JP6178947B2 - バブルの製造方法およびバブル - Google Patents

Description

本発明は、マイクロバブルまたはナノバブルの製造方法、およびそのマイクロバブルまたはナノバブルの製造方法で製造されたバブルに関する。特に、超音波診断および超音波治療に用いるマイクロバブルまたはナノバブルの製造方法、および、そのマイクロバブルまたはナノバブルの製造方法で製造されたバブルに関する。

近年、医療、食品、魚介類の養殖、排水処理等の様々な分野において、マイクロサイズ（数百マイクロメートル程度）、または、ナノサイズ（数百ナノメートル以下）のバブルの利用が検討されている。特に、医療分野では、マイクロバブルを超音波造影剤として用いて、胸部や腹部を超音波診断する方法が知られている。

この超音波診断方法は、超音波造影剤を静脈等から体内へ注入し、診断部位に超音波照射を行って、超音波造影剤からの反射波（反射エコー）を画像化して診断する方法である。そして、超音波造影剤としては、タンパク質や脂質等から構成された外殻と、外殻内に封入されたガスとからなる微小な気泡（マイクロバブル）が広く用いられている。

また、近年では、このマイクロバブルを用いた超音波治療方法が検討されている（例えば、特許文献１）。より具体的には、遺伝子や薬剤（薬物）を封入したマイクロバブルを体内へ注入し、これを血管を通して患部に運ぶ。そして、マイクロバブルが患部付近に到達した際に、超音波をマイクロバブルに照射して、マイクロバブルを破裂させる。そうすることにより、マイクロバブルに封入された薬物を患部に集中的に投与することができる。

このようなマイクロバブルの製造方法として、過飽和バブル発生法、気液２相流旋回法が知られている。過飽和バブル発生法は、マイクロバブルの構成材料と生理食塩水とを含む混合液中に気体を高圧下で溶解させた後、減圧することにより混合液中にマイクロバブルを生成させる方法である。また、気液２相流旋回法は、上記混合液を高速で攪拌することにより、混合液の渦流を発生させて、渦流の中に十分に気体を巻き込んだ後、この渦流を止めることにより混合液中にマイクロバブルを生成させる方法である。

上記のマイクロバブルの製造方法では、マイクロバブルを生成するために、最低でも１〜１０Ｌの混合液を用意する必要があった。また、少量の混合液（例えば、数ｍｌの混合液）で安定的にマイクロバブルを生成することが困難であった。また、生成するマイクロバブルのサイズにバラつきがあるという問題点があった。

特開２００２−２０９８９６号公報

本発明は、上記従来の問題点を鑑みたものであり、その目的は、均一なサイズのバブル（マイクロバブルまたはナノバブル）を安定的に製造することができるバブルの製造方法を提供することにある。また、別の目的は、均一なサイズのバブルを提供することにある。

このような目的は以下の（１）〜（１５）の本発明により達成される。
（１） 水性液体を、容器の所定の高さまで注入する工程と、
前記水性液体が前記容器の内面に繰り返し衝突するように、５０００ｒｐｍ以上の回転数で前記容器を振動させる工程とを有していることを特徴とするバブルの製造方法。

（２） 前記容器を振動させる工程は、前記容器内を１．０ａｔｍより大きい圧力にした状態で行われる上記（１）に記載のバブルの製造方法。

（３） 前記容器は、長尺状をなし、
前記容器を振動させる工程は、前記容器を、該容器の長手方向への往復運動または主として前記長手方向への回転運動によって振動させるように行われる上記（１）または（２）に記載のバブルの製造方法。

（４） 前記容器の高さをＸ（ｍｍ）としたとき、前記容器の長手方向の振動幅は、０．７Ｘ〜１．５Ｘ（ｍｍ）である上記（３）に記載のバブルの製造方法。

（５） 前記容器は、長尺状をなし、
前記容器を振動させる工程は、前記容器を、該容器の短手方向への往復運動または主として前記短手方向への回転運動によって振動させるように行われる上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のバブルの製造方法。

（６） 前記容器の前記水平方向の振動幅は、０．３Ｘ〜０．８Ｘ（ｍｍ）である上記（５）に記載のバブルの製造方法。

（７） 前記容器を密閉した状態において、所定のガスを前記容器に注入する工程をさらに有する上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のバブルの製造方法。

（８） 前記所定の高さは、前記溶液が注入された前記容器を水平に静置した状態において、前記容器の高さをＸ（ｍｍ）とし、前記容器における前記溶液の液面の高さをＹ（ｍｍ）としたとき、０．２≦Ｙ／Ｘ≦０．７の関係を満足する上記（１）ないし（７）のいずれかに記載のバブルの製造方法。

（９） 前記容器を振動させる工程後、前記容器内の圧力を変化させた後に、５０００ｒｐｍ以上の回転数で前記容器を再振動させる工程をさらに有する上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のバブルの製造方法。

（１０） 前記容器を再振動させる工程は、前記圧力を、前記容器を振動させる工程における前記圧力よりも１〜１０ａｔｍ高くなるように行われる上記（９）に記載のバブルの製造方法。

（１１） 前記容器を再振動させる工程は、前記容器を振動させる工程における前記回転数と異なる回転数で行われる上記（９）または（１０）に記載のバブルの製造方法。

（１２） 水性液体中に微分散しているバブルであって、
該バブルの平均径が、１０ｎｍ〜１００μｍであることを特徴とするバブル。

（１３） 前記水性液体は、水、糖類、塩類、薬物および前記バブルの外殻を構成する外殻材料からなる群から選択される少なくとも１つを含む上記（１２）に記載のバブル。

（１４） 前記外殻は、両親媒性材料の分子の単層で構成されるミセル、または前記両親媒性材料の分子の二重層で構成されるリポソームで構成されている上記（１３）に記載のバブル。

（１５） 当該バブルは、亜酸化窒素、酸素、水素、ヘリウム、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、エチレン、プロピレン、プロパジエン、ブテン、アセチレン、プロピン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタンからなる群から選択される少なくとも１種を含む上記（１２）ないし（１４）のいずれかに記載のバブル。

