WO2016204120A1

WO2016204120A1 - 竹発酵抽出物の製造方法及び免疫賦活剤

Info

Publication number: WO2016204120A1
Application number: PCT/JP2016/067571
Authority: WO
Inventors: 乃玉井
Original assignee: 乃玉井
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2016-06-13
Publication date: 2016-12-22
Also published as: US10820612B2; EP3308655B1; AU2016279383A1; KR102025260B1; HK1249366A1; MY176017A; US20200029610A1; KR20180002764A; JPWO2016204120A1; AU2016279383B9; AU2016279383B2; EP3308655A4; EP3308655A1; JP6534443B2; CN107708445A

Abstract

新たな機能に基づく竹の新たな用途を提供すること。　竹発酵抽出物の製造方法は、竹を粉砕して竹粉を得る粉砕工程と、竹粉を乳酸菌により発酵させて竹発酵物を得る発酵工程と、竹発酵物を熱水抽出して抽出液を得る抽出工程と、を有している。

Description

竹発酵抽出物の製造方法及び免疫賦活剤

　本発明は、竹を乳酸発酵させた竹発酵物を抽出処理して得られる竹発酵抽出物の製造方法及びこの竹発酵抽出物を有効成分として含む免疫賦活剤、免疫賦活用食品組成物に関する。

　竹は主に日本を含むアジア地域に多く見られるイネ科植物である。竹は成長が早く伐採も容易であるため、古来より建築材や工芸品、日用品の材料として広く用いられてきた。しかしながら、合成樹脂等の化学材料の出現により、竹材の利用は減少しており、伐採されないまま放置された竹林が野山や農地を侵食するという問題が生じている。また、管理された竹林においても、伐採竹の引き取り手がいないため、廃棄費用がかかるという問題があった。

　そこで、竹を有効活用すべく、竹の新たな用途に関する研究開発が進められている。例えば、特許文献１には、竹材の表皮部分に抗菌作用があること、竹材の表皮部分から得られた竹微粉末を脱臭抗菌材として用いることが記載されている。また、本願発明者による特許文献２～４には、竹材を粉砕加工して得られた竹粉を乳酸発酵させて得られた乳酸発酵竹粉が記載され、当該乳酸発酵竹粉は家畜飼料、植物肥料、土質改良剤、消臭製品及び抗菌製品等に適用できることが記載されている。

特許第２５２４９４４号特許第５３５７４５９号特開２０１４－６４５６４号公報特開２０１４－６４５６５号公報

　上述したような竹の新たな用途は種々提案されているが、さらなる竹の利用を図るため、竹の価値を高めるような新たな機能に基づく用途が期待されている。

　本発明は上述した点に鑑み案出されたもので、その目的は、新たな機能に基づく竹の新たな用途を提供することにある。

　また、本発明の他の目的は、本願発明者がこれまで提案してきた乳酸発酵竹粉に関する技術に基づいた、竹の新たな用途を提供することにある。

　本願発明者は、竹を乳酸菌発酵させて得られた竹発酵物について、熱水抽出処理を施すことにより、免疫賦活作用を有する抽出物が得られることを見出し、本発明を完成させた。よって、上記課題を解決する本発明の竹発酵抽出物の製造方法は、竹を粉砕して竹粉を得る粉砕工程と、竹粉を乳酸菌により発酵させて竹発酵物を得る発酵工程と、竹発酵物を熱水抽出して抽出液を得る抽出工程とを有している。これにより、免疫賦活作用を有する竹発酵抽出物を容易に得ることができる。竹を粉砕した竹粉を発酵原料とすることにより、菌体が接触する表面積が増えると共に、粉砕により細胞内部に含まれている糖類、アミノ酸、ビタミン等が竹粉中に溶出し、微細なハニカム構造様の柔組織等中に生息していた乳酸菌も竹粉中に分散されるため、乳酸菌が効率よく増殖し、発酵も促進される。そして、この竹発酵物を熱水抽出することにより免疫賦活作用を有する竹発酵抽出物が得られるので、安全性も高く、食品、飲料、化粧品及び医薬をはじめ、畜産飼料、水産用添加剤又は農業用製剤等のさまざまな製品に安心して適用することができる。

　また、本発明の竹発酵抽出物の製造方法は、さらに、抽出液又はその濃縮液にアルコールを添加し、沈殿を得る沈殿生成工程を有することも好ましい。これにより、向上した免疫賦活作用を有する竹発酵抽出物が得られる。

　また、上述した沈殿生成工程において、アルコールの最終濃度が６０～８０重量％となるように、アルコールが添加されることも好ましい。これにより、沈殿形成のために添加されるアルコールの好適な濃度が選択される。

　さらに、上述した抽出工程において、竹発酵物の熱水抽出が、８０℃～１３０℃、０．１～０．３ＭＰａ条件下で行われることも好ましい。これにより、好適な熱水抽出の温度及び圧力条件が選択される。

