WO2016186206A1 - ＩｇＧ結合ペプチドによる抗体の特異的修飾 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an IgG-binding peptide, an IgG-binding peptide modified with a crosslinking agent, an IgG-binding peptide-IgG complex modified with the crosslinking agent, a method for producing the complex, and the like.
  • Antibodies have been widely used for the detection of target molecules in various researches and developments in the past, and are extremely important industrially as detection reagents and diagnostic agents. Antibodies are also attracting attention as pharmaceuticals for the treatment of diseases because of their specificity for target molecules.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Chemical modifications for functional addition of antibodies include enzymes such as alkaline phosphatase (AP) and peroxidase (HRP) (Non-Patent Documents 1 and 2), iodination for radioisotopes and addition of chelate compounds ( Non-patent document 3) and modification with low molecular weight compounds such as biotin have been made (non-patent document 4). These modifications are mainly performed through the amino group of lysine, the thiol group of cysteine, the activated carboxyl group, etc., which are specific for the functional group, but not site-specific. There are problems such as reducing the activity of the antibody by modifying the antigen binding site, and controlling the number of bound compounds.
  • AP alkaline phosphatase
  • HRP peroxidase
  • Non-Patent Documents 5 to 6 Even in antibody drug conjugates (ADCs) of antibody drugs that have recently appeared (Non-Patent Documents 5 to 6), the anti-cancer drug is bound to the antibody non-specifically, so that the activity of the antibody itself is weakened or Due to the difficulty in controlling the number of binding agents, there was a problem that the subsequent formulation steps were complicated.
  • an antibody is modified by using an antibody having a specific functional group introduced site-specifically.
  • non-natural amino acids Non-Patent Documents 7 to 9
  • free cysteine Non-Patent Documents 10 to 11
  • TG transglutaminase
  • Non-Patent Documents 14 to 15 modification techniques targeting sugar chains on Fc of antibodies are also used (Non-Patent Documents 14 to 15), and although these methods are site-specific, they require oxidative modification of sugar chains. There is a problem that the reaction process is complicated. In this way, site-specific antibody modification technology is being developed, but in many cases, it is necessary to modify the antibody itself in terms of antibody engineering. It is not necessarily an advantageous method.
  • the present inventors have so far reported a peptide that specifically or selectively binds to IgG (hereinafter referred to as “IgG-binding peptide”) (see WO2013 / 027796 and WO2008 / 054030).
  • IgG-binding peptide a peptide that specifically or selectively binds to IgG
  • the present inventor based on the X-ray crystal structure analysis of the complex of IgG-binding peptide and IgG Fc, the position of each amino acid of IgG-binding peptide in the binding state and each amino acid of IgG Fc The positional relationship with was examined in detail.
  • an amino acid capable of binding to a cross-linking agent is introduced into the peptide, and the amino acid is modified with the cross-linking agent to prepare an IgG-binding peptide that is site-specifically modified with the cross-linking agent.
  • the present invention was completed by finding that it can be modified.
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue; H is a histidine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, G is a glycine residue; Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue, L is a leucine residue; V is a valine residue, and W is a tryptophan residue.
  • a peptide comprising an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues represented by the above and capable of binding to human IgG and / or rabbit IgG.
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine
  • C is a cysteine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid
  • G is a glycine residue
  • Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue; A is an alanine residue, Y is a tyrosine residue; H is a histidine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, G is a glycine residue; E is a glutamic acid residue, L is a leucine residue; V is a valine residue, and W is a tryptophan residue.
  • the peptide according to (1) or (2) above which comprises an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues and is capable of binding to human IgG and / or rabbit IgG.
  • the peptide according to (1) or (2) above which comprises an amino acid sequence consisting of 13 amino acid residues and is capable of binding to human IgG and / or rabbit IgG.
  • Consists of any of the following amino acid sequences 1) to 4), wherein Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid The peptide according to (6) above.
  • the peptide forms a disulfide bond between the two outer cysteine (C) residues, or the sulfide group in the two outer cysteine residues of the peptide has the following formula:
  • (11) The peptide according to any one of (1) to (10) above, to which a drug is bound.
  • (12) The peptide according to any one of (1) to (11) above, wherein Xaa1 is a lysine residue.
  • the cross-linking agent is DSG (disuccinimidyl glutarate), DSS (disuccinimidyl suberate), DMA (dimethyl adipimidate dihydrochloride), DMP (dimethyl pemilimido acid dihydrochloride), DMS ( (13) selected from the group consisting of suberic acid dimethyl dihydrochloride), DTBP (3,3'-dithiobispropionimidic acid dimethyl dihydrochloride), and DSP (dithiobissuccinimidyl propionic acid)
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of (1) to (15) above or the complex according to (16) above.
  • a peptide containing two or more cysteine residues and the following formula: (Wherein R 1 and R 2 are each independently an arbitrary halogen atom), and sulfide groups in two or more cysteine residues are represented by the following formula:
  • a method for producing a peptide in which two or more cysteine residues are linked by a linker comprising the step of obtaining a peptide linked by a linker represented by the formula: (20) The method according to (19) above, wherein in the compound, R 1 and R 2 are the same and are Cl, Br, or I.
  • (21) The method according to (19) or (20) above, wherein the peptide is a peptide defined in any one of (1) to (8) and (10) to (15) above.
  • the IgG-binding peptide modified with the cross-linking agent of the present invention can be added to IgG in a short time and with almost no side reaction, various compounds can be bound by binding various compounds to the IgG-binding peptide.
  • IgG can be modified specifically and conveniently.
  • the IgG-binding peptide modified with the cross-linking agent of the present invention can be directly bound to wild-type IgG and the like, and there is no need to alter the sequence of the antibody molecule, the function decreases due to the genetic modification of the antibody molecule.
  • various compounds can be bound to the antibody at lower cost without incurring.
  • the compound to be introduced can be bound in advance to an IgG-binding peptide, and the binding reaction between the IgG-binding peptide and the antibody can be performed under mild reaction conditions, the compound to be introduced and IgG are directly bound. A complicated reaction conventionally required in the reaction step is not required, and a decrease in antibody function due to the reaction can be prevented.
  • FIG. 1 (A) shows the structure of a complex of an IgG-binding peptide (C35A-3 / 15: DCAYHRGELVWCT (SEQ ID NO: 33)) and human IgG Fc.
  • the IgG-binding peptide is a space filling model
  • the IgG ⁇ Fc is a ribbon model
  • the sugar chain of Fc is shown by a wire model.
  • FIG. 1 (B) shows a model of a cross-linked structure between an IgG-binding peptide modified with DSG (C35A-3 / 15 (R8K): DCAYHKGELVWCT (SEQ ID NO: 34)) and IgGcFc.
  • the main chain of the peptide is indicated by a ribbon model.
  • peptide-Lys8 is the 6th lysine residue of C35A-3 / 15 (R8K)
  • peptide-Tyr6-Gly9 is the 7th glycine residue from the 4th tyrosine residue of C35A-3 / 15 (R8K).
  • Fc-Lys248 indicates Fc Lys248 according to EU numbering
  • Fc-Pro247-Asp249 indicates Fc Pro247 to Asp249 according to EU numbering.
  • FIG. 2 shows the results of SDS-PAGE (A) and Western blot (B) of a mixture of labeled IgG-binding peptide and various proteins.
  • DSG indicates that the IgG-binding peptide reacted with DSG (disuccinimidyl glutarate) and DSS indicates that the IgG-binding peptide reacted with DSS (disuccinimidyl suberate) was tested.
  • hIgG represents human IgG
  • hIgA represents human IgA
  • HSA represents human serum albumin.
  • FIG. 3 shows the examination results by ELISA of reaction molar ratio (A) and reaction time (B) in the reaction of labeled IgG-binding peptide and IgG.
  • DSS R8K 0 min is obtained by adding Tris-HCl (pH 7.0) to a labeled IgG-binding peptide having a molar ratio of 10 times that of IgG, blocking NHS groups, and then adding to wells.
  • No DSS R8K uses a biotinylated IgG-binding (R8K) peptide that does not bind DSS, and no pep indicates a control with no peptide added.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the reactivity of the labeled IgG-binding peptide to each protein (hIgA, hIgG, BSA (bovine serum albumin)) using size exclusion chromatography.
  • FIG. 5 shows the human IgG Fc solution and DSG-modified IgG-binding peptide dissolved in DMF added at a molar ratio of 0.5, 1.0, 2.0, or 5.0 with respect to human IgG. The result of a liquid chromatography after having been made to show is shown.
  • FIG. 5 shows unreacted (peak 2), adduct of one peptide (peak 3), and two when human IgG and DSG-modified IgG-binding peptide are reacted at each molar ratio.
  • the change in the amount of peptide adduct (peak 4) produced is shown.
  • FIG. 6 shows a DSG-modified IgG-binding peptide dissolved in DMF with respect to an Fc solution of human IgG prepared at pH 4.0 (A), pH 5.5 (B), or pH 7.0 (C).
  • FIG. 7A shows the binding of 4D5-Fc antibody to HER2 antigen on breast cancer cell line SK-BR3, DSG-modified biotinylated IgG binding peptide (Biotinylated IgG binding peptide) or biotinylated anti-human IgG mouse antibody (Anti hIgG The results of detection with mAb-biotin label) and PE-labeled Streptavidin (SA-PE label) are shown.
  • FIG. 7A shows the binding of 4D5-Fc antibody to HER2 antigen on breast cancer cell line SK-BR3, DSG-modified biotinylated IgG binding peptide (Biotinylated IgG binding peptide) or biotinylated anti-human IgG mouse antibody (Anti hIgG
  • SA-PE label PE-labeled Streptavidin
  • FIG. 7B shows the results of the same experiment (Biotinylated IgG-binding peptide + SA-PE label or Anti hIgG mAb-biotin label + SA-PE label) without adding the 4D5-Fc antibody, and 4D5-Fc as a positive control.
  • the result using an antibody and PE labeled anti-human IgG mouse antibody (Anti-hIgG-mAb-PE label) is shown.
  • FIG. 8A shows three main peaks (a, b, and c) obtained as a result of ion exchange chromatography after ligation by click reaction between an azide peptide antibody and dibenzocyclooctyne-maleimide-modified VHH.
  • Lane 8B shows the result of SDS-PAGE analysis of each of the obtained peaks in the reduced state.
  • Lane 1 is anti-HER2 human IgG antibody
  • lane 2 is anti-HER2 human IgG antibody-azide peptide
  • lane 3 is peak a (unreacted anti-HER2 human IgG antibody)
  • lane 4 is peak b (anti-HER2 human IgG antibody- (Monovalent VHH)
  • Lane 5 shows the results of electrophoresis of peak c (anti-HER2 human IgG antibody-divalent VHH)
  • Lane 6 shows VHH
  • Lane 7 shows molecular weight markers.
  • FIG. 9A to 9C show that SK-BR3 cells that highly express HER2 were used as primary antibodies using the cell fraction from which dead cells were removed by 7-AAD staining, and anti-HER2 human IgG antibody (FIG. 9A), anti- Using IgA receptor VHH (C-terminal HIS tag addition) ( Figure 9B), anti-HER2 human antibody-monovalent VHH (C-terminal HIS tag addition) ( Figure 9C), biotin with a final concentration of 50 nM as the secondary antibody
  • FIG. 9A shows that SK-BR3 cells that highly express HER2 were used as primary antibodies using the cell fraction from which dead cells were removed by 7-AAD staining
  • FIG. 9A anti- Using IgA receptor VHH (C-terminal HIS tag addition)
  • Figure 9B anti-HER2 human antibody-monovalent VHH (C-terminal HIS tag addition)
  • biotin with a final concentration of 50 nM as the secondary antibody
  • FIG. 9D-F show binding to HL60 cells with high expression of IgA receptor by induction of differentiation with DMSO 1.3%, anti-HER2 human antibody (Figure 9D) as primary antibody, anti-IgA receptor VHH (C-terminal HIS The results of detection using a PE-labeled anti-human IgG polyclonal antibody as a secondary antibody using tag addition (FIG. 9E) and anti-HER2 human antibody-monovalent VHH (FIG. 9F) are shown.
  • FIG. 10 shows that SK-BR3 cells were cultured in the presence of 0-10 nM drug (Herceptin or the antibody-drug conjugate prepared in Example 11), and the number of cells after 72 hours was measured using a cell measurement kit.
  • FIG. 10A shows the effect of anti-HER2 antibody-DM1 * 1 on SK-BR3 cells
  • FIG. 10B shows the effect of anti-HER2 antibody-DM1 * 2 on SK-BR3 cells.
  • FIG. 10C shows the effect of anti-HER2 antibody-DM1 * 1 on C6 cells
  • FIG. 10D shows the effect of anti-HER2 antibody-DM1 * 2 on C6 cells.
  • FIG. 11 shows a synthesis scheme of an IgG-binding peptide having an SS cross-linking structure with dichloropropanone prepared in Example 12.
  • FIG. 12 shows the results of culturing SK-BR3 cells in the presence of 0-500 nM drug and evaluating the number of cells 72 hours later using a cell measurement kit.
  • FIG. 12A shows the results when Herceptin or VcMMAE is added
  • FIG. 12B shows the results when Herceptin or the antibody-drug conjugate prepared in Example 12 is added.
  • FIG. 12A shows the results when Herceptin or VcMMAE is added
  • FIG. 12B shows the results when Herceptin or the antibody-drug conjugate prepared in Example 12 is added.
  • FIG. 13A shows the results of SDS-PAGE electrophoresis of various human, mouse, rabbit, and rat IgG antibodies (lane 1: marker, lane 2: Trastuzumab (IgG1), lane 3: Human IgG1, lane 4: Human IgG2, Lane 5: Human IgG3, Lane 6: Human IgG4, Lane 7: Mouse IgG1, Lane 8: Mouse IgG2b, Lane 9: Mouse IgG3, Lane 10: Rabbit IgG (polyclonal antibody), Lane 11: Rat IgG1, lane 12: Rat IgG2b, Lane 13: Rat IgG2c).
  • FIG. 13B shows the result of Western blotting using a biotin-labeled IgG-binding peptide and HRP-labeled streptavidin after transferring the gel after electrophoresis to a PVDF membrane.
  • IgG refers to mammals, eg, primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats, mice, and rabbits, domestic animals such as pigs, cows, horses, sheep, and goats, In addition, it refers to IgG of pet animals such as dogs and cats, preferably human IgG (IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4).
  • the IgG in the present specification is more preferably human IgG1, IgG2, or IgG4, or rabbit IgG, and particularly preferably human IgG1, IgG2, or IgG4.
  • the present invention provides a compound of formula I: (X 1-3 ) -C- (X 2 ) -H- (Xaa1) -G- (Xaa2) -LVWC- (X 1-3 ) (I)
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine
  • C is a cysteine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid
  • G is a glycine residue
  • Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue.
  • a peptide characterized by comprising an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues and capable of binding to human IgG and / or rabbit IgG.
  • the notation of X 1-3 at the N-terminal or C-terminal means that 1 to 3 consecutive amino acid residues X other than cysteine (C or Cys) are independent, The amino acid residues constituting are the same or different residues, but preferably all three are composed of sequences that are not the same.
  • X 2 also means that two arbitrary amino acid residues X other than cysteine (C or Cys) are consecutive, and the amino acid residues constituting them are the same or different residues. Preferably, however, the two consecutive amino acid residues consist of sequences that are not the same residue.
  • the two cysteine residues of Formula I can be disulfide bonded to form a cyclic peptide.
  • the outer two cysteine residues are disulfide bonded.
  • the sulfide groups in the outer two cysteine residues can be represented by the following formula: It may be connected by a linker represented by A broken line part in the above formula means a bond part with a sulfide group. The linker is more stable against a reduction reaction or the like than a normal disulfide bond.
  • This peptide can be prepared, for example, by the method described in ⁇ Method for producing a peptide in which cysteine residues are linked by a linker>.
  • the peptide represented by the formula I ′ is (X 1-3 ) -C- (X 1 ) -YH- (Xaa1) -GNLVWC- (X 1-3 ) (I ')
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine
  • C is a cysteine residue
  • Y is a tyrosine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid
  • G is a glycine residue
  • N is an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue.
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue; A is an alanine residue, H is a histidine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, G is a glycine residue; E is a glutamic acid residue, L is a leucine residue; V is a valine residue, and W is a tryptophan residue. ) Characterized in that it comprises an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues and is capable of binding to human IgG and / or rabbit IgG.
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue; H is a histidine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, G is a glycine residue; Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue, L is a leucine residue; V is a valine residue; W is a tryptophan residue; Xaa3 is an alanine residue, a serine residue or a threonine residue, and Xaa4 is a tyrosine residue or
  • amino acid sequences of the peptides of the above formula I ′, formula I ′′ and formula II when the amino acid sequence is 17 amino acid residues, the first and second amino acid residues X and the 16th and 17th amino acid residues X from the N-terminal are missing.
  • Such peptides may be 13 amino acids long.
  • 17 amino acid residues refers to the N-terminal of 17 residues, which is the longest amino acid length for a peptide of formula I, etc. It is a term expressed for convenience in order to number from 1 to 17 in order.
  • the peptide represented by Formula III is (X 1-3 ) -CAYH- (Xaa1) -GELVWC- (X 1-3 ) (III)
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine
  • C is a cysteine residue
  • A is an alanine residue
  • Y is a tyrosine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid
  • G is a glycine residue
  • E is a glutamic acid residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue.
  • amino acid sequence of the peptide of the above formula III when it is 17 amino acid residues, the first and second amino acid residues from the N-terminal, and the 16th and 17th amino acid residues X may be deleted, Such peptides are 13 amino acids long.
  • amino acid residues other than cysteine (C) in the amino acid sequence of the peptides of the above formulas that is, amino acids 1 to 3, 5, 6, and 15 to 17 from the N-terminal in the case of 17 amino acid residues
  • the peptide represented by Formula IV is DC- (Xaa3)-(Xaa4) -H- (Xaa1) -G- (Xaa2) -LVWCT (IV)
  • D is an aspartic acid residue
  • C is a cysteine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid
  • G is a glycine residue
  • Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue
  • T is a threonine residue
  • Xaa3 is an alanine residue or a threonine residue
  • Xaa4 is a tyrosine residue or a tryptophan residue.
  • DCAYH (Xaa1) GELVWCT (SEQ ID NO: 1), 2) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 2), 13) RGNCAYH (Xaa1) GQLVWCTYH (SEQ ID NO: 13), 14) G (Xaa2) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (Xaa2) H (SEQ ID NO: 36), and 15) RRGPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 37) (Wherein Xaa1 is a lysine residue and Xaa2 is a homocysteine, preferably cysteines and / or homocysteines form a disulfide bond with each other).
  • the peptide of the present invention has the following general formula V as a primary structure in a broad sense: DC- (Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1) -G- (Xaa5) -L- (Xaa6) -WCT (V) (Where D is an aspartic acid residue; C is a cysteine residue; G is a glycine residue; L is a leucine residue; W is a tryptophan residue; T is a threonine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, Xaa2 is an alanine residue, a serine residue or a threonine residue, Xaa3 is a tryptophan residue or a tyrosine residue, Xaa4 is a histidine residue, arginine residue, se
  • the two cysteine residues of formula V can be disulfide bonded to form a cyclic peptide.
  • the two outer cysteine residues of the peptide of formula V are disulfide bonded.
  • the sulfide group in the outer two cysteine residues can be represented by the following formula:
  • linker represented by A broken line part in the above formula means a bond part with a sulfide group.
  • the linker is more stable against a reduction reaction or the like than a normal disulfide bond.
  • This peptide can be prepared, for example, by the method described in ⁇ Method for producing a peptide in which cysteine residues are linked by a linker>.
  • the peptide of the above formula according to the present invention has at least two cysteine (C) residues that are separated in each amino acid sequence, and cysteine cysteine so that a disulfide bond can be formed between the cysteine residues.
