клетки-хозяева, экспрессирующие CAR, может быть составлена как комплекс включения, такой как циклодекстриновый комплекс, или как липосома. Липосомы могут служить для нацеливания клеток-хозяев (например, Т-клеток или NK-клеток) или последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению на конкретную ткань. Липосомы могут быть также использованы для увеличения периода полужизни последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Для получения липосом доступны многие способы, такие как описанные, например, в Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980), и в патентах США № 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369.
Композиция может использовать систему с отсроченным высвобождением, замедленным высвобождением и пролонгированным высвобождением, так что доставка композиции согласно изобретению происходит до и в течение достаточного времени, чтобы вызвать сенсибилизацию места лечения. Многие типы систем доставки с отсроченным высвобождением доступны и известны специалистам в данной области. С помощью таких систем можно избежать повторных введений композиции, тем самым увеличивая удобство для субъекта и врача, и они могут быть особенно подходящими для определенных воплощений композиции данного изобретения.
Композиция желательно содержит клетки-хозяева, экспрессирующие последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующую CAR, или вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, в количестве, которое является эффективным для лечения или предотвращения множественной миеломы или лимфомы Ходжкина. Используемый в данном документе термин лечение относится к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Предпочтительно, эффект является терапевтическим, т.е. эффект частично или полностью излечивает заболевание и/или неблагоприятный симптом, свойственный заболеванию. Для этого способ согласно изобретению включает введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей клетки-хозяева, экспрессирующие последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующую CAR, или вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от таких факторов, как степень заболевания, возраст, пол и вес человека и способность CAR вызывать желаемый ответ у индивидуума. Например, терапевтически эффективное количество CAR согласно изобретению представляет собой количество, которое связывается с ВСМА на клетках множественной миеломы и разрушает их.
Альтернативно, фармакологический и/или физиологический эффект может быть профилактическим, т.е. эффект полностью или частично предотвращает заболевание или его симптом. В этом отношении способ согласно изобретению включает введение профилактически эффективного количества композиции, содержащей клетки-хозяева, экспрессирующие последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующую CAR, или вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, млекопитающему, который предрасположен к множественной миеломе или лимфоме Ходжкина. Понятие профилактически эффективного количества относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата (например, предотвращения возникновения заболевания).
Типичное число клеток-хозяев, вводимых млекопитающему (например, человеку), может находиться, например, в диапазоне от 1 млн до 100 млрд клеток; тем не менее в объем данного изобретения входят числа ниже или выше этого примерного диапазона. Например, суточная доза клеток-хозяев согласно изобретению может составлять от примерно 1 млн до примерно 50 млрд клеток (например, примерно 5 млн клеток, примерно 25 млн клеток, примерно 500 млн клеток, примерно 1 млрд клеток, примерно 5 млрд клеток, примерно 20 млрд клеток, примерно 30 млрд клеток, примерно 40 млрд клеток, либо диапазон определяется любыми двумя из указанных выше значений), предпочтительно от примерно 10 млн до примерно 100 млрд клеток (например, примерно 20 млн клеток, примерно 30 млн клеток, примерно 40 млн клеток, примерно 60 млн клеток, примерно 70 млн клеток, примерно 80 млн клеток, примерно 90 млн клеток, примерно 10 млрд клеток, примерно 25 млрд клеток, примерно 50 млрд клеток, примерно 75 млрд клеток, примерно 90 млрд клеток, либо диапазон определяется любыми двумя из указанных выше значений), более предпочтительно от примерно 100 млн клеток до примерно 50 млрд клеток (например, примерно 120 миллионов клеток, примерно 250 млн клеток, примерно 350 млн клеток, примерно 450 млн клеток, примерно 650 миллионов клеток, примерно 800 млн клеток,
- 12 044661 примерно 900 млн клеток, примерно 3 млрд клеток, примерно 30 млрд клеток, примерно 45 млрд клеток, либо диапазон определяется любыми двумя из вышеуказанных значений).
Терапевтическую или профилактическую эффективность можно контролировать путем периодического обследования пациентов. В случае многократных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния лечение повторяют до желательного подавления симптомов заболевания. Тем не менее другие режимы дозировки также могут быть использованы и входят в объем данного изобретения. Желаемая дозировка может быть доставлена путем однократного болюсного введения композиции, повторных болюсных введений композиции или путем непрерывного инфузионного введения композиции.
Композицию, содержащую клетки-хозяева, которые экспрессируют кодирующую CAR последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, или вектор, содержащий кодирующую CAR последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, можно вводить в организм млекопитающего с помощью стандартных способов введения, в том числе пероральным, внутривенным, внутрибрюшинным, подкожным, легочным, трансдермальным, внутримышечным, интраназальным, трансбуккальным, сублингвальным путем или с помощью суппозиториев. Композиция предпочтительно является подходящей для парентерального введения.
Термин парентеральное, используемый в данном документе, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и внутрибрюшинное введение. Более предпочтительно композицию вводят млекопитающему путем периферийной системной доставки с помощью внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.
Композицию, содержащую клетки-хозяева, которые экспрессируют кодирующую CAR последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, или вектор, содержащий кодирующую CAR последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, можно вводить с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим агентом, который может быть совместно введен млекопитающему. Под совместном введением понимается введение одного или более чем одного дополнительного терапевтического агента и композиции, содержащей клетки-хозяева согласно изобретению или вектор согласно изобретению, достаточно близко по времени, так что CAR согласно изобретению может усилить эффект одного или более чем одного дополнительного терапевтического агента, или наоборот. В связи с этим композиция, содержащая клетки-хозяева согласно изобретению или вектор согласно изобретению, может быть введена первой, а один или более чем один дополнительный терапевтический агент может быть введен вторым, или наоборот. Альтернативно, композиция, содержащая клеткихозяева согласно изобретению или вектор согласно изобретению, и один или более чем один дополнительный терапевтический агент могут быть введены одновременно. Примером терапевтического агента, который может быть введен совместно с композицией, содержащей клетки-хозяева согласно изобретению или вектор согласно изобретению, является IL-2.
После того как композицию, содержащую клетки-хозяева, экспрессирующие последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, или вектор, содержащий кодирующую CAR последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, вводят млекопитающему (например, человеку), биологическая активность CAR может быть измерена любым подходящим способом, известным в данной области. В соответствии со способом согласно изобретению CAR связывается с ВСМА на клетках множественной миеломы, и клетки множественной миеломы разрушаются. Связывание CAR с ВСМА на поверхности клеток множественной миеломы может быть проанализировано с помощью любого подходящего способа, известного в данной области, в том числе, например, ELISA и проточной цитометрии. Способность CAR разрушать клетки множественной миеломы может быть измерена с помощью любого подходящего способа, известного в данной области, такого как анализ цитотоксичности, описанный, например, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7):689-702 (2009), и Herman et al., J. Immunological Methods, 285(1):25-40 (2004). Биологическую активность CAR также можно измерить путем анализа экспрессии некоторых цитокинов, таких как CD107a, IFNy, IL-2 и TNF.