　また、本発明の竹発酵抽出物の製造方法における竹は、竹の茎部であることも好ましい。竹の茎部のみを発酵材料に用いることにより、微生物の増殖が活発となり発酵が促進される。また、発酵のための水分調整も容易となるため、発酵状態が安定する。

　また、本発明の免疫賦活用食品組成物は、上述の工程により得られた竹発酵抽出物を有効成分として含有する。本発明の免疫賦活用食品組成物は、特に自然免疫機能を活性化させる作用を有するため、食品として摂取することにより、腸管免疫機構を介して、自然免疫機能、すなわち、ウイルスや細菌等に対する迅速な感染防御や悪性腫瘍に対する攻撃等の作用を活性化し、増強することができる。

　さらに、本発明の免疫賦活剤は、竹を粉砕して竹粉を得る粉砕工程、竹粉を乳酸菌により発酵させて竹発酵物を得る発酵工程、竹発酵物を熱水抽出して抽出液を得る抽出工程及び抽出液又はその濃縮液にアルコールを添加し、沈殿を得る沈殿生成工程を順に経て得られた竹発酵抽出物を有効成分として含有する。本発明の免疫賦活剤は、特に自然免疫機能を活性化させる作用を有する。これにより、生物の自然免疫機能、すなわち、ウイルスや細菌等に対する迅速な感染防御や悪性腫瘍に対する攻撃等の作用を活性化し、増強することができる。

　また、本発明の竹発酵抽出物の製造方法は、上述の発酵工程において、少なくともワイセラ（Weissella）属の乳酸菌を含む培養物を添加することも好ましい。これにより、スターターとして、本発明の竹発酵抽出物を得るための好適な微生物種が添加されるため、発酵工程にかかる時間が短縮される。

　また、本発明の竹発酵抽出物の製造方法は、上述の発酵工程の前に、竹粉を乳酸菌により発酵させて竹発酵物を得る種菌準備工程を備え、発酵工程において、種菌準備工程で得られた竹発酵物を添加することも好ましい。これにより、スターターとして、竹粉の発酵に馴化した発酵微生物が添加されるため、発酵工程にかかる時間が短縮される。

　本発明によれば、以下のような優れた効果を有する竹発酵抽出物の製造方法、免疫賦活剤及び免疫賦活用食品組成物を提供することができる。
（１）免疫賦活作用、特に自然免疫機能を活性化する作用を有する。また、ＩＬ－１２及びＩＦＮ－γの産生を誘導する作用を有するため、ウイルスや細菌に対する感染防御効果、免疫機能低下の改善、抗腫瘍効果等を有する。
（２）使用原料が竹であり、水やアルコールを用いて抽出されるため、安全性が高く、食品、機能性食品、飲料、化粧品、医薬品、畜産飼料、水産用添加剤又は農業用製剤等のさまざまな製品に安心して適用することができる。
（３）竹を乳酸菌発酵させたのち、熱水抽出することにより得られるため、比較的簡単に製造することができる。
（４）竹材の有効活用に寄与することができる。

本発明の第一の実施形態に係る竹発酵抽出物の製造方法を概略的に示すフローチャートである。本発明の第二の実施形態に係る竹発酵抽出物の製造方法を概略的に示すフローチャートである。実施例５における本発明の竹発酵抽出物の免疫機能活性測定結果を示すグラフである。比較例１における乳酸発酵竹液の免疫機能活性測定結果を示すグラフである。実施例８における竹発酵抽出物の免疫機能活性測定結果を示すグラフである。実施例１０における竹発酵抽出物のＩＬ－１２産生誘導結果を示すグラフである。実施例１０における竹発酵抽出物のＩＦＮ－γ産生誘導結果を示すグラフである。

　まず、図１を参照し、本発明の第一の実施形態に係る竹発酵抽出物の製造方法について説明する。

　図１に示すように、本発明の竹発酵抽出物Ｐ１の製造方法は、原料である竹を準備する工程Ｓ０、竹を粉砕して竹粉にする粉砕工程Ｓ１、竹粉を発酵させて竹発酵物を得る発酵工程Ｓ２、竹発酵物を熱水抽出する熱水抽出工程Ｓ３から概略構成される。

