KR20220083768A - 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법은, 방사성 금속 착체와, 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 항체를 클릭 반응시켜서, 방사성 금속 표지 항체를 생성하는 공정을 갖는다. 클릭 반응은, 방사성 금속 착체가 구비하는 제1 원자단과, 펩티드에 직접적 또는 간접적으로 연결되어 있는 제2 원자단 간에 실행된다. 제2 원자단은, 아지드를 포함하는 원자단이거나, 또는 trans-시클로옥텐을 포함하는 원자단이다.
Description
본 발명은 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
항체는, 항체가 갖는 표적 분자에 대한 특이성을 이용하여, 표적 분자의 검출을 위한 시약, 진단약, 또는, 질환의 치료를 위한 의약품으로서 사용되고 있다. 검출 성능 및 치료 효과의 더한층 향상을 목적으로 하여, 방사성 핵종이나 약제가 결합한 항체에 관한 검토가 진행되고 있다.
특허문헌 1에는, 13 내지 17 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 인간 항체와 결합 가능한 펩티드가 기재되어 있다. 동 문헌에는, 상기 펩티드가, 방사성 동위 원소를 포함하는 착체 등의 표지 물질이나 항암제 등의 약제에 의해 수식 가능함, 및 해당 펩티드와 항체의 복합체를 형성 가능함도 기재되어 있다.
특허문헌 2에는, 방사성 금속인 111In의 DTPA 착체에 의해 수식된 펩티드와, 항체의 복합체가 기재되어 있다. 이 항체 복합체는, 종양에 발현한 표적 분자에 특이적으로 결합하는 것도 기재되어 있다.
그런데, 방사성 금속 착체가 결합한 항체를 제조할 때에, 사용하는 배위자 및 방사성 금속의 조합에 따라서는, 착체의 형성 효율을 높이기 위하여 반응계를 가열할 필요가 있다. 그러나, 이 조건에서는, 항체가 가열 변성되어버리므로, 목적으로 하는 항체를 얻을 수 없다. 이러한 문제점을 해결하는 반응 조건에 대해서, 특허문헌 1 및 2에서는 전혀 검토되고 있지 않다.
따라서, 본 발명의 과제는, 온화한 반응 조건이더라도, 항체에 대한 방사성 금속의 표지 효율이 우수한 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 방사성 금속 착체와, 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 항체를 클릭 반응시켜서, 방사성 금속 표지 항체를 생성하는 공정을 갖고,
클릭 반응은, 방사성 금속 착체가 구비하는 제1 원자단과, 펩티드에 직접적 또는 간접적으로 연결되어 있는 제2 원자단 간에 실행되고,
제2 원자단이, 아지드기를 포함하는 원자단이거나, 또는 trans-시클로옥텐을 포함하는 원자단인, 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 방사성 금속 표지 항체로서,
방사성 금속 착체가 펩티드에 직접적 또는 간접적으로 연결되어 있고, 해당 펩티드와 해당 방사성 금속 착체 간에 하기 식 (10a)로 표시되는 트리아졸 골격 함유 구조를 가지거나, 또는 해당 펩티드와 해당 방사성 금속 착체 간에 피리다진 골격 함유 구조를 갖는 방사성 금속 표지 항체를 제공하는 것이다.
(식 중, R1A는 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, R2A는 펩티드와의 결합 부위를 나타낸다.)
또한 본 발명은 방사성 금속에 배위하는 킬레이트부와, 클릭 반응 가능한 제1 원자단을 구비하는 수식부를 갖고, 제1 원자단이 하기 식 (1a) 또는 (1b)의 어느 것으로 표시되는 원자단인, 킬레이트 링커를 제공하는 것이다.
(식 (1a) 중, R1은, 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, 식 (1b) 중, R3 및 R4 중 한쪽이 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, 다른 쪽이 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타낸다.)
또한 본 발명은 하기 식 (i)로 표시되는, 13 내지 17 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 펩티드 수식 항체로서,
펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 클릭 반응 가능한 제2 원자단을 갖고, 제2 원자단이, 하기 식 (2a) 또는 (2b)의 어느 것으로 표시되는 원자단인, 펩티드 수식 항체를 제공하는 것이다.
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) …(i)
(식 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는, 각각, 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고,
X는, 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기의 어느 것도 갖지 않는 아미노산 잔기이며,
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이고, 또한 a+b+c+d≤14를 충족하고,
Xaa1 및 Xaa3은, 각각 독립적으로,
측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 또한, 디술피드 결합을 통하여 결합하고 있거나 혹은 술피드기가 링커를 통하여 결합하고 있거나,
또는,
한쪽이, 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 다른 쪽이, 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 또한, 티오에테르 결합을 통하여 결합하고 있고,
Xaa2는, 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산이다.)
(식 (2a) 중, R2는, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단과의 결합 부위를 나타내고, 식 (2b) 중, R5는, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단과의 결합 부위를 나타낸다.)
본 발명에 따르면, 온화한 반응 조건이더라도, 항체에 대한 방사성 금속의 표지 효율이 우수하다.
이하, 본 발명의 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법을, 그의 바람직한 실시 형태에 기초하여 설명한다.
본 발명의 제조 방법은, 방사성 금속 착체와, 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 항체(이하, 이것을 간단히 「펩티드 수식 항체」라고도 한다.)를 클릭 반응시켜서, 방사성 금속 표지 항체를 생성하는 공정(표지 공정)을 구비하고 있다. 방사성 금속 및 그의 착체, 그리고 펩티드의 상세는 후술한다.
방사성 금속 착체 및 펩티드 수식 항체는, 클릭 반응 가능한 원자단을 각각 갖고 있고, 이들 원자단이 서로 반응하여, 방사성 금속 착체와 펩티드 수식 항체를 서로 결합할 수 있게 되어 있다. 즉, 본 공정에 있어서의 클릭 반응은, 방사성 금속 착체가 구비하는 제1 원자단과, 펩티드 수식 항체에 있어서의 펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되어 있는 제2 원자단 간에 실행되는 것이다.
「직접적으로 또는 간접적으로」란, 제2 원자단과 펩티드 간에, 후술하는 링커 구조를 갖고 있는지의 여부를 가리킨다. 「직접적으로」란, 링커 구조를 갖고 있지 않은 것을 가리키고, 상세하게는, 제2 원자단이 링커 구조를 통하지 않고 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 결합하고 있는 것을 가리킨다. 또한, 「간접적으로」란, 링커 구조를 갖고 있는 것을 가리키고, 상세하게는, 제2 원자단이 링커 구조를 통하여 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 결합하고 있는 것을 가리킨다. 「직접적으로」 혹은 「간접적으로」의 어느 양태이든, 제2 원자단은, 펩티드의 N 말단측에 결합하고 있는 것이 바람직하다.
상술한 링커 구조는, 이하의 식 (S1)로 표시된다.
**-((L1)m-Z)k-L2-AG2 …(S1)
(식 중, **은, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단과의 결합 부위를 나타내고,
L1은, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 링커부이며,
m은, 1 이상 50 이하의 정수이며,
Z는, (L1)m과 L2를 결합하는 제2 링커부이며,
k는, 0 또는 1이며,
L2는, 제2 PEG 링커부이며,
AG2는 제2 원자단이다.)
상기 식 (S1)에 있어서, Z의 구조는, (L1)m과 L2를 서로 결합하는 링커 구조이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1 이상 5 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우, Z에 포함되는 아미노산 서열은, 시스테인 잔기를 포함하는 것이 바람직하고, 시스테인 잔기의 티올기와 말레이미드기의 결합에 의해 형성된 티오에테르기를 통하여 L2와 결합하고 있는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, L2를 구성하는 PEG 링커부는, 이하의 식 (P1)에 표시되는 구조를 갖고 있는 것이 바람직하다. 식 (P1) 중, n은 정수이며, 바람직하게는 1 이상 50 이하, 보다 바람직하게는 1 이상 20 이하, 더욱 바람직하게는 2 이상 10 이하이다.
PEG 링커부의 구조의 일단부는, 시판되고 있는 PEG화 시약에서 유래되는 구조 또는 PEG화할 때에 통상적으로 사용되는 시약에서 유래되는 구조에 의해 수식되어 있어도 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 디글리콜산 또는 그의 유도체, 말레이미드 또는 그의 유도체에서 유래되는 구조가 예시된다.
본 공정에 있어서, 클릭 반응 가능한 원자단의 조합으로서는, 클릭 반응의 종류에 따라 적절한 것이 선택되어, 예를 들어, 알킨과 아지드의 조합, 1,2,4,5-테트라진과 알켄의 조합 등을 들 수 있다. 이들 원자단은, 제1 원자단이 상기 원자단 중 1개를 갖고, 제2 원자단이 제1 원자단의 조합이 되는 원자단을 갖고 있으면 된다. 방사성 금속 착체 및 펩티드 수식 항체의 안정성과, 이들의 결합 효율의 향상을 양립하는 관점에서, 제1 원자단이 알킨이며 또한 제2 원자단이 아지드이거나, 또는 제1 원자단이 1,2,4,5-테트라진이며 또한 제2 원자단이 알켄인 것이 바람직하다. 이러한 원자단의 조합에 의한 클릭 반응의 구체예로서, 휘스겐 환화 부가 반응, 혹은 역전자 요청형 딜스알더 반응 등을 들 수 있다.
클릭 반응 가능한 원자단의 조합의 구체예로서는, 이하의 식에 나타내는 바와 같이, 제1 원자단의 알킨으로서 디벤질시클로옥틴(DBCO)을 포함하는 원자단(식 (1a))과, 제2 원자단의 아지드로서 아지드기를 포함하는 원자단(식 (2a))의 조합, 혹은, 제1 원자단이 1,2,4,5-테트라진을 포함하는 원자단(식 (1b))과, 제2 원자단의 알켄으로서 trans-시클로옥텐(TCO)을 포함하는 원자단(식 (2b))의 조합을 들 수 있다.
(식 (1a) 중, R1은, 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, 식 (2a) 중, R2는, 펩티드 수식 항체에 있어서의 펩티드와의 결합 부위를 나타낸다.)
(식 (1b) 중, R3 및 R4 중 한쪽이 다른 구조와의 결합 부위를 나타내고, 다른 쪽이 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타내고, 식 (2b) 중, R5는, 다른 구조와의 결합 부위를 나타낸다.)
본 공정은, 방사성 금속 착체와 펩티드 수식 항체가 클릭 반응 가능하다면, 이들의 첨가 순서는 묻지 않고, 예를 들어, 용매를 수용한 반응 용기에, 방사성 금속 착체 및 펩티드 수식 항체의 한쪽을 첨가하고, 이어서 다른 쪽을 첨가하여 반응시켜도 되고, 방사성 금속 착체 및 펩티드 수식 항체의 한쪽을 용매에 분산한 분산액에 다른 쪽을 첨가하여 반응시켜도 된다. 혹은, 용매를 수용한 반응 용기에, 이들을 동시에 첨가하여 반응시켜도 된다.
본 공정에 사용되는 용매로서는, 물을 포함하는 용매를 사용할 수 있고, 예를 들어, 물, 생리 식염수, 또는 아세트산나트륨 완충액, 아세트산암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, 트리스히드록시메틸아미노메탄 완충액(이하, 간단히 「Tris 완충액」이라고 함), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 완충액(이하, 간단히 「HEPES 완충액」이라고 함), 혹은 테트라메틸암모늄아세트산 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다. 완충액을 사용하는 경우, 착체 및 항체의 안정성과, 이들의 결합 효율을 양립하는 관점에서, 25℃에서의 pH로서, 하한은, 3.5 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 4.0 이상, 더욱 바람직하게는 4.5 이상, 보다 더욱 바람직하게는 5.0 이상, 특히 바람직하게는 5.5 이상이며, 상한은, 바람직하게는 10.0 이하, 보다 바람직하게는 9.5 이하, 더욱 바람직하게는 9.0 이하, 보다 더욱 바람직하게는 8.5 이하, 특히 바람직하게는 8.0 이하이고, 바람직한 범위로서 4.0 이상 10.0 이하, 더욱 바람직한 범위로서 5.5 이상 8.5 이하로 한다.
