WO2016163443A1 - バブル製造用容器 - Google Patents

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克郎 立花
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ＳｏｎｏＣｏｒｅ株式会社
学校法人福岡大学
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Definitions

  • the present invention relates to a bubble manufacturing container used in a method for manufacturing microbubbles or nanobubbles.
  • the present invention relates to a bubble manufacturing container used in a method of manufacturing microbubbles or nanobubbles used for ultrasonic diagnosis and ultrasonic therapy.
  • micro-sized bubbles In recent years, in various fields such as medical care, food, seafood culture, wastewater treatment, etc., the use of micro-sized (about several hundreds of micrometers) or nano-sized (less than several hundred nanometers) bubbles has been studied. . In particular, in the medical field, a method for ultrasonic diagnosis of the chest and abdomen using microbubbles as an ultrasound contrast agent is known.
  • This ultrasonic diagnostic method is a method in which an ultrasonic contrast agent is injected into the body from a vein or the like, ultrasonic irradiation is performed on the diagnostic region, and a reflected wave (reflected echo) from the ultrasonic contrast agent is imaged and diagnosed. is there.
  • the micro bubble micro bubble which consists of the outer shell comprised from protein, a lipid, etc. and the gas enclosed in the outer shell is used widely.
  • the supersaturated bubble generation method is a method in which a microbubble is generated in a liquid mixture by dissolving a gas under high pressure in a liquid mixture containing a constituent material of microbubbles and physiological saline and then reducing the pressure.
  • the gas-liquid two-phase flow swirl method the above mixed liquid is stirred at a high speed to generate a vortex of the mixed liquid. After sufficiently entraining the gas in the vortex, mixing is performed by stopping the vortex. In this method, microbubbles are generated in the liquid.
  • the present invention has been made in view of the above-described conventional problems, and an object of the present invention is to provide a bubble manufacturing container that can stably manufacture bubbles (microbubbles or nanobubbles) of uniform size. .
  • a bubble production container used for producing a bubble A container body with an opening; A rubber stopper provided on the opening of the container body, The said bubble stopper is pierced with an injection needle, It is comprised so that the said bubble inside the said container main body can be taken out,
  • the container for bubble manufacture characterized by the above-mentioned.
  • the said container main body is comprised by the upper main body part provided with the said opening part, and the lower main body part which has an internal diameter smaller than this upper main body part, and to which the said weight part is attached (2)
  • the lower main body includes a thread groove formed over the entire outer peripheral surface thereof.
  • the said weight part is a container for bubble production as described in said (3) or (4) comprised so that the said lower main-body part can be moved by screwing together with the said thread groove.
  • the weight portion is provided in the vicinity of the opening of the container body, and has a through hole through which the injection needle is inserted so as to correspond to the opening of the tightening portion.
  • the weight portion is attached to the container body so as to cover the opening,
  • the said rubber stopper is provided on the said weight part,
  • the container for bubble manufacture as described in said (6) which has the mark for piercing the said injection needle in the position corresponding to the said through-hole.
  • the container body has a long shape, and has two weight parts covering both ends of the container body,
  • the said opening part is a container for bubble manufacture as described in said (1) provided in the protrusion part formed between the said both ends of the said container main body.
  • the mini-nert valve has a pipe line through which the injection needle can be inserted and communicated with the tube, and an open / close mechanism that controls opening and closing of the pipe line,
  • the said tube is a container for bubble manufacture as described in said (12) connected with the said rubber stopper or the said container main body.
  • the bubble production container of the present invention By using the bubble production container of the present invention, it is possible to stably produce a large amount of uniform size bubbles in an aqueous liquid. As a result, a container containing a large amount of uniform-sized bubbles can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining an example of a bubble manufactured by the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view showing a state in which a part of a bubble manufactured by the bubble manufacturing method of the present invention is cut.
  • FIG. 1 (a) shows a state in which a part of a bubble in which gas is sealed in the outer shell is cut, and
  • FIGS. 1 (b) and 1 (c) show that gas and drug are contained in the outer shell. The state which cut some encapsulated bubbles is shown.
  • FIG. 3 is a flowchart for explaining the first embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view for explaining the first embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIG. 5 is a partially enlarged view for explaining a state in which the aqueous liquid and the inner surface (upper surface) of the container collide violently in the step of vibrating the container shown in FIG.
  • FIG. 6 is a flowchart for explaining a second embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view for explaining a second embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIG. 8 is a flow chart for explaining a fifth embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIG. 9 is a partial cross-sectional view showing the vicinity of the lid of the production container used in the sixth embodiment of the bubble production method of the present invention.
  • FIG. 10 is sectional drawing which shows typically the container used for 7th Embodiment of the manufacturing method of the bubble of this invention.
  • FIG. 11 is a perspective view for explaining an eighth embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIG. 12 is a view for explaining the configuration (handle is omitted) in the vicinity of the rubber plug of the mini-nert valve shown in FIG. 12A is a top view of the vicinity of the rubber plug of the mini-nert valve
  • FIG. 12B is a cross-sectional view taken along the line XX of FIG. 12A.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of the bubble-containing container shown in FIG. FIG.
  • FIG. 14 is a perspective view for demonstrating the manufacturing container used for 9th Embodiment of the manufacturing method of the bubble of this invention.
  • FIG. 15 is sectional drawing for demonstrating the manufacturing container used for 10th Embodiment of the manufacturing method of the bubble of this invention.
  • FIG. 16 is sectional drawing for demonstrating the manufacturing container used for 11th Embodiment of the manufacturing method of the bubble of this invention.
  • FIG. 16A shows the production container in an exploded state
  • FIG. 16B shows the production container in an assembled state.
  • FIG. 17 is sectional drawing for demonstrating the manufacturing container used for 12th Embodiment of the manufacturing method of the bubble of this invention.
  • FIG. 18 is sectional drawing for demonstrating the manufacturing container used for 13th Embodiment of the manufacturing method of the bubble of this invention.
  • FIG. 18A shows the production container in an exploded state
  • FIG. 18B shows the production container in an assembled state
  • FIG. 19 is a view for explaining the position of the opening formed in the lid of the manufacturing container shown in FIG.
  • FIG. 19 (a) is a view for explaining a state before the injection needle of the syringe is pierced through the rubber stopper
  • FIG. 19 (b) shows a tightening portion after the injection needle is removed from the rubber stopper. It is a figure for demonstrating the state fastened to the baseplate part.
  • FIG. 20A is a graph showing the bubble diameter distribution of the bubbles when the bubbles are produced at a rotational speed of 5000 rpm and 6500 rpm.
  • FIG. 20A is a graph showing the bubble diameter distribution of the bubbles when the bubbles are produced at a rotational speed of 5000 rpm and 6500 rpm.
  • FIG. 20B is a partially enlarged view in which the horizontal axis is in the range of 0 to 700 nm in the graph shown in FIG.
  • FIG. 21A is a graph showing the relationship between the number of rotations of the closed vial and the average diameter of the bubbles.
  • FIG. 21B is a graph showing the relationship between the rotational speed of the closed vial and the bubble content.
  • FIG. 22A is a graph showing the relationship between the volume of gas sealed in a closed vial and the average diameter of bubbles.
  • FIG. 22B is a graph showing the relationship between the volume of gas sealed in the closed vial and the bubble content.
  • FIG. 23 is a fluorescence microscope image of a cerebral vascular pericyte cell culture medium cultured at 37 ° C. for 48 hours.
  • FIG. 23 (a) is irradiation intensity: 0.6 W / cm a ultrasonic irradiation image of the sample at 2, FIG. 23 (b), irradiation intensity: at 0.8 W / cm 2 of ultrasonic irradiation samples It is an image.
  • FIG. 24 is a fluorescence microscope image of a cerebral vascular pericyte medium cultured at 37 ° C. for 48 hours.
  • FIG. 24 (b) irradiation intensity: at 1.0 W / cm 2 of ultrasonic irradiation samples It is an image.
  • FIG. 24 is a fluorescence microscope image of a cerebral vascular pericyte medium cultured at 37 ° C. for 48 hours.
  • FIG. 25 is a graph showing the bubble diameter distribution of the bubbles obtained in Examples 4 to 11.
  • FIG. 26 is a graph showing the bubble diameter distribution of the bubbles obtained in Examples 12-17.
  • FIG. 27 is a microscopic image of bubbles and a bubble diameter distribution graph obtained in Examples 18 and 19.
  • FIG. 28 is a microscopic image and a bubble diameter distribution graph of the bubbles obtained in Example 20.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining an example of a bubble manufactured by the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view showing a state in which a part of a bubble manufactured by the bubble manufacturing method of the present invention is cut.
  • FIG. 2 (a) shows a state where a part of the bubble in which the gas is sealed in the outer shell is cut, and
  • FIGS. 2 (b) and 2 (c) show the gas and gas in the outer shell. The state which cut
  • Bubbles 1 (bubbles) shown in FIG. 1 are formed by finely dispersing gas 3 in aqueous liquid 10.
  • the bubble 1 can be manufactured by the first and second embodiments of the bubble manufacturing method of the present invention described later.
  • Such a bubble 1 can be used in various fields such as medical care, food, seafood culture, and wastewater treatment.
  • a case where the bubble 1 is used as an ultrasonic contrast agent in ultrasonic diagnosis will be described.
  • the bubble 1 having such a configuration is formed as an aqueous liquid 10 using an aqueous medium.
  • the aqueous medium include distilled water, pure water, ultrapure water, ion exchange water, water such as RO water, and saline (approximately 0.9% saline) such as PBS (phosphate buffered saline).
  • saline approximately 0.9% saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • An aqueous sugar solution obtained by mixing various sugars such as glucose and sucrose and distilled water. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the gas 3 is a gaseous substance at the temperature (about 20 ° C.) when the bubble 1 is manufactured. Further, the gas 3 is a gaseous substance even when the bubble 1 is injected into the body, that is, at a temperature inside the body (about 37 ° C.).
  • the gas 3 is not particularly limited.
  • an inert gas such as air, nitrogen, nitrous oxide, oxygen, carbon dioxide, hydrogen, helium, argon, xenon, or krypton, sulfur hexafluoride, dipentafluoride.
  • Sulfur, sulfur fluoride such as trifluoromethyl sulfur pentafluoride, methane, ethane, propane, butane, pentane, cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane, ethylene, propylene, propadiene, butene, acetylene, propyne, perfluoropropane, Examples include low molecular weight hydrocarbons such as perfluorobutane and perfluoropentane or halides thereof, ethers such as dimethyl ether, ketones, and esters, and one or more of these are combined. Can be used.
  • the bubble 1 in which these gases are sealed has high stability in the body, and is more reliably transported through the blood vessel to the affected part (treatment target site) or diagnosis target site.
  • the diameter of the bubble 1 composed of such components is changed by changing the conditions of each step of the bubble manufacturing method of the present invention. That is, the produced bubble 1 has a micron size (about several hundreds of micrometers) or a nano size (about several hundreds of nanometers).
  • the average diameter of the bubble 1 is not particularly limited, but is preferably about 10 nm to 1000 ⁇ m, more preferably about 10 nm to 100 ⁇ m, and further preferably about 50 to 2000 nm. If the average diameter of the bubble 1 is within the above range, when the bubble 1 is injected into the body by intravenous injection, the diameter of the bubble 1 is sufficiently small so that the bubble 1 moves smoothly in the blood vessel due to blood flow. Can do. Further, the bubble having such a diameter has high stability in the blood vessel, and is reliably transported to the target site without disappearing while moving in the blood vessel. In particular, since nanobubbles have high stability in blood vessels, they are reliably transported to a target site without almost disappearing.
  • a bubble containing a gas has a property of efficiently reflecting ultrasonic waves at the interface between the liquid and the gas. Therefore, the bubble 1 having an average diameter in the above range has a sufficiently large area at the interface between the liquid (the aqueous liquid 10 or blood when injected into the body as an ultrasound contrast agent) and the gas 3, It is effectively used as an ultrasound contrast agent.
  • the bubble 1 having the above-described configuration can be used in fields other than the medical field such as food, seafood culture, and wastewater treatment.
  • the bubble 1 having an average diameter in the above range can be sufficiently applied to various fields because of its sufficiently high stability and easy handling.
  • the bubble 1 shown in FIG. 2 (a) can be manufactured by the third and fifth to thirteenth embodiments of the bubble manufacturing method of the present invention described later.
  • the bubble 1 in FIG. 2A has an outer shell 2 (spherical film) that constitutes the shell of the bubble 1 and a gas 3 enclosed in the outer shell 2.
  • Such a bubble 1 can be used in various fields such as medical care, food, seafood culture, and wastewater treatment.
  • a case where the bubble 1 is used as an ultrasonic contrast agent in ultrasonic diagnosis will be described.
  • each component which comprises the bubble 1 is demonstrated.
  • the outer shell 2 has a function of holding the gas 3 sealed inside thereof in the bubble 1.
  • Such an outer shell 2 is mainly composed of an amphiphilic material (outer shell material) having both hydrophobic and hydrophilic properties (substituent groups) in one molecule.
  • the amphiphilic material is not particularly limited. Higher fatty acids such as saccharides, saccharides such as galactose, cholesterol, sterols such as sitosterol, surfactants, natural or synthetic polymers, fluorescent dyes, antibodies, labeled metals, etc. Two or more kinds can be used in combination.
  • the amphiphilic material constituting the outer shell 2 is arranged in a spherical shape in the aqueous medium so that the hydrophobic group is on the inner side and the hydrophilic group is on the outer side. Due to this property, the outer shell 2 becomes a micelle composed of a single layer of amphiphilic material molecules or a liposome (spherical molecular film) composed of a double layer of amphiphilic material molecules.
  • the diameter of the bubble 1 composed of such components is the same as that of the bubble 1 shown in FIG.
  • a bubble that encloses a gas in the outer shell has a property of efficiently reflecting ultrasonic waves at the interface between the outer shell and the gas. Therefore, the bubble 1 having the average diameter in the above-described range has a sufficiently large area at the interface between the outer shell 2 and the gas 3 and is effectively used as an ultrasound contrast agent.
  • FIGS. 2B and 2C ⁇ Third configuration example>
  • the bubble 1 shown in FIGS. 2B and 2C can be manufactured by the fourth to thirteenth embodiments of the bubble manufacturing method of the present invention described later.
  • Such a bubble 1 has an outer shell 2 constituting a shell of the bubble 1, a gas 3 and a drug 4 enclosed in the outer shell 2.
  • This bubble 1 is used for ultrasonic therapy and ultrasonic diagnosis.
  • 2B shows the bubble 1 in which the drug 4 is sealed in the outer shell 2 in a gas state or a solid state
  • FIG. 2C shows the outer shell 2 in the drug 4 in the liquid state.
  • the bubble 1 enclosed in the inside is shown.
  • the outer shell 2 has a function of holding the gas 3 and the drug 4 sealed inside thereof in the bubble 1 and has a function of protecting the drug 4 until the bubble 1 is carried to the affected part.
  • the drug 4 is an effective component for treating various diseases such as prostate cancer, uterine fibroids, myocardial infarction, cerebral infarction and the like.
  • the drug 4 is transported to the affected part while being contained in the bubble 1 and is administered to the affected part by rupturing the outer shell 2 near the affected part by ultrasonic irradiation.
  • the drug 4 may be contained in the outer shell 2 itself or may be adsorbed on the outer surface of the outer shell 2.
  • Drug 4 is not particularly limited as long as it is effective for treating diseases, but includes a gene, a drug, and the like. Specifically, peptides, antibodies, oligosaccharides, polysaccharides, genes, oligonucleotides, antisense oligonucleotides, siRNA, ribozymes, triple helix molecules, viral vectors, plasmids, low molecular organic compounds, anticancer agents, metals, etc. One or more of these can be used in combination.
  • the volume ratio of the drug 4 and the gas 3 is preferably about 1:99 to 90:10, more preferably about 10:90 to 70:30, and about 40:60 to 60:40. Is more preferable. If the volume ratio of the drug 4 and the gas 3 is within the above range, the stability of the bubble 1 is improved, and the bubble 1 can be more reliably transported to the vicinity of the affected part. In addition, when the outer shell 2 is ruptured in the vicinity of the affected area, a sufficient amount of drug can be administered to the affected area. Therefore, the affected part can be treated more efficiently.
  • the diameter of the bubble 1 composed of such components is changed by changing the conditions of each step of the bubble manufacturing method of the present invention, as in the bubble 1 shown in FIG.
  • the bubble 1 has an average diameter of about 200 to 300 nm, the bubble 1 can be smoothly transported into the new blood vessel and reach cancer cells. That is, the bubble 1 can be suitably used for cancer treatment. Also, some of the bubbles 1 can be taken into cancer cells through the blood vessel wall. Further, the bubble 1 having an average diameter of about 600 to 900 nm is smoothly transported in the blood vessel of the brain, and the position thereof can be reliably specified in the ultrasonic image. Therefore, it can be suitably used for brain treatment (for example, intravascular treatment).
  • the average diameter of the bubble 1 shown in FIG. 1 and FIGS. 2A to 2C is, for example, a laser diffraction / scattering method, a nanoparticle tracking analysis method, an electric resistance method, an AFM (Atomic Force Microscope), or a laser microscope. It can be measured by observation by the As an apparatus for measuring AFM, for example, a resonance type particle measurement system (trade name: Archimedes) manufactured by Malvern may be used.
  • the bubble 1 as described above can be manufactured by the bubble manufacturing method of the present invention described below.
  • the bubble production method of the present invention will be described in detail.
  • Bubble Manufacturing Method ⁇ First Embodiment> Next, a first embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention will be described.
  • the bubble 1 shown in FIG. 1 described above can be manufactured by the bubble manufacturing method of the present embodiment.
  • FIG. 3 is a flowchart for explaining a first embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention
  • FIGS. 4A to 4D illustrate the first embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of the manufacturing container for the purpose of explaining the state in which the aqueous liquid and the inner surface (upper surface) of the container collided violently in the step of vibrating the container shown in FIG. It is an enlarged view.
  • FIGS. 4 (a) to 4 (d) and FIG. 5 the upper side in FIGS. 4 (a) to 4 (d) and FIG. 5 is referred to as “upper”, and the lower side in FIGS. 4 (a) to (d) and FIG. To tell.
  • the bubble manufacturing method of the present embodiment has five steps (S1) to (S5) as shown in FIG.
  • Step (S1) is a step of preparing an aqueous liquid and a bubble manufacturing container (hereinafter simply referred to as “manufacturing container”) into which the aqueous liquid is injected.
  • Step (S2) is a step of injecting this aqueous liquid to a predetermined height of the production container.
  • Step (S3) is a step of sealing the manufacturing container in a state where the manufacturing container is filled with gas.
  • Step (S4) is a step of vibrating the production container at a predetermined rotational speed so that the aqueous liquid repeatedly collides with the inner surface of the container.
  • Step (S5) is a step of standing the production container.
  • the aqueous liquid 10 is prepared.
  • the aqueous medium described above is used as the aqueous liquid 10.
  • the present inventor has found that the higher the concentration of water in the aqueous liquid 10 is, the smaller the diameter of the generated bubble 1 and the greater the amount of the bubble 1 generated. Therefore, when water (distilled water) is used as the aqueous liquid 10, bubbles 1 having a smaller diameter can be generated in a larger amount.
  • the smaller the sugar concentration in the aqueous sugar solution that is, the higher the water concentration, the smaller the diameter of the generated bubble 1, and the amount of production thereof. Will increase. Therefore, the bubble 1 having a desired diameter can be easily obtained by appropriately setting the type of the aqueous medium and the conditions of the step (S4).
  • the sugar concentration in the aqueous sugar solution described above is not particularly limited, but is preferably about 0.01 to 60 wt%, more preferably about 0.1 to 50 wt%, and about 5 to 30 wt%. More preferably.
  • the sugar aqueous solution having the sugar concentration in the above range the stability of the bubble 1 generated in the aqueous liquid 10 is increased in the step (S4) described later. Therefore, it is possible to more reliably prevent the bubble 1 from unintentionally bursting and improve the temporal stability of the bubble 1.
  • the production container 20 includes an opening, and includes a container main body 21 that contains the aqueous liquid 10 and a lid 22 that seals the container main body 21.
  • the container body 21 is not particularly limited, but it is preferable that the outer shape as shown in FIG.
  • a vial with a capacity of about 0.5 to 20 ml is used as the container body 21.
  • the sealed space in the container body 21 is used. Since an appropriate pressure is applied to the aqueous liquid 10, the bubbles 1 having a uniform size can be stably obtained.
  • a bubble-containing liquid of about 0.3 to 0.6 ml required for one ultrasonic diagnosis is placed in one manufacturing container 20. Can be manufactured. In this case, since the bubble-containing liquid in one manufacturing container 20 can be used up at the time of ultrasonic diagnosis, waste of the bubble-containing liquid to be manufactured can be eliminated.
  • the dimensions of the vial with such a small capacity are such that the length X in the longitudinal direction is about 35 to 60 mm and the outer diameter R is about 10 to 40 mm.
  • the lid 22 has a disk-shaped rubber stopper (septum) 221 that is in close contact with the bottle mouth of the container body 21, and the rubber stopper 221 is fixed to the bottle mouth of the container body 21.
  • a tightening portion 222 is provided.
  • the rubber plug 221 is not particularly limited, and for example, a rubber plug made of silicon can be used.
  • the tightening portion 222 is configured to cover the edge of the rubber plug 221 and has an opening at a substantially center in a plan view.
  • screw grooves formed so as to be screwable with each other are formed on the inner peripheral surface on the bottle mouth side of the tightening portion 222 and on the outer peripheral surface on the bottle mouth side of the container body 21 (not shown).
  • the rubber plug 221 is fixed in close contact with the bottle mouth of the container body 21 by screwing them together.
  • the container body 21 and the tightening part 222 can be fixed in a state where the rubber stopper 221 is in close contact with the bottle mouth of the container body 21 by caulking the fastening part 222 to the bottle mouth of the container body 21.
  • the height (length in the longitudinal direction) of the container body 21 is X [mm]
  • the container When the height of the liquid surface of the aqueous liquid 10 in the main body 21 is Y [mm], it is preferable that the relationship of 0.2 ⁇ Y / X ⁇ 0.7 is satisfied.
  • the aqueous liquid 10 is vigorously collided with the upper and lower surfaces and side surfaces (particularly the upper and lower surfaces) of the production container 20. be able to. Due to this collision, a shock wave is generated in the aqueous liquid 10, and the bubble 1 can be easily formed in the aqueous liquid 10.
  • the relationship preferably satisfies the relationship of 0.3 ⁇ Y / X ⁇ 0.5, and more preferably satisfies the relationship of 0.35 ⁇ Y / X ⁇ 0.4. Thereby, a bubble can be more easily formed in the aqueous liquid 10 in a process (S4).
  • the container body 21 into which the aqueous liquid 10 has been injected is moved into the chamber.
  • the air in the chamber is replaced with gas 3.
  • the aqueous liquid 10 and the gas 3 can be sealed in the production container 20 by fastening the lid 22 to the opening of the container body 21.
  • the gas 3 the various gases described above are used.
  • the manufacturing container 20 is vibrated so that the aqueous liquid 10 repeatedly collides with the upper and lower surfaces and side surfaces (particularly the upper and lower surfaces) of the manufacturing container 20.
  • the manufacturing container 20 is vibrated so that the manufacturing container 20 reciprocates substantially in the longitudinal direction (vertical direction in FIG. 4C).
  • the production container 20 sealed in the step (S3) (the lower diagram in FIG. 4C) is vibrated upward (the middle diagram in FIG. 4C).
  • the aqueous liquid 10 moves to near the middle of the production container 20.
  • the aqueous liquid 10 moves to the upper part of the production container 20 and collides with the lower surface (rubber plug 221) of the lid 22 (upper view in FIG. 4C).
  • a shock wave is generated as shown in FIG. Due to the pressure of the shock wave, the gas 3 is finely dispersed in the aqueous liquid 10 and the bubble 1 is formed.
  • the bubble 1 contains a gas 3 finely dispersed or dissolved in the aqueous liquid 10 by vibration.
  • the manufacturing container 20 (the upper diagram in FIG. 4C) is vibrated downward (the middle diagram in FIG. 4C). Thereby, the aqueous liquid 10 moves to near the middle of the production container 20.
  • the aqueous liquid 10 moves to the lower part of the production container 20 and collides with the lower surface of the production container 20 (the lower view of FIG. 4C). Also at this time, shock waves are generated as shown in FIG.
  • the manufacturing container 20 is vibrated at 5000 rpm or more in order to obtain a sufficiently fine and uniform bubble 1.
  • size (pressure) of the shock wave generated when the aqueous liquid 10 and the production container 20 collide becomes sufficiently large, the bubbles 1 generated in the aqueous liquid 10 are miniaturized, and the size is made uniform. be able to.
  • the number of rotations of the manufacturing container 20 is set to a low value within the above range, the magnitude of the generated shock wave becomes small, so that the bubble 1 having a relatively large diameter can be generated.
  • the “number of rotations” of the manufacturing container 20 means the number of times that the manufacturing container 20 moves through the entire vibration path per unit time. For example, the fact that the manufacturing container 20 vibrates at 5000 rpm means that the manufacturing container 20 moves (vibrates) all vibration paths 5000 times per minute.
  • the rotation speed of the production container 20 is more preferably 5500 rpm or more, and further preferably 6000 to 20000 rpm. By making the rotation speed of the production container 20 within the above range, it is possible to more reliably prevent the bubbles 1 generated by vibration from collapsing due to collision or coalescing and coarsening. Thereby, it is possible to produce a large amount of bubbles 1 of a more uniform size in the aqueous liquid 10 while reducing the diameter of the bubbles 1.
  • a bead type high-speed cell disruption system can be used as an apparatus that can vibrate the production container 20 at the number of rotations as described above.
  • homogenizer a high-speed cell disruption system
  • Precellys manufactured by Bertin Technologies, Inc. can be used.
  • the pressure of the shock wave generated when the aqueous liquid 10 and the production container 20 collide is preferably 40 kPa to 1 GPa.
  • the pressure of the shock wave generated at the time of the collision between the aqueous liquid 10 and the production container 20 falls within the above range, the bubbles 1 generated in the aqueous liquid 10 can be made finer and the size thereof can be made more uniform.
  • the finer bubble 1 can be generated.
  • the vibration width in the longitudinal direction of the production container 20 is preferably about 0.7X to 1.5X [mm], more preferably about 0.8X to 1X [mm]. More preferred. Accordingly, when the production container 20 vibrates, the aqueous liquid 10 can be reliably collided with the lower surface of the production container 20 and the lid 22, and the number of collisions between the aqueous liquid 10 and the lower surface of the production container 20 and the lid 22 can be sufficiently increased. Can be much more. Further, by vibrating the production container 20 with a sufficient vibration width in this way, the speed at which the aqueous liquid 10 moves in the production container 20 is increased. Therefore, the magnitude of the shock wave generated when the aqueous liquid 10 collides with the lower surface of the production container 20 and the lid 22 becomes sufficiently large. As a result, a large amount of fine bubbles 1 can be generated in the aqueous liquid 10.
  • the production container 20 when the production container 20 is reciprocated in the vertical direction, the production container 20 is preferably vibrated in the short direction (horizontal direction).
  • the vibration width in the short direction of the production container 20 is preferably about 0.3X to 0.8X [mm], and more preferably about 0.5X to 0.7X [mm]. Thereby, the effect mentioned above becomes more remarkable.
  • the direction in which the manufacturing container 20 is vibrated may be only the short direction. In this case, the vibration width in the short direction (horizontal direction) of the manufacturing container 20 is preferably the same as the vibration width in the short direction described above.
  • the aqueous liquid 10 reliably collides with the inner side surface of the manufacturing container 20, so that more shock waves can be generated in the aqueous liquid 10. As a result, a large amount of fine bubbles 1 can be generated in the aqueous liquid 10.
  • the instantaneous relative velocity of the manufacturing container 20 and the aqueous liquid 10 in the manufacturing container 20 when colliding the aqueous liquid 10 with the upper and lower surfaces and side surfaces of the manufacturing container 20 is 40 km / h or more. It is preferable to vibrate the container 20. Moreover, it is more preferable to vibrate the production container 20 so that the instantaneous relative speed is 50 km / h or more.
  • the time for vibrating the production container 20 under the above conditions is preferably about 10 to 120 seconds, and more preferably about 30 to 60 seconds.
  • the vibration time of the production container 20 is preferably about 10 to 120 seconds, and more preferably about 30 to 60 seconds.
  • generated in the aqueous liquid 10 can be adjusted by changing the rotation speed of the manufacturing container 20 within the range mentioned above.