　（竹の準備）
　まず、図１に示す竹を準備する工程Ｓ０について説明する。本発明にかかる竹発酵抽出物の原料となる竹には、一般的に竹、笹及びバンブーと呼ばれるイネ科の植物が広く含まれる。具体的には、特に限定されないが、孟宗竹（Phyllostachys heterocycla f.pubescence）、真竹（Phyllostachys bambusoides）、淡竹（Phyllostachys nigra）、四方竹（Tetragonocalamus quadrangularis）、メダケ（Pleioblastus Simonii）、ヤダケ（Pseudosasa japonica）、クマザサ（Sasa veitchii）等が挙げられ、孟宗竹が好適に用いられる。竹は生竹のまま使用することができるため、竹についた土等の洗浄を行うほかは前処理等を行わず、伐採した竹をそのまま本発明の竹発酵抽出物の使用に用いることができる。生竹は粉砕して粉状又は切断してチップ状とすることにより、竹の茎内部、特に微細なハニカム状の柔組織内に存在する乳酸菌が表出して分散し、竹由来の乳酸菌による発酵が進行する。竹のうち、笹の葉のような葉部には抗菌性物質が多く含まれており、後述する発酵工程Ｓ２における乳酸菌発酵を妨げる可能性が高いため、葉部は切り落として茎部（幹）のみを以下工程で用いることが好ましい。

　（粉砕）
　次に、竹の粉砕工程Ｓ１について説明する。竹の粉砕方法としては、竹を粉状にできればどのような方法であってもよく、特に限定されないが、例えば、生竹の筒端面が当接した際に作動する回転刃を備えた竹粉化装置を利用することができる。この種の竹粉化装置では、生竹の筒端面を筒端面に対して略平行方向に連続的に切削していくことにより、生竹を所定の大きさの竹粉に粉砕する。生竹の筒端面を回転刃で削り取るようにして竹を粉砕することにより、竹の茎部の柔組織や維管束鞘等に多数存在している乳酸菌が表出し、後の発酵工程Ｓ２における発酵が促進される。また、竹を粉砕することにより、細胞壁が破壊され、細胞中に含まれているグルコース等の糖類、アミノ酸、ビタミン類も粉体中に分散され、発酵工程Ｓ２における乳酸菌の栄養要求が満足されて発酵が効率よく進行する。

　竹粉の粉粒の大きさとしては、特に限定されないが、細かすぎると取扱いが困難になり、大き過ぎると発酵速度が低下する観点から、粒径５０μｍ～１ｍｍ程度とすることが好ましく、粒径２００μｍ～６００μｍがより好ましい。また、粉砕処理により得られた竹粉を金属除去装置に導入して、竹粉化装置の回転刃の刃零れ等による異物を吸着除去することも好ましい。さらに、粉砕処理により得られた竹粉を篩装置に導入して、得られた竹粉の粒度範囲を揃えたり、粉砕工程Ｓ１で粉砕されなかった未切削片を除去してもよい。

　（発酵）
　次に、発酵工程Ｓ２について説明する。竹粉の発酵は竹由来の乳酸菌により行われる。具体的には、例えば、上述した粉砕工程Ｓ１により得られた竹粉を発酵容器、例えば透明樹脂袋等の発酵袋に所定量ずつ詰め、発酵袋内部の空気を出来るだけ除去した後、発酵袋の口部側を封口して容器内部を略嫌気状態とする。この発酵袋を筵等の遮光性シートで覆い、２０～３０℃の環境下で５～２０日間程度静置することにより、竹粉の乳酸発酵物が得られる。発酵状態は竹粉のｐＨ値より把握することができる。すなわち、乳酸発酵が進行するにつれて竹粉中に乳酸が生じ、竹粉が呈するｐＨが酸性となることから、１００ｍＬの精製水に竹粉を４０ｇ入れて５分間攪拌したのち、２分静置し、ろ紙でろ過したろ液のｐＨが４．３以下となった時点で発酵が十分に進んだと判断して、発酵工程Ｓ２を終了することができる。

　発酵工程Ｓ２において得られた竹発酵物について、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）による微生物叢解析を行ったところ、発酵初期段階では、主にロイコノストック（Leuconostoc）属及びワイセラ（Weissella）属の乳酸菌が観察され、発酵終了した竹発酵物ではワイセラ（Weissella）属の乳酸菌が微生物叢の主体となっていることが確認された。このことより、発酵工程Ｓ２において、ワイセラ（Weissella）属の乳酸菌を含む培養物をスターターとして用いることも好ましい。これによって、竹粉中の微生物叢の優占種を速やかにワイセラ（Weissella）属として発酵を促進させ、発酵工程Ｓ２における発酵日数を３割ほど短縮することができ、３～１５日程度とすることができる。また、気温の変動や竹の含水量や種類等により、微生物叢や微生物数は変動するが、スターターを用いることにより、年間を通じて安定した竹発酵物が得られる。スターターは、別途液体培地にて培養したワイセラ（Weissella）属乳酸菌を含むスターターを竹粉１ｋｇあたり０．５ｍＬ～５ｍＬとなるように添加することが好ましい。