本発明によれば、容器を所定の回転数で振動させるだけで、水性液体中に均一なサイズのバブルを多量に安定的に生成することができる。その結果、均一なサイズのバブルを多量に含有する容器を提供することができる。

図１は、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブルの一例を説明するための図である。 図２は、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブルの一例について、その一部を切断した状態を示す斜視図である。図１（ａ）は、外殻内にガスが封入されたバブルの一部を切断した状態を示しており、図１（ｂ）および図１（ｃ）は、外殻内にガスおよび薬物が封入されたバブルの一部を切断した状態を示す。 図３は、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態を説明するためのフローチャートである。 図４は、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態を説明するための断面図である。 図５は、図４（ｃ）に示す容器を振動させる工程において、水性液体と容器の内面（上面）とが激しく衝突した状態を説明するための部分拡大図である。 図６は、本発明のバブルの製造方法の第２実施形態を説明するためのフローチャートである。 図７は、本発明のバブルの製造方法の第２実施形態を説明するための断面図である。 図８は、本発明のバブルの製造方法の第５実施形態を説明するためのフローチャートである。 図９は、本発明のバブルの製造方法の第６実施形態に用いられる製造容器の蓋付近を示す部分断面図である。 図１０は、本発明のバブルの製造方法の第７実施形態に用いられる容器を模式的に示す断面図である。 図１１は、本発明のバブルの製造方法の第８実施形態を説明するための斜視図である。 図１２は、図１１（ａ）に示すミニナートバルブのゴム栓付近の構成（ハンドルは省略）を説明するための図である。図１２（ａ）は、ミニナートバルブのゴム栓付近の上面図であり、図１２（ｂ）は、図１２（ａ）のＸ−Ｘ線断面図である。 図１３は、図１１（ｃ）に示すバブル含有容器の断面図である。 図１４は、本発明のバブルの製造方法の第９実施形態に用いられる製造容器を説明するための斜視図である。 図１５は、本発明のバブルの製造方法の第１０実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。 図１６は、本発明のバブルの製造方法の第１１実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。図１６（ａ）は、分解した状態の製造容器を示しており、図１６（ｂ）は、組立てた状態の製造容器を示している。 図１７は、本発明のバブルの製造方法の第１２実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。 図１８は、本発明のバブルの製造方法の第１３実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。図１８（ａ）は、分解した状態の製造容器を示しており、図１８（ｂ）は、組立てた状態の製造容器を示している。 図１９は、図１８（ｂ）に示す製造容器の蓋に形成される開口部の位置を説明するための図である。図１９（ａ）は、注射器の注射針をゴム栓に刺通する前の状態を説明するための図であり、図１９（ｂ）は、注射針をゴム栓から抜いた後に締付部を底板部に締め付けた状態を説明するための図である。 図２０（ａ）は、５０００ｒｐｍおよび６５００ｒｐｍの回転数でバブルを製造した時のバブルのバブル径分布を示すグラフである。図２０（ｂ）は、図２０（ａ）に示すグラフにおいて、横軸が０〜７００ｎｍの範囲である部分拡大図である。 図２１（ａ）は、密閉バイアル瓶の回転数とバブルの平均径との関係を示すグラフである。図２１（ｂ）は、密閉バイアル瓶の回転数とバブルの含有量との関係を示すグラフである。 図２２（ａ）は、密閉バイアル瓶内に封入されるガスの容量とバブルの平均径との関係を示すグラフである。図２２（ｂ）は、密閉バイアル瓶内に封入されるガスの容量とバブルの含有量との関係を示すグラフである。 図２３は、３７℃において４８時間培養させた脳血管周皮細胞培地の蛍光顕微鏡画像である。図２３（ａ）は、照射強度：０．６Ｗ／ｃｍ^２で超音波照射したサンプルの画像であり、図２３（ｂ）は、照射強度：０．８Ｗ／ｃｍ^２で超音波照射したサンプルの画像である。 図２４は、３７℃において４８時間培養させた脳血管周皮細胞培地の蛍光顕微鏡画像である。図２４（ａ）は、照射強度：０．９Ｗ／ｃｍ^２で超音波照射したサンプルの画像であり、図２４（ｂ）は、照射強度：１．０Ｗ／ｃｍ^２で超音波照射したサンプルの画像である。 図２５は、実施例４〜１１で得られたバブルのバブル径分布を示すグラフである。 図２６は、実施例１２〜１７で得られたバブルのバブル径分布を示すグラフである。 図２７は、実施例１８および１９で得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。 図２８は、実施例２０で得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。

以下、本発明のバブル、バブルの製造方法およびバブル製造用容器を添付図面に示す好適な実施形態に基づいて説明する。

１．バブル
まず、本発明のバブルの製造方法およびバブル製造用容器の説明に先立って、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブル（本発明のバブル）について説明する。

図１は、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブルの一例を説明するための図である。図２は、本発明のバブルの製造方法により製造されるバブルの一例について、その一部を切断した状態を示す斜視図である。なお、図２（ａ）は、外殻内にガスが封入されたバブルの一部を切断した状態を示しており、図２（ｂ）および図２（ｃ）は、外殻内にガスおよび薬物が封入されたバブルの一部を切断した状態を示す。

＜第１構成例＞
まず、図１に示すバブル１について説明する。
図１に示すバブル１（気泡）は、水性液体１０中にガス３が微分散することにより形成される。このバブル１は、後述する本発明のバブルの製造方法の第１および第２実施形態により製造することができる。このようなバブル１は、医療、食品、魚介類の養殖、排水処理等の様々な分野に用いることができる。本実施形態では、バブル１を超音波診断における超音波造影剤として用いる場合について説明する。

かかる構成のバブル１は、水性液体１０として、水性媒体を用いて形成される。水性媒体としては、例えば、蒸留水、純水、超純水、イオン交換水、ＲＯ水等の水、Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）等の生理食塩水（０．９％程度の食塩水）、グルコース、スクロース等の各種糖類と蒸留水とを混合した糖水溶液等が挙げられる。これらは、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

ガス３は、バブル１を製造する際の温度（２０℃程度）において、気体状の物質である。また、ガス３は、バブル１を体内に注入した状態において、すなわち、体内の温度（３７℃程度）においても、気体状の物質である。