Специалист в данной области легко поймет, что последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующая CAR, может быть изменена с помощью любого числа способов, например, так, чтобы терапевтическая или профилактическая эффективность CAR увеличилась за счет модификации. Например, CAR может быть конъюгирован прямо или косвенно через линкер с целевой группировкой. Практика конъюгации соединений, например, CAR, с целевыми группировками известна в данной области. См., например, Wadwa et al., J. Drug Targeting, 3:111 (1995) и патент США № 5087616.
Настоящее изобретение может быть воплощено в следующем виде: выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный рецептор антигена (CAR), где CAR содержит фрагмент распознавания антигена и фрагмент Т-клеточной активации и где фрагмент распознавания антигена направлен против антигена созревания В-клеток (ВСМА).
Согласно одному из вариантов осуществления фрагмент распознавания антигена включает моноклональное антитело, направленное против ВСМА, или его антигенсвязывающую часть.
Согласно одному из вариантов осуществления фрагмент распознавания антигена содержит вариабельную область моноклинального антитела, направленного против ВСМА.
- 13 044661
Согласно одному из вариантов осуществления фрагмент Т-клеточной активации содержит домен Т-клеточного сигналинга любого из следующих белков: человеческого белка CD8-альфа, человеческого белка CD28, человеческого белка CD3-дзета, человеческого белка FcRy, белка CD27, белка ОХ40, человеческого белка 4-1ВВ, модифицированных версий любого из вышеперечисленных белков или любой комбинации вышеперечисленных белков.
Согласно одному из вариантов осуществления, выделенная или очищенная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
Настоящее изобретение может быть воплощено в следующем виде: выделенный или очищенный CAR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Согласно одному из вариантов осуществления выделенный или очищенный CAR включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
Настоящее изобретение может быть воплощено в следующем виде: вектор, содержащий выделенную или очищенную последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение может быть воплощено в следующем виде: выделенная клетка-хозяин, которая экспрессирует последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Согласно одному из вариантов осуществления выделенная клетка-хозяин экспрессирует CAR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
Согласно одному из вариантов осуществления выделенная клетка-хозяин представляет собой Т-клетку.
Согласно одному из вариантов осуществления, выделенная клетка-хозяин является натуральным киллером (NK-клеткой).
Настоящее изобретение может быть воплощено в следующем виде: способ разрушения клеток множественной миеломы, который включает контактирование клеток множественной миеломы, экспрессирующих ВСМА, с одной или более чем одной из выделенных Т-клеток согласно настоящему изобретению, где CAR продуцируется и связывается с ВСМА на клетках множественной миеломы, и клетки множественной миеломы разрушаются.
Настоящее изобретение может быть воплощено в следующем виде: разрушения клеток множественной миеломы, который включает контактирование клеток множественной миеломы, экспрессирующих ВСМА, с одной или более чем одной из выделенных NK-клеток согласно настоящему изобретению, где CAR продуцируется и связывается с ВСМА на клетках множественной миеломы, и клетки множественной миеломы разрушаются
Согласно одному из вариантов осуществления клетки множественной миеломы являются человеческими.
Согласно одному из вариантов осуществления клетки множественной миеломы находятся in vitro.
Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но, разумеется, не должны быть истолкованы как каким-либо образом ограничивающие его объем.
Пример 1.
Этот пример демонстрирует характер экспрессии ВСМА на человеческих клетках.
Количественную полимеразную цепную реакцию (кПЦР, qPCR) проводили на панели образцов кДНК из широкого диапазона нормальных тканей, включенных в панель II Human Major Tissue qPCR (Origine Technologies, Роквилл, Мэриленд), с использованием ВСМА-специфического праймера и набора зондов (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). кДНК из клеток плазмоцитомы, которую резецировали у пациента с прогрессирующей множественной миеломой, анализировали в качестве положительного контроля. РНК экстрагировали из клеток плазмоцитомы с помощью мини-набора RNeasy (Qiagen, Inc., Валенсия, Калифорния), и синтезировали кДНК с помощью стандартных способов. Стандартную кривую для кПЦР ВСМА получали путем разведения плазмиды, кодирующей полноразмерную кДНК ВСМА (Origine Technologies, Роквилл, Мэриленд), в носителе ДНК. кПЦР точно определяла число копий ВСМА от 102 до 109 на реакцию. Число копий кДНК β-актина в тех же тканях количественно оценивали с помощью праймера на β-актин Taqman и набора зондов (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Стандартную кривую β-актина получали путем амплификации серийных разведений плазмиды с β-актином. Все реакции кПЦР проводили на машине Roche LightCycler480 (Roche Applied Sciences, Индианополис, Индиана).
Результаты анализа кПЦР изображены на фиг. 1А и 1В. 93% клеток из образца плазмоцитомы были плазматическими клетками, что было определено с помощью проточной цитометрии. Экспрессия ВСМА в образце плазмоцитомы была значительно выше, чем экспрессия ВСМА в любой другой ткани. кДНК ВСМА была обнаружена в нескольких гематологических тканях, таких как мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), костный мозг, селезенка, лимфатический узел и миндалина. Низкие уровни кДНК ВСМА были обнаружены в большинстве органов желудочно-кишечного тракта, таких как двена
- 14 044661 дцатиперстная кишка, прямая кишка и желудок. Экспрессия ВСМА в органах желудочно-кишечного тракта может быть связана с плазматическими клетками и В-клетками, присутствующими в лимфоидной ткани кишечника, например в собственной пластинке и пейеровых бляшках (см., например, Brandtzaeg, Immunological Investigations, 39(4-5):303-355 (2010)). Низкие уровни кДНК ВСМА также были обнаружены в семенниках и трахее. Низкие уровни кДНК ВСМА, обнаруженные в трахее, могут быть связаны с наличием плазматических клеток в собственной пластинке слизистой оболочки трахеи (см., например, Soutar, Thorax, 31(2):158-166 (1976)).
Экспрессию ВСМА дополнительно характеризовали с помощью проточной цитометрии на поверхности различных типов клеток (см. фиг. 2A-L), включая линии клеток множественной миеломы Н929, U266 и RPMI8226. Линии клеток множественной миеломы Н929, U266 и RPMI8226 все экспрессировали ВСМА на клеточной поверхности. Напротив, клеточная линия саркомы ТС71, линия Т-клеточной лейкемии CCRF-CEM и линия клеток почки 293Т-17 не экспрессировали ВСМА на клеточной поверхности. Первичные гемопоэтические CD34+-клетки, первичные эпителиальные клетки малых дыхательных путей, первичные бронхиальные эпителиальные клетки и первичные эпителиальные клетки кишечника не экспрессировали ВСМА на клеточной поверхности.
Результаты этого примера показывают, что ВСМА экспрессируется на поверхности клеток множественной миеломы и имеет ограниченный характер экспрессии в нормальных тканях.