펩티드 수식 항체의 의도하지 않는 변성을 방지하면서, 방사성 금속 착체와 펩티드 수식 항체의 결합 효율을 높이는 관점에서, 본 공정에 있어서의 클릭 반응은, 반응 온도로서, 상한은, 120℃ 이하가 바람직하고, 90℃ 이하가 보다 바람직하고, 50℃ 이하가 더욱 바람직하고, 보다 더욱 바람직하게는 40℃ 이하이다. 또한 반응 온도의 하한은, 클릭 반응 가능한 온도이면 특별히 제한은 없지만, 10℃ 이상이 바람직하고, 15℃ 이상이 보다 바람직하고, 20℃ 이상이 더욱 바람직하고, 30℃ 이상이 보다 더욱 바람직하고, 35℃ 이상이 특히 바람직하다. 클릭 반응의 반응 시간은, 상술한 반응 온도인 것을 조건으로 하여, 하한은, 5분 이상이 바람직하고, 10분 이상이 보다 바람직하고, 20분 이상이 더욱 바람직하고, 30분 이상이 보다 더욱 바람직하고, 60분 이상이 특히 바람직하고, 상한은, 36시간 이하가 바람직하고, 24시간 이하가 보다 바람직하고, 20시간 이하가 보다 더욱 바람직하고, 15시간 이하가 특히 바람직하고, 바람직한 범위는 5분 이상 24시간 이하, 더욱 바람직한 범위는 10분 이상 20시간 이하이다.
반응액량은 특별히 한정되지 않지만, 제조 공정에 있어서의 실용성의 관점에서, 본 공정의 개시 시에 있어서, 하한은, 0.01mL 이상이 바람직하고, 0.1mL 이상이 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1mL 이상이며, 상한은, 1000mL 이하가 바람직하고, 100mL 이하가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10mL 이하이고, 예를 들어, 0.1mL 이상 10mL 이하가 바람직하다. 또한, 방사성 금속 착체 및 펩티드 수식 항체의 반응액 중의 농도는, 각각 독립적으로, 본 공정의 개시 시에 있어서, 하한은 0.01μmol/L 이상이 바람직하고, 0.1μmol/L 이상이 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1μmol/L 이상이며, 상한은, 10000μmol/L 이하가 바람직하고, 1000μmol/L 이하가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 100μmol/L 이하이고, 예를 들어 1μmol/L 이상 100μmol/L 이하인 것이, 목적으로 하는 방사성 금속 표지 항체의 수량의 관점에서 바람직하다.
얻어진 방사성 금속 표지 항체는, 이것을 그대로 사용해도 되고, 혹은, 여과 필터, 멤브레인 필터, 여러가지 충전제를 충전한 칼럼, 크로마토그래피 등을 사용하여 정제해도 된다.
상술한 공정을 갖는 본 발명의 제조 방법에 의하면, 온화한 반응 조건에서, 방사성 금속 착체와 펩티드 수식 항체를 결합시켜서, 방사성 금속에 의해 표지된 항체를 수율 높게 얻을 수 있다. 또한, 얻어지는 표지 항체는, 항체의 항원 특이성을 저해하지 않는 부위에 특이적으로 표지를 행할 수 있으므로, 항체 자체가 갖는 항원 특이성이 유지된 것이 된다. 특히 상기 공정은, 방사성 금속 착체와 펩티드 수식 항체의 결합 반응을 촉진시키기 위한 가열 처리를 행하지 않더라도, 착체와 항체의 결합 반응을 충분히 또한 단시간에 진행시킬 수 있으므로, 양전자 방출 핵종 등의 반감기가 짧은 방사성 금속을 사용한 경우일지라도, 방사 화학적 순도 및 방사 화학적 수율이 높은 표지 항체를 단시간에 얻을 수 있다.
본 발명의 제조 방법은, 표지 항체의 용도 및 목적에 따라, 표지하는 방사성 금속을 특별히 제한없이 사용 가능하게 하는 관점에서, 리간드와 방사성 금속을 반응시켜서, 방사성 금속 착체를 형성하는 공정(착체 형성 공정)을 표지 공정 전에 구비하는 것이 바람직하다. 본 공정에 있어서 사용되는 리간드는, 제1 원자단을 갖고 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 공정에 있어서의 방사성 금속은, 착체 형성 효율을 높이는 관점에서, 전리 가능한 방사성 금속 화합물의 양태에서 사용하는 것이 바람직하고, 방사성 금속 이온의 양태에서 사용하는 것이 더욱 바람직하다(이하, 이들 양태를 총칭하여 「방사성 금속원」이라고도 한다.).
또한, 리간드와 방사성 금속의 조합에 의존하지 않고, 방사성 금속 착체의 형성 효율을 높이는 관점에서, 착체 형성 공정에 있어서, 리간드와 방사성 금속을 가열하여 반응시키는 것이 바람직하다. 이 점에 대해서, 리간드와 방사성 금속의 조합에 따라서는, 비가열 조건 하에서는 착체 형성이 양호하게 진행하지 않는 경우가 있는 바, 방사성 금속 이온이 배위한 착체의 형성을 가열 조건 하에서 행함으로써, 리간드와 방사성 금속의 조합에 의존하지 않고, 착체 형성을 효율적으로 진행시킬 수 있다.
착체 형성 공정은, 방사성 금속 이온과 착체 형성이 가능하다면, 리간드와 방사성 금속원의 첨가 순서는 묻지 않고, 예를 들어, 용매를 수용한 반응 용기에, 리간드 및 방사성 금속원의 한쪽을 첨가하고, 이어서 다른 쪽을 첨가하여 반응시켜도 되고, 리간드 및 방사성 금속원의 한쪽을 용매에 분산한 분산액에 다른 쪽을 첨가하여 반응시켜도 된다. 혹은, 용매를 수용한 반응 용기에, 이들을 동시에 첨가하여 반응시켜도 된다.
착체 형성 공정에 있어서의 반응 조건으로서는, 예를 들어 이하의 조건으로 할 수 있다. 본 공정에서 사용되는 용매로서는, 예를 들어 물, 생리 식염수, 또는 아세트산나트륨 완충액, 아세트산암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, Tris 완충액, HEPES 완충액, 혹은 테트라메틸암모늄아세트산 완충액 등의 완충액 등, 혹은 탄소수 1 이상 5 이하의 알코올, 아세토니트릴, N,N-디메틸포르미아미드, 테트라히드로푸란, 디메틸술폭시드 및 아세톤 등의 수용성 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있다. 반응 온도로서는, 예를 들어 실온(25℃)이어도 되고, 가열 조건 하여도 되지만, 리간드의 분해 억제와 착체의 형성 효율 향상을 양립하는 관점에서, 상한은, 120℃ 이하가 바람직하고, 90℃ 이하가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 50℃ 이하이고, 40℃ 이하에서 행하는 것이 보다 더욱 바람직하다. 하한은, 클릭 반응 가능한 온도이면 특별히 제한은 없지만, 0℃ 이상이 바람직하고, 10℃ 이상이 보다 바람직하고, 15℃ 이상이 더욱 바람직하고, 20℃ 이상이 보다 더욱 바람직하고, 30℃ 이상이 보다 더한층 바람직하고, 35℃ 이상이 특히 바람직하다. 바람직하게는 30℃ 이상 100℃ 이하, 더욱 바람직하게는 37℃ 이상 90℃ 이하로 가열한다. 반응 시간은, 상술한 반응 온도인 것을 조건으로 하여, 하한은, 5분 이상이 바람직하고, 10분 이상이 보다 바람직하고, 20분 이상이 더욱 바람직하고, 30분 이상이 보다 더욱 바람직하고, 특히 바람직하게는 60분 이상이며, 상한은, 300분 이하가 바람직하고, 150분 이하가 보다 바람직하고, 120분 이하가 더욱 바람직하고, 특히 바람직하게는 60분 이하이고, 바람직하게는 10분 이상 150분 이하, 더욱 바람직하게는 30분 이상 60분 이하이다.
착체 형성 공정에 있어서의 방사성 금속원은, 예를 들어, 물을 주체로 하는 용매에, 방사성 금속 이온이 분산 또는 용해된 용액을 사용할 수 있다.
본 공정에 있어서의 반응액량은 특별히 한정되지 않지만, 제조 공정에 있어서의 실용성의 관점에서, 본 공정의 개시 시에 있어서, 하한은, 0.01mL 이상이 바람직하고, 0.1mL 이상이 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1mL 이상이며, 상한은, 1000mL 이하가 바람직하고, 100mL 이하가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10mL 이하이고, 예를 들어, 0.01mL 이상 100mL 이하가 바람직하다. 또한, 리간드 및 방사성 금속 이온의 반응액 중의 농도는, 각각 독립적으로, 본 공정의 개시 시에 있어서, 하한은 0.01μmol/L 이상이 바람직하고, 0.1μmol/L 이상이 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1μmol/L 이상이며, 상한은, 10000μmol/L 이하가 바람직하고, 1000μmol/L 이하가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 100μmol/L 이하이고, 예를 들어 1μmol/L 이상 100μmol/L 이하인 것이, 목적으로 하는 방사성 금속 착체의 수율의 관점에서 바람직하다. 리간드 및 방사성 금속 이온의 몰 비율은, 사용하는 리간드 및 방사성 금속 이온의 종류에 따라 다르기도 하지만, 리간드/방사성 금속 이온으로서, 하한은, 10/1 이상이 바람직하고, 100/1 이상이 보다 바람직하고, 200/1 이상, 300/1 이상이 더욱 바람직하고, 보다 더욱 바람직하게는 500/1 이상이며, 상한은, 10000/1 이하가 바람직하고, 9000/1 이하가 보다 바람직하고, 8000/1 이하가 더욱 바람직하고, 보다 더욱 바람직하게는 7000/1 이하이고, 바람직하게는 200/1 이상 10000/1 이하, 특히 바람직하게는 500/1 이상 7000/1 이하의 범위이다.
얻어진 방사성 금속 착체는, 이것을 그대로 사용해도 되고, 혹은, 여과 필터, 멤브레인 필터, 여러가지 충전제를 충전한 칼럼, 크로마토그래피 등을 사용하여 정제해도 된다. 특히 본 공정은, 검출이 곤란한 저에너지 방사선이나, α선을 방출하는 방사성 금속 핵종을 사용한 경우에도, 착체 형성이 양호하게 진행하고, 생성물의 수율이 높으므로, 해당 방사성 금속 핵종을 포함하는 착체를 미정제의 상태에서 이후의 공정에 제공할 수 있는 점에서 유리하다.
리간드와 방사성 금속 이온의 반응의 반응 효율의 향상과, 얻어지는 착체와 펩티드 수식 항체의 클릭 반응의 반응 효율의 향상을 양립하는 관점에서, 리간드는, 방사성 금속 이온이 배위하는 부위인 킬레이트부와, 제1 원자단과 결합한 수식부를 갖는 것이 바람직하다.
이하의 식 (3a)로 표시되는 바와 같이, 수식부(식 (3a) 중, Rm으로 나타낸다.)는 상술한 킬레이트부(식 (3a) 중, Ch로 나타낸다.)와 결합되어 있고, 또한 상술한 제1 원자단(식 (3a) 중, AG로 나타낸다.)이 결합하고 있는 것이다. 식 (3a) 중, Rm은, 직쇄 또는 분지쇄이며, 치환 또는 비치환이며, 또한 총 탄소 원자수 10 이상 50 이하의 원자단이다.
