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Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Rosskastaniensaponins mit geringer Hämolyseaktivität (c-Aescin)
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Rosskastaniensaponins mit verhältnismässig geringer hämolytische Aktivität (a- Aescin) aus B - Aescin, wobei letzteres aus Rosskastanienextrakt, vorzugsweise einem frischen Extrakt aus frischen Samen, z. B. durch Ansäuern oder nach Passage durch einen Kationenaustauscher ausgefällt, von den übrigen Inhaltstoffen des Extraktes getrennt und mit alkalisch reagierenden Verbindungen, insbesondere Natronlauge, in die gelöste Salzform übergeführt wird.
Bemerkt sei, dass bei den bisherigen Untersuchungen weder das B - Aescin noch das a : - Aescin einheitliche Stoffe zu sein scheinen ; es handelt sich nach den bisherigen Erkenntnissen um Glykosidgemische mit ähnlichen chemisch-physikalischen Eigenschaften (z. B. Verteilungsverhalten in zweiphasigen Lösungsmittelgemischen oder auf Adsorbentien).
Es wurde nun gefunden, dass unter bestimmten Bedingungen eine Veränderung des in Wasser schwer löslichen Aescins (Säureform des ss-Aescins ist in Wasser schwer löslich) zum in Wasser leichtlöslichen Aescin (Säureform des ct-Aescins ist in Wasser leicht löslich) gelingt, ohne dass dabei erhebliche Verseifung zu acylärmeren Produkten stattfindet, die bekanntlich verhältnismässig leicht bei Rosskastaniensaponinen im alkalischen Milieu durch Verseifung unter Abspaltung ihrer Acylgruppen zum schwerlöslichen, hämolytisch unwirksamen Aescinol vor sich geht.
Gemäss der Erfindung wird aus einem Rosskastanienextrakt unter Umwandlung des sogenannten ss-Aescins, das im frischen Extrakt den Anteil an a-Aescin weit übersteigt, ein grosser Anteil an dem
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Aescin1 : 18000, hergestellt.
Erfindungsgemäss wird vorgeschlagen, dass in seiner freien Säureform in Wasser schwerlösliches ss - Aescin durch Belassen in wässeriger Lösung im pH-Bereich von 4, 5 bis 7, 5, vorzugsweise 6, 0 bis 6, 9, in einem Temperaturbereich von etwa 10 bis IOOOC, vorzugsweise 60 bis 90 C, in die Aescinform mit niedrigem Hömolyse-Index im Bereich von 15 bis 22000, z. B. 18000 (a- Aescin), umgewandelt wird.
Das ss -Aescin lässt sich in a-Aescin also dann umwandeln und eineAbspaltung von Acylgruppen bzw. eine Verseifung zu Aescin sich-mindestens im wesentlichen-vermeiden, wenn die Acidität eines wässerig-alkoholischen Extraktes bzw. einer ss-Aescinlösung verringert und die Reaktion der Lösung durch Zugeben von etwa neutral reagierendenPuffersubstanzen oder einfacher von alkalischen Mitteln, z. B. Natronlauge, auf einen PH-Wert von 5, 0 bis 7, 5, jedenfalls über 4, 5, vorzugsweise über 6, 0 und unterhalb 7, 0, eingestellt wird.
Es wurde festgestellt, dass im etwa neutralen Milieu das B-Aescin in Form eines Anions vorliegt, das sich beim Lagemlassen bei Raumtemperatur und rascher bei erhöhter Temperatur, vorzugsweise im
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Bereich von 50 bis 100 C, in a-Aescin umwandelt, d. li. in ein Produkt, das mit einem niedrigen Hämolyse-Index eine hohe pharmakologische Wirksamkeit verbindet, ohne dass dabei grössere Mengen an hämolytisch unwirksamen Verseifungsprodukten entstehen.