Пример 2.
Этот пример описывает конструкцию последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей химерные антигенные анти-ВСМА-рецепторы (CAR).
Последовательности двух мышиных антител против человеческого ВСМА, обозначенных как С12А3.2 и C11D5.3, были получены из публикации международной патентной заявки WO 2010/104949 (Kalled et al.). Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи этих антител использовали для создания одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), имеющих следующую общую структуру: вариабельная область легкой цепи - линкер - вариабельная область тяжелой цепи.
Линкер имеет следующую аминокислотную последовательность: GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 7) (см., например, Cooper et al., Blood, 101(4):1637-1644(2003)).
Были разработаны последовательности ДНК, кодирующие два химерных антигенных рецептора, каждая из которых содержала следующие элементы в направлении от 5' к 3': сигнальную последовательность CD8a, вышеупомянутую анти-BCMA-scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы человеческого CD8a, цитоплазматический фрагмент молекулы CD28 и цитоплазматический фрагмент молекулы CD3Z. Схема этих последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих CAR, приведена на фиг. 3А. CAR, включающие вариабельные области из С12А3.2 и C11D5.3, были обозначены как анти-bcma1 и анти-bcma2 соответственно.
На основании описанного выше анти-bcma2-CAR были разработаны последовательности ДНК, кодирующие пять дополнительных химерных антигенных рецепторов, каждый из которых содержал различные сигнальные последовательности и домены Т-клеточной активации. В этом отношении 8ss-анти-bcma2-CAR содержал следующие элементы в направлении от 5' к 3': сигнальную последовательность CD8a, scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы человеческого CD8a, цитоплазматический фрагмент молекулы CD28 и цитоплазматический фрагмент молекулы CD3Z. G-анти-bcma2-CAR содержал следующие элементы в направлении от 5' к 3': сигнальную последовательность рецептора человеческого GM-CSF, scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы человеческого CD8a, цитоплазматический фрагмент молекулы CD28 и цитоплазматический фрагмент молекулы CD3Z. Анти-bcma2-BB-CAR содержал следующие элементы в направлении от 5' к 3': сигнальную последовательность CD8a, scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы человеческого CD8a, цитоплазматический фрагмент молекулы 4-1ВВ и цитоплазматический фрагмент молекулы CD3ZD. Анти-bcma2-OX40-CAR содержал следующие элементы в направлении от 5' к 3': сигнальную последовательность CD8a, scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы человеческого CD8a, цитоплазматический фрагмент молекулы ОХ40 (см., например, Latza et al., European Journal of Immunology, 24:677-683 (1994)), и цитоплазматический фрагмент молекулы CD3Z. Анти-bcma2-ВВОХ40 содержал следующие элементы в направлении от 5' к 3': сигнальную последовательность CD8a, scFv, шарнирную и трансмембранную области молекулы человеческого CD8a, цитоплазматический фрагмент молекулы 4-1ВВ, цитоплазматический фрагмент молекулы ОХ40 и цитоплазматический фрагмент молекулы CD3Z. Элементы, присутствующие в каждой из семи последовательностей CAR, приведены в табл. 1.
- 15 044661
Таблица 1
CAR | SEQ ID № (аминокислотная) | Сигнальная последовательность | Шарнирная и трансмембранная области | Внутри-клет очный домен Т-клеточного сигналинга |
антиbcmal | 4 | Человеческий CD8A | Человеческий CD8A | CD28 ΟΟ3ζ |
анти- Ьста2 | 5 | Человеческий CD8A | Человеческий CD8A | CD28 ΟΟ3ζ |
G- Анти- Ьста2 | 8 | Рецептор GM-CSF | Человеческий CD8A | CD28 ΟΟ3ζ |
8ssантиЬста2 | 9 | Человеческий CD8A | Человеческий CD8A | CD28 ΟΟ3ζ |
антиЬста2 -ВВ | 10 | Человеческий CD8A | Человеческий CD8A | 4-1 ВВ ΟΟ3ζ |
анти- Ьста2 -ОХ40 | 11 | Человеческий CD8A | Человеческий CD8A | ΟΧ40 ΟΟ3ζ |
анти- Ьста2 В BOX 40 | 12 | Человеческий CD8A | Человеческий CD8A | 4-1ΒΒ ΟΧ40 ΟΟ3ζ |
Последовательности, используемые для CD8a, CD28, CD3Z, 4-1ВВ (CD137) и ОХ40 (CD134), были получены из общедоступной базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI).
Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, были получены с использованием способов, известных в данной области, таких как описанные, например, в Kochenderfer et al., J. Immunology, 32(7): 689-702 (2009) и Zhao et al., J. Immunology, 183(9):5563-5574 (2009). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую каждый CAR, подвергали оптимизации по кодонам и синтезировали с использованием технологии GeneArt™ (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) с соответствующими сайтами рестрикции.
Последовательности, кодирующие анти-bcma1- и анти-bcma2-CAR, лигировали в лентивирусную векторную плазмиду, обозначенную pRRLSIN.cPPT.MSCV.coDMF5.oPRE (см., например, Yang et al., J. Immunotherapy, 33(6): 648-658 (2010)). Часть CoDMF5 этого вектора была заменена последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими CAR, с помощью стандартных способов. Два полученных анти-BCMA-CAR-вектора были обозначены как pRRLSIN.cPPT.MSCV.anti-bcma1.oPRE и pRRLSIN.cPPT.MSCV.anti-bcma2.oPRE. Также был сконструирован отрицательный контроль CAR, содержащий scFv SP6, который распознает гаптен 2,4,6-тринитрофенил (см., например, Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(24):10024-10028 (1989)). Этот CAR был обозначен как SP6. SP6-CAR был клонирован в тот же лентивирусный вектор, что и анти-BCMA-CAR, и содержал те же сигнальные домены, что и анти-bcma1 и анти-bcma2. Супернатант, содержащий лентивирусы, кодирующие каждый CAR, получали в соответствии с протоколом, описанным в Yang et al., см. выше. В частности, клетки 293Т-17 (АТСС CRL-11268) трансфицировали следующими плазмидами: pMDG (кодирующей белок оболочки вируса везикулярного стоматита), pMDLg/pRRE (кодирующей белки ВИЧ Gag и Pol), PRSV-Rev (кодирующей белок RSV Rev), и плазмидами, кодирующими анти-BCMA-CAR (например, Yang et al., см. выше).
Последовательности, кодирующие CAR G-анти-bcma2, 8ss-анти-bcma2, анти-bcma2-ВВ, анти-bcma2-ОХ40 и анти-bcma2-ВВОХ40, лигировали в гамма-ретровирусный плазмидный вектор, обозначенный как MSGV (сплайс-gag вектор на основе вируса мышиных стволовых клеток) с использованием стандартных способов, таких как описанные, например, в Hughes et al., Human Gene Therapy, 16: 457472 (2005). После того как были получены кодирующие CAR гамма-ретровирусные плазмиды, были созданы некомпетентные по репликации ретровирусы с оболочкой RD114 путем временной трансфекции упаковывающих клеток на основе 293, описанных в Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7):689-702 (2009).