수식부(Rm)는, 리간드와 방사성 금속 이온의 착체 형성이 가능하다면, 킬레이트부(Ch)와의 결합 양식에 특별히 제한은 없지만, 리간드와 방사성 금속 이온의 착체 형성을 효율적으로 행하는 관점에서, 수식부(Rm)와 킬레이트부(Ch)가 티오우레아 결합을 형성하여 결합하거나, 또는 수식부(Rm)와 킬레이트부(Ch)가 아미드 결합을 형성하여 결합하는 것이 바람직하다. 또한, 방사성 금속 착체와 항체의 표지 효율을 높이는 관점에서, 수식부(Rm)는, 제1 원자단에 있어서의 상기 식 (1a) 및 식 (1b)로 표시되는 R1 및 R3 또는 R4와 결합하고 있는 것도 바람직하다.
방사성 금속 착체와 항체의 표지 효율을 일층 높이는 관점에서, 수식부는, 식 (3a) 중, Rm으로 표시되는 구조 중에, 이하의 식 (P2)에 표시되는 구조가 결합하고 있는 것이 바람직하다. 당해 구조는, 에틸렌글리콜 유래의 구조이며, 식 (P2) 중, r은, 바람직하게는 2 이상 50 이하의 정수, 더욱 바람직하게는 2 이상 30 이하의 정수이다.
또한, 킬레이트부는, 방사성 금속이 배위하는 부위를 구조 중에 갖는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, CB-TE2A(1,4,8,11-테트라아자비시클로(Tetraazabicyclo)[6.6.2]헥사데칸(hexadecane)-4,11-디아세트산(diacetic acid)), CDTA(시클로헥산-trans-1,2-디아민 테트라-아세트산)(Cyclohexane-trans-1,2-diamine tetra-acetic acid), CDTPA(4-시아노-4-[[(도데실티오)티옥소메틸]티오]-펜타노익산)(4-cyano-4-[[(dodecylthio)thioxomethyl]thio]-Pentanoic acid), DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(Tetraazacyclododecane)-1,4,7,10-테트라아세트산(tetraacetic acid)), DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α',α'',α'''-테트라메틸(tetramethyl)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododecane)-1,4,7,10-테트라아세트산(tetraacetic acid)), DOTAM(1,4,7,10-tetrakis(카르바모일메틸(carbamoylmethyl))-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododecane)), DOTA-GA(α-(2-카르복시에틸(Carboxyethyl))-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododecane)-1,4,7,10-테트라아세트산(tetraacetic acid)), DOTP(((1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(Tetraazacyclododecane)-1,4,7,10-테트라일(tetrayl))tetrakis(메틸렌(methylene)))테트라포스폰산(tetraphosphonic acid)), DOTMP(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(Tetraazacyclododecane)-1,4,7,10-tetrakis(메틸렌포스폰산(methylenephosphonic acid))), DOTA-4AMP(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododecane)-1,4,7,10-tetrakis(아세트아미도메틸렌포스폰산(acetamidomethylenephosphonic acid)), D02P(테트라아자시클로도데칸 디메탄포스폰산(Tetraazacyclododecane dimethanephosphonic acid)), 디페록사민(Deferoxamine)(DFO), DTPA(글리신(Glycine), N,N-bis[2-[bis(카르복시메틸(carboxymethyl))아미노(amino)]에틸(ethyl)]-), DTPA-BMA(5,8-Bis(카르복시메틸(carboxymethyl))-11-[2-(메틸아미노(methylamino))-2-옥소에틸(oxoethyl)]-3-옥소(oxo)-2,5,8,11-테트라아자트리데칸(tetraazatridecan)-13-오익산(oic acid)), EDTA(2,2',2'',2'''-(에탄(ethane)-1,2-디일비스(diylbis)(아잔트리일(azanetriyl)))테트라아세트산(tetraacetic acid)), NOTA(1,4,7-트리아자시클로노난(Triazacyclononane)-1,4,7-트리아세트산(triacetic acid)), NOTP(1,4,7-트리아자시클로노난(Triazacyclononane)-1,4,7-트리일트리스(triyltris)(메틸렌포스폰산(methylenephosphonic acid)), TETPA(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸(tetraazacyclotetradecane)-1,4,8,11-테트라프로피온산(tetrapropionic acid)), TETA(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸(Tetraazacyclotetradecane)-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(tetraacetic acid)), TTHA(3,6,9,12-Tetrakis(카르복시메틸(carboxymethyl))-3,6,9,12-테트라아자테트라데칸디오익산(tetraazatetradecanedioic acid)), HEHA(1,2,7,10,13-헥사아자시클로옥타데칸(hexaazacyclooctadecane)-1,4,7,10,13,16-헥사아세트산(hexaacetic acid)), 1,2-HOPO(N,N',N'',N'''-tetra(1,2-디히드로(dihydro)-1-히드록시(hydroxy)-2-옥소피리딘(oxopyridine)-6-카르보닐(carbonyl))-1,5,10,14-테트라아자테트라데칸(tetraazatetradecane)), PEPA(1,4,7,10,13-펜타아자시클로펜타데칸(pentaazacyclopentadecane)-N,N',N'',N''',N''''-펜타-아세트산(penta-acetic acid)), H4옥타파(octapa)(N,N'-bis(6-카르복시(carboxy)-2-피리딜메틸(pyridylmethyl))-에틸렌디아민(ethylenediamine)-N,N'-디아세트산(diacetic acid)), H2비스파(bispa)2(6,6'-({9-히드록시(hydroxy)-1,5-bis(메톡시카르보닐(methoxycarbonyl))-2,4-di(피리딘(pyridine)-2-일(yl))-3,7-디아자비시클로(diazabicyclo)[3.3.1]노난(nonane)-3,7-디일(diyl)}bis(-메틸렌(methylene)))디피콜린산(dipicolinic acid)), H2데드파(dedpa)(1,2-[{6-(카르복시(carboxy))-피리딘(pyridin)-2-일(yl)}-메틸아미노(methylamino)]에탄(ethane)), H2마크로파(macropa)(6-(1,4,10,13-테트라옥사(tetraoxa)-7,16-디아자시클로옥타데칸(diazacyclooctadecan)-N,N'-메틸(methyl))피콜린산(picolinic acid)), H5데카파(decapa)(N,N''-bis(6-카르복시(carboxy)-2-피리딜메틸(pyridylmethyl))-디에틸렌트리아민(diethylenetriamine)-N,N',N''-트리아세트산(triacetic acid)), H6포스파(phospa)(N,N'-(메틸렌포스포네이트(methylenephosphonate))-N,N'-[6-(메톡시카르보닐(methoxycarbonyl))피리딘(pyridin)-2-일(yl)]-메틸(methyl)-1,2-디아미노에탄(diaminoethane)), HP-D03A(히드록시프로필테트라아자시클로도데칸트리아세트산(Hydroxypropyltetraazacyclododecanetriacetic acid)) 혹은 포르피린(porphyrin) 또는 하기 식 (A) 내지 (K)의 어느 하나로 표시되는 것이 바람직하다. 이들 구조는, 후술하는 방사성 금속의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 어느 킬레이트부이더라도, 본 발명의 효과는 충분히 발휘된다.
식 (A) 중, R11, R13 및 R14는, 각각 독립적으로, -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은, -(CHCOOH)(CH2)pCOOH를 포함하는 기이며, R12 또는 R15의 한쪽이, 수소 원자, 카르복실기, 또는, 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이며, 다른 쪽이, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며, p가 0 이상 3 이하의 정수이다.
식 (B) 중, R21, R22, R23 및 R24는, 각각 독립적으로, 카르복실기 또는, 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기인데, R21, R22, R23 또는 R24의 어느 하나의 기가 상기 수식부와 결합하고 있는 기이다.
식 (C) 중, R31, R32, R33 및 R34는, 각각 독립적으로, 수소 원자와 2 이상 10 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자 또는 산소 원자를 포함하고 있어도 되는 원자단을 포함하는 기이며, R35는, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이다.
식 (D) 중, R41 또는 R42의 한쪽이, 수소 원자와 5 이상 20 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 원자단을 포함하는 기이며, 다른 쪽이 상기 수식부와 결합하고 있는 기이다.
식 (E) 중, R51, R52, R53, R54 및 R55는, 각각 독립적으로, 카르복실기, 또는, 탄소 원자수가 2 혹은 3의 카르복시알킬기인데, 단, R51, R52, R53, R54 또는 R55의 어느 하나의 기가, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이다.
식 (F) 중, R61, R62, R63, R64, R65 및 R66은, 각각 독립적으로, 카르복실기, 또는, 탄소 원자수가 2 혹은 3의 카르복시알킬기이며, R67은, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이다.
식 (G) 중, R71 및 R72는, -O(CH2CH2O)nCH3(단, n은 1 이상 5 이하의 정수)이며, R73, R75, R76 및 R78은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며, R74 또는 R77은, 어느 한쪽이 탄소수 1 이상 5 이하의 히드록시알킬기이며, 다른 쪽이 상기 수식부와 결합하고 있는 기이다.
식 (H) 중, R81 및 R82는, 각각 독립적으로, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며, 당해 알킬기의 말단이, 1 이상의 카르복실기로 치환된 피리딜기로 치환되어 있어도 되고, R87은, -CHOH 또는 -C=O인데, R81, R82 또는 R87의 어느 하나의 기가 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며, R83 및 R84는, 치환되어 있어도 되는 피리디닐기이며, R85 및 R86은, 각각 독립적으로, -COORa이며, Ra는 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이다.
식 (I) 중, R91, R92, R93 및 R94는, 각각 독립적으로, -OCH2COOH인데, R91, R92, R93 또는 R94의 어느 하나의 기가, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며, R95, R96, R97 및 R98은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 이상 6 이하의 알킬기이다.
식 (J) 중, R101, R102 및 R103은, 각각 독립적으로, 카르복실기, 혹은, 탄소 원자수가 2 혹은 3의 카르복시알킬기이거나, 또는, 식 (J) 중, R101, R102 및 R103 중 적어도 하나는, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며, 다른 기는, 카르복실기, 혹은, 탄소 원자수가 2 혹은 3의 카르복시알킬기이다.
상기 식 (A) 내지 (J) 중, 「수식부와 결합하고 있는 기」는, 카르복실기, 아미노기, N-히드록시숙신이미드에스테르(NHS)기, 2,6-디옥소테트라히드로-2H-피라닐기, 이소시아네이트기, 또는 이소티오시아네이트기에 유래하는 구조와, 수식부가 결합하고 있는 구조를 나타낸다.
식 (A)로 표시되는 구체적인 구조로서는, 이하의 식 (A-1) 내지 (A-12)로 표시되는 화합물에서 유래하는 구조를 들 수 있다.
식 (B) 및 (C)로 표시되는 구체적인 구조로서는, 이하의 식 (B-1) 내지 (B-2) 및 (C-1) 내지 (C-5)로 표시되는 화합물에서 유래하는 구조를 들 수 있다.
식 (D) 및 (E)로 표시되는 구체적인 구조로서는, 이하의 식 (D-1) 내지 (D-3), 및 (E-1)로 표시되는 화합물에서 유래하는 구조를 들 수 있다.
식 (F) 및 (G)로 표시되는 구체적인 구조로서는, 이하의 식 (F-1) 내지 (F-2), 및 (G-1)로 표시되는 화합물에서 유래하는 구조를 들 수 있다.
식 (H) 및 (I)로 표시되는 구체적인 구조로서는, 이하의 식 (H-1) 내지 (H-4), 및 (I-1)로 표시되는 화합물에서 유래하는 구조를 들 수 있다.
식 (J)로 표시되는 구체적인 구조로서는, 이하의 식 (J-1) 내지 (J-5)로 표시되는 화합물에서 유래하는 구조를 들 수 있다.
킬레이트부와 수식부의 결합 부위는, 상술한 바와 같이 아미드 결합이거나, 티오우레아 결합인 것이 바람직한데, 수율을 보다 높이는 관점에서 아미드 결합이 보다 바람직하다.