ガス３としては、特に限定されないが、例えば、空気、窒素、亜酸化窒素、酸素、二酸化炭素、水素、ヘリウム、アルゴン、キセノン、クリプトンのような不活性ガス、六フッ化硫黄、十フッ化二硫黄、トリフルオロメチル硫黄ペンタフルオリドのようなフッ化硫黄、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、エチレン、プロピレン、プロパジエン、ブテン、アセチレン、プロピン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタンのような低分子量炭化水素類またはこれらのハロゲン化物、ジメチルエーテルのようなエーテル類、ケトン類、エステル類等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの物質の中でも、特に、六フッ化硫黄、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタンが好ましい。これらのガスが封入されたバブル１は、体内において安定性が高く、血管を通して患部（治療対象部位）または診断対象部位までより確実に運搬される。

このような成分で構成されたバブル１の径は、本発明のバブルの製造方法の各工程の条件を変更することにより変化する。すなわち、製造されるバブル１は、ミクロンサイズ（数百マイクロメートル程度）、または、ナノサイズ（数百ナノメートル程度）を有することとなる。

具体的に、バブル１の平均径は、特に限定されないが、１０ｎｍ〜１０００μｍ程度であるのが好ましく、１０ｎｍ〜１００μｍ程度であるのがより好ましく、５０〜２０００ｎｍ程度であるのがさらに好ましい。バブル１の平均径が上記範囲内であれば、バブル１を静脈注射により体内に注入した際に、バブル１の径が十分に小さいため、血流によりバブル１が血管内を滑らかに移動することができる。また、このような径のバブルは、血管内での安定性が高く、血管内を移動している間に消滅することなく、目的の部位まで確実に運ばれる。特に、ナノバブルは、血管内での安定性が高いため、ほぼ消滅することなく、目的の部位まで確実に搬送される。

一般的に、気体を内包するバブルは、液体と気体との界面において効率良く超音波を反射する性質を有している。そのため、上記範囲の平均径を有するバブル１は、液体（水性液体１０、または、超音波造影剤として体内に注入された際には、血液）とガス３との界面の面積が十分に大きく、超音波造影剤として有効に用いられる。

また、上述したような構成のバブル１は、食品、魚介類の養殖、排水処理等の医療分野以外の分野にも用いることができる。特に、上記範囲の平均径を有するバブル１は、その安定性を十分に高くすることができ、取扱いが容易なため、様々な分野に適用することができる。

＜第２構成例＞
次に、図２（ａ）に示すバブル１について説明する。
なお、前記第１構成例のバブルとの相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
図２（ａ）に示すバブル１（気泡）は、後述する本発明のバブルの製造方法の第３および第５〜第１３実施形態により製造することができる。図２（ａ）のバブル１は、バブル１の殻を構成する外殻２（球状の膜）と、外殻２内に封入されたガス３とを有している。このようなバブル１は、医療、食品、魚介類の養殖、排水処理等の様々な分野に用いることができる。本実施形態では、バブル１を超音波診断における超音波造影剤として用いる場合について説明する。以下、バブル１を構成する各成分を説明する。

外殻２は、その内側に封入されるガス３をバブル１内に保持する機能を有している。
このような外殻２は、主として１つの分子中に疎水性と親水性との両方の性質（置換基）を有する両親媒性材料（外殻材料）から構成されている。両親媒性材料としては、特に限定されないが、例えば、アルブミンのようなタンパク質、ポリカチオン性脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチダルエタノールアミンのようなリン脂質、パルミチン酸、ステアリン酸のような高級脂肪酸、ガラクトースのような糖類、コレステロール、シトステロールのようなステロール類、界面活性剤、天然または合成高分子、蛍光色素、抗体、標識金属等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

なお、図２には示されていないが、外殻２を構成する両親媒性材料は、水性媒体中において、疎水基が内側に、親水基が外側になるようにして球状に配置される。この性質により、外殻２は、両親媒性材料の分子の単層で構成されるミセルや、両親媒性材料の分子の二重層で構成されるリポソーム（球状の分子膜）となる。

このような成分で構成されたバブル１の径は、図１に示すバブル１と同様である。

一般的に、外殻内に気体を内包するバブルは、外殻と気体との界面において効率良く超音波を反射する性質を有している。そのため、上述した範囲の平均径を有するバブル１は、外殻２とガス３との界面の面積が十分に大きく、超音波造影剤として有効に用いられる。

＜第３構成例＞
次に、図２（ｂ）および図２（ｃ）に示すバブル１について説明する。
なお、前記第１および第２構成例のバブルとの相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
図２（ｂ）および図２（ｃ）に示すバブル１は、後述する本発明のバブルの製造方法の第４〜第１３実施形態により製造することができる。このようなバブル１は、バブル１の殻を構成する外殻２と、外殻２内に封入されるガス３および薬物４を有している。このバブル１は、超音波治療および超音波診断に用いられる。なお、図２（ｂ）では、薬物４が気体状態あるいは固体状態で外殻２内に封入されているバブル１を示しており、図２（ｃ）では、薬物４が液体状態で外殻２内に封入されているバブル１を示している。

外殻２は、その内側に封入されるガス３や薬物４をバブル１内に保持する機能を有し、バブル１が患部に運ばれるまで薬物４を保護する機能を有している。

また、図２（ｂ）および図２（ｃ）に示すバブル１において、薬物４は、前立腺癌、子宮筋腫、心筋梗塞、脳梗塞等の様々な疾病の治療に有効な成分である。薬物４は、バブル１に包含された状態で患部に運搬され、超音波照射により患部付近で外殻２を破裂させることにより、患部に投与される。なお、図示しないが、薬物４は、外殻２自体に含有されてもよいし、外殻２の外表面に吸着されていてもよい。

薬物４としては、疾病の治療に有効であれば特に限定されないが、遺伝子、薬剤等を含む。具体的には、ペプチド、抗体、オリゴ糖、多糖、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、トリプルヘリックス分子、ウイルスベクター、プラスミド、低分子有機化合物、抗癌剤、金属等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