  • a preferred peptide is characterized in that two cysteine residues are disulfide-bonded to form a cyclic peptide, and 1 or 2 is present on the N-terminal side and C-terminal side of each cysteine residue. It may have any amino acid residue other than one cysteine.
  • each cysteine residue has 1 or 2 amino acid residues on the N-terminal side and C-terminal side, the remaining amino acids 1 to 2 and 16 to 17 from the N terminal when 17 amino acid residues are used
  • the groups are those exemplified above.
  • Xaa1 is a protein-constituting amino acid such as lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, and glutamic acid residue, and non-protein such as diaminopropionic acid and 2-aminosuberic acid It is a constituent amino acid, preferably a lysine residue.
  • Xaa1 is preferably modifiable by a crosslinking agent described later.
  • non-proteinogenic amino acid refers to an amino acid that is not used to constitute a protein in a living body.
  • the peptide of the present invention has no or almost no residue in the sequence as Xaa1 (for example, 1 Preferably only one or two).
  • Xaa1 is a lysine residue
  • the peptide of the present invention preferably has no or almost no lysine residue in the sequence other than Xaa1.
  • the peptide of the present invention has a binding affinity for human IgG of about 10 times or more, preferably about 50 times or more, more preferably about 200 times or more compared to other human immunoglobulins (IgA, IgE, IgM). high.
  • the dissociation constant (Kd) relating to the binding between the peptide of the present invention and human IgG can be determined by surface plasmon resonance spectrum analysis (for example, using the BIACORE system), for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 1 M to less than 1 ⁇ 10 ⁇ 3 M , Preferably less than 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M, more preferably less than 1 ⁇ 10 ⁇ 5 M.
  • the IgG-binding peptide of the present invention binds to the Fc domain of IgG.
  • the IgG-binding peptide of the present invention has a specific region of IgG Fc, that is, Lys248 residue according to Eu numbering in human IgG Fc (hereinafter, simply referred to as “Lys248” in the present specification).
  • Lys248 residue according to Eu numbering in human IgG Fc
  • Peptides of the present invention include conventional liquid phase synthesis methods, peptide synthesis methods such as solid phase synthesis methods, peptide synthesis using an automatic peptide synthesizer, etc.
  • peptide synthesis methods such as solid phase synthesis methods, peptide synthesis using an automatic peptide synthesizer, etc.
  • the peptide may be produced by a gene recombination method using a nucleic acid encoding the peptide of the present invention, a phage display method, or the like.
  • the target peptide can be produced by incorporating a DNA encoding the amino acid sequence of the peptide of the present invention into an expression vector, introducing it into a host cell and culturing.
  • the produced peptide can be obtained by conventional methods, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, HPLC chromatography, ammonium sulfate fractionation, ultrafiltration, and immunoadsorption. It can be recovered or purified by a method or the like.
  • amino acids prepared by protecting functional groups other than the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxyl group to be bound of each amino acid are prepared.
  • a peptide bond forming reaction is carried out between the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxyl group of each amino acid.
  • the carboxyl group of the amino acid residue located at the C-terminus of the peptide is bound to the solid phase via an appropriate spacer or linker.
  • the amino-terminal protecting group of the dipeptide thus obtained is selectively removed, and a peptide bond is formed with the ⁇ -carboxyl group of the next amino acid.
  • the production by gene recombination method is performed, for example, by inserting a DNA encoding the peptide of the present invention into an appropriate expression vector, introducing the vector into an appropriate host cell, culturing the cell, and from inside the cell or extracellular fluid.
  • Can be achieved by a method comprising recovering the peptide of interest from The vector is not limited, and is, for example, a vector such as a plasmid, phage, cosmid, phagemid, and virus.
  • Plasmid vectors include, but are not limited to, E. coli-derived plasmids (eg, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, etc.) ) And yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YCp50, etc.).
  • E. coli-derived plasmids eg, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, etc.
  • yeast-derived plasmids eg, YEp13, YCp50, etc.
  • Phage vectors include, but are not limited to, T7 phage display vectors (T7Select10-3b, T7Select1-1b, T7Select1-2a, T7Select1-2b, T7Select1-2c, etc. (Novagen)), and ⁇ phage vectors (Charon4A, Charon21A , EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, ⁇ ZAPII, etc.).
  • viral vectors include, but are not limited to, animal viruses such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses, and Sendai viruses, and insect viruses such as baculoviruses.
  • cosmid vectors include, but are not limited to, Lorist 6, Charomid 9-20, and Charomid 9-42.
  • phagemid vectors include, but are not limited to, pSKAN, pBluescript, pBK, and pComb3H.
  • the vector may include a regulatory sequence so that the target DNA can be expressed, a selection marker for selecting a vector containing the target DNA, a multicloning site for inserting the target DNA, and the like.
  • regulatory sequences include promoters, enhancers, terminators, S-D sequences or ribosome binding sites, replication origins, poly A sites, and the like.
  • an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a dihydrofolate reductase gene, and the like can be used as the selection marker.
  • Host cells for introducing the vector include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (for example, mammalian cells), plant cells, and the like, and transformation or transfer into these cells.
  • the effects include, for example, a calcium phosphate method, an electroporation method, a lipofection method, a particle gun method, and a PEG method.
  • the transformed cells are cultured according to a usual method used for culturing host organisms. For example, a culture solution of microorganisms such as Escherichia coli and yeast cells contains a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts that can be assimilated by the host microorganism.
  • the peptide produced by expression out of the cell is preferable to secrete the peptide produced by expression out of the cell.
  • This can be performed by binding DNA encoding a peptide sequence that allows secretion of the peptide from the cell to the 5 ′ end of the DNA encoding the target peptide.
  • the fusion peptide transferred to the cell membrane is cleaved by signal peptidase, and the target peptide is secreted and released into the medium.
  • the target peptide accumulated in the cells can be recovered. In this case, the cells are physically or chemically destroyed, and the target peptide is recovered using protein purification techniques.
  • the present invention further relates to a nucleic acid encoding the peptide of the present invention.
  • the nucleic acid includes DNA or RNA (for example, mRNA).
  • the IgG-binding peptide of the present invention and another protein are fused, after preparing the IgG-binding peptide and the other protein separately, the IgG-binding peptide and the protein may be fused using a linker as necessary.
  • An appropriate linker may be added as necessary by gene recombination to produce a fusion protein. In this case, it is preferable to prepare a fusion protein so that the IgG-binding peptide of the present invention does not impair the binding property with IgG.
  • the IgG-binding peptide in the present invention is preferably modified with a cross-linking agent.
  • the IgG-binding peptide of the present invention is adjacent to Lys248 or Lys246, preferably Lys248 according to EuEnumbering in a specific region of IgG Fc, that is, human IgG Fc, in Xaa1, as shown in the Examples described later. Therefore, by modifying Xaa1 of the IgG-binding peptide of the present invention with a crosslinking agent and crosslinking reaction with IgG, a cross-linking structure site-specifically between Xaa1 of IgG-binding peptide and Lys248 or Lys246 of IgGLFc, preferably Lys248 Can be formed.
  • various compounds can be specifically and easily introduced into IgG by modifying Xaa1 of the IgG-binding peptide of the present invention with a crosslinking agent and various compounds and allowing it to undergo a crosslinking reaction with IgG.
  • a compound can be introduced via an IgG-binding peptide, compounds having various structures can be introduced into IgG.
  • the method of the present invention has an advantage that the yield of the obtained product is high and the antibody itself is not modified, so that the possibility of reducing the function of the antibody is low.
  • the IgG-binding peptide of the present invention can also be used for non-human animal, preferably mammalian IgG.
  • the site in IgG to which the IgG-binding peptide of the present invention binds can be easily determined by those skilled in the art who have read this specification by, for example, aligning the sequence of human IgG with the sequence of IgG from other animals. Can be specified.
  • the “crosslinking agent” is a chemical substance for linking the IgG-binding peptide of the present invention and IgG Fc by a covalent bond.
  • the cross-linking agent of the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art, and may be selected from desired amino acids (for example, lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, Or a compound having at least two sites capable of binding to diaminopropionic acid, arginine, and the like).
  • crosslinkers preferably containing two or more succinimidyl groups such as DSG (disuccinimidyl glutarate) and DSS (disuccinimidyl glutarate), DMA Imido such as (dimethyl adipimidate ⁇ 2 HCl, adipimidic acid dimethyl dihydrochloride), DMP (dimethyl pimelimidate ⁇ 2 HCl, dimethyl dimelimidate dihydrochloride), and DMS (dimethyl suberimidate ⁇ 2 HCl, dimethyl suberimidate)
  • Crosslinker preferably containing two or more acid moieties, DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate 2HCl, 3,3'-dithiobispropionimidic acid dimethyl dihydrochloride) and DSP (dithiobis (succinimidyl propionate), dithiobis And a crosslinking agent having an SS bond such as succinimidyl
  • the IgG-binding peptide of the present invention may be modified with other functional substances, for example, antibodies such as IgA or VHH, labeling substances and / or other drugs.
  • the IgG-binding peptide and other functional substance can be linked by a method known to those skilled in the art, for example, a reaction between an azide group and dibenzocyclooctyne or a reaction between a maleimide group and a sulfhydryl group.
  • the IgG-binding peptide of the present invention forms a complex with IgG, whereby IgG can be detected or quantified via the labeling substance.
  • Labeling substances include, but are not limited to, fluorescent dyes, chemiluminescent dyes, radioisotopes (eg, chelate complexes of radioiodine or radioisotope metal ions, eg, chelate complexes of DOTA or desferrioxamine), and biotin and GFP
  • preferable labeling substances include fluorescent proteins such as (green fluorescent protein), luminescent proteins, and enzymes such as peroxidase
  • examples of preferred labeling substances include fluorescein derivatives such as fluorescein and FITC, rhodamine derivatives such as rhodamine and tetramethylrhodamine, and Texas Red The fluorescent dye.
  • the drug is not limited to, for example, auristatin such as auristatin E, maytansine, emtansine, doxorubicin, bleomycin, or an anti-cancer such as these derivatives Agents; and targeting agents that bind to receptors on the blood-brain barrier and allow them to enter the central nervous system, or agents that bind to cancer cells and enable antibodies to enter cells Agents.
  • auristatin such as auristatin E
  • maytansine emtansine
  • doxorubicin bleomycin
  • an anti-cancer such as these derivatives Agents
  • the IgG-binding peptide modified with the crosslinking agent of the present invention can be produced, for example, by reacting an IgG-binding peptide obtained according to the method described in the above item ⁇ IgG-binding peptide> with a crosslinking agent.
  • a crosslinking agent it is necessary to specifically modify the side chain of the amino acid residue of Xaa1 in the IgG-binding peptide, and this can be done, for example, by selecting a combination of the type of Xaa1 and a crosslinking agent.
  • a cross-linking agent containing a succinimidyl group such as DSS or DSG reacts with a primary amine present on the side chain of a lysine residue and the N-terminus of a polypeptide, the N-terminus of an IgG-binding peptide is blocked and the DSS or By reacting with DSG, only the side chain of the lysine residue can be specifically modified with DSS or DSG.
  • a cross-linking agent containing a succinimidyl group such as DSS or DSG reacts with a primary amine present on the side chain of a lysine residue and the N-terminus of a polypeptide
  • the N-terminus of an IgG-binding peptide is blocked and the DSS or By reacting with DSG, only the side chain of the lysine residue can be specifically modified with DSS or DSG.
  • Such a combination of an amino acid residue and a crosslinking agent can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the IgG-binding peptide modified with the crosslinking agent of the present invention can also be produced, for example, by performing peptide synthesis using an amino acid residue modified with the crosslinking agent.
  • an IgG-binding peptide is modified with a labeling substance and / or other drug, it is modified with the labeling substance and / or other drug by synthesizing the peptide using amino acid residues with these modifications.
  • IgG-binding peptides may be prepared.
  • the present invention relates to a method for producing a complex of an IgG binding peptide and IgG comprising the step of mixing IgG with an IgG binding peptide modified with a cross-linking agent of the present invention.
  • a cross-linking reaction can occur between IgG-binding peptide modified with a cross-linking agent and IgG.
  • the cross-linking reaction can particularly occur site-specifically between the amino acid residue Xaa1 of IgG-binding peptide and Lys248 or Lys246, preferably Lys248 of IgG Fc.
  • the conditions for the mixing step are not particularly limited as long as the mixing step is performed under conditions that cause a cross-linking reaction between the IgG-binding peptide of the present invention and IgG.
  • the reaction can be performed by mixing the IgG-binding peptide of the present invention and IgG in a suitable buffer at room temperature (eg, about 15 ° C. to 30 ° C.).
  • the mixing step may be performed by adding an appropriate amount of a catalyst that promotes the crosslinking reaction, if necessary.
  • the mixing ratio of the IgG-binding peptide of the present invention and IgG in the mixing step is not particularly limited.
  • the molar ratio of the IgG-binding peptide of the present invention to IgG can be, for example, 1: 1 to 20: 1, preferably 2: 1 to 20: 1 or 5: 1 to 10: 1.
  • the mixing time (reaction time) in the mixing step is not limited as long as a cross-linking reaction occurs between the IgG-binding peptide of the present invention and IgG, but for example, 1 minute to 5 hours, preferably 10 minutes to 2 hours. Or it may be 15 minutes to 1 hour.
  • the method for producing the IgG-binding peptide-IgG complex of the present invention separates impurities, for example, unreacted IgG-binding peptide, IgG, and reagents, from the mixture after the above-described steps, if necessary. And a step of purifying the complex.
  • This step can be performed by a method known in the art, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, and the like.
  • the present invention relates to a complex of an IgG binding peptide of the present invention and IgG.
  • the complex can be formed by the crosslinking reaction. Therefore, the present invention preferably provides an IgG binding peptide and IgG in which the amino acid residue of Xaa1 of IgG binding peptide and Lys248 or Lys246 of IgG Fc, preferably Lys248, are bound site-specifically via a crosslinking agent. And the complex.
  • the complex of the present invention is formed by a site-specific cross-linking reaction, there is little possibility that the cross-linking reaction has a negative effect on the activity of IgG.
  • new functionality can be added to IgG by linking the modified IgG-binding peptide to IgG.
  • IgG-binding peptide modified with a labeling substance when an IgG-binding peptide modified with a labeling substance is bound to IgG, it is possible to detect or quantify IgG via the labeling substance. Since examples of the labeling substance are as described above, the description is omitted here.
  • IgG-binding peptide modified with a drug is bound to IgG, which is a pharmaceutical antibody, the therapeutic effect of IgG disease can be enhanced. Since the example of the medicine is as described above, the description is omitted here.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or diagnostic agent comprising the IgG-binding peptide, an IgG-binding peptide modified with the cross-linking agent, or a complex of an IgG-binding peptide and IgG modified with the cross-linking agent.
  • the IgG-binding peptide is preferably modified with, for example, the above-mentioned drug.
  • the IgG-binding peptide is preferably modified with, for example, the above-described labeling substance. preferable.
  • the disease or disorder which can be targeted by an antibody Preferably, cancer, an inflammatory disease, an infectious disease, and a nerve Examples include degenerative diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, rectal administration, or transmucosal administration).
  • the pharmaceutical composition of this invention can be made into a suitable dosage form according to an administration route. Specifically, granules, tablets, pills, capsules, syrups, emulsions, suspensions, intravenous injections, arterial injections, injections for intramuscular injections, drops, external preparations, suppositories, etc. It can be prepared in a dosage form.
  • the administration method and dosage form can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the sex, age, weight, symptoms, etc. of the patient.
  • composition of the present invention can be formulated according to a conventional method (see, for example, Remington's Pharmaceutical, Science, Latest Edition, Mark Publishing, Company, Easton, USA) and pharmaceutically acceptable carriers and additives. May be included.
  • Examples of carriers and pharmaceutical additives that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, polyacrylic acid Sodium, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, Examples include human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • HSA human serum albumin
  • mannitol mannitol
  • sorbitol lactose
  • surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • the IgG binding protein of the present invention or a complex of IgG binding protein and IgG is dissolved in a solution such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • a solution such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • Tween80, Tween-20, gelatin, human serum albumin and the like can be used.
  • it may be freeze-dried to obtain a dosage form that is dissolved and reconstituted before use.
  • the stabilizer for freeze-drying include sugar alcohols such as mannitol and glucose and / or sugars. Can be used.
  • the effective dose and administration interval of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected according to the sex, age, weight, symptom, etc. of the patient.
  • the invention relates to a method of producing a peptide in which cysteine residues are linked by a linker.
  • the method comprises a peptide comprising two or more cysteine residues, preferably two, and the following formula: (Wherein R 1 and R 2 are each independently any halogen atom), and the sulfide group in two or more, preferably two cysteine residues is formula:
  • R 1 and R 2 are each independently any halogen atom
  • a broken line part in the above formula means a bond part with a sulfide group.
  • a peptide in which cysteine residues are linked by the linker is more stable against a reduction reaction or the like than a peptide in which a normal disulfide bond is linked.
  • R 1 and R 2 are preferably selected from the group consisting of F, Cl, Br, and I, more preferably Cl, Br, and I.
  • R 1 and R 2 are preferably the same, more preferably R 1 and R 2 are both Cl.
  • the conditions of the mixing step in this method are not particularly limited as long as a ligation reaction occurs between cysteine residues of the peptide.
  • the reaction can be performed by mixing the peptide and the compound in a suitable buffer such as a buffer containing guanidinium chloride at room temperature (eg, about 15 ° C. to 30 ° C.).
  • the mixing step may be performed by adding an appropriate amount of a catalyst that promotes the ligation reaction as necessary.
  • the mixing ratio of peptide and compound in the mixing step of this method is not particularly limited.
  • the molar ratio of peptide to compound can be, for example, 1: 0.2 to 1:10, preferably 1: 0.5 to 1: 5 or 1: 1 to 1: 2.
  • the mixing time (reaction time) in the mixing step is not limited as long as a ligation reaction occurs between cysteine residues of the peptide, but for example, 1 minute to 5 hours, preferably 10 minutes to 2 hours or 15 minutes to It can be 1 hour.
  • the present method further includes a step of separating impurities, for example, unreacted peptides and compounds, from the mixture after performing the above steps, and purifying a peptide having a cysteine residue linked, if necessary. It's okay.
  • This step can be performed by a method known in the art, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, and the like.
  • the type of peptide used in this method is not particularly limited as long as the cysteine residue can be linked by the above compound.
  • the IgG-binding peptide described in the present specification or the peptide described in the specification of WO2013 / 027796 Is mentioned.
  • Examples of the peptide described in the specification of WO2013 / 027796 include a peptide in which the Xaa1 residue of the IgG-binding peptide described in this specification is substituted with an arginine residue (R).
  • Example 1 X-ray crystal structure analysis of complex of IgG-binding peptide and IgG] ⁇ Method> (1) Preparation of IgG-binding peptide solution G (HC) DCAYHRGELVWCT (HC) H-NH 2 sequence (SEQ ID NO: 31 where HC is homocysteine, 4th and 14th two Cys, 2nd A cyclic homocysteine peptide having 16th two homocysteines each forming a disulfide bond in the molecule was prepared by a peptide solid phase synthesis method by F-moc method according to a conventional method. The prepared IgG-binding peptide 0.8 mg powder was dissolved in 24 ⁇ L of 100% dimethyl sulfoxide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to prepare an IgG-binding peptide solution.
  • HC DCAYHRGELVWCT
  • H-NH 2 sequence SEQ ID NO: 31 where HC is homocysteine, 4th and 14th
  • 63 ⁇ L of 16mg / mL human IgG Fc solution (0.1M sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries), 0.04M 2-morpholinoethanesulfonic acid (Wako Pure Chemical Industries) (pH 6.0)) was prepared in (1) above.
  • the resulting IgG-binding peptide solution was mixed with 2 ⁇ L to prepare a complex solution of Fc and IgG-binding peptide.