아미드 결합은, 예를 들어, 상기 식 (B-1) 내지 (B-2), (G-1), (H-1) 내지 (H-4), (I-1), (J-1) 내지 (J-3)으로 표시되는 화합물의 카르복실기, 상기 식 (A-10)이나 (A-11)의 N-히드록시숙신이미드에스테르(NHS)기, 또는, 상기 (A-12)의 2,6-디옥소테트라히드로-2H-피라닐기와, 제1급 아민의 반응에 의해 형성되거나, 식 (K)로 표시되는 화합물의 도면 중의 우측 단부에 기재된 아미노기와, 히드록시기, 카르복실기, 또는 NHS기를 갖는 시약의 반응에 의해 형성된다. 여기서, 히드록시기를 갖는 시약과 반응시키는 경우에는, 히드록시기를 카르복실기로 변환하여 사용한다. 또한, 티오우레아 결합은, 상기 식 (A-2), (A-3), (D-2) 또는 (F-2)로 표시되는 화합물의 이소티오시아네이트기와, 제1급 아민 또는 말레이미드기의 반응에 의해 형성된다.
수식부는, 원하는 제1 원자단이 결합하고 있고, 제1급 아민을 구비하는 시판하고 있는 시약 혹은 아미드 결합이나 티오우레아 결합을 형성 가능한 시판하고 있는 시약으로부터 여러가지 선택하여 형성할 수 있다.
이러한 시약으로서는, 제1 원자단으로서 상기 식 (1a)로 표시되는 디벤질시클로옥틴(Dibenzylcyclooctyne)(DBCO)을 사용하는 경우에는, DBCO-아민, DBCO-말레이미드, DBCO-PEG-NHS에스테르, DBCO-PEG-알코올, DBCO-PEG-아민, DBCO-PEG-말레이미드 등을 선택할 수 있지만, 바람직하게는 DBCO-아민, DBCO-말레이미드, DBCO-PEG-아민, DBCO-PEG-말레이미드를 선택할 수 있다.
방사성 금속 착체는, 상술한 제1 원자단, 킬레이트부 및 수식부 중에서 적절한 것을 선택된 구조를 갖는 리간드와, 방사성 금속을 반응시켜서 형성된 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 방사성 금속 착체는, 이하의 식 (ii)로 표시되는 구조를 갖는 리간드와 방사성 금속을 반응시켜서 형성된 것인 것이 바람직하다.
A-B-C …(ii)
식 (ii) 중, A는 이하의 식 (iia)로 표시된다.
식 (iia) 중, Ra, Rb 및 Rc는, 독립적으로, -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은, -(CHCOOH)(CH2)pCOOH를 포함하는 기이며, p는 0 이상 3 이하의 정수이며, Rd 또는 Re의 어느 한쪽이, B와의 결합 부위(*)이며, 다른 쪽이 수소 원자이거나, -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은, -(CHCOOH)(CH2)pCOOH를 포함하는 기이며, p는 0 이상 3 이하의 정수이다.
식 (ii) 중, B는 이하의 식 (iib)로 표시된다.
식 (iib) 중, La 및 Lb는, 독립적으로, 적어도 아미드 결합 또는 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, t는 0 이상 30 이하의 정수이며, s는 0 또는 1이며, *은 A와의 결합 부위이며, **은 C와의 결합 부위이다.
식 (ii) 중, C는, 이하의 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체 또는 식 (iid)로 표시되는 테트라진 유도체의 어느 것이다.
식 (iic) 중, X는 CHRk-** 또는 N-**이며, Y는 CHRk 또는 C=O이며, Rk는 독립적으로 수소 원자이거나, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며, X가 CHRk-**이고, Y가 CHRk일 경우에는, Rk 부분이 합쳐져서 시클로알킬기를 형성해도 되고, Rf, Rg, Rh 및 Ri는, 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며, Rf와 Rg가 합쳐지거나, 혹은 Rh와 Ri가 합쳐져서 탄화수소환을 형성해도 되고, **은 B와의 결합 부위를 나타내고, 식 (iid) 중, **은 B와의 결합 부위를 나타내고, Rj는 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타낸다.
또한, 리간드는, A로서, 상기 식 (iia) 중, Ra 내지 Rd가, -(CH2)pCOOH이며, p가 1이며, Re가 B와의 결합 부위인 DOTA 유도체; 또는 Ra 내지 Rc가, -(CH2)pCOOH이며, p가 1이며, Rd가 B와의 결합 부위(*)이며, Re가 수소 원자인 DO3A 유도체 혹은 DOTAGA 유도체의 어느 것이 보다 바람직하다.
식 (ii) 중, A가 상기 DOTA 유도체일 경우, B는, La가 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, s가 0 또는 1이며, s가 1일 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이며, Lb가 아미드 결합 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, C는, 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체이며, 식 (iic) 중, X가 N-**이며, Y가 CHRk이며, Rk가 수소 원자이며, Rf와 Rg가 합쳐져서 벤젠환을 형성하고 있고, Rh와 Ri가 합쳐져서 벤젠환을 형성하고 있고, **은 B와의 결합 부위인, DOTA-PEGt-DBCO 유도체; 또는 B는, La가 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, s가 0 또는 1이며, s가 1일 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이며, Lb가 아미드 결합 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, C는, 식 (iid)로 표시되는 테트라진 유도체인, DOTA-PEGt-Tz 유도체가 더욱 보다 바람직하다.
식 (ii) 중, A가 상기 DO3A 유도체일 경우, B는, La가 아미드 결합 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, s가 0 또는 1이며, s가 1일 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이며, Lb가 아미드 결합 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, C는, 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체이며, 식 (iic) 중, X가 N-**이며, Y가 CHRk이며, Rk가 수소 원자이며, Rf와 Rg가 합쳐져서 벤젠환을 형성하고 있고, Rh와 Ri가 합쳐져서 벤젠환을 형성하고 있고, **은 B와의 결합 부위인, DO3A-PEGt-DBCO 유도체가 더욱 보다 바람직하다.
식 (ii) 중, A가 상기 DOTAGA 유도체일 경우, B는, La가 아미드 결합 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, s가 0 또는 1이며, s가 1일 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이며, Lb가 아미드 결합을 포함하는 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, C는, 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체이며, 식 (iic) 중, X가 N-**이며, Y가 CHRk이며, Rk가 수소 원자이며, Rf와 Rg가 합쳐져서 벤젠환을 형성하고 있고, Rh와 Ri가 합쳐져서 벤젠환을 형성하고 있고, **은 B와의 결합 부위인, DOTAGA-PEGt-DBCO 유도체가 더욱 보다 바람직하다.
이하에, 상술한 각 실시 형태에 공통적으로 적용 가능한 사항에 대하여 설명한다. 본 발명에 사용되는 펩티드 수식 항체는, 항체의 특정한 부위가 펩티드에 의해 특이적으로 수식되어 있고, 바람직하게는 항체의 Fc 영역(정상 영역)이 특이적으로 수식되고, 특히 바람직하게는 항체의 Fc 영역에 있어서의 리신 잔기가 부위 특이적으로 수식되어서 이루어지는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서는, 펩티드와 항체를 반응시켜서, 펩티드 수식 항체를 얻는 공정(항체 수식 공정)을 표지 공정보다도 전에 구비하고 있어도 된다.
본 발명에서 사용되는 항체는, Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드이면 되고, 모노클로날 항체여도 되고, 폴리클로날 항체여도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 모노클로날 항체에는, 항체 변이체(키메라 항체, 인간화 항체 등) 등 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체도 포함된다.
본 발명에서 사용되는 펩티드는, 항체의 Fc 영역에 부위 특이적으로 수식하는 것이면, 쇄상 펩티드여도 되고, 환상 펩티드여도 되지만, 환상 펩티드가 바람직하다. 또한, 하기 식 (i)로 표시되는, 13 내지 17 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 아미노산 서열에 관한 이하의 설명은, 아미노산 서열의 지면 좌측이 N 말단측을 나타내고, 아미노산 서열의 지면 우측이 C 말단측을 나타내는 것으로 하여 설명한다. 펩티드에 연결되어 있는 제2 원자단의 결합 위치는, 제1 원자단과의 사이에서 클릭 반응 가능하다면 특별히 제한은 없지만, 반응성 향상의 관점에서, 바람직하게는 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 제2 원자단을 갖고 있고, 더욱 바람직하게는 펩티드의 N 말단에 제2 원자단을 갖는다.
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) …(i)
상기 식 (i) 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는, 각각, 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고,
X는, 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기의 어느 것도 갖지 않는 아미노산 잔기이며,
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이고, 또한 a+b+c+d≤14를 충족하고,
Xaa1 및 Xaa3은, 각각 독립적으로,
측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 또한, 디술피드 결합을 통하여 결합하고 있거나, 혹은 술피드기가 링커를 통하여 결합하고 있거나, 또는,
한쪽이, 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 다른 쪽이, 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 또한, 티오에테르 결합을 통하여 결합하고 있고,
Xaa2는, 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산이며, 바람직하게는, 가교제로 수식되어 있다.
상기 식 (i)에 있어서의 X에 포함될 수 있는 아미노산 잔기로서는, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 티로신, 메티오닌 등의 아미노산에서 유래되는 것을 들 수 있고, X는, 동일한 종류의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기여도 되고, 각각 다른 종류의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기여도 된다.
식 (i) 중의 a, b, c 및 d는, 상술한 범위 내의 수라면 특별히 제한은 없지만, 펩티드와 항체의 결합 안정성의 관점에서, a+b+c+d≤14를 조건으로 하여, a는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수, b는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수, c는 바람직하게는 3 이상 5 이하의 정수, 및 d는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수이다.
Xaa1 및 Xaa3은, 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기이며, 해당 아미노산은 각각 동일해도 되고, 달라도 된다. 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 시스테인, 호모 시스테인을 들 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는, 디술피드 결합에 의해 결합하고 있거나, 또은 이하의 식 (4)에 표시되는 구조를 통하여, 술피드기가 결합되어 있는 것이 바람직하다. 식 (4) 중, 파선 부분은 술피드기와의 결합 부분을 나타낸다.
Xaa1 및 Xaa3은, 상술한 조합 대신에, Xaa1 및 Xaa3 중 한쪽이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기이며, 다른 쪽이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기여도 된다. 이들은, 티오에테르 결합을 통하여 결합하고 있다. 할로아세틸기는, 그 말단이 요오드 등의 할로겐으로 치환되어 있고, 다른 쪽의 측쇄에 있어서의 티올기와의 반응에 의해 할로겐이 탈리하여, 티오에테르 결합이 형성된다.
식 (i)로 표시되는 펩티드의 구체적인 아미노산 서열은, 예를 들어 국제 공개 2016/186206호 팸플릿, 국제 공개 2017/217347호 팸플릿 및 국제 공개 2018/230257호 팸플릿에 기재된 펩티드를 들 수 있고, 이들을 사용할 수도 있다.
이들 중, 펩티드의 아미노산 서열로서, 이하의 서열 (1) 내지 (14)의 어느 하나를 갖고 있는 것이 바람직하고, 이하의 서열 (1), (2), (13) 또는 (14)를 갖고 있는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 아미노산 서열을 갖고 있는 것에 의해, 펩티드와 항체(예를 들어, 인간 IgG)와의 결합 친화성을 높일 수 있다. 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (14)에 있어서, (Xaa2)는 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산을 나타내고, 바람직하게는, 가교제로 수식되어 있고, (Xaa1) 및 (Xaa3)은 모두 호모 시스테인 잔기를 나타낸다. 또, 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (14) 중, (Xaa1), (Xaa2) 및 (Xaa3) 이외의 아미노산은 1문자 약호로 표기한다.