薬物４とガス３との体積比率は、１：９９〜９０：１０程度であるのが好ましく、１０：９０〜７０：３０程度であるのがより好ましく、４０：６０〜６０：４０程度であるのがさらに好ましい。薬物４とガス３との体積比率が上記範囲内であれば、バブル１の安定性が向上し、患部付近までより確実にバブル１を運搬することができる。また、患部付近で外殻２を破裂させた際に、患部に対して、十分な量の薬物を投与することができる。そのため、患部をより効率良く治療することができる。

このような成分で構成されたバブル１の径は、図２（ａ）に示すバブル１と同様に、本発明のバブルの製造方法の各工程の条件を変更することにより変化する。

ここで、癌細胞が存在する患部では、その周囲の血管から癌細胞へと、正常血管よりも細径の新生血管が伸びている。平均径が２００〜３００ｎｍ程度のバブル１であれば、バブル１が、新生血管内にも円滑に搬送され、癌細胞にまで到達することができる。すなわち、かかるバブル１は、癌治療に好適に用いられることができる。また、一部のバブル１を、血管壁を通過させて、癌細胞に取り込ませることもできる。
また、バブル１の平均径が６００〜９００ｎｍ程度のバブル１は、脳の血管内を円滑搬送されるとともに、その位置を超音波画像において確実に特定することができる。そのため、脳治療（例えば、脳血管内治療等）に好適に用いることができる。

なお、図１および図２（ａ）〜（ｃ）に示すバブル１の平均径は、例えば、レーザー回折・散乱法、ナノ粒子トラッキング解析法、電気抵抗法、ＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、レーザー顕微鏡による観測等により測定することができる。また、ＡＦＭを測定する装置としては、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ社製の共振式粒子計測システム（商品名：アルキメデス）を用いることができる。

上述したようなバブル１は、以下に記載する本発明のバブルの製造方法により製造することができる。以下、本発明のバブルの製造方法について、詳細に説明する。

２．バブルの製造方法
＜第１実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態について説明する。前述した図１に示すバブル１は、本実施形態のバブルの製造方法により、製造することができる。

図３は、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態を説明するためのフローチャートであり、図４（ａ）〜（ｄ）は、本発明のバブルの製造方法の第１実施形態を説明するための製造容器の断面図であり、図５は、図４（ｃ）に示す容器を振動させる工程において、水性液体と容器の内面（上面）とが激しく衝突した状態を説明するための部分拡大図である。

なお、以下の説明では、図４（ａ）〜（ｄ）および図５中の上側を「上」と言い、図４（ａ）〜（ｄ）および図５中の下側を「下」と言う。

本実施形態のバブルの製造方法は、図３に示すように、工程（Ｓ１）〜（Ｓ５）の５つの工程を有する。工程（Ｓ１）は、水性液体、および水性液体が注入されるバブル製造用容器（以下、単に「製造容器」という）を準備する工程である。工程（Ｓ２）は、この水性液体を製造容器の所定の高さまで注入する工程である。工程（Ｓ３）は、製造容器内にガスを充填させた状態で製造容器を密閉する工程である。工程（Ｓ４）は、水性液体が容器の内面に繰り返し衝突するように、所定の回転数で製造容器を振動させる工程である。工程（Ｓ５）は、製造容器を静置する工程である。以下、これらの工程について順次説明する。

［Ｓ１］ 準備工程
まず、水性液体１０を準備する。
本実施形態のバブルの製造方法では、水性液体１０として、前述した水性媒体が使用される。

本発明者は、水性液体１０中の水の濃度が高くなるほど、生成されるバブル１の径が小さくなるとともに、その生成量が多くなることを見出した。したがって、水性液体１０として、水（蒸留水）を用いた場合に、より小さい径のバブル１をより多量に生成することができる。
また、水性液体１０として、糖水溶液を用いた場合には、糖水溶液中の糖濃度が低くなるほど、すなわち、水の濃度が高くなるほど、生成されるバブル１の径が小さくなるとともに、その生成量が増加する。したがって、水性媒体の種類および工程（Ｓ４）の条件を適宜設定することにより、所望の径のバブル１を容易に得ることができる。

なお、上述した糖水溶液中の糖濃度は、特に限定されないが、０．０１〜６０ｗｔ％程度であるのが好ましく、０．１〜５０ｗｔ％程度であるのがより好ましく、５〜３０ｗｔ％程度であるのがさらに好ましい。上記範囲の糖濃度の糖水溶液を用いることにより、後述する工程（Ｓ４）において、水性液体１０中に生成されるバブル１の安定性が高くなる。そのため、バブル１が不本意に破裂するのをより確実に防止して、バブル１の経時安定性が向上する。

次に、製造容器２０（バブル製造用容器の第１実施形態）を準備する。
製造容器２０は、開口部を備え、水性液体１０を収容する容器本体２１と、容器本体２１を密閉するための蓋２２とを有している。

容器本体２１は、特に限定されないが、図４（ａ）に示すような外形が有底円筒状をなしていることが好ましい。本実施形態では、容器本体２１として、容量が０．５〜２０ｍｌ程度のバイアル瓶を用いる。本発明のバブルの製造方法では、容器本体２１として、このような容量の小さなバイアル瓶を用いた場合であっても、容器本体２１を蓋２２で密閉した際に、容器本体２１内の密閉空間で適切な圧力が水性液体１０に付与されるので、均一なサイズのバブル１を安定的に得ることができる。特に、容量が０．５〜１．５ｍｌ程度のバイアル瓶であれば、１つの製造容器２０内に、１回の超音波診断に必要となる０．３〜０．６ｍｌ程度のバブル含有液を製造することができる。この場合、超音波診断の際に、１つの製造容器２０内のバブル含有液を使い切ることができるため、製造されるバブル含有液の無駄をなくすことができる。

このように容量の小さいバイアル瓶（容量：０．５〜２０ｍｌ程度）の寸法は、長手方向の長さＸが、３５〜６０ｍｍ程度であり、外径Ｒが、１０〜４０ｍｍ程度である。

蓋２２は、図４（ｂ）〜（ｄ）に示すように、容器本体２１の瓶口に密着する円盤状のゴム栓（セプタム）２２１と、ゴム栓２２１を容器本体２１の瓶口に固定する締付部２２２とを備えている。