　また、発酵工程Ｓ２において、予め竹粉を発酵させて得られた竹発酵物をスターターとして用いることも好ましい。このように、前もって種菌準備工程を設け、得られた竹発酵物をスターターとして用いることにより、竹発酵物中に含まれる優占種のワイセラ（Weissella）属が、粉砕工程Ｓ１を経たばかりの新たな竹粉の発酵を促進させ、発酵工程Ｓ２における発酵日数を３割ほど短縮することができ、３～１５日程度とすることができる。また、スターターを用いることにより、気候や竹の状態に左右されず、安定した竹発酵物が得られる。このように、予め準備された竹発酵物をスターターとして用いる場合には、新たな竹粉１ｋｇあたり５ｇ～２０ｇとなるように添加することが好ましい。さらに、本発酵工程Ｓ２において得られた竹発酵物の一部を次回の発酵工程の際のスターターとして用いることも有効である。

　また、発酵工程Ｓ２における発酵を、低真空又は中真空条件下、あるいは窒素ガスのような不活性ガス雰囲気下で行うことも好ましい。これにより、竹粉中でのハンゼヌラ（Hansenula）又はピチア（Pichia）等の酵母の増殖が妨げられ、酵母により生成される酢酸とエタノールから生じる酢酸エチルの発生を防止することができる。

　（熱水抽出）
　次に、熱水抽出工程Ｓ３について説明する。この熱水抽出工程Ｓ３では、発酵工程Ｓ２で得られた竹発酵物を熱水抽出して竹発酵抽出物Ｐ１を得る。熱水抽出方法としては、還流加熱抽出やオートクレーブ装置等を利用した加圧熱水抽出等が挙げられる。具体的には、例えば、竹発酵物と水とを反応容器に入れ、還流加熱処理等を所定時間行って竹発酵物抽出物を抽出する。水は竹発酵物１ｋｇに対し、４～１５リットル添加することが好ましく、４～１０リットル添加することがより好ましい。抽出溶媒としては、水が用いられるが、抽出効率を妨げず、得られる竹発酵抽出物の作用に影響を及ぼさない範囲において他の成分を含有させることも可能である。抽出温度としては、８０℃以上とすることが好ましく、８０℃～１３０℃がより好ましく、１００℃～１２１℃が特に好ましい。抽出は、大気圧下または加圧下で行われ、加圧条件としては、０．１ＭＰａ～０．５ＭＰａが好ましく、０．１ＭＰａ～０．３ＭＰａがより好ましい。抽出時間は１０分～５時間が好ましく、２０分～２時間がより好ましい。熱水抽出処理後、残渣を取り除くことにより竹発酵抽出物Ｐ１が得られる。本発明の竹発酵抽出物Ｐ１としては、熱水抽出工程Ｓ３で得られた竹発酵抽出物Ｐ１そのもののほか、竹発酵抽出物Ｐ１を減圧濃縮等の濃縮処理により濃縮液としたもの、竹発酵抽出物Ｐ１に凍結乾燥処理等の乾燥処理を施して、固形状・粉末状としたものなどが挙げられる。

　次に、図２を参照し、本発明の第二の実施形態に係る竹発酵抽出物の製造方法について説明する。

　図２に示すように、本発明の竹発酵抽出物Ｐ２の製造方法は、原料である竹を準備する工程Ｓ０、竹を粉砕して竹粉にする粉砕工程Ｓ１、竹粉を発酵させて竹発酵物を得る発酵工程Ｓ２、竹発酵物を熱水抽出する抽出工程Ｓ３及び熱水抽出液より沈殿を得る沈殿生成工程Ｓ４から概略構成される。これらの工程Ｓ０～Ｓ４のうち、竹の準備工程Ｓ０、粉砕工程Ｓ１、発酵工程Ｓ２及び熱水抽出工程Ｓ３は、上述した第一の実施形態における工程Ｓ０～Ｓ３とそれぞれ同様であり、その作用効果も同様であるため、説明を省略する。

　（沈殿生成）
　沈殿生成工程Ｓ４について説明する。この沈殿生成工程Ｓ４では、熱水抽出工程Ｓ３で得られた抽出液にアルコールを加えて沈殿を生成させ、その沈殿を回収することにより竹発酵抽出物Ｐ２を得る。用いられるアルコールとしては、例えば、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられるが、安全性に優れる観点から、エタノールが好ましい。アルコールは、抽出液中に不溶性の沈殿生成が生じる程度の量及び濃度で添加されればよいが、効率よく沈殿形成を促す観点から、具体的には、抽出液とアルコールからなる混合液中のアルコールの最終濃度が５０重量％～８５重量％となるように添加されることが好ましく、アルコールの最終濃度が６０重量％～８０重量％となるように添加されることが好ましく、６５重量％～７５重量％となるように添加されることが特に好ましい。また、抽出液中に添加するアルコールの量を減量できる観点から、アルコールを添加する前の抽出液に減圧濃縮処理等を施して、濃縮液としておくことも好ましい。この場合、抽出液の濃縮割合としては、熱水抽出工程Ｓ３で竹発酵物に添加した水の量により変動するが、３～２０倍に濃縮することが好ましく、５～１５倍に濃縮することがより好ましい。熱水抽出液又はその濃縮液にアルコールが所定量添加されることにより、抽出液中に含まれる免疫賦活作用を有する成分が選択的に沈殿生成し、不用成分が除去され、精製された竹発酵抽出物Ｐ２が得られる。得られた沈殿、すなわち、竹発酵抽出物Ｐ２は、ろ過処理や遠心分離処理等により固液分離されて回収される。竹発酵抽出物Ｐ２はその後乾燥させて、固形状・粉末状として保存される。