  • Crystal of complex of Fc and IgG binding peptide was obtained by sitting drop vapor diffusion method. That is, 0.3 ⁇ L of the complex solution of Fc and IgG-binding peptide prepared in (2) above and a crystallization agent (20% polyethylene glycol 3350 (Sigma Aldrich), 0.2M potassium iodide (Wako Pure Chemical Industries) (pH 6. 9)) 0.3 ⁇ L was mixed on the S1 well of an intelligent crystallization plate (manufactured by Veritas) using HydoraII + (manufactured by Matrix), which is a crystallization robot, to obtain a crystallization drop.
  • a crystallization agent 20% polyethylene glycol 3350 (Sigma Aldrich), 0.2M potassium iodide (Wako Pure Chemical Industries) (pH 6. 9)
  • diffraction intensity data was processed with a resolution of 3.0 angstroms using a diffraction intensity data processing program HKL2000 (manufactured by HKL Research).
  • HKL2000 manufactured by HKL Research
  • the crystal space group was P21
  • the completeness of the obtained data was 99.9% and Rmerge was 13.8%.
  • the IgG-binding peptide binds to the boundary region of the CH2 and CH3 domains overlapping the protein A binding site, and the previously reported IgG-binding peptide Fc-III (DeLano, WL et al., Science, 2000, 287, pp. 1279-1283).
  • the characteristic interaction between the IgG-binding peptide and Fc is that the side chain guanidino group of the 8th residue Arg of the IgG-binding peptide is 2.91 angstroms and the side chain of Fc Glu380 (based on EU numbering; the same applies hereinafter). It is a point which is salt-bonded to the carboxylic acid.
  • the side chain of Glu380 is salt-bound with Lys248 in human IgG Fc to form a salt-binding network in the molecule, and IgG binding peptide Arg8 and Fc Lys248 are linked to Fc Glu380.
  • the 8th residue Arg of the IgG binding peptide was changed to Lys, and the side chain amino groups of the peptide Lys8 and the antibody Lys248 were cross-linked with a cross-linking agent in a form similar to this salt-bonded network structure. Devised.
  • intramolecular SS bonds are formed under oxidizing conditions in aqueous solution at pH 8.5, and using reverse phase HPLC, the flow rate is 1.0 ml / min, 10% to 60% containing 0.1% TFA.
  • Peptides with intramolecular SS bonds were purified by gradient elution of acetonitrile.
  • 0.4MCMEDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and 0.1M onto CM5 sensor chip set in BIAcoreT200 (GE healthcare)
  • sulfo-NHS sulfo-N-hydroxysuccinimide
  • the sensor chip is activated by injecting into the sensor chip for 7 minutes at a flow rate of 10 ⁇ l / ml, pH 4.0 IgG was immobilized so that the amount of immobilization was 4000 to 5000 in terms of RU value under the condition of (10 mM mM acetic acid Na).
  • HBS-EP buffer 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20, 3 mM mM EDTA, pH 7.0
  • Type I (R8K) peptide When each cross-linking agent is bound to Type I (R8K) peptide, the affinity for human IgG is about 330 nM (Kd) and Type I (R8K) -DSS-OH for Type I (R8K) -DSG-OH. About 390 nM (Kd), and no significant decrease in affinity due to binding of the cross-linking agent was observed. Any peptide has an affinity of ⁇ M or less in Kd value, and thus it was considered that sufficiently specific labeling was possible.
  • Example 3 Specific modification of human IgG-Fc with IgG-binding peptide
  • Method 3 A labeled reagent peptide in which an IgG-binding peptide (Type I (R8K)) with Biotin-PEG4 added to the N-terminus was modified with DSS or DSG by the same method as in Example 2, was reacted with human IgG Fc, The labeling reaction of human IgG Fc was examined.
  • IgG-binding peptide (R8K) 200 pmol / 5 ⁇ L in 0.1% TFA reacted with excess DSS or DSG by the same method as in Example 2 was purified on a reverse phase column, and then acetonitrile was removed under reduced pressure.
  • Proteins labeled with biotinylated peptides were detected with a chemiluminescent reagent (Immunostar (registered trademark) Basic, Wako Pure Chemical Industries) using SA-conjugated HRP (1000-fold dilution, Vector Laboratories).
  • chemiluminescent reagent Immunostar (registered trademark) Basic, Wako Pure Chemical Industries
  • Example 4 Examination of reaction conditions of IgG-binding peptide against IgG] ⁇ Method> (1) Examination of reaction molar ratio Each protein (IgG (Chugai Pharmaceutical), IgA (Athens Research & Technology), or Bovine gelatin (Wako Pure Chemical Industries)) is added to a well of a 96-well microplate (Nunc (registered trademark) MaxiSorp). A 0.1 M NaHCO3 solution containing (50 ng (0.33 pmol) / ⁇ l / well) was added to the plate and allowed to stand overnight at room temperature, whereby each protein was adsorbed on the surface of the plate and blocked with 0.5% BSA.
  • the biotinylated IgG binding (R8K) peptide (NO DSS R8K) not modified with DSS shows a very weak binding, which is considered to be a binding activity caused by a peptide bound by a non-covalent bond. Furthermore, even when an excess of labeled IgG-binding peptide reagent was added, no binding to other proteins (hIgA, Bovine gelatin, or BSA used as a blocking agent) was detected.
  • the IgG-binding peptide of the present invention modified with a crosslinking agent specifically binds IgG in a short time.
  • Example 5 Labeling of Fc with fluorescent IgG-binding peptide
  • ⁇ Method> 200 ⁇ L of IgG (Chugai Pharmaceutical), IgA (Athens Research & Technology), or BSA (Sigma Aldrich) (15 ⁇ g: 100 pmol in terms of IgG) and DSG cross-linked peptide or DSS cross-linked peptide (500 pmol) prepared according to Example 2 The mixture was reacted at room temperature for 60 min, and 10 ⁇ L of 1M Tris-HCl (pH 7.0) was added to stop the reaction.
  • Example 6 Analysis of modified Fc by IgG-binding peptide (pH 4.5)] ⁇ Method> Human IgG (Chugai Pharmaceutical) Fc solution (20 ⁇ M, 0.1 M acetate buffer pH 4.5) 200 ⁇ L and DSG modified IgG binding peptide (RGNCAYHXGQLVWCTYH (SEQ ID NO: 35) dissolved in DMF by the same method as in Example 2. ), X is lysine) (4 mM) (0.5, 1.0, 2.0, 5.0 ⁇ L (0.5, 1.0, 2.0, 5.0 in molar ratio)), stirred rapidly, reacted at room temperature for 15 minutes, and reacted with 1M Tris-HCl (pH 7.
  • FIG. 5B shows changes in the amount of unreacted (peak 2), one peptide adduct (peak 3), and two peptide adducts (peak 4) when reacted at each molar ratio. It is a graph. For example, even when the reaction is carried out at a molar ratio of 1: 1, the unreacted product is 20% or less, and at the molar ratio of 1: 2, the unreacted product is 10% or less, indicating that the yield is extremely high. In addition, even when the molar ratio was 1: 5, the ratio of adducts of two peptides increased relatively, but Fc with more peptides added was not detected on the ion exchange chromatogram. This indicates that this labeling reaction is very specific.
  • Example 7 Effect of pH and reaction time on Fc reaction by IgG-binding peptide
  • ⁇ Method> In 200 ⁇ L of human IgG Fc solution prepared at pH 4.0 (25 mM acetate buffer), pH 5.5 (25 mM acetate buffer), or pH 7.0 (PBS), in DMF prepared in Example 5. 1.0 ⁇ L of dissolved DSG-modified IgG-binding peptide (4 mM) was added (1.0 molar ratio), and the mixture was stirred rapidly and reacted at room temperature.
  • Example 8 FACS analysis by fluorescent labeling of single chain Fv-Fc antibody using IgG-binding peptide
  • the obtained scFv-Fc was purified by a protein A column to prepare a 4D5-Fc antibody (a single chain Fv clone 4D5 and Fc fusion protein having specificity for HER2).
  • This reaction product was added to a breast cancer cell line SK-BR3 (purchased from ATCC) (5.0 ⁇ 10 5 cells) dispersed in 100 ⁇ L of PBS containing 10% FBS, and left at 4 ° C. for 30 minutes. After washing once with PBS containing 3% BSA and suspending in 100 ⁇ L of PBS containing 3% BSA, 0.01 ⁇ g (0.2 pmol) of PE-labeled Streptavidin (Vector Laboratories) was added and left at 4 ° C. for 30 minutes.
  • FIG. 7A shows the result of detection of binding of the 4D5-Fc antibody to the HER2 antigen on the breast cancer cell line SK-BR3 with a DSG-modified biotinylated IgG-binding peptide and PE-labeled Streptavidin.
  • Flow cytometry analysis using biotinylated anti-human IgG mouse antibody (Anti hIgG mAb-biotin label) (0.01 ⁇ g) instead of DSG-modified biotinylated IgG binding peptide (Biotinylated IgG binding peptide) as a control The results are also shown (in each case, analysis was performed using only the cell fraction excluding dead cells stained by 7-AAD staining).
  • Example 9 Conjugation of anti-IgA receptor VHH and human IgG antibody by IgG-binding peptide] ⁇ Method> DSG modified N-terminal azide IgG-binding peptide (Azide-PEG4-GPDCAYHXGELVWCTFH (SEQ ID NO: 2), X is DSG-lysed lysine, 2 Cys forms intramolecular SS bond, C-terminal is amidated) Prepared by a method similar to Example 2.
  • This peptide is dissolved in DMSO at a concentration of 10 mM, and 20 ⁇ L of this solution is added to 8 mL of 16.6 ⁇ M anti-HER2 human IgG antibody (Chugai Pharmaceutical) dissolved in 25 mM acetate buffer (pH 5.0) (moles of peptide and antibody). The ratio was 1: 1.5) and the reaction was performed at room temperature for 5 hours. After the reaction, the azide peptide anti-HER2 human IgG antibody (1) was eluted on a CIMmultus TM SO3-1 (SHOWA DENKO) column (1 mL) with a NaCl gradient elution of 25 mM acetate buffer (pH 5.0) from 0 to 1M. (A mixture of divalent azide peptide antibody and divalent azide peptide antibody).
  • Alpaca-derived anti-IgA receptor VHH antibody clone 2b1-L9 (with HIS tag added to the C terminus) was secreted and expressed in E. coli HB2151 and affinity purified using the HIS tag added to the C terminus.
  • the phagemid vector pKSTV03 carrying the VHH gene was selected on a 2TYAG plate and cultured overnight at 37 ° C. in a 2TYA liquid medium. After adding 10 mL of this culture to 500 mL of 2TYA and culturing at 37 ° C. for 1 hour, 500 ⁇ L of 1M IPTG was added and cultured with shaking for 16 hours.
  • TES buffer 0.2 M Tris-base, 0.5 mM EDTA, 0.5 M sucrose
  • TES buffer diluted 4-fold was added in 20 ⁇ mL, resuspended, allowed to stand on ice for 1 h, and then centrifuged to collect the supernatant fraction (periplasm fraction).
  • the supernatant was purified with affinity column (His trap excel, GE Healthcare) using Profinia (BioRad) purification system (flow rate was binding / eluting 2 mL / min, washing 2 mL / min, Buffer is Equilibration Buffer: 0.5M NaCl, 20mM Na Phosphate, Wash Buffer: 0.5M NaCl, 20mM Na Phosphate, Elution Buffer: 500mM Imidazole, 0.5M0.5NaCl, 20mM Na Phosphate, PBS (pH 7.
  • FIG. 8A shows the result of SDS-PAGE analysis in the reduced state.
  • a (lane 3) the same 50 kDa band derived from the H chain as the original IgG (lane 1) and a 25 kDa band derived from the L chain were observed.
  • a is an IgG antibody to which VHH is not added
  • b is an IgG antibody linked to one VHH (anti-HER2 human antibody-monovalent VHH)
  • c is an IgG antibody linked to two VHHs It was found to be an antibody (anti-HER2 human antibody-divalent VHH).
  • low molecular weight antibodies such as VHH
  • VHH low molecular weight antibodies
  • IgG antibodies can be linked to IgG antibodies by a click reaction between the azide group introduced on the IgG antibody using an IgG-binding peptide reagent and the dibenzocyclooctyne group introduced to the VHH low molecular weight antibody.
  • Example 10 Antigen binding analysis by FACS of conjugate of anti-IgA receptor VHH and anti-HER2 human IgG antibody via IgG binding peptide] ⁇ Method> HL60 cells (obtained from JCRB) were induced to differentiate for 6 days by adding 1.3% DMSO in RPMI1640 medium (Life Technologies) containing 10% FBS and 100 units / mL penicillin G and 100 ⁇ g / mL streptomycin sulfate.
  • SK-BR3 cells purchased from ATCC
  • McCoy's 5A (Life Technologies) medium containing 10% FBS, 100units / mL penicillin G, and 100 ⁇ g / mL streptomycin sulfate at 37 ° C, 5% CO 2 incubator
  • trypsin-EDTA (Life Technologies).
  • Each 2 ⁇ 10 5 cells were dispersed in PBS containing 200 ⁇ L of 3% BSA, and the primary antibody (anti-HER2 human IgG antibody, anti-IgA receptor VHH prepared in Example 9 (final concentration) was adjusted to 200 nM.
  • HER2 highly expressing SK-BR3 cells were used as primary antibodies, anti-HER2 human IgG antibody (Fig. 9A), anti-IgA receptor VHH (C Using a HIS tag at the end) (Fig. 9B), anti-HER2 human antibody-monovalent VHH (with H-tag at the C end) (Fig. 9C), as a secondary antibody, a final concentration of 50 nM biotinylated anti-HIS antibody + PE
  • FIGS. 9A to 9C The results of FACS analysis using the obtained SA mixture are shown in FIGS. 9A to 9C.
  • FIG. 9C since a large fluorescence shift was observed, it was found that the anti-HER2 antibody in the prepared anti-HER2 human antibody-monovalent VHH has binding activity to SKBR-3 cells. .
  • FIG. 9E shows the results of detection using anti-HER2 human antibody-monovalent VHH (FIG. 9F) and a PE-labeled anti-human IgG polyclonal antibody as the secondary antibody.
  • Example 11 Inhibition of cell proliferation of antibody-drug conjugate by IgG-binding peptide
  • Maleimide-PEG4 synthetic peptide RRGPDCAYHXGELVWCTFH in which the amino group at the N-terminus is modified with Maleimideacetoxyl succinimidyl ester was synthesized according to a conventional method by the Fmoc solid phase synthesis method. After removal of the protecting group, intramolecular SS bonds are formed under oxidizing conditions in aqueous solution at pH 8.5, and using reverse phase HPLC, 10% to 60% acetonitrile containing 0.1% TFA at a flow rate of 1.0 ml / min.
  • a peptide having an intramolecular SS bond was purified by gradient elution. 24 ⁇ L of DM-1 (emtansine (XDCExplorer), 50 mM) dissolved in DMSO was added to 40 ⁇ L of peptide (18.5 mM) dissolved in DMSO, and 3.4 ⁇ L of pyridine was further added. (Final concentration 5%) was added and reacted at 50 ° C. for 3 hours. Subsequently, 80 ⁇ L of DSG (500 mM) dissolved in acetonitrile was added and reacted at 50 ° C.
  • DM-1 emtansine (XDCExplorer)
  • the obtained sample was measured for mass with MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF / TOF-KG (Bruker Daltonics), peak A was 3553 (theoretical value 3535) compared to the original anti-HER2 human antibody, peak B was the original Since there are 7092 (theoretical value 7070) increase compared to the anti-HER2 human antibody, there are one maleimide-PEG4 IgG-binding peptide linked with DM-1 (anti-HER2 antibody-DM1 * 1) and 2 respectively. It was confirmed that two (anti-HER2 antibody-DM1 * 2) were introduced.
  • SK- is added to McCoy's 5A (Life Technologies) medium containing 10% FBS, 100 units / mL penicillin G, and 100 ⁇ g / mL streptomycin sulfate so that it becomes 10000 cells / 100 ⁇ L.
  • BR3 cells purchased from ATCC
  • C6 cells obtained from JCRB
  • ADC antibody drug conjugate
  • ADC antibody drug conjugate
  • Example 12 Inhibition of cell growth of antibody drug conjugate by IgG-binding peptide having SS cross-linked structure by dichloropropanone] ⁇ Method> N-terminal acetylated RRC (Acm protected) -PEG4-synthesized synthetic peptide GPDCAYHXGELVWCTFH (SEQ ID NO: 2, X is lysine, C-terminal is amidated) was synthesized on peptide synthetic beads (Rink-amide-Chemmatrix resin, Biotage) The Fmoc solid phase synthesis method was used for the synthesis according to the conventional method. After excising the peptide from the resin and deprotecting it, the peptide (FIG.
  • VcMMAE-modified human IgG antibody (antibody drug conjugate, ADC) thus prepared contains 10 mM acetate buffer (pH 4.5) on a cation ion exchange column Shodex SP825 (8.0 mm ⁇ 75 mm, Shodex). Purification by gradient elution of NaCl from 0M to 1.0M. One major peak other than the unreacted antibody was collected, and desalted and concentrated by centrifugation at 3000 g on Vivaspin (10000 Da cutoff, Sartorius).
  • the obtained sample was measured for mass with MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF / TOF-KG (Bruker Daltonics) and increased by 3941 (theoretical value 4178) compared to the original anti-HER2 human antibody. It was confirmed that one added N-terminal acetyl-RRC-PEG4-modified IgG-binding peptide (R8K) was introduced.
  • SK cell culture medium containing 10% FBS, 100 units / mL penicillin G, and 100 ⁇ g / mL streptomycin sulfate to 10000 cells / 100 ⁇ L add SK -BR3 cells (purchased from ATCC) or C6 cells (obtained from JCRB) were seeded. After culturing in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, 100 ⁇ L of a medium containing antibody drug conjugate (ADC) at each concentration was added, and further cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 72 hours. 10 ⁇ L of Cell Counting Kit-8 (Doujin Chemical) was added to each well and incubated for 2 hours in a 37 ° C. CO 2 incubator, and then the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader.
  • ADC antibody drug conjugate
  • SK-BR3 cells were cultured in the presence of 0-500 nM ADC, and the number of cells after 72 hours was evaluated using a cell measurement kit (Figure 12).
  • the anticancer drug VcMMAE used itself showed growth inhibition only at 250 nM or higher (Fig. 12A), but the ADC prepared this time showed significant cells at a concentration of 0.4 nM or higher compared to SK-BR3 that highly expresses HER2. It exhibited growth inhibitory activity (FIG. 12B), and the cell growth inhibitory activity was enhanced about 500 times by conjugation with the antibody.
  • Example 13 Evaluation of labeling with various IgG-binding peptides for various IgGs
  • the PVDF membrane after transfer is blocked with 0.5% BSA, reacted with HRP-labeled streptavidin (Vector Laboratories) at room temperature for 1 hour, and chemiluminescent detection reagent Chemi-Lumi One (NACALAI TESQUE) Detection was performed with a luminescence imager ChemDock (BioRad).
  • the antibodies used for labeling are as follows.
  • Human IgG1 (Clone ID: CB1), Human IgG2 (Clone ID: CB2), Human IgG3 (Clone ID: CB3), Human IgG4 (Clone ID: CB4), Mouse IgG1 (Clone ID: CB5), Mouse IgG2b (Clone ID) : CB8) and mouse IgG3 (Clone ID: CB9) were purchased from Crown Bioscience Inc.
  • Rat IgG1 (Clone #: 43414) and IgG2b (Clone #: 141945) were purchased from R & D
  • IgG2c (Clone Name: SB68b) was purchased from LifeSpan BioScience
  • rabbit IgG was purchased from Thermo Scientific.
  • IgG-binding peptide of the present invention various compounds linked to an IgG-binding peptide can be added to IgG Fc in a short time and with almost no side reaction.
  • IgG used as a detection reagent, a diagnostic agent, a medicine, and the like can be specifically and easily modified with various compounds.