ゴム栓２２１は、特に限定されないが、例えば、シリコン製のゴム栓を用いることができる。

締付部２２２は、ゴム栓２２１の縁部を覆うように構成されており、その平面視略中央に開口を有している。また、締付部２２２の瓶口側の内周面および容器本体２１の瓶口側の外周面には、互いに螺合可能に形成されるネジ溝が、それぞれ形成されており（図示せず）、これらを螺合させることにより、ゴム栓２２１が容器本体２１の瓶口と密着した状態で固定される。また、締付部２２２を容器本体２１の瓶口にかしめることで、ゴム栓２２１が容器本体２１の瓶口と密着した状態で、容器本体２１と締付部２２２とを固定することもできる。

［Ｓ２］水性液体を製造容器に注入する工程
調製された水性液体１０を容器本体２１（製造容器２０）の所定の高さまで注入する。本実施形態では、図４（ａ）に示すように、Ｙ［ｍｍ］まで注入する。したがって、図４（ａ）に示すように、水性液体１０が注入された状態の容器本体２１は、その上部に空隙部１１を有する。

本実施形態では、水性液体１０が注入された容器本体２１（製造容器２０）を水平に静置した状態において、容器本体２１の高さ（長手方向の長さ）をＸ［ｍｍ］とし、容器本体２１における水性液体１０の液面の高さをＹ［ｍｍ］としたとき、０．２≦Ｙ／Ｘ≦０．７の関係を満足するのが好ましい。上記関係を満足することにより、十分な大きさの空隙部１１が存在するので、工程（Ｓ４）において、水性液体１０を製造容器２０の上下面および側面（特に、上下面）により勢いよく衝突させることができる。この衝突により、水性液体１０中に衝撃波が生じ、水性液体１０中にバブル１を容易に形成することができる。

なお、前記関係は、０．３≦Ｙ／Ｘ≦０．５の関係を満足するのがより好ましく、０．３５≦Ｙ／Ｘ≦０．４の関係を満足するのがさらに好ましい。これにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０中にバブルをより容易に形成することができる。

［Ｓ３］製造容器を密閉する工程
次に、容器本体２１にガス３を充填させた状態で密閉する（図４（ｂ）参照）。具体的には、水性液体１０が注入された容器本体２１の空隙部１１を、ガス３でパージした後、蓋２２を容器本体２１の開口部（瓶口）に締付ける。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。

容器本体２１の空隙部１１をガス３でパージする方法としては、例えば、水性液体１０が注入された容器本体２１をチャンバー内に移動させる。次に、チャンバー内の空気をガス３で置換する。その後、蓋２２を容器本体２１の開口部に締付けることにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とを密閉することができる。
ガス３としては、前述した各種ガスが使用される。

［Ｓ４］製造容器を振動させる工程
次に、水性液体１０が、製造容器２０の上下面および側面（特に、上下面）に繰り返し衝突するように、製造容器２０を振動させる。本実施形態では、図４（ｃ）に示すように、製造容器２０が、略その長手方向（図４（ｃ）では、鉛直方向）に往復運動するように、製造容器２０を振動させる。

本工程では、工程（Ｓ３）で密閉した製造容器２０（図４（ｃ）の下図）を上方向に振動させる（図４（ｃ）の真中の図）。これにより、水性液体１０は、製造容器２０の中間付近に移動する。更に製造容器２０を上方向に振動させると、水性液体１０が製造容器２０の上部に移動して、蓋２２の下面（ゴム栓２２１）に衝突する（図４（ｃ）の上図）。この際に、図５に示すように、衝撃波が発生する。この衝撃波の圧力により、ガス３が水性液体１０中に微分散し、バブル１が形成する。このバブル１内には、振動により水性液体１０に微分散または溶解したガス３が含まれる。

一方、製造容器２０（図４（ｃ）の上図）を下方向に振動させる（図４（ｃ）の真中の図）。これにより、水性液体１０は、製造容器２０の中間付近に移動する。更に製造容器２０を下方向に振動させると、水性液体１０が製造容器２０の下部に移動して、製造容器２０の下面に衝突する（図４（ｃ）の下図）。この時も、図５に示すように、衝撃波が発生する。

また、製造容器２０を鉛直方向に振動させる際に、水性液体１０は、製造容器２０の内側の側面とも衝突する。この時も、図５に示すように、衝撃波が発生する。

以上の操作を繰り返し行うことによって、水性液体１０中に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に生成させることができる。

本発明のバブルの製造方法では、十分に微細で、均一なサイズのバブル１を得るために、製造容器２０を５０００ｒｐｍ以上で振動させる。これにより、水性液体１０と製造容器２０とが衝突する際に発生する衝撃波の大きさ（圧力）が十分に大きくなり、水性液体１０中に生じるバブル１が微細化され、そのサイズを均一にすることができる。また、製造容器２０の回転数を上記範囲内で低めに設定した場合には、発生する衝撃波の大きさが小さくなるので、比較的径の大きなバブル１を生成することができる。また、回転数を高めに設定した場合には、発生する衝撃波の大きさが大きくなるので、比較的径の小さいバブル１を生成することができる。なお、本明細書において、製造容器２０の「回転数」とは、単位時間当たりに、製造容器２０がその全振動経路を移動する回数を意味する。例えば、製造容器２０が５０００ｒｐｍで振動するとは、製造容器２０が、１分間に全振動経路を５０００回移動（振動）することを意味する。

また、製造容器２０の回転数は、５５００ｒｐｍ以上であることがより好ましく、６０００〜２００００ｒｐｍであることがさらに好ましい。製造容器２０の回転数を上記範囲内とすることにより、振動により生成したバブル１同士が、衝突により崩壊したり、合体して粗大化するのをより確実に防止することができる。これにより、バブル１の径を微細化しつつ、より均一なサイズのバブル１を多量に水性液体１０中に生成させることができる。

上記のような回転数で製造容器２０を振動させることができる装置としては、例えば、ビーズ方式の高速細胞破砕システム（ホモジナイザー）を用いることができる。具体例としては、バーティンテクノロジーズ（ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製のプレセリーズ（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ）等を用いることができる。