　本発明の竹発酵抽出物は免疫賦活作用を有する。本発明でいう免疫賦活作用とは、自然免疫と獲得免疫の両方の機能を向上させる作用を意味するが、本発明にかかる竹発酵抽出物を有効成分として含む免疫賦活剤は、特に、自然免疫機能を賦活化する作用を有し、ＩＬ－１２及びＩＦＮ－γ産生誘導作用を有する。これにより、自然免疫機能、すなわち、病原体に対する迅速な感染防御や悪性腫瘍に対する攻撃等の作用を活性化し、増強することができる。また、加齢やストレス、疲労等の原因によって免疫機能が低下した場合に免疫反応を活性化させる作用、又は、加齢やストレス、疲労等の原因に曝されても免疫機能を安定的に維持する作用も有する。また、本発明の竹発酵抽出物は、ＩＬ－１２及びＩＦＮ－γ産生誘導作用を有していることから、Ｔｈ１細胞を活性化させて細胞性免疫を亢進させるだけでなく、細胞性免疫の亢進により、液性免疫を抑制させてアレルギー反応を抑制させる作用も有することも期待される。

　本発明の免疫賦活剤は、食品、飲料、化粧品、医薬部外品及び医薬品をはじめ、畜産飼料、水産用添加剤又は農業用製剤等のさまざまな製品に用いることができる。有効成分である竹発酵抽出物は、タケノコ等食用としても用いられてきた竹の新たな機能を見出したものであり、安全性が高く、日常的に摂取することが可能である。それゆえ、食品や飲料用組成物として用いることが好ましい。この竹発酵抽出物を有効成分として含む、免疫賦活用食品組成物は、錠剤やカプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などのサプリメント形態、飲料、菓子、パン、粥、シリアル、麺類、ゼリー、スープ、乳製品、調味料、食用油等のあらゆる形態で用いることができる。また、食品組成物として用いる際には、本発明の有効成分の効能に影響を与えない範囲において、他の有効成分や、ビタミン、ミネラル若しくはアミノ酸等の栄養素等を種々組み合わせることも可能である。本発明の食品組成物から展開される食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等が含まれる。また、ヒト以外の他の動物（ペット、家畜、水産養殖動物等）に対して使用することもでき、その際には、飼料、ペットフード、動物用サプリメント又は動物用飲料等の形態で用いることができる。

　本発明の免疫賦活剤を医薬品又は医薬部外品として用いる場合には、従来慣用されている方法により種々の形態に調製することができる。この場合、通常製剤用の薬理学的に許容される担体や賦形剤、滑沢剤、分散剤、崩壊剤、緩衝剤、溶剤、増量剤、保存剤、香料又は安定化剤など、医薬品の添加剤として許容されている添加剤を用いて製剤化することができる。さらに、バイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、リポソーム製剤、微粉末化又はシクロデキストリン等を用いた包接化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。剤型としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤等を挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。

　本発明の免疫賦活剤を含有する医薬品や食品組成物等は、一日の摂取量として、竹発酵抽出物を乾燥重量換算で１ｍｇ～１０ｇとすることが好ましく、１ｍｇ～１ｇとすることがより好ましい。

　以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

　［実施例１］
　１．竹発酵抽出物（１）の製造
　茎高が４ｍ程度の孟宗竹を伐採し、葉部を鉈で切り落として茎部のみとしたのち、水で洗浄して泥や汚れ等を取り除いた。この孟宗竹の茎部約４ｍを竹粉化装置（丸大鉄工株式会社製品、型番：ＰＡ－Ｚ）を用いて粉砕し、５００μｍ以下の竹粉を約１０ｋｇ得た。次に１５ｋｇ容量の樹脂袋に粉砕処理した竹粉１０ｋｇを入れ、樹脂袋の外周を押圧して袋内部の空気を出来るだけ除去し、封口した。樹脂袋を遮光性シートで覆い、２５℃環境下にて１４日間静置した。１４日経過した竹発酵物の一部をとり、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）による微生物叢解析を行ったところ、ワイセラ属の乳酸菌（Weissella cibaria又はconfusa）が微生物叢の主体となっていることが確認された。得られた竹発酵物１ｋｇを還流加熱用の反応容器に入れて水５Ｌを注ぎ、加熱還流にて熱水抽出を行った。反応時間は６０分とした。反応終了後、反応容器内の混合物を濾過し、ろ液（約４．５Ｌ）を抽出液として回収した。この抽出液４．５Ｌに対し、１５％エタノール水溶液を６Ｌ添加して不溶性となった成分を沈殿させ、沈殿を回収した。回収した沈殿を凍結乾燥させ、約３０ｇの竹発酵抽出物（１）を得た。