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Abstract

この発明は、IgG結合ペプチド、架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド、該架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体、及び該複合体を生産する方法等に関する。

Description

ＩｇＧ結合ペプチドによる抗体の特異的修飾
　本発明は、IgG結合ペプチド、架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド、該架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体、及び該複合体を生産する方法等に関する。
　抗体は、従来から種々の研究・開発において、標的分子の検出に多く利用されており、検出試薬や診断薬として産業面でも、極めて重要なものとなっている。また、抗体は、その標的分子に対する特異性から、疾患の治療のための医薬品としても注目されている。
　抗体の機能付加のための化学修飾として、アルカリフォスファターゼ（AP）やパーオキシダーゼ（HRP）等の酵素（非特許文献1～2）、さらには放射性同位体のためのヨウ素化やキレート化合物の付加（非特許文献3）、ビオチン等といった低分子化合物による修飾がなされてきた（非特許文献4）。これらの修飾は、主にリシンのアミノ基やシステインのチオール基、及び活性化されたカルボキシル基等を介して行われており、これらは官能基について特異的だが、部位特異的ではないため、抗体の抗原結合部位への修飾等により抗体の活性を低下させるといった問題や、結合する化合物の数をコントロールすることが難しい等の問題があった。近年登場した抗体医薬の抗体薬物複合体（ADC）においても（非特許文献5～6）、抗がん剤を部位非特異的に抗体に結合させるため、抗体そのものの活性が弱まったり、抗がん剤の結合数のコントロールの困難さからその後の製剤化のステップが煩雑となる等の問題があった。
　このような問題を克服するため、特定の官能基を部位特異的に導入した抗体を使って、抗体を修飾することが行われている。例えば、非天然アミノ酸（非特許文献7～9）やフリーのシステイン（非特許文献10～11）を、特定の部位に遺伝子工学的改変により導入することで、特定の部位での修飾が可能になった。またトランスグルタミナーゼ（TG）を利用して、抗体中の天然のもしくは人工的に導入された特定のグルタミンを標的にして修飾を行うことが報告されているが（非特許文献12～13）、導入する化合物の構造や、標的とするグルタミン残基の空間的な環境によってその反応収率が大きく影響を受けることが知られている。さらに、抗体のFc上の糖鎖を標的にした修飾技術も利用されており（非特許文献14～15）、これらの方法は部位特異的であるものの、糖鎖の酸化修飾が必要であるため、反応の工程が複雑であるといった問題がある。このように部位特異的な抗体修飾技術は開発されつつあるが、多くの場合、抗体そのものを抗体工学的に改変する必要があり、その改変に伴う抗体の機能低下や開発のコスト高を考えると必ずしも有利な方法とはいえない。
Imagawa, M. et al., Journal of Applied Biochemistry, 1982, 4, pp. 41-57 Hashida, S et al., Journal of Applied Biochemistry, 1984, 6, pp. 56-63 Rodwell, J. D. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1986, 83, pp.2632-2636 Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, The third edition, Elsevier, USA, 2013 Lewis Phillips, G. D. et al., Cancer Research, 2008, 68, pp. 9280-9290 Boyraz, B. et al., Current Medical Research and Opinion, 2013, 29, pp. 405-414 Axup, J. Y. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109, pp. 16101-16106 Tian, F. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111, pp. 1766-1771 Zimmerman, E. S. et al., Bioconjugate chemistry, 2014, 25, pp. 351-361 Shen, B. Q. et al., Nature Biotechnology, 2012, 30, pp. 184-189 Bernardes, G. J. et al., Nature Protocols, 2013, 8, pp. 2079-2089 Dennler, P. et al., Bioconjugate Chemistry, 2014, 25, pp. 569-578 Jeger, S. et al., Angewandte Chemie 2010, 49, pp. 9995-9997 Bejot, R et al., J. Labelled. Compd. Rad., 2012, 55, pp. 346-353 Zhou, Q. et al., Bioconjugate Chemistry, 2014, 25, pp. 510-520
　したがって、特異的かつ簡便に抗体を修飾することができる方法が必要とされている。
　本発明者らはこれまで、IgGに特異的又は選択的に結合するペプチド（以下、「IgG結合ペプチド」という）について報告してきた（WO2013/027796及びWO2008/054030参照）。上記課題を解決するために、本発明者は、IgG結合ペプチドとIgG Fcとの複合体のX線結晶構造解析に基づいて、結合状態におけるIgG結合ペプチドの各アミノ酸の位置とIgG Fcの各アミノ酸との位置関係を詳細に検討した。さらに、架橋剤と結合可能なアミノ酸をペプチドに導入し、該アミノ酸を架橋剤により修飾することで、架橋剤により部位特異的に修飾されたIgG結合ペプチドを調製し、これを用いて、IgGを修飾できることを見出し、本願発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
（１）下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチド。
（２）下記の式II：
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、上記（１）に記載のペプチド。
（３）下記の式III：
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3)　　(III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載のペプチド。
（４）17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1～3、15～17番目の各アミノ酸残基が、
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし
である、上記（１）～（３）のいずれかに記載のペプチド。
（５）以下の１）～１５）のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、Xaa2はホモシステインである、上記（４）に記載のペプチド。
１）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）
２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）
３）RCAYH(Xaa1)GELVWCS（配列番号３）
４）GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４）
５）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号５）
６）GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号６）
７）GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号７）
８）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号８）
９）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH（配列番号９）
１０）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１０）
１１）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１１）
１２）SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１２）
１３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）
１４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号３６）
１５）RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号３７）
（６）下記の式IV：
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T　　(IV)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。）によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載のペプチド。
（７）以下の１）～４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸である、上記（６）に記載のペプチド。
１）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１４）
２）DCAYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１５）
３）DCTYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１６）
４）DCAWH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１７）
（８）下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T　　(V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチド。
（９）ペプチドが外側の2つのシステイン(C)残基間でジスルフィド結合を形成しているか、又はペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表されるリンカーにより連結されている、上記（１）～（８）のいずれかに記載のペプチド。
（１０）標識物質により標識されている、上記（１）～（９）のいずれかに記載のペプチド。
（１１）薬剤が結合している、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のペプチド。
（１２）Xaa1がリシン残基である、上記（１）～（１１）のいずれかに記載のペプチド。
（１３）Xaa1が架橋剤で修飾されている、上記（１）～（１２）のいずれかに記載のペプチド。
（１４）前記架橋剤が、DSG（ジスクシンイミジルグルタレート）、DSS（ジスクシンイミジルスベレート）、DMA（アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMP（ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMS（スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DTBP（3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びDSP（ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）からなる群より選択される、上記（１３）に記載のペプチド。
（１５）前記架橋剤がDSG（ジスクシンイミジルグルタレート）又はDSS（ジスクシンイミジルスベレート）である、上記（１４）に記載のペプチド。
（１６）上記（１３）～（１５）のいずれかに記載のペプチドとIgGとの複合体であって、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGの架橋反応によって形成される、前記複合体。
（１７）上記（１３）～（１５）のいずれかに記載のペプチドとIgGを混合し、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGを架橋反応させる工程を含む、ペプチドとIgGの複合体を生産する方法。
（１８）上記（１）～（１５）のいずれかに記載のペプチド、又は上記（１６）に記載の複合体を含む、医薬組成物。
（１９）システイン残基を2つ以上含むペプチドと、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 で表される化合物（式中、R1及びR2は、各々独立的に任意のハロゲン原子である）を混合し、2つ以上のシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 で表されるリンカーにより連結されたペプチドを得る工程を含む、2つ以上のシステイン残基がリンカーにより連結されたペプチドを生産する方法。
（２０）前記化合物において、R1及びR2が同一であり、かつCl、Br、又はIである、上記（１９）に記載の方法。
（２１）前記ペプチドが、上記（１）～（８）及び（１０）～（１５）のいずれかに規定されるペプチドである、上記（１９）又は（２０）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-103153号の開示内容を包含する。
　本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、短時間で、しかもほとんど副反応なくIgGに付加することができるため、該IgG結合ペプチドに種々の化合物を結合させることで、種々の化合物によってIgGを特異的かつ簡便に修飾することができる。また、本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、野生型IgGなどにそのまま結合させることができ、抗体分子の配列を改変する必要が無いことから、抗体分子の遺伝子改変に伴う機能低下を招くことなく、より低コストで種々の化合物を抗体に結合させることができる。さらに、導入する化合物はIgG結合ペプチドに予め結合させておくことができ、当該IgG結合ペプチドと抗体との結合反応はマイルドな反応条件下で行うことができることから、導入する化合物とIgGとを直接反応させる工程で従来必要となっていた複雑な反応を必要とせず、また、当該反応による抗体の機能低下を防ぐことができる。
図1（A）は、IgG結合ペプチド（C35A-3/15：DCAYHRGELVWCT（配列番号33））とヒトIgG Fcとの複合体の構造を示す。IgG結合ペプチドはスペースフィリングモデルで、IgG Fcはリボンモデルで、Fcの糖鎖をワイヤーモデルで示す。図1（B）は、DSGによって修飾したIgG結合ペプチド（C35A-3/15(R8K)：DCAYHKGELVWCT（配列番号34））とIgG Fcとの架橋構造のモデルを示す。ペプチドの主鎖はリボンモデルで示す。peptide-Lys8は、C35A-3/15(R8K)の6番目のリシン残基を、peptide-Tyr6-Gly9は、C35A-3/15(R8K)の4番目のチロシン残基から７番目のグリシン残基を示す。また、Fc-Lys248は、EU numberingに従うFcのLys248を、Fc-Pro247-Asp249は、EU numberingに従うFcのPro247からAsp249を示す。 図2は、標識化IgG結合ペプチドと各種タンパク質の混合物のSDS-PAGE（A）及びウエスタンブロット（B）の結果を示す。図中、DSGは、DSG（ジスクシンイミジルグルタレート）と反応させたIgG結合ペプチドを、DSSは、DSS（ジスクシンイミジルスベレート）と反応させたIgG結合ペプチドを供試したことを示す。また、図中、hIgGはヒトIgGを、hIgAはヒトIgAを、HSAはヒト血清アルブミンをそれぞれ示す。 図3は、標識化IgG結合ペプチドとIgGの反応における、反応モル比（A）及び反応時間（B）のELISAによる検討結果を示す。DSS R8K 0 minは、IgGの10倍モル比の標識化IgG結合ペプチドにTris-HCl（pH7.0）を加えNHS基をブロッキング後、ウェルに加えたものである。No DSS R8Kは、DSSを結合させていないビオチン化IgG結合（R8K）ペプチドを使用したものであり、no pepは、ペプチドを加えていないコントロールを示す。 図4は、標識化IgG結合ペプチドの各タンパク質（hIgA、hIgG、BSA（ウシ血清アルブミン））への反応性を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定した結果を示す。（A）は、DSSにより修飾したIgG結合ペプチドの反応性を、（B）は、DSGにより修飾したIgG結合ペプチドの反応性を測定した結果を示す。 図5（A）は、ヒトIgGのFc溶液と、DMF中に溶解したDSG修飾したIgG結合ペプチドを、ヒトIgGに対しモル比で0.5、1.0、2.0、又は5.0加え、撹拌後、室温で反応させた後の、液体クロマトグラフィーの結果を示す。図5（B）は、ヒトIgGとDSG修飾したIgG結合ペプチドを各モル比で反応させた場合の、未反応（ピーク２）、１個のペプチドの付加物（ピーク３）、及び２個のペプチドの付加物（ピーク４）の生成量の変化を示したものである。 図6は、pH4.0（A）、pH5.5（B）、又はpH7.0（C）にて調製したヒトIgGのFc溶液に対し、DMF中に溶解したDSG修飾したIgG結合ペプチドを、モル比で1.0加え、撹拌後、室温で反応させ、反応の１、５、１０、又は３０分後の、未反応（ピーク２）、１個のペプチドの付加物（ピーク３）、及び２個のペプチドの付加物（ピーク４）の生成量の変化を示したものである。 図7Aは、乳がん細胞株SK-BR3上のHER2抗原への4D5-Fc抗体の結合を、DSG修飾したビオチン化IgG結合ペプチド（Biotin化IgG結合ペプチド）又はビオチン化抗ヒトIgGマウス抗体（Anti hIgG mAb-biotin標識）、及びPE標識Streptavidin（SA-PE標識）により検出した結果を示す。図7Bは、4D5-Fc抗体を加えずに同様の実験（Biotin化IgG結合ペプチド＋SA-PE標識、又はAnti hIgG mAb-biotin標識＋SA-PE標識）を行った結果、及びポジティブコントロールとして4D5-Fc抗体とPE標識抗ヒトIgGマウス抗体（Anti hIgG mAb-PE標識）を用いた結果を示す。 図8Aは、アジ化ペプチド抗体とDibenzocyclooctyne-maleimide化VHHとのクリック反応による連結後のイオン交換クロマトグラフィーの結果得られた3つの主要なピーク（a、b、及びc）を示す。図8Bは、得られたピークのそれぞれを、還元状態でSDS-PAGEで分析した結果を示す。レーン1は抗HER2ヒトIgG抗体、レーン2は抗HER2ヒトIgG抗体－アジ化ペプチド、レーン3はピークa（未反応の抗HER2ヒトIgG抗体）、レーン4はピークb（抗HER2ヒトIgG抗体－1価VHH）、レーン5はピークc（抗HER2ヒトIgG抗体－2価VHH)、レーン6はVHH、レーン7は分子量マーカーを、それぞれ電気泳動した結果を示す。 図9A～Cは、7-AAD染色により死細胞を除いた細胞画分を使って、HER2を高発現するSK-BR3細胞を、1次抗体として、抗HER2ヒトIgG抗体（図9A）、抗IgA受容体VHH（C末HISタグ付加）（図9B）、抗HER2ヒト抗体－1価VHH（C末HISタグ付加）（図9C）を使用し、2次抗体として、最終濃度50 nMのビオチン化抗HIS抗体＋PE標識したSAの混合物を用いてFACS解析を行った結果を示す。図9D～Fは、DMSO1.3％による分化誘導でIgA受容体を高発現したHL60細胞への結合を、1次抗体として抗HER2ヒト抗体（図9D）、抗IgA受容体VHH（C末HISタグ付加）（図9E）、抗HER2ヒト抗体－1価VHH（図9F）を用い、2次抗体として、PE標識抗ヒトIgGポリクローナル抗体を用いて検出した結果を示す。 図10は、0-10 nMの薬剤（Herceptin又は実施例11で調製した抗体薬物複合体）の存在下でSK-BR3細胞を培養し、72時間後の細胞数を細胞測定キットを用いて吸光度（Abs.）により評価した結果を示す。図中、BG（Back ground）は細胞を加えていないコントロールを示す。図10AはSK-BR3細胞に対する抗HER2抗体－DM1*1の効果を、図10BはSK-BR3細胞に対する抗HER2抗体－DM1*2の効果を示す。 この図は図10－1の続きである。図10CはC6細胞に対する抗HER2抗体－DM1*1の効果を、図10DはC6細胞に対する抗HER2抗体－DM1*2の効果を示す。 図11は、実施例12で調製したジクロロプロパノンによるSS架橋構造を持つIgG結合ペプチドの合成スキームを示す。 図12は、0-500 nMの薬剤の存在下でSK-BR3細胞を培養し、72時間後の細胞数を細胞測定キットにより評価した結果を示す。図12AはHerceptin又はVcMMAEを添加した場合の結果を、図12BはHerceptin又は実施例12で調製した抗体薬物複合体を添加した場合の結果を示す。 図13Aは、ヒト、マウス、ウサギ、及びラットの各種IgG抗体のSDS-PAGEによる電気泳動の結果を示す（レーン1：マーカー、レーン2：Trastuzumab (IgG1)、レーン3：Human IgG1、レーン4：Human IgG2、レーン5：Human IgG3、レーン6：Human IgG4、レーン7：Mouse IgG1、レーン8：Mouse IgG2b、レーン9：Mouse IgG3、レーン10：Rabbit IgG (polyclonal antibody)、レーン11：Rat IgG1、レーン12：Rat IgG2b、レーン13：Rat IgG2c）。図13Bは、電気泳動を行った後のゲルをPVDF膜に転写し、ビオチン標識IgG結合ペプチド及びHRP標識ストレプトアビジンを用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す。
＜IgG結合ペプチド＞
　本明細書中で使用する「IgG」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のIgG、好ましくはヒトのIgG（IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4）を指すものとする。本明細書におけるIgGは、さらに好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、若しくはIgG4、又はウサギIgGであり、特に好ましくはヒトIgG1、IgG2、又はIgG4である。
　一態様において、本発明は、下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドに関する。
　上記式で、N末端又はC末端のX1-3という表記は、システイン（C又はCys）以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが1～3個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは3個すべてが同じ残基でない配列からなる。同様に、X2もシステイン（C又はCys）以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが2個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは当該2個連続しているアミノ酸残基は同じ残基でない配列からなる。
　式Iの2つのシステイン残基はジスルフィド結合して環状ペプチドを形成することができる。通常、式Iのペプチドにおいて、外側の2つのシステイン残基はジスルフィド結合している。或いは、式Iのペプチドにおいて、外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基は、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 で表されるリンカーにより連結されていてもよい。上記式中の破線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。当該リンカーは、通常のジスルフィド結合よりも、還元反応等に対して安定である。このペプチドは、例えば以下の＜システイン残基がリンカーにより連結されたペプチドを生産する方法＞で記載される方法により、調製することができる。
　式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式I'及び式I''で表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式I'で表されるペプチドは、
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3)　　(I')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Nはアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
　式I''で表されるペプチドは、
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3)　　(I'')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
　また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIで表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式IIで表されるペプチドは、
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
　上記の式I'、式I''及び式IIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から１番目及び２番目並びに１６番目及び１７番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長からなる。
　本明細書で使用する「17アミノ酸残基とした場合の」とは、ペプチドのアミノ酸残基をアミノ酸番号で呼ぶときに、式Iのペプチド等について最長のアミノ酸長である17残基のN末端から順番に1番目から17番目まで番号づけするために便宜的に表現した用語である。
　また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIIで表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式IIIで表されるペプチドは、
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3)　　(III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
　上記の式IIIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から１番目及び２番目、並びに１６番目及び１７番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長からなる。
　さらに、上記の各式のペプチドのアミノ酸配列のシステイン（C）以外のアミノ酸残基、すなわち、17アミノ酸残基とした場合のN末端から1～3、5、6、15～17番目の各アミノ酸残基は、以下のものから選択されることが好ましい。ここで、各大文字のアルファベットは、アミノ酸の一文字表記である:
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし。
5番目のアミノ酸残基= A又はT、
6番目のアミノ酸残基= Y又はW。
　また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IVで表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式IVで表されるペプチドは、
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T　　(IV)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。）によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
　式Iのペプチドの具体例のいくつかを以下の1)～19)に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
１）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）、
２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）、
３）RCAYH(Xaa1)GELVWCS（配列番号３）、
４）GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４）、
５）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号５）、
６）GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号６）、
７）GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号７）、
８）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号８）、
９）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH（配列番号９）、
１０）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１０）、
１１）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１１）、
１２）SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１２）、
１３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）、
１４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号３６）、
１５）RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号３７）、
１６）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１４）、
１７）DCAYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１５）、
１８）DCTYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１６）、及び
１９）DCAWH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１７）、
（式中、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、Xaa2はホモシステインであり、好ましくはホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している）。
　式Iのペプチドの好ましい具体例として、
１）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）、
２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）、
１３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）、
１４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号３６）、及び
１５）RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号３７）
（式中、Xaa1はリシン残基であり、Xaa2はホモシステインであり、好ましくはシステイン同士及び／又はホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している）が挙げられる。
　また、本発明のペプチドは、広義の一次構造として、下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T　　(V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドである。
　式Vの2つのシステイン残基はジスルフィド結合して環状ペプチドを形成することができる。通常、式Vのペプチドの外側の2つのシステイン残基は、ジスルフィド結合している。或いは、式Vのペプチドにおいて、外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基は、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
で表されるリンカーにより連結されていてもよい。上記式中の破線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。当該リンカーは、通常のジスルフィド結合よりも、還元反応等に対して安定である。このペプチドは、例えば以下の＜システイン残基がリンカーにより連結されたペプチドを生産する方法＞で記載される方法により、調製することができる。
　式Vのペプチドの具体例のいくつかを以下の２０）～３１）に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
２０）DCTYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１８）、
２１）DCAYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１９）、
２２）DCSYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２０）、
２３）DCTWT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２１）、
２４）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２２）、
２５）DCTYR(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２３）、
２６）DCTYS(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２４）、
２７）DCTYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２５）、
２８）DCTYT(Xaa1)GELVWCT（配列番号２６）、
２９）DCTYT(Xaa1)GRLVWCT（配列番号２７）、
３０）DCTYT(Xaa1)GDLVWCT（配列番号２８）、及び
３１）DCTYT(Xaa1)GNLIWCT（配列番号２９）、
（式中、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸である）。
　前述の通り、本発明に関わる上記式のペプチドは、各アミノ酸配列の中に離間した少なくとも2つのシステイン（C）残基を有し、該システイン残基間でジスルフィド結合を形成しうるようにシステイン残基が配置されていることを特徴としており、好ましいペプチドは、2つのシステイン残基がジスルフィド結合して環状ペプチドを形成し、各システイン残基のN末端側及びC末端側には１又は２個のシステイン以外の任意のアミノ酸残基を有していても良い。各システイン残基のN末端側及びC末端側には１又は２個のアミノ酸残基を有する場合において、17アミノ酸残基とした場合のN末端から1～2、16～17番目の各アミノ酸残基は、上記例示のものである。
　上記の通り、本発明のペプチドにおいて、Xaa1は、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、及びグルタミン酸残基等のタンパク質構成アミノ酸、並びにジアミノプロピオン酸及び2-アミノスベリン酸等の非タンパク質構成アミノ酸、好ましくはリシン残基である。Xaa1は、後述する架橋剤によって修飾可能であることが好ましい。本明細書において「非タンパク質構成アミノ酸」とは、生体においてタンパク質を構成するのに用いられないアミノ酸を指す。本発明のペプチドを架橋剤によって修飾する際の部位特異性を高めるため、本発明のペプチドは、その配列中にXaa1と同じ残基を、全く有さないか、ほとんど有さない（例えば、1個又は2個しか有さない）ことが好ましい。例えば、Xaa1がリシン残基である場合には、本発明のペプチドは、その配列中にXaa1以外の場所にリシン残基を全く有さないか、ほとんど有さないことが好ましい。
　本発明のペプチドは、ヒトIgGとの結合親和性が、他のヒト免疫グロブリン（IgA、IgE、IgM）と比較して約10倍以上、好ましくは約50倍以上、より好ましくは約200倍以上高い。本発明のペプチドとヒトIgGとの結合に関する解離定数(Kd)は、表面プラズモン共鳴スペクトル解析（例えばBIACOREシステム使用）により決定可能であり、例えば1×10-1M～1×10-3M未満、好ましくは1×10-4M未満、より好ましくは1×10-5M未満である。
　本発明のIgG結合ペプチドは、IgGのFcドメインに結合する。本発明のIgG結合ペプチドは、後述する実施例において示す通り、上記Xaa1において、IgG Fcの特定の領域、すなわち、ヒトIgG FcにおけるEu numberingに従うLys248残基（以下、本明細書では単に「Lys248」とも表記し、ヒトIgG CH2（配列番号３０）の18番目の残基に相当する）又はLys246残基（以下、本明細書では単に「Lys246」とも表記し、ヒトIgG CH2（配列番号３０）の16番目の残基に相当する）、好ましくはLys248と近接する。
　本発明のペプチドは、慣用の液相合成法、固相合成法等のペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成等（Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY. (1990) Vol.12, p.1-19;S tewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) W.H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: p.5132、「新生化学実験講座１ タンパク質IV」（1992）日本生化学会編，東京化学同人）によって製造することができる。あるいは、本発明のペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子組換え法やファージディスプレイ法等によって、ペプチドを製造してもよい。例えば本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを発現ベクター中に組み込み、宿主細胞中に導入し培養することにより、目的のペプチドを製造することができる。製造されたペプチドは、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法等により、回収又は精製することができる。
　ペプチド合成では、例えば、各アミノ酸（天然であるか非天然であるかを問わない）の、結合しようとするα－アミノ基とα－カルボキシル基以外の官能基を保護したアミノ酸類を用意し、それぞれのアミノ酸のα－アミノ基とα－カルボキシル基との間でペプチド結合形成反応を行う。通常、ペプチドのC末端に位置するアミノ酸残基のカルボキシル基を適当なスペーサー又はリンカーを介して固相に結合しておく。このようにして得られたジペプチドのアミノ末端の保護基を選択的に除去し、次のアミノ酸のα－カルボキシル基との間でペプチド結合を形成する。このような操作を連続して行い側基が保護されたペプチドを製造し、最後に、すべての保護基を除去し、固相から分離する。保護基の種類や保護方法、ペプチド結合法の詳細は、上記の文献に詳しく記載されている。
　遺伝子組換え法による製造は、例えば、本発明のペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞にベクターを導入し、細胞を培養し、細胞内から又は細胞外液から目的のペプチドを回収することを含む方法によりなされ得る。ベクターは、限定されないが、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、及びウイルス等のベクターである。
　プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌由来のプラスミド（例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等）、及び酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等）等が挙げられる。
　ファージベクターとしては、限定するものではないが、T7ファージディスプレイベクター（T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen））、及びλファージベクター（Charon4A、 Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等）が挙げられる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、及びセンダイウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルス等が挙げられる。コスミドベクターとしては、限定するものではないが、Lorist 6、Charomid9-20、及びCharomid9-42等が挙げられる。
　ファージミドベクターとしては、限定するものではないが、例えばpSKAN、pBluescript、pBK、及びpComb3H等が知られている。ベクターには、目的のDNAが発現可能なように調節配列や、目的DNAを含むベクターを選別するための選択マーカー、目的DNAを挿入するためのマルチクローニングサイト等が含まれ得る。そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、S-D配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリAサイト等が含まれる。また、選択マーカーには、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等が用いられ得る。ベクターを導入するための宿主細胞は、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、及び植物細胞等であり、これらの細胞への形質転換又はトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、及びPEG法等を含む。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物の培養液は、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する。
　本発明のペプチドの回収を容易にするために、発現によって生成したペプチドを細胞外に分泌させることが好ましい。これは、その細胞からのペプチドの分泌を可能にするペプチド配列をコードするDNAを、目的ペプチドをコードするDNAの5'末端側に結合することにより行うことができる。細胞膜に移行した融合ペプチドがシグナルペプチダーゼによって切断されて、目的のペプチドが培地に分泌放出される。あるいは、細胞内に蓄積された目的ペプチドを回収することもできる。この場合、細胞を物理的又は化学的に破壊し、タンパク質精製技術を使用して目的ペプチドを回収する。
　それゆえに、本発明はさらに、本発明のペプチドをコードする核酸にも関する。ここで、核酸は、DNA又はRNA（例えばmRNA）を含む。
　本発明のIgG結合ペプチドと他のタンパク質を融合させる場合、IgG結合ペプチドと他のタンパク質を別々に調製した後に、必要に応じてリンカーを用いてIgG結合ペプチドとタンパク質を融合させても良いし、遺伝子組換え法によって、必要に応じて適当なリンカーを加えて融合タンパク質として作製してもよい。この場合、本発明のIgG結合ペプチドがIgGとの結合性を損なわないように融合タンパク質を作製することが好ましい。
＜架橋剤で修飾されたペプチド＞
　一態様において、本発明における上記IgG結合ペプチドは、架橋剤により修飾されていることが好ましい。
　上記の通り、本発明のIgG結合ペプチドは、後述する実施例において示す通り、上記Xaa1において、IgG Fcの特定の領域、すなわちヒトIgG FcにおけるEu numberingに従うLys248又はLys246、好ましくはLys248と近接する。したがって、本発明のIgG結合ペプチドのXaa1を架橋剤で修飾し、IgGと架橋反応させることによって、IgG結合ペプチドのXaa1とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248の間で部位特異的に架橋構造を形成させることができる。上記の様に、本発明のIgG結合ペプチドのXaa1を架橋剤及び種々の化合物で修飾し、IgGと架橋反応させることによって、種々の化合物を、特異的かつ簡便にIgGに導入することができる。また、本発明によれば、IgG結合ペプチドを介して化合物を導入することができるため、様々な構造の化合物をIgGに導入することができる。さらに本発明の方法は、得られる産物の収率が高く、また、抗体そのもの改変を伴わないため、抗体の機能を低下させる可能性が低いという利点も有する。
　本発明のIgG結合ペプチドは、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物のIgGに対して用いることもできる。この場合、本発明のIgG結合ペプチドが結合するIgG中の部位は、本明細書を読んだ当業者であれば、例えばヒトIgGの配列と他の動物のIgGの配列をアライメントすることにより、容易に特定することができる。
　本発明において、「架橋剤」とは、本発明のIgG結合ペプチドと、IgG Fcを、共有結合により連結させるための化学物質である。本発明の架橋剤は、当業者であれば適宜選択することが可能であり、所望のアミノ酸（例えば、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸、及びアルギニン等）と結合可能な部位を少なくとも２箇所有する化合物とすることができる。その例として、限定するものではないが、DSG（disuccinimidyl glutarate、ジスクシンイミジルグルタレート）、DSS（disuccinimidyl suberate、ジスクシンイミジルスベレート）等のスクシンイミジル基を好ましくは2以上含む架橋剤、DMA（dimethyl adipimidate・2 HCl、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMP（dimethyl pimelimidate・2 HCl、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びDMS（dimethyl suberimidate・2 HCl、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）等のイミド酸部分を好ましくは2以上含む架橋剤、並びにDTBP（dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate・2HCl、3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）及びDSP（dithiobis（succinimidyl propionate）、ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）等のSS結合を有する架橋剤が挙げられる。
　本発明のIgG結合ペプチドは、他の機能性物質、例えば、IgA又はVHH等の抗体、標識物質及び／又は他の薬剤により修飾されていてもよい。IgG結合ペプチドと他の機能性物質の連結は、当業者に公知の方法、例えばアジド基とdibenzocyclooctyneとの反応、又はマレイミド基とスルフヒドリル基の反応等により行うことができる。標識物質により標識されている場合、本発明のIgG結合ペプチドがIgGと複合体を形成することで、該標識物質を介してIgGの検出又は定量を行うことが可能となる。標識物質は、限定されないが、例えば蛍光色素、化学発光色素、放射性同位元素（例えば、放射性ヨウ素又は放射性同位体金属イオンのキレート錯体、例えばDOTA又はデスフェリオキサミンのキレート錯体）、並びにビオチン及びGFP（緑色蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質、発光タンパク質、並びにペルオキシダーゼ等の酵素を含み、好ましい標識物質の例は、フルオレセイン及びFITC等のフルオレセイン誘導体、ローダミン及びテトラメチルローダミン等のローダミン誘導体、並びにテキサスレッド等の蛍光色素である。本発明のペプチドを他の薬剤によって修飾する場合、薬剤として、限定するものではないが、例えば、オーリスタチンE等のオーリスタチン、メイタンシン、エムタンシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、又はこれらの誘導体等の抗がん剤；並びに、血液脳関門上のレセプターに結合して中枢神経への移行を可能とする薬剤、又はがん細胞等に結合して抗体の細胞内への移行を可能にする薬剤等の標的化剤が挙げられる。薬剤を連結している場合、本発明のIgG結合ペプチドは、例えば医薬抗体として用いられるIgGと複合体を形成することで、疾患の治療効果を高めることができる。
　本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、例えば上記＜IgG結合ペプチド＞の項目で記載した方法に従って得られたIgG結合ペプチドを架橋剤と反応させることにより製造することができる。この場合、IgG結合ペプチド中の上記Xaa1のアミノ酸残基の側鎖を特異的に修飾することが必要であり、これは、例えば、Xaa1の種類と架橋剤の組み合わせを選択することによりなされ得る。例えば、DSS又はDSG等のスクシンイミジル基を含む架橋剤は、リシン残基の側鎖及びポリペプチドのN末端に存在する一級アミンと反応するため、IgG結合ペプチドのN末端をブロッキングした上でDSS又はDSGと反応させることで、リシン残基の側鎖のみをDSS又はDSGで特異的に修飾することができる。このようなアミノ酸残基と架橋剤の組み合わせは、当業者であれば適宜選択することができる。
　本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、例えば、架橋剤により修飾されたアミノ酸残基を用いてペプチド合成を行うことによって製造することもできる。同様に、IgG結合ペプチドを標識物質及び／又は他の薬剤で修飾する場合には、これらの修飾を加えたアミノ酸残基を用いてペプチド合成することにより標識物質及び／又は他の薬剤で修飾されたIgG結合ペプチドを調製してもよい。
＜架橋反応＞
　一態様において、本発明は、本発明の架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGを混合する工程を含む、IgG結合ペプチドとIgGの複合体を生産する方法に関する。本工程により、架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じ得る。架橋反応は、特にIgG結合ペプチドの上記Xaa1のアミノ酸残基とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248の間で部位特異的に生じ得る。
　該混合工程の条件は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じる条件で行うものであれば特に限定しない。例えば、本発明のIgG結合ペプチドとIgGを、適当なバッファー中において、室温（例えば約15℃～30℃）で混合することにより反応を行うことができる。該混合工程は、必要に応じて架橋反応を促進する触媒を適量加えて行ってもよい。
　該混合工程における本発明のIgG結合ペプチドとIgGの混合比率は、特に限定しない。本発明のIgG結合ペプチドとIgGのモル比率は、例えば1：1～20：1、好ましくは2：1～20：1又は5：1～10：1とすることができる。
　該混合工程における混合時間（反応時間）は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じる限り限定するものではないが、例えば、1分～5時間、好ましくは10分～2時間又は15分～1時間とすることができる。
　本発明のIgG結合ペプチドとIgGの複合体を生産する方法は、必要に応じて、上記工程を行った後の混合物から、不純物、例えば、未反応のIgG結合ペプチド、IgG、及び試薬等を分離し、該複合体を精製する工程をさらに含んでよい。該工程は、本分野で公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、及びHPLC等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
＜複合体＞
　一態様において、本発明は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGとの複合体に関する。該複合体は、上記架橋反応によって形成され得る。よって、本発明は、好ましくは、IgG結合ペプチドの上記Xaa1のアミノ酸残基とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248との間が部位特異的に架橋剤を介して結合したIgG結合ペプチドとIgGとの複合体に関する。
　本発明の複合体は、部位特異的な架橋反応によって形成されることから、該架橋反応が、IgGの活性に負の影響を与える可能性が少ない。また、修飾したIgG結合ペプチドをIgGに連結することによって、IgGに新たな機能性を付加することができる。例えば、標識物質により修飾したIgG結合ペプチドをIgGに結合させれば、該標識物質を介してIgGの検出又は定量を行うことが可能となる。標識物質の例は、上記の通りであるからここでは記載を省略する。また、例えば、薬剤により修飾したIgG結合ペプチドを、医薬抗体であるIgGに結合させれば、IgGの疾患の治療効果を高めることができる。薬剤の例は、上記の通りであるからここでは記載を省略する。
＜医薬組成物又は診断剤＞
　一態様において、本発明は上記IgG結合ペプチド、上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド、又は上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体を含む医薬組成物又は診断剤に関する。医薬組成物に含まれる場合、IgG結合ペプチドは、例えば上記の薬剤により修飾されていることが好ましく、診断剤に含まれる場合、IgG結合ペプチドは、例えば上記の標識物質により修飾されていることが好ましい。
　本発明の医薬組成物及び診断剤の対象となる疾患として、限定するものではないが、例えば、抗体により標的化可能な疾患又は障害、好ましくは、がん、炎症性疾患、感染症、及び神経変性疾患が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、又は経粘膜投与等）で、投与することができる。また、本発明の医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、静脈注射、動脈注射、若しくは筋肉注射用の注射剤、点滴剤、外用剤、又は坐剤等の各種製剤形態に調製することができる。投与方法及び剤型は、患者の性別、年齢、体重、症状等により、当業者であれば適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国を参照されたい）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