Некомпетентные по репликации лентивирусы и ретровирусы, кодирующие описанные выше CAR, использовали для трансдукции Т-клеток человека. Для анти-bcma1 и анти-bcma2 Т-клетки культивировали, как описано выше (см., например, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7):689-702 (2009)) и стимулировали моноклональным анти-CD3-антителом ОКТ3 (Ortho-Biotech, Хоршам, Пенсильвания) в среде AIM V™ (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), содержащей 5% человеческой АВ-сыворотки (Valley Biomedical, Винчестер, Вирджиния) и 300 международных единиц (МЕ)/мл интерлейкина-2 (Novartis Diagnostics, Эмеривилл, Калифорния). Через 36 ч после начала культивирования активированные Т-клетки суспендировали в лентивирусном супернатанте с сульфатом протамина и 300 МЕ/мл IL-2. Клетки центрифугировали в течение 1 ч при 1200д. Затем Т-клетки культивировали в течение трех часов при 37°С. Затем супернатант разводили 1:1 средой RPMI (Mediatech, Inc., Манассас, Вирджиния) + 10% фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и IL-2. Т-клетки культивирова
- 16 044661 ли в разведенном супернатанте в течение ночи, а затем возвращали в культуру в среде AIM V™ (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) с 5% человеческой АВ-сывороткой и IL-2. Т-клетки окрашивали меченными биотином поликлональными козлиными антителами против мышиного F(ab)2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Вест Гроув, Пенсильвания) для обнаружения анти-BCMA-CAR. Высокие уровни экспрессии анти-bcma1-CAR, анти-bcma2-CAR и SP6-CAR наблюдались на клеточной поверхности трансдуцированных Т-клеток, как показано на фиг. 3B-3D.
Для CAR G-анти-bcma2, 8ss-анти-bcma2, анти-bcma2-ВВ, анти-bcma2-OX40 и анти-bcma2-ВВОХ40 мононуклеарные клетки периферической крови суспендировали в концентрации 1x106 клеток в 1 мл Т-клеточной среды, содержащей 50 нг/мл моноклинального анти-CD3-антитела OKT3 (Ortho, Бриджуотер, Нью-Джерси) и 300 МЕ/мл IL-2. Полипептид RETRONECTIN™ (Takara Bio Inc., Шига, Япония), который представляет собой рекомбинантный полипептид из фрагментов фибронектина человека, который связывает вирусы и белки клеточной поверхности, растворяли в концентрации 11 мкг/мл в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) и 2 мл полипептида RETRONECTIN™ в растворе PBS добавляли в каждую лунку 6-луночных планшетов, покрытых неклеточной культурой (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси). Планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре (RT). После инкубации раствор RETRONECTIN™ аспирировали и в каждую лунку, покрытую RETRONECTIN™, вносили 2 мл блокирующего раствора, состоящего из сбалансированного солевого растворе Хэнкса (HBSS) с 2% бычьим сывороточным альбумином (BSA). Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Блокирующий раствор аспирировали и лунки промывали раствором HBSS + 2,5% (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) (HEPES). Ретровирусный супернатант быстро размораживали и разводили 1:1 в Т-клеточной среде и затем в каждую лунку, покрытую RETRONECTIN™, вносили 2 мл разведенного супернатанта. После добавления супернатантов планшеты центрифугировали при 2000g в течение 2 ч при 32°С. Затем супернатант аспирировали из лунок и в каждую лунку добавляли 2x106 Т-клеток, которые были культивированы с ОКТ3-антителом и IL-2 в течение 2 дней. Когда Т-клетки вносили в планшет, покрытый ретровирусом, их суспендировали в концентрации 0,5x106 клеток на 1 мл Т-клеточной среды + 300 МЕ/мл IL-2. После того как Т-клетки были добавлены в каждую лунку, планшеты центрифугировали в течение 10 мин при 1000g. Планшеты инкубировали при 37°С в течение ночи. Трансдукцию повторяли на следующий день. После 18-24-часовой инкубации Т-клетки удаляли из планшетов и суспендировали в свежей Т-клеточной среде с 300 МЕ/мл IL-2 в концентрации 0,5x106 клеток на 1 мл и культивировали при 37°С и 5% СО2. Наблюдались высокие уровни экспрессии анти-bcma2-ВВОХ40, анти-bcma2-ВВ и 8ss-анти-bcma2 на поверхности трансдуцированных Т-клеток.
Результаты этого примера демонстрируют способ получения последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей CAR, и способ экспрессии CAR на поверхности Т-клеток.
Пример 3.
Этот пример описывает серию экспериментов, используемых для определения специфичности CAR согласно изобретению к ВСМА.
Клетки.
NCI-H929, U266 и RPMI8226 все являются ВСМА-положительными клеточными линиями множественной миеломы, которые получены из АТСС (АТСС №№ CRL-9068, TIB-196 и CCL-155, соответственно). А549 (АТСС № CCL-185) представляет собой ВСМА-отрицательную клеточную линию рака легких. ТС71 представляет собой ВСМА-отрицательную клеточную линию саркомы. CCRF-CEM представляет собой ВСМА-отрицательную Т-клеточную линию (АТСС № CCL-119). BCMA-K562 представляет собой клетки K562 (АТСС № CCL-243), которые были трансдуцированы последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный ВСМА. NGFR-K562 представляет собой клетки K562, которые были трансдуцированы геном, кодирующим низкоаффинный рецептор фактора роста нервов (см, например, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7):689-702 (2009)). Были использованы лимфоциты периферической крови (PBL) от трех пациентов с множественной миеломой (т.е. пациенты с миеломой 1-3), а также PBL от трех других субъектов: донора А, донора В и донора С. Доноры А-С все имели меланому. Первичные CD34+-клетки были получены от трех нормальных здоровых доноров. Образец клеток плазмоцитомы был получен от пациента с миеломой 1, а образец костного мозга был получен от пациента с миеломой 3. Все образцы от людей, упомянутые выше, были получены от пациентов, включенных в IRB-утвержденные клинические испытания в Национальном институте рака. Следующие первичные эпителиальные клетки человека были получены от Lonza, Inc. (Базель, Швейцария): эпителиальные клетки малых дыхательных путей, бронхиальные эпителиальные клетки и эпителиальные клетки кишечника.
ELISA на интерферон-γ и TNF.
ВСМА-положительные или ВСМА-отрицательные клетки объединяли с CAR-трансдуцированными Т-клетками в дубликатах лунок 96-луночного круглодонного планшета (Corning Life Sciences, Лоуэлл, Массачусетс) в среде AIM V™ (Life Technologies, Карлсбад, СА) + 5% человеческой сыворотки. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 18-20 ч. После инкубации выполняли анализ ELISA на IFNy и TNF
- 17 044661 с использованием стандартных способов (Pierce, Рокфорд, Иллинойс).