また、水性液体１０と製造容器２０とが衝突する際に発生する衝撃波の圧力は、４０ｋＰａ〜１ＧＰａとなることが好ましい。水性液体１０と製造容器２０との衝突時に発生する衝撃波の圧力が上記範囲内となることにより、水性液体１０中に生じるバブル１をより微細化し、そのサイズをより均一にすることができる。特に、水性液体１０と製造容器２０との衝突時に発生する衝撃波の圧力が大きくなるほど、より微細なバブル１を生成することができる。

製造容器２０を振動させる際に、製造容器２０の長手方向の振動幅は、０．７Ｘ〜１．５Ｘ［ｍｍ］程度であるのが好ましく、０．８Ｘ〜１Ｘ［ｍｍ］程度であるのがより好ましい。これにより、製造容器２０の振動時に、水性液体１０と製造容器２０の下面および蓋２２とを確実に衝突させることができ、水性液体１０と製造容器２０の下面および蓋２２との衝突回数を十分に多くすることができる。また、このように十分な振動幅で製造容器２０を振動させることにより、水性液体１０が製造容器２０内を移動する速度が大きくなる。そのため、水性液体１０と製造容器２０の下面および蓋２２との衝突時に発生する衝撃波の大きさが十分に大きくなる。結果として、水性液体１０中に微細なバブル１を多量に生成させることができる。

また、製造容器２０を鉛直方向に往復運動させる際に、製造容器２０は、その短手方向（水平方向）にも振動させるのが好ましい。これにより、製造容器２０の内側の側面にも水性液体１０が衝突するので、水性液体１０に衝撃波をより多く発生させることができる。製造容器２０の短手方向への振動幅は、０．３Ｘ〜０．８Ｘ［ｍｍ］程度であるのが好ましく、０．５Ｘ〜０．７Ｘ［ｍｍ］程度であるのがより好ましい。これにより、上述した効果はより顕著となる。
なお、製造容器２０を振動させる方向は、その短手方向のみであってもよい。この場合、製造容器２０の短手方向（水平方向）への振動幅は、上述した短手方向への振動幅と同じであることが好ましい。かかる振動幅であれば、製造容器２０の内側の側面に水性液体１０が確実に衝突するので、水性液体１０に衝撃波をより多く発生させることができる。その結果、水性液体１０中に微細なバブル１を多量に生成させることができる。

また、本工程では、水性液体１０を製造容器２０の上下面および側面に衝突させる際における製造容器２０と製造容器２０内の水性液体１０との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるように製造容器２０を振動させることが好ましい。また、かかる瞬間相対速度が５０ｋｍ／ｈ以上となるように製造容器２０を振動させることがより好ましい。上記条件を満足することにより、水性液体１０と製造容器２０とが衝突する際に生じる衝撃波の圧力を十分に大きくすることができる。その結果、水性液体１０中に生じるバブル１をより微細化し、そのサイズをより均一にすることができる。

なお、製造容器２０を上記条件で振動させる時間は、１０〜１２０秒程度であるのが好ましく、３０〜６０秒程度であるのがより好ましい。製造容器２０の振動時間を上記範囲内とすることにより、水性液体１０が製造容器２０と衝突する回数が十分に多くなるため、水性液体１０中に、多量のバブル１を生成させることができる。なお、製造容器２０の振動時間を上記範囲内で長く設定することにより、水性液体１０中に生成されるバブル１の量をより多くすることができる。

なお、水性液体１０中に生成されるバブル１の平均径は、製造容器２０の回転数を前述した範囲内で変更することにより調整することができる。本実施形態では、水性液体１０として、上述したような水性媒体を用いることにより、おおよそ数十〜数百ナノメーターサイズのナノバブルを安定的に生成させることができる。

なお、本実施形態では、製造容器２０が、ほぼその長手方向に往復運動するように、製造容器２０を振動させているが、製造容器２０を振動させる方法は、これに限定されない。例えば、製造容器２０が、主として、その短手方向および／または長手方向に回転運動するように、製造容器２０を振動させてもよい。この場合であっても、製造容器２０内の水性液体１０は、製造容器２０の上下面および側面に繰り返し衝突することにより、衝撃波が発生する。このような振動方法を用いても、水性液体１０中に、均一なサイズのバブル１を多量に安定的に生成することができる。

［Ｓ５］製造容器を静置する工程
上記条件で製造容器２０を振動させた後、製造容器２０を静置する（図４（ｄ）参照）。これにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１（図１参照）を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０が得られる。

なお、上述した工程（Ｓ２）と、工程（Ｓ３）と、工程（Ｓ４）とは、水性液体１０の温度を一定に維持するようにして行われるのが好ましい。これにより、バブルの製造過程で水性液体１０の特性（粘性等）が安定するため、水性液体１０中に均一な径のバブル１を安定的に生成させることができる。水性液体１０の温度を一定に維持するための方法としては、例えば、上述した各工程（Ｓ２）〜（Ｓ４）をグローブボックスや恒温槽内で行う方法が挙げられる。特に、本実施形態では、工程（Ｓ４）において、製造容器２０を高速で振動させるため、水性液体１０と製造容器２０の内面との衝突により製造容器２０が発熱し易い。しかし、恒温槽内で製造容器２０を振動させることにより、水性液体１０の温度が上昇するのを確実に防止することができる。その結果、水性液体１０中に均一な径のバブル１をより安定的に生成させることができる。

以上の工程（Ｓ１）〜（Ｓ５）を経て、平均径が１０ｎｍ〜１０００μｍ程度のバブル１が製造される。なお、水性液体１０として、上述したような水性媒体を用いる本実施形態では、平均径が小さいバブル１を生成し易い。特に、本実施形態では、平均径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍのバブル１を安定的に多量に生成することができる。

なお、従来のバブルの製造方法では、大掛かりな還流装置や、バブルの製造装置を構成する様々なシステム（チューブ、ノズル、コンプレッサ等）が必要であった。そのため、食品分野や医療分野等に用いられるバブルを製造する際に、清潔で、かつ無菌環境を維持するのが困難であった。これに対して、本発明では、バブル１の製造に気密性の高い製造容器２０を用いるため、水性液体１０およびガス３を製造容器２０内に含有した状態で、例えば、γ線滅菌等による滅菌処理を製造容器２０に施せばよい。これにより、製造容器２０内が滅菌されるため、バブル１を滅菌環境下で製造することができる。したがって、このように製造されたバブル１は、食品分野や医療分野等に好適に用いることができる。