　本発明の医薬組成物に含まれ得る担体及び医薬添加物の例としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、及び医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
　実際の添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明のIgG結合タンパク質又はIgG結合タンパク質とIgGの複合体を溶液、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに容器吸着防止剤、例えばTween80、Tween 20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解して再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のため安定化剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコール及び／又は糖類を使用することができる。
　本発明の医薬組成物の有効投与量及び投与間隔は、患者の性別、年齢、体重、及び症状等に応じて適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物を投与する時期は、上記疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず、予防的投与であっても治療的投与であってもよい。
＜システイン残基がリンカーにより連結されたペプチドを生産する方法＞
　一態様において、本発明は、システイン残基がリンカーにより連結されたペプチドを生産する方法に関する。本方法は、システイン残基を2つ以上、好ましくは2つ含むペプチドと、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で表される化合物（式中、R1及びR2は、各々独立的に任意のハロゲン原子である）を混合し、2つ以上、好ましくは2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で表されるリンカーにより連結されたペプチドを得る工程を含む。上記式中の破線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。システイン残基が当該リンカーによって連結されたペプチドは、通常のジスルフィド結合で連結されたペプチドよりも、還元反応等に対して安定である。
　前記化合物において、R1及びR2は、好ましくはF、Cl、Br、及びI、さらに好ましくはCl、Br、及びIからなる群から選択される。R1及びR2は好ましくは同一であり、さらに好ましくは、R1及びR2はいずれもClである。
　本方法における混合工程の条件は、ペプチドのシステイン残基間で連結反応が生じる条件であれば特に限定しない。例えば、ペプチドと前記化合物を、適当なバッファー、例えば塩化グアニジウムを含む緩衝液中において、室温（例えば約15℃～30℃）で混合することにより反応を行うことができる。該混合工程は、必要に応じて連結反応を促進する触媒を適量加えて行ってもよい。
　本方法の混合工程におけるペプチドと化合物の混合比率は、特に限定しない。ペプチドと化合物のモル比率は、例えば1：0.2～1：10、好ましくは1：0.5～1：5又は1：1～1：2とすることができる。
　該混合工程における混合時間（反応時間）は、ペプチドのシステイン残基間で連結反応が生じる限り限定するものではないが、例えば、1分～5時間、好ましくは10分～2時間又は15分～1時間とすることができる。
　本発方法は、必要に応じて、上記工程を行った後の混合物から、不純物、例えば、未反応のペプチド及び化合物等を分離し、システイン残基が連結されたペプチドを精製する工程をさらに含んでよい。該工程は、本分野で公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、及びHPLC等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
　本方法において用いられるペプチドの種類は、システイン残基が前記化合物により連結可能なものである限り特に限定されないが、例えば本明細書に記載のIgG結合ペプチド又はWO2013/027796の明細書に記載のペプチドが挙げられる。WO2013/027796の明細書に記載のペプチドの例としては、本明細書に記載のIgG結合ペプチドのXaa1残基をアルギニン残基（R）に置換したペプチドが挙げられる。
［実施例1：IgG結合ペプチドとIgGの複合体のX線結晶構造解析］
＜方法＞
（1）IgG結合ペプチド溶液の作製
　G(HC)DCAYHRGELVWCT(HC)H-NH2の配列（配列番号３１、ただし、HCはホモシステインであり、4番目と14番目の2つのCys、2番目と16番目の2つのホモシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成する）を有する環状ホモシステインペプチドを、F-moc法によるペプチド固相合成法にて常法に従い調製した。調製したIgG結合ペプチド0.8mgの粉末を24μLの100％ジメチルスルホキシド（和光純薬）で溶かし、IgG結合ペプチド溶液を調製した。
（2）FcとIgG結合ペプチドとの複合体の作製
　ヒトIgG（中外製薬）のヒンジ部分を、10mM EDTAおよび1mM L-システインを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)中において37℃でパパイン（ロシュ社製）を用いて切断した。続いて、ヒトIgG Fcを、陽イオン交換カラム（TSKgel SP5-PW（東ソー））を用いて、流速1mL/min、20mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5.0)中、0-0.3 M NaClのグラジエント溶出にて精製した。16mg/mLのヒトIgG Fcを含む63μLの溶液（0.1M 塩化ナトリウム（和光純薬）、0.04M 2－モルホリノエタンスルホン酸（和光純薬）（pH6.0））を、上記（1）で作製したIgG結合ペプチド溶液2μLと混合し、FcとIgG結合ペプチドとの複合体溶液を調製した。
（3）FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶の作製
　FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。すなわち、上記（2）で作製したFcとIgG結合ペプチドとの複合体溶液0.3μLと結晶化剤（20％ ポリエチレングリコール3350（シグマアルドリッチ）、0．2Mヨウ化カリウム（和光純薬）（pH6.9））0.3μLを、結晶化用ロボットであるHydoraII＋（マトリックス社製）を用いて、インテリ結晶化プレート（ベリタス社製）のS1ウェル上で混合し、結晶化ドロップとした。リザーバー溶液としては、上記結晶化剤70μLを分注した。プレートをPowerSeal CRISTAL VIEW（グライナーバイオ－ワン社製）で密閉後、20℃の恒温槽内に約2週間静置し、結晶を得た。
（4）FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶のX線回折強度データの収集
　上記（3）で得られた結晶を、安定化母液（22％ポリエチレングリコール3350、0.2M ヨウ化カリウム、0.1M　塩化ナトリウム、25％グリセロール（w／v）、0.04M 2－モルホリノエタンスルホン酸（pH6.0））に移し、－170℃の窒素ガス気流にて急速凍結し、X線回折データを振動法にて測定した。X線の波長は1オングストローム、振動角は1°/フレームで実施した。次に、回折強度データ処理プログラムHKL2000(HKL Research社製)を使用して、回折強度データを分解能3.0オングストロームで処理した。その結果、結晶の空間群がP21であり、格子定数がa＝66.1オングストローム、b＝60.5オングストローム、c＝69.5オングストローム、α＝γ＝90°、β＝101.3°であった。得られたデータのCompletenessは99.9％、Rmergeは13.8％であった。
（5）FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶構造の決定
　DCAYHRGELVWCT（配列番号33）について、上記（4）で得られた回折強度データを、CCP4（Collaborative Computational Project Number 4）に含まれるプログラムPhaserを利用して分子置換法による位相決定を試みた。分子置換法のサーチモデルにはProtein Data Bank（PDB、URL:http://www.rcsb.org/pdb/）にPDB accession code：1DN2として登録されているFc部分のモデルを利用した。その結果、非対称単位中に1分子のモデルを見出すことができた。次にCCP4に含まれる構造精密化プログラムRefmac5を用いた構造精密化とモデル構築プログラムであるX－tal viewを用いたモデルの修正を繰り返し実施し、FcとIgG結合ペプチド（DCAYHRGELVWCT（配列番号33））との複合体の結晶構造を得た。Fcのペプチド結合部位にIgG結合ペプチドに相当する電子密度が観測された。決定した結晶構造の正確さの指標であるR因子は、0.216であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の5％に相当する構造因子から計算されるRfree因子は0.317であった。
（6）架橋構造モデルの作成
　上記のX線結晶解析の構造を基に、計算科学ソフトウェアMOE（Molecular Operating Environment）上で架橋構造モデルを作成した。DCAYHRGELVWCT（配列番号33）の６番目のアミノ酸をLysに置換後、このLysのεアミノ基と抗体Fcの248番目Lysのεアミノ基の間をつなぐ形で、DSG又はDSSによる架橋構造をモデル化した。
＜結果＞
　図1Aに示した様に、IgG結合ペプチドは、プロテインAの結合部位と重なるCH2とCH3ドメインの境界領域に結合し、既に報告されているIgG結合ペプチドFc-III（DeLano, W. L. et al., Science, 2000, 287, pp. 1279-1283）と類似した形でIgGと結合していると考えられた。IgG結合ペプチドとFcとの特徴的な相互作用は、IgG結合ペプチドの8番目の残基Argの側鎖のグアニジノ基が、2.91オングストロームでFcのGlu380（EU numberingに基づく。以下同じ）の側鎖のカルボン酸と塩結合している点である。このGlu380の側鎖は、ヒトIgG Fcの中で、Lys248と塩結合して分子内での塩結合のネットワークを形成しており、IgG結合ペプチドのArg8とFcのLys248は、FcのGlu380との相互作用を介して近づいていた。そこで、IgG結合ペプチドの8番目の残基ArgをLysに換え、この塩結合のネットワーク構造に類似した形で、ペプチドのLys8と抗体のLys248の側鎖のアミノ基を架橋剤で架橋することを考案した。実際に、IgG結合ペプチドとヒトIgG Fcとの複合体構造をベースに、DSG（ジスクシンイミジルグルタレート）もしくはDSS（ジスクシンイミジルスベレート）による架橋構造のモデルを作成したところ、空間的にも抗体の主鎖構造のひずみを伴わずに架橋剤の導入が可能であると考えられた（図1B）。
［実施例2：標識用ペプチドの調製と特性］
＜方法＞
　アミノ基をBiotinもしくは5/6TAMURA succinimidyl ester（AnaSpec, Inc.）（蛍光色素）で修飾したamino-PEG4化合成ペプチドGPDCAYHXGELVWCTFH（配列番号２）（ただし、C末端はアミド化）はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。保護基を除去した後、ｐH8.5の水溶液中酸化条件下で分子内S-S結合を形成させ、逆相HPLCを用いて、流速1.0ml/min、0.1%のTFAを含む10%から60%のアセトニトリルのグラジエント溶出によって分子内S-S結合を有するペプチドを精製した。
　精製したIgG結合ペプチドを1mM含むDMF溶液100μLと100mMのDSS又はDSG（Thermo Fisher Scientific社）のアセトニトリル溶液100μLを混合後、室温で一晩反応させた。反応物を0.1% TFAで2.5倍に希釈後、Waters社製 μ Bondasphere 5C18 100オングストローム(直径3.9 mm x 150 mm)にインジェクトし、0.1% TFAを含む4％から60％までのアセトニトリルのグラジエントで溶出した。得られた生成物へ架橋剤の付加については、BEH300 C18 （1.7μm、直径2.1 mmx 50 mm）カラムを接続したLC-Mass spectrometry（Acquity SQD UPLC system, Waters Corp.)上にて、0.1%ギ酸を含む4％から60％へのアセトニトリルのグラジエントで溶出し、ピークの分子量の測定により確認した。
　得られたラベル化試薬ペプチドの親和性解析は、1M Tris-HCl (pH=7.0)を10分の１量加え15 min反応させることでNHS基を加水分解後、以下の方法で行った。BIAcoreT200（GE healthcare）にセットしたCM5センサーチップ上へ、0.4M EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）と0.1M sulfo-NHS（sulfo-N-hydroxysuccinimide、スルホ－N－ヒドロキシスクシンイミド）を等量混合後、10 μl/mlの流速で、センサーチップに7分間インジェクトすることによりセンサーチップを活性化し、pH4.0（10 mM 酢酸Na）の条件下で、固定化量がRU値で4000～5000となるように、IgGを固定化した。HBS-EP緩衝液（0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、0.005% Tween 20、3 mM EDTA、pH 7.0）を用いながら、流速50 μl/mlにて、10nMから2μMの濃度のペプチドを180 秒間インジェクトすることで結合反応をモニターし、その後、緩衝液により600 sec洗浄することで解離反応を測定した。結合パラメーターの解析は、BIAevalution T100ソフトウェアを用いて行った。
＜結果＞
　架橋構造の導入が、IgG結合ペプチドの特異性及び親和性に影響を与えるか検討するため、架橋構造を導入したIgG結合ペプチドのIgGへの結合力をSPR解析で測定した（表1）。8残基目のアルギニンをリジンに置換したIgG結合ペプチド（以下、Type I（R8K）とも称する）のヒトIgG に対する親和性は131 nM (Kd) であり、置換前のIgG結合ペプチド（以下、Type Iとも称する）と比べ10倍親和性が低下した。Type I（R8K）ペプチドに各架橋剤を結合させたものでは、ヒトIgG に対する親和性は、Type I（R8K）-DSG-OHで約330 nM (Kd)、Type I（R8K）-DSS-OHで約390 nM (Kd) であり、架橋剤が結合することによる親和性の大きな減少は見られなかった。いずれのペプチドにしても、Kd値でμM以下の親和性を有することから、十分特異的な標識化が可能であると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［実施例3：IgG結合ペプチドによるヒトIgG-Fcの特異的修飾］
＜方法＞
　実施例2と同様の方法によってN末端にBiotin-PEG4を付加したIgG結合ペプチド（TypeI（R8K））をDSS又はDSGで修飾した標識化試薬ペプチドを調製し、これをヒトIgG Fcを反応させ、ヒトIgG Fcの標識化反応を検討した。即ち、実施例2と同様の方法によって過剰なDSS又はDSGと反応させたIgG結合ペプチド(R8K)（200 pmol/5μL in 0.1％ TFA）を逆相カラムにて精製後、減圧下でアセトニトリルを除去した後、0.5M Na2HPO4を約1/8加えて中和し、ただちにタンパク質サンプル（hIgG（中外製薬）、hIgA（Athens Research&Technology）、HSA（シグマアルドリッチ）、又は血清（健常者から採血したもの））（各40 pmol/5μL、血清については、PBSにより10倍希釈したものを使用）に、モル比10倍量で加え、最終量をPBS で20μLにした後、室温で5分放置した。その後、1M Tris-HCl（pH=7.0）を1μl加え反応を停止した後、4xSDSサンプル溶液6.7μl及び2-メルカプトエタノール1.4μl（最終5%）を加え、95℃、10minで処理後、プレキャストゲルSuperSepTMAce,5-20%（和光純薬）を用いてSDS-PAGEを行った。泳動後のゲルは、ホーファー・セミホールTE70（Hoefer Semiphor TE70）トランスブロットシステムを用いて35mA、60分で、PMDF膜に転写後、0.5％BSAでブロッキングを行った。ビオチン化ペプチドで標識されたタンパク質は、SAコンジュゲートHRP（1000倍希釈、Vector Laboratories）を用いて、化学発光試薬（イムノスター（登録商標）ベーシック、和光純薬）により検出した。
＜結果＞
　図2Bに示した様に、ウエスタンブロッティングにおいて、IgGと反応させた場合にのみ、複合体とみられるバンドが観察されたことから、DSG又はDSSと反応させたIgG結合ペプチドは、ともに、IgAやHAS、血清中のIgG以外のタンパク質とは結合せずに、IgGに選択的に結合していることがわかった。
［実施例4：IgGに対するIgG結合ペプチドの反応条件の検討］
＜方法＞
（1）反応モル比の検討
　96穴マイクロプレート（Nunc（登録商標）MaxiSorp）のウェルに、各タンパク質（IgG（中外製薬）、IgA（Athens Research & Technology）、又はBovine gelatin（和光純薬））(50 ng（0.33 pmol）/μl/well)を含む0.1 M NaHCO3溶液をプレートに加えて室温で一晩放置することによって、各タンパク質をプレートの表面に吸着させ、0.5 % BSAでブロッキングを行なった後、各ウェルに、実施例２と同様に調製したDSGで修飾したビオチン化IgG結合ペプチド（モル比で、0,1,2,5,10）を加え、１時間経過後、１M Tris-HCl (pH7.0)を3μL加え反応を停止した。0.5 % BSA で2000倍希釈したSA-HRP（Vector Laboratories）を50μL加え、室温で一時間反応後、0.1% PBSTで5回洗浄後、HRPの呈色にTMB溶液(Wako Chemicals)を用いて、５分の発色反応後、450nmの吸光度をELISAプレートリーダー（モデル 680 マイクロプレートリーダー（バイオラッド））にて測定した。
（2）反応時間の検討
　50ng/50μLの溶液により4℃で一晩固定化したhIgG（50 ng）に対しDSGで修飾したビオチン化IgG結合ペプチドをモル比2で加え、各反応時間（0～60分）で、１M Tris-HCl (pH7.0)を3μL加え反応を停止した。結合の検出は（A）と同様に行った。
＜結果＞
　DSS標識化IgG結合ペプチドを用いて、抗体と反応させるモル数及び反応時間の違いによる反応効率をELISAにて検討した (図3)。即ち、プラスティックプレートに固定化したIgG結合ペプチドのモル比を1から10まで変化させてhIgGと反応させたところ、ほぼモル比5のあたりで飽和がみられたことから、モル比5程度のペプチド試薬を加えれば、抗体の標識化には充分であると考えられた（図3A）。DSSで修飾していないビオチン化IgG結合(R8K)ペプチド（NO DSS R8K）では極めて弱い結合がみられているが、これは、非共有結合で結合したペプチドによる結合活性と考えられる。さらに、標識化IgG結合ペプチド試薬を過剰に加えても、他のタンパク質（hIgA、Bovine gelatinあるいはブロッキング剤として用いているBSA）への結合は全く検出されなかった。
　次に、IgGとIgG結合ペプチドのモル比1：2で反応させた際の、反応時間の検討を行った。その結果、約15分で飽和が見られたことから、反応は15分でほぼ終了していると考えられた(図3 B)。
　以上の結果より、架橋剤で修飾した本発明のIgG結合ペプチドは、短時間で、かつ特異的にIgGと結合することが示された。
［実施例5：蛍光IgG結合ペプチドによるFcの標識化］
＜方法＞
　IgG（中外製薬）、IgA（Athens Research & Technology）、又はBSA（シグマアルドリッチ）（15 μg：IgG換算で100 pmol）と実施例2に従って調製したDSG架橋ペプチド又はDSS架橋ペプチド（500 pmol）を200μL中で室温にて60 min反応させ、1M Tris-HCl (pH=7.0)を10μL加え反応を停止させた。その後、SuperdexTM200 10/30GL　直径1.0cm×30cm（GEヘルスケア）；流速：0.3ml/min；ランニングバッファー：PBS　pH 7.4、にてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、蛍光検出器　RF-10A（島津製作所）（励起光：541 nm 蛍光: 565 nm）を用いて測定を行った。
＜結果＞
　DSS又はDSGを反応させた標識化IgG結合ペプチドを各タンパク質に対するモル比1：5でタンパク質と室温にて60 min反応させ、サイズ排除クロマトグラフィーにて分析した。いずれの標識化IgG結合ペプチド（DSS又はDSG）を用いても、IgGへの反応性の特異性は同程度であり、hIgAやBSA等の他のタンパク質への蛍光標識化は、全く検出されなかった（図4）。以上のことから、作製したいずれのIgG結合ペプチドを用いても、高い特異性を持って、ヒトIgGを蛍光標識できることがわかった。
［実施例6：IgG結合ペプチドによるFcの修飾物の解析（pH4.5）］
＜方法＞
　ヒトIgG（中外製薬）のFc溶液（20μM、0.1M酢酸緩衝液pH4.5）200μLと、DMF中に溶解した、実施例2と同様の方法によってDSG修飾したIgG結合ペプチド（RGNCAYHXGQLVWCTYH（配列番号３５）、Xはリジン）（4mM）を0.5、1.0、2.0、5.0μL（モル比で0.5、1.0、2.0、5.0）加え、素早く撹拌後、室温で15分反応し、１M Tris-HCl（pH7.0）を10μL加え、反応を停止させた。反応物50μLをShodex IEC SP-825カラムを接続したNGC Chromatography system（バイオラッド）にインジェクトし、25mM Acetate buffer（pH4.5）から1M NaClを含む25mM Acetate buffer（pH4.5）へのグラジエント溶出を行い、タンパク質の溶出を、215nmの吸光度でモニターした。得られた各ピークを分取し、LC/MSによる分子量測定に供した。
　Waters ACQUITY UPLC BEH C8 （1.7μm　2.1mm×100mm）カラムを接続したShimadzu LCMS-8030に、得られたピークのフラクションを20μLインジェクションした後、0.1% ギ酸を含む4％アセトニトリルから0.1% ギ酸を含む60％アセトニトリルまでのグラジエント溶出を行った。溶出されたピークのマススペクトル分析を行い、解析ソフトを用いた多価イオンピークからのデコンボリューションによって質量を計算した。
＜結果＞
　ヒトIgG1-FcとDSG修飾したIgG結合ペプチド（4mM、Biotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH2；分子量2760、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成）をモル比で0.5、1.0、2.0、又は5.0で反応させたところ、図5Aに示した様に、元のヒトIgG1-Fcの溶出位置のピーク（ピーク２）と２つのピーク３、４が現れた（ピーク１は、DSG化したIgG結合ペプチドであると考えられる）。これらの分子種を同定するために、LCMS解析を行った。反応前のIgG1-Fcは、イオン交換クロマトグラムではピーク１のところに溶出され、LCMS解析では、55084という値が得られた。反応後の２、３、４のピークのLCMS解析を行ったところ、それぞれ、55087、57735（55087＋2648）、60384（55087＋5297）という値が得られた。このことから、反応後のピーク２は、未反応のFcであり、ピーク３と４は、Fcにそれぞれ１つ及び２つのペプチドが結合したものであることがわかった。
　図5Bは、各モル比で反応させた場合の、未反応（ピーク２）、１個のペプチドの付加物（ピーク３）、２個のペプチドの付加物（ピーク４）の生成量の変化をグラフ化したものである。例えば、モル比１：１で反応させた場合でも、未反応物は20％以下となり、モル比１：２では未反応物は10％以下と極めて収量が高いことがわかる。また過剰なモル比１：５の場合でも相対的に２個のペプチドの付加物の生成比率が増えたが、それ以上のペプチドが付加されたFcはイオン交換クロマトグラム上では検出されなかったことから、この標識反応は極めて特異的であることがわかった。
［実施例7：IgG結合ペプチドによるFcの反応に対するｐHと反応時間の影響］
＜方法＞
　pH4.0（25ｍM酢酸緩衝液）、pH5.5（25ｍM酢酸緩衝液）、又はpH7.0（PBS）にて調製したヒトIgGのFc溶液200μLに対し、実施例5で調製した、DMF中に溶解したDSG修飾したIgG結合ペプチド（4 mM）を1.0μL（モル比で1.0）加え、素早く撹拌後、室温で反応した。反応後１、５、１０、又は３０分に、１M Tris-HCl（pH7.0）を10μL加え、反応を停止させ、反応物50μLをShodex IEC SP-825カラムを接続したNGC Chromatography system（バイオラッド）にインジェクトし、25mM Acetate buffer（pH4.5）から1M NaClを含む25mM Acetate buffer（pH4.5）へのグラジエント溶出を行い、タンパク質の溶出を、215nmの吸光度でモニターした。得られたクロマトグラムを基に各ピークの比率を計算した。
＜結果＞
　図6に示した様に、試験したpH 4.0、pH 5.5、及びpH 7.0のいずれにおいても標識化反応は早く、反応の90％以上が１分以内に終了していることがわかった。また、pH4.0では、未反応物の残量が40％を超えており反応収率が低く、特に、２つのペプチドの付加物（ピーク４）の収量が15％程度と他のpHの場合（35-40%）に比べ低かった。pH 5.5及び7.0では、未反応物の収量も10％台と低く、効率よく反応していることがわかった。pH5.5と7.0の差としては、若干、ピーク４の収量がpH 7.0で低くなる傾向が見られた。
［実施例8：IgG結合ペプチドを用いた単鎖Fv-Fc抗体の蛍光標識によるFACS解析］
＜方法＞
　Her2に対するscFv（4D5）とFc遺伝子を連結したscFv-Fcを保有するpcDNA3.1/Zeo（+）を、HEK293細胞へLipofectamine 2000を用いてトランスフェクションし、5日間培養後、培養液中に分泌されたscFv-FcをプロテインAカラムにより精製して、4D5-Fc抗体（HER2に対する特異性を持った単鎖Fvクローン4D5とFcの融合蛋白質）を調製した。続いて、調製した4D5-Fc抗体1.0μgを3％BSAを含むPBS 10μLに希釈したものを、実施例2と同様の方法によってDSG修飾したN末ビオチン化IgG結合ペプチド（Biotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH（配列番号３５）、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成）0.16μg（20 p mol）と混合し10分間反応させた。この反応物を、10％FBSを含むPBS 100μLに分散した乳がん細胞株SK-BR3(ATCCから購入)（5.0×105細胞）に加え、30分間4℃で放置した。3％BSAを含むPBSで1回洗浄し、3％BSAを含むPBS 100 μLに懸濁した後、PE標識Streptavidin（Vector Laboratories）0.01μg（0.2 pmol）を加え、30分間4℃で放置した。再度、3％BSAを含むPBSで1回洗浄した後、3％BSAを含むPBS100μLに分散し、7-AAD Viability Dye（ベックマン・コールター）を10μL添加後、15分間放置した。PBS 400μLを加え分散し、35μmのメッシュ（Corning）を通した後、S3eTM セルソーター（バイオラッド）上で分析した。