Т-клетки, трансдуцированные анти-bcma1- или анти-bcma2-CAR, продуцировали большие количества IFNy, когда их культивировали в течение ночи с ВСМА-экспрессирующей клеточной линией ВСМА-К562, но CAR-трансдуцированные Т-клетки продуцировали только фоновые уровни IFNy, когда их культивировали с отрицательным контролем, клеточной линией NGFR-K562, как указано в табл. 2 (все единицы: пг/мл IFNy).
Таблица 2
ВСМА- экспрессирующие | BCMA-отрицательные мишени | только Тклетки | |||||||
мишени1' ВСМАК562 | Н929 | RPMI -8226 | NGFRК562 | CCRFСЕМ | А549 | ТС71 | 293Т | ||
Эффекторные клетки* анти-Ьста1 | 15392 | 11306 | 5335 | 76 | 76 | 52 | 65 | 54 | 112 |
анти-Ьста2 | 25474 | 23120 | 1058 7 | 62 | 67 | 32 | 31 | 28 | 41 |
SP6 | 32 | 60 | 149 | 27 | 28 | 21 | 361 | 73 | 27 |
Нетрансду- | <12 | <12 | <12 | <12 | <12 | <12 | <12 | 12 | <12 |
цированные Только | <12 | <12 | <12 | <12 | <12 | <12 | <12 | 13 | |
мишени |
*Эффекторные клетки были Т-клетками от пациента с множественной миеломой (пациента с миеломой 2). Т-клетки трансдуцировали указанным CAR или оставляли нетрансдуцированными.
**Указанные клетки-мишени объединяли с эффекторных клеток для инкубации в течение ночи и проводили ELISA на IFNy.
Т-клетки, экспрессирующие CAR 8ss-анти-bcma2, анти-bcma2-ВВ и анти-bcma2-ОХ40, продуцировали IFNy специфически в ответ на ВСМА-положительные клетки-мишени, когда Т-клетки и клеткимишени совместно культивировали в течение ночи, как указано в табл. 3 (все единицы: пг/мл IFNy).
Таблица 3
ВСМАположительные мишени | ВСМА-отрицательные мишени | ||||||||
ВСМА-К562 | RPMI8226 | NGFRК562 | CCRFСЕМ | А549 | только Тклетки | ||||
Эффекторные клетки | |||||||||
анти-Ьста2-ОХ40 | 17704 | 4875 | 42 | 44 | 24 | 40 | |||
анти-Ьста2-ВВ | 25304 | 8838 | 404 | 602 | 350 | 706 | |||
855-анти-Ьста2 | 9671 | 2168 | 100 | 120 | 49 | 171 | |||
Нетрансдуцированные | <12 | 57 | 15 | 17 | <12 | 20 |
Т-клетки, трансдуцированные анти-BCMA-CAR, продуцировали большие объемы IFNy, когда их культивировали в течение ночи с ВСМА-экспрессирующими клеточными линиями множественной миеломы. Напротив, анти-BCMA-CAR продуцировали значительно более низкие количества IFNy, когда их культивировали с различными ВСМА-отрицательными клеточными линиями. По сравнению с Т-клетками, трансдуцированными анти-bcma1-CAR, Т-клетки, трансдуцированные анти-bcma2-CAR и его вариантами (т.е. 8ss-анти-bcma2, анти-bcma2-ВВ и анти-bcma2-ОХ40), продуцировали больше IFNy при культивировании с ВСМА-положительными клетками и меньше IFNy при культивировании с ВСМА-отрицательными клетками.
Т-клетки, трансдуцированные вариантами анти-bcma2-CAR, продуцировали TNF специфически в ответ на ВСМА-положительные клетки-мишени, когда Т-клетки и клетки-мишени совместно культивировали в течение ночи, как указано в табл. 4 (все единицы: пг/мл фактора некроза опухоли (TNF)).
Таблица 4
ВСМА- положительные мишени | ВСМА-отрицательные мишени | |||||
ВСМА-К562 | RPMI-8226 | NGFR-K562 | CCRF-CEM | А549 | только Тклетки | |
Эффекторные клетки | ||||||
анти-Ьста2-ОХ40 | 4913 | 3406 | <40 | 47 | <40 | 74 |
анти-Ьста2-ВВ | 6295 | 2723 | 56 | 164 | 89 | 252 |
8ss-aHTH-bcma2 | 5340 | 1354 | <40 | 121 | <40 | 191 |
Нетрансдуцированные | <40 | <40 | 47 | <40 | <40 | <40 |
Так как Т-клетки, трансдуцированные анти-bcma2-CAR и его вариантами, демонстрировали чуть более сильное и более специфическое распознавание ВСМА-экспрессирующих клеток, чем Т-клетки трансдуцированные анти-bcma1-CAR, то в последующих экспериментах были использованы только анти-bcma2-CAR и варианты анти-bcma2-CAR.
Анализ CD107а.
Две популяции Т-клеток были получены в двух отдельных пробирках. Одна пробирка содержала
- 18 044661
ВСМА-клетки K562, а другая пробирка содержала клетки NGFR-K562. Обе пробирки также содержали Т-клетки, трансдуцированные анти-bcma2-CAR и вариантами анти-bcma2-CAR, 1 мл AIM V™ среды (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) с 5% человеческой сыворотки, титрованную концентрацию анти-СО107а-антитела (eBioscience, Inc., Сан-Диего, Калифорния, клон eBioH4A3) и 1 мкл Golgi Stop (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси). Все пробирки инкубировали при 37°С в течение 4 ч, а затем окрашивали на экспрессию CD3, CD4 и CD8.
CAR-трансдуцированные Т-клетки от трех различных субъектов имели повышенную регуляцию CD107a специфически в ответ на стимуляцию с ВСМА-экспрессирующими клетками-мишенями (см. фиг. 4А-С). Это указывает на возникновение ВСМА-специфической дегрануляции Т-клеток, которая является необходимым условием для перфорин-опосредованной цитотоксичности (см., например, Rubio et al., Nature Medicine, 9(11):1377-1382 (2003)). Кроме того, Т-клетки, экспрессирующие варианты анти-bcma2-CAR (8ss-анти-bcma2, анти-bcma2-ВВ, анти-bcma2-ОХ40), дегранулировали ВСМАспецифическим образом при стимуляции с клетками-мишенями in vitro, как показано на фиг. 5A-5D.
Анализ внутриклеточного окрашивания цитокинов (intracellular cytokine staining assay, ICCS).
Популяция клеток ВСМА-К562 и популяция клеток NGFR-K562 были получены в двух отдельных пробирках, как описано выше. Обе пробирки также содержали Т-клетки, трансдуцированные анти-bcma2-CAR, от пациента с миеломой 2, 1 мл AIM V среды (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) с 5% человеческой сывороткой и 1 мкл Golgi Stop (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси). Все пробирки инкубировали при 37°С в течение 6 ч. Поверхность клеток окрашивали анти-CD3-, антиСО4-, и анти-CD8-антителами. Клетки подвергали пермеабилизации и проводили внутриклеточное окрашивание на IFNy (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, клон В27), IL-2 (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, клон MQ1-17H12) и TNF (BD Biosciences, Франклин Лейкс, НьюДжерси, клон MAb11), следуя инструкциям к набору Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси).