  • nanobubbles having a size of about several tens to several hundreds of nanometers can be stably generated.
  • the manufacturing container 20 is vibrated so that the manufacturing container 20 reciprocates substantially in the longitudinal direction, but the method of vibrating the manufacturing container 20 is not limited to this.
  • the manufacturing container 20 may be vibrated so that the manufacturing container 20 rotates mainly in the lateral direction and / or the longitudinal direction thereof.
  • the aqueous liquid 10 in the production container 20 repeatedly impacts the upper and lower surfaces and side surfaces of the production container 20 to generate a shock wave. Even if such a vibration method is used, a large amount of bubbles 1 of uniform size can be stably generated in the aqueous liquid 10.
  • the process (S2), the process (S3), and the process (S4) described above are performed so as to maintain the temperature of the aqueous liquid 10 constant.
  • the characteristics (viscosity, etc.) of the aqueous liquid 10 are stabilized during the bubble production process, the bubbles 1 having a uniform diameter can be stably generated in the aqueous liquid 10.
  • a method for maintaining the temperature of the aqueous liquid 10 constant for example, a method of performing the above-described steps (S2) to (S4) in a glove box or a thermostatic bath can be mentioned.
  • the production container 20 since the production container 20 is vibrated at a high speed in the step (S4), the production container 20 easily generates heat due to a collision between the aqueous liquid 10 and the inner surface of the production container 20. However, it is possible to reliably prevent the temperature of the aqueous liquid 10 from rising by vibrating the manufacturing container 20 in the thermostat. As a result, the bubbles 1 having a uniform diameter can be more stably generated in the aqueous liquid 10.
  • the bubble 1 having an average diameter of about 10 nm to 1000 ⁇ m is manufactured.
  • a large amount of bubbles 1 having an average diameter of 10 nm to 1000 nm can be stably generated.
  • the conventional bubble manufacturing method requires a large-scale reflux device and various systems (tubes, nozzles, compressors, etc.) constituting the bubble manufacturing device. For this reason, it has been difficult to maintain a clean and sterile environment when producing bubbles used in the food and medical fields.
  • the highly airtight production container 20 is used for the production of the bubble 1, sterilization by, for example, ⁇ -ray sterilization in the state where the aqueous liquid 10 and the gas 3 are contained in the production container 20. What is necessary is just to give a process to the manufacturing container 20. FIG.
  • the bubble 1 can be manufactured in a sterilization environment. Therefore, the bubble 1 manufactured in this way can be suitably used in the food field, the medical field, and the like.
  • the bubble 1 obtained as described above can exist stably in the aqueous liquid 10. Therefore, the obtained production container 20 containing the bubble-containing liquid (hereinafter simply referred to as “bubble-containing container”) can be stored at room temperature for a long period of time. Specifically, it can be stored for a period of 6 to 24 months. Further, even after being stored for such a long period of time, since the stability of the bubble 1 in the aqueous liquid 10 is high, it is possible to use it without having to vibrate the bubble-containing container again. Moreover, since the manufacturing container 20 with a small capacity
  • the bubble manufacturing method of this embodiment may perform a centrifugation process with respect to a bubble containing container after a process (S5).
  • the bubbles 1 generated in the manufacturing container 20 can be separated according to a desired diameter.
  • the bubble 1 having a large diameter tends to move to the upper layer of the manufacturing container 20, and the bubble 1 having a small diameter moves to the lower layer of the manufacturing container 20.
  • the average diameter of the bubbles 1 in the bubble-containing liquid remaining in the production container 20 is the step (S5). It becomes smaller than the average diameter of the bubble 1 in the bubble containing liquid obtained later. Moreover, the average diameter of the bubble 1 in the bubble containing liquid (supernatant liquid) attracted
  • the bubble 1 which has a more monodispersed bubble diameter distribution can be obtained by using a centrifugation process.
  • the bubble 1 having a larger diameter can be easily moved to an upper layer, and the bubble 1 having a smaller diameter is moved to a lower layer. As a result, the bubble 1 having a more monodispersed bubble diameter distribution can be obtained.
  • the conditions for the centrifugal separation process are appropriately set according to the average diameter of the bubbles 1 to be separated.
  • the centrifugal acceleration of about 1 ⁇ g to 22000 ⁇ g is applied to the bubble-containing liquid for about 30 seconds to 24 hours.
  • the centrifugal acceleration is set to a small value (about 1 ⁇ g to 100 ⁇ g)
  • a bubble 1 having a more monodispersed bubble diameter distribution is obtained by processing for a long time (about 12 hours to about 24 hours). Can do.
  • the centrifugal acceleration when the centrifugal acceleration is set to a large value (100 ⁇ g to 22000 ⁇ g), a bubble 1 having a more monodispersed bubble diameter distribution is obtained by processing for a relatively short time (about 30 seconds to 12 hours). be able to.
  • the centrifuge capable of performing the centrifugal separation process on the bubble-containing container with the centrifugal acceleration as described above is not particularly limited.
  • a micro high-speed such as a trade name “TOMY MX-301” (manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.)
  • a cooling centrifuge can be used.
  • the centrifugal acceleration (centrifugal force) in the above range is loaded on the bubble-containing liquid by setting the rotation speed to about 50 to 2000 rpm. Moreover, the centrifugation process may be performed once or multiple times.
  • the injection needle of the syringe is pierced through the rubber stopper 221 of the lid 22.
  • the bubble-containing liquid is sucked from the bubble-containing container.
  • the injection needle is removed from the rubber stopper 221, and the injection needle of the syringe that sucked the bubble-containing liquid is punctured into the blood vessel (for example, a vein) of the patient, and the bubble-containing liquid is injected into the blood vessel.
  • the bubble 1 is carried to an affected part by a blood flow.
  • the lid 22 may be removed from the bubble-containing container (manufacturing container 20), and the bubble-containing liquid may be sucked from the bubble-containing container using a syringe.
  • ultrasonic diagnosis at the time of ultrasonic diagnosis, at the timing when the bubble 1 arrives at the site to be diagnosed, diagnostic ultrasonic waves having such a frequency and intensity that the bubble 1 does not burst are irradiated (radiated). Thereafter, a signal (reflected echo) reflected from the diagnosis target part is received and processed, thereby imaging the diagnosis target part. Thereby, ultrasonic diagnosis can be performed.
  • a known ultrasonic probe can be used as a device that receives the ultrasonic wave and the reflected wave from the bubble 1.
  • the bubble-containing container obtained as described above can be applied to various fields other than the use of ultrasonic diagnosis.
  • the bubble 1 in the bubble-containing container obtained as described above has a bactericidal effect on water and food and has an effect of maintaining the freshness of the food.
  • water, and oil hydrophobic component
  • a large amount of oil can be mixed with water. Utilizing this effect, it is possible to cook while suppressing separation of moisture and oil in the food. Therefore, the obtained bubble-containing liquid can be used in the food field.
  • step (S4) and step (S5) may be repeated at least once. By repeating the step (S4) and the step (S5), the bubbles 1 having a uniform diameter can be generated more stably.
  • FIG. 6 is a flowchart for explaining a second embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • 7 (a) to 7 (d) are cross-sectional views for explaining a second embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • the upper side in FIGS. 7A to 7D is referred to as “upper”, and the lower side in FIGS. 7A to 7D is referred to as “lower”.
  • the bubble manufacturing method of the present embodiment except that the manufacturing container is sealed in a state where the inside of the manufacturing container is pressurized in the step (S3) of the first embodiment described above, This is the same as the bubble manufacturing method of the first embodiment described above.
  • Step of sealing the production container The container body 21 is filled with the gas 3, and the production container 20 is sealed in a pressurized state (see FIG. 7B). Specifically, after the space 11 of the container main body 21 into which the aqueous liquid 10 has been injected is purged with the gas 3, the lid 22 is fastened to the opening (bottle opening) of the container main body 21. Thereby, the aqueous liquid 10 and the gas 3 are sealed in the manufacturing container 20.
  • a syringe filled with gas 3 is prepared. Then, the injection needle of the syringe is pierced through the rubber stopper 221. Thereafter, the inside of the production container 20 is pressurized by further adding the gas 3 from the syringe into the production container 20. Thereafter, the injection needle is removed from the rubber stopper 221. Thereby, the manufacturing container 20 sealed with the inside of the manufacturing container 20 pressurized with the gas 3 can be obtained.
  • the pressure in the manufacturing container 20 (the pressure of the gas 3 filled in the gap 11) is made larger than 1.0 atm.
  • the pressure in the production container 20 is preferably 1.5 to 10 atm, and more preferably 2 to 5 atm. Thereby, a part of the gas 3 is finely dispersed or dissolved in the aqueous liquid 10.
  • the bubble 1 is easily generated when the aqueous liquid 10 and the production container 20 collide with each other to generate a shock wave in the step (S 4). Thereby, more bubbles 1 can be generated in the aqueous liquid 10 in the step (S4).
  • the diameter and content of the bubble 1 generated in the aqueous liquid 10 can be more easily adjusted by setting the pressure in the production container 20 to an arbitrary value larger than 1.0 atm.
  • the step (S4) and the step (S5) or the steps (S4) to (S6) are performed as in the first embodiment described above.
  • the step (S4) and the step (S5) or the steps (S4) to (S6) are performed as in the first embodiment described above.
  • the manufacturing container 20 in which the gap 11 is pressurized with the gas 3 is used, so that the gas 3 is sufficiently finely dispersed in the aqueous liquid 10 before the manufacturing container 20 is vibrated. Or it is dissolved. Therefore, when the manufacturing container 20 is vibrated in the step (S4), the bubbles 1 are likely to be generated in the aqueous liquid 10, which is easier and more uniform than the bubble manufacturing method of the first embodiment described above. Bubble 1 can be produced in large quantities.
  • the inside of the bubble-containing container (manufacturing container 20) obtained in the present embodiment is pressurized.
  • the pressure in the bubble-containing container is rapidly reduced, adverse effects such as a change in the particle size of the bubble 1 in the bubble-containing liquid or a decrease in the content may occur. Therefore, when sucking the bubble-containing liquid from the bubble-containing container, it is preferable to reduce the pressure in the bubble-containing container to atmospheric pressure in advance.
  • syringe (a syringe for decompression) different from the syringe for sucking the bubble-containing liquid from the bubble-containing container (the syringe for decompression) is prepared, and the injection needle is inserted into the rubber stopper 221. At that time, the injection needle of the decompression syringe is prevented from coming into contact with the bubble-containing liquid.
  • the pressure in the bubble-containing container is reduced to atmospheric pressure by operating the plunger of the decompression syringe and sucking the gas 3 in the bubble-containing container.
  • the injection needle of the bubble suction syringe is pierced through the rubber stopper 221 and then the bubble-containing liquid is sucked.
  • the plunger of the syringe for decompression is pulled out from the outer cylinder.
  • the injection needle of the decompression syringe is opened inside and outside the bubble-containing container, and air freely enters and exits from the injection needle into the bubble-containing container.
  • the inside of the bubble-containing container is prevented from becoming a negative pressure, that is, the inside of the bubble-containing container is maintained at atmospheric pressure, and the generated bubble 1 is described above.
  • Such adverse effects do not occur.
  • the bubble-containing liquid may be sucked from the bubble-containing container by removing the lid 22 in a state where the pressure in the bubble-containing container is reduced to atmospheric pressure.
  • the pressure in the bubble-containing container is reduced to atmospheric pressure, it is possible to reliably prevent the bubble-containing liquid from being blown out of the manufacturing container 20 at the moment when the lid 22 is removed.
  • the bubble manufacturing method and bubble manufacturing container of the second embodiment also produce the same operations and effects as the bubble manufacturing method of the first embodiment.
  • the bubble manufacturing method of the third embodiment will be described with a focus on differences from the bubble manufacturing methods of the first and second embodiments, and description of similar matters will be omitted.
  • the aqueous liquid 10 includes a material (outer shell material) constituting the outer shell 2 of the bubble 1 and an aqueous medium. That is, in the bubble manufacturing method of the present embodiment, the second liquid described above except that the aqueous liquid 10 prepared in the step (S1) of the second embodiment described above includes an outer shell material in addition to the aqueous medium. This is the same as the bubble manufacturing method of the embodiment.
  • the outer shell material and the aqueous medium constituting the outer shell 2 of the bubble 1 are placed in an aqueous liquid preparation container (hereinafter simply referred to as “preparation container”), and the outer shell material is used as the aqueous medium.
  • preparation container aqueous liquid preparation container
  • a predetermined amount of the outer shell material and the aqueous medium are added to the preparation container, and then stirred to dissolve the outer shell material in the aqueous medium.
  • the order of putting the outer shell material and the aqueous medium into the preparation container is not particularly limited.
  • a method for dissolving the outer shell material in the aqueous medium for example, stirring with a stirring bar, ultrasonic treatment, or the like can be used.
  • the outer shell material the above-mentioned amphiphilic material is used.
  • the aqueous medium the same aqueous medium as in the first embodiment described above can be used.
  • the content of the outer shell material in the aqueous liquid 10 is not particularly limited as long as the bubbles 1 are formed in the aqueous liquid 10 in the step (S4).
  • the preferred content of the outer shell material varies depending on the combination of each type of outer shell material and aqueous medium, but the outer shell material is preferably contained in the aqueous liquid 10 at a concentration equal to or higher than the critical micelle concentration (CMC). .
  • the content of the outer shell material contained in the aqueous liquid 10 is preferably 0.01 to 50 wt%, and more preferably 0.1 to 20 wt%.
  • the concentration of the outer shell material in the aqueous liquid 10 is more surely equal to or higher than the critical micelle concentration, the outer shell 2 (liposome, micelle) can be reliably formed in the aqueous liquid 10. Therefore, in the step (S4) described later, the gas 3 can be easily taken into the liposome or micelle, and the bubble 1 having a desired diameter can be easily generated in the aqueous liquid 10.
  • the bubble 1 generated in the present embodiment can prevent the gas 3 in the bubble 1 from dissolving in the aqueous liquid 10 (aqueous medium) over a long period of time due to the presence of the outer shell 2. Therefore, the stability of the bubble 1 becomes high and it can prevent more reliably that the bubble 1 bursts unintentionally. Furthermore, the variation in the size of the generated bubble 1 can be reduced. That is, the bubble 1 having a uniform size can be generated.
  • the content of the aqueous medium contained in the prepared aqueous liquid 10 is preferably 50 to 99.99 wt%, and more preferably 80 to 99.0 wt%. Thereby, the outer shell material can be sufficiently dissolved in the aqueous medium, and a more uniform aqueous liquid 10 can be obtained.
  • a manufacturing container 20 similar to that of the first and second embodiments described above is prepared.
  • the preparation container and the production container 20 described above may be different containers or the same container.
  • the preparation container and the production container 20 are different containers, for example, as the preparation container, a container having a relatively large capacity is used, while the production container 20 (container body 21) has a relatively small capacity. Containers can be used. In this case, by preparing a large amount of the aqueous liquid 10 having a uniform composition in the preparation container and subdividing the aqueous liquid 10 into a plurality of production containers 20, the size of bubbles generated in each production container 20 ( Diameter) and amount can be made uniform.
  • the step (S2) can be omitted. Therefore, there is an advantage in that the process can be simplified.
  • a container different from the manufacturing container 20 is used as the preparation container.
  • the steps (S2) to (S5) or the steps (S2) to (S6) are performed to stably stabilize a large amount of bubbles 1 of uniform size in the manufacturing container 20. Can be manufactured automatically. At the same time, a production container 20 containing a large amount of uniform-sized bubbles 1 is obtained.
  • the gas 3 is finely dispersed or dissolved in the aqueous liquid 10 by the pressure of the shock wave generated when the aqueous liquid 10 and the production container 20 collide in the step (S4), and the outside of the aqueous liquid 10 is Change the shell material to bubble 1.
  • the bubble 1 (outer shell 2) contains the gas 3 finely dispersed or dissolved in the aqueous liquid 10 in the step (S3) and the gas 3 finely dispersed or dissolved in the aqueous liquid 10 by the vibration of this step. It is.
  • the inside of the production container 20 may not be pressurized (that is, the pressure in the production container 20 is atmospheric pressure), and the production is performed in the same manner as in the second embodiment.
  • the inside of the container 20 may be pressurized.
  • the bubble manufacturing method and bubble manufacturing container of the third embodiment also produce the same operations and effects as the bubble manufacturing method of the first and second embodiments.
  • the aqueous liquid 10 includes an aqueous medium, a shell material, and a drug 4. That is, the bubble manufacturing method of the present embodiment is the same as that described above except that the aqueous liquid 10 to be adjusted in the step (S1) of the third embodiment described above contains the drug 4 in addition to the outer shell material and the aqueous medium. This is the same as the bubble manufacturing method of the third embodiment.
  • the outer shell material, the drug 4 and the aqueous medium are placed in a preparation container, and the outer shell material and the drug 4 are dissolved in the aqueous medium to prepare the aqueous liquid 10. That is, a predetermined amount of the outer shell material, the drug 4 and the aqueous medium are added to the preparation container, and then stirred to dissolve the outer shell material and the drug 4 in the aqueous medium.
  • the order in which the outer shell material, the drug 4, and the aqueous medium are put into the preparation container is not particularly limited.
  • a method for dissolving the outer shell material and the drug 4 in the aqueous medium for example, stirring with a stirring bar, ultrasonic treatment, or the like can be used.
  • the above-mentioned genes, drugs, etc. are used.
  • the content of the drug 4 contained in the prepared aqueous liquid 10 is preferably 0.1 to 50 wt%, and more preferably 20 to 50 wt%. Thereby, sufficient quantity of the medicine 4 can be included in the bubble 1 manufactured. As a result, it is possible to manufacture the bubble 1 having a better therapeutic effect on the affected area.
  • the aqueous liquid 10 may not include the outer shell material.
  • the steps (S2) to (S5) or the steps (S2) to (S6) are performed in the same manner as in the third embodiment described above, thereby the inside of the production container 20 It is possible to stably produce a large amount of bubbles 1 of uniform size (see FIGS. 2B and 2C). At the same time, a production container 20 containing a large amount of uniform-sized bubbles 1 is obtained.
  • the gas 3 finely dispersed or dissolved in the aqueous liquid 10 in the step (S3), and finely dispersed or dissolved in the aqueous liquid 10 by the vibration of the step (S4).
  • Gas 3 and drug 4 are included.
  • the drug 4 is enclosed in the outer shell 2 together with the gas 3, or is contained or adsorbed in the outer shell 2 itself.
  • the bubble-containing container obtained as described above is used for ultrasonic therapy or ultrasonic diagnosis of a patient.
  • the injection needle of the syringe is pierced through the rubber stopper 221 of the lid 22.
  • the bubble-containing liquid is sucked from the bubble-containing container using a syringe.
  • the injection needle of the syringe that sucked the bubble-containing liquid is punctured into the blood vessel (for example, a vein) of the patient, and the bubble-containing liquid is injected into the blood vessel.
  • the bubble 1 is carried to an affected part by a blood flow.
  • the outer shell 2 is ruptured by irradiating a therapeutic ultrasonic wave having a frequency and intensity enough to rupture the outer shell 2.
  • the drug 4 in the bubble 1 can be concentrated (supplied) to the affected area to treat the affected area.
  • the ultrasonic wave for diagnosis is irradiated to the bubble 1 in the blood vessel, and the reflected wave is monitored. Thereby, the position and behavior of the bubble 1 in the blood vessel (inside the body) can be accurately grasped.
  • the bubble 1 reaches the vicinity of the target affected part, the bubble 1 (outer shell 2) is ruptured by irradiating therapeutic ultrasonic waves. Thereby, a drug can be supplied to an affected part more accurately and treated.
  • the gas 3 in the outer shell 2 is changed. Dissolve in aqueous medium. Thereafter, when the gas 3 in the outer shell 2 is completely dissolved in the aqueous medium, only the drug 4 is sealed in the outer shell 2. That is, in such a case, the bubble 1 becomes a liposome or a micelle in which only the drug 4 is enclosed in the outer shell 2.
  • the liposomes or micelles thus obtained can also be used as drugs.
  • the intensity (output) of therapeutic ultrasound is preferably about 0.1 to 30 W / cm 2 , and more preferably about 0.5 to 10 W / cm 2 .
  • the intensity of therapeutic ultrasound is preferably about 10 to 120 seconds, more preferably about 30 to 60 seconds.
  • the frequency of the ultrasonic wave irradiated during the ultrasonic treatment is preferably about 100 kHz to 10 MHz, and more preferably about 700 kHz to 1 MHz.
  • the bubble can be ruptured with a lower ultrasonic output.
  • FIG. 8 is a flowchart for explaining a fifth embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • the bubble manufacturing method of the fifth embodiment will be described with a focus on differences from the bubble manufacturing methods of the first to fourth embodiments, and description of similar matters will be omitted.
  • the bubble manufacturing method according to the present embodiment includes steps (S7) to (S5) (or steps (S1) to (S6)) of the second embodiment described above. ) And step (S8).
  • Step (S7) is a step of changing the pressure in the production container.
  • Step (S8) is a step of setting the number of rotations for vibrating the production container.
  • the bubble manufacturing method of the present embodiment when the rotation speed is not changed in step (S8) (“NO” is selected in step (S8) in FIG. 8), the step (S4 ′) and the step are further performed. (S5 ′). On the other hand, when the rotational speed is changed in the step (S8) ("YES” is selected in the step (S8) in FIG. 8), the step (S9) and the step (S10) are further included. Furthermore, the bubble manufacturing method of the present embodiment includes a step (S11) of changing the pressure in the manufacturing container. Hereinafter, each process after a process (S7) is demonstrated one by one.
  • the aqueous liquid 10 may be only an aqueous medium as in the first and second embodiments, or only the aqueous medium and the outer material as in the third embodiment.
  • an aqueous medium, a shell material, and the drug 4 may be included.
  • the inside of the manufacturing container 20 is pressurized like the process (S3) mentioned above.
  • the gas 3 to be injected may be the same as or different from the gas 3 used in the step (S3), but the same gas 3 is used from the viewpoint of the stability of the finally generated bubble 1. Is preferred.
  • the pressure in the production container 20 is preferably higher than the pressure in the step (S3) by 0.5 atm or more, more preferably 1 to 10 atm.
  • generated in the process (S4) mentioned above can be produced
  • the pressure in the production container 20 is appropriately adjusted within a range of greater than 1.0 atm and lower than the pressure in the step (S3).
  • Rotational speed at the time of revibrating the container is set to 5000 rpm or more as in the above-described step (S4).
  • step (S8) when the rotational speed when the container is revibrated is not changed from the rotational speed in the step (S4), that is, when “NO” is selected in the step (S8) in FIG. (S4 ′) is performed.
  • step (S8) when changing the rotation speed when the container is revibrated from the rotation speed in the step (S4), that is, when “YES” is selected in the step (S8) in FIG. A process (S9) is performed.
  • the diameter of the bubble 1 newly generated in the present embodiment changes according to the pressure changed in the step (S7). That is, since the diameter of the bubble 1 can be adjusted by changing the pressure, the bubble 1 having a desired different diameter (average diameter) can be manufactured with good reproducibility. Moreover, since it is not necessary to change the setting of the apparatus which vibrates the manufacturing container 20, the bubble 1 which has a different diameter can be manufactured more simply.
  • the rotation speed of the production container 20 is not particularly limited as long as it is higher than the rotation speed in the step (S4), but is preferably 6000 to 20000 rpm, and more preferably 7000 to 20000 rpm.
  • the manufacturing container 20 is vibrated with the rotation speed larger than the rotation speed in process (S4), the bubble 1 of a diameter smaller than the bubble 1 produced
  • the bubbles 1 generated in the step (S4) and this step can be more reliably prevented from collapsing or coalescing to become coarse. can do.
  • generated in the process (S4) can be manufactured.
  • the rotation speed of the production container 20 is not particularly limited as long as it is lower than the rotation speed in the step (S4), but it is preferably 5000 to 9000 rpm, more preferably 5500 to 7500 rpm.
  • the manufacturing container 20 is vibrated at the rotation speed lower than the rotation speed in the step (S4), the bubble 1 having a larger diameter than the bubble 1 generated in the step (S4) can be generated.
  • the bubbles 1 generated in the step (S4) and this step can be more reliably prevented from collapsing or coalescing to become coarse. can do. Thereby, the bubble 1 produced
  • the diameter of the bubble 1 newly generated in the present embodiment is the change in pressure in the production container 20 and the rotation during revibration. It depends on the number.
  • this process is advantageous when manufacturing the bubble 1 having a significantly different average diameter.
  • Step of standing the production container After the production container 20 is vibrated in the step (S9), the production container 20 is left in the same manner as in the step (S5). Thereby, the bubble 1 of a different size can be stably manufactured in the manufacturing container 20. At the same time, a production container 20 (bubble-containing container) containing a large amount of such bubbles 1 is obtained. A process (S11) is performed after standing still.
  • step (S11) Step of changing pressure in manufacturing container again
  • the pressure in manufacturing container 20 is not changed, that is, when “NO” is selected in step (S11) in FIG.
  • the method ends.
  • the first bubble 1 and the second bubble 1 having different average diameters in the range of the average diameter of 10 nm to 1000 ⁇ m are manufactured.
  • step (S8) is performed. Thereafter, the above-described steps (S4 '), (S5') and (S11), or steps (S9), (S10) and (S11) are repeated. As a result, it is possible to manufacture bubbles 1 having a plurality of average diameters different from each other in an average diameter range of 10 nm to 1000 ⁇ m.
  • the number of bubbles 1 having a plurality of different average diameters corresponding to the number of times the pressure is changed can be manufactured.
  • the bubble-containing container obtained as described above contains bubbles 1 having different diameters in the aqueous liquid 10. Due to the difference in size, the ease of passage of the bubble 1 into the blood vessel and the site to be transported also change (for example, the smaller the size of the bubble 1, the more it can be transported to the tip of the capillary).
  • the bubble-containing liquid thus obtained can be used in a multifaceted manner in accordance with the purpose of ultrasonic therapy.
  • FIG. 9 is a partial cross-sectional view showing the vicinity of the lid of the production container used in the sixth embodiment of the bubble production method of the present invention.
  • the upper side in FIG. 9 is referred to as “upper”, and the lower side in FIG. 9 is referred to as “lower”.
  • the bubble manufacturing method of this embodiment is the same as the bubble manufacturing method of the first to fifth embodiments described above except that the configuration of the lid 22 of the manufacturing container 20 (second embodiment of the bubble manufacturing container) is different. It is.
  • the bottom plate portion 223 is provided at the opening of the container main body 21 in a state of being bonded to the rubber stopper 221. Since the manufacturing container 20 of the present embodiment includes the bottom plate portion 223, the mass of the lid 22 becomes larger than the lid 22 of the manufacturing container 20 of the first embodiment described above. That is, the bottom plate portion 22 becomes a weight portion that increases the mass of the manufacturing container 20.
  • the bottom plate portion 223 is a member having a disk shape smaller in diameter than the rubber plug 221. Further, the bottom plate portion 223 is formed with a through-hole 224 through which the injection needle of the syringe is inserted substantially at the center in plan view so as to correspond to the opening of the tightening portion 222.
  • the size of the through hole 224 is not particularly limited. However, when the through hole 224 is the same size as the rubber plug 221 exposed from the tightening portion 222, the injection needle is inserted anywhere in the region exposed from the tightening portion 222 of the rubber plug 221 in the step (S3). You can pass.
  • the through-hole 224 may be a size through which the injection needle can be inserted. In this case, a mark corresponding to the through hole 224 is attached to the upper surface of the rubber plug 221 (not shown), and the injection needle may be pierced through the rubber plug 221 using this mark as a mark.
  • the bottom plate portion 223 may be provided with a plurality of through holes 224.
  • two through holes 224 of the through hole for inserting the injection needle of the syringe filled with gas 3 and the injection needle of the above-described decompression syringe and the through hole for inserting the injection needle of the bubble suction syringe May be provided on the bottom plate portion 223.
  • the bubble 1 can be sucked by the bubble suction syringe in a state where the pressure in the bubble-containing container is set to atmospheric pressure.
  • a mark may be attached at a position corresponding to each through hole 224 as a mark for piercing the injection needle of each syringe.
  • Examples of the constituent material of the bottom plate portion 223 include various ceramic materials and various metal materials, and materials having a density higher than glass (2000 kg / m 3 or more) are preferable.
  • Examples of such materials include stainless steel such as cast iron (density: about 7000 to 7700 kg / m 3 ), chromium nickel steel 18/8 (density: about 7900 kg / m 3 ), and V2A steel (density: about 7900 kg / m 3 ).