Bekannt ist, dass das ss -Aescin sich durch 50stündiges Verreiben im Mörser in ein röntgenamorphes Produkt überfuhren lässt, das zu 2% über einige Stunden in Wasser gelöst bleibt Ebenso ist die Einführung von 1 bis 3 Acetylresten beschrieben, die zu einer Löslichkeitssteigerung führen. Schliesslich ist die Gewinnung von a-Aescin aus dem mit Cholesterin fänbaren Saponinanteil von Rosskastanienextrakten bekannt
Während einerseits die Gewinnung von a - Aescin über das Saponin-Cholesterid relativ umständlich ist, anderseits das mikronisierte Aescin nur instabile Lösungen geringer Konzentration ergibt, führt eine Acetylierung bereits zu einem partiell synthetisch veränderten Aescin.
Nach der Erfindung dagegen gelingt es auf einfache Weise, aus dem in Wasser schwerlöslichen Aescin ein leichtlösliches Produkt herzustellen, das in Wasser über hinaus stabil in Lösung bleibt, wobei 1-bis 105oige wässerige Lösungen von a-Aescin sich in der Hitze sterilisieren lassen, ohne dabei zu einem Rückgang an hämolytischer Aktivität zu führen.
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bildung, die sich in der Bildung von Gallerten bemerkbar macht Kurzes Erwärmen auf 50 bis 600 bringt diese Erscheinung wieder zum Verschwinden, ohne dass dabei Ausfällungen eintreten.
Auf Grund dieser günstigen chemisch-physikalischen Eigenschaften sind a-Aescinlösungen als Injektionspräparat ebenso geeignet wie für eine orale Anwendung.
Es hat sich herausgestellt dass der an sich bekannte - erfindungsgemäss nachgewisene - Aescinanteil (a-Aescin), der in Lösung bleibt wenn das wasserunlösliche Aescin (8 -Aescin) durch Ansäuern der
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dex (HI) in der Grössenordnung von etwa 1 : 20 000 besitzt, jedoch überraschenderweise eine erheblich antiödematöse Wirkung aufweist, die sich am Verbrennungsödem messen lässt.
Die hämolytische Aktivität der Rosskastaniensaponine wird vorzugsweise gemäss der im folgenden beschriebenen photometrischen Methode, die optimal genaue Werte liefert, festgestellt
Gemessen wird die Extinktion des in Lösung gegangenen Blutfarbstoffes, stabilisiert als Cyanhämoglobin.
Man setzt diejenige Konzentration des Testsaponins mit der des Standardsaponins (8 - Aescin, HI = 1 : 40 000) ins Verhältnis, die die Auflösung der Hälfte einer 2%igen Erythrocytensuspension (ethalten durch Vermischen von 1 ml 4%iger Hammel-Erythrocytensuspension mit 1 ml Saponinlösung) bei PH 7, 2 nach 24stündigem Stehen bei Raumtemperatur verursacht
Bisherist man von andererseite den Weg gegangen, das für besonders wirksam angesehene 8-Aescin zu gewinnen, und hat geglaubt, dass das, was im Extrakt an Rosskastaniensaponinen nach Fällung und Abtrennen des 8 - Aescins übrig bleibt, entweder völlig wertlos sei (infolge des geringen HI) bzw. wenig Wert habe und verworfen werden könne, da es die von der Fällung nicht erfassten Spuren von ss- - Aescin seien.
Die Erfindung lehrt nun einen entgegengesetzten Weg, d. 11. es soll so viel wie möglich in - Aescin gewonnen werden, u. zw. weit mehr als in dem frischen Extrakt frischer Kastanien vorliegt
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird von einem Rosskastanienextrakt ausgegangen, insbesondere von einem frisch bereiteten Rosskastanienauszug aus frisch geemteten Rosskasta- l1iensamen ; anschliessend an die Extraktion wird nach dieser Ausführungsform der Erfindung der Extrakt in an sich bekannter Weise auf ss -Aescin aufgearbeitet, z. B. durch Zusetzen von starker Säure oder durch Verwendung eines Kationenaustauschers, wobei das 8 -Aescin in seiner Säureform zur Ausfällung gebracht wird.