　［実施例２］
　２．竹発酵抽出物（２）の製造
　茎高が４ｍ程度の孟宗竹を伐採し、葉部を鉈で切り落として茎部のみとしたのち、水で洗浄して泥や汚れ等を取り除いた。この孟宗竹の茎部約４ｍを竹粉化装置（丸大鉄工株式会社製品、型番：ＰＡ－Ｚ）を用いて粉砕し、５００μｍ以下の竹粉を約１０ｋｇ得た。竹粉１０ｋｇに対し、実施例１で得られた竹発酵物を１００ｇ添加し、よく混合した。次に１５ｋｇ容量の樹脂袋にこの竹粉を入れ、樹脂袋の外周を押圧して袋内部の空気を出来るだけ除去し、封口した。樹脂袋を遮光性シートで覆い、２５℃環境下にて９日間静置した。得られた竹発酵物１ｋｇを還流加熱用の反応容器に入れて水５Ｌを注ぎ、加熱還流にて熱水抽出を行った。反応時間は６０分とした。反応終了後、反応容器内の混合物を濾過し、ろ液（約４．５Ｌ）を抽出液として回収した。この抽出液４．５Ｌに対し、１５％エタノール水溶液を６Ｌ添加して不溶性となった成分を沈殿させ、沈殿を回収した。回収した沈殿を凍結乾燥させ、約３０ｇの竹発酵抽出物（２）を得た。

　［実施例３］
　３．免疫機能活性試験のための竹発酵抽出物（３）の製造
　実施例１で得られた竹発酵物を、滅菌した生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）にサンプル濃度１００ｍｇ／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁物をオートクレーブ内で１２１℃で２０分間、竹発酵物の熱水抽出処理を行った。熱水抽出液を遠心分離して上清を回収し、竹発酵抽出物（３）を得た。この上清を免疫賦活試験に用いた。また、回収した上清１ｍＬを遠心エバポレータにかけて乾固させ、得られた乾燥重量から上清中の竹発酵抽出物（３）の濃度を算出した。

　［実施例４］
　４．免疫機能活性試験のための竹発酵抽出物（４）の製造
　実施例２で得られた竹発酵物を、滅菌した生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）にサンプル濃度１００ｍｇ／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁物をオートクレーブ内で１２１℃で２０分間、竹発酵物の熱水抽出処理を行った。熱水抽出液を遠心分離して上清を回収し、竹発酵抽出物（４）を得た。この上清を免疫賦活試験に用いた。また、回収した上清１ｍＬを遠心エバポレータにかけて乾固させ、得られた乾燥重量から上清中の竹発酵抽出物（４）の濃度を算出した。

　［実施例５］
　５．免疫機能活性試験
　免疫機能活性試験としては、カイコ筋収縮を指標とした自然免疫促進活性試験を行った。すなわち、本試験方法は、カイコ等の完全変態型昆虫の幼虫に被検試料を投与した場合、被検試料中に神経伝達物質が存在すると急激な筋収縮が起こるが、自然免疫機能活性化作用を有する物質を完全変態型昆虫の幼虫に投与した場合には、その完了に１０分程度を要するゆっくりとした筋収縮（緩行性筋収縮）が起こるという知見に基づいている。実施例３で得られた竹発酵抽出物（３）及び実施例４で得られた竹発酵抽出物（４）を被検試料として以下試験を行った。

　カイコの緩行性筋収縮の測定は次のようにして行った（Hamamoto H., Kamimura M.,Sekimizu K., J.Biol.Chem.、2008年、283(4)、pp.2185-91参照）。５日齢カイコの断頭筋肉標本に被検試料５０μＬを体腔内注射し、カイコの体長を測定して、筋収縮値（Contraction Value、Ｃ値＝（［収縮前（注射前）の長さ］－［収縮後（注射後）の長さ］）／［収縮前の長さ］）の最大値（約１０分後）を求めた。被検試料は、０．９％生理食塩液で以下表１に示すように所定濃度に系列段階希釈し、各希釈液についてそれぞれＣ値を測定した。Ｃ値＝０．１５のときの緩行性筋収縮活性を１ユニットと定義し、得られた用量応答曲線からＣ値＝０．１５を与える被検試料量を求め、被検試料１ｍｇあたりの活性を算出した。また、生理食塩液５０μＬをネガティブコントロールとし、空気０．２ｍＬをポジティブコントロールとした。結果を以下表１及び図２に示す。図３（ａ）は竹発酵抽出物（３）の結果を示し、図３（ｂ）は竹発酵抽出物（４）の結果を示している。