Большие популяции Т-клеток, трансдуцированных анти-bcma2-CAR, от пациента с миеломой 2 специфически продуцировали цитокины IFNy, IL-2 и TNF ВСМА-специфическим образом после шестичасовой стимуляции с ВСМА-экспрессирующими клетками-мишенями, как показано на фиг. 6А-6С.
Анализы пролиферации/
Оценивали способность Т-клеток, трансдуцированных анти-bcma2-CAR, к пролиферации при стимуляции с ВСМА-экспрессирующими клетками-мишенями. В частности, 0,5x106 облученных клеток ВСМА-562 или 0,5x106 облученных клеток NGFR-562 культивировали совместно с 1x106 общих Т-клеток, которые были трансдуцированы либо анти-bcma2-CAR, либо SP6-CAR. Т-клетки были помечены карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловым эфиром (CFSE) (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), как описано в Mannering et al., J. Immunological Methods, 283(1-2):173-183 (2003). Среда, используемая в объединенных культурах, была средой AIM V™ (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) с 5% человеческой АВ-сыворотки. IL-2 к среде не добавляли. Через четыре дня после начала живые клетки в каждой объединенной культуре подсчитывали с помощью трипанового синего для исключения мертвых клеток. Затем проводили проточную цитометрию путем окрашивания Т-клеток поликлональными меченными биотином козлиными антителами против человеческого ВСМА (R&D Systems, Миннеаполис), а затем стрептавидином (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси), анти-CD38антителом (eBioscience, Inc., San Diego, CA) и анти-CD56-антителом (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси). Анализ данных проточной цитометрии выполняли с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc., Ашленд, Орегон).
Т-клетки, которые экспрессировали анти-bcma2-CAR, демонстрировали большее разведение CFSE при культивировании с клетками ВСМА-К562, чем при культивировании с отрицательным контролем, клетками NGFR-K562, как показано на фиг. 7А. Эти результаты указывают на то, что Т-клетки, трансдуцированные анти-bcma2-CAR, специфически пролиферировали при стимуляции с ВСМАэкспрессирующими клетками-мишенями. Напротив, никакой существенной разницы в разведении CFSE не было, когда Т-клетки, экспрессирующие SP6-CAR, культивировали либо с клетками-мишенями ВСМА-К562, либо с клетками-мишенями NGFR-K562 (фиг. 7В), что указывает на отсутствие ВСМАспецифической пролиферации Т-клеток, экспрессирующих SP6-CAR.
В начале анализа пролиферации 0,8x106 Т-клеток, экспрессирующих анти-bcma2-CAR, культивировали либо с клетками ВСМА-К562, либо с клетками NGFR-K562. После 4 дней культивирования 2,7x106 Т-клеток, экспрессирующих анти-bcma2-CAR, присутствовало в культурах, содержащих клетки ВСМА-К562, в то время как в культурах, содержащих клетки NGFR-K562, присутствовало только 0,6x106 Т-клеток, экспрессирующих анти-bcma2-CAR. Это ВСМА-специфическое увеличение абсолютного числа Т-клеток, экспрессирующих анти-bcma2-CAR, указывает на то, что эти Т-клетки пролиферировали в ответ на ВСМА.
Результаты этого примера показывают, что Т-клетки, экспрессирующие CAR согласно изобретению, демонстрируют ВСМА-специфическую продукцию цитокинов, дегрануляцию и пролиферацию.
- 19 044661
Пример 4.
В этом примере показано, что Т-клетки, экспрессирующие анти-BCMA-CAR согласно изобретению, могут разрушать клеточные линии множественной миеломы.
Анализы цитотоксичности выполняли, чтобы определить, могут ли Т-клетки, трансдуцированные анти-bcma2-CAR, описанным в примерах 2 и 3, разрушать ВСМА-экспрессирующие клеточные линии множественной миеломы (ММ). Конкретно, цитотоксичность клеток-мишеней измеряли путем сравнения выживания ВСМА-экспрессирующих клеток-мишеней (например, клеточных линий множественной миеломы Н929 и RPMI8226) относительно выживания отрицательного контроля, клеток CCRF-CEM, с использованием анализа, описанного, например, в Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7):689-702 (2009), и Hermans et al., J. Immunological Methods, 285(1):25-40 (2004).
Приблизительно 50000 ВСМА-экспрессирующих клеток-мишеней и 50000 клеток CCRF-CEM объединяли в одних и тех же пробирках с различным числом CAR-трансдуцированных Т-клеток. Клетки отрицательного контроля CCRF-CEM метили флуоресцентным красителем 5-(и-6)-(((4-хлорметил)бензоил)амино)тетраметилродамином (CMTMR) (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), а ВСМАэкспрессирующие клетки-мишени метили CFSE. Во всех экспериментах цитотоксичность эффекторных Т-клеток, трансдуцированных анти-bcma2-CAR, сравнивали с цитотоксичностью эффекторных Т-клеток отрицательного контроля от того же самого субъекта, которые были трансдуцированы SP6-CAR. Объединенные культуры находились в стерильных 5 мл пробирках (BD Biosciences, Франклин Лейкс, НьюДжерси) в двух экземплярах в следующем соотношении Т-клеток и клеток-мишеней: 20,0:1, 7:1, 2:1 и 0,7:1. Культуры инкубировали в течение 4 ч при 37°С. Сразу же после инкубации добавляли 7-аминоактиномицин D (7AAD BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси). Для каждой объединенной культуры Т-клеток/клеток-мишеней определяли процент живых ВСМА-экспрессирующих клеток-мишеней и живых клеток CCRF-CEM отрицательного контроля.
Для каждой объединенной культуры Т-клеток/клеток-мишеней определяли процент выживаемости ВСМА-экспрессирующих клеток-мишеней по отношению к клеткам CCRF-CEM отрицательного контроля посредством деления процента ВСМА-экспрессирующих клеток на процент клеток CCRF-CEM отрицательного контроля. Скорректированный процент выживания ВСМА-экспрессирующих клетокмишеней рассчитывали путем деления процента живых ВСМА-экспрессирующих клеток-мишеней в каждой объединенной культуре Т-клеток/клеток-мишеней на отношение процента ВСМАэкспрессирующих клеток-мишеней к проценту клеток CCRF-CEM отрицательного контроля в пробирках, содержащих только ВСМА-экспрессирующие клетки-мишени и клетки CCRF-CEM отрицательного контроля без эффекторных Т-клеток. Эта поправка была необходима для учета различий в исходных количествах клеток и спонтанной гибели клеток-мишеней. Цитотоксичность рассчитывали следующим образом:
% цитотоксичности BCMA-экспрессирующих клеток - мишеней = 100 - скорректированный % живых BCMA-экспрессирующих клеток-мишеней.