Dieses ss-Aescin wird dann in die Form seines Salzes, vorzugsweise alkalisalzes, z. B. Natrium- salz, übergeführt z. B. durch Hinzufügen von wässeriger Natronlauge, bis ein pH-Wert im Bereich von : 1 :, 5 bis 7, 5, insbesondere 6,4 bis 6, 9, erreicht ist. Diese Lösung wird entweder bei Raumtemperatur belassen oder vorzugsweise erwärmt, wobei in Abwesenheit von Puffersubstanzen durch geringfügige Abspaltung von Acylresten der PH auf etwa 6 absinken kann und in Abhängigkeit von Zeit, Temperatur und Konzentration das 8 -Aescin teilwe1se oder vollständig in ein wasserlösliches Produkt umgewandelt wird.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nach partieller Umwandlung
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dann wieder durch Stehenlassen, vorzugsweise unter gelindem Erwärmen, weiter in wasserlösliches Saponin umgewandelt wird. Diese unvollständige Umwandlung von ss-Aescin in wasserlösliches Saponin ermöglicht die optimale Gewinnung von pharmakologisch wirksamem Material, Wird nach erfolgter Umwandlung zum wasserlöslichen Saponin die Aufbewahrungsfrist im Reak- ) tionsmilieu weit überschritten, so tritt in Abhängigkeit von PH, Temperatur und Konzentration die bereits früher beobachtete Abspaltung der Acylgruppen ein, die zu hämolytisch unwirksamen Produkten mit geringer Löslichkeit führt.
Bevorzugt ist-wie oben ausgeführt-die Umwandlung des gesamten ss -Aescins in α-Aescin, d.h., die Gewinnung der Rosskastaniensaponine des Extraktes zur Gänze als a-Aescin.
Über den Einfluss von Zeit, Temperatur und Konzentration hinaus ist besonders der pH-Wert der Lösung, in der die Umwandlung von ss-Aescin in a-Aescin vor sich geht, von Bedeutung. wobei pH-Werte unter 4, 5 die Umwandlung hemmen, während PH-Werte über 7,5 zu einer raschen Aufspaltung führen.
Ebenfalls ist für die Geschwindigkeit der Umwandlung und auch das Mass der Umwandlung die Temperatur, bei der die Lösung gehalten wird, von Belang. Hier ergaben sich günstige Wirkungen bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 1000, vorzugsweise 50 bis 90 .
Statt aus der Extraktlösung das ss -Aescin durch Ansäuern oder Passage durch einen Kationenaustauscher auszufällen und auf diese Weise das ss-Aescin aus dem Extrakt, d. h. von dem ce-Aescin und den übrigen Extrakt-Inhaltstoffen, zu trennen, kann nach einer andem bevorzugten AusfÜhrungsform auch so vorgegangen werden, dass der frisch bereitete Rosskastanien-Auszug in der Nähe des Neutralpunktes bei Raumtemperatur oder kürzer bei erhöhter Temperatur belassen wird, wobei die Umsetzung des anfänglich als ss-Aescin im Extrakt vorliegenden Anteils, z. B. quantitativ, In cx- Aescih erfolgt. Bezüglich Zeit, Temperatur, Konzentration und PH-Werten gelten auch für diese Ausführungsform die oben angegebenen Regeln.
Die folgende Tabelle zeigt die Umwandlung von ss-Aescin in cc-Aescin bei pH 6, 9 in Abhängigkeit von Zeit, Temperatur und Konzentration. Als Versuchsubstanz wurde ein durch mehrfaches Umfällen hochgereinigtes ss -Aescin (Schmp. 223 bis 2240) gewählt, das in 15o/oiger wässeriger Suspension nach Versetzen mit Natronlauge bis PH 6, 9 in das wasserlösliche Salz übergeführt wurde. Nach entsprechender Umwandlung wurde die Lösung über eine Kationenaustauschersäule gegeben und die abfliessende saure Lösung 7 min auf 960 erhitzt, um noch vorhandenes 8-Aescin auszufällen. Das In Lösung befindliche a-Aescin wurde im Vakuum zur Trockne gebracht und gravimetrisch bestimmt Die h molytische Aktivität des wasserlöslichen Anteils war bei allen Ansätzen gegenüber dem schwerlöslichen Aescin auf etwa die Hälfte abgesunken.