［比較例１］
　６．免疫機能活性試験のための乳酸発酵竹液の製造及び免疫機能活性試験
　実施例１で得られた竹発酵物１ｋｇを１０Ｌ容量のプラスチック容器に入れ、竹炭粉２０ｇ及びパパイン酵素６ｇを加えてよく混合した。さらに水８Ｌを注いで蓋をしめ、２５℃環境下にて１４日静置した。１４日後、容器内の混合物を濾過し、ろ液（約８Ｌ）を乳酸発酵竹液として回収した。この乳酸発酵竹液を１０ｍＬとり、ｐＨ試験紙でｐＨを調べてＮａＯＨで中和した。また、乳酸発酵竹液１ｍＬを遠心エバポレータにかけて乾固させ、得られた乾燥重量から乳酸発酵竹液に含まれる成分の濃度を算出した。この乳酸発酵竹液を被検試料として実施例５と同様の免疫機能活性試験を行った。結果を以下表２及び図４に示す。

　表１に示すように、竹発酵抽出物（３）の濃度は１５ｍｇ／ｍＬであり、竹発酵抽出物（４）の濃度は１１ｍｇ／ｍＬであった。また、これら抽出物の免疫機能活性を測定したところ、図３に示すような用量応答曲線がみられ、本発明の竹発酵抽出物には自然免疫促進活性があることがわかった。竹発酵抽出物（３）の比活性は２．１ｕｎｉｔｓ／ｍｇであり、竹発酵抽出物（４）の比活性は２．７ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。他方、比較例で示した乳酸発酵竹液については、図４に示すように用量応答曲線がみられず、自然免疫促進活性は観察されなかった。これらの結果より、竹発酵物を熱水抽出することにより得られた竹発酵抽出物には、免疫賦活作用があることが明らかとなった。

　［実施例６］
　７．竹発酵抽出物（５）の製造
　実施例１で得られた竹発酵物１０ｇを、滅菌した生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）１００ｍＬに懸濁させた。この懸濁物をオートクレーブ内で１２１℃、２気圧下で２０分間、竹発酵物の熱水抽出処理を行った。熱水抽出液を遠心分離して上清を回収し、遠心エバポレータにかけて乾固させ、粉末の竹発酵抽出物（５）を４４０ｍｇ得た。また、得られた竹発酵抽出物（５）中に含まれる糖類の量をフェノール硫酸法により定量したところ、竹発酵抽出物（５）のうちの７重量％が糖類であることがわかった（表４参照）。

　［実施例７］
　８．竹発酵抽出物（６）の製造
　実施例１で得られた竹発酵物１０ｇを、滅菌した生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）１００ｍＬに懸濁させた。この懸濁物をオートクレーブ内で、１２１℃、２気圧下で２０分間、竹発酵物の熱水抽出処理を行った。熱水抽出液を遠心分離して上清を回収した。回収した上清に９５％エタノールを添加し、エタノールの最終濃度が６８％となるまでエタノールを加えた。生成した沈殿を回収し、乾燥させて粉末の竹発酵抽出物（６）を２７ｍｇ得た。また、得られた竹発酵抽出物（６）中に含まれる糖類の量をフェノール硫酸法により定量したところ、竹発酵抽出物（６）のうちの５２重量％が糖類であることがわかった（表４参照）。

　［実施例８］
　９．竹発酵抽出物（５）及び（６）についての免疫機能活性試験
　実施例７及び実施例８で得られた竹発酵抽出物（５）及び竹発酵抽出物（６）を被検試料として、実施例５と同様の方法で免疫機能活性試験を行った。結果を以下表３及び図５に示す。図５（ａ）は竹発酵抽出物（５）の結果を示し、図５（ｂ）は竹発酵抽出物（６）の結果を示している。

　実施例６及び実施例７で得られた竹発酵抽出物の免疫機能活性を測定したところ、図５に示す用量応答曲線がみられ、本発明の竹発酵抽出物には自然免疫促進活性があることがわかった。この用量応答曲線から求めた比活性の値は、竹発酵抽出物（５）は７．３ｕｎｉｔｓ／ｍｇであり、エタノール沈殿形成工程を経た竹発酵抽出物（６）は２３０ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった（表４参照）。このことより、竹発酵物を熱水抽出することにより得られた竹発酵抽出物には免疫賦活作用があること、免疫賦活作用を有する成分はエタノール沈殿によって濃縮されるか、選択的に得ることができ、沈殿生成工程を経た竹発酵抽出物（６）は、より高い免疫賦活作用を示すことが明らかとなった。また、以下表４に示すように、竹発酵抽出物（６）は糖類の含有量が５２重量％に上昇している。このように、糖類の含有量の上昇に伴って比活性も上昇していることから、竹発酵抽出物に含まれる多糖類が、免疫賦活作用を有する活性成分のひとつであると考えられる。