Результаты анализа цитотоксичности показаны на фиг. 7С и 7D. Т-клетки, трансдуцированные анти-bcma2-CAR, специфически убивали ВСМА-экспрессирующие клеточные линии множественной миеломы Н929 и RPMI8226. Напротив, Т-клетки, трансдуцированные SP6-CAR, обладали гораздо более низкими уровнями цитотоксичности против этих клеточных линий.
Результаты этого примера показывают, что последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующая анти-BCMA-CAR, может быть использована в способе разрушения клеточных линий множественной миеломы.
Пример 5.
В этом примере показано, что Т-клетки, экспрессирующие анти-BCMA-CAR согласно изобретению, могут разрушать первичные клетки множественной миеломы.
Первичные клетки множественной миеломы, описанные в примере 2, оценивали на экспрессию ВСМА, а также на ВСМА-специфическую продукцию цитокинов, дегрануляцию и пролиферацию с использованием способов, описанных выше.
Экспрессия ВСМА на клеточной поверхности была обнаружена в четырех образцах первичной множественной миеломы, а также на первичных клетках множественной миеломы в костном мозге пациента с миеломой 3 (см. фиг. 8А). ВСМА-экспрессирующие плазматические клетки составляли 40% клеток в образце костного мозга от пациента с миеломой 3. Аллогенные Т-клетки от донора С, трансдуцированные анти-bcma2-CAR, продуцировали IFNy после совместного культивирования с необработанными клетками костного мозга от пациента с миеломой 3, как показано на фиг. 8В. Т-клетки от того же аллогенного донора, трансдуцированные анти-bcma2-CAR, продуцировали гораздо меньше IFNy, когда их культивировали с мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) от пациента с миеломой 3. Кроме того, SP6-CAR-трансдуцированные Т-клетки от донора С специфически не распознавали костный мозг от пациента с миеломой 3. Ранее сообщалось, что нормальные РВМС не включают клетки, экспрессирующие ВСМА (см., например, Ng et al., J. Immunology, 173(2):807-817 (2004)). Чтобы подтвердить это наблюдение, РВМС от пациента 3 оценивали на экспрессию ВСМА с помощью проточной цитометрии.
- 20 044661
РВМС от пациента 3 не включали ВСМА-экспрессирующие клетки, отдельно от небольшой популяции клеток CD56+CD38hlgh, которая составила примерно 0,75% от РВМС. Эта популяция, возможно, состояла из циркулирующих клеток множественной миеломы.
Плазмоцитома, резецированная у пациента с миеломой 1, состояла на 93% из плазматических клеток, и эти первичные плазматические клетки экспрессировали ВСМА, как показано на фиг. 8С. Т-клетки от пациента с миеломой 2 продуцировали IFNy при культивировании с аллогенными необработанными клетками плазмоцитомы от пациента с миеломой 1. Т-клетки от пациента с миеломой 2 не продуцировали значительных количеств IFNy при культивировании с РВМС от пациента с миеломой 1. Т-клетки от пациента с миеломой 2, трансдуцированные SP6-CAR, не продуцировали значительных количеств IFNy, когда их культивировали либо с клетками плазмоцитомы, либо с РВМС от пациента с миеломой 1. РВМС от пациента с миеломой 1 не экспрессировали ВСМА, что было измерено с помощью проточной цитометрии.
Т-клетки от пациента с миеломой 1, который ранее получил восемь циклов терапии против миеломы, были успешно культивированы и трансдуцированы лентивирусом вектором, кодирующим антиbcma2-CAR. Через восемь дней после того, как культуры были инициированы, экспрессия анти-bcma2CAR была обнаружена на 65% Т-клеток. Т-клетки от пациента с миеломой 1, экспрессирующие антиbcma2-CAR, продуцировали IFNy специфически в ответ на аутологичные клетки плазмоцитомы (фиг. 8D). Т-клетки от пациента с миеломой 1, экспрессирующие SP6-CAR, не распознавали аутологичные клетки плазмоцитомы. Т-клетки, экспрессирующие анти-bcma2-CAR, и Т-клетки, экспрессирующие SP6-CAR, не распознавали аутологичные РВМС. Т-клетки от пациента с миеломой 1, экспрессирующие анти-bcma2-CAR, также специфически убивали аутологичные клетки плазмоцитомы при низком соотношении с мишенью. Напротив, Т-клетки от пациента с миеломой 1, экспрессирующие SP6-CAR, демонстрировали низкие уровни цитотоксичности против аутологичных клеток плазмоцитомы (фиг. 8Е).
Результаты этого примера показывают, что анти-BCMA-CAR согласно изобретению может быть использован в способе разрушения первичных клеток множественной миеломы.
Пример 6.
В этом примере показано, что Т-клетки, экспрессирующие анти-BCMA-CAR согласно изобретению, могут разрушать верифицированные опухоли у мышей.
Иммунодефицитным мышам NSG (NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1WjI/SzJ, Jackson Laboratory) вводили внутрикожно 8x106 клеток RPMI8226. Опухоли росли в течение 17-19 дней, а затем мыши получали внутривенные инфузии 8x106 человеческих Т-клеток, трансдуцированных либо анти-bcma2-CAR, либо SP6-CAR. Опухоли измеряли циркулем каждые 3 дня. Самую большую длину и длину, перпендикулярную самой большой длине, перемножали, получая размер опухоли (площадь) в мм2. Когда самая большая длина достигала 15 мм, мышей умерщвляли. Исследования на животных были утверждены Комитетом по уходу и использованию животных Национального института рака.
Результаты этого примера показаны на фиг. 9А и В. Примерно на 6-й день мыши, которым вводили анти-bcma2-трансдуцированные Т-клетки, продемонстрировали уменьшение размера опухоли, и опухоли были ликвидированы к 15-му дню. Кроме того, все мыши, которым вводили анти-bcma2трансдуцированные Т-клетки, дожили до 30 дня после инфузии Т-клеток.
Результаты этого примера показывают, что анти-BMCA-CAR согласно изобретению может разрушать клетки множественной миеломы in vivo.
Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, цитируемые в данном документе, включены посредством ссылки в той же степени, как если бы про каждый объект ссылки было отдельно и конкретно указано, что он включен посредством ссылки и изложен в данном документе во всей его полноте.
Использование терминов в единственном числе и аналогичные объекты ссылки в контексте описания изобретения (особенно в контексте следующей ниже формулы изобретения) должно толковаться как охватывающее единственное число и множественное число, если иное не указано в данном документе или это явно не противоречит контексту. Термины содержащий, имеющий и включающий должны быть истолкованы как неограничивающие термины (т.е. означающие включающий, но не ограниченный этим), если не указано иное. Указание диапазонов значений в данном документе является только способом быстрой записи с индивидуальной ссылкой на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон, если в данном документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно приведено в данном документе. Все описанные здесь способы могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если это явно не противоречит контексту или не указано иное. Использование в данном документе любых и всех примеров или иллюстративных выражений (например, такой как) предназначено только для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничений на объем изобретения, если не заявлено иное. Отсутствие выражения в описании следует толковать как указание на любой незаявленный элемент в качестве существенного в практике изобретения.