(1) DCAYH(Xaa2)GELVWCT
(2) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH
(3) RCAYH(Xaa2)GELVWCS
(4) GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH
(5) SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH
(6) GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH
(7) GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH
(8) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH
(9) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH
(10) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY
(11) SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY
(12) SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY
(13) RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH
(14) G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H
본 발명에 사용되는 펩티드는, 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 묻지 않는 아미노산을 조합하여 사용하여, 예를 들어 액상 합성법, 고상 합성법, 자동 펩티드 합성법, 유전자 재조합법 또는 파지 디스플레이법 등의 펩티드 합성법에 제공함으로써 제조할 수 있다. 펩티드의 합성 시에, 필요에 따라, 사용되는 아미노산의 관능기의 보호를 행해도 된다. 이들은, 예를 들어, 국제 공개 2017/217347호 팸플릿 및 국제 공개 2018/230257호 팸플릿에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
본 발명에 있어서의 펩티드에의 제2 원자단에의 도입 방법은, 상술한 방법에 의해 원하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 얻은 후, 해당 펩티드를, 용해 보조제 및 환원제, 그리고 필요에 따라 산을 첨가한 용액에 용해하고, 해당 용액에 제2 원자단으로서, 아지드기 또는 TCO를 포함하는 원자단의 유기 용매 용액을 첨가하고, 실온에서 교반함으로써 도입하는 방법을 들 수 있다.
제2 원자단으로서 아지드기를 포함하는 원자단을 도입하는 경우에는, 시판하고 있는 아지드기 도입 시약을 사용하여, 통상의 방법에 따라서, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 직접 아지드기를 도입하거나, 또는 상술한 링커 구조를 통하여 아지드기를 포함하는 원자단을 도입할 수 있다. 사용되는 아지드기 도입 시약으로서는 예를 들어, 실릴아지드, 인산아지드, 알킬암모늄아지드, 무기 아지드, 술포닐아지드, 또는 PEG 아지드 등을 들 수 있다.
또한, 제2 원자단으로서 TCO를 포함하는 원자단을 도입하는 경우에는, TCO를 포함하는 시판하고 있는 클릭 케미스트리용 시약을 사용하여, 통상의 방법에 따라서, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 직접 TCO를 도입하거나, 또는 상술한 링커 구조를 통하여 TCO를 포함하는 원자단을 도입할 수 있다.
펩티드와 항체를 결합시켜서, 펩티드 수식 항체를 얻는 방법은, 예를 들어 가교제를 사용하여 행할 수 있다. 가교제란, 펩티드와, 항체를 공유 결합에 의해 연결시키기 위한 화학 물질이며, 그 예로서, 디숙신이미딜글루타레이트(DSG), 디숙신이미딜수베레이트(DSS) 등의 숙신이미딜기를 바람직하게는 2개 이상 포함하는 가교제, 아디프이미드산디메틸 등의 이미드산 부분을 바람직하게는 2개 이상 포함하는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 가교제, 그리고 3,3'-디티오비스프로피온이미드산디메틸, 디티오비스숙신이미딜프로피온산 등의 디술피드 결합을 갖는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 것 등을 들 수 있다. 이러한 가교제를 사용함으로써, 펩티드에 있어서의 Xaa2의 아미노산 잔기와, 항체 간에 가교 반응을 일으킬 수 있다. 항체에 있어서의 가교 반응이 발생하는 부위는, 항체로서 인간 IgG(예를 들어, 트라스투주맙)를 사용한 경우, Xaa2의 아미노산 잔기와, 트라스투주맙에 있어서의 Eu 넘버링에 따르는 Lys246 잔기 및 Lys248 잔기의 적어도 한쪽과의 사이에 부위 특이적으로 가교 구조를 통하여 결합한다. 이들 Lys 잔기는, 인간 IgG에 있어서의 Fc 영역에 존재하고, 트라스투주맙 이외의 항체이더라도 당업자라면 항체의 아미노산 서열을 얼라인먼트하고, 상당하는 Lys 잔기를 특정할 수 있다.
펩티드와 항체의 결합 방법은, 예를 들어, 상술한 펩티드와, 항체와, 가교제와, 필요에 따라 촉매를, 적절한 완충액 중에 10℃ 이상 30℃ 이하 환경 하에서 분산시켜서 행할 수 있다. 반응 시간은 10분 이상 2시간 정도로 할 수 있다. 펩티드와 항체의 반응 시에 있어서의 몰 비율은, 펩티드:항체로서, 1:1 내지 20:1의 범위로 할 수 있다.
이상의 공정을 거쳐서 얻어지는 펩티드 수식 항체는, 항체(바람직하게는 면역 글로불린 클래스가 IgG인 항체) 1분자에 대하여 적어도 펩티드 1분자 이상이 결합하고 있으면 되지만, 항체 그 자체의 활성(항원 인식 작용, 중화 작용, 보체 활성화 작용, 옵소닌 작용)을 유지하는 관점에서, 항체의 Fc 영역(정상 영역)에 부위 특이적으로 펩티드가 결합하고 있는 것이 바람직하고, 본 발명에 있어서, 펩티드 수식 항체는, 항체 1분자에 대하여 펩티드 1분자 또는 2분자 결합하고 있는 것이 보다 바람직하다.
상기 펩티드 수식 항체는, 항체 1분자에 대하여 펩티드 1분자가 결합한 항체(이하, 「1가 항체」라고 함)와, 항체 1분자에 대하여 펩티드 2분자가 결합한 항체(이하, 「2가 항체」라고 함)를 임의의 비율로 함유하는 혼합물인데, 이것을 그대로 이후의 공정에 제공해도 되고, 여과 필터, 멤브레인 필터, 여러가지 충전제를 충전한 칼럼, 각종 크로마토그래피 등의 방법으로 미수식 항체와, 1가 항체와, 2가 항체를 분리 정제한 뒤에 어느 가수의 항체만을 이후의 공정에 제공해도 된다. 정제의 결과, 미수식 항체와 다른 가수의 항체의 분리를 할 수 없는 경우에는, 이들을 함유하는 혼합물로서 이후의 공정에 제공해도 된다.
미수식 항체와, 1가 항체와, 2가 항체를 분리 정제하는 경우에는, 상기 어느 정제 방법으로 분리 정제해도 되지만, 여러가지 충전제를 충전한 칼럼을 사용하는 것이 바람직하고, 항체 등의 단백질의 분리 정제에 적합한 충전제를 충전한 칼럼을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
방사성 금속 착체에 이온의 상태에서 배위되어 있는 방사성 금속은, α선, β선 혹은 γ선 또는 이들의 조합의 방사선을 방출하는 금속 핵종을 사용할 수 있다. 이러한 방사성 금속의 핵종으로서는, 예를 들어 알칼리 금속, 알칼리 토류 금속, 란타노이드, 악티노이드, 전이 금속 혹은 이들 금속 이외의 금속의 방사성 동위체 등을 들 수 있다. 이들 중, 상업 이용 가능하고 또한 착체 형성성의 향상을 도모하는 관점에서, 방사성 금속의 핵종으로서, 44Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 60Co, 59Fe, 67Ga, 68Ga, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 89Zr, 90Y, 99mTc, 103Ru, 111In, 153Sm, 165Dy, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 198Au, 201Tl, 197Hg, 203Hg, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 227Th 또는 225Ac를 사용하는 것이 바람직하다. 이들 방사성 금속은, 통상의 방법에 따라서 제조할 수 있고, 방사성 금속이 전리한 양태에서 포함하는 용액으로서 얻는 것이 바람직하다.
방사성 금속 표지 항체를 질환의 치료를 목적으로 하여 사용하는 경우에는, 치료 효과를 높이는 관점에서, 방사성 금속으로서 α선 방출 핵종 또는 β-선 방출 핵종을 사용하는 것이 바람직하다. α선 방출 핵종은, 방사성 금속의 괴변 과정에서 α선을 방출하는 핵종이면 되고, 상세하게는, 212Bi, 213Bi, 227Th 또는 225Ac 등이 바람직하게 사용되고, 보다 바람직하게는 227Th 또는 225Ac이며, 더욱 바람직하게는 225Ac이다. β-선 방출 핵종은, 방사성 금속의 괴변 과정에서 β-선을 방출하는 핵종이면 되고, 상세하게는, 60Co, 59Fe, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 90Y, 99mTc, 103Ru, 153Sm, 165Dy, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 198Au, 203Hg, 212Bi, 213Bi 또는 212Pb 등이 바람직하게 사용되고, 보다 바람직하게는 64Cu, 67Cu, 89Sr, 90Y 또는 177Lu가 사용된다.
또한, 방사성 금속 표지 항체를 질환의 진단이나 병소의 검출을 목적으로 하여 사용하는 경우에는, 진단 성능을 높이는 관점에서, 방사성 금속으로서 β+선 방출 핵종, 전자 포획 괴변 핵종, 또는 γ선 방출 핵종을 사용하는 것이 바람직하다. β+선 방출 핵종은, 방사성 금속의 괴변 과정에서 양전자를 방출하는 핵종이면 되고, 44Sc, 58Co, 68Ga, 64Cu 또는 89Zr 등이 바람직하게 사용되고, 보다 바람직하게는 64Cu 또는 89Zr이다. 전자 포획 괴변 핵종은, 방사성 금속의 괴변 과정에서 오제 전자 또는 특성 X선을 방출하는 핵종이면 되고, 51Cr, 57Co, 58Co, 67Ga, 68Ga, 64Cu, 89Zr, 111In, 186Re, 201Tl 또는 197Hg 등이 바람직하게 사용된다. γ선 방출 핵종은, γ 붕괴에 의해, γ선을 방출하는 핵종이면 되고, γ 붕괴에 의해 γ선을 방출하는 핵종으로서는, 99mTc, 68Ga 또는 201Tl이 바람직하게 사용된다.
예를 들어, 방사성 금속 착체에 이온의 상태에서 배위되어 있는 방사성 금속을, 이온 반경에 기초하여 선택하는 경우, 이온 반경이 70 내지 130pm 정도의 방사성 금속으로서, 67Ga, 68Ga, 64Cu, 67Cu, 89Zr, 90Y, 99mTc, 103Ru, 111In, 153Sm, 165Dy, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 198Au, 201Tl, 197Hg, 203Hg, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 225Ac 등을 들 수 있고, 이들은 바람직하게는 상기 식 (A) 내지 (K)로 표시되는 구조의 킬레이트부를 갖는 리간드와 방사성 금속 착체를 형성할 수 있다.
예를 들어, 방사성 금속 표지 항체를 질환의 치료를 목적으로 하여 사용하는 경우에, 방사성 금속으로서 225Ac, 177Lu 또는 90Y를 사용하는 경우에는, 상기 식 (A) 또는 (D) 내지 (I)의 어느 것으로 표시되는 구조의 킬레이트부를 갖는 리간드를 사용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 상기 식 (A), (D) 또는 (F)의 어느 것으로 표시되는 구조의 킬레이트부를 갖는 리간드를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 상기 식 (A)로 표시되는 구조의 킬레이트부를 갖는 리간드를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 방사성 금속 표지 항체를 질환의 진단이나 병소의 검출을 목적으로 하여 사용하는 경우에, 방사성 금속으로서 89Zr 또는 111In을 사용하는 경우에는, 리간드로서 상기 식 (A), (C) 또는 (K)의 어느 것으로 표시되는 구조의 킬레이트부를 갖는 리간드를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 식 (A)로 표시되는 구조의 킬레이트부를 갖는 리간드를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 항체의 면역 글로불린 클래스는, IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE의 어느 클래스를 특별히 제한없이 사용할 수 있는데, 이들 중 IgG가 면역 응답의 2차 응답에 있어서의 주요한 클래스이며, 혈중에서 가장 많이 존재하고, 항원에 대한 인식 특이성이 높은 점에서 바람직하게 사용된다. 또한 포유 동물의 IgG가 바람직하고, 포유 동물로서 구체적으로는 인간, 침팬지 등의 영장류; 래트, 마우스 및 토끼 등의 실험동물; 돼지, 소, 말, 양 및 염소 등의 가축 동물; 그리고 개 및 고양이 등의 애완동물을 들 수 있다. 또한, 인간 IgG 또는 토끼 IgG가 더욱 바람직하고, 인간 IgG가 더욱 보다 바람직하다. 또한, 이들 항체의 서브 클래스에 대해서도 특별히 제한은 없고, 예를 들어 인간 IgG를 사용하는 경우, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 적어도 1종일 수 있고, IgG1, IgG3 또는 IgG4인 것이 바람직하다.