なお、上記のようにして得られたバブル１は、水性液体１０中に安定的に存在することができる。そのため、得られたバブル含有液を含む製造容器２０（以下、単に「バブル含有容器」という）は、室温にて長期保存することができる。具体的には、６〜２４か月間もの期間にわたって保存することができる。また、これだけ長期間保存した後でも、水性液体１０中でのバブル１の安定性が高いため、再度バブル含有容器を振動させたりする必要なく、使用することが可能である。また、製造容器として、容量が小さい製造容器２０を用いることができるので、バブル含有容器の単価を抑えることができる。そのため、上記のようにして得られたバブル含有容器は、医療機関等にとっては、取扱い易いというメリットがある。

［Ｓ６］遠心分離処理工程
本実施形態のバブルの製造方法は、工程（Ｓ５）後に、バブル含有容器に対して、遠心分離処理を行ってもよい。この処理により、製造容器２０内に生成されたバブル１を、所望の径別に分離することができる。
具体的には、バブル含有容器に対して遠心分離処理を行うことにより、径の大きいバブル１が製造容器２０の上層へ移動する傾向があり、径の小さいバブル１が製造容器２０の下層へ移動する傾向がある。したがって、製造容器２０の上層の液体（上澄み液）を吸引手段（注射器、ピペット等）により除去すれば、製造容器２０内に残存するバブル含有液中のバブル１の平均径は、工程（Ｓ５）後に得られたバブル含有液中のバブル１の平均径よりも小さくなる。また、吸引手段により吸引したバブル含有液（上澄み液）中のバブル１の平均径は、工程（Ｓ５）後に得られたバブル含有液中のバブル１の平均径よりも大きくなる。このように、遠心分離処理を用いることにより、より単分散なバブル径分布を有するバブル１を得ることができる。
また、水性液体１０と比重の異なる物質をバブル含有液に加えて、遠心分離処理することにより、径の大きいバブル１がより上層へと移動し易くなり、径の小さいバブル１がより下層へと移動し易くなる、その結果、より単分散なバブル径分布を有するバブル１を得ることができる。

工程（Ｓ１）〜（Ｓ５）を経て、例えば、平均径が６００ｎｍのバブル１を含有するバブル含有液を経た場合、遠心分離の条件を適宜設定することにより、平均径が２００〜３００ｎｍのバブル１を含有するバブル含有液を得ることができる。このバブル含有液を超音波造影剤として用いた場合には、比較的径が大きいバブル１が存在しないため、解像度が高く、より高精細な画像を得ることができる。

遠心分離処理の条件は、分離するバブル１の平均径によって適宜設定され、例えば、バブル含有液に１×ｇ〜２２０００×ｇ程度の遠心加速度が３０秒〜２４時間程度かかるようにする。遠心加速度を小さく設定（１×ｇ〜１００×ｇ程度）する場合には、長時間（１２時間〜２４時間程度）にわたって処理することにより、より単分散なバブル径分布を有するバブル１を得ることができる。また、遠心加速度を大きく設定（１００×ｇ〜２２０００×ｇ）する場合には、比較的短時間（３０秒〜１２時間程度）の処理により、より単分散なバブル径分布を有するバブル１を得ることができる。遠心分離処理を上記条件で行うことにより、所望の平均径を有するバブル１を効率良く分離することができる。
上記のような遠心加速度でバブル含有容器に遠心分離処理を行うことができる遠心分離機としては、特に限定されないが、例えば、商品名「ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１」（トミー精工社製）等の微量高速冷却遠心機を用いることができる。なお、上記微量高速冷却遠心機を用いる場合には、その回転数が５０〜２０００ｒｐｍ程度に設定することにより、上記範囲の遠心加速度（遠心力）がバブル含有液に負荷される。
また、遠心分離処理は、１回でもよいし、複数回にわたって行ってもよい。

３．使用方法
上記のようにして得られたバブル含有容器は、患者の超音波診断に用いられる。

具体的には、まず、注射器の注射針を蓋２２のゴム栓２２１に刺通する。次に、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引する。そして、ゴム栓２２１から注射針を抜去し、バブル含有液を吸引した注射器の注射針を患者の血管（例えば静脈）に穿刺して、バブル含有液を血管内に注入する。これにより、バブル１は、血流により患部に運ばれる。なお、バブル含有容器（製造容器２０）から蓋２２を外し、注射器を用いて、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引してもよい。

超音波診断の際には、バブル１が診断対象部位に到達するタイミングで、バブル１が破裂しない程度の周波数および強度を有する診断用超音波をバブル１に照射（放射）する。その後、診断対象部位から反射される信号（反射エコー）を受信して、データ処理することにより、診断対象部位を画像化する。これにより、超音波診断を行うことができる。
なお、超音波の照射およびバブル１からの反射波を受信するデバイスとしては、公知の超音波探触子を用いることができる。

上記のようにして得られたバブル含有容器は、超音波診断の用途以外にも、様々な分野に適用することができる。例えば、上記のようにして得られたバブル含有容器内のバブル１は、水や食材に対する殺菌効果を有するとともに、食材の鮮度を維持する効果を有する。さらに、バブル１と、水と、油分（疎水性成分）とを含む液体中では、水に対して多量の油分を混合することができる。この効果を利用して、食材中の水分と油分との分離を抑制して調理することも可能である。したがって、得られたバブル含有液を食品分野に用いることも可能である。

また、上記の説明では、工程（Ｓ１）〜（Ｓ５）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１（図１参照）を多量に安定的に製造することができる。ただし、本実施形態のバブルの製造方法は、これに限定されない。例えば、工程（Ｓ５）の後に、工程（Ｓ４）および工程（Ｓ５）を少なくとも１回以上繰り返し行うようにしてもよい。工程（Ｓ４）および工程（Ｓ５）を繰り返し行うことにより、均一な径のバブル１をより安定的に生成させることができる。