Tabelle
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<tb>
<tb> Prozentualer <SEP> Anteil <SEP> an <SEP> a-Aescin <SEP> nach <SEP> Umlagerung <SEP> von <SEP> 8 <SEP> -Aescin <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 6,9
<tb> Temperatur <SEP> : <SEP> 90
<tb> ss-Na*) <SEP> 2 <SEP> h <SEP> 3,5 <SEP> h <SEP> 5 <SEP> h <SEP> 6,5 <SEP> h <SEP> 9 <SEP> h <SEP> 10 <SEP> h <SEP> 14 <SEP> h <SEP> 18 <SEP> h
<tb> 1% <SEP> 49 <SEP> 74 <SEP> 84 <SEP> 87 <SEP> 100
<tb> 10% <SEP> 43 <SEP> 55 <SEP> 64 <SEP> 74 <SEP> 85 <SEP> 100
<tb> l% <SEP> 49 <SEP> 74 <SEP> 84 <SEP> 87 <SEP> 100
<tb> 10% <SEP> 43 <SEP> 55 <SEP> 64 <SEP> 74 <SEP> 85 <SEP> 100
<tb> Temperatur <SEP> : <SEP> 680 <SEP> Temperatur <SEP> :
<SEP> 500 <SEP>
<tb> ss-Na*) <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 72 <SEP> h <SEP> 96 <SEP> h <SEP> ss-Na*) <SEP> 68 <SEP> h
<tb> 1% <SEP> 47 <SEP> 80 <SEP> 92 <SEP> 1% <SEP> 26
<tb> 10% <SEP> 19 <SEP> 40 <SEP> 48 <SEP> 77 <SEP> 10% <SEP> 8
<tb>
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eine Kationenaustauschersäule (zirka 50 ml Austauscher) gegeben. Die abfliessende saure Lösung wird 7 min auf etwa 900 erhitzt und der sich bildende ss-Aescin-Niederschlag abzentrifugiert, Die leicht trübe Lösung wird durch Druckfilter geklärt und das Filtrat im Rotationsverdampfer unter Vakuum zur Trockne gebracht.
Ausbeute: 85% wasserlösliches Saponin (a-Aescin) mit einer hämolytischen Aktivität von zirka l : 20 000.
Beispiel 2 : Ein aus getrockneten Kastanien mit zirka 60'obigem Äthanol oder Methanol bei Raumtemperatur frisch gewonnener Extrakt wird vom Alkohol befreit, auf 100/0 Trockenruckstand eingestellt und bis PH 6, 7 vorsichtig mit NaOH versetzt. Nach 2stündigem Erhitzen auf 960 lässt sich im Gegensatz zum nicht erhitzten Extrakt durch Ansäuern auf PH 2 und weitere 10 min langem Erhitzen auf 960 kein ss-Aescin mehr ausfällen. Die hämolytische Aktivität des erhitzten Extraktes ist um etwa ein Viertel abgesunken.
PATENTANSPRÜCHE :
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einen Kationenaustauscher ausgefällt, von den übrigen Inhaltstoffen des Extraktes getrennt und mit alkalisch reagierenden Verbindungen, insbesondere Natronlauge, in die gelöstesalzform übergeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass in seiner freien Säureform in Wasser schwerlösliches ss-Aescin durch Belassen in wässeriger Lösung im pH-Bereich von 4, 5 bis 7, 5, vorzugsweise 6, 0 bis 6, 9, in einem Temperaturbereich von etwa 10 bis IOOOC, vorzugsweise 60 bis 90 C, in die Aescinform mit niedrigem Hämolyse-Index im Bereich von 15 bis 22000, z. B. 18 000 (a-Aescin), umgewandelt wird.