상술한 제조 방법을 거쳐서 얻어진 방사성 금속 표지 항체는, 항체의 특정한 부위가 펩티드에 의해 특이적으로 수식된 것이다. 방사성 금속 착체는, 펩티드와 직접적 또는 간접적으로 연결되어 있고, 펩티드와 방사성 금속 착체 사이에, 바람직하게는 클릭 반응으로 형성된 결합 부위를 갖고 있다. 결합 부위는, 방사성 금속 착체가 구비하는 제1 원자단과, 펩티드에 연결되어 있는 제2 원자단에서 유래되는 화학 구조인 것이 바람직하다. 이러한 화학 구조로서는, 예를 들어, 결합 부위는, 치환된 트리아졸 골격을 포함하는 구조가 형성되어 있거나, 치환된 피리다진 골격을 포함하는 구조가 형성되어 있거나 하는 것이다. 치환된 상기 골격을 포함하는 구조로서는, 예를 들어, 트리아졸 골격 또는 피리다진 골격에 치환기, 지방족환 및 방향족환의 적어도 1종을 포함하는 구조가 결합하고 있고, 또한 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위 및 펩티드와의 결합 부위를 갖는 것을 들 수 있다.
구체적인 결합 부위의 구조로서는, 예를 들어 제1 원자단 및 제2 원자단이 DBCO를 포함하는 원자단과, 아지드기를 포함하는 원자단의 조합일 경우에는, 사용하는 반응 시약에 따라 다르지만, 이하의 식 (10a) 또는 식 (10b)에 나타내는 트리아졸 골격을 포함하는 구조가 형성되고, 이들은 이성체의 관계에 있기 때문에 임의의 비율로 포함되어 있어도 된다. 또한, 제1 원자단 및 제2 원자단이 1,2,4,5-테트라진을 포함하는 원자단과, TCO를 포함하는 원자단의 조합일 경우에는, 사용하는 반응 시약에 따라 다르지만, 이하의 식 (10c)에 나타내는 피리다진 골격을 포함하는 구조가 형성된다. 식 (10a) 및 식 (10b) 중, R1A는 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, R2A는 펩티드와의 결합 부위를 나타낸다. 식 (10c) 중, R3A 및 R4A 중 한쪽은 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타내고, 다른 쪽은 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, R5A는 펩티드와의 결합 부위를 나타낸다.
방사성 금속 표지 항체는, 이것을 그대로, 또는 이것을 정제한 뒤에, 해당 방사성 금속 표지 항체를 유효 성분으로서 포함하는 방사성 의약 조성물을 조제할 수도 있다. 방사성 의약 조성물이란, 방사성 금속 표지 항체 또는 그의 유도체를 포함하고, 생체 내에의 투여에 적합한 형태가 되어 있는 조성물을 가리킨다. 방사성 의약 조성물은, 예를 들어 상술한 방법으로 제조된 방사성 금속 표지 항체를, 물을 주체로 하여, 또한 생체와 대략 등장의 용매에 용해시켜서 제조할 수 있다. 이 경우, 방사성 의약 조성물은 수용액의 형태인 것이 바람직하고, 필요에 따라, 약학적으로 허용되는 다른 성분을 포함하고 있어도 된다. 방사성 의약 조성물은, 경구적으로, 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 혹은 근육 내 등의 비경구적으로 생체에 투여되어, 질환의 치료, 질환의 진단, 혹은 병소의 검출 등에 사용된다.
상기 식 (A) 내지 (J) 그리고 트리아졸 골격 함유 구조 및 피리다진 골격 함유 구조로 치환될 수 있는 치환기로서는, 예를 들어 할로겐 원자, 포화 또는 불포화의 알킬기, 히드록시기, 알데히드기, 카르복시기, 아실기, 아미노기, 니트로기, 에스테르기, 이소티오시아네이트기, 티옥시기, 시아노기, 아미드기, 이미드기, 인산기, 페닐기, 벤질기, 피리딜기 등을 들 수 있다. 이들 치환기는, 1종이 단독으로 치환되어 있어도 되고, 이들 치환기가 2종 이상 조합되어서 치환되어 있어도 된다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명의 범위는, 이러한 실시예에 제한되지 않는다. 이하의 표 중, 「-」란은, 실시하고 있지 않은 것을 나타낸다.
〔실시예 1 내지 4〕
(1-1. 착체 형성 공정)
본 실시예에 사용되는 리간드의 구조를, 이하의 식 (L1-1) 내지 (L1-3)에 나타내었다. 식 (L1-1)로 표시되는 DO3A-DBCO는, Liang Y, Jiang X, Yuan R, Zhou Y, Ji C, Yang L et al. Metabolism-Based Click-Mediated Platform for Specific Imaging and Quantification of Cell Surface Sialic Acids. Anal Chem. Jan 3; 89(1): 538-543.(2017)에 기재된 방법에 따라서, 합성하였다. 식 (L1-2)로 표시되는 DOTA-DBCO는, Wang H, Wang R, Cai K, He H, Liu Y, Yen J et al. Selective in vivo metabolic cell-labeling-mediated cancer targeting. Nat Chem Biol. Apr; 13(4): 415-424.(2017)에 기재된 방법에 따라서 합성하였다. 또한, 식 (L1-3)으로 표시되는 DO3A-PEG4-DBCO는, 시판품인 Iris Biotech GmbH사제를 사용하였다. 이들 리간드를, 용매로서 0.1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH6.0)에 분산시켜서, 리간드를 1.7mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.0025mL와, 방사성 금속원으로서 225Ac 이온 함유 용액(0.2mol/L 염산 수용액, 방사능 농도 160MBq/mL, Oak Ridge NationalLaboratory제로부터 조제, 액량 0.0025mL) 0.4MBq(검정 일시 방사능량으로부터 감쇠 계산한 계산값)를 혼합한 반응액을, 가열 조건 하에서 반응시켜서, 225Ac 착체 용액을 얻었다. 리간드와 방사성 금속 이온의 몰 비율은, 리간드:225Ac 이온=3000:1이며, 반응액의 가열 온도는 70℃, 가열 시간은 90분간으로 하였다.
얻어진 225Ac 착체의 방사 화학적 순도를, 다음 방법으로 측정하였다. 즉, 225Ac 착체 용액의 일부를 박층 크로마토그래피(Agilent사제, 형식 번호: SGI0001, 전개 용매:아세토니트릴/물 혼합액(체적비 1:1))로 전개하고, 그 후, 라디오 γ-TLC 애널라이저(raytest제, MODEL GITA Star)로 측정하였다. 검출된 전방사능(카운트)에 대한, 원점 부근에 검출된 피크의 방사능(카운트)의 백분율을 225Ac 착체의 방사 화학적 순도(％)로 하였다. 그 결과, 225Ac 착체의 방사 화학적 순도는 89 내지 99％였다. 얻어진 225Ac 착체 용액은, 그대로 표지 공정에 사용하였다.
(1-2. 항체 수식 공정)
별도로, 펩티드를 국제 공개 2017/217347호 팸플릿에 기재된 방법으로 제조해서, 하기 식 (P3)으로 표시되는 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 얻었다. 이 펩티드의 아미노산 서열은, 서열 번호(2)의 Xaa2가 리신 잔기인 서열과 동일하며, 리신 잔기의 측쇄 말단 아미노기가 R1로 표시되는 구조로 수식되어 있었다. 또한, 2개의 시스테인 잔기로 서로 디술피드 결합하고 있고, 펩티드의 N 말단은 디글리콜산 및 8개의 PEG를 갖는 링커 구조를 통하여, 제2 원자단인 아지드기를 포함하는 원자단으로서, 에틸아지드가 결합하고 있는 것이었다.
(식 (P3) 중, Gly는 글리신을, Pro는 프롤린을, Asp는 아스파르트산을, Cys는 시스테인을, Ala는 알라닌을, Tyr은 티로신을, His는 히스티딘을, Glu는 글루탐산을, Leu는 류신을, Val은 발린을, Trp는 트립토판을, Phe는 페닐알라닌을 나타낸다.)
이 펩티드와, 인간 IgG 항체(리툭시맙; 로슈사제, 또는 트라스투주맙; 로슈사제)를 아세트산나트륨 완충액(pH6.0)에 혼합한 혼합액을, 실온에서 30분간 반응시켜서, 펩티드 수식 항체를 포함하는 용액을 얻었다. 이 펩티드 수식 항체는, 상기 펩티드에 의해 항체의 Fc 영역이 부위 특이적으로 수식된 것이다.
(2. 펩티드 수식 항체 분리 공정)
상술한 펩티드 수식 항체를, 1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH6.0)으로 희석하고, ProteinA 칼럼(GE 헬스케어사제, HiTrap MabSelect SuRe)에 첨가하고, 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.05mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH5.7)을 흘리고, 2가 항체를 포함하는 용액을 회수하고, 회수한 분획에 포함되는 2가 항체의 농도가 15mg/mL로 되도록 농도를 조정하였다. 그 후, 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.05mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH3.5)을 흘리고, 1가 항체를 포함하는 용액을 회수하고, 회수한 분획에 포함되는 미수식 항체 및 1가 항체의 농도가 17 내지 40mg/mL로 되도록 농도를 조정하였다.
(3. 표지 공정)
상술한 각 공정을 거쳐서 얻어진 225Ac 착체의 용액과, 펩티드 수식 항체(1가 항체)를 포함하는 용액을, 미정제인 채로 각각 0.02mol/L 아스코르브산 함유 0.09mol/L 아세트산나트륨 완충액에 첨가하고, 37℃에서 120분간 클릭 반응시켜서, 실시예 1 내지 4의 225Ac 착체 표지 항체를 얻었다. 225Ac 착체의 양 및 펩티드 수식 항체(1가 항체)의 양은 각각 43μmol 및 46μmol이거나(실시예 1), 또는 모두 100μmol이며(실시예 2 내지 4), 제1 원자단(DBCO)과 제2 원자단(아지드)의 몰비는 각각 약 1:1이었다. 미정제 시의 실시예의 225Ac 착체 표지 항체의 반응률(％)을 이하의 표 1에 나타내었다. 여기서, 반응률(％)이란, 착체 형성 공정에서의 표지율(％)에 대한 225Ac 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도(％)를 의미하고, 표지율(％)이란 투입 방사능량에 대한 225Ac 착체의 방사능량(％)을 의미한다.
또한, 37℃에서 2시간 반응시켜서 얻어진 225Ac 착체 표지 항체의 용액을 한외 여과 필터(Merck사제, 형식 번호: UFC505096)를 사용하여 정제하였다. 정제 후의 225Ac 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도(RCP) 및 방사 화학적 수율(RCY)을 이하의 표 1에 나타내었다.
225Ac 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도 및 방사 화학적 수율의 측정 방법은 이와 같이 하였다. 즉, 박층 크로마토그래피(Agilent사제, 형식 번호: SGI0001, 전개 용매는 아세토니트릴: 0.1mmol/L EDTA 용액의 혼합액(체적비 1:1))을 라디오 γ-TLC 애널라이저(raytest제, MODEL GITA Star)로 측정하고, 검출된 전방사능(카운트)에 대한, 원점 부근에 검출된 피크의 방사능(카운트)의 백분율을 방사 화학적 순도(％)로 하였다. 또한, 표지 공정 개시 시에 가한 전방사능(γ선 스펙트로미터(Ge 반도체 검출기: GMX10P4-70(ORTEC사제), 멀티 채널 애널라이저: M7-000(세이코 EG&G사제), 데이터 처리: Spectrum Navigator: DS-P300(세이코 EG&G사제) 및 Gamma Studio: DS-P600(세이코 EG&G사제))으로 측정한 카운트로부터 계산한 방사능량)에 대하여 한외 여과 정제 후에 회수한 방사능(상술한 바와 동일하게, γ선 스펙트로미터로 측정한 카운트로부터 계산한 방사능량)의 백분율을 방사 화학적 수율(％)로 하였다.