＜結果＞
　乳がん細胞株SK-BR3上のHER2抗原への4D5-Fc抗体の結合を、DSG修飾したビオチン化IgG結合ペプチドとPE標識Streptavidinにより検出した結果を図7Aに示す。コントロールとして、DSG修飾したビオチン化IgG結合ペプチド（Biotin化IgG結合ペプチド）の代わりにビオチン化抗ヒトIgGマウス抗体（Anti hIgG mAb-biotin標識）（0.01μg）を使用した場合の、フローサイトメトリー解析の結果も併せて示した（いずれの場合も、7-AAD染色により染色される死細胞を除いた細胞画分のみを使用して分析した）。2つの系ではともに、蛍光強度にはほとんど違いがなかったことから、SG修飾したビオチン化IgG結合ペプチドは、ヒトFcを特異的に標識することにより、単鎖Fv-Fc等のFACS染色に利用できることが分かった。一方、ネガティブコントロールとして、4D5-Fcを加えない系も検討を行ったが（図7B）、SG修飾ビオチン化IgG結合ペプチドを加えていない系（Anti hIgG mAb-biotin標識＋SA-PE標識、及びAnti hIgG mAb-PE標識）と同様に、全く蛍光強度のシフトが見られなかったことから、DSG修飾したビオチン化IgG結合ペプチド単独では、細胞に対する非特異的な修飾は起こっていないことが分かった。
［実施例9：IgG結合ペプチドによる、抗IgA受容体VHHとヒトIgG抗体のコンジュゲート形成］
＜方法＞
　DSG修飾したN末アジ化IgG結合ペプチド（Azide-PEG4-GPDCAYHXGELVWCTFH（配列番号２）、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成、C末端はアミド化）は、実施例2と同様の方法によって調製した。このペプチドを10ｍMの濃度でDMSOに溶解し、この溶液20μLを25ｍM酢酸緩衝液（ｐH5.0）に溶解した16.6μMの抗HER2ヒトIgG抗体（中外製薬）溶液8mLに加え（ペプチドと抗体のモル比＝1：1.5）、室温で5時間反応させた。反応後、CIMmultusTM SO3-1（SHOWA DENKO）のカラム（1mL）上で、25mM酢酸緩衝液（ｐH5.0）の0から1MまでのNaClグラジエント溶出にてアジ化ペプチド抗HER2ヒトIgG抗体（1価アジ化ペプチド抗体、２価アジ化ペプチド抗体の混合物）を精製した。
　アルパカ由来の抗IgA受容体VHH抗体クローン2b1-L9（C末端にHISタグを付加）は、大腸菌HB2151にて分泌発現したものを、C末端に付加したHISタグを使いアフィニティ精製した。具体的には、大腸菌HB2151にVHH遺伝子を保有するファージミドベクターpKSTV03を導入後、2TYAGプレートで選択し、2TYA液体培地中で37℃で一晩培養した。この培養液10 mLを2TYA 500mLに加え37℃で1時間培養した後、1M IPTGを500μL添加し、16時間振盪培養した。遠心後の菌体をTES buffer（0.2M Tris-base、0.5mM EDTA、0.5M sucrose）10mLで懸濁し、氷上で2時間静置した。４倍希釈したTES bufferを20 mL加え再懸濁し氷上で1h静置後、遠心し、上清画分（ペリプラズム画分）を回収した。上清は、アフィニティーカラム（His trap excel、GE Healthcare）にて、Profinia（BioRad）の精製システムを用いてVHHを精製した（流速は結合・溶出 2 mL/min、洗浄 2mL/min、Bufferは、平衡化Buffer: 0.5M NaCl、20mMリン酸Na、洗浄Buffer:0.5M NaCl、20mMリン酸Na、溶出Buffer:500mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mMリン酸Naを用いた。続いて、PBS（pH7.4）中にて、0.1ｍMのDTTの存在下で、1時間、室温にて還元処理後、IEC SP-825 （Shodex）カラム（8.0mm ×75mm）上で、10mM酢酸緩衝液（pH4.5）の0から1MまでのNaClグラジエント溶出にて精製した。還元処理したVHH溶液（41.2μM、pH4.5）200μLと10mM酢酸緩衝液（pH4.5）に溶解した870μM Dibenzocyclooctyne（DBCO）-maleimide（Click Chemistry Tools）42μLを混合（モル比で1：4.4）し、室温で1時間反応させた。このようにして調製したDibenzocyclooctyne-maleimide化VHH（22μM）290μLを、上記の通り調製したアジ化ペプチド抗体溶液（17μM、ｐH4.5）116μLと混合（モル比で3.3：1）し、4℃で14時間反応させた。反応物は、IEC SP-825（Shodex）カラム（8.0mm×75mm）上で、10ｍM酢酸緩衝液（pH4.5）中、0から1MまでのNaClのグラジエント溶出で精製された。精製された画分は、還元後、5-20%のグラジエントゲルSuper Sep Ace(WAKO)上で、SDS-PAGEにより分離後、CBBによりタンパク質染色した。
＜結果＞
　アジ化ペプチド抗体とDibenzocyclooctyne-maleimide化VHHとのクリック反応による連結後のイオン交換クロマトグラフィーの結果、３本（a、b、及びc）の主要なピークが得られた（図8A）。それぞれを還元状態でSDS-PAGEで分析した結果を図8Bに示す。a（レーン3）では元のIgG（レーン1）と同じH鎖由来の50 kDaとL鎖由来の25kDaのバンドが見られた。b（レーン4）では、L鎖のバンドに変化はなかったが、元のIgG抗体の重鎖（約50kDa）（レーン1）に加え、ほぼ等量の濃さの約80kDaの位置の新たなバンドが見られた。c（レーン5）では、L鎖のバンドに変化はなかったが、元の重鎖（約50kDa）のバンドが消失し、約80kDaのバンドのみが見られた。これらのことから、aはVHHが付加されていないIgG抗体、bは1個のVHHが連結されたIgG抗体（抗HER2ヒト抗体－1価VHH）、cは2個のVHHが連結されたIgG抗体（抗HER2ヒト抗体－2価VHH）であることが分かった。
　以上のことから、IgG抗体上にIgG結合ペプチド試薬を使って導入したアジド基と、VHH低分子抗体に導入したDibenzocyclooctyne基間のクリック反応によって、IgG抗体に低分子抗体（VHH等）を連結できることが分かった。
［実施例10:抗IgA受容体VHHと抗HER2ヒトIgG抗体のIgG結合ペプチドを介したコンジュゲートのFACSによる抗原結合解析］
＜方法＞
　HL60細胞（JCRBから入手）は、10％FBS並びに100units/mLペニシリンGと100μg/mLストレプトマイシン硫酸塩を含むRPMI1640培地(Life Technologies社)にて、1.3％DMSO添加によって６日間分化誘導を行った。SK-BR3細胞(ATCCから購入)については、10％FBS、100units/mLペニシリンG、及び100μg/mLストレプトマイシン硫酸塩を含むMcCoy's 5A (Life Technologies社)培地で、37℃にて5％CO2インキュベーターで培養後、トリプシン－EDTA（Life Technologies社）にて細胞を剥離、回収した。各2×105の細胞を200μLの3％BSAを含むPBSに分散させ、最終濃度が200nMになるように１次抗体（抗HER2ヒトIgG抗体、実施例9で調製した抗IgA受容体VHH（C末HISタグ付加）、又は実施例9で調製した抗HER2ヒト抗体－1価VHH（C末HISタグ付加））を加え、4℃で30分放置した。1回洗浄後、3％BSAを含むPBSに分散した細胞液200μLに、2次抗体として、1）ビオチン化抗HISタグ抗体（MBLライフサイエンス）＋PE標識したSA（最終濃度50nM）（Vector Laboratories）、又は2）PE標識した抗ヒトIgGポリクローナル抗体（Affimetrix eBioscience）（最終濃度13nM）を加え、4℃で30分放置した。1回洗浄後、3％BSAを含むPBSに分散した細胞液200μLに、7-AAD Viability Dye（ベックマン・コールター）10μLを加え15分放置後、800μLのPBSを加え、35μmのメッシュ（Corning）を通したのち、S3eTM セルソーター（バイオラッド）上で分析した。
＜結果＞
　7-AAD染色により死細胞を除いた細胞画分を使って、HER2を高発現するSK-BR3細胞を、1次抗体として、抗HER2ヒトIgG抗体（図9A）、抗IgA受容体VHH（C末HISタグ付加）（図9B）、抗HER2ヒト抗体－1価VHH（C末HISタグ付加）（図9C）を使用し、2次抗体として、最終濃度50 nMのビオチン化抗HIS抗体＋PE標識したSAの混合物を用いてFACS解析を行った結果を図9A～Cに示す。図9Cの場合において、大きな蛍光シフトが見られたことから、調製した抗HER2ヒト抗体－1価VHH中の抗HER2抗体は、SKBR-3細胞への結合活性を有していることが分かった。
　一方、DMSO1.3％による分化誘導でIgA受容体を高発現したHL60細胞への結合を、1次抗体として抗HER2ヒト抗体（図9D）、抗IgA受容体VHH（C末HISタグ付加）（図9E）、抗HER2ヒト抗体－1価VHH（図9F）を用い、2次抗体として、PE標識抗ヒトIgGポリクローナル抗体を用いて検出した結果を、図9D～Fに示す。こちらにおいても、図9Fの抗HER2ヒト抗体－1価VHHにおいてのみHL60への結合が見られることから、抗HER2ヒト抗体－1価VHH中のVHHは、IgA受容体に対する抗原結合活性を保持していることが分かった。なお、図9Dにおける若干の蛍光シフトは、分化したHL60細胞上にHER2が少量発現していることを示しているが、この結合による蛍光強度に比べ、図9Fでの蛍光強度ははるかに大きいため、HER2への結合の寄与は無視してよいと考えられる。
［実施例11：IgG結合ペプチドによる抗体薬物複合体の細胞増殖抑制］
＜方法＞
　N末のアミノ基をMaleimideacetoxyl succinimidyl esterで修飾したマレイミド-PEG4化合成ペプチドRRGPDCAYHXGELVWCTFH（配列番号３７：配列番号２のペプチドのN末端に2つのArgを付加したもの、Xはリジンで、C末端はアミド化）はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。保護基を除去した後、pH8.5の水溶液中酸化条件下で分子内S-S結合を形成させ、逆相HPLCを用いて、流速1.0ml/min、0.1%TFAを含む10%から60%のアセトニトリルのグラジエント溶出によって分子内S-S結合を有するペプチドを精製した。DMSOに溶解したペプチド（18.5mM）40μLに同じくDMSO に溶解したDM-1（emtansine（XDCExplorer社）、50mM）24μL（ペプチドとDM-１のモル比＝1：1.6）を加え、さらにピリジン3.4μL（最終濃度5％）を加え、50℃で3時間反応させた。引き続き、アセトニトリルに溶解したDSG（500ｍM）80μL加え、50℃で3時間反応させ、IgG結合ペプチドのマレイミド基とDM-1のスルフヒドリル基の間で架橋構造を形成させた。全量を0.1％TFAを含む10％アセトニトリル10mlに希釈し、遠心後の上清を、Inertsustain C18 カラム（7.6mm 1×250ｍｍ, GL Science）にインジェクションし、0.1％TFAを含む10％から70％までのアセトニトリルのグラジエントで溶出した。溶出物の質量分析を行い、目的物を回収後、溶媒除去後、凍結乾燥した。
　DMSO中に溶解した12.0mMのDM-1を連結したDSG修飾マレイミド-PEG4化IgG結合ペプチド試薬0.56μLと、10ｍM酢酸緩衝液（pH5.5）に溶解した6.8μMの抗HER2ヒト抗体（中外製薬）1ｍLを混合し、室温で30分間反応（ペプチドと抗体のモル比＝1：1）させた。このようにして調製したDM-1修飾ヒト抗体（抗体薬物複合体、ADC）は、陽イオンイオン交換カラムShodex SP825（8.0mm×75mm, Shodex）にて、10mM酢酸緩衝液（pH5.5）を含む0Mから1.0MまでのNaClのグラジエント溶出にて精製された。未反応の抗体以外の2本のピーク（ピークA、B）を分取後、Vivaspin（10000Daカットオフ、Sartorius）上で、3000ｇの遠心操作により脱塩濃縮を行った。得られたサンプルは、MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG（Bruker Daltonics）で質量を測定し、ピークAが元の抗HER2ヒト抗体に比べ3553（理論値3535）、ピークBが元の抗HER2ヒト抗体に比べ7092（理論値7070）増えていることから、DM-1を連結したマレイミド-PEG4化IgG結合ペプチドが、それぞれ、1つ（抗HER2抗体－DM1*1）、及び2つ（抗HER2抗体－DM1*2）の導入されていることを確認した。
　96穴の細胞培養プレートの各ウェルに、10000 cell/100μLとなるように、10％FBSと100units/mLペニシリンGと100μg/mLストレプトマイシン硫酸塩を含むMcCoy's 5A (Life Technologies社)培地に、SK-BR3細胞(ATCCから購入)又はC6細胞（JCRBから入手）を播種した。37℃にて5％CO2インキュベーターで24時間培養した後、各濃度の上記の通り調製した抗体薬物複合体（ADC）を含む培地100μLを加え、さらに、37℃のCO2インキュベーターで72時間培養した。Cell Counting Kit-8（同人化学）を各wellに10μLずつ加え、37℃のCO2インキュベーターで2時間保温後、プレートリーダーで、450nmの吸光度を測定した。
＜結果＞
　乳がん細胞株SK-BR3に対する調製したADCの細胞増殖抑制効果を評価するため、0-10 nMのADCの存在下でSK-BR3細胞を培養し、72時間後の細胞数を細胞測定キットにより評価した（図10）。今回調製した抗HER2抗体－DM1*1、抗HER2抗体－DM1*2ともに、HER2を高発現するSK-BR3に対し、0.4ｎM以上の濃度で、顕著な細胞増殖抑制活性を示した。一方、HER2を発現していないC6細胞に関しては、使用した抗体薬物複合体の濃度範囲では、細胞増殖抑制は見られなかった。以上のことから、IgG結合ペプチドを介した共有結合による抗体薬物複合体は、がん細胞株に対して、有効な細胞増殖抑制活性を発現できることが分かった。
［実施例12：ジクロロプロパノンによるSS架橋構造を持つIgG結合ペプチドによる抗体薬物複合体の細胞増殖抑制］
＜方法＞
　N末アセチル化RRC（Acm保護）-PEG4化合成ペプチドGPDCAYHXGELVWCTFH（配列番号２、Xはリジンで、C末端はアミド化）は、ペプチド合成ビーズ（Rink-amide-Chemmatrix resin、Biotage)上にて、Fmoc固相合成法により常法に従って合成した。樹脂からのペプチドの切り出し、脱保護を行った後、ペプチド（図11、a）を得た。得られたペプチド65mg（15.6μmol）を6 M Gn・HClを含むリン酸緩衝液 (pH =7.3)5 mLに溶解し、これにアセトニトリル120μLに溶解した1, 3-Dichloro-2-propanone (2.9 mg, 23.4 μmol, 1.5等量モル)を加えて、室温で攪拌した。1時間後、HPLC分析によって反応の終了を確認し、反応溶液を直接HPLCにて精製することによって、環化ペプチド(図11、b、33 mg、7.8 μmol、収率50％)を得た。この環化ペプチドに対して、90%酢酸水溶液(8.8 mL)に懸濁した酢酸銀(30.8 mg, 184.5 μmol)を加えて、室温下、遮光で5時間攪拌した。ジチオスレイトール(DTT:352 mg, 2.3 mmol)を加え、生じた沈殿を遠心分離によって除去し、得られた上清をHPLCによって、精製することで、環化ペプチド(図11、c、20.5 mg、5.2 μmol、収率67%)を得た。
　上記の通り調製した環化ペプチドをDMSOに溶解した溶液（60mM）6μLに、同じくDMSO に溶解した27mM のVcMMAE（Maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzoyloxycarbonyl-monomethyl auristatin E, MedChem Express）18μL（ペプチドとVcMMAEのモル比＝1：1.4）を加え、さらにピリジン1.2μL（最終濃度5％）を加え、50℃で3時間反応させた。引き続き、アセトニトリルに溶解したDSG（500ｍM）25μL加え、50℃で3時間反応させた。全量を0.1％TFAを含む10％アセトニトリル10mlに希釈し、遠心後の上清を、Inertsustain C18カラム（7.6mm×250mm, GL Science）にインジェクションし、0.1％TFAを含む10％から80％までのアセトニトリルのグラジエントで溶出した。溶出物の質量分析を行い、目的物を回収後、溶媒除去後、凍結乾燥した。
　DMSO中に溶解した5.0mMのDSG修飾N末アセチル化RRC-PEG4化IgG結合ペプチド試薬（R8K）5.4μLと10ｍM酢酸緩衝液（pH5.5）に溶解した6.8μMの抗HER2ヒトIgG抗体（中外製薬）1ｍLを混合し、室温で15時間反応（ペプチドと抗体のモル比＝1：4）させた。このようにして調製したVcMMAE修飾ヒトIgG抗体（抗体薬物複合体、ADC）は、陽イオンイオン交換カラムShodex SP825（8.0mm×75mm, Shodex）にて、10mM酢酸緩衝液（pH4.5）を含む0Mから1.0MまでのNaClのグラジエント溶出にて精製された。未反応の抗体以外の主要な１本のピークを分取後、Vivaspin（10000Daカットオフ、Sartorius）上で、3000ｇの遠心操作により脱塩濃縮を行った。得られたサンプルは、MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG（Bruker Daltonics）で質量を測定し、元の抗HER2ヒト抗体に比べ3941（理論値4178）増えていることから、VcMMAEが付加されたN末アセチル-RRC-PEG4化IgG結合ペプチド（R8K）が１つ導入されていることを確認した。
　96穴の細胞培養プレートの各ウェルに、10000 cell/100 μLとなるように、10％FBSと100units/mLペニシリンGと100μg/mLストレプトマイシン硫酸塩を含むMcCoy's 5A (Life Technologies社)培地に、SK-BR3細胞(ATCCから購入)もしくはC6細胞（JCRBから入手）を播種した。37℃にて5％CO2インキュベーターで24時間培養した後、各濃度の抗体薬物複合体（ADC）を含む培地100μLを加え、さらに、37℃のCO2インキュベーターで72時間培養した。Cell Counting Kit-8（同人化学）を各wellに10μLずつ加え、37℃のCO2インキュベーターで2時間保温後、プレートリーダーで、450nmの吸光度を測定した。
＜結果＞
　乳がん細胞株SK-BR3に対する調製したADCの細胞増殖抑制効果を評価するため、0-500 nM ADCの存在下でSK-BR3細胞を培養し、72時間後の細胞数を細胞測定キットにより評価した（図12）。使用した抗癌剤VcMMAEそのものについては、250nM以上においてのみ増殖抑制が見られたが（図12A）、今回調製したADCでは、HER2を高発現するSK-BR3に対し、0.4nM以上濃度で、顕著な細胞増殖抑制活性を示し（図12B）、抗体とのコンジュゲートによって、500倍程度細胞増殖抑制活性が増強していた。一方、このような細胞増殖抑制は、元の抗HER2ヒト抗体のみでは見られなかった。以上のことから、IgG結合ペプチドを介した共有結合による抗体薬物複合体は、がん細胞株に対して、有効な細胞増殖抑制活性を発揮できることが分かった。
［実施例13：各種IgGに対するIgG結合ペプチドによる標識評価］
＜方法＞
　ヒト、マウス、ウサギ、及びラットの各種抗体溶液（14μM）1.25μL （抗体2.5μg相当）に、PBS 3.15μLを加え、実施例2と同様の方法によってDSG修飾したN末ビオチン化IgG結合ペプチドBiotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH（配列番号３５、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成）のDMSO溶液（118μM）0.65μLを混合後、室温で30分間反応（抗体とペプチドのモル比＝1：4）させた。この反応液（5.0μL）に、SDS-PAGEのサンプルバッファー（4×）5.0μL、2-mercaptoethanol 0.6 μL、超純水9.35μLを加え混合後、95℃で10分間加熱し、グラジエントゲル（Super SepTM Ace 5-20%, Wako Chemicals）上で、SDS-PAGEを行った。ゲルは、CBBでタンパク質染色を行い、またゲルからPBDF膜に転写したタンパク質は、Western Blotに供した。すなわち、転写後のPVDF膜を、0.5％ BSAでブロッキングを行い、HRP標識ストレプトアビジン（Vector Laboratories）を室温で１時間反応させ、化学発光検出試薬Chemi-Lumi One (NACALAI TESQUE)を用いて、化学発光イメージャーChemDock（BioRad）で検出した。標識に使用した抗体は以下の通りである。ヒトIgG1（Clone ID: CB1）、ヒトIgG2（Clone ID: CB2）、ヒトIgG3（Clone ID: CB3）、ヒトIgG4（Clone ID: CB4）、 マウスIgG1（Clone ID: CB5）、マウスIgG2b（Clone ID: CB8）、及びマウスIgG3（Clone ID: CB9）は、Crown Bioscience Inc.から購入した。ラットIgG1（Clone #: 43414）とIgG2b（Clone #: 141945）はR&D社から、IgG2c（Clone Name: SB68b）はLifeSpan BioScience社から、ウサギIgGは、Thermo Scientific社から、購入した。
＜結果＞
　図13に示したように、Trastuzumab（抗HER2ヒト化IgG1抗体）と同程度に、ヒトモノクローナルIgG1、ヒトIgG2、及びヒトIgG4において、濃いバンドが認められた。また、使用した動物抗体のうち、ウサギポリクローナルIgG抗体が、特に強く染色された。以上のことから、本IgG結合ペプチドを使った標識では、ヒトIgG1、2、及び4並びにウサギIgG抗体を効率良く標識できることが分かった。
　本発明のIgG結合ペプチドを用いて、IgG結合ペプチドに連結させた種々の化合物を、短時間で、しかもほとんどの副反応なくIgGのFcに付加することができる。これによって、検出試薬、診断薬、及び医薬等として用いられるIgGを種々の化合物によって特異的かつ簡便に修飾することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (21)

  1. 　下記の式I：
    (X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(I)
    (式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、かつ
    Wはトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチド。
  2. 　下記の式II：
    (X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(II)
    (式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、
    Wはトリプトファン残基であり、
    Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
    Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　下記の式III：
    (X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3)　　(III)
    (式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Aはアラニン残基であり、
    Yはチロシン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Eはグルタミン酸残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、かつ
    Wはトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチド。
  4. 　17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1～3、15～17番目の各アミノ酸残基が、
    1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は、なし
    2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン、又は、なし
    3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
    15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
    16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン、又は、なし、
    17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし
    である、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド。
  5. 　以下の１）～１５）のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、Xaa2はホモシステインである、請求項４に記載のペプチド。
    １）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）
    ２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）
    ３）RCAYH(Xaa1)GELVWCS（配列番号３）
    ４）GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４）
    ５）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号５）
    ６）GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号６）
    ７）GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号７）
    ８）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号８）
    ９）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH（配列番号９）
    １０）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１０）
    １１）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１１）
    １２）SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１２）
    １３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）
    １４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号３６）
    １５）RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号３７）
  6. 　下記の式IV：
    D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T　　(IV)