　［実施例９］
　１０．竹発酵抽出物（７）の製造
　実施例１で得られた竹発酵物１ｋｇを還流加熱用の反応容器に入れて水１０Ｌを注ぎ、加熱還流にて１００℃で熱水抽出を行った。反応時間は１２０分間とした。反応終了後、反応容器内の混合物を濾過して、ろ液を約９Ｌ回収した。このろ液を約１０倍に濃縮して濃縮液とした。この濃縮液に対し、９５％エタノールを添加し、エタノールの最終濃度が７０％となるまでエタノールを加えた。この混合液をろ過して生成した沈殿を回収し、乾燥させて粉末の竹発酵抽出物（７）を得た。

　［実施例１０］
　１１．マウス脾臓細胞を用いた免疫応答試験
　Ｃ５７Ｂ６マウスから脾臓細胞を採取し、脾臓細胞がＲＰＭＩ－１６４０液体培地中に５×１０^６個／ｍＬで存在するよう調整した。被検試料には、実施例９で製造した竹発酵抽出物（７）を用いた。また、天然物由来の抽出物にはＬＰＳがたびたび含まれていることがあるため、比較試料として、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用い、本発明の竹発酵抽出物によるサイトカインの産生がＬＰＳによるものであるか否かについて確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスの脾臓細胞（５×１０^６個／ｍＬ）に竹発酵抽出物（７）を最終濃度が２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬとなるように加え、４８時間培養した。同様に、Ｃ５７Ｂ６マウスの脾臓細胞（５×１０^６個／ｍＬ）にＬＰＳを最終濃度が０．１μｇ／ｍＬとなるように加え、４８時間培養した。４８時間培養後、培地中のＩＬ－１２（ｐ７０）とＩＦＮ－γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＩＬ－１２（ｐ７０）産生量の結果を図６に、ＩＦＮ－γの産生量の結果を図７に示す。図６及び図７に示すように、本発明の竹発酵抽出物は、ＩＬ－１２及びＩＦＮ－γの産生を誘導することがわかった。また、ＬＰＳを添加した脾臓細胞からは、ＩＬ－１２もＩＦＮ－γも産生が認められなかったことから、本発明の竹発酵抽出物によるこれらのサイトカインの産生は、ＬＰＳによるものではなく、竹発酵抽出物に含まれるＬＰＳ以外の成分による作用であると考えられた。

　本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。

　本発明の竹発酵抽出物は、食品や飲料、医薬品として利用されるほか、畜産や水産養殖分野において利用されることができる。

Claims

　竹を粉砕して竹粉を得る粉砕工程と、
　前記竹粉を乳酸菌により発酵させて竹発酵物を得る発酵工程と、
　前記竹発酵物を熱水抽出して抽出液を得る抽出工程と、を有することを特徴とする竹発酵抽出物の製造方法。
　さらに、前記抽出液又はその濃縮液にアルコールを添加し、沈殿を得る沈殿生成工程を有することを特徴とする請求項１に記載の竹発酵抽出物の製造方法。
　前記沈殿生成工程において、前記アルコールの最終濃度が６０～８０重量％となるように、前記アルコールが添加されることを特徴とする請求項２に記載の竹発酵抽出物の製造方法。
　前記抽出工程における熱水抽出が、８０℃～１３０℃、０．１ＭＰａ～０．３ＭＰａ条件下で行われることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の竹発酵抽出物の製造方法。
　前記竹が、竹の茎部であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の竹発酵抽出物の製造方法。
　竹を粉砕して竹粉を得る粉砕工程と、該竹粉を乳酸菌により発酵させて竹発酵物を得る発酵工程と、該竹発酵物を熱水抽出して抽出液を得る抽出工程とを順に経て得られた竹発酵抽出物を有効成分として含有する免疫賦活用食品組成物。
　竹を粉砕して竹粉を得る粉砕工程と、該竹粉を乳酸菌により発酵させて竹発酵物を得る発酵工程と、該竹発酵物を熱水抽出して抽出液を得る抽出工程と、該抽出液又はその濃縮液にアルコールを添加し、沈殿を得る沈殿生成工程とを順に経て得られた竹発酵抽出物を有効成分として含有する免疫賦活用食品組成物。
　竹を粉砕して竹粉を得る粉砕工程と、該竹粉を乳酸菌により発酵させて竹発酵物を得る発酵工程と、該竹発酵物を熱水抽出して抽出液を得る抽出工程と、該抽出液又はその濃縮液にアルコールを添加し、沈殿を得る沈殿生成工程とを順に経て得られた竹発酵抽出物を有効成分として含有する免疫賦活剤。