  • the bottom plate portion 223 made of such a material has a larger mass than a member formed using a material having a low specific gravity (density) such as synthetic rubber or resin.
  • a material having a low specific gravity (density) such as synthetic rubber or resin.
  • the rubber plug 221 is pierced so that the injection needle of the syringe filled with the gas 3 passes through the through hole 224 of the bottom plate portion 223.
  • the inside of the production container 20 is pressurized by adding the gas 3 from the syringe into the production container 20.
  • the production container 20 sealed in a state where the inside of the production container 20 is pressurized by the gas 3 can be obtained.
  • a bubble-containing container can be obtained through the same steps as the bubble production methods of the first to fifth embodiments described above.
  • the bubble manufacturing method of the sixth embodiment produces the same operations and effects as the bubble manufacturing methods of the first to fifth embodiments.
  • 10 (a) to 10 (f) are cross-sectional views schematically showing a container used in the seventh embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIGS. 10A to 10F the upper side in FIGS. 10A to 10F is referred to as “upper”, and the lower side in FIGS. 10A to 10F is referred to as “lower”.
  • the bubble manufacturing method of the seventh embodiment will be described focusing on the differences from the bubble manufacturing methods of the first to sixth embodiments, and the description of the same matters will be omitted.
  • the bubble manufacturing method of the present embodiment is the same as the bubble manufacturing method of the first to sixth embodiments described above except that the shape of the container (production container) is different.
  • the production container 20 (third embodiment of the bubble production container) has various shapes of container main bodies 21 shown in FIGS. 10 (a) to 10 (d) and the shape of the upper surface of each container main body 21. And a combined lid (not shown).
  • the inner surface of the container body 21 includes at least one of a concave surface, a convex surface, and an uneven surface.
  • the container main body 21 shown in FIG. 10A is a container whose upper surface and lower surface are convex surfaces protruding toward the inside.
  • a manufacturing container 20 shown in FIG. 10B is a container whose upper and lower surfaces are uneven surfaces.
  • the manufacturing container 20 shown in FIG. 10C is a container whose upper surface and lower surface are concave surfaces protruding outward.
  • the manufacturing container shown in FIG. 10D is a container whose side surface is a convex surface that curves toward the inside of the manufacturing container 20.
  • Such a surface (concave surface, convex surface, or uneven surface) has a larger surface area than a flat surface. Therefore, in the above-described step (S4), the area where the aqueous liquid 10 can collide with the inner surface of the production container is increased, and more shock waves can be generated. Moreover, in such a surface, the degree of pressure of the generated shock wave varies depending on the shape. Thereby, a large amount of bubbles 1 having different diameters can be generated in the aqueous liquid 10.
  • the height of the container body 21 can be made higher than that of the container body 21 of the first to sixth embodiments described above.
  • the moving distance of the aqueous liquid 10 becomes long when the production container is vibrated in the steps (S4, S4 'and S9). Therefore, the magnitude of the shock wave generated at the time of the collision can be increased. Thereby, the size of the bubble 1 manufactured in the aqueous liquid 10 can be made smaller.
  • the height of the container body 21 can be made lower than that of the container body 21 of the first to sixth embodiments described above.
  • the manufacturing container is vibrated in the steps (S4, S4 'and S9), the moving distance of the aqueous liquid 10 is shortened. Therefore, since the frequency
  • the bubble manufacturing method of the seventh embodiment produces the same operations and effects as the bubble manufacturing methods of the first to sixth embodiments.
  • FIGS. 11A to 11C are perspective views for explaining an eighth embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention.
  • FIG. 12 is a view for explaining the configuration (handle is omitted) in the vicinity of the rubber plug of the mini-nert valve shown in FIG. 11 (a), and
  • FIG. FIG. 12B is a cross-sectional view taken along the line XX of FIG.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of the bubble-containing container shown in FIG.
  • FIGS. 11A to 11C, FIG. 12B, and FIG. 13 and the front side in FIG. 12A are referred to as “up”, and FIG. ) To (c), FIG. 12 (b), the lower side in FIG. 13 and the back side in FIG. 12 (a) are referred to as “lower”.
  • the left side in FIGS. 11A to 11C is referred to as “left”, and the right side in FIGS. 11A to 11C is referred to as “right”.
  • the bubble manufacturing method of the eighth embodiment will be described with a focus on differences from the bubble manufacturing methods of the first to seventh embodiments, and description of similar matters will be omitted.
  • the bubble manufacturing method of the present embodiment is the same as the bubble manufacturing method of the first to fifth embodiments described above except that the configuration of the manufacturing container is different.
  • Step A production container 20 (fourth embodiment of a bubble production container) as shown in FIG. 11A is prepared.
  • the manufacturing container 20 includes a container main body 21 and a lid 22 in the same manner as the manufacturing container 20 of the first embodiment described above.
  • the lid 22 is provided with a mininate valve 30 and a tube 33 for connecting the rubber plug 221 and the mininate valve 30 on the upper side thereof.
  • the mini-nert valve 30 includes a valve main body 31 having a through hole 311, a rubber plug 32 embedded in the through hole 311 and formed with a pipe line 321 penetrating in the thickness direction (vertical direction), and opening and closing of the pipe line 321. And a handle (opening / closing mechanism) 34 for controlling.
  • the valve body 31 has a substantially rectangular parallelepiped shape, and a through-hole 311 that penetrates in the thickness direction (vertical direction) is formed near the center in the longitudinal direction (see FIGS. 12A and 12B). ). Further, as shown in FIG. 12B, the valve body 31 is formed with a through hole 312 penetrating in the longitudinal direction.
  • the rubber plug 32 has a substantially cylindrical shape, and is made of, for example, silicon rubber.
  • the rubber plug 32 is inserted into the through hole 311 of the valve body 31 and is fixed (embedded) in the valve body 31.
  • a pipe line 321 is formed in which the injection needle 41 of the syringe 40 can be inserted.
  • the rubber plug 32 is formed with a through hole 322 that is orthogonal to the pipe 321 and penetrates in the width direction (left-right direction) of the rubber plug 32 (see FIG. 12B).
  • the through hole 322 of the rubber plug 32 and the through hole 312 of the valve body 31 communicate with each other, and a shaft 342 of the handle 34 described later is slidably inserted into the through hole 322 and the through hole 312.
  • the handle 34 is connected to a pair of knobs 341 provided on both ends in the longitudinal direction (left and right direction) of the valve body 31 and the knobs 341, and is connected to the through hole 322 of the rubber plug 32 and the through hole 312 of the valve body 31. And a shaft 342 slidably inserted. A part of the shaft 342 is formed with a through hole 343 penetrating in the thickness direction (vertical direction in FIG. 11A).
  • the tube 33 is not particularly limited, and is formed of, for example, a silicon tube.
  • the upper end portion of the tube 33 communicates with the pipe line 321 of the rubber plug 32, and the lower end portion of the tube 33 communicates with the internal space (gap portion 11) of the container main body 21 via the rubber plug 221. .
  • the pipe line 321 and the internal space of the container main body 21 communicate with each other via the tube 33.
  • the left knob 341 is pushed to the right so that the left knob 341 and the left end of the valve body 31 are in contact with each other.
  • plan view top view
  • the through hole 343 of the shaft 342 and the pipe line 321 overlap (communicate).
  • the pipe 321 is opened, and the pipe 321, the tube 33, and the internal space of the container body 21 are in communication (see FIGS. 11A and 12B).
  • the right knob 341 is pushed leftward so that the right knob 341 and the right end of the valve body 31 are in contact with each other.
  • the position of the through hole 343 of the shaft 342 and the position of the pipe line 321 are shifted. Thereby, the pipe line 321 is closed and the inside of the manufacturing container 20 is sealed.
  • the lid 22 includes a rubber plug 221, a tightening portion 222, and a bottom plate portion 223, as in the case of the lid 22 shown in FIG. 9 (see FIG. 13).
  • the lower end portion of the tube 33 (the end portion on the side connected to the rubber plug 221) is disposed at a position corresponding to the through hole 224 of the bottom plate portion 223. Therefore, the tube 33 communicates with the inside of the container main body 21.
  • a syringe 40 filled with the gas 3 is prepared.
  • the knob 341 on the left side of the handle 34 is pressed to the right to open the pipe line 321, and the pipe line 321 and the tube 33 are communicated with each other.
  • the injection needle 41 of the syringe 40 is inserted into the pipe line 321, and then the gas 3 is further added from the syringe 40 into the manufacturing container 20 through the mininert valve 30 and the tube 33. Thereby, the inside of the manufacturing container 20 is pressurized.
  • the tube 33 is cut at the side of the sealing part 331 on the side of the mininert valve 30 (upper side in the drawing), and the manufacturing container 20 sealed in a state where the inside of the manufacturing container 20 is pressurized by the gas 3 can be obtained. (Refer FIG.11 (c)).
  • the subsequent steps are performed in the same manner as in the first to fifth embodiments described above, whereby a uniform amount of bubbles 1 can be stably produced in a large amount in the production container 20.
  • a production container (sealed container) 20 (bubble-containing container) containing a large amount of uniform-sized bubbles 1 is obtained.
  • the inside of the manufacturing container 20 can be pressurized without directly inserting the injection needle 41 into the rubber stopper 221 of the lid 22. That is, in this embodiment, since there is no through hole in the lid 22 and the tube 33 (section from the rubber plug 221 to the sealing portion 331), the airtightness in the manufacturing container 20 can be improved.
  • the bubble 1 can be present more stably in the aqueous liquid 10 in the finally obtained bubble-containing container. That is, the long-term storage stability of the bubble-containing container is further improved.
  • FIG. 14 is a perspective view for explaining a production container used in the ninth embodiment of the bubble production method of the present invention.
  • the upper side in FIG. 14 is referred to as “upper”, and the lower side in FIG. 14 is referred to as “lower”. Further, the left side in FIG. 14 is referred to as “left”, and the right side in FIG. 14 is referred to as “right”.
  • the bubble manufacturing method of the ninth embodiment will be described focusing on the differences from the bubble manufacturing methods of the first to eighth embodiments, and the description of the same matters will be omitted.
  • the bubble manufacturing method of the present embodiment differs from the bubble manufacturing method of the eighth embodiment described above in that the mini-nert valve 30 is provided on the side surface of the container body 21.
  • the production container 20 used in the present embodiment includes a container main body 21 and a lid 22 used in the bubble production method of the eighth embodiment described above. And the mininate valve 30 and the tube 33 for connecting the container main body 21 and the mininate valve 30 to each other. Further, in the manufacturing container 20 of the present embodiment, the mini-nert valve 30 is provided on the lid 22 side (upper side in the drawing) from the liquid level of the aqueous liquid 10.
  • the tube 33 is composed of a glass tube and is formed integrally with the container body 21 (vial bottle).
  • the left end portion of the tube 33 communicates with the internal space (gap portion 11) of the container main body 21, and the right end portion of the tube 33 is connected to the conduit 321 of the rubber plug 32. Communicate. Therefore, also in this embodiment, the pipe line 321 and the internal space of the container main body 21 communicate with each other through the tube 33.
  • a bubble-containing container can be obtained through the same steps as the bubble manufacturing method of the eighth embodiment described above.
  • FIG. 15 is a cross-sectional view for explaining a production container used in the tenth embodiment of the bubble production method of the present invention.
  • the upper side in FIG. 15 is referred to as “upper”, and the lower side in FIG. 15 is referred to as “lower”. Further, the left side in FIG. 15 is referred to as “left”, and the right side in FIG. 15 is referred to as “right”.
  • the bubble manufacturing method according to the tenth embodiment will be described focusing on the differences from the bubble manufacturing methods according to the first to ninth embodiments, and description of similar matters will be omitted.
  • the bubble manufacturing container of the present embodiment is configured such that the longitudinal direction thereof is substantially horizontal (in the above-described first to ninth embodiments, the longitudinal direction of the manufacturing container 20 is vertical).
  • the production container is vibrated in the horizontal direction.
  • the bubble manufacturing method of the present embodiment is different from the bubble manufacturing methods of the first to ninth embodiments described above. Specifically, in the step (S4), the manufacturing container 20 is vibrated so that the manufacturing container 20 shown in FIG. 15 reciprocates substantially in the horizontal direction.
  • the manufacturing container 20 of the present embodiment includes a container body 21 having a cylindrical portion 211 at the top, a rubber plug 23 that seals the opening of the cylindrical portion 211, and two weight portions 5 that are fixed to both ends of the container body 21. And.
  • the container body 21 has a substantially cylindrical shape that is long in the horizontal direction (left-right direction in FIG. 15).
  • a cylindrical portion (protruding portion) 211 that protrudes vertically upward from the upper surface of the container main body 21 is formed in the approximate center of the container main body 21.
  • screw grooves 212 are formed on both ends of the container body 21.
  • the rubber plug 23 is not particularly limited, and for example, a rubber plug made of silicon can be used.
  • the weight portion 5 includes a flat plate portion 51 having a disk shape and a cylindrical portion 52 erected from an edge portion of the flat plate portion 51, and a member having a substantially C shape when the outer shape thereof is viewed in cross section. It is.
  • a thread groove 521 that can be screwed into the thread groove 212 of the container body 21 is formed on the inner peripheral side of the cylindrical portion 52.
  • Such a weight portion 5 is made of a material having a large specific gravity, such as a ceramic material or a metal material, like the bottom plate portion 223 of the lid 22 shown in FIG. 9 described above. Therefore, by attaching the weight part 5 to the container main body 21, the mass of the both ends of the container main body 21 can be increased. Thereby, in the process (S4), the magnitude
  • iron or an iron alloy such as stainless steel is used among metal materials from the viewpoint of high specific gravity and high corrosion resistance with respect to the constituent components of the aqueous liquid 10. Particularly preferred.
  • such a weight portion 5 can be easily attached to and detached from the container main body 21.
  • the mass of the weight part 5 can be adjusted as appropriate.
  • the mass of the weight part 5 can be adjusted in the step (S4). That is, in the bubble manufacturing method of the present embodiment, bubbles 1 having various sizes and contents can be manufactured using the same manufacturing container 20. Therefore, since it is not necessary to prepare a plurality of types of production containers 20 having different sizes in accordance with the target size and content of the bubble 1, the productivity of the bubble-containing container is improved.
  • a syringe 40 filled with the gas 3 is prepared. Then, the injection needle 41 of the syringe 40 is pierced through the rubber plug 23. Thereafter, the gas 3 is further added from the syringe 40 into the production container 20. Thereby, the inside of the manufacturing container 20 is pressurized. Thereafter, by removing the injection needle from the rubber stopper 23, it is possible to obtain the sealed manufacturing container 20 with the inside of the manufacturing container 20 being pressurized by the gas 3.
  • the manufacturing container 20 is vibrated so that the aqueous liquid 10 repeatedly collides with both ends and side surfaces (particularly both ends) of the manufacturing container 20.
  • the manufacturing container 20 is vibrated so that the manufacturing container 20 reciprocates substantially in the horizontal direction (longitudinal direction) of the manufacturing container 20.
  • the vibration of the manufacturing container 20 in this embodiment can be performed on the same conditions as the process (S4) of 1st Embodiment mentioned above.
  • the subsequent steps are performed in the same manner as in the first to fifth embodiments described above, whereby a uniform amount of bubbles 1 can be stably produced in a large amount in the production container 20.
  • a production container (sealed container) 20 (bubble-containing container) containing a large amount of uniform-sized bubbles 1 is obtained.
  • FIG. 16 is a cross-sectional view for explaining a production container used in the eleventh embodiment of the bubble production method of the present invention.
  • FIG. 16A shows the production container in an exploded state
  • FIG. 16B shows the production container in an assembled state.
  • FIGS. 16A and 16B the upper side in FIGS. 16A and 16B is referred to as “upper”, and the lower side in FIGS. 16A and 16B is referred to as “lower”. Also, the left side in FIGS. 16A and 16B is referred to as “left”, and the right side in FIGS. 16A and 16B is referred to as “right”.
  • the bubble manufacturing method according to the eleventh embodiment will be described focusing on the differences from the bubble manufacturing methods according to the first to tenth embodiments, and description of similar matters will be omitted.
  • both ends of the container body 21 of the manufacturing container 20 are opened to the outside. Except for this, it is the same as the bubble manufacturing method using the manufacturing container 20 shown in FIG. 15 of the tenth embodiment described above. That is, the container main body 21 is configured by a cylindrical member having both ends opened to the outside.
  • the weight part 5 is first attached to the container body 21 by screwing the thread groove 521 of the weight part 5 into the screw groove 212 of the container body 21. As shown in FIG. 16B, in the state where the weight portion 5 is attached to the container main body 21, the flat plate portion 51 is in close contact with each end portion of the container main body 21.
  • a packing for enhancing the adhesion between the weight portion 5 and the container body 21 may be disposed between the flat plate portion 51 and each end portion of the container body 21. Thereby, the airtightness of the manufacturing container 20 can be improved.
  • a bubble-containing container can be obtained through the same steps as the bubble manufacturing method of the present embodiment described above.
  • the bubble-containing container thus obtained can be used by sucking the bubble-containing liquid after inserting the syringe needle through the rubber stopper 23. Moreover, in this structure, the weight part 5 is removed from the container main body 21, and a bubble containing liquid can be taken out from a bubble containing container directly, without using a syringe.
  • the bubble manufacturing method according to the eleventh embodiment produces the same operations and effects as the bubble manufacturing methods according to the first to tenth embodiments.
  • ⁇ Twelfth embodiment> Next, a twelfth embodiment of the bubble manufacturing method of the present invention will be described.
  • FIG. 17 is sectional drawing for demonstrating the manufacturing container used for 12th Embodiment of the manufacturing method of the bubble of this invention.
  • the upper side in FIG. 17 is referred to as “upper”, and the lower side in FIG. 17 is referred to as “lower”.
  • the bubble manufacturing method of the present embodiment is the same as the bubble manufacturing method of the first to fifth embodiments described above except that the configuration of the manufacturing container is different.
  • the manufacturing container 20 of the present embodiment includes a container body 21, a lid 22 that seals the container body 21, and a weight part 5 that is provided on the other end side of the container body 21 so as to be movable in the longitudinal direction of the container body 21. And a pair of O-rings 6 for fixing the weight portion 5.
  • the lid 22 has the same configuration as the lid 22 of the manufacturing container 20 of the first embodiment described above.
  • the container body 21 has a substantially bottomed cylindrical shape.
  • the container body 21 includes an upper body part 215 to which the lid 22 is attached and a lower body part 216 to which the weight part 5 is attached and has an inner diameter smaller than that of the upper body part 215.
  • the upper main body portion 215 has a reduced diameter portion 217 that is reduced in diameter so as to have the same inner diameter as that of the lower main body portion 216.
  • a thread groove 214 that can be screwed with the weight portion 5 (the inner peripheral surface of the weight portion 5) is formed over the entire outer peripheral surface of the lower main body portion 216.
  • the material which comprises the container main body 21 is not specifically limited, Various ceramic materials, resin materials, etc., such as glass, can be used.
  • the length of the upper body 215 in the longitudinal direction is not particularly limited, but is preferably about 10 to 60 mm, and more preferably about 15 to 30 mm. Further, the inner diameter of the upper main body 215 is preferably about 5 to 20 mm, and more preferably about 8 to 15 mm.
  • the length of the lower body 216 in the longitudinal direction is not particularly limited, but is preferably about 10 to 35 mm, and more preferably about 13 to 23 mm. Further, the inner diameter of the lower main body 216 is not particularly limited as long as it is smaller than the inner diameter of the upper main body 215, but is preferably about 2 to 15 mm, more preferably about 3 to 8 mm.
  • the container body 21 having such a size By using the container body 21 having such a size, an appropriate pressure is applied to the aqueous liquid 10 in the sealed space in the container body 21, so that the bubble 1 having a uniform size can be stably obtained. Further, in this case, since the bubble-containing liquid in one production container 20 can be used up in ultrasonic diagnosis, waste of the produced bubble-containing liquid can be eliminated. Further, when the inner diameter of the upper main body portion 215 and the inner diameter of the lower main body portion 216 are within the above range, the difference between the inner diameter of the upper main body portion 215 and the inner diameter of the lower main body portion 216 is increased, and the reduced diameter portion 217 is increased. Become.
  • the aqueous liquid 10 moves from the upper main body 215 to the lower main body 216, the aqueous liquid 10 collides with the reduced diameter portion 217, and a shock wave is generated.
  • the frequency of occurrence of shock waves generated in the manufacturing container 20 can be increased compared to the case where a container having a constant inner diameter is used.
  • the moving speed of the aqueous liquid 10 is increased. Therefore, bubbles are more easily generated in the aqueous liquid 10 in the lower main body 216 due to the cavitation effect. By these synergistic effects, the bubbles 1 having a uniform particle diameter can be generated more efficiently in a shorter time.
  • the weight 5 is moved from the lower end of the container main body 21 to the vicinity of the center if the length in the longitudinal direction is within the above range. be able to.
  • the weight part 5 is provided near the lower end of the container body 21, the weight of the lower end part of the container body 21 is increased. Therefore, similarly to the tenth embodiment described above, the shock wave generated when the aqueous liquid 10 collides with the lower end portion of the container main body 21 in the step (S4) can be increased.
  • the position of the weight portion 5 is provided near the center of the container main body 21, the weight of the reduced diameter portion 217 increases.
  • the shock wave generated when the aqueous liquid 10 collides with the reduced diameter portion 217 can be increased. Further, the closer the position where the weight portion 5 is provided to the lower end portion of the container main body 21, the larger the shock wave generated when the aqueous liquid 10 collides with the lower end portion of the container main body 21. That is, in this embodiment, the magnitude of the shock wave generated in the manufacturing container 20 can be controlled by adjusting the position where the weight part 5 is installed in the lower main body part 216, and the bubble 1 having a desired size can be formed. It can be generated more stably.
  • the length of the entire container body 21 in the longitudinal direction is not particularly limited, but is preferably about 20 to 85 mm, and more preferably about 30 to 53 mm.
  • the weight portion 5 is a ring-shaped member. In a state where the weight portion 5 is screwed into the screw groove 214 of the lower main body portion 216, the weight portion 5 rotates the weight portion 5 in the longitudinal direction in the region where the screw groove 214 of the lower main body portion 216 is formed. It moves in the vertical direction in FIG.
  • the magnitude of the shock wave generated in the manufacturing container 20 can be controlled by setting the position where the weight part 5 is provided in the container body 21. Thereby, the size and content of the bubble 1 obtained can be adjusted.
  • the mass of the weight portion 5 is not particularly limited, but is preferably about 3 to 30 g, more preferably about 5 to 20 g, for the container body 21 having the dimensions described above. If the mass of the weight portion 5 is within the above range, the size and content of the obtained bubble 1 can be adjusted more efficiently.
  • the O-ring 6 is a member that is provided on the upper side and the lower side of the weight part 5 so as to sandwich the weight part 5 and prevents the weight part 5 from moving due to vibration of the manufacturing container 20 or the like.
  • a silicon O-ring can be used as the O-ring 6.
  • the weight part 5 and the O-ring can be attached to the container body 21 as follows. First, the first O-ring 6 is inserted from the lower end side of the lower main body 216 and stopped at a predetermined position. Next, the weight portion 5 is attached to the lower end portion of the lower body portion 216 and moved until it comes into contact with the attached O-ring 6. Thereafter, the second O-ring 6 is inserted from the lower end side of the lower main body 216 and moved until it comes into contact with the weight 5, whereby the weight 5 is fixed by the two O-rings 6.
  • the subsequent steps are performed in the same manner as in the first to fifth embodiments described above, whereby a uniform amount of bubbles 1 can be stably produced in a large amount in the production container 20.
  • a production container (sealed container) 20 (bubble-containing container) containing a large amount of uniform-sized bubbles 1 is obtained.
  • FIG. 18 is a cross-sectional view for explaining a production container used in the thirteenth embodiment of the bubble production method of the present invention.
  • FIG. 18A shows the production container in an exploded state
  • FIG. 18B shows the production container in an assembled state.
  • FIG. 19 is a view for explaining the position of the opening formed in the lid of the manufacturing container shown in FIG.
  • FIG. 19 (a) is a view for explaining a state before the injection needle of the syringe is pierced through the rubber stopper
  • FIG. 19 (b) shows a tightening portion after the injection needle is removed from the rubber stopper. It is a figure for demonstrating the state fastened to the baseplate part.
  • FIGS. 18A and 18B the upper side in FIGS. 18A and 18B is referred to as “upper”, and the lower side in FIGS. 18A and 18B is referred to as “lower”. Further, the left side in FIGS. 18A and 18B is referred to as “left”, and the right side in FIGS. 18A and 18B is referred to as “right”.
  • the bubble manufacturing method according to the thirteenth embodiment will be described with a focus on differences from the bubble manufacturing methods according to the first to twelfth embodiments, and description of similar matters will be omitted.
  • the bubble manufacturing method of the present embodiment is the same as the bubble manufacturing method of the first to fifth embodiments described above except that the configuration of the lid of the manufacturing container is different.
  • the manufacturing container 20 of the present embodiment includes a container body 21 and a lid 22 similar to the manufacturing container 20 of the first embodiment described above.
  • the lid 22 includes a bottom plate portion 223 fixed to the bottle mouth of the container body 21, a rubber plug 221 disposed on the opposite side of the bottom plate portion 223 from the container body 21, and the rubber plug 221 as the bottom plate portion. And a tightening portion 222 that is fixed to 223.
  • the bottom plate portion 223 has a flat plate portion 225 having a disk shape and a cylindrical portion 226 erected from an edge portion of the flat plate portion 225, and a member having a substantially C shape when the outer shape thereof is viewed in cross section. It is.
  • the shape of the bottom plate portion 223 (flat plate portion 225) in plan view (top view) and the shape of the rubber plug 221 are substantially the same and have substantially the same diameter.
  • thread grooves formed so as to be screwable with each other are formed on the inner peripheral surface of the cylindrical portion 226 and the outer peripheral surface on the bottle mouth side of the container main body 21, respectively, and by screwing these together, The bottom plate portion 223 (the flat plate portion 225) is fixed in a state of being in close contact with the bottle mouth of the container body 21.
  • the bottom plate portion 223 is formed with a through-hole 224 having a size that allows the injection needle of the syringe to be inserted at a position separated from the center by a predetermined distance in plan view (top view). That is, as shown in FIG. 19A, the center C of the rubber plug 221 and the through hole 224 of the bottom plate portion 223 are misaligned in the plan view of the lid 22.
  • the bottom plate portion 223 is made of a material having a large specific gravity, such as a ceramic material or a metal material, similarly to the bottom plate portion 223 of the lid 22 shown in FIG. 9 described above.
  • a material having a large specific gravity such as a ceramic material or a metal material
  • the rubber plug 22 As the rubber plug 221, a rubber plug similar to the rubber plug 221 used in the bubble manufacturing method of the first embodiment described above can be used. On the surface of the rubber stopper 221, a mark X is inserted for piercing the injection needle at a position corresponding to the through hole 224 of the bottom plate portion 223 when the lid 22 is attached to the container main body 21 (see FIG. 19 (a)).
  • the tightening portion 222 is configured to cover the edge of the rubber plug 221. Further, screw grooves formed so as to be able to be screwed to each other are formed on the outer peripheral surfaces of the tightening portion 222 and the bottom plate portion 223 (flat plate portion 225), and the rubber plugs 221 are screwed together. Are fixed in close contact with the bottom plate portion 223 (flat plate portion 225).
  • the mark X of the rubber plug 221 is pierced with the injection needle of the syringe filled with the gas 3, and the injection needle is inserted into the through hole 224 of the bottom plate portion 223. Thereafter, the gas 3 is further added from the syringe into the manufacturing container 20 to pressurize the manufacturing container 20, and then the injection needle is removed from the rubber stopper 221.
  • the tightening portion 222 is turned to tighten the tightening portion 222 to the bottom plate portion 223 (the state shown in FIG. 19B).
  • the rubber plug 221 is compressed toward the bottom plate portion 223 while rotating (for example, rotating 180 °) with respect to the bottom plate portion 223. Therefore, in plan view, the position of the through hole 227 formed in the rubber stopper 221 and the position of the through hole 224 of the bottom plate portion 223 are shifted by the insertion of the injection needle (see FIG. 19B). Thereby, the through-hole 224 of the bottom plate part 223 is closed by the rubber plug 221, and the production container 20 sealed in a state where the inside of the production container 20 is pressurized by the gas 3 can be obtained.
  • the hermeticity in the manufacturing container 20 can be improved.
  • the bubble 1 can be present more stably in the aqueous liquid 10 in the finally obtained bubble-containing container. That is, the long-term storage stability of the bubble-containing container is further improved.