〔실시예 5〕
(1-1. 착체 형성 공정)
본 실시예에서는, 이하의 식 (L2)에 구조를 나타내는 리간드를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 행하여, 225Ac 착체 용액을 얻었다. 식 (L2)로 표시되는 DOTA-PEG7-Tz는, Poty S, Membreno R, Glaser JM, Ragupathi A, Scholz WW, Zeglis BM et al. The inverse electron-demand Diels-Alder reaction as a new methodology for the synthesis of 225Ac-labelled radioimmunoconjugates. Chem Commun(Camb). Mar 8; 54(21): 2599-2602.(2018)에 기재된 방법에 따라서 합성하였다.
(1-2. 항체 수식 공정)
본 실시예에서 사용한 펩티드는, 하기 식 (P4)로 표시되는 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 얻었다. 이 펩티드의 아미노산 서열은, 서열 번호(2)의 Xaa2가 리신 잔기인 서열과 동일하며, 리신 잔기의 측쇄 말단 아미노기가 R2로 표시되는 구조로 수식되어 있었다. 또한, 2개의 시스테인 잔기의 티올기끼리가 상기 식 (4)로 표시되는 링커에 의해 연결되어 있고, 펩티드의 N 말단은, N 말단측에서 보아서, 5개의 PEG, 측쇄의 티올기가 제2 원자단인 TCO를 포함하는, R1로 표시되는 구조로 치환된 시스테인 잔기, 2개의 글루탐산 잔기, 아세틸기를 이 순으로 갖는 링커 구조를 갖고 있었다.
(식 (P4) 중, Gly는 글리신을, Pro는 프롤린을, Asp는 아스파르트산을, Cys는 시스테인을, Ala는 알라닌을, Tyr은 티로신을, His는 히스티딘을, Glu는 글루탐산을, Leu는 류신을, Val은 발린을, Trp는 트립토판을, Phe는 페닐알라닌을 나타낸다)
이 펩티드와, 인간 IgG 항체(트라스투주맙; 로슈사제)를 아세트산나트륨 완충액(pH6)에 혼합한 혼합액을, 실온에서 30분간 반응시켜서, 펩티드 수식 항체를 포함하는 용액을 얻었다.
(2. 표지 공정)
실시예 1과 동일한 수순으로 클릭 반응시켜서, 225Ac 착체 표지 항체를 얻었다. 225Ac 착체의 양 및 펩티드 수식 항체의 양은 모두 100μmol이며, 제1 원자단(1,2,4,5-테트라진)과 제2 원자단(TCO)의 몰비는 1:1이었다. 미정제 시의 실시예의 225Ac 착체 표지 항체의 반응률(％)을 이하의 표 1에 나타내었다. 여기서, 반응률(％)이란, 착체 형성 공정에서의 표지율(％)에 대한 225Ac 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도(％)를 의미하고, 표지율(％)이란 투입 방사능량에 대한 225Ac 착체의 방사능량(％)을 의미한다. 또한, 실시예 1과 마찬가지로 한외 여과 필터를 사용하여 정제한 후의 225Ac 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도(RCP) 및 방사 화학적 수율(RCY)을 이하의 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타내는 바와 같이, 착체 형성 공정을 행한 후에, 착체와 항체의 반응을 행한 실시예는, 항체에 대하여 과도한 가열을 행하지 않더라도, 온화한 반응 조건에서 표지 반응이 진행하고, 또한 항체에 대한 방사성 금속의 표지 효율이 우수함을 알 수 있다.
〔실시예 6 내지 7〕 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO를 사용한 Tmab, Rmab 제조
(1. 착체 형성 공정)
본 실시예에 사용되는 리간드의 구조를, 이하의 식 (L1-4)에 나타내었다. 식 (L1-4)로 표시되는 DOTAGA-DBCO는 Bernhard et al. DOTAGA-Anhydride: A Valuable Building Block for the Preparation of DOTA-Like Chelating Agents Chem. Eur. J. 2012, 18, 7834-7841에 기재된 방법을 기초로 하여 제조하였다. 이들 리간드를, 용매로서 0.1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH6.0)에 분산시켜서, 리간드를 1.7mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.005mL와, 방사성 금속원으로서 225Ac 이온 함유 용액(0.2mol/L 염산 수용액, 방사능 농도 320 내지 340MBq/mL, Oak Ridge NationalLaboratory제로부터 조제, 액량 0.005mL) 1.6 내지 1.7MBq(검정 일시 방사능량으로부터 감쇠 계산한 계산값)를 혼합한 반응액을, 가열 조건 하에서 반응시켜서, 225Ac 착체 용액을 얻었다. 리간드와 방사성 금속 이온과의 몰 비율은, 리간드:225Ac 이온=약 2500:1이며, 반응액의 가열 온도는 70℃, 가열 시간은 30분간으로 하였다.
얻어진 225Ac 착체의 방사 화학적 순도를 실시예 1과 마찬가지로 측정한 결과, 90％였다. 얻어진 225Ac 착체 용액은, 그대로 표지 공정에 사용하였다.
(2. 표지 공정)
상술한 공정 (1)을 거쳐서 얻어진 미정제인 채의 225Ac 착체의 용액과, 실시예 1과 마찬가지로 하여 얻어진 펩티드 수식 항체(1가 항체)를 포함하는 용액을, 각각 0.1mol/L 아르기닌 함유 0.1mol/L 히스티딘 완충액 pH6.0에 첨가하고, 37℃에서 120분간 클릭 반응시켜서, 225Ac 착체 표지 항체를 얻었다. 225Ac 착체의 양 및 펩티드 수식 항체(1가 항체)의 양은 각각 85㎚ol 및 100㎚ol이며(실시예 6 및 7), 제1 원자단(DBCO)과 제2 원자단(아지드)의 몰비는 각각 약 1:1.2였다. 미정제 시의 225Ac 착체 표지 항체의 반응률(％)을 이하의 표 2에 나타내었다. 여기서, 반응률(％)이란, 착체 형성 공정에서의 표지율(％)에 대한 225Ac 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도(％)를 의미하고, 표지율(％)이란 투입 방사능량에 대한 225Ac 착체의 방사능량(％)을 의미한다.
또한, 37℃에서 2시간 반응시켜서 얻어진 225Ac 착체 표지 항체의 용액을 한외 여과 필터(Merck사제, 형식 번호: UFC505096)를 사용하여 정제하였다. 정제 후의 225Ac 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도(RCP) 및 방사 화학적 수율(RCY)을 이하의 표 2에 나타내었다.
225Ac 표지 1가 항체의 방사 화학적 순도 및 방사 화학적 수율의 측정 방법은 실시예 1과 동일하게 행하였다.
〔실시예 8〕 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO를 사용한 Tmab 제조
(1. 착체 형성 공정)
본 실시예에 사용되는 리간드의 구조는, 상술한 식 (L1-4)와 동일하다. 이 리간드를, 용매로서 DMSO에 분산시켜서, 리간드를 0.33mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.030mL와, 방사성 금속원으로서 89Zr 이온 함유 용액(0.1mol/L 염산 수용액, 방사능 농도 181MBq/mL, 니혼 메디피직스 가부시키가이샤제로부터 조제, 액량 0.33mL) 60MBq를 혼합한 반응액을, 가열 조건 하에서 반응시켜서, 89Zr 착체 용액을 얻었다. 리간드와 방사성 금속 이온의 몰 비율은, 리간드:89Zr 이온=약 250:1이며, 반응액의 가열 온도는 70℃, 가열 시간은 60분간으로 하였다.
얻어진 89Zr 착체의 방사 화학적 순도를, 다음 방법으로 측정하였다. 즉, 89Zr 착체 용액의 일부를 박층 크로마토그래피(Agilent사제, 형식 번호: SGI0001, 전개 용매: 아세토니트릴/물 혼합액(체적비 1:1))로 전개하고, 그 후, 라디오 γ-TLC 애널라이저(raytest제, MODEL GITA Star PS)로 측정하였다. 검출된 전방사능(카운트)에 대한, 원점 부근에 검출된 피크의 방사능(카운트)의 백분율을 89Zr 착체의 방사 화학적 순도(％)로 하였다. 그 결과, 89Zr 착체의 방사 화학적 순도는 90％였다. 얻어진 89Zr 착체 용액은, 그대로 표지 공정에 사용하였다.
(2. 표지 공정)
상술한 공정 (1)을 거쳐서 얻어진 미정제인 채의 89Zr 착체의 용액과, 실시예 1과 마찬가지로 하여 얻어진 펩티드 수식 항체(1가 항체)를 포함하는 용액을, 미정제인 채로 각각 0.1mol/L 아르기닌 함유 0.1mol/L 히스티딘 완충액 pH6.0에 첨가하고, 37℃에서 120분간 클릭 반응시켜서, 실시예 8의 89Zr 착체 표지 항체를 얻었다. 89Zr 착체의 양 및 펩티드 수식 항체(1가 항체)의 양은 각각 100㎚ol이며, 제1 원자단(DBCO)과 제2 원자단(아지드)의 몰비는 각각 약 1:1이었다. 미정제 시의 실시예의 89Zr 착체 표지 항체의 반응률(％)을 이하의 표 3에 나타내었다. 여기서, 반응률(％)이란, 착체 형성 공정에서의 표지율(％)에 대한 89Zr 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도(％)를 의미하고, 표지율(％)이란 투입 방사능량에 대한 89Zr 착체의 방사능량(％)을 의미한다.
또한, 37℃에서 2시간 반응시켜서 얻어진 89Zr 착체 표지 항체의 용액을 한외 여과 필터(Merck사제, 형식 번호: UFC505096)를 사용하여 정제하였다. 정제 후의 89Zr 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도(RCP) 및 방사 화학적 수율(RCY)을 이하의 표 3에 나타내었다.
89Zr 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도 및 방사 화학적 수율의 측정 방법은, 실시예 8과 동일하게 행하였다.
〔실시예 9〕 89Zr 표지 DOTA-DBCO를 사용한 Tmab 제조
(1-1. 착체 형성 공정)
본 실시예에 사용되는 리간드의 구조는, 상술한 식 (L1-2)와 동일하다. 이 리간드를, 용매로서 DMSO에 분산시켜서, 리간드를 1mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.1mL와, 방사성 금속원으로서 89Zr 이온 함유 용액(0.1mol/L 염산 수용액, 방사능 농도 450MBq/mL, 오카야마 다이가쿠제로부터 조제, 액량 0.1mL) 45MBq를 혼합한 반응액을, 가열 조건 하에서 반응시켜서, 89Zr 착체 용액을 얻었다. 리간드와 방사성 금속 이온의 몰 비율은, 리간드:89Zr 이온=약 10000:1이며, 반응액의 가열 온도는 70℃, 가열 시간은 60분간으로 하였다.
얻어진 89Zr 착체의 방사 화학적 순도는, 실시예 1에 준하여 행하였다. 그 결과, 89Zr 착체의 방사 화학적 순도는 99％였다.