    (式中、
    Dはアスパラギン酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、
    Wはトリプトファン残基であり、
    Tはトレオニン残基であり、
    Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
    Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチド。
  7. 　以下の１）～４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸である、請求項６に記載のペプチド。
    １）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１４）
    ２）DCAYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１５）
    ３）DCTYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１６）
    ４）DCAWH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１７）
  8. 　下記の式V：
    D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T　　(V)
    (式中、
    Dはアスパラギン酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Wはトリプトファン残基であり、
    Tはトレオニン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
    Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
    Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
    Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
    Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び／又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチド。
  9. 　ペプチドが外側の2つのシステイン(C)残基間でジスルフィド結合を形成しているか、又はペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表されるリンカーにより連結されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のペプチド。
  10. 　標識物質により標識されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチド。
  11. 　薬剤が結合している、請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
  12. 　Xaa1がリシン残基である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のペプチド。
  13. 　Xaa1が架橋剤で修飾されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載のペプチド。
  14. 　前記架橋剤が、DSG（ジスクシンイミジルグルタレート）、DSS（ジスクシンイミジルスベレート）、DMA（アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMP（ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMS（スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DTBP（3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びDSP（ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）からなる群より選択される、請求項１３に記載のペプチド。
  15. 　前記架橋剤がDSG（ジスクシンイミジルグルタレート）又はDSS（ジスクシンイミジルスベレート）である、請求項１４に記載のペプチド。
  16. 　請求項１３～１５のいずれか一項に記載のペプチドとIgGとの複合体であって、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGの架橋反応によって形成される、前記複合体。
  17. 　請求項１３～１５のいずれか一項に記載のペプチドとIgGを混合し、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGを架橋反応させる工程を含む、ペプチドとIgGの複合体を生産する方法。
  18. 　請求項１～１５のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項１６に記載の複合体を含む、医薬組成物。
  19. 　システイン残基を2つ以上含むペプチドと、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表される化合物（式中、R1及びR2は、各々独立的に任意のハロゲン原子である）を混合し、2つ以上のシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で表されるリンカーにより連結されたペプチドを得る工程を含む、2つ以上のシステイン残基がリンカーにより連結されたペプチドを生産する方法。
  20. 　前記化合物において、R1及びR2が同一であり、かつCl、Br、又はIである、請求項１９に記載の方法。
  21. 　前記ペプチドが、請求項１～８及び１０～１５のいずれか一項に規定されるペプチドである、請求項１９又は２０に記載の方法。
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Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017217347A1 (ja) * 2016-06-13 2017-12-21 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチドによる部位特異的ＲＩ標識抗体
WO2018061509A1 (ja) 2016-09-30 2018-04-05 富士フイルム株式会社 環状ペプチド、アフィニティクロマトグラフィー担体、標識化抗体、抗体薬物複合体および医薬製剤
WO2018092867A1 (ja) * 2016-11-18 2018-05-24 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法
WO2018199337A1 (ja) 2017-04-28 2018-11-01 味の素株式会社 可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩
WO2018230257A1 (ja) * 2017-06-16 2018-12-20 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチド、及び該ペプチドによる抗体の特異的修飾
WO2019203191A1 (ja) 2018-04-16 2019-10-24 日本メジフィジックス株式会社 修飾抗体、および、放射性金属標識抗体
WO2019240287A1 (ja) 2018-06-14 2019-12-19 味の素株式会社 抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩
WO2019240288A1 (ja) 2018-06-14 2019-12-19 味の素株式会社 抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩
JP2020019723A (ja) * 2018-07-30 2020-02-06 国立大学法人 鹿児島大学 抗ＣＤ７０抗体とＩｇＧ結合ペプチドの複合体
WO2020090979A1 (ja) 2018-10-31 2020-05-07 味の素株式会社 抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩
WO2021075544A1 (ja) 2019-10-18 2021-04-22 日本メジフィジックス株式会社 Ｒｉ標識されたヒト化抗体
WO2021075546A1 (ja) 2019-10-18 2021-04-22 日本メジフィジックス株式会社 放射性金属標識抗体の製造方法
WO2021080008A1 (ja) 2019-10-24 2021-04-29 国立大学法人 鹿児島大学 １価ｃｃａｐ生成物の製造方法
JPWO2020075670A1 (ja) * 2018-10-10 2021-09-02 国立大学法人 鹿児島大学 ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法
WO2021215462A1 (ja) 2020-04-23 2021-10-28 ブライトパス・バイオ株式会社 改良ペプチドワクチン
WO2022004805A1 (ja) 2020-06-30 2022-01-06 株式会社ガイアバイオメディシン Ｎｋ細胞と抗体との結合を安定化する方法、及びその利用
WO2022080481A1 (ja) 2020-10-16 2022-04-21 日本メジフィジックス株式会社 抗ｈｅｒ２抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
WO2022080385A1 (ja) * 2020-10-13 2022-04-21 国立大学法人京都大学 ペプチド、およびペプチドを用いる抗体の修飾
WO2022097500A1 (ja) 2020-11-09 2022-05-12 国立大学法人 鹿児島大学 ペプチド架橋剤及び当該架橋剤で架橋された架橋ペプチド
WO2022149578A1 (ja) 2021-01-08 2022-07-14 日本メジフィジックス株式会社 Ａｃ－２２５溶液の製造方法およびＡｃ－２２５溶液を用いた医薬の製造方法
WO2022154116A1 (ja) 2021-01-18 2022-07-21 味の素株式会社 化合物またはその塩、およびそれらにより得られる抗体
WO2022191283A1 (ja) 2021-03-11 2022-09-15 味の素株式会社 化合物またはその塩、およびそれらにより得られる抗体
WO2022196675A1 (ja) 2021-03-16 2022-09-22 味の素株式会社 複合体またはその塩、およびその製造方法
WO2022211051A1 (ja) 2021-03-31 2022-10-06 日本メジフィジックス株式会社 抗ｅｇｆｒ抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
WO2022225007A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 放射性抗腫瘍剤
WO2022224980A1 (ja) 2021-04-20 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 抗ｃｄ２０抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
WO2022225006A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 β線を放出する核種で標識されたヒト化抗体
WO2023033022A1 (ja) 2021-08-31 2023-03-09 日本メジフィジックス株式会社 脱グリコシル化抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
WO2023038082A1 (ja) 2021-09-08 2023-03-16 国立大学法人 鹿児島大学 化合物、化合物の塩、抗体修飾試薬、修飾抗体の製造方法及び修飾抗体
TWI837077B (zh) 2016-06-13 2024-04-01 國立大學法人鹿兒島大學 藉由IgG結合肽之部位特異性RI標識抗體

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020153774A1 (ko) * 2019-01-23 2020-07-30 앱티스 주식회사 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도
US20230158167A1 (en) * 2019-03-08 2023-05-25 AbTis Co., Ltd. Site-specific antibody conjugation and antibody-drug conjugate as specific embodiment thereof
JP2021049375A (ja) * 2020-12-09 2021-04-01 株式会社三洋物産 遊技機
WO2022178754A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Shanghai Allygen Biologics Co., Ltd. Targeting conjugates with therapeutic agents and oligonucleotides and uses thereof
WO2022178753A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Shanghai Allygen Biologics Co., Ltd. Targeting conjugates comprising targeting moiety binding fragments and uses thereof
KR20240041378A (ko) * 2021-07-09 2024-03-29 브라이트 피크 테라퓨틱스 아게 체크포인트 억제제와 il-2의 접합체 및 이의 용도
WO2024096577A1 (ko) * 2022-11-01 2024-05-10 앱티스 주식회사 Fc 결합성 유닛을 포함하는 화합물 및 이를 이용하여 제조된 컨쥬게이트

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013027796A1 (ja) * 2011-08-24 2013-02-28 大塚化学株式会社 IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4751286A (en) * 1985-11-19 1988-06-14 The Johns Hopkins University Protein label and drug delivery system
FR2604092B1 (fr) 1986-09-19 1990-04-13 Immunotech Sa Immunoreactifs destines a cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo
US6013763A (en) * 1996-06-04 2000-01-11 Genentech, Inc. Peptide variants of protein A
WO1999066951A2 (en) 1998-06-22 1999-12-29 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
JP2005532343A (ja) 2002-05-29 2005-10-27 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 脳およびｃｎｓ腫瘍の放射免疫治療のための方法および組成物
AU2009270805B2 (en) * 2008-07-18 2016-11-03 Trinity Therapeutics, Inc. Methods for treating immune-mediated dengue fever infections and antibody-dependent enhancement of dengue fever infections, including dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome
US9593147B2 (en) * 2010-05-24 2017-03-14 Kagoshima University IgA-binding peptide and purification of IgA using the same
EP2614371B1 (en) 2010-09-06 2017-04-05 GE Healthcare Bio-Sciences AB Method for labeling of compounds
JP6959616B2 (ja) * 2016-06-13 2021-11-02 国立大学法人 鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチドによる部位特異的ＲＩ標識抗体
CN112789295B (zh) * 2018-10-10 2023-08-15 国立大学法人鹿儿岛大学 包含IgG结合肽的固相担载体及IgG的分离方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013027796A1 (ja) * 2011-08-24 2013-02-28 大塚化学株式会社 IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUZE N. ET AL.: "Molecular structure of 1,3-dichloropropanone by gas-phase electron diffraction combined with ab initio calculations.", J. MOL. STRUCT., vol. 612, no. 2-3, 2002, pages 171 - 180, XP055331173 *
See also references of EP3299383A4 *

Cited By (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017217347A1 (ja) * 2016-06-13 2017-12-21 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチドによる部位特異的ＲＩ標識抗体
TWI837077B (zh) 2016-06-13 2024-04-01 國立大學法人鹿兒島大學 藉由IgG結合肽之部位特異性RI標識抗體
WO2018061509A1 (ja) 2016-09-30 2018-04-05 富士フイルム株式会社 環状ペプチド、アフィニティクロマトグラフィー担体、標識化抗体、抗体薬物複合体および医薬製剤
WO2018092867A1 (ja) * 2016-11-18 2018-05-24 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法
WO2018199337A1 (ja) 2017-04-28 2018-11-01 味の素株式会社 可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩
CN110637036A (zh) * 2017-04-28 2019-12-31 味之素株式会社 具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐
JPWO2018230257A1 (ja) * 2017-06-16 2020-04-30 国立大学法人 鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチド、及び該ペプチドによる抗体の特異的修飾
WO2018230257A1 (ja) * 2017-06-16 2018-12-20 国立大学法人鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチド、及び該ペプチドによる抗体の特異的修飾
US11472865B2 (en) 2017-06-16 2022-10-18 Kagoshima University IgG-binding peptide, and specific modification of antibody with said peptide
JP7291395B2 (ja) 2017-06-16 2023-06-15 国立大学法人 鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチド、及び該ペプチドによる抗体の特異的修飾
WO2019203191A1 (ja) 2018-04-16 2019-10-24 日本メジフィジックス株式会社 修飾抗体、および、放射性金属標識抗体
KR20200143366A (ko) 2018-04-16 2020-12-23 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 수식 항체 및 방사성 금속 표지 항체
US11701440B2 (en) 2018-04-16 2023-07-18 Nihon Medi-Physics Co., Ltd. Modified antibody and radioactive metal-labelled antibody
WO2019240288A1 (ja) 2018-06-14 2019-12-19 味の素株式会社 抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩
JPWO2019240288A1 (ja) * 2018-06-14 2021-07-26 味の素株式会社 抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩
WO2019240287A1 (ja) 2018-06-14 2019-12-19 味の素株式会社 抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩
JP2020019723A (ja) * 2018-07-30 2020-02-06 国立大学法人 鹿児島大学 抗ＣＤ７０抗体とＩｇＧ結合ペプチドの複合体
JP7117741B2 (ja) 2018-10-10 2022-08-15 国立大学法人 鹿児島大学 ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法
JPWO2020075670A1 (ja) * 2018-10-10 2021-09-02 国立大学法人 鹿児島大学 ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法
WO2020090979A1 (ja) 2018-10-31 2020-05-07 味の素株式会社 抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩
WO2021075546A1 (ja) 2019-10-18 2021-04-22 日本メジフィジックス株式会社 放射性金属標識抗体の製造方法
KR20220083768A (ko) 2019-10-18 2022-06-20 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법
WO2021075544A1 (ja) 2019-10-18 2021-04-22 日本メジフィジックス株式会社 Ｒｉ標識されたヒト化抗体
KR20220087468A (ko) 2019-10-24 2022-06-24 가고시마 유니버시티 1가 ccap 생성물의 제조 방법
WO2021080008A1 (ja) 2019-10-24 2021-04-29 国立大学法人 鹿児島大学 １価ｃｃａｐ生成物の製造方法
WO2021215462A1 (ja) 2020-04-23 2021-10-28 ブライトパス・バイオ株式会社 改良ペプチドワクチン
WO2022004805A1 (ja) 2020-06-30 2022-01-06 株式会社ガイアバイオメディシン Ｎｋ細胞と抗体との結合を安定化する方法、及びその利用
WO2022080385A1 (ja) * 2020-10-13 2022-04-21 国立大学法人京都大学 ペプチド、およびペプチドを用いる抗体の修飾
WO2022080481A1 (ja) 2020-10-16 2022-04-21 日本メジフィジックス株式会社 抗ｈｅｒ２抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
KR20230088764A (ko) 2020-10-16 2023-06-20 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 항her2 항체의 방사성 복합체, 및 방사성 의약
WO2022097500A1 (ja) 2020-11-09 2022-05-12 国立大学法人 鹿児島大学 ペプチド架橋剤及び当該架橋剤で架橋された架橋ペプチド
WO2022149578A1 (ja) 2021-01-08 2022-07-14 日本メジフィジックス株式会社 Ａｃ－２２５溶液の製造方法およびＡｃ－２２５溶液を用いた医薬の製造方法
US11752223B2 (en) 2021-01-08 2023-09-12 Nihon Medi-Physics Co., Ltd. Method for producing Ac-225 solution and method for producing medicine using Ac-225 solution
WO2022154116A1 (ja) 2021-01-18 2022-07-21 味の素株式会社 化合物またはその塩、およびそれらにより得られる抗体
WO2022191283A1 (ja) 2021-03-11 2022-09-15 味の素株式会社 化合物またはその塩、およびそれらにより得られる抗体
KR20230154853A (ko) 2021-03-11 2023-11-09 아지노모토 가부시키가이샤 화합물 또는 이의 염, 및 이들에 의해 얻어지는 항체
WO2022196675A1 (ja) 2021-03-16 2022-09-22 味の素株式会社 複合体またはその塩、およびその製造方法
WO2022211051A1 (ja) 2021-03-31 2022-10-06 日本メジフィジックス株式会社 抗ｅｇｆｒ抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
WO2022224980A1 (ja) 2021-04-20 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 抗ｃｄ２０抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
WO2022225006A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 β線を放出する核種で標識されたヒト化抗体
WO2022225007A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 放射性抗腫瘍剤
WO2023033022A1 (ja) 2021-08-31 2023-03-09 日本メジフィジックス株式会社 脱グリコシル化抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
WO2023038082A1 (ja) 2021-09-08 2023-03-16 国立大学法人 鹿児島大学 化合物、化合物の塩、抗体修飾試薬、修飾抗体の製造方法及び修飾抗体
KR20240052833A (ko) 2021-09-08 2024-04-23 가고시마 유니버시티 화합물, 화합물의 염, 항체 수식 시약, 수식 항체의 제조 방법 및 수식 항체

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