  • the rubber plug 221 is compressed to the bottom plate portion 223 side.
  • the thickness of the rubber plug 221 before the tightening portion 222 is tightened to the bottom plate portion 223 is t 1 (mm)
  • the thickness of the rubber plug 221 when the tightening portion 222 is tightened to the bottom plate portion 223 is t 2.
  • the compression rate ((t 1 -t 2 ) / t 1 ⁇ 100) of the rubber plug 221 is preferably 5 to 60%, and more preferably 10 to 30%.
  • the adhesiveness between the rubber plug 221 and the bottom plate portion 223 can be further improved while suppressing the load on the rubber plug 221 due to the tightening of the tightening portion 222.
  • the airtightness in the manufacturing container 20 can be further improved.
  • a large amount of bubbles 1 of uniform size can be stably produced in the production container 20.
  • a production container 20 (bubble-containing container) containing a large amount of uniform-sized bubbles 1 is obtained.
  • the bottom plate portion 223 may be provided with a plurality of through holes 224 as in the above-described sixth embodiment.
  • the same operations and effects as the bubble manufacturing methods of the first to twelfth embodiments are produced.
  • Example 1 First, the relationship between the rotation speed of the production container 20 and the diameter and content of the bubbles 1 generated in the aqueous liquid 10 was examined.
  • Step of injecting aqueous liquid into container The whole amount of albumin solution and 25% phosphate buffered saline was injected into the prepared vial.
  • the liquid surface height Y of the aqueous liquid obtained by mixing the albumin solution and 25% phosphate buffered saline was 25 mm.
  • Step of vibrating container Two sealed vials were prepared. One sealed vial was vibrated at 5000 rpm for 30 seconds, and the other sealed vial was vibrated at 6500 rpm for 30 seconds, using Precellys (high-speed cell disruption system) manufactured by Bertin Technologies. At that time, the closed vial reciprocated in the vertical direction, and it was confirmed that the aqueous liquid repeatedly collided with the upper and lower surfaces of the vial.
  • the vibration width in the longitudinal direction (vertical direction) of the sealed vial was 40 mm
  • the vibration width in the short direction (horizontal direction) of the sealed vial was 20 mm. .
  • the instantaneous relative speed between the vial and the aqueous liquid was set to 40 km / h or more for any vial.
  • Bubble diameter distribution measurement From the bubble-containing container obtained as described above, an aqueous liquid containing bubbles (bubble-containing liquid) was taken out with a syringe, and then converted into an aqueous liquid using a bubble measuring device (nanoparticle analysis system nanosight). The bubble diameter distribution measurement of the bubble contained was performed. The result is shown in FIG.
  • FIG. 20 (a) is a graph showing the bubble diameter distribution of the bubbles when the bubbles are produced at a rotational speed of 5000 rpm and 6500 rpm.
  • FIG. 20B is a partially enlarged view in which the horizontal axis is in the range of 0 to 700 nm in the graph shown in FIG.
  • the bubble content in the aqueous liquid can be significantly increased by vibrating the sealed vial at 6500 rpm, compared to when the sealed vial is vibrated at 5000 rpm. did it.
  • the content of bubbles smaller than about 600 nm in diameter is 3 to 5 times higher when the closed vial is vibrated at 6500 rpm than when the closed vial is vibrated at 5000 rpm. It was.
  • the bubble content in the aqueous liquid can be increased to some extent by increasing the vibration time. However, it is less than the bubble content when the rotational speed is 6500 rpm.
  • the magnitude of the pressure of the shock wave generated when the aqueous liquid collides with the vial changes according to the number of rotations of the closed vial.
  • the magnitude of the pressure of the shock wave is a major factor that determines the diameter and content of bubbles generated in the aqueous liquid.
  • the bubble which has a sufficiently small diameter like this invention cannot be produced
  • FIG. 21 shows the result of analysis of the bubble diameter distribution graph shown in FIG.
  • FIG. 21A is a graph showing the relationship between the number of rotations of the closed vial and the average diameter of the bubbles.
  • FIG. 21B is a graph showing the relationship between the rotational speed of the closed vial and the bubble content.
  • the average diameter of the generated bubbles is about 80 nm smaller than when the sealed vial is vibrated at 5000 rpm. It was.
  • the content of the generated bubbles is 9 ⁇ compared to when the closed vial is vibrated at 5000 rpm. The size was reduced to about 10 7 particles / ml. Also from this result, it was found that when the closed vial was vibrated at 6500 rpm, a larger amount of bubbles having a smaller diameter could be generated than when the closed vial was vibrated at 5000 rpm.
  • Example 2 Next, the relationship between the volume of the gas 3 sealed in the production container 20 and the diameter and content of the bubble 1 generated in the aqueous liquid 10 was examined.
  • FIG. 22 (a) is a graph showing the relationship between the volume of gas sealed in a closed vial and the average bubble diameter.
  • FIG. 22B is a graph showing the relationship between the volume of gas sealed in the closed vial and the bubble content.
  • the average diameter of the generated bubbles was reduced by increasing the pressure in the sealed vial. Specifically, when the pressure in the closed vial is 2 atm, the average diameter of the generated bubbles is about 100 nm smaller than that in the case where the pressure in the closed vial is 1.2 atm. .
  • the bubble content increased by increasing the pressure in the sealed vial.
  • the pressure in the closed vial was 2 atm
  • the bubble content was more than twice as large as that in the case where the pressure in the closed vial was 1.2 atm.
  • Example 3 Method for producing nanobubbles containing GFP gene
  • 120 ⁇ l of albumin solution CSL Behring's albumin 25%
  • 12 ml of 25% phosphate buffered saline were prepared.
  • 2 ⁇ g of GFP gene was prepared.
  • a 15 ml vial (height X: 50 mm, outer diameter R: 25 mm) was prepared. This vial has the same shape as the manufacturing container 20 shown in FIG.
  • Step of injecting aqueous liquid into container The albumin solution, 25% phosphate buffered saline, and GFP gene were all injected into the prepared vial.
  • the liquid surface height Y of the aqueous liquid obtained by mixing the albumin solution, 25% phosphate buffered saline and the GFP gene was 25 mm.
  • Step of vibrating container Next, the above-mentioned sealed vial was vibrated at a rotational speed of 7000 rpm for 30 seconds using Precellys manufactured by Bertin Technologies. At that time, the closed vial reciprocated in the vertical direction, and it was confirmed that the aqueous liquid repeatedly collided with the upper and lower surfaces of the vial.
  • the vibration width in the longitudinal direction (vertical direction) of the sealed vial was 40 mm
  • the vibration width in the short direction (horizontal direction) of the sealed vial was 20 mm.
  • the instantaneous relative speed between the vial and the aqueous liquid was set to 40 km / h or more.
  • Step of leaving the container stationary After vibration, the sealed vial was allowed to stand to obtain a bubble-containing container.
  • the aqueous liquid containing a bubble bubble containing liquid
  • the size of the bubble was confirmed using a bubble measuring apparatus (nanoparticle analysis system nanosight). As a result, the average diameter of the bubbles was 600 nm.
  • pericite Cerebrovascular pericytes (pericite) (product code: C-12980, manufactured by Takara Bio Inc.) were added with 0.2 ⁇ g of the aqueous liquid obtained in Example 3 to culture the brain. A medium was obtained. Note that perisite is known as a cell in which gene transfer is very difficult.
  • FIG. 23 is a fluorescence microscope image of a cerebral vascular pericyte cell culture medium cultured at 37 ° C. for 48 hours, and FIG. 23 (a) is an image of a sample irradiated with ultrasound at an irradiation intensity of 0.6 W / cm 2.
  • FIG. 23B is an image of a sample irradiated with ultrasonic waves at an irradiation intensity of 0.8 W / cm 2 .
  • FIG. 24 is a fluorescence microscopic image of a cerebral vascular pericyte cell culture medium cultured at 37 ° C. for 48 hours, and FIG. 24 (a) shows a sample subjected to ultrasonic irradiation at an irradiation intensity of 0.9 W / cm 2 .
  • FIG. 24B is an image of a sample irradiated with ultrasonic waves at an irradiation intensity of 1.0 W / cm 2 .
  • FIGS. 23 (a), (b) and FIGS. 24 (a), (b) a green colored region was confirmed in the sample irradiated with ultrasonic waves at any irradiation output.
  • GFP green fluorescent protein
  • Example 4 (Bubble manufacturing method) [Preparation process] First, 12 ml of distilled water as an aqueous liquid was prepared. In addition, a 15 ml vial (height X: 50 mm, outer diameter R: 25 mm) was prepared. This vial has the same shape as the manufacturing container 20 shown in FIG.
  • Step of injecting aqueous liquid into container Distilled water (aqueous liquid) was injected into the prepared vial.
  • the liquid surface height Y of the aqueous liquid was 25 mm.
  • Example 5 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 4 except that distilled water was changed to a 1 w / v% dextran aqueous solution.
  • Example 6 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 4 except that distilled water was changed to 100% phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 7 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 4 except that the distilled water was changed to Soldem 3A infusion (manufactured by Terumo Corporation).
  • Example 8 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 4 except that the distilled water was changed to Soldem 1 infusion (manufactured by Terumo Corporation).
  • Example 9 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 4 except that the distilled water was changed to physiological saline (0.9 w / v% NaCl aqueous solution).
  • Example 10 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 4 except that the distilled water was changed to a 0.25 w / v% albumin aqueous solution.
  • Example 11 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 4 except that the distilled water was changed to a 20 w / v% glucose aqueous solution.
  • FIG. 25 is a graph showing the bubble diameter distribution of the bubbles obtained in Examples 4 to 11. As shown in FIG. 25, it was found that the higher the concentration of water in the aqueous liquid, the smaller the diameter of the generated bubble 1 and the greater the amount of generation. In particular, in Example 4 using distilled water as an aqueous liquid, the average diameter of the bubbles is about 100 nm, and the content of bubbles generated in the bubble-containing liquid is about 27 ⁇ 10 6 pieces / ml. became. More specifically, in Example 4, most bubbles with a bubble diameter of about 100 nm were generated. Further, in Example 4, bubbles having a bubble diameter of about 0 to 200 nm with 100 nm as the peak center were generated.
  • Example 7 using the Soldem 3A infusion as the aqueous liquid and Example 8 using the Soldem 1 infusion the number of bubbles generated was smaller than that in Example 4, but similar to Example 4.
  • a bubble diameter distribution of the shape obtained was obtained.
  • Example 11 using a 20 w / v% glucose aqueous solution as the aqueous liquid most bubbles having a bubble diameter of about 200 nm were produced.
  • the bubbles obtained in Example 11 had a wide bubble diameter distribution and had a bubble diameter of about 100 to 400 nm.
  • Example 10 using 0.25% albumin as an aqueous liquid bubbles having a bubble diameter of about 100 to 500 nm were uniformly generated.
  • Example 12 In Example 4, distilled water was changed to physiological saline (0.9 w / v% NaCl aqueous solution), and [Preparation step] and [Step of injecting aqueous liquid into container] were performed. Next, after performing [the step of sealing the container] using air as the gas to be filled in the vial, [the step of vibrating the container] and [the container is left stationary, as in the first embodiment] The bubble containing container was obtained by performing the process to make.
  • Example 13 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 12 except that the air was changed to ethylene (C 2 H 4 ).
  • Example 14 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 13 except that the hydrogen was changed to ethylene (C 2 H 4 ).
  • Example 15 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 13 except that hydrogen was changed to ethane (C 2 H 6 ).
  • Example 16 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 13 except that hydrogen was changed to methane (CH 4 ).
  • Example 17 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 13 except that hydrogen was changed to nitrous oxide (N 2 O).
  • FIG. 26 is a graph showing the bubble diameter distribution of the bubbles obtained in Examples 12-17.
  • the amount of bubbles generated was changed by changing the type of gas sealed in the vial.
  • the gas enclosed in the vial was ethylene (Example 12)
  • the amount of bubble generation was about twice as large as when using air as the gas to be enclosed (Example 14).
  • the amount of bubble generation increased.
  • generated using the manufacturing container 20 shown in FIG. 17 were investigated.
  • Example 18 (Bubble manufacturing method) [Preparation process] First, as in the first embodiment described above, 120 ⁇ l of albumin solution (CSL Behring's albumin 25%) and 12 ml of 25% phosphate buffered saline were prepared. Further, the manufacturing container 20 shown in FIG. 17 (the length of the upper main body: 23.82 mm, the inner diameter of the upper main body: 10.26 mm, the length of the lower main body: 20 mm, the inner diameter of the lower main body: 5.9 mm). Got ready.
  • Step of injecting aqueous liquid into container The whole amount of albumin solution and 25% phosphate buffered saline was injected into the prepared production container. The height of the liquid surface of the aqueous liquid obtained by mixing the albumin solution and 25% phosphate buffered saline was 25 mm from the bottom surface of the production container 20.
  • Example 19 In the same manner as in Example 18, an aqueous liquid composed of an albumin solution and 25% phosphate buffered saline was injected into the production container 20 shown in FIG. Thereafter, in the same manner as in Example 12, the production container 20 was filled with air, and [the process of sealing the container] was performed. Thereafter, in the same manner as in Example 18, a bubble-containing container was obtained by performing [the process of vibrating the container] and [the process of allowing the container to stand still].
  • Example 20 A bubble-containing container was obtained in the same manner as in Example 19 except that the air was changed to perfluoropropane.
  • Bubble diameter distribution measurement For the bubble-containing liquids of Examples 18 to 20 obtained as described above, bubble diameter distribution measurement was performed in the same manner as in the first embodiment. The bubble-containing liquid obtained in Examples 18 to 20 was dropped on a preparation using a syringe and observed with an optical microscope. The results are shown in FIGS.
  • FIG. 27 (a-1) is a microscopic image of bubbles and a bubble diameter distribution graph obtained using the container without weight of Example 18.
  • FIG. 27 (a-2) is a microscopic image and a bubble diameter distribution graph of bubbles obtained using the container with weight of Example 18.
  • FIG. 27 (b-1) is a microscopic image of bubbles and a bubble diameter distribution graph obtained using the container without weight of Example 19.