(1-2. 미반응물 제거 공정)
얻어진 89Zr 착체 용액을 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분취하고, 미반응된 DOTA-DBCO를 제거하였다. HPLC의 조건은 하기와 같다. 검출기: 자외 흡광 광도계(측정 파장: 254㎚)/신틸레이션 검출기, 칼럼: XBridge C18 3.5㎛, 4.6×100㎚; Waters제, 이동상 A: 10mmol/L 히스티딘 완충액 pH6.5, 이동상 B: 액체 크로마토그래피용 아세토니트릴, 이동상의 송액: 이동상 A 및 이동상 B의 혼합비를 다음과 같이 바꾸어서 농도 구배 제어했다(A:B=90:10(0분)→50:50(40분)(vol％/vol％)), 유량: 0.5mL/분, 분취 피크의 유지 시간 약 32분. 얻어진 분취액을 약 20μL까지 용매 증류 제거하고, 표지 공정에 사용하였다. 89Zr 착체 표지 항체의 미반응물 제거 공정에서의 방사 화학적 수율(HPLC 회수율)은 이하의 표 4에 나타냈다. 방사 화학적 수율(HPLC 회수율)의 측정 방법은 본 공정 개시 시에 투입 방사능량의 양에 대하여 분취액의 방사능의 양의 백분율을 미반응물 제거 공정에서의 HPLC 회수율(％)로 하였다.
(2. 표지 공정)
상술한 각 공정을 거쳐서 얻어진 89Zr 착체의 용액과, 실시예 1과 마찬가지로 하여 얻어진 펩티드 수식 항체(1가 항체)를 포함하는 용액을, 각각 0.1mol/L 아르기닌 함유 0.1mol/L 히스티딘 완충액 pH6.0에 첨가하고, 37℃에서 120분간 클릭 반응시켜서, 89Zr 착체 표지 항체를 얻었다. 미정제 시의 실시예의 89Zr 착체 표지 항체의 표지 공정 반응률(％)을 이하의 표 4에 나타내었다. 여기서, 표지 공정 반응률(％)이란 HPLC 분취액의 방사능량에 대한 89Zr 착체의 방사능량(％)을 의미한다.
또한, 37℃에서 2시간 반응시켜서 얻어진 89Zr 착체 표지 항체의 용액을 한외 여과 필터(Merck사제, 형식 번호: UFC505096)를 사용하여 정제하였다. 정제 후의 89Zr 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도(RCP) 및 방사 화학적 수율(RCY)을 이하의 표 4에 나타내었다.
89Zr 착체 표지 항체의 방사 화학적 순도 및 방사 화학적 수율의 측정 방법은 실시예 1에 준하여 행하였다.
이상, 실시 형태를 참조하여 본 발명을 설명했지만, 본 발명은 상기 실시 형태에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구성이나 상세에는, 본 발명의 스코프 내에서 당업자가 이해할 수 있는 여러가지 변경을 할 수 있다.
본 명세서에서 설명된 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에 인용된 것에 의해, 그 모두가 명시된 것과 동일 정도로 본 명세서에 편입되는 것이다.
본 발명에 따르면, 온화한 반응 조건이더라도, 항체에 대한 방사성 금속의 높은 표지 효율이 가능해진다.
본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허 출원 제2019-191561(출원일: 2019년 10월 18일)을 기초로 하고 있고 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Nihon Medi-Physics Co., Ltd.
<120> Method for the production of radioactive metal-labeled antibodies
<130> 093090
<150> JP2019191561
<151> 2019-10-18
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide for modifying antibody cited in the specification,
paragraph [0109] (1)
<220>
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residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or
diaminopropionic acid.
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Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
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<213> Artificial Sequence
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<221> SITE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid
residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or
diaminopropionic acid.
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Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
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His
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diaminopropionic acid.
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Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
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Tyr
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residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or
diaminopropionic acid.
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<220>
<221> SITE
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residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or
diaminopropionic acid.
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<223> Peptide for modifying antibody cited in the specification,
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<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide for modifying antibody cited in the specification,
paragraph [0109] (14)
<220>
<221> SITE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is a homosysteine residue.
<220>
<221> SITE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid
residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or
diaminopropionic acid.
<220>
<221> SITE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa is a homosysteine residue.
<400> 14
Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa
1 5 10 15
His
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide for modifying antibody cited in the specification, P3
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> linking to linker structure
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(14)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> modification with R1 structure
<400> 15
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide for modifying antibody cited in the specification, P4
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> linking to linker structure
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(14)
<223> linking via linker structure
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> modification with R2 structure
<400> 16
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
Claims (15)
- 방사성 금속 착체와, 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 펩티드 수식 항체를 클릭 반응시켜서, 방사성 금속 표지 항체를 생성하는 공정을 갖고,
상기 클릭 반응은, 상기 방사성 금속 착체가 구비하는 제1 원자단과, 상기 펩티드에 직접적 또는 간접적으로 연결되어 있는 제2 원자단 간에 실행되고,
상기 제2 원자단이, 아지드기를 포함하는 원자단이거나, 또는 trans-시클로옥텐을 포함하는 원자단인, 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법. - 제1항에 있어서, 상기 펩티드가, 하기 식 (i)로 표시되는, 13 내지 17 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 해당 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 제2 원자단을 갖는 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법.
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) …(i)
(식 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는, 각각, 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고,
X는, 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기의 어느 것도 갖지 않는 아미노산 잔기이며,
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이고, 또한 a+b+c+d≤14를 충족하고,
Xaa1 및 Xaa3은, 각각 독립적으로,
측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 또한, 디술피드 결합을 통하여 결합하고 있거나 혹은 술피드기가 링커를 통하여 결합하고 있거나, 또는,
한쪽이, 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 다른 쪽이, 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 또한, 티오에테르 결합을 통하여 결합하고 있고,
Xaa2는, 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산이다.) - 제1항 또는 제2항에 있어서, 리간드와 방사성 금속을 반응시켜서, 상기 방사성 금속 착체를 형성하는 공정을 더 포함하는, 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 리간드와 상기 방사성 금속을 가열하여 반응시키는, 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 리간드는, 상기 방사성 금속에 배위하는 킬레이트부와, 상기 제1 원자단이 결합하고 있는 수식부를 갖는 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 킬레이트부는, 하기 식 (A) 내지 (K)의 어느 하나로 표시되는, 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법.
(식 (A) 중, R11, R13 및 R14는, 각각 독립적으로, -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은, -(CHCOOH)(CH2)pCOOH를 포함하는 기이며, R12 또는 R15의 한쪽이, 수소 원자, 카르복실기, 또는, 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이며, 다른 쪽이, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며, p가 0 이상 3 이하의 정수이며,
식 (B) 중, R21, R22, R23 및 R24는, 각각 독립적으로, 카르복실기 또는, 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기인데, R21, R22, R23 또는 R24의 어느 하나의 기가 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며,
식 (C) 중, R31, R32, R33 및 R34는, 각각 독립적으로, 수소 원자와 2 이상 10 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자 또는 산소 원자를 포함하고 있어도 되는 원자단을 포함하는 기이며, R35는, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며,
식 (D) 중, R41 또는 R42의 한쪽이, 수소 원자와 5 이상 20 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 원자단을 포함하는 기이며, 다른 쪽이 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며,
식 (E) 중, R51, R52, R53, R54 및 R55는, 각각 독립적으로, 카르복실기, 또는, 탄소 원자수가 2 혹은 3의 카르복시알킬기인데, 단, R51, R52, R53, R54 또는 R55의 어느 하나의 기가, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며,
식 (F) 중, R61, R62, R63, R64, R65 및 R66은, 각각 독립적으로, 카르복실기, 또는, 탄소 원자수가 2 혹은 3의 카르복시알킬기이며, R67은, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며,
식 (G) 중, R71 및 R72는, -O(CH2CH2O)nCH3(단, n은 1 이상 5 이하의 정수)이며, R73, R75, R76 및 R78은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며, R74 또는 R77은, 어느 한쪽이 탄소수 1 이상 5 이하의 히드록시알킬기이며, 다른 쪽이 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며,
식 (H) 중, R81 및 R82는, 각각 독립적으로, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며, 당해 알킬기의 말단이, 1 이상의 카르복실기로 치환된 피리딜기로 치환되어 있어도 되고, R87은, -CHOH 또는 -C=O인데, R81, R82 또는 R87의 어느 하나의 기가 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며, R83 및 R84는, 치환되어 있어도 되는 피리디닐기이며, R85 및 R86은, 각각 독립적으로, -COORa이며, Ra는 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며,
식 (I) 중, R91, R92, R93 및 R94는, 각각 독립적으로, -OCH2COOH인데, R91, R92, R93 또는 R94의 어느 하나의 기가, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며, R95, R96, R97 및 R98은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 이상 6 이하의 알킬기이며,
식 (J) 중, R101, R102 및 R103은, 각각 독립적으로, 카르복실기, 혹은, 탄소 원자수가 2 혹은 3의 카르복시알킬기이거나, 또는, 식 (J) 중, R101, R102 및 R103 중 적어도 하나는, 상기 수식부와 결합하고 있는 기이며, 다른 기는, 카르복실기, 혹은, 탄소 원자수가 2 혹은 3의 카르복시알킬기이다.) - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사성 금속이, 44Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 60Co, 59Fe, 67Ga, 68Ga, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 89Zr, 90Y, 99mTc, 103Ru, 111In, 153Sm, 165Dy, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 198Au, 201Tl, 197Hg, 203Hg, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 227Th 또는 225Ac인, 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 방사성 금속이 α선 방출 핵종인, 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클릭 반응을 50℃ 이하에서 실행하는, 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 수식 항체가, 1분자의 항체에 대하여 1분자 또는 2분자의 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 것인, 방사성 금속 표지 항체의 제조 방법.
- 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 방사성 금속 표지 항체로서,
방사성 금속 착체가 상기 펩티드에 직접적 또는 간접적으로 연결되어 있고, 해당 펩티드와 해당 방사성 금속 착체 간에 하기 식 (10a)로 표시되는 트리아졸 골격 함유 구조를 가지거나, 또는 해당 펩티드와 해당 방사성 금속 착체 간에 피리다진 골격 함유 구조를 갖는 방사성 금속 표지 항체.
(식 중, R1A는 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, R2A는 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다.) - 제11항에 있어서, 상기 펩티드와 상기 방사성 금속 착체 간에 하기 식 (10c)로 표시되는 피리다진 골격 함유 구조를 갖는 방사성 금속 표지 항체.
(식 중, R3A 및 R4A 중 한쪽은 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타내고, 다른 쪽은 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, R5A는 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다.) - 방사성 금속에 배위하는 킬레이트부와, 클릭 반응 가능한 제1 원자단이 결합하고 있는 수식부를 갖고, 상기 제1 원자단이 하기 식 (1a) 또는 (1b)의 어느 것으로 표시되는 원자단인, 킬레이트 링커.
(식 (1a) 중, R1은, 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, 식 (1b) 중, R3 및 R4 중 한쪽이 수식부 또는 킬레이트부와의 결합 부위를 나타내고, 다른 쪽이 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타낸다.) - 하기 식 (i)로 표시되는, 13 내지 17 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 펩티드 수식 항체로서,
상기 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 클릭 반응 가능한 제2 원자단이 연결되어 있고, 상기 제2 원자단이, 하기 식 (2a) 또는 (2b)의 어느 것으로 표시되는 원자단인, 펩티드 수식 항체.
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) …(i)
(식 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는, 각각, 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고,
X는, 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기의 어느 것도 갖지 않는 아미노산 잔기이며,
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이고, 또한 a+b+c+d≤14를 충족하고,
Xaa1 및 Xaa3은, 각각 독립적으로,
측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 또한, 디술피드 결합을 통하여 결합하고 있거나 혹은 술피드기가 링커를 통하여 결합하고 있거나, 또는,
한쪽이, 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 다른 쪽이, 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래되는 아미노산 잔기를 나타내고, 또한, 티오에테르 결합을 통하여 결합하고 있고,
Xaa2는, 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산이다.)
(식 (2a) 중, R2는, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단과의 연결 부위를 나타내고, 식 (2b) 중, R5는, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단과의 연결 부위를 나타낸다.) - 제14항에 있어서, 상기 펩티드 수식 항체가, 1분자의 항체에 대하여 1분자 또는 2분자의 상기 펩티드에 의해 부위 특이적으로 수식된 것인, 펩티드 수식 항체.
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