В данном документе описаны предпочтительные воплощения данного изобретения, включая наилучший способ, известный авторам изобретения, для осуществления данного изобретения. Вариации
-
Claims (25)
- (1) (i) определяющую комплементарность область (CDR) легкой цепи - CDR1 с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 45-59 SEQ ID NO: 4, (ii) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 75-81 SEQ ID NO: 4, (iii) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 114-122 SEQ ID NO: 4, (iv) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 181-185 SEQ ID NO: 4, (v) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 200-216 SEQ ID NO: 4 и (vi) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 249-256 SEQ ID NO: 4;1. Химерный рецептор антигена (CAR), включающий:(а) одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), направленный против антигена созревания В-клеток (ВСМА), содержащий:
- 2. CAR по п.1, включающий трансмембранный домен CD28.(2) (i) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 45-59 SEQ ID NO: 5, (ii) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 75-81 SEQ ID NO: 5, (iii) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 114-122 SEQ ID NO: 5, (iv) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 181-185 SEQ ID NO: 5, (v) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 200-216 SEQ ID NO: 5 и (vi) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 249-256 SEQ ID NO: 5;
- 3. CAR по п.1, включающий трансмембранный домен CD8a.(3) (i) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 45-59 SEQ ID NO: 6, (ii) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 75-81 SEQ ID NO: 6, (iii) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 114-122 SEQ ID NO: 6, (iv) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 181-185 SEQ ID NO: 6, (v) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 200-216 SEQ ID NO: 6 и (vi) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 249-256 SEQ ID NO: 6;
- 4. CAR по любому из пп.1-3, включающий внутриклеточные домены сигналинга Т-клеток CD28 и CD3Z.(4) (i) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 46-60 SEQ ID NO: 8, (ii) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 76-82 SEQ ID NO: 8, (iii) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 115-123 SEQ ID NO: 8, (iv) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 182-186 SEQ ID NO: 8, (v) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 201-217 SEQ ID NO: 8 и (vi) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 250-257 SEQ ID NO: 8;
- 5. CAR по любому из пп.1-3, включающий внутриклеточные домены сигналинга Т-клеток ОХ40 и CD3Z.(5) (i) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 45-59 SEQ ID NO: 9, (ii) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 75-81 SEQ ID NO: 9, (iii) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 114-122 SEQ ID NO: 9, (iv) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 181-185 SEQ ID NO: 9, (v) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 200-216 SEQ ID NO: 9 и (vi) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 249-256 SEQ ID NO: 9;
- 6. CAR по любому из пп.1-3, включающий внутриклеточные домены сигналинга Т-клеток 4-1ВВ и CD3Z.(6) (i) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 45-59 SEQ ID NO: 10, (ii) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 75-81 SEQ ID NO: 10, (iii) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 114-122 SEQ ID NO: 10, (iv) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 181-185 SEQ ID NO: 10, (v) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 200-216 SEQ ID NO: 10 и (vi) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 249-256 SEQ ID NO: 10;
- 7. CAR по п.1, включающий трансмембранный домен CD8a и внутриклеточные домены сигналинга Т-клеток 4-1ВВ и CD3Z.(7) (i) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 45-59 SEQ ID NO: 11, (ii) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 75-81 SEQ ID NO: 11, (iii) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 114-122 SEQ ID NO: 11, (iv) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 181-185 SEQ ID NO: 11, (v) CDR2 тяжелой цепи с аминокис
- 8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR по любому из пп.1-7.
- 9. Экспрессионный вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.8.
- 10. Экспрессионный вектор по п.9, где указанный вектор представляет собой ретровирусный вектор.
- 11. Экспрессионный вектор по п.10, где указанный ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.
- 12. Выделенная клетка для экспрессии CAR по любому из пп.1-7, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.8.
- 13. Выделенная клетка для экспрессии CAR по любому из пп.1-7, содержащая вектор по любому из пп.9-11.
- 14. Выделенная клетка по п.12 или 13, которая представляет собой Т-клетку.
- 15. Выделенная клетка по п.12 или 13, которая является натуральным киллером (NK-клеткой).
- 16. Композиция для лечения человека, страдающего от рака, экспрессирующего ВСМА, содержащая выделенную клетку по любому из пп.12-15 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
- 17. Способ разрушения клеток множественной миеломы, который включает контактирование клеток множественной миеломы, экспрессирующих ВСМА, с одной или более чем одной из выделенных Т-клеток по п.14, где CAR экспрессируется и связывается с ВСМА на клетках множественной миеломы, и клетки множественной миеломы разрушаются.
- 18. Способ разрушения клеток множественной миеломы, который включает контактирование клеток множественной миеломы, экспрессирующих ВСМА, с одной или более чем одной из выделенных NK-клеток по п.15, где CAR экспрессируется и связывается с ВСМА на клетках множественной миеломы, и клетки множественной миеломы разрушаются.
- 19. Способ по п.17 или 18, где клетки множественной миеломы являются человеческими.
- 20. Применение CAR по любому из пп.1-7 при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.
- 21. Применение выделенной нуклеиновой кислоты по п.8 при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.
- 22. Применение экспрессионного вектора по любому из пп.9-11 при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.- 22 044661 лотной последовательностью из аминокислотных остатков 200-216 SEQ ID NO: 11 и (vi) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 249-256 SEQ ID NO: 11; или (8) (i) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 45-59 SEQ ID NO: 12, (ii) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 75-81 SEQ ID NO: 12, (iii) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 114-122 SEQ ID NO: 12, (iv) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 181-185 SEQ ID NO: 12, (v) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 200-216 SEQ ID NO: 12 и (vi) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из аминокислотных остатков 249-256 SEQ ID NO: 12;(b) трансмембранный домен CD28 или CD8a;(c) один или более внутриклеточных доменов сигналинга Т-клеток, выделенных из белка, выбранного из группы, состоящей из CD28, CD3Z, FcRy, CD27, ОХ40 и белка 4-1ВВ.
- 23. Применение выделенной клетки по любому из пп.12-15 при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.
- 24. Применение композиции по п.16 при производстве лекарственного средства для разрушения раковых клеток.
- 25. Применение по любому из пп.20-24, где раковые клетки представляют собой клетки множественной миеломы или клетки лимфомы Ходжкина.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/622,600 | 2012-04-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044661B1 true EA044661B1 (ru) | 2023-09-20 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11773396B2 (en) | Chimeric antigen receptors targeting B-cell maturation antigen | |
EA044661B1 (ru) | Химерный рецептор антигена, направленный на антиген созревания b-клеток, кодирующая его нуклеиновая кислота, соответствующие экспрессионный вектор, клетка, композиция, применения и способы |