  • FIG. 27 (b-2) is a microscopic image of bubbles and a bubble diameter distribution graph obtained using the container with weight of Example 19.
  • FIG. 28 (a-1) is a microscopic image of bubbles and a bubble diameter distribution graph obtained using the container without a weight of Example 20.
  • FIGS. 27 and 28 are a microscopic images of bubbles and a bubble diameter distribution graph obtained using the container with weight of Example 20.
  • the horizontal axis of the bubble diameter distribution graph shown in FIGS. 27 and 28 indicates the measured bubble diameter, and the diameter increases from the left side to the right side of the horizontal axis.
  • the leftmost bar graph on the horizontal axis indicates the amount of bubbles having an average diameter of 1 ⁇ m or less.
  • FIGS. 27 and 28 in any of Examples 18 to 20, when a container with a weight attached was used, the amount of bubble generation increased. In particular, it was found that the amount of bubbles with a small diameter (diameter: 1 ⁇ m or less) was remarkably increased. Further, from the comparison between FIG. 27 (b-2) and FIG.
  • the bubble production container of the present invention By using the bubble production container of the present invention, it is possible to stably generate a large amount of uniform-sized bubbles in an aqueous liquid simply by vibrating the container at a predetermined rotational speed.
  • the bubbles thus obtained can be used in various fields such as medicine, food, seafood culture, wastewater treatment and the like. Therefore, the bubble manufacturing container of the present invention has industrial applicability.

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Abstract

本発明のバブル製造用容器２０は、開口部を備えた容器本体２１と、容器本体２１の開口部上に設けられたゴム栓２２１とを有し、ゴム栓２２１は、注射針を刺通して、容器本体２１の内部のバブル１を取り出すことができるように構成されている。また、バブル製造用容器２０は、開口を有し、ゴム栓２２１上に設けられ、容器本体２１をゴム栓２２１とともに密閉する締付部２２２をさらに有していることが好ましい。また、容器本体２１には、錘部が設けられていることが好ましい。

Description

バブル製造用容器
　本発明は、マイクロバブルまたはナノバブルの製造方法に用いられるバブル製造用容器に関する。特に、超音波診断および超音波治療に用いるマイクロバブルまたはナノバブルの製造方法に用いられるバブル製造用容器に関する。
　近年、医療、食品、魚介類の養殖、排水処理等の様々な分野において、マイクロサイズ（数百マイクロメートル程度）、または、ナノサイズ（数百ナノメートル以下）のバブルの利用が検討されている。特に、医療分野では、マイクロバブルを超音波造影剤として用いて、胸部や腹部を超音波診断する方法が知られている。
　この超音波診断方法は、超音波造影剤を静脈等から体内へ注入し、診断部位に超音波照射を行って、超音波造影剤からの反射波（反射エコー）を画像化して診断する方法である。そして、超音波造影剤としては、タンパク質や脂質等から構成された外殻と、外殻内に封入されたガスとからなる微小な気泡（マイクロバブル）が広く用いられている。
　また、近年では、このマイクロバブルを用いた超音波治療方法が検討されている（例えば、特許文献１）。より具体的には、遺伝子や薬剤（薬物）を封入したマイクロバブルを体内へ注入し、これを血管を通して患部に運ぶ。そして、マイクロバブルが患部付近に到達した際に、超音波をマイクロバブルに照射して、マイクロバブルを破裂させる。そうすることにより、マイクロバブルに封入された薬物を患部に集中的に投与することができる。
　このようなマイクロバブルの製造方法として、過飽和バブル発生法、気液２相流旋回法が知られている。過飽和バブル発生法は、マイクロバブルの構成材料と生理食塩水とを含む混合液中に気体を高圧下で溶解させた後、減圧することにより混合液中にマイクロバブルを生成させる方法である。また、気液２相流旋回法は、上記混合液を高速で攪拌することにより、混合液の渦流を発生させて、渦流の中に十分に気体を巻き込んだ後、この渦流を止めることにより混合液中にマイクロバブルを生成させる方法である。
　上記のマイクロバブルの製造方法では、マイクロバブルを生成するために、最低でも１～１０Ｌの混合液を用意する必要があった。また、少量の混合液（例えば、数ｍｌの混合液）で安定的にマイクロバブルを生成することが困難であった。また、生成するマイクロバブルのサイズにバラつきがあるという問題点があった。
特開２００２－２０９８９６号公報
　本発明は、上記従来の問題点を鑑みたものであり、その目的は、均一なサイズのバブル（マイクロバブルまたはナノバブル）を安定的に製造することができるバブル製造用容器を提供することにある。
　このような目的は以下の（１）～（１４）の本発明により達成される。
　（１）　バブルを製造するために用いられるバブル製造用容器であって、
　開口部を備えた容器本体と、
　該容器本体の前記開口部上に設けられたゴム栓とを有し、
　前記ゴム栓は、注射針を刺通して、前記容器本体の内部の前記バブルを取り出すことができるように構成されていることを特徴とするバブル製造用容器。
　（２）　開口を有し、前記ゴム栓上に設けられ、前記容器本体を前記ゴム栓とともに密閉する締付部をさらに有し、
　前記容器本体には、錘部が設けられている上記（１）に記載のバブル製造用容器。
　（３）　前記容器本体は、前記開口部を備えた上部本体部と、該上部本体部よりも小さな内径を有し、前記錘部が取り付けられる下部本体部とで構成されている上記（２）に記載のバブル製造用容器。
　（４）　前記上部本体部は、その内径が、前記下部本体部の前記内径になるように縮径した縮径部を備えている上記（３）に記載のバブル製造用容器。
　（５）　前記下部本体部は、その外周面の全体にわたって形成されたネジ溝を備え、
　前記錘部は、前記ネジ溝と螺合して、前記下部本体部を移動可能に構成されている上記（３）または（４）に記載のバブル製造用容器。
　（６）　前記錘部は、前記容器本体の前記開口部付近に設けられ、前記締付部の前記開口に対応するように、前記注射針が挿通する貫通孔を備えている上記（２）に記載のバブル製造用容器。
　（７）　前記錘部は、前記開口部を覆うように前記容器本体に取り付けられ、
　前記ゴム栓は、前記錘部上に設けられ、前記貫通孔に対応する位置に前記注射針を刺通するためのマークを有する上記（６）に記載のバブル製造用容器。
　（８）　前記ゴム栓の前記マークの位置は、前記締付部を回転することにより、前記錘部の前記貫通孔の位置からシフトするように構成されている上記（７）に記載のバブル製造用容器。
　（９）　前記容器本体は、長尺状をなし、該容器本体の両端部を覆う２つの錘部を有し、
　前記開口部は、前記容器本体の前記両端部間に形成された突出部に設けられている上記（１）に記載のバブル製造用容器。
　（１０）　前記容器本体は、前記両端部を外部に開放するように円筒状に形成されている上記（９）に記載のバブル製造用容器。
　（１１）　前記錘部は、前記容器本体を構成する材料よりも密度の高い材料で構成されている上記（２）ないし（１０）のいずれかに記載のバブル製造用容器。
　（１２）　前記容器本体の前記内部の密閉性を維持するミニナートバルブと、前記容器本体の前記内部と前記ミニナートバルブとを連通させるチューブとをさらに有する上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載のバブル製造用容器。
　（１３）　前記ミニナートバルブは、前記注射針を挿通でき、前記チューブと連通する管路と、該管路の開閉を制御する開閉機構とを有し、
　前記チューブは、前記ゴム栓または前記容器本体と連結する上記（１２）に記載のバブル製造用容器。
　（１４）　前記容器本体は、その内面の少なくとも一部が、凹面、凸面または凹凸面で形成されている上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載のバブル製造用容器。
　本発明のバブル製造用容器を用いることにより、水性液体中に均一なサイズのバブルを多量に安定的に生成することができる。その結果、均一なサイズのバブルを多量に含有する容器を提供することができる。
図１は、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブルの一例を説明するための図である。 図２は、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブルの一例について、その一部を切断した状態を示す斜視図である。図１（ａ）は、外殻内にガスが封入されたバブルの一部を切断した状態を示しており、図１（ｂ）および図１（ｃ）は、外殻内にガスおよび薬物が封入されたバブルの一部を切断した状態を示す。 図３は、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態を説明するためのフローチャートである。 図４は、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態を説明するための断面図である。 図５は、図４（ｃ）に示す容器を振動させる工程において、水性液体と容器の内面（上面）とが激しく衝突した状態を説明するための部分拡大図である。 図６は、本発明のバブルの製造方法の第２実施形態を説明するためのフローチャートである。 図７は、本発明のバブルの製造方法の第２実施形態を説明するための断面図である。 図８は、本発明のバブルの製造方法の第５実施形態を説明するためのフローチャートである。 図９は、本発明のバブルの製造方法の第６実施形態に用いられる製造容器の蓋付近を示す部分断面図である。 図１０は、本発明のバブルの製造方法の第７実施形態に用いられる容器を模式的に示す断面図である。 図１１は、本発明のバブルの製造方法の第８実施形態を説明するための斜視図である。 図１２は、図１１（ａ）に示すミニナートバルブのゴム栓付近の構成（ハンドルは省略）を説明するための図である。図１２（ａ）は、ミニナートバルブのゴム栓付近の上面図であり、図１２（ｂ）は、図１２（ａ）のＸ－Ｘ線断面図である。 図１３は、図１１（ｃ）に示すバブル含有容器の断面図である。 図１４は、本発明のバブルの製造方法の第９実施形態に用いられる製造容器を説明するための斜視図である。 図１５は、本発明のバブルの製造方法の第１０実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。 図１６は、本発明のバブルの製造方法の第１１実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。図１６（ａ）は、分解した状態の製造容器を示しており、図１６（ｂ）は、組立てた状態の製造容器を示している。 図１７は、本発明のバブルの製造方法の第１２実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。 図１８は、本発明のバブルの製造方法の第１３実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。図１８（ａ）は、分解した状態の製造容器を示しており、図１８（ｂ）は、組立てた状態の製造容器を示している。 図１９は、図１８（ｂ）に示す製造容器の蓋に形成される開口部の位置を説明するための図である。図１９（ａ）は、注射器の注射針をゴム栓に刺通する前の状態を説明するための図であり、図１９（ｂ）は、注射針をゴム栓から抜いた後に締付部を底板部に締め付けた状態を説明するための図である。 図２０（ａ）は、５０００ｒｐｍおよび６５００ｒｐｍの回転数でバブルを製造した時のバブルのバブル径分布を示すグラフである。図２０（ｂ）は、図２０（ａ）に示すグラフにおいて、横軸が０～７００ｎｍの範囲である部分拡大図である。 図２１（ａ）は、密閉バイアル瓶の回転数とバブルの平均径との関係を示すグラフである。図２１（ｂ）は、密閉バイアル瓶の回転数とバブルの含有量との関係を示すグラフである。 図２２（ａ）は、密閉バイアル瓶内に封入されるガスの容量とバブルの平均径との関係を示すグラフである。図２２（ｂ）は、密閉バイアル瓶内に封入されるガスの容量とバブルの含有量との関係を示すグラフである。 図２３は、３７℃において４８時間培養させた脳血管周皮細胞培地の蛍光顕微鏡画像である。図２３（ａ）は、照射強度：０．６Ｗ／ｃｍ２で超音波照射したサンプルの画像であり、図２３（ｂ）は、照射強度：０．８Ｗ／ｃｍ２で超音波照射したサンプルの画像である。 図２４は、３７℃において４８時間培養させた脳血管周皮細胞培地の蛍光顕微鏡画像である。図２４（ａ）は、照射強度：０．９Ｗ／ｃｍ２で超音波照射したサンプルの画像であり、図２４（ｂ）は、照射強度：１．０Ｗ／ｃｍ２で超音波照射したサンプルの画像である。 図２５は、実施例４～１１で得られたバブルのバブル径分布を示すグラフである。 図２６は、実施例１２～１７で得られたバブルのバブル径分布を示すグラフである。 図２７は、実施例１８および１９で得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。 図２８は、実施例２０で得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。
　以下、本発明のバブル、バブルの製造方法およびバブル製造用容器を添付図面に示す好適な実施形態に基づいて説明する。
１．バブル
　まず、本発明のバブルの製造方法およびバブル製造用容器の説明に先立って、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブル（本発明のバブル）について説明する。
　図１は、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブルの一例を説明するための図である。図２は、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブルの一例について、その一部を切断した状態を示す斜視図である。なお、図２（ａ）は、外殻内にガスが封入されたバブルの一部を切断した状態を示しており、図２（ｂ）および図２（ｃ）は、外殻内にガスおよび薬物が封入されたバブルの一部を切断した状態を示す。
＜第１構成例＞
　まず、図１に示すバブル１について説明する。
　図１に示すバブル１（気泡）は、水性液体１０中にガス３が微分散することにより形成される。このバブル１は、後述する本発明のバブルの製造方法の第１および第２実施形態により製造することができる。このようなバブル１は、医療、食品、魚介類の養殖、排水処理等の様々な分野に用いることができる。本実施形態では、バブル１を超音波診断における超音波造影剤として用いる場合について説明する。
　かかる構成のバブル１は、水性液体１０として、水性媒体を用いて形成される。水性媒体としては、例えば、蒸留水、純水、超純水、イオン交換水、ＲＯ水等の水、Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）等の生理食塩水（０．９％程度の食塩水）、グルコース、スクロース等の各種糖類と蒸留水とを混合した糖水溶液等が挙げられる。これらは、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　ガス３は、バブル１を製造する際の温度（２０℃程度）において、気体状の物質である。また、ガス３は、バブル１を体内に注入した状態において、すなわち、体内の温度（３７℃程度）においても、気体状の物質である。
　ガス３としては、特に限定されないが、例えば、空気、窒素、亜酸化窒素、酸素、二酸化炭素、水素、ヘリウム、アルゴン、キセノン、クリプトンのような不活性ガス、六フッ化硫黄、十フッ化二硫黄、トリフルオロメチル硫黄ペンタフルオリドのようなフッ化硫黄、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、エチレン、プロピレン、プロパジエン、ブテン、アセチレン、プロピン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタンのような低分子量炭化水素類またはこれらのハロゲン化物、ジメチルエーテルのようなエーテル類、ケトン類、エステル類等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの物質の中でも、特に、六フッ化硫黄、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタンが好ましい。これらのガスが封入されたバブル１は、体内において安定性が高く、血管を通して患部（治療対象部位）または診断対象部位までより確実に運搬される。
　このような成分で構成されたバブル１の径は、本発明のバブルの製造方法の各工程の条件を変更することにより変化する。すなわち、製造されるバブル１は、ミクロンサイズ（数百マイクロメートル程度）、または、ナノサイズ（数百ナノメートル程度）を有することとなる。
　具体的に、バブル１の平均径は、特に限定されないが、１０ｎｍ～１０００μｍ程度であるのが好ましく、１０ｎｍ～１００μｍ程度であるのがより好ましく、５０～２０００ｎｍ程度であるのがさらに好ましい。バブル１の平均径が上記範囲内であれば、バブル１を静脈注射により体内に注入した際に、バブル１の径が十分に小さいため、血流によりバブル１が血管内を滑らかに移動することができる。また、このような径のバブルは、血管内での安定性が高く、血管内を移動している間に消滅することなく、目的の部位まで確実に運ばれる。特に、ナノバブルは、血管内での安定性が高いため、ほぼ消滅することなく、目的の部位まで確実に搬送される。
　一般的に、気体を内包するバブルは、液体と気体との界面において効率良く超音波を反射する性質を有している。そのため、上記範囲の平均径を有するバブル１は、液体（水性液体１０、または、超音波造影剤として体内に注入された際には、血液）とガス３との界面の面積が十分に大きく、超音波造影剤として有効に用いられる。
　また、上述したような構成のバブル１は、食品、魚介類の養殖、排水処理等の医療分野以外の分野にも用いることができる。特に、上記範囲の平均径を有するバブル１は、その安定性を十分に高くすることができ、取扱いが容易なため、様々な分野に適用することができる。
＜第２構成例＞
　次に、図２（ａ）に示すバブル１について説明する。
　なお、前記第１構成例のバブルとの相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　図２（ａ）に示すバブル１（気泡）は、後述する本発明のバブルの製造方法の第３および第５～第１３実施形態により製造することができる。図２（ａ）のバブル１は、バブル１の殻を構成する外殻２（球状の膜）と、外殻２内に封入されたガス３とを有している。このようなバブル１は、医療、食品、魚介類の養殖、排水処理等の様々な分野に用いることができる。本実施形態では、バブル１を超音波診断における超音波造影剤として用いる場合について説明する。以下、バブル１を構成する各成分を説明する。
　外殻２は、その内側に封入されるガス３をバブル１内に保持する機能を有している。
　このような外殻２は、主として１つの分子中に疎水性と親水性との両方の性質（置換基）を有する両親媒性材料（外殻材料）から構成されている。両親媒性材料としては、特に限定されないが、例えば、アルブミンのようなタンパク質、ポリカチオン性脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチダルエタノールアミンのようなリン脂質、パルミチン酸、ステアリン酸のような高級脂肪酸、ガラクトースのような糖類、コレステロール、シトステロールのようなステロール類、界面活性剤、天然または合成高分子、蛍光色素、抗体、標識金属等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　なお、図２には示されていないが、外殻２を構成する両親媒性材料は、水性媒体中において、疎水基が内側に、親水基が外側になるようにして球状に配置される。この性質により、外殻２は、両親媒性材料の分子の単層で構成されるミセルや、両親媒性材料の分子の二重層で構成されるリポソーム（球状の分子膜）となる。
　このような成分で構成されたバブル１の径は、図１に示すバブル１と同様である。
　一般的に、外殻内に気体を内包するバブルは、外殻と気体との界面において効率良く超音波を反射する性質を有している。そのため、上述した範囲の平均径を有するバブル１は、外殻２とガス３との界面の面積が十分に大きく、超音波造影剤として有効に用いられる。
＜第３構成例＞
　次に、図２（ｂ）および図２（ｃ）に示すバブル１について説明する。
　なお、前記第１および第２構成例のバブルとの相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　図２（ｂ）および図２（ｃ）に示すバブル１は、後述する本発明のバブルの製造方法の第４～第１３実施形態により製造することができる。このようなバブル１は、バブル１の殻を構成する外殻２と、外殻２内に封入されるガス３および薬物４を有している。このバブル１は、超音波治療および超音波診断に用いられる。なお、図２（ｂ）では、薬物４が気体状態あるいは固体状態で外殻２内に封入されているバブル１を示しており、図２（ｃ）では、薬物４が液体状態で外殻２内に封入されているバブル１を示している。
　外殻２は、その内側に封入されるガス３や薬物４をバブル１内に保持する機能を有し、バブル１が患部に運ばれるまで薬物４を保護する機能を有している。
　また、図２（ｂ）および図２（ｃ）に示すバブル１において、薬物４は、前立腺癌、子宮筋腫、心筋梗塞、脳梗塞等の様々な疾病の治療に有効な成分である。薬物４は、バブル１に包含された状態で患部に運搬され、超音波照射により患部付近で外殻２を破裂させることにより、患部に投与される。なお、図示しないが、薬物４は、外殻２自体に含有されてもよいし、外殻２の外表面に吸着されていてもよい。
　薬物４としては、疾病の治療に有効であれば特に限定されないが、遺伝子、薬剤等を含む。具体的には、ペプチド、抗体、オリゴ糖、多糖、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、トリプルヘリックス分子、ウイルスベクター、プラスミド、低分子有機化合物、抗癌剤、金属等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　薬物４とガス３との体積比率は、１：９９～９０：１０程度であるのが好ましく、１０：９０～７０：３０程度であるのがより好ましく、４０：６０～６０：４０程度であるのがさらに好ましい。薬物４とガス３との体積比率が上記範囲内であれば、バブル１の安定性が向上し、患部付近までより確実にバブル１を運搬することができる。また、患部付近で外殻２を破裂させた際に、患部に対して、十分な量の薬物を投与することができる。そのため、患部をより効率良く治療することができる。
　このような成分で構成されたバブル１の径は、図２（ａ）に示すバブル１と同様に、本発明のバブルの製造方法の各工程の条件を変更することにより変化する。
　ここで、癌細胞が存在する患部では、その周囲の血管から癌細胞へと、正常血管よりも細径の新生血管が伸びている。平均径が２００～３００ｎｍ程度のバブル１であれば、バブル１が、新生血管内にも円滑に搬送され、癌細胞にまで到達することができる。すなわち、かかるバブル１は、癌治療に好適に用いられることができる。また、一部のバブル１を、血管壁を通過させて、癌細胞に取り込ませることもできる。
　また、バブル１の平均径が６００～９００ｎｍ程度のバブル１は、脳の血管内を円滑搬送されるとともに、その位置を超音波画像において確実に特定することができる。そのため、脳治療（例えば、脳血管内治療等）に好適に用いることができる。
　なお、図１および図２（ａ）～（ｃ）に示すバブル１の平均径は、例えば、レーザー回折・散乱法、ナノ粒子トラッキング解析法、電気抵抗法、ＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ　Ｆｏｒｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、レーザー顕微鏡による観測等により測定することができる。また、ＡＦＭを測定する装置としては、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ社製の共振式粒子計測システム（商品名：アルキメデス）を用いることができる。
　上述したようなバブル１は、以下に記載する本発明のバブルの製造方法により製造することができる。以下、本発明のバブルの製造方法について、詳細に説明する。
　２．バブルの製造方法
　＜第１実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態について説明する。前述した図１に示すバブル１は、本実施形態のバブルの製造方法により、製造することができる。
　図３は、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態を説明するためのフローチャートであり、図４（ａ）～（ｄ）は、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態を説明するための製造容器の断面図であり、図５は、図４（ｃ）に示す容器を振動させる工程において、水性液体と容器の内面（上面）とが激しく衝突した状態を説明するための部分拡大図である。
　なお、以下の説明では、図４（ａ）～（ｄ）および図５中の上側を「上」と言い、図４（ａ）～（ｄ）および図５中の下側を「下」と言う。
　本実施形態のバブルの製造方法は、図３に示すように、工程（Ｓ１）～（Ｓ５）の５つの工程を有する。工程（Ｓ１）は、水性液体、および水性液体が注入されるバブル製造用容器（以下、単に「製造容器」という）を準備する工程である。工程（Ｓ２）は、この水性液体を製造容器の所定の高さまで注入する工程である。工程（Ｓ３）は、製造容器内にガスを充填させた状態で製造容器を密閉する工程である。工程（Ｓ４）は、水性液体が容器の内面に繰り返し衝突するように、所定の回転数で製造容器を振動させる工程である。工程（Ｓ５）は、製造容器を静置する工程である。以下、これらの工程について順次説明する。
　［Ｓ１］　準備工程
　まず、水性液体１０を準備する。
　本実施形態のバブルの製造方法では、水性液体１０として、前述した水性媒体が使用される。
　本発明者は、水性液体１０中の水の濃度が高くなるほど、生成されるバブル１の径が小さくなるとともに、その生成量が多くなることを見出した。したがって、水性液体１０として、水（蒸留水）を用いた場合に、より小さい径のバブル１をより多量に生成することができる。
　また、水性液体１０として、糖水溶液を用いた場合には、糖水溶液中の糖濃度が低くなるほど、すなわち、水の濃度が高くなるほど、生成されるバブル１の径が小さくなるとともに、その生成量が増加する。したがって、水性媒体の種類および工程（Ｓ４）の条件を適宜設定することにより、所望の径のバブル１を容易に得ることができる。
　なお、上述した糖水溶液中の糖濃度は、特に限定されないが、０．０１～６０ｗｔ％程度であるのが好ましく、０．１～５０ｗｔ％程度であるのがより好ましく、５～３０ｗｔ％程度であるのがさらに好ましい。上記範囲の糖濃度の糖水溶液を用いることにより、後述する工程（Ｓ４）において、水性液体１０中に生成されるバブル１の安定性が高くなる。そのため、バブル１が不本意に破裂するのをより確実に防止して、バブル１の経時安定性が向上する。
　次に、製造容器２０（バブル製造用容器の第１実施形態）を準備する。
　製造容器２０は、開口部を備え、水性液体１０を収容する容器本体２１と、容器本体２１を密閉するための蓋２２とを有している。
　容器本体２１は、特に限定されないが、図４（ａ）に示すような外形が有底円筒状をなしていることが好ましい。本実施形態では、容器本体２１として、容量が０．５～２０ｍｌ程度のバイアル瓶を用いる。本発明のバブルの製造方法では、容器本体２１として、このような容量の小さなバイアル瓶を用いた場合であっても、容器本体２１を蓋２２で密閉した際に、容器本体２１内の密閉空間で適切な圧力が水性液体１０に付与されるので、均一なサイズのバブル１を安定的に得ることができる。特に、容量が０．５～１．５ｍｌ程度のバイアル瓶であれば、１つの製造容器２０内に、１回の超音波診断に必要となる０．３～０．６ｍｌ程度のバブル含有液を製造することができる。この場合、超音波診断の際に、１つの製造容器２０内のバブル含有液を使い切ることができるため、製造されるバブル含有液の無駄をなくすことができる。
　このように容量の小さいバイアル瓶（容量：０．５～２０ｍｌ程度）の寸法は、長手方向の長さＸが、３５～６０ｍｍ程度であり、外径Ｒが、１０～４０ｍｍ程度である。
　蓋２２は、図４（ｂ）～（ｄ）に示すように、容器本体２１の瓶口に密着する円盤状のゴム栓（セプタム）２２１と、ゴム栓２２１を容器本体２１の瓶口に固定する締付部２２２を備えている。
　ゴム栓２２１は、特に限定されないが、例えば、シリコン製のゴム栓を用いることができる。
　締付部２２２は、ゴム栓２２１の縁部を覆うように構成されており、その平面視略中央に開口を有している。また、締付部２２２の瓶口側の内周面および容器本体２１の瓶口側の外周面には、互いに螺合可能に形成されるネジ溝が、それぞれ形成されており（図示せず）、これらを螺合させることにより、ゴム栓２２１が容器本体２１の瓶口と密着した状態で固定される。また、締付部２２２を容器本体２１の瓶口にかしめることで、ゴム栓２２１が容器本体２１の瓶口と密着した状態で、容器本体２１と締付部２２２とを固定することもできる。
　［Ｓ２］水性液体を製造容器に注入する工程
　調製された水性液体１０を容器本体２１（製造容器２０）の所定の高さまで注入する。本実施形態では、図４（ａ）に示すように、Ｙ［ｍｍ］まで注入する。したがって、図４（ａ）に示すように、水性液体１０が注入された状態の容器本体２１は、その上部に空隙部１１を有する。
　本実施形態では、水性液体１０が注入された容器本体２１（製造容器２０）を水平に静置した状態において、容器本体２１の高さ（長手方向の長さ）をＸ［ｍｍ］とし、容器本体２１における水性液体１０の液面の高さをＹ［ｍｍ］としたとき、０．２≦Ｙ／Ｘ≦０．７の関係を満足するのが好ましい。上記関係を満足することにより、十分な大きさの空隙部１１が存在するので、工程（Ｓ４）において、水性液体１０を製造容器２０の上下面および側面（特に、上下面）により勢いよく衝突させることができる。この衝突により、水性液体１０中に衝撃波が生じ、水性液体１０中にバブル１を容易に形成することができる。
　なお、前記関係は、０．３≦Ｙ／Ｘ≦０．５の関係を満足するのがより好ましく、０．３５≦Ｙ／Ｘ≦０．４の関係を満足するのがさらに好ましい。これにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０中にバブルをより容易に形成することができる。
　［Ｓ３］製造容器を密閉する工程
　次に、容器本体２１にガス３を充填させた状態で密閉する（図４（ｂ）参照）。具体的には、水性液体１０が注入された容器本体２１の空隙部１１を、ガス３でパージした後、蓋２２を容器本体２１の開口部（瓶口）に締付ける。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。
　容器本体２１の空隙部１１をガス３でパージする方法としては、例えば、水性液体１０が注入された容器本体２１をチャンバー内に移動させる。次に、チャンバー内の空気をガス３で置換する。その後、蓋２２を容器本体２１の開口部に締付けることにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とを密閉することができる。
　ガス３としては、前述した各種ガスが使用される。
　［Ｓ４］製造容器を振動させる工程
　次に、水性液体１０が、製造容器２０の上下面および側面（特に、上下面）に繰り返し衝突するように、製造容器２０を振動させる。本実施形態では、図４（ｃ）に示すように、製造容器２０が、略その長手方向（図４（ｃ）では、鉛直方向）に往復運動するように、製造容器２０を振動させる。
　本工程では、工程（Ｓ３）で密閉した製造容器２０（図４（ｃ）の下図）を上方向に振動させる（図４（ｃ）の真中の図）。これにより、水性液体１０は、製造容器２０の中間付近に移動する。更に製造容器２０を上方向に振動させると、水性液体１０が製造容器２０の上部に移動して、蓋２２の下面（ゴム栓２２１）に衝突する（図４（ｃ）の上図）。この際に、図５に示すように、衝撃波が発生する。この衝撃波の圧力により、ガス３が水性液体１０中に微分散し、バブル１が形成する。このバブル１内には、振動により水性液体１０に微分散または溶解したガス３が含まれる。
　一方、製造容器２０（図４（ｃ）の上図）を下方向に振動させる（図４（ｃ）の真中の図）。これにより、水性液体１０は、製造容器２０の中間付近に移動する。更に製造容器２０を下方向に振動させると、水性液体１０が製造容器２０の下部に移動して、製造容器２０の下面に衝突する（図４（ｃ）の下図）。この時も、図５に示すように、衝撃波が発生する。
　また、製造容器２０を鉛直方向に振動させる際に、水性液体１０は、製造容器２０の内側の側面とも衝突する。この時も、図５に示すように、衝撃波が発生する。
　以上の操作を繰り返し行うことによって、水性液体１０中に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に生成させることができる。
　本発明のバブルの製造方法では、十分に微細で、均一なサイズのバブル１を得るために、製造容器２０を５０００ｒｐｍ以上で振動させる。これにより、水性液体１０と製造容器２０とが衝突する際に発生する衝撃波の大きさ（圧力）が十分に大きくなり、水性液体１０中に生じるバブル１が微細化され、そのサイズを均一にすることができる。また、製造容器２０の回転数を上記範囲内で低めに設定した場合には、発生する衝撃波の大きさが小さくなるので、比較的径の大きなバブル１を生成することができる。また、回転数を高めに設定した場合には、発生する衝撃波の大きさが大きくなるので、比較的径の小さいバブル１を生成することができる。なお、本明細書において、製造容器２０の「回転数」とは、単位時間当たりに、製造容器２０がその全振動経路を移動する回数を意味する。例えば、製造容器２０が５０００ｒｐｍで振動するとは、製造容器２０が、１分間に全振動経路を５０００回移動（振動）することを意味する。
　また、製造容器２０の回転数は、５５００ｒｐｍ以上であることがより好ましく、６０００～２００００ｒｐｍであることがさらに好ましい。製造容器２０の回転数を上記範囲内とすることにより、振動により生成したバブル１同士が、衝突により崩壊したり、合体して粗大化するのをより確実に防止することができる。これにより、バブル１の径を微細化しつつ、より均一なサイズのバブル１を多量に水性液体１０中に生成させることができる。
　上記のような回転数で製造容器２０を振動させることができる装置としては、例えば、ビーズ方式の高速細胞破砕システム（ホモジナイザー）を用いることができる。具体例としては、バーティンテクノロジーズ（ｂｅｒｔｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製のプレセリーズ（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ）等を用いることができる。
　また、水性液体１０と製造容器２０とが衝突する際に発生する衝撃波の圧力は、４０ｋＰａ～１ＧＰａとなることが好ましい。水性液体１０と製造容器２０との衝突時に発生する衝撃波の圧力が上記範囲内となることにより、水性液体１０中に生じるバブル１をより微細化し、そのサイズをより均一にすることができる。特に、水性液体１０と製造容器２０との衝突時に発生する衝撃波の圧力が大きくなるほど、より微細なバブル１を生成することができる。
　製造容器２０を振動させる際に、製造容器２０の長手方向の振動幅は、０．７Ｘ～１．５Ｘ［ｍｍ］程度であるのが好ましく、０．８Ｘ～１Ｘ［ｍｍ］程度であるのがより好ましい。これにより、製造容器２０の振動時に、水性液体１０と製造容器２０の下面および蓋２２とを確実に衝突させることができ、水性液体１０と製造容器２０の下面および蓋２２との衝突回数を十分に多くすることができる。また、このように十分な振動幅で製造容器２０を振動させることにより、水性液体１０が製造容器２０内を移動する速度が大きくなる。そのため、水性液体１０と製造容器２０の下面および蓋２２との衝突時に発生する衝撃波の大きさが十分に大きくなる。結果として、水性液体１０中に微細なバブル１を多量に生成させることができる。
　また、製造容器２０を鉛直方向に往復運動させる際に、製造容器２０は、その短手方向（水平方向）にも振動させるのが好ましい。これにより、製造容器２０の内側の側面にも水性液体１０が衝突するので、水性液体１０に衝撃波をより多く発生させることができる。製造容器２０の短手方向への振動幅は、０．３Ｘ～０．８Ｘ［ｍｍ］程度であるのが好ましく、０．５Ｘ～０．７Ｘ［ｍｍ］程度であるのがより好ましい。これにより、上述した効果はより顕著となる。
　なお、製造容器２０を振動させる方向は、その短手方向のみであってもよい。この場合、製造容器２０の短手方向（水平方向）への振動幅は、上述した短手方向への振動幅と同じであることが好ましい。かかる振動幅であれば、製造容器２０の内側の側面に水性液体１０が確実に衝突するので、水性液体１０に衝撃波をより多く発生させることができる。その結果、水性液体１０中に微細なバブル１を多量に生成させることができる。
　また、本工程では、水性液体１０を製造容器２０の上下面および側面に衝突させる際における製造容器２０と製造容器２０内の水性液体１０との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるように製造容器２０を振動させることが好ましい。また、かかる瞬間相対速度が５０ｋｍ／ｈ以上となるように製造容器２０を振動させることがより好ましい。上記条件を満足することにより、水性液体１０と製造容器２０とが衝突する際に生じる衝撃波の圧力を十分に大きくすることができる。その結果、水性液体１０中に生じるバブル１をより微細化し、そのサイズをより均一にすることができる。
　なお、製造容器２０を上記条件で振動させる時間は、１０～１２０秒程度であるのが好ましく、３０～６０秒程度であるのがより好ましい。製造容器２０の振動時間を上記範囲内とすることにより、水性液体１０が製造容器２０と衝突する回数が十分に多くなるため、水性液体１０中に、多量のバブル１を生成させることができる。なお、製造容器２０の振動時間を上記範囲内で長く設定することにより、水性液体１０中に生成されるバブル１の量をより多くすることができる。
　なお、水性液体１０中に生成されるバブル１の平均径は、製造容器２０の回転数を前述した範囲内で変更することにより調整することができる。本実施形態では、水性液体１０として、上述したような水性媒体を用いることにより、おおよそ数十～数百ナノメーターサイズのナノバブルを安定的に生成させることができる。
　なお、本実施形態では、製造容器２０が、ほぼその長手方向に往復運動するように、製造容器２０を振動させているが、製造容器２０を振動させる方法は、これに限定されない。例えば、製造容器２０が、主として、その短手方向および／または長手方向に回転運動するように、製造容器２０を振動させてもよい。この場合であっても、製造容器２０内の水性液体１０は、製造容器２０の上下面および側面に繰り返し衝突することにより、衝撃波が発生する。このような振動方法を用いても、水性液体１０中に、均一なサイズのバブル１を多量に安定的に生成することができる。
　［Ｓ５］製造容器を静置する工程
　上記条件で製造容器２０を振動させた後、製造容器２０を静置する（図４（ｄ）参照）。これにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１（図１参照）を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０が得られる。
　なお、上述した工程（Ｓ２）と、工程（Ｓ３）と、工程（Ｓ４）とは、水性液体１０の温度を一定に維持するようにして行われるのが好ましい。これにより、バブルの製造過程で水性液体１０の特性（粘性等）が安定するため、水性液体１０中に均一な径のバブル１を安定的に生成させることができる。水性液体１０の温度を一定に維持するための方法としては、例えば、上述した各工程（Ｓ２）～（Ｓ４）をグローブボックスや恒温槽内で行う方法が挙げられる。特に、本実施形態では、工程（Ｓ４）において、製造容器２０を高速で振動させるため、水性液体１０と製造容器２０の内面との衝突により製造容器２０が発熱し易い。しかし、恒温槽内で製造容器２０を振動させることにより、水性液体１０の温度が上昇するのを確実に防止することができる。その結果、水性液体１０中に均一な径のバブル１をより安定的に生成させることができる。
　以上の工程（Ｓ１）～（Ｓ５）を経て、平均径が１０ｎｍ～１０００μｍ程度のバブル１が製造される。なお、水性液体１０として、上述したような水性媒体を用いる本実施形態では、平均径が小さいバブル１を生成し易い。特に、本実施形態では、平均径が１０ｎｍ～１０００ｎｍのバブル１を安定的に多量に生成することができる。
　なお、従来のバブルの製造方法では、大掛かりな還流装置や、バブルの製造装置を構成する様々なシステム（チューブ、ノズル、コンプレッサ等）が必要であった。そのため、食品分野や医療分野等に用いられるバブルを製造する際に、清潔で、かつ無菌環境を維持するのが困難であった。これに対して、本発明では、バブル１の製造に気密性の高い製造容器２０を用いるため、水性液体１０およびガス３を製造容器２０内に含有した状態で、例えば、γ線滅菌等による滅菌処理を製造容器２０に施せばよい。これにより、製造容器２０内が滅菌されるため、バブル１を滅菌環境下で製造することができる。したがって、このように製造されたバブル１は、食品分野や医療分野等に好適に用いることができる。
　なお、上記のようにして得られたバブル１は、水性液体１０中に安定的に存在することができる。そのため、得られたバブル含有液を含む製造容器２０（以下、単に「バブル含有容器」という）は、室温にて長期保存することができる。具体的には、６～２４か月間もの期間にわたって保存することができる。また、これだけ長期間保存した後でも、水性液体１０中でのバブル１の安定性が高いため、再度バブル含有容器を振動させたりする必要なく、使用することが可能である。また、製造容器として、容量が小さい製造容器２０を用いることができるので、バブル含有容器の単価を抑えることができる。そのため、上記のようにして得られたバブル含有容器は、医療機関等にとっては、取扱い易いというメリットがある。
　［Ｓ６］遠心分離処理工程
　本実施形態のバブルの製造方法は、工程（Ｓ５）後に、バブル含有容器に対して、遠心分離処理を行ってもよい。この処理により、製造容器２０内に生成されたバブル１を、所望の径別に分離することができる。
　具体的には、バブル含有容器に対して遠心分離処理を行うことにより、径の大きいバブル１が製造容器２０の上層へ移動する傾向があり、径の小さいバブル１が製造容器２０の下層へ移動する傾向がある。したがって、製造容器２０の上層の液体（上澄み液）を吸引手段（注射器、ピペット等）により除去すれば、製造容器２０内に残存するバブル含有液中のバブル１の平均径は、工程（Ｓ５）後に得られたバブル含有液中のバブル１の平均径よりも小さくなる。また、吸引手段により吸引したバブル含有液（上澄み液）中のバブル１の平均径は、工程（Ｓ５）後に得られたバブル含有液中のバブル１の平均径よりも大きくなる。このように、遠心分離処理を用いることにより、より単分散なバブル径分布を有するバブル１を得ることができる。
　また、水性液体１０と比重の異なる物質をバブル含有液に加えて、遠心分離処理することにより、径の大きいバブル１がより上層へと移動し易くなり、径の小さいバブル１がより下層へと移動し易くなる、その結果、より単分散なバブル径分布を有するバブル１を得ることができる。
　工程（Ｓ１）～（Ｓ５）を経て、例えば、平均径が６００ｎｍのバブル１を含有するバブル含有液を経た場合、遠心分離の条件を適宜設定することにより、平均径が２００～３００ｎｍのバブル１を含有するバブル含有液を得ることができる。このバブル含有液を超音波造影剤として用いた場合には、比較的径が大きいバブル１が存在しないため、解像度が高く、より高精細な画像を得ることができる。
　遠心分離処理の条件は、分離するバブル１の平均径によって適宜設定され、例えば、バブル含有液に１×ｇ～２２０００×ｇ程度の遠心加速度が３０秒～２４時間程度かかるようにする。遠心加速度を小さく設定（１×ｇ～１００×ｇ程度）する場合には、長時間（１２時間～２４時間程度）にわたって処理することにより、より単分散なバブル径分布を有するバブル１を得ることができる。また、遠心加速度を大きく設定（１００×ｇ～２２０００×ｇ）する場合には、比較的短時間（３０秒～１２時間程度）の処理により、より単分散なバブル径分布を有するバブル１を得ることができる。遠心分離処理を上記条件で行うことにより、所望の平均径を有するバブル１を効率良く分離することができる。
　上記のような遠心加速度でバブル含有容器に遠心分離処理を行うことができる遠心分離機としては、特に限定されないが、例えば、商品名「ＴＯＭＹ　ＭＸ－３０１」（トミー精工社製）等の微量高速冷却遠心機を用いることができる。なお、上記微量高速冷却遠心機を用いる場合には、その回転数が５０～２０００ｒｐｍ程度に設定することにより、上記範囲の遠心加速度（遠心力）がバブル含有液に負荷される。
　また、遠心分離処理は、１回でもよいし、複数回にわたって行ってもよい。
　３．使用方法
　上記のようにして得られたバブル含有容器は、患者の超音波診断に用いられる。
　具体的には、まず、注射器の注射針を蓋２２のゴム栓２２１に刺通する。次に、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引する。そして、ゴム栓２２１から注射針を抜去し、バブル含有液を吸引した注射器の注射針を患者の血管（例えば静脈）に穿刺して、バブル含有液を血管内に注入する。これにより、バブル１は、血流により患部に運ばれる。なお、バブル含有容器（製造容器２０）から蓋２２を外し、注射器を用いて、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引してもよい。
　超音波診断の際には、バブル１が診断対象部位に到達するタイミングで、バブル１が破裂しない程度の周波数および強度を有する診断用超音波をバブル１に照射（放射）する。その後、診断対象部位から反射される信号（反射エコー）を受信して、データ処理することにより、診断対象部位を画像化する。これにより、超音波診断を行うことができる。
　なお、超音波の照射およびバブル１からの反射波を受信するデバイスとしては、公知の超音波探触子を用いることができる。
　上記のようにして得られたバブル含有容器は、超音波診断の用途以外にも、様々な分野に適用することができる。例えば、上記のようにして得られたバブル含有容器内のバブル１は、水や食材に対する殺菌効果を有するとともに、食材の鮮度を維持する効果を有する。さらに、バブル１と、水と、油分（疎水性成分）とを含む液体中では、水に対して多量の油分を混合することができる。この効果を利用して、食材中の水分と油分との分離を抑制して調理することも可能である。したがって、得られたバブル含有液を食品分野に用いることも可能である。
　また、上記の説明では、工程（Ｓ１）～（Ｓ５）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１（図１参照）を多量に安定的に製造することができる。ただし、本実施形態のバブルの製造方法は、これに限定されない。例えば、工程（Ｓ５）の後に、工程（Ｓ４）および工程（Ｓ５）を少なくとも１回以上繰り返し行うようにしてもよい。工程（Ｓ４）および工程（Ｓ５）を繰り返し行うことにより、均一な径のバブル１をより安定的に生成させることができる。
　＜第２実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法およびバブル製造容器の第２実施形態について説明する。
　図６は、本発明のバブルの製造方法の第２実施形態を説明するためのフローチャートである。図７（ａ）～（ｄ）は、本発明のバブルの製造方法の第２実施形態を説明するための断面図である。
　なお、以下の説明では、図７（ａ）～（ｄ）中の上側を「上」と言い、図７（ａ）～（ｄ）中の下側を「下」と言う。
　以下、第２実施形態のバブルの製造方法について、前記第１実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブルの製造方法は、図６に示すように、前述した第１実施形態の工程（Ｓ３）において、製造容器内を加圧した状態で製造容器を密閉するようにした以外は、前述した第１実施形態のバブルの製造方法と同様である。
　［Ｓ３］　製造容器を密閉する工程
　容器本体２１にガス３を充填させて、製造容器２０内を加圧した状態で密閉する（図７（ｂ）参照）。具体的には、水性液体１０が注入された容器本体２１の空隙部１１を、ガス３でパージした後、蓋２２を容器本体２１の開口部（瓶口）に締付ける。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。
　次に、ガス３が充填された注射器を準備する。そして、注射器の注射針をゴム栓２２１に刺通する。その後、注射器から製造容器２０内にさらにガス３を加えることにより、製造容器２０内が加圧される。その後、ゴム栓２２１から注射針を抜去する。これにより、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる。
　本実施形態のバブルの製造方法では、製造容器２０内の圧力（空隙部１１に充填されたガス３の圧力）を１．０ａｔｍより大きくする。特に、製造容器２０内の圧力は、１．５～１０ａｔｍであるのが好ましく、２～５ａｔｍであるのがより好ましい。これにより、ガス３の一部が水性液体１０に微分散または溶解する。
　水性液体１０にガス３が微分散または溶解することにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０と製造容器２０とが衝突して衝撃波が発生する際に、バブル１が発生し易くなる。これにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０中により多くのバブル１を生成させることができる。
　また、製造容器２０中の圧力を１．０ａｔｍよりも大きい任意の値に設定することにより、水性液体１０中に生成するバブル１の径および含有量をより容易に調整することができる。
　このようにして水性液体１０とガス３とが密閉された製造容器２０を用いて、前述した第１実施形態と同様に、工程（Ｓ４）および工程（Ｓ５）または工程（Ｓ４）～（Ｓ６）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０が得られる。
　本実施形態のバブルの製造方法では、空隙部１１がガス３で加圧された製造容器２０を用いるため、製造容器２０の振動前の段階で、水性液体１０中にガス３が十分に微分散または溶解している。そのため、工程（Ｓ４）において製造容器２０を振動させる際に、水性液体１０中にバブル１が発生し易く、前述した第１実施形態のバブルの製造方法よりも、より容易に、均一なサイズのバブル１を多量に製造することができる。
　また、本実施形態で得られたバブル含有容器（製造容器２０）内は加圧されている。このバブル含有容器内を急激に減圧すると、バブル含有液中のバブル１の粒径が変化したり、含有量が減少したりする等の悪影響が生じる可能性がある。そのため、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引する際に、あらかじめ、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧しておくことが好ましい。
　例えば、バブル含有容器からバブル含有液を吸引するための注射器（バブル吸引用注射器）とは異なる別の注射器（減圧用注射器）を用意し、その注射針をゴム栓２２１に刺通する。その際に、減圧用注射器の注射針がバブル含有液に接触しないようにする。次に、減圧用注射器のプランジャーを操作して、バブル含有容器内のガス３を吸引することにより、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧する。次に、バブル吸引用注射器の注射針をゴム栓２２１に刺通し、その後、バブル含有液を吸引する。その際に、減圧用注射器のプランジャーを、その外筒から引き抜いた状態にしておくのが好ましい。この場合、減圧用注射器の注射針が、バブル含有容器の内部および外部に開放され、かかる注射針からバブル含有容器内に自由に空気が出入りする。かかる構成では、バブル含有液を吸引する際に、バブル含有容器内が陰圧となることが防止され、すなわち、バブル含有容器内が大気圧の状態で維持され、生成されたバブル１に上述したような悪影響が生じない。
　なお、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧した状態で、蓋２２を外し、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引してもよい。この場合、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧しているため、蓋２２を外した瞬間に、バブル含有液が製造容器２０の外部に吹き出すのを確実に防止することができる。
　かかる第２実施形態のバブルの製造方法およびバブル製造用容器によっても、前記第１実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第３実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第３実施形態について説明する。前述した図２（ａ）に示すバブル１は、本実施形態のバブルの製造方法により、製造することができる。
　以下、第３実施形態のバブルの製造方法について、前記第１および第２実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態では、水性液体１０が、バブル１の外殻２を構成する材料（外殻材料）および水性媒体を含んでいる。すなわち、本実施形態のバブルの製造方法は、前述した第２実施形態の工程（Ｓ１）において準備する水性液体１０が、水性媒体に加え、外殻材料を含んでいる以外は、前述した第２実施形態のバブルの製造方法と同様である。
　［Ｓ１］　準備工程
　本実施形態では、バブル１の外殻２を構成する外殻材料および水性媒体を水性液体調製容器（以下、単に「調製容器」という）に入れて、外殻材料を水性媒体に溶解させて、水性液体１０を調製する。すなわち、調製容器内に外殻材料および水性媒体を所定量加えた後、攪拌して、外殻材料を水性媒体に溶解させる。外殻材料、水性媒体を調製容器に入れる順番は、特に限定されない。外殻材料を水性媒体に溶解させる方法としては、例えば、攪拌子による攪拌、超音波処理等を用いることができる。
　外殻材料としては、前述した両親媒性材料が使用される。また、水性媒体としては、前述した第１実施形態と同様の水性媒体を用いることができる。
　水性液体１０中における外殻材料の含有量は、工程（Ｓ４）において、水性液体１０中にバブル１が形成されるのであれば特に限定されない。外殻材料の好ましい含有量は、外殻材料および水性媒体の各種類の組み合わせによって変わるが、外殻材料は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上の濃度で水性液体１０に含まれているのが好ましい。具体的には、水性液体１０に含まれる外殻材料の含有量は、０．０１～５０ｗｔ％であるのが好ましく、０．１～２０ｗｔ％であるのがより好ましい。
　これにより、水性液体１０中の外殻材料の濃度が、より確実に臨界ミセル濃度以上となるので、水性液体１０中に外殻２（リポソーム、ミセル）を確実に形成することができる。そのため、後述する工程（Ｓ４）において、リポソームやミセル内にガス３が簡単に取り込まれ、所望の径のバブル１を水性液体１０中に容易に生成させることができる。本実施形態で生成されるバブル１は、外殻２の存在により、バブル１内のガス３が水性液体１０（水性媒体）に溶け出すのを長期にわたって防止することができる。そのため、バブル１の安定性が高くなり、バブル１が不本意に破裂するのをより確実に防止することができる。さらに、生成されるバブル１の大きさのバラつきを小さくすることができる。すなわち、均一なサイズのバブル１を生成することができる。
　調製される水性液体１０に含まれる水性媒体の含有量は、５０～９９．９９ｗｔ％であるのが好ましく、８０～９９．０ｗｔ％であるのがより好ましい。これにより、外殻材料を水性媒体に十分に溶解させることができ、より均一な水性液体１０を得ることができる。
　次に、前述した第１および第２実施形態と同様の製造容器２０を準備する。
　なお、上述した調製容器と製造容器２０とは、異なる容器でも同じ容器でもかまわない。
　調製容器と製造容器２０とが異なる容器である場合には、例えば、調製容器としては、比較的容量の大きい容器を用い、一方、製造容器２０（容器本体２１）としては、比較的容量の小さい容器を用いることができる。この場合、調製容器内に均一な組成の水性液体１０を多量に調製して、この水性液体１０を複数の製造容器２０に小分けすることにより、各製造容器２０内で生成されるバブルのサイズ（径）、量を均一にすることができる。
　また、調製容器と製造容器２０とが同一の容器である場合には、工程（Ｓ２）を省略することができる。したがって、プロセスを簡略化できる点で利点がある。
　なお、本実施形態では、調製容器として、製造容器２０と異なる容器を用いる。
　次に、前述した第１実施形態と同様に、工程（Ｓ２）～（Ｓ５）または工程（Ｓ２）～（Ｓ６）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０が得られる。
　本実施形態では、工程（Ｓ４）において水性液体１０と製造容器２０とが衝突した際に発生する衝撃波の圧力により、ガス３が水性液体１０中に微分散または溶解し、水性液体１０中の外殻材料をバブル１にする。このバブル１（外殻２）内には、上記工程（Ｓ３）において水性液体１０中に微分散または溶解したガス３、および本工程の振動により水性液体１０に微分散または溶解したガス３が含まれる。
　なお、工程（Ｓ３）において、第１実施形態と同様に、製造容器２０内を加圧しなくてもよいし（すなわち、製造容器２０内の圧力が大気圧）、第２実施形態と同様に製造容器２０内を加圧してもよい。
　かかる第３実施形態のバブルの製造方法およびバブル製造用容器によっても、前記第１および第２実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第４実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第４実施形態について説明する。前述した図２（ｂ）および図２（ｃ）に示すバブル１は、本実施形態のバブルの製造方法により、製造することができる。
　以下、第４実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第３実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態では、水性液体１０が、水性媒体、外殻材料および薬物４を含んでいる。すなわち、本実施形態のバブルの製造方法は、前述した第３実施形態の工程（Ｓ１）において調整する水性液体１０が、外殻材料、水性媒体に加え、薬物４を含んでいる以外は、前述した第３実施形態のバブルの製造方法と同様である。
　［Ｓ１］　準備工程
　本実施形態では、外殻材料、薬物４および水性媒体を調製容器に入れて、外殻材料と薬物４とを水性媒体に溶解させて、水性液体１０を調製する。すなわち、調製容器内に外殻材料、薬物４および水性媒体を所定量加えた後、攪拌して、外殻材料および薬物４を水性媒体に溶解させる。外殻材料、薬物４、水性媒体を調製容器に入れる順番は、特に限定されない。外殻材料および薬物４を水性媒体に溶解させる方法としては、例えば、攪拌子による攪拌、超音波処理等を用いることができる。
　薬物４としては、前述した遺伝子、薬剤等が使用される。調製される水性液体１０に含まれる薬物４の含有量は、０．１～５０ｗｔ％であるのが好ましく、２０～５０ｗｔ％であるのがより好ましい。これにより、製造されるバブル１に十分な量の薬物４を含ませることができる。その結果、患部に対する治療効果がより優れたバブル１を製造することができる。なお、薬物４が、外殻材料の代わりに、外殻２を構成する場合には、水性液体１０中に外殻材料を含まないでもよい。
　このようにして調整された水性液体１０を用いて、前述した第３実施形態と同様に、工程（Ｓ２）～（Ｓ５）または工程（Ｓ２）～（Ｓ６）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１（図２（ｂ）および図２（ｃ）参照）を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０が得られる。
　本実施形態では、バブル１（外殻２）内には、工程（Ｓ３）において水性液体１０中に微分散または溶解したガス３、および工程（Ｓ４）の振動により水性液体１０に微分散または溶解したガス３、薬物４が含まれる。その結果、生成されるバブル１は、薬物４がガス３とともに外殻２内に封入され、または、外殻２自体に含有または吸着している。
　３．使用方法
　上記のようにして得られたバブル含有容器は、患者の超音波治療、または超音波診断に用いられる。
　具体的には、まず、注射器の注射針を蓋２２のゴム栓２２１に刺通する。次に、注射器を用いてバブル含有容器内からバブル含有液を吸引する。バブル含有液を吸引した注射器の注射針を患者の血管（例えば静脈）に穿刺して、バブル含有液を血管内に注入する。これによりバブル１は、血流により患部に運ばれる。
　超音波治療の際には、バブル１が患部付近に到達した際に、外殻２が破裂する程度の周波数および強度を有する治療用超音波を照射して、外殻２を破裂させる。これより、バブル１内の薬物４を患部に集中的に供給（付与）して、患部を治療することができる。
　また、この場合、超音波治療と超音波診断とを組み合わせて行うのも有効である。具体的には、血管内のバブル１に対して、診断用超音波を照射して、その反射波をモニタリングする。これにより、バブル１の血管内（体内）での位置や挙動を正確に把握することができる。バブル１が目的の患部付近に到達したときに、治療用超音波を照射してバブル１（外殻２）を破裂させる。これにより、患部に対して、より正確に薬物を供給して、治療することができる。
　なお、ガス３として、前述した水性媒体に溶解性の高い成分（例えば、二酸化炭素等）を用いる場合には、バブル１を製造してから所定の時間経過すると、外殻２内のガス３が、水性媒体中に溶け出す。その後、外殻２内のガス３が完全に水性媒体中に溶け出すと、外殻２内に薬物４のみが封入された状態となる。すなわち、このような場合には、バブル１は、外殻２内に薬物４のみが封入されるリポソームまたはミセルとなる。このようにして得られたリポソームまたはミセルを薬剤として用いることもできる。
　なお、治療用超音波の強度（出力）は、０．１～３０Ｗ／ｃｍ２程度であるのが好ましく、０．５～１０Ｗ／ｃｍ２程度であるのがより好ましい。治療用超音波の強度を上記範囲内とすることにより、より確実にバブル１を破裂させることができるとともに、患部周辺の正常細胞へ与えるダメージを無くすか低減することができる。また、治療用超音波の強度が上記範囲内である場合、その照射時間は、１０～１２０秒程度であるのが好ましく、３０～６０秒程度であるのがより好ましい。
　また、超音波治療の際に照射する超音波の周波数は、１００ｋＨｚ～１０ＭＨｚ程度であるのが好ましく、７００ｋＨｚ～１ＭＨｚ程度であるのがより好ましい。照射する超音波の周波数を上記範囲内とすることにより、より低い超音波出力でバブルを破裂させることができる。
　かかる第４実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第３実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第５実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第５実施形態について説明する。
　図８は、本発明のバブルの製造方法の第５実施形態を説明するためのフローチャートである。
　以下、第５実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第４実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブルの製造方法は、図８に示すように、前述した第２実施形態の工程（Ｓ１）～（Ｓ５）（または、工程（Ｓ１）～（Ｓ６））の後に、工程（Ｓ７）、工程（Ｓ８）を有している。工程（Ｓ７）は、製造容器内の圧力を変化させる工程である。工程（Ｓ８）は、製造容器を振動させる回転数を設定する工程である。
　本実施形態のバブルの製造方法は、工程（Ｓ８）において、回転数を変化させない場合には（図８中、工程（Ｓ８）で「ＮＯ」を選択）、さらに、工程（Ｓ４’）および工程（Ｓ５’）を有している。一方、工程（Ｓ８）において、回転数を変化させる場合には（図８中、工程（Ｓ８）で「ＹＥＳ」を選択）、さらに、工程（Ｓ９）および工程（Ｓ１０）を有している。さらに、本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器内の圧力を変化させる工程（Ｓ１１）を有している。以下、工程（Ｓ７）以降の各工程について順次説明する。
　なお、本実施形態では、水性液体１０が、第１および第２実施形態のように、水性媒体のみであってもよいし、第３実施形態のように、水性媒体と外郭材料のみであってもよいし、または、第４実施形態のように水性媒体、外殻材料および薬物４を含んでいてもよい。
　［Ｓ７］製造容器内の圧力を変化させる工程
　前述した第１実施形態の工程（Ｓ５）後のバブル含有容器（製造容器２０）内の圧力を変化させる。
　（１）製造容器内の圧力を工程（Ｓ３）における圧力より高くする場合
　製造容器２０内を、前述した工程（Ｓ３）と同様にして加圧する。なお、注入するガス３は、工程（Ｓ３）で用いたガス３と同じでも、異なっていてもよいが、最終的に生成されるバブル１の安定性の観点から、同一のガス３を用いるのが好ましい。
　このような製造容器２０では、製造容器２０内が工程（Ｓ３）における製造容器２０内の圧力よりもさらに加圧さているため、水性液体１０中に微分散または溶解するガス３の量が、工程（Ｓ３）での水性液体１０に微分散または溶解したガス３の量よりも多くなる。そのため、後述する工程（Ｓ４’）または工程（Ｓ９）において製造容器２０を再振動させる際に、生成されるバブル１中に水性液体１０中のガス３が取り込まれ易くなり、その結果、バブル１の生成量が多くなる。また、工程（Ｓ４）で生成されるバブル１に加えられる圧力よりも大きい圧力が水性液体１０に加えられる。これにより、生成過程のバブル１がより大きな圧力で圧縮されるため、バブル１の径が小さくなりやすい。そのため、工程（Ｓ４）において生成されるバブル１よりも、より小さい径のバブル１を生成させることができる。
　この場合、製造容器２０内の圧力は、工程（Ｓ３）における圧力よりも、０．５ａｔｍ以上高くするのが好ましく、１～１０ａｔｍ高くするのがより好ましい。これにより、前述した工程（Ｓ４）において生成されるバブル１の径よりも小さい径のバブル１をより確実に生成させることができる。
　（２）製造容器内の圧力を１．０ａｔｍよりも大きくしつつ、工程（Ｓ３）における圧力より低くする場合
　まず、空の注射器を準備する。次に、注射器の注射針でゴム栓２２１を刺通する。その後、注射器に製造容器２０内のガス３を吸引する。これにより、製造容器２０内が減圧され、製造容器２０内の圧力が減圧される。その後、ゴム栓２２１から注射針を抜去する。
　このような製造容器２０では、後述する工程（Ｓ４’）または工程（Ｓ９）において製造容器２０を再振動させた際に、水性液体１０に加えられる圧力は、工程（Ｓ４）で生成される水性液体１０に加えられる圧力よりも小さい。これにより、生成過程のバブル１を圧縮する程度が小さくなり、バブル１の径が大きくなりやすい。そのため、工程（Ｓ４）において生成されるバブル１よりも、より大きい径のバブル１を生成させることができる。
　この場合、製造容器２０内の圧力は、１．０ａｔｍより大きく、工程（Ｓ３）における圧力よりも低い圧力までの範囲内で適宜調整される。
　［Ｓ８］製造容器を振動させる回転数の設定工程
　上記のようにして製造容器２０内の圧力を変化させた後、容器を再振動させる際の回転数を設定する。
　容器を再振動させる際の回転数は、前述した工程（Ｓ４）と同様に、５０００ｒｐｍ以上に設定される。
　工程（Ｓ８）において、容器を再振動させる際の回転数を工程（Ｓ４）における回転数から変えない場合、すなわち、図８中の工程（Ｓ８）で「ＮＯ」を選択した場合、以下の工程（Ｓ４’）を行う。
　一方、工程（Ｓ８）において、容器を再振動させる際の回転数を工程（Ｓ４）における回転数から変える場合、すなわち、図８中の工程（Ｓ８）で「ＹＥＳ」を選択した場合、以下の工程（Ｓ９）を行う。
　［Ｓ４’］製造容器を再振動させる工程
　上記のようにして、圧力を変化させた製造容器２０を、前述した工程（Ｓ４）と同じ回転数で再振動させる。これにより、工程（Ｓ４）において生成されるバブル１とは異なる径のバブル１が水性液体１０中に生成される。
　本工程では、工程（Ｓ４）と同じ回転数で製造容器２０を再振動させるため、本実施形態で新たに生成するバブル１の径は、工程（Ｓ７）において変化させた圧力に応じて変化する。すなわち、圧力を変化させることによって、バブル１の径を調整することができるため、所望の異なる径（平均径）を有するバブル１を再現性良く製造することができる。また、製造容器２０を振動させる装置の設定を変更する必要がないため、より簡易的に異なる径を有するバブル１を製造することができる。
　［Ｓ５’］製造容器を静置する工程
　上記条件で製造容器２０を振動させた後、工程（Ｓ５）と同様にして製造容器２０を静置する。これにより、製造容器２０内に異なるサイズのバブル１を安定的に多量に製造することができる。また、同時に、このようなバブル１を多量に含有する製造容器２０（バブル含有容器）が得られる。
　静置後、工程（Ｓ１１）が行われる。
　［Ｓ９］製造容器を再振動させる工程
　圧力を変化させた製造容器２０を、前述した工程（Ｓ４）とは異なる回転数で再振動させる。これにより、工程（Ｓ４）において生成されるバブル１とは異なる径のバブル１が水性液体１０中に生成される。
　（１）製造容器を工程（Ｓ４）よりも高い回転数で再振動させる場合
　製造容器２０を振動させる回転数を、工程（Ｓ４）での回転数よりも高くする以外は、前述した工程（Ｓ４）と同様にして、製造容器２０を再振動させる。
　この場合、製造容器２０の回転数は、工程（Ｓ４）での回転数よりも高くする限り特に限定されないが、６０００～２００００ｒｐｍであるのが好ましく、７０００～２００００ｒｐｍであるのがより好ましい。これにより、工程（Ｓ４）での回転数よりも大きい回転数で製造容器２０を振動させるため、工程（Ｓ４）で生成されたバブル１よりも小さい径のバブル１を生成させることができる。また、製造容器２０の回転数を上記範囲内とすることにより、工程（Ｓ４）および本工程で生成したバブル１同士が、衝突により崩壊したり、合体して粗大化するのをより確実に防止することができる。これにより、工程（Ｓ４）において生成されたバブル１と、工程（Ｓ４）において生成されたバブル１よりも小さい径のバブル１とを製造することができる。
　（２）製造容器を工程（Ｓ４）よりも低い回転数で再振動させる場合
　製造容器２０を振動させる回転数を、工程（Ｓ４）での回転数よりも低くする以外は、前述した工程（Ｓ４）と同様にして、製造容器２０を再振動させる。
　この場合、製造容器２０の回転数は、工程（Ｓ４）での回転数よりも低くする限り特に限定されないが、５０００～９０００ｒｐｍであるのが好ましく、５５００～７５００ｒｐｍであるのがより好ましい。これにより、工程（Ｓ４）での回転数よりも低い回転数で製造容器２０を振動させるため、工程（Ｓ４）で生成されたバブル１よりも大きい径のバブル１を生成させることができる。また、製造容器２０の回転数を上記範囲内とすることにより、工程（Ｓ４）および本工程で生成したバブル１同士が、衝突により崩壊したり、合体して粗大化するのをより確実に防止することができる。これにより、工程（Ｓ４）において生成されたバブル１と、工程（Ｓ４）において生成されたバブル１よりも大きい径のバブル１とを製造することができる。
　本工程では、工程（Ｓ４）と異なる回転数で製造容器２０を再振動させるため、本実施形態で新たに生成するバブル１の径は、製造容器２０内の圧力の変化および再振動時の回転数によって変化する。このように、製造容器２０内の圧力および再振動時の回転数のいずれも変化させることにより、前述した第１実施形態で得られる径とは大きく異なる径のバブル１を製造することができる。したがって、平均径が大きく異なるバブル１を製造する際には、本工程は有利である。
　［Ｓ１０］製造容器を静置する工程
　工程（Ｓ９）で製造容器２０を振動させた後、工程（Ｓ５）と同様にして製造容器２０を静置する。これにより、製造容器２０内に異なるサイズのバブル１を安定的に製造することができる。また、同時に、このようなバブル１を多量に含有する製造容器２０（バブル含有容器）が得られる。
　静置後、工程（Ｓ１１）が行われる。
　［Ｓ１１］製造容器内の圧力を再度変化させる工程
　製造容器２０内の圧力を変化させない場合、すなわち、図８中の工程（Ｓ１１）で「ＮＯ」を選択した場合、本実施形態のバブルの製造方法は終了する。これにより、平均径が１０ｎｍ～１０００μｍの範囲で、それぞれ異なる平均径を有する第１のバブル１と、第２のバブル１とが製造される。
　一方、製造容器２０内の圧力を変化させる場合、すなわち、図８中の工程（Ｓ１１）で「ＹＥＳ」を選択した場合、工程（Ｓ８）が行われる。その後、上述した工程（Ｓ４’）、（Ｓ５’）および（Ｓ１１）、または工程（Ｓ９）、（Ｓ１０）および（Ｓ１１）が繰り返し行われる。これにより、平均径が１０ｎｍ～１０００μｍの範囲で、互いに異なる複数の平均径を有するバブル１を製造することができる。
　なお、工程（Ｓ１１）において、繰り返し圧力を変化させる場合には、圧力を変化させる回数に応じた数の互いに異なる複数の平均径を有するバブル１を製造することができる。
　以上のようにして得られたバブル含有容器は、水性液体１０中に異なる径を有するバブル１を含む。サイズの違いによりバブル１の血管内の通過のし易さ、また、運搬される部位も変わってくる（例えば、バブル１のサイズが小さいほど、毛細血管の先端まで運搬できる。）ため、上記のようにして得られたバブル含有液は、超音波治療の目的に合わせて多面的に用いることが可能である。
　かかる第５実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第４実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第６実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第６実施形態について説明する。
　図９は、本発明のバブルの製造方法の第６実施形態に用いられる製造容器の蓋付近を示す部分断面図である。
　なお、以下の説明では、図９中の上側を「上」と言い、図９中の下側を「下」と言う。
　以下、第６実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第５実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器２０（バブル製造用容器の第２実施形態）の蓋２２の構成が異なる以外は、前述した第１～第５実施形態のバブルの製造方法と同様である。
　図９に示す蓋２２は、前述したゴム栓２２１、締付部２２２に加え、ゴム栓２２１の下面に接着剤等により接着する底板部２２３を備えている。換言すれば、底板部２２３は、容器本体２１の開口部に、ゴム栓２２１と接着した状態で設けられている。本実施形態の製造容器２０は、底板部２２３を備えることにより、前述した第１実施形態の製造容器２０の蓋２２よりも、蓋２２の質量が大きくなる。すなわち、底板部２２は、製造容器２０の質量を増加させる錘部となる。
　底板部２２３は、ゴム栓２２１よりも小径の円盤状をなす部材である。また、底板部２２３は、締付部２２２の開口に対応するように、平面視において、その略中心に注射器の注射針が挿通する貫通孔２２４が形成されている。なお、貫通孔２２４のサイズは特に限定されない。ただし、貫通孔２２４が、締付部２２２から露出するゴム栓２２１と同じサイズである場合には、工程（Ｓ３）において注射針をゴム栓２２１の締付部２２２から露出する領域のどこにでも刺通することができる。また、図９に示すように、貫通孔２２４が、注射針が挿通可能なサイズであってもよい。この場合、ゴム栓２２１の上面には、貫通孔２２４に対応する位置にマークを付して（図示せず）、このマークを目印として注射針をゴム栓２２１に刺通すればよい。
　また、底板部２２３には、複数の貫通孔２２４が設けられていてもよい。例えば、ガス３が充填された注射器の注射針および前述した減圧用注射器の注射針を挿通するための貫通孔、およびバブル吸引用注射器の注射針を挿通するための貫通孔の２つの貫通孔２２４を底板部２２３に設けてもよい。かかる構成では、減圧用注射器を用いることにより、バブル含有容器内の圧力を大気圧にした状態でバブル吸引用注射器によりバブル１を吸引することができる。そのため、吸引されたバブル含有液中のバブル１の粒径が変化したり、含有量が減少したりする等の悪影響の発生をより確実に防止することができる。また、底板部２２３に各注射器の注射針を挿通するための３つの貫通孔２２４を設けてもよい。また、ゴム栓２２１の上面には、各貫通孔２２４に対応する位置に、各注射器の注射針を刺通する目印としてマークを付してもよい。
　このような底板部２２３の構成材料としては、例えば、各種セラミック材料、各種金属材料が挙げられるが、ガラス以上の密度（２０００ｋｇ／ｍ３以上）を有する材料が好ましい。このような材料としては、鋳鉄（密度：７０００～７７００ｋｇ／ｍ３程度）、クロムニッケル鋼１８／８（密度：７９００ｋｇ／ｍ３程度）、Ｖ２Ａ鋼（密度：７９００ｋｇ／ｍ３程度）等のステンレス鋼、アルミニウム（密度：２７００ｋｇ／ｍ３程度）、ジェラルミン（密度：２７００ｋｇ／ｍ３程度）、鉛（密度：１１３４０ｋｇ／ｍ３程度）、鉄（密度：７８７０ｋｇ／ｍ３程度）、銅（密度：８９００ｋｇ／ｍ３程度）、真鍮（密度：８２５０～８５００ｋｇ／ｍ３程度）、ニッケル（密度：８３５０ｋｇ／ｍ３程度）、鋳鉄（密度：７０００～７７００ｋｇ／ｍ３程度）、亜鉛（密度：７１３０ｋｇ／ｍ３程度）、すず（密度：７２８０ｋｇ／ｍ３程度）等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの材料の中でも、比重が高く、水性液体１０の構成成分に対する高い耐腐食性を有するという観点から、鉄や、ステンレス鋼等の鉄合金を用いるのが特に好ましい。
　このような材料で構成される底板部２２３は、合成ゴムや樹脂等の比重（密度）の小さい材料を用いて形成される部材よりも、その質量が大きくなる。底板部２２３の質量を大きくすることにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が製造容器２０の上面（底板部２２３）に衝突した際に発生する衝撃波の大きさをより大きくすることができる。その結果、水性液体１０中に微細なバブル１をより容易に、かつ安定的に生成することができる。
　かかる蓋２２を用いる場合には、工程（Ｓ３）において、ガス３が充填された注射器の注射針が底板部２２３の貫通孔２２４を挿通するようにゴム栓２２１を刺通する。その後、上述した第２実施形態と同様に、注射器から製造容器２０内にさらにガス３を加えることにより、製造容器２０内を加圧する。その後、蓋２２（ゴム栓２２１）から注射針を抜くことにより、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる。
　かかる構成の製造容器２０（本実施形態のバブル製造用容器）を用いて、前述した第１～第５実施形態のバブルの製造方法と同様の工程を経て、バブル含有容器を得ることができる。
　かかる第６実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第５実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第７実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第７実施形態について説明する。
　図１０（ａ）～（ｆ）は、本発明のバブルの製造方法の第７実施形態に用いられる容器を模式的に示す断面図である。
　なお、以下の説明では、図１０（ａ）～（ｆ）中の上側を「上」と言い、図１０（ａ）～（ｆ）中の下側を「下」と言う。
　以下、第７実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第６実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブルの製造方法は、容器（製造容器）の形状が異なる以外は、前述した第１～第６実施形態のバブルの製造方法と同様である。
　本実施形態では、製造容器２０（バブル製造用容器の第３実施形態）は、図１０（ａ）～（ｄ）に示す様々な形状の容器本体２１と、各容器本体２１の上面の形状に合わせた蓋（図示せず）とを有している。図１０（ａ）～（ｄ）に示すように、容器本体２１の内面は、凹面、凸面および凹凸面のうちの少なくとも１つを含んでいる。
　図１０（ａ）に示す容器本体２１は、上面および下面が、内側に向かって突出した凸面である容器である。図１０（ｂ）に示す製造容器２０は、上面および下面が、凹凸面である容器である。図１０（ｃ）に示す製造容器２０は、上面および下面が、外側に向かって突出した凹面である容器である。図１０（ｄ）に示す製造容器は、側面が、製造容器２０の内側に向かって湾曲する凸面である容器である。
　このような面（凹面、凸面、または凹凸面）は、平坦面に比べて表面積が大きい。そのため、前述した工程（Ｓ４）において、水性液体１０が、製造容器の内面と衝突できる面積が大きくなり、より多くの衝撃波を発生させることができる。また、このような面では、その形状によって、発生する衝撃波の圧力の程度が異なる。これにより、水性液体１０中に異なる径のバブル１を多量に生成させることができる。
　また、容器本体２１の高さを、図１０（ｅ）に示すように、前述した第１～第６実施形態の容器本体２１よりも高くすることができる。このような容器本体２１を用いた場合には、工程（Ｓ４、Ｓ４’およびＳ９）において製造容器を振動させる際に、水性液体１０の移動距離が長くなる。そのため、衝突時に発生する衝撃波の大きさを大きくすることができる。これにより、水性液体１０中に製造されるバブル１のサイズをより小さくすることができる。
　一方、容器本体２１の高さを、図１０（ｆ）に示すように、前述した第１～第６実施形態の容器本体２１よりも低くすることができる。このような容器本体２１を用いた場合には、工程（Ｓ４、Ｓ４’およびＳ９）において製造容器を振動させる際に、水性液体１０の移動距離が短くなる。そのため、水性液体１０が製造容器の内面と衝突する回数を多くすることができるので、水性液体１０に衝撃波による圧力をより多く付与することができる。これにより、水性液体１０中により多くのバブル１を製造することができる。
　かかる第７実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第６実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第８実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第８実施形態について説明する。
　図１１（ａ）～（ｃ）は、本発明のバブルの製造方法の第８実施形態を説明するための斜視図である。図１２は、図１１（ａ）に示すミニナートバルブのゴム栓付近の構成（ハンドルは省略）を説明するための図であり、図１２（ａ）は、ミニナートバルブのゴム栓付近の上面図であり、図１２（ｂ）は、図１２（ａ）のＸ－Ｘ線断面図である。図１３は、図１１（ｃ）に示すバブル含有容器の断面図である。
　なお、以下の説明では、図１１（ａ）～（ｃ）、図１２（ｂ）、図１３中の上側および図１２（ａ）中の紙面手前側を「上」と言い、図１１（ａ）～（ｃ）、図１２（ｂ）、図１３中の下側および図１２（ａ）中の紙面奥側を「下」と言う。また、図１１（ａ）～（ｃ）中の左側を「左」と言い、図１１（ａ）～（ｃ）中の右側を「右」と言う。
　以下、第８実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第７実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器の構成が異なる以外は、前述した第１～第５実施形態のバブルの製造方法と同様である。
　［Ｓ１］　準備工程
　図１１（ａ）に示すような製造容器２０（バブル製造用容器の第４実施形態）を準備する。
　本実施形態では、製造容器２０は、前述した第１実施形態の製造容器２０と同様に、容器本体２１と、蓋２２とを有している。この蓋２２は、図１１（ａ）に示すように、その上側にミニナートバルブ３０と、ゴム栓２２１とミニナートバルブ３０とを連結するチューブ３３とを備えている。
　ミニナートバルブ３０は、貫通孔３１１を有するバルブ本体３１と、貫通孔３１１に埋設され、厚さ方向（上下方向）に貫通する管路３２１が形成されたゴム栓３２と、管路３２１の開閉を制御するハンドル（開閉機構）３４とを有している。
　バルブ本体３１は、略直方体状をなしており、その長手方向の中央付近に、厚さ方向（上下方向）に貫通する貫通孔３１１が形成されている（図１２（ａ）、（ｂ）参照）。また、図１２（ｂ）に示すように、バルブ本体３１には、その長手方向に貫通する貫通孔３１２が形成されている。
　ゴム栓３２は、略円筒状をなしており、例えば、シリコンゴム等で構成されている。このゴム栓３２は、バルブ本体３１の貫通孔３１１に挿入され、バルブ本体３１に固定（埋設）されている。ゴム栓３２の略中心には、注射器４０の注射針４１が挿入可能に形成された管路３２１が形成されている。また、ゴム栓３２には、管路３２１と直交し、ゴム栓３２の幅方向（左右方向）に貫通する貫通孔３２２が形成されている（図１２（ｂ）参照）。ゴム栓３２の貫通孔３２２とバルブ本体３１の貫通孔３１２とは互いに連通しており、貫通孔３２２および貫通孔３１２に、後述するハンドル３４のシャフト３４２が摺動可能に挿入される。
　ハンドル３４は、バルブ本体３１の長手方向（左右方向）の両端側に設けられた一対のノブ３４１と、各ノブ３４１と接続し、ゴム栓３２の貫通孔３２２およびバルブ本体３１の貫通孔３１２に摺動可能に挿入されるシャフト３４２とを有している。このシャフト３４２には、その一部に、厚さ方向（図１１（ａ）中、上下方向）に貫通する貫通孔３４３が形成されている。
　チューブ３３は、特に限定されないが、例えば、シリコン製のチューブで構成されている。チューブ３３の上端部は、ゴム栓３２の管路３２１と連通しており、チューブ３３の下端部は、ゴム栓２２１を介して、容器本体２１の内部空間（空隙部１１）と連通している。言い換えれば、管路３２１と容器本体２１の内部空間とは、チューブ３３を介して連通している。
　本実施形態の製造容器２０では、図１１（ａ）に示すように、左側のノブ３４１を右側に押して、左側のノブ３４１とバルブ本体３１の左側の端部とを接触した状態とすることにより、平面視（上面視）においてシャフト３４２の貫通孔３４３と管路３２１とが重なる（連通する）。これにより、管路３２１が開けられ、管路３２１、チューブ３３および容器本体２１の内部空間が連通した状態となる（図１１（ａ）、図１２（ｂ）参照）。一方、図１１（ｂ）に示すように、右側のノブ３４１を左側に押して、右側のノブ３４１とバルブ本体３１の右側の端部とを接触した状態とすることにより、平面視（上面視）においてシャフト３４２の貫通孔３４３の位置と管路３２１の位置とがずれる。これにより、管路３２１が閉じられ、製造容器２０内は密閉される。
　また、本実施形態では、蓋２２は、図９に示す蓋２２と同様に、ゴム栓２２１と、締付部２２２と、底板部２２３とを備えている（図１３参照）。図１３に示すように、チューブ３３の下端部（ゴム栓２２１と接続される側の端部）が、底板部２２３の貫通孔２２４に対応する位置に配置されている。そのため、チューブ３３は、容器本体２１の内部と連通する。
　［Ｓ３］製造容器を密閉する工程
　水性液体１０が注入された容器本体２１の空隙部１１を、ガス３でパージした後、蓋２２を容器本体２１の開口部（瓶口）に挿着する。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。
　次に、ガス３が充填された注射器４０を準備する。図１１（ａ）に示すように、ハンドル３４の左側のノブ３４１を右側に押圧操作して管路３２１を開き、管路３２１とチューブ３３とを連通させる。そして、注射器４０の注射針４１を管路３２１に挿入し、その後、ミニナートバルブ３０およびチューブ３３を介して、注射器４０から製造容器２０内にさらにガス３を加える。これにより、製造容器２０内が加圧される。
　その後、注射針４１を管路３２１から抜くと同時に、ハンドル３４の右側のノブ３４１を左側に押圧操作して管路３２１を閉めて、管路３２１とチューブ３３とを非連通状態とする。
　次に、チューブ３３の一部に熱処理を行い、チューブ３３内の空間が閉塞されたシーリング部３３１を形成する（図１１（ｂ）参照）。
　その後、チューブ３３を、シーリング部３３１のミニナートバルブ３０側（図中、上側）で切断し、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる（図１１（ｃ）参照）。
　その後の工程は、前述した第１～第５実施形態と同様に行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器（密閉容器）２０（バブル含有容器）が得られる。
　本実施形態では、工程（Ｓ３）において、注射針４１を蓋２２のゴム栓２２１に直接刺通することなく、製造容器２０内を加圧することができる。すなわち、本実施形態では、蓋２２およびチューブ３３（ゴム栓２２１からシーリング部３３１までの区間）に貫通孔がないため、製造容器２０内の密閉性を向上させることができる。製造容器２０内の密閉性が向上することにより、最終的に得られるバブル含有容器では、バブル１が水性液体１０中により安定的に存在することができる。すなわち、バブル含有容器の長期保存性がより向上する。
　かかる第８実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第７実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第９実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第９実施形態について説明する。
　図１４は、本発明のバブルの製造方法の第９実施形態に用いられる製造容器を説明するための斜視図である。
　なお、以下の説明では、図１４中の上側を「上」と言い、図１４中の下側を「下」と言う。また、図１４中の左側を「左」と言い、図１４中の右側を「右」と言う。
　以下、第９実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第８実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブルの製造方法は、ミニナートバルブ３０が、容器本体２１の側面に設けられている点で、前述した第８実施形態のバブルの製造方法と異なる。
　本実施形態で用いられる製造容器２０（バブル製造用容器の第５実施形態）は、図１４に示すように、前述した第８実施形態のバブルの製造方法で用いた容器本体２１と、蓋２２と、ミニナートバルブ３０と、容器本体２１とミニナートバルブ３０とを連結するチューブ３３とを有している。さらに、本実施形態の製造容器２０は、ミニナートバルブ３０が、水性液体１０の液面よりも蓋２２側（図中、上側）に設けられている。
　チューブ３３は、ガラス製のチューブ（管）で構成されており、容器本体２１（バイアル瓶）と一体的に形成されている。
　図１４に示すように、チューブ３３の左側の端部は、容器本体２１の内部空間（空隙部１１）と連通しており、チューブ３３の右側の端部は、ゴム栓３２の管路３２１と連通している。したがって、本実施形態においても、管路３２１と容器本体２１の内部空間とは、チューブ３３を介して連通している。
　かかる構成の製造容器２０を用いて、前述した第８実施形態のバブルの製造方法と同様の工程を経て、バブル含有容器を得ることができる。
　かかる第９実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第８実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第１０実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第１０実施形態について説明する。
　図１５は、本発明のバブルの製造方法の第１０実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。
　なお、以下の説明では、図１５中の上側を「上」と言い、図１５中の下側を「下」と言う。また、図１５中の左側を「左」と言い、図１５中の右側を「右」と言う。
　以下、第１０実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第９実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブル製造用容器は、その長手方向がほぼ水平方向（前述した第１～第９実施形態では、製造容器２０の長手方向が鉛直方向）となるように構成されている。また、工程（Ｓ４）において、製造容器を水平方向に振動させる。以上の点で、本実施形態のバブルの製造方法は、前述した第１～第９実施形態のバブルの製造方法と相違する。具体的には、工程（Ｓ４）において、図１５に示す製造容器２０を、ほぼその水平方向に往復運動するように、製造容器２０を振動させる。
　［Ｓ１］　準備工程
　図１５に示すような製造容器２０（バブル製造用容器の第６実施形態）を準備する。
　本実施形態の製造容器２０は、上部に円筒部２１１を有する容器本体２１と、円筒部２１１の開口を封止するゴム栓２３と、容器本体２１の両端部に固定される２つの錘部５とを備えている。
　容器本体２１は、水平方向（図１５中、左右方向）に長尺な略円筒状をなしている。容器本体２１の略中央には、容器本体２１の上面から鉛直上方に突出した円筒部（突出部）２１１が形成されている。なお、本実施形態の容器本体２１は、円筒部２１１の開口のみが外部に開放している。また、容器本体２１の両端側には、ネジ溝２１２が形成されている。
　ゴム栓２３は、特に限定されないが、例えば、シリコン製のゴム栓を用いることができる。
　錘部５は、円盤状をなす平板部５１と、平板部５１の縁部から立設する筒状部５２とを有しており、その外形が断面視した際に略Ｃ字状をなす部材である。筒状部５２の内周側には、容器本体２１のネジ溝２１２に螺合可能なネジ溝５２１が形成されている。錘部５のネジ溝５２１を容器本体２１のネジ溝２１２に螺合させることにより、平板部５１が容器本体２１の各端部に密着した状態で錘部５が容器本体２１に取り付けられる（固定される）。
　このような錘部５は、前述した図９に示す蓋２２の底板部２２３と同様に、セラミック材料、金属材料等の比重の大きい材料で構成されている。そのため、錘部５を容器本体２１に取り付けることにより、容器本体２１の両端部の質量を大きくすることができる。これにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が容器本体２１の錘部５に固定された部分（特に、両端部）に衝突した際に発生する衝撃波の大きさをより大きくすることができる。その結果、水性液体１０中に微細なバブル１をより容易に、かつ安定的に生成することができる。
　なお、錘部５の構成材料としては、比重が高く、水性液体１０の構成成分に対する高い耐腐食性を有するという観点から、金属材料の中でも鉄、または、ステンレス鋼等の鉄合金を用いるのが特に好ましい。
　また、このような錘部５は、容器本体２１に容易に脱着可能である。錘部５の構成材料および／またはサイズを変更することにより、錘部５の質量を適宜調整することができる。この錘部５の質量を調整することにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０中に生成されるバブル１のサイズおよび生成量を調整することができる。すなわち、本実施形態のバブルの製造方法では、様々なサイズおよび含有量のバブル１を、同一の製造容器２０を用いて製造することができる。そのため、目的とするサイズおよび含有量のバブル１に合わせて、サイズの異なる複数種の製造容器２０を準備する必要がないため、バブル含有容器の生産性が向上する。
　［Ｓ３］製造容器を密閉する工程
　水性液体１０が注入された容器本体２１内を、ガス３でパージした後、ゴム栓２３を容器本体２１の円筒部２１１の開口に挿着する。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。
　次に、ガス３が充填された注射器４０を準備する。そして、注射器４０の注射針４１をゴム栓２３に刺通する。その後、注射器４０から製造容器２０内にさらにガス３を加える。これにより、製造容器２０内が加圧される。その後、ゴム栓２３から注射針を抜くことにより、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる。
　［Ｓ４］製造容器を振動させる工程
　次に、水性液体１０が、製造容器２０の両端部および側面（特に、両端部）に繰り返し衝突するように、製造容器２０を振動させる。本実施形態では、製造容器２０が、製造容器２０の水平方向（長手方向）にほぼ往復運動するように、製造容器２０を振動させる。
　なお、本実施形態における製造容器２０の振動は、前述した第１実施形態の工程（Ｓ４）と同様の条件で行うことができる。
　その後の工程は、前述した第１～第５実施形態と同様に行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器（密閉容器）２０（バブル含有容器）が得られる。
　かかる第１０実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第９実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第１１実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第１１実施形態について説明する。
　図１６は、本発明のバブルの製造方法の第１１実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。図１６（ａ）は、分解した状態の製造容器を示しており、図１６（ｂ）は、組立てた状態の製造容器を示している。
　なお、以下の説明では、図１６（ａ）および（ｂ）中の上側を「上」と言い、図１６（ａ）および（ｂ）中の下側を「下」と言う。また、図１６（ａ）および（ｂ）中の左側を「左」と言い、図１６（ａ）および（ｂ）中の右側を「右」と言う。
　以下、第１１実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第１０実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブルの製造方法は、図１６（ａ）および（ｂ）に示すように、製造容器２０（バブル製造用容器の第７実施形態）の容器本体２１の両端が外部に開放される以外は、前述した第１０実施形態の図１５に示す製造容器２０を用いたバブルの製造方法と同じである。すなわち、容器本体２１は、両端が外部に開口した円筒状をなす部材で構成されている。
　かかる構成の製造容器２０を用いる場合には、まず、錘部５のネジ溝５２１を容器本体２１のネジ溝２１２に螺合させることにより、錘部５を容器本体２１に取り付ける。なお、図１６（ｂ）に示すように、錘部５が容器本体２１に取り付けられた状態では、平板部５１が容器本体２１の各端部に密着する。
　なお、図示しないが、平板部５１と容器本体２１の各端部との間に、錘部５と容器本体２１との密着性を高めるためのパッキンを配置してもよい。これにより、製造容器２０の密閉性を向上させることができる。
　その後、上述した本実施形態のバブルの製造方法と同様の工程を経て、バブル含有容器を得ることができる。
　このようにして得られたバブル含有容器は、ゴム栓２３に注射器の注射針を刺通した後、バブル含有液を吸引して使用することができる。また、かかる構成では、錘部５を容器本体２１から外し、注射器を用いることなく、直接バブル含有容器からバブル含有液を取り出すことができる。
　かかる第１１実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第１０実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第１２実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第１２実施形態について説明する。
　図１７は、本発明のバブルの製造方法の第１２実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。
　なお、以下の説明では、図１７中の上側を「上」と言い、図１７中の下側を「下」と言う。
　以下、第１２実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第１１実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器の構成が異なる以外は、前述した第１～第５実施形態のバブルの製造方法と同じである。
　［Ｓ１］　準備工程
　図１７に示すような製造容器２０（バブル製造用容器の第８実施形態）を準備する。
　本実施形態の製造容器２０は、容器本体２１と、容器本体２１を密閉する蓋２２と、容器本体２１の他端側に、容器本体２１の長手方向に移動可能に設けられた錘部５と、錘部５を固定する一対のＯリング６とを有している。なお、蓋２２は、前述した第１実施形態の製造容器２０の蓋２２と同じ構成を有している
　容器本体２１は、略有底円筒状をなしている。容器本体２１は、蓋２２が取り付けられる上部本体部２１５と、錘部５が取り付けられ、上部本体部２１５よりも小さい内径を有する下部本体部２１６とを有する。また、図１７に示すように、上部本体部２１５は、その下端部に、下部本体部２１６と同じ内径となるように縮径している縮径部２１７を有する。上部本体部２１５の一端側（上端側）の外周面には、蓋２２の締付部２２２（締付部２２２の内周面）と螺合可能なネジ溝２１３が形成されている。また、下部本体部２１６の外周面の全体にわたって、錘部５（錘部５の内周面）と螺合可能なネジ溝２１４が形成されている。
　また、容器本体２１を構成する材料は、特に限定されないが、ガラス等の各種セラミックス材料、樹脂材料等を用いることができる。
　上部本体部２１５の長手方向の長さは、特に限定されないが、１０～６０ｍｍ程度であるのが好ましく、１５～３０ｍｍ程度であるのがより好ましい。また、上部本体部２１５の内径は、５～２０ｍｍ程度であるのが好ましく、８～１５ｍｍ程度であるのがより好ましい。また、下部本体部２１６の長手方向の長さは、特に限定されないが、１０～３５ｍｍ程度であるのが好ましく、１３～２３ｍｍ程度であるのがより好ましい。また、下部本体部２１６の内径は、上部本体部２１５の内径よりも小さければ、特に限定されないが、２～１５ｍｍ程度であるのが好ましく、３～８ｍｍ程度であるのがより好ましい。
　かかる寸法の容器本体２１を用いることにより、容器本体２１内の密閉空間で適切な圧力が水性液体１０に付与されるので、均一なサイズのバブル１を安定的に得ることができる。また、この場合、超音波診断の際に、１つの製造容器２０内のバブル含有液を使い切ることができるため、製造されるバブル含有液の無駄をなくすことができる。
　また、上部本体部２１５の内径と下部本体部２１６の内径とが上記範囲内であると、上部本体部２１５の内径と下部本体部２１６の内径との差が大きくなり、縮径部２１７が大きくなる。そのため、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が上部本体部２１５から下部本体部２１６側へと移動する際に、水性液体１０が、この縮径部２１７に衝突して、衝撃波が発生する。このように、縮径部２１７の存在により、一定の内径を有する容器を用いる場合に比べて、製造容器２０内に発生する衝撃波の発生頻度を高くすることができる。
　さらに、製造容器２０の振動工程において、上部本体部２１５から下部本体部２１６へと水性液体１０が移動するため、水性液体１０の移動速度が速くなる。そのため、キャビテーション効果により、下部本体部２１６内の水性液体１０にバブルがより生成し易くなる。これらの相乗効果により、より短時間で、均一な粒径のバブル１をより効率良く生成することができる。
　また、ネジ溝２１４が、下部本体部２１６の外周面の全体にわたって形成されるので、長手方向の長さが上記範囲内であれば、錘部５を容器本体２１の下端から中央付近まで移動させることができる。
　錘部５を容器本体２１の下端付近に設けた場合には、容器本体２１の下端部の重量が大きくなる。そのため、前述した第１０実施形態と同様に、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が容器本体２１の下端部と衝突した際に発生する衝撃波を大きくすることができる。
　一方、錘部５の位置を容器本体２１の中央付近に設けた場合には、縮径部２１７の重量が大きくなる。そのため、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が縮径部２１７と衝突した際に発生する衝撃波を大きくすることができる。
　また、錘部５が設けられる位置が、容器本体２１の下端部に近いほど、水性液体１０が容器本体２１の下端部と衝突した際に発生する衝撃波が大きくなる。すなわち、本実施形態では、下部本体部２１６に錘部５を設置する位置を調整することにより、製造容器２０内に発生する衝撃波の大きさを制御することができ、所望のサイズのバブル１をより安定的に生成させることができる。
　なお、容器本体２１全体の長手方向の長さは、特に限定されないが、２０～８５ｍｍ程度であるのが好ましく、３０～５３ｍｍ程度であるのがより好ましい。
　錘部５は、リング状をなす部材である。錘部５を下部本体部２１６のネジ溝２１４に螺合させた状態において、錘部５を回転させることにより、錘部５は、下部本体部２１６のネジ溝２１４が形成された領域を長手方向（図１７中、上下方向）に移動する。
　上述したように、本実施形態のバブルの製造方法では、容器本体２１に錘部５を設ける位置を設定することにより、製造容器２０内に発生する衝撃波の大きさを制御することができる。これにより、得られるバブル１のサイズおよび含有量を調整することができる。
　錘部５の質量は、特に限定されないが、上述した寸法の容器本体２１に対しては、３～３０ｇ程度であるのが好ましく、５～２０ｇ程度であるのがより好ましい。錘部５の質量が上記範囲内であれば、得られるバブル１のサイズおよび含有量を、より効率良く調整することができる。
　Ｏリング６は、錘部５を挟むように錘部５の上側と下側とに設けられ、製造容器２０の振動等により錘部５が移動するのを防止するための部材である。なお、Ｏリング６としては、シリコン製のＯリングを用いることができる。
　錘部５およびＯリングは、以下のようにして、容器本体２１と取り付けることができる。まず、１つ目のＯリング６を下部本体部２１６の下端側から挿通し、所定の位置で止める。次に、錘部５を下部本体部２１６の下端部に取り付け、取り付けたＯリング６と接触するまで移動させる。その後、２つ目のＯリング６を下部本体部２１６の下端側から挿通し、錘部５に接触するまで移動させることにより、２つのＯリング６により錘部５が固定される。
　その後の工程は、前述した第１～第５実施形態と同様に行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器（密閉容器）２０（バブル含有容器）が得られる。
　かかる第１２実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第１１実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　＜第１３実施形態＞
　次に、本発明のバブルの製造方法の第１３実施形態について説明する。
　図１８は、本発明のバブルの製造方法の第１３実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。図１８（ａ）は、分解した状態の製造容器を示しており、図１８（ｂ）は、組立てた状態の製造容器を示している。図１９は、図１８（ｂ）に示す製造容器の蓋に形成される開口部の位置を説明するための図である。図１９（ａ）は、注射器の注射針をゴム栓に刺通する前の状態を説明するための図であり、図１９（ｂ）は、注射針をゴム栓から抜いた後に締付部を底板部に締め付けた状態を説明するための図である。
　なお、以下の説明では、図１８（ａ）および（ｂ）中の上側を「上」と言い、図１８（ａ）および（ｂ）中の下側を「下」と言う。また、図１８（ａ）および（ｂ）中の左側を「左」と言い、図１８（ａ）および（ｂ）中の右側を「右」と言う。
　以下、第１３実施形態のバブルの製造方法について、前記第１～第１２実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
　本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器の蓋の構成が異なる以外は、前述した第１～第５実施形態のバブルの製造方法と同様である。
　［Ｓ１］　準備工程
　図１８（ｂ）に示すような製造容器２０（バブル製造用容器の第９実施形態）を準備する。
　本実施形態の製造容器２０は、前述した第１実施形態の製造容器２０と同様の容器本体２１と、蓋２２とを有している。
　本実施形態では、蓋２２は、容器本体２１の瓶口に固定される底板部２２３と、底板部２２３の容器本体２１とは反対側に配置されるゴム栓２２１と、ゴム栓２２１を底板部２２３に固定する締付部２２２とを備えている。
　底板部２２３は、円盤状をなす平板部２２５と、平板部２２５の縁部から立設する筒状部２２６とを有しており、その外形を断面視した際に略Ｃ字状をなす部材である。本実施形態では、平面視（上面視）における底板部２２３（平板部２２５）の形状と、ゴム栓２２１との形状がほぼ等しく、互いにほぼ同じ径を有している。また、筒状部２２６の内周面および容器本体２１の瓶口側の外周面には、互いに螺合可能に形成されたネジ溝が、それぞれ形成されており、これらを螺合させることにより、底板部２２３（平板部２２５）が容器本体２１の瓶口と密着した状態で固定される。
　また、底板部２２３には、平面視（上面視）において、その中心から所定の距離離間した位置に、注射器の注射針が挿通可能なサイズを有する貫通孔２２４が形成されている。すなわち、図１９（ａ）に示すように、蓋２２の平面視において、ゴム栓２２１の中心Ｃと底板部２２３の貫通孔２２４とはズレている。
　かかる底板部２２３は、前述した図９に示す蓋２２の底板部２２３と同様に、セラミック材料、金属材料等の比重の大きい材料で構成されている。底板部２２３の質量を大きくすることにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が製造容器２０の上面（底板部２２３）に衝突した際に発生する衝撃波の大きさをより大きくすることができる。その結果、水性液体１０中に微細なバブル１をより容易に、かつ安定的に生成することができる。
　ゴム栓２２１としては、前述した第１実施形態のバブルの製造方法で用いたゴム栓２２１と同様のゴム栓を用いることができる。このゴム栓２２１の表面には、蓋２２を容器本体２１に取り付けた状態において、底板部２２３の貫通孔２２４に対応する位置に注射針を刺通するためのマークＸが付されている（図１９（ａ）参照）。
　締付部２２２は、ゴム栓２２１の縁部を覆うように構成されている。また、締付部２２２および底板部２２３（平板部２２５）の外周面には、互いに螺合可能に形成されたネジ溝が、それぞれ形成されており、これらを螺合させることにより、ゴム栓２２１が底板部２２３（平板部２２５）と密着した状態で固定される。
　［Ｓ３］製造容器を密閉する工程
　まず、水性液体１０が注入された容器本体２１の空隙部１１を、ガス３でパージした後、蓋２２を容器本体２１の開口部（瓶口）に挿着する（図１９（ａ）に示す状態）。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。
　図１９（ａ）に示す状態において、ゴム栓２２１のマークＸに、ガス３が充填された注射器の注射針を刺通して、注射針を底板部２２３の貫通孔２２４に挿通させる。その後、注射器から製造容器２０内にさらにガス３を加えて、製造容器２０内を加圧した後、ゴム栓２２１から注射針を抜く。
　次に、締付部２２２を回して、締付部２２２を底板部２２３に締め付ける（図１９（ｂ）に示す状態）。締付部２２２を底板部２２３に締め付けることにより、ゴム栓２２１が、底板部２２３に対して回転（例えば、１８０°回転）しながら、底板部２２３側に圧縮される。そのため、平面視における、注射針の刺通によりゴム栓２２１に形成された貫通孔２２７の位置と底板部２２３の貫通孔２２４の位置とがずれる（図１９（ｂ）参照）。これにより、底板部２２３の貫通孔２２４がゴム栓２２１により閉じられ、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる。
　本実施形態では、製造容器２０の内部と外部とを連通する部分が存在しないため、製造容器２０内の密閉性を向上させることができる。製造容器２０内の密閉性が向上することにより、最終的に得られるバブル含有容器では、バブル１が水性液体１０中により安定的に存在することができる。すなわち、バブル含有容器の長期保存性がより向上する。
　上述したように、締付部２２２を底板部２２３に締め付けることにより、ゴム栓２２１は底板部２２３側に圧縮される。締付部２２２を底板部２２３に締め付ける前の状態におけるゴム栓２２１の厚さをｔ１（ｍｍ）とし、締付部２２２を底板部２２３に締め付けた状態におけるゴム栓２２１の厚さをｔ２（ｍｍ）としたとき、ゴム栓２２１の圧縮率（（ｔ１－ｔ２）／ｔ１×１００）は、５～６０％であるのが好ましく、１０～３０％であるのがより好ましい。これにより、締付部２２２の締付けによるゴム栓２２１への負荷を抑えつつ、ゴム栓２２１と底板部２２３との密着性をより向上させることができる。その結果、製造容器２０内の密閉性をより向上させることができる。
　本実施形態においても、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０（バブル含有容器）が得られる。
　なお、底板部２２３には、前述した第６実施形態と同様に、複数の貫通孔２２４が設けられてもよい。
　かかる第１３実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１～第１２実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　以上、本発明のバブルの製造方法およびバブル製造用容器を図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明は、これに限定されるものではなく、各工程は、同様の機能を発揮し得る任意の工程と置換することができる。
　例えば、前記第１～第１３実施形態の任意の構成を組み合わせることもできる。
　ここで、製造容器２０内に封入するガス３の容量および製造容器２０の回転数が、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量に与える影響を解明するために、以下の実験を行った。
　（実施例１）
　まず、製造容器２０の回転数と、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量との関係を調べた。
（バブルの製造方法）
　［準備工程］
　まず、アルブミンが２５０ｍｇ／ｍｌ含まれるアルブミン溶液（ＣＳＬ　Ｂｅｈｒｉｎｇ社製　アルブミナー２５％）を１２０μｌ準備するとともに、２５％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１２ｍｌ準備した。また、１５ｍｌのバイアル瓶（高さＸ：５０ｍｍ、外径Ｒ：２５ｍｍ）を準備した。なお、このバイアル瓶は、図４に示す製造容器２０と同様の形状をなしている。
　［水性液体を容器に注入する工程］
　準備したバイアル瓶内に、アルブミン溶液と２５％リン酸緩衝生理食塩水とを全量注入した。なお、アルブミン溶液と２５％リン酸緩衝生理食塩水とを混合してなる水性液体の液面の高さＹは、２５ｍｍであった。
　［容器を密閉する工程］
　次に、水性液体が注入されたバイアル瓶内の空隙をパーフルオロブタンでパージした後、バイアル瓶の瓶口に図４に示す蓋２２と同様の形状の蓋を挿着した。次に、パーフルオロブタンが充填された注射器を準備した。注射器の注射針で蓋のゴム栓を刺通して、注射器からバイアル瓶内にさらに２ｍｌのパーフルオロブタンを加えた。これにより、内部の圧力が２ａｔｍの密閉バイアル瓶を得た。
　［容器を振動させる工程］
　次に、上記の密閉バイアル瓶を２つ準備した。ｂｅｒｔｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（高速細胞破砕システム）を用いて、一方の密閉バイアル瓶を回転数５０００ｒｐｍで３０秒間振動させ、他方の密閉バイアル瓶を回転数６５００ｒｐｍで３０秒間振動させた。その際、密閉バイアル瓶は、上下方向に往復運動し、水性液体がバイアル瓶の上下面に繰り返し衝突することを確認した。なお、密閉バイアル瓶を振動させる際に、密閉バイアル瓶の長手方向（鉛直方向）の振動幅は、４０ｍｍであり、密閉バイアル瓶の短手方向（水平方向）の振動幅は、２０ｍｍであった。上記条件に設定することにより、いずれのバイアル瓶についても、バイアル瓶と水性液体との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるようにした。
　［容器を静置させる工程］
　振動後、密閉バイアル瓶を静置させ、バブル含有容器を得た。
（バブル径分布測定）
　上記のようにして得られたバブル含有容器から、バブルを含有する水性液体（バブル含有液）を注射器で取出した、次に、バブル測定装置（ナノ粒子解析システム　ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を用いて、水性液体に含まれるバブルのバブル径分布測定を行った。その結果を、図２０に示す。
　図２０（ａ）は、５０００ｒｐｍおよび６５００ｒｐｍの回転数でバブルを製造した時のバブルのバブル径分布を示すグラフである。図２０（ｂ）は、図２０（ａ）に示すグラフにおいて、横軸が０～７００ｎｍの範囲である部分拡大図である。
　図２０（ａ）に示すように、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させることにより、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合に比べて、水性液体中のバブルの含有量を大幅に多くすることができた。特に、径が６００ｎｍ程度よりも小さいバブルの含有量は、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合に比べて、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合の方が、３～５倍以上多くなった。
　密閉バイアル瓶の回転数が５０００ｒｐｍの場合でも、その振動時間を長くすることにより、水性液体中のバブルの含有量をある程度多くすることはできる。ただし、回転数が６５００ｒｐｍの場合のバブルの含有量に比べると少ない。
　また、図２０（ｂ）に示すように、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合には、径が１００～１５０ｎｍ程度の極小のバブルを多量に生成させることができた。
　以上の結果は、以下のような作用・効果によるものと考えられる。すなわち、密閉バイアル瓶の回転数に応じて、水性液体とバイアル瓶とが衝突する際に生じる衝撃波の圧力の大きさが変化する。この衝撃波の圧力の大きさが、水性液体中に生成されるバブルの径および含有量を決定する大きな要因となっている。一般的な攪拌子を用いた攪拌や、５０００ｒｐｍよりも小さい回転数での振動では、このような衝撃波が発生しない、または、発生したとしても発生量がわずかである。そのため、本願発明のように十分に小さい径を有するバブルを、十分な含有量で水性液体中に生成させることはできない。
　図２１は、図２０（ａ）に示すバブル径分布のグラフを解析した結果である。
　図２１（ａ）は、密閉バイアル瓶の回転数とバブルの平均径との関係を示すグラフである。図２１（ｂ）は、密閉バイアル瓶の回転数とバブルの含有量との関係を示すグラフである。
　図２１（ａ）に示すように、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合には、生成されるバブルの平均径は、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合に比べて、８０ｎｍ程度小さくなった。また、図２１（ｂ）に示すように、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合には、生成されるバブルの含有量は、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合に比べて、９×１０７個（ｐａｒｔｉｃｌｅ）／ｍｌ程度小さくなった。この結果からも、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合に、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合よりも、小さい径のバブルを多量に生成することができることが分かった。
　（実施例２）
　次に、製造容器２０内に封入するガス３の容量と、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量との関係を調べた。
（バブルの製造方法）
　実施例１の容器を密閉する工程において、バイアル瓶内に封入するパーフルオロブタンの容量を、０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌ、２ｍｌにそれぞれ変更した４つの密閉バイアル瓶を準備した以外は、前記実施例１と同様にしてバブル含有容器を得た。
　なお、各密閉バイアル瓶について、封入するガス（パーフルオロブタン）の容量（ｍｌ）、密閉バイアル瓶内の圧力（ａｔｍ）および容器を振動させる工程における密閉バイアル瓶の回転数（ｒｐｍ）を、下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（バブル径分布測定）
　実施例１と同様にして、得られた各バブル含有容器内のバブル含有液のバブル径分布測定を行った。得られたバブル径分布のグラフを解析した結果を、図２２に示す。
　図２２（ａ）は、密閉バイアル瓶内に封入されるガスの容量とバブルの平均径との関係を示すグラフである。図２２（ｂ）は、密閉バイアル瓶内に封入されるガスの容量とバブルの含有量との関係を示すグラフである。
　図２２（ａ）に示すように、密閉バイアル瓶を振動させる回転数が同じであっても、密閉バイアル瓶内の圧力を大きくすることによって、生成されるバブルの平均径が小さくなった。具体的には、密閉バイアル瓶内の圧力が２ａｔｍである場合には、生成されるバブルの平均径は、密閉バイアル瓶内の圧力が１．２ａｔｍである場合に比べて、１００ｎｍ程度小さくなった。
　また、図２２（ｂ）に示すように、密閉バイアル瓶内の圧力を大きくすることによって、バブルの含有量が多くなった。特に、密閉バイアル瓶内の圧力が２ａｔｍである場合には、バブルの含有量は、密閉バイアル瓶内の圧力が１．２ａｔｍである場合に比べて、２倍以上多くなった。
　密閉バイアル瓶内の圧力を大きくなることによって、水性液体とバイアル瓶とが衝突する際に生じる衝撃波の圧力が、生成されるバブルの径および含有量に大きく作用すると考えられる。そのため、密閉バイアル瓶を振動させる回転数が同じであっても、密閉バイアル瓶内の圧力に応じて、生成されるバブルの平均径が変化する。また、密閉バイアル瓶内の圧力を大きくなることによって、ガスが水性液体中に多量に取り込まれる。そのため、前述したような衝撃波の作用により、水性液体中に生成されるバブルの含有量を多くすることができた。
　（実施例３）
　（ＧＦＰ遺伝子を含有するナノバブルの製造方法）
　［準備工程］
　まず、前述した第１実施形態と同様に、１２０μｌのアルブミン溶液（ＣＳＬ　Ｂｅｈｒｉｎｇ社製　アルブミナー２５％）と、１２ｍｌの２５％リン酸緩衝生理食塩水を準備した。さらに、ＧＦＰ遺伝子を２μｇ準備した。また、１５ｍｌのバイアル瓶（高さＸ：５０ｍｍ、外径Ｒ：２５ｍｍ）を準備した。なお、このバイアル瓶は、図４に示す製造容器２０と同様の形状をなしている。
　［水性液体を容器に注入する工程］
　準備したバイアル瓶内に、アルブミン溶液と、２５％リン酸緩衝生理食塩水と、ＧＦＰ遺伝子とを全量注入した。なお、アルブミン溶液、２５％リン酸緩衝生理食塩水およびＧＦＰ遺伝子を混合してなる水性液体の液面の高さＹは、２５ｍｍであった。
　［容器を密閉する工程］
　次に、水性液体が注入されたバイアル瓶内の空隙をパーフルオロブタンでパージした後、バイアル瓶の瓶口に図４に示す蓋２２と同様の形状の蓋を挿着した。次に、パーフルオロブタンが充填された注射器を準備した。注射器の注射針で蓋のゴム栓を刺通して、注射器からバイアル瓶内にさらに２ｍｌのパーフルオロブタンを加えた。これにより、これにより、内部の圧力が２ａｔｍの密閉バイアル瓶を得た。
　［容器を振動させる工程］
　次に、上記の密閉バイアル瓶を、ｂｅｒｔｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰｒｅｃｅｌｌｙｓを用いて、回転数７０００ｒｐｍで３０秒間振動させた。その際、密閉バイアル瓶は、上下方向に往復運動し、水性液体がバイアル瓶の上下面に繰り返し衝突することを確認した。なお、密閉バイアル瓶を振動させる際に、密閉バイアル瓶の長手方向（鉛直方向）の振動幅は、４０ｍｍであり、密閉バイアル瓶の短手方向（水平方向）の振動幅は、２０ｍｍであった。上記条件に設定することにより、バイアル瓶と水性液体との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるようにした。
　［容器を静置させる工程］
　振動後、密閉バイアル瓶を静置させ、バブル含有容器を得た。なお、バブルを含有する水性液体（バブル含有液）を注射器で取出し、バブル測定装置（ナノ粒子解析システム　ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を用いて、バブルのサイズを確認した。その結果、バブルの平均径は、６００ｎｍであった。
　＜細胞内への蛍光タンパク質発現遺伝子の導入の評価＞
　脳血管周皮細胞（ペリサイト）（タカラバイオ株式会社製　製品コード：Ｃ－１２９８０）を培養したシャーレーに、実施例３で得られた０．２μｇの水性液体を添加し、脳血管周皮細胞培地を得た。なお、ペリサイトは、遺伝子導入が非常に難しい細胞として知られている。
　このような脳血管周皮細胞培地を４サンプル準備した。これらのサンプルに対して、周波数：１．０ＭＨｚの超音波（正弦波、パルス繰り返し周波数（ＰＲＦ）：１００Ｈｚ、デューティー比（ＤＣ）：１０％）を以下の出力で６０秒間照射した。
［照射出力］
　０．６Ｗ／ｃｍ２、０．８Ｗ／ｃｍ２、０．９Ｗ／ｃｍ２、１．０Ｗ／ｃｍ２
　その後、３７℃において４８時間にわたって脳血管周皮細胞培地を培養させた後の各サンプルを蛍光顕微鏡で観察した。
　図２３は、３７℃において４８時間培養させた脳血管周皮細胞培地の蛍光顕微鏡画像であり、図２３（ａ）は、照射強度：０．６Ｗ／ｃｍ２で超音波照射したサンプルの画像であり、図２３（ｂ）は、照射強度：０．８Ｗ／ｃｍ２で超音波照射したサンプルの画像である。また、図２４は、３７℃において４８時間培養させた脳血管周皮細胞培地の蛍光顕微鏡画像であり、図２４（ａ）は、照射強度：０．９Ｗ／ｃｍ２で超音波照射したサンプルの画像であり、図２４（ｂ）は、照射強度：１．０Ｗ／ｃｍ２で超音波照射したサンプルの画像である。
　図２３（ａ）、（ｂ）および図２４（ａ）、（ｂ）に示すように、いずれの照射出力で超音波照射されたサンプルにおいても、緑色に発色した領域が確認された。これは、各サンプルにおいて、脳血管周皮細胞内で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が発現していることを示している。したがって、いずれのサンプルにおいても、超音波照射によってバブルが破裂し、バブルに包含されたＧＦＰ遺伝子が脳血管周皮細胞内に導入されたことが示された。
　次に、水性液体１０の種類と、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量との関係を調べた。
　（実施例４）
（バブルの製造方法）
　［準備工程］
　まず、水性液体としての蒸留水を１２ｍｌ準備した。また、１５ｍｌのバイアル瓶（高さＸ：５０ｍｍ、外径Ｒ：２５ｍｍ）を準備した。なお、このバイアル瓶は、図４に示す製造容器２０と同様の形状をなしている。
　［水性液体を容器に注入する工程］
　準備したバイアル瓶内に、蒸留水（水性液体）を注入した。なお、水性液体の液面の高さＹは、２５ｍｍであった。
　次に、バイアル瓶内に充填するガスとして、パーフルオロプロパンを用いて［容器を密閉する工程］を行った後、前記第１実施形態と同様に、［容器を振動させる工程］および［容器を静置させる工程］を行うことにより、バブル含有容器を得た。
　（実施例５）
　蒸留水を１ｗ／ｖ％のデキストラン水溶液に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例６）
　蒸留水を１００％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例７）
　蒸留水をソルデム３Ａ輸液（テルモ株式会社製）に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例８）
　蒸留水をソルデム１輸液（テルモ株式会社製）に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例９）
　蒸留水を生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％ＮａＣｌ水溶液）に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例１０）
　蒸留水を０．２５ｗ／ｖ％のアルブミン水溶液に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例１１）
　蒸留水を２０ｗ／ｖ％のグルコース水溶液に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。
（バブル径分布測定）
　上記のようにして得られた実施例４～実施例１１のバブル含有液に対して、前記第１実施形態と同様にして、バブル径分布測定を行った。その結果を、図２５に示す。
　図２５は、実施例４～１１で得られたバブルのバブル径分布を示すグラフである。
　図２５に示すように、水性液体中の水の濃度が高いほど、生成されるバブル１の径が小さくなるとともに、その生成量が多くなる傾向があることが分かった。特に、水性液体として蒸留水を用いた実施例４では、そのバブルの平均径が１００ｎｍ程度であり、また、バブル含有液中に生成されるバブルの含有量が２７×１０６個／ｍｌ程度となった。より具体的には、実施例４では、バブル径が１００ｎｍ程度のバブルが最も多く生成された。さらに、実施例４では、１００ｎｍをピーク中心として、０～２００ｎｍ程度のバブル径を有するバブルが生成された。
　また、水性液体として、ソルデム３A輸液を用いた実施例７およびソルデム１輸液を用いた実施例８では、実施例４に比べて、生成されるバブルの数が少なかったが、実施例４と類似した形状のバブル径分布が得られた。
　一方、水性液体として、２０ｗ／ｖ％のグルコース水溶液を用いた実施例１１では、２００ｎｍ程度のバブル径を有するバブルが最も多く生成された。また、実施例１１で得られたバブルは、そのバブル径分布が広く、１００～４００ｎｍ程度のバブル径を有していた。さらに、水性液体として、０．２５％アルブミンを用いた実施例１０では、１００～５００ｎｍ程度のバブル径を有するバブルが均等に生成された。
　また、実施例４～１１のバブル含有液は、いずれも、５００ｎｍよりも大きいサイズのバブルがほとんど存在しなかった。そのため、このようなバブル含有液を超音波造影剤として用いることにより、解像度が高く、高精細な画像を得ることができる。
　次に、ガス３の種類と、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量との関係を調べた。
　（実施例１２）
　前記実施例４において、蒸留水を生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％ＮａＣｌ水溶液）に変更して、［準備工程］および［水性液体を容器に注入する工程］を行った。次に、バイアル瓶内に充填するガスとして、空気を用いて［容器を密閉する工程］を行った後、前記第１実施形態と同様に、［容器を振動させる工程］および［容器を静置させる工程］を行うことにより、バブル含有容器を得た。
　（実施例１３）
　空気をエチレン（Ｃ２Ｈ４）に変更した以外は、前記実施例１２と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例１４）
　水素をエチレン（Ｃ２Ｈ４）に変更した以外は、前記実施例１３と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例１５）
　水素をエタン（Ｃ２Ｈ６）に変更した以外は、前記実施例１３と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例１６）
　水素をメタン（ＣＨ４）に変更した以外は、前記実施例１３と同様にして、バブル含有容器を得た。
　（実施例１７）
　水素を亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）に変更した以外は、前記実施例１３と同様にして、バブル含有容器を得た。
（バブル径分布測定）
　上記のようにして得られた実施例１２～実施例１７のバブル含有液に対して、前記第１実施形態と同様にして、バブル径分布測定を行った。その結果を、図２６に示す。
　図２６は、実施例１２～１７で得られたバブルのバブル径分布を示すグラフである。
　図２６に示すように、バイアル瓶内に封入するガスの種類を変更することにより、バブルの生成量が変化した。バイアル瓶内に封入されるガスがエチレンである場合（実施例１２）、封入されるガスとして空気を用いる場合（実施例１４）に比べて、バブル生成量が２倍程度多くなった。また、特に、ガスとして水素やエタンを用いた実施例１３および１５では、バブル生成量が多くなることが分かった。
　次に、図１７に示す製造容器２０を用いて生成されるバブル１の径および含有量を調べた。
　（実施例１８）
（バブルの製造方法）
　［準備工程］
　まず、前述した第１実施形態と同様に、１２０μｌのアルブミン溶液（ＣＳＬ　Ｂｅｈｒｉｎｇ社製　アルブミナー２５％）と、１２ｍｌの２５％リン酸緩衝生理食塩水とを準備した。また、図１７に示す製造容器２０（上部本体部の長さ：２３．８２ｍｍ、上部本体部の内径：１０．２６ｍｍ、下部本体部の長さ２０ｍｍ、下部本体部の内径：５．９ｍｍ）を準備した。
　［水性液体を容器に注入する工程］
　準備した製造容器内に、アルブミン溶液と、２５％リン酸緩衝生理食塩水とを全量注入した。なお、アルブミン溶液および２５％リン酸緩衝生理食塩水を混合してなる水性液体の液面の高さは、製造容器２０の底面から２５ｍｍであった。
　［容器を密閉する工程］
　次に、水性液体が注入された製造容器２０の瓶口（開口部）に図１７に示す蓋２２と同様の形状の蓋を挿着した。これにより内部の圧力が１ａｔｍの密閉容器（密閉された製造容器２０）を得た。
　［容器を振動させる工程］
　次に、上記の密閉容器を２つ準備した。一方の密閉容器（製造容器２０）にのみ、１３．５ｇの錘部５を取り付けた。これら２つの密閉容器を、ｂｅｒｔｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰｒｅｃｅｌｌｙｓを用いて、回転数６５００ｒｐｍで３０秒間振動させた。その際、密閉容器は、上下方向に往復運動し、水性液体が密閉容器の上下面に繰り返し衝突することを確認した。なお、密閉容器を振動させる際に、密閉容器の長手方向（鉛直方向）の振動幅は、４０ｍｍであり、密閉容器の短手方向（水平方向）の振動幅は、２０ｍｍであった。上記条件に設定することにより、製造容器２０と水性液体との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるようにした。
　［容器を静置させる工程］
　振動後、密閉容器を静置させ、バブル含有容器を得た。
　（実施例１９）
　前記実施例１８と同様にして、図１７に示す製造容器２０にアルブミン溶液および２５％リン酸緩衝生理食塩水からなる水性液体を注入した。
　その後、前記実施例１２と同様にして製造容器２０内に空気を充填して［容器を密閉する工程］を行った。その後、前記実施例１８と同様に、［容器を振動させる工程］および［容器を静置させる工程］を行うことにより、バブル含有容器を得た。
　（実施例２０）
　空気をパーフルオロプロパンに変更した以外は、前記実施例１９と同様にして、バブル含有容器を得た。
（バブル径分布測定）
　上記のようにして得られた実施例１８～実施例２０のバブル含有液に対して、前記第１実施形態と同様にして、バブル径分布測定を行った。また、実施例１８～２０で得られたバブル含有液を、注射器を用いてプレパラートに数滴垂らし、光学顕微鏡で観察した。その結果を、図２７および２８に示す。
　図２７（ａ－１）は、実施例１８の錘無しの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。図２７（ａ－２）は、実施例１８の錘有りの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。図２７（ｂ－１）は、実施例１９の錘無しの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。図２７（ｂ－２）は、実施例１９の錘有りの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。
　また、図２８（ａ－１）は、実施例２０の錘無しの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。図２８（ａ－２）は、実施例２０の錘有りの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。
　なお、図２７および２８に示すバブル径分布グラフの横軸は、測定されたバブルの径を示し、横軸の左側から右側へと径が大きくなる。横軸の最も左側の棒グラフが、平均径１μｍ以下のバブルの量を示している。
　図２７および２８に示すように、実施例１８～２０のいずれの実施例においても、錘を取り付けた容器を用いた場合に、バブル生成量が多くなった。特に、径の小さいバブル（径：１μｍ以下）の生成量が顕著に多くなることが分かった。また、図２７（ｂ－２）と図２８（ｃ－２）との比較から、容器内に封入するガスとしてパーフルオロプロパンを用いることにより、ガスとして空気を用いる場合よりも、より径の小さいバブルの生成量が多くなることが分かった。したがって、図１７に示すような、一部に錘が取り付けられた製造容器を用いることにより、径の小さいバブル（１μｍ以下のバブル）を効率良く製造することができることが分かった。
　本発明のバブル製造用容器を用いることにより、容器を所定の回転数で振動させるだけで、水性液体中に均一なサイズのバブルを多量に安定的に生成することができる。このようにして得られたバブルは、医療、食品、魚介類の養殖、排水処理等の様々な分野に用いることができる。したがって、本発明のバブル製造用容器は、産業上の利用可能性を有する。

Claims (14)

  1. 　バブルを製造するために用いられるバブル製造用容器であって、
    　開口部を備えた容器本体と、
    　該容器本体の前記開口部上に設けられたゴム栓とを有し、
    　前記ゴム栓は、注射針を刺通して、前記容器本体の内部の前記バブルを取り出すことができるように構成されていることを特徴とするバブル製造用容器。
  2. 　開口を有し、前記ゴム栓上に設けられ、前記容器本体を前記ゴム栓とともに密閉する締付部をさらに有し、
    　前記容器本体には、錘部が設けられている請求項１に記載のバブル製造用容器。
  3. 　前記容器本体は、前記開口部を備えた上部本体部と、該上部本体部よりも小さな内径を有し、前記錘部が取り付けられる下部本体部とで構成されている請求項２に記載のバブル製造用容器。
  4. 　前記上部本体部は、その内径が、前記下部本体部の前記内径になるように縮径した縮径部を備えている請求項３に記載のバブル製造用容器。
  5. 　前記下部本体部は、その外周面の全体にわたって形成されたネジ溝を備え、
    　前記錘部は、前記ネジ溝と螺合して、前記下部本体部を移動可能に構成されている請求項３または４に記載のバブル製造用容器。
  6. 　前記錘部は、前記容器本体の前記開口部付近に設けられ、前記締付部の前記開口に対応するように、前記注射針が挿通する貫通孔を備えている請求項２に記載のバブル製造用容器。
  7. 　前記錘部は、前記開口部を覆うように前記容器本体に取り付けられ、
    　前記ゴム栓は、前記錘部上に設けられ、前記貫通孔に対応する位置に前記注射針を刺通するためのマークを有する請求項６に記載のバブル製造用容器。
  8. 　前記ゴム栓の前記マークの位置は、前記締付部を回転することにより、前記錘部の前記貫通孔の位置からシフトするように構成されている請求項７に記載のバブル製造用容器。
  9. 　前記容器本体は、長尺状をなし、該容器本体の両端部を覆う２つの錘部を有し、
    　前記開口部は、前記容器本体の前記両端部間に形成された突出部に設けられている請求項１に記載のバブル製造用容器。
  10. 　前記容器本体は、前記両端部を外部に開放するように円筒状に形成されている請求項９に記載のバブル製造用容器。
  11. 　前記錘部は、前記容器本体を構成する材料よりも密度の高い材料で構成されている請求項２ないし１０のいずれかに記載のバブル製造用容器。
  12. 　前記容器本体の前記内部の密閉性を維持するミニナートバルブと、前記容器本体の前記内部と前記ミニナートバルブとを連通させるチューブとをさらに有する請求項１ないし１１のいずれかに記載のバブル製造用容器。
  13. 　前記ミニナートバルブは、前記注射針を挿通でき、前記チューブと連通する管路と、該管路の開閉を制御する開閉機構とを有し、
    　前記チューブは、前記ゴム栓または前記容器本体と連結する請求項１２に記載のバブル製造用容器。
  14. 　前記容器本体は、その内面の少なくとも一部が、凹面、凸面または凹凸面で形成されている請求項１ないし１３のいずれかに記載のバブル製造用容器。
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