＜第２実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法およびバブル製造容器の第２実施形態について説明する。
図６は、本発明のバブルの製造方法の第２実施形態を説明するためのフローチャートである。図７（ａ）〜（ｄ）は、本発明のバブルの製造方法の第２実施形態を説明するための断面図である。
なお、以下の説明では、図７（ａ）〜（ｄ）中の上側を「上」と言い、図７（ａ）〜（ｄ）中の下側を「下」と言う。

以下、第２実施形態のバブルの製造方法について、前記第１実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブルの製造方法は、図６に示すように、前述した第１実施形態の工程（Ｓ３）において、製造容器内を加圧した状態で製造容器を密閉するようにした以外は、前述した第１実施形態のバブルの製造方法と同様である。

［Ｓ３］ 製造容器を密閉する工程
容器本体２１にガス３を充填させて、製造容器２０内を加圧した状態で密閉する（図７（ｂ）参照）。具体的には、水性液体１０が注入された容器本体２１の空隙部１１を、ガス３でパージした後、蓋２２を容器本体２１の開口部（瓶口）に締付ける。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。

次に、ガス３が充填された注射器を準備する。そして、注射器の注射針をゴム栓２２１に刺通する。その後、注射器から製造容器２０内にさらにガス３を加えることにより、製造容器２０内が加圧される。その後、ゴム栓２２１から注射針を抜去する。これにより、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる。

本実施形態のバブルの製造方法では、製造容器２０内の圧力（空隙部１１に充填されたガス３の圧力）を１．０ａｔｍより大きくする。特に、製造容器２０内の圧力は、１．５〜１０ａｔｍであるのが好ましく、２〜５ａｔｍであるのがより好ましい。これにより、ガス３の一部が水性液体１０に微分散または溶解する。

水性液体１０にガス３が微分散または溶解することにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０と製造容器２０とが衝突して衝撃波が発生する際に、バブル１が発生し易くなる。これにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０中により多くのバブル１を生成させることができる。

また、製造容器２０中の圧力を１．０ａｔｍよりも大きい任意の値に設定することにより、水性液体１０中に生成するバブル１の径および含有量をより容易に調整することができる。

このようにして水性液体１０とガス３とが密閉された製造容器２０を用いて、前述した第１実施形態と同様に、工程（Ｓ４）および工程（Ｓ５）または工程（Ｓ４）〜（Ｓ６）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０が得られる。

本実施形態のバブルの製造方法では、空隙部１１がガス３で加圧された製造容器２０を用いるため、製造容器２０の振動前の段階で、水性液体１０中にガス３が十分に微分散または溶解している。そのため、工程（Ｓ４）において製造容器２０を振動させる際に、水性液体１０中にバブル１が発生し易く、前述した第１実施形態のバブルの製造方法よりも、より容易に、均一なサイズのバブル１を多量に製造することができる。

また、本実施形態で得られたバブル含有容器（製造容器２０）内は加圧されている。このバブル含有容器内を急激に減圧すると、バブル含有液中のバブル１の粒径が変化したり、含有量が減少したりする等の悪影響が生じる可能性がある。そのため、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引する際に、あらかじめ、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧しておくことが好ましい。

例えば、バブル含有容器からバブル含有液を吸引するための注射器（バブル吸引用注射器）とは異なる別の注射器（減圧用注射器）を用意し、その注射針をゴム栓２２１に刺通する。その際に、減圧用注射器の注射針がバブル含有液に接触しないようにする。次に、減圧用注射器のプランジャーを操作して、バブル含有容器内のガス３を吸引することにより、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧する。次に、バブル吸引用注射器の注射針をゴム栓２２１に刺通し、その後、バブル含有液を吸引する。その際に、減圧用注射器のプランジャーを、その外筒から引き抜いた状態にしておくのが好ましい。この場合、減圧用注射器の注射針が、バブル含有容器の内部および外部に開放され、かかる注射針からバブル含有容器内に自由に空気が出入りする。かかる構成では、バブル含有液を吸引する際に、バブル含有容器内が陰圧となることが防止され、すなわち、バブル含有容器内が大気圧の状態で維持され、生成されたバブル１に上述したような悪影響が生じない。

なお、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧した状態で、蓋２２を外し、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引してもよい。この場合、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧しているため、蓋２２を外した瞬間に、バブル含有液が製造容器２０の外部に吹き出すのを確実に防止することができる。

かかる第２実施形態のバブルの製造方法およびバブル製造用容器によっても、前記第１実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第３実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第３実施形態について説明する。前述した図２（ａ）に示すバブル１は、本実施形態のバブルの製造方法により、製造することができる。

以下、第３実施形態のバブルの製造方法について、前記第１および第２実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態では、水性液体１０が、バブル１の外殻２を構成する材料（外殻材料）および水性媒体を含んでいる。すなわち、本実施形態のバブルの製造方法は、前述した第２実施形態の工程（Ｓ１）において準備する水性液体１０が、水性媒体に加え、外殻材料を含んでいる以外は、前述した第２実施形態のバブルの製造方法と同様である。

［Ｓ１］ 準備工程
本実施形態では、バブル１の外殻２を構成する外殻材料および水性媒体を水性液体調製容器（以下、単に「調製容器」という）に入れて、外殻材料を水性媒体に溶解させて、水性液体１０を調製する。すなわち、調製容器内に外殻材料および水性媒体を所定量加えた後、攪拌して、外殻材料を水性媒体に溶解させる。外殻材料、水性媒体を調製容器に入れる順番は、特に限定されない。外殻材料を水性媒体に溶解させる方法としては、例えば、攪拌子による攪拌、超音波処理等を用いることができる。
外殻材料としては、前述した両親媒性材料が使用される。また、水性媒体としては、前述した第１実施形態と同様の水性媒体を用いることができる。

水性液体１０中における外殻材料の含有量は、工程（Ｓ４）において、水性液体１０中にバブル１が形成されるのであれば特に限定されない。外殻材料の好ましい含有量は、外殻材料および水性媒体の各種類の組み合わせによって変わるが、外殻材料は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上の濃度で水性液体１０に含まれているのが好ましい。具体的には、水性液体１０に含まれる外殻材料の含有量は、０．０１〜５０ｗｔ％であるのが好ましく、０．１〜２０ｗｔ％であるのがより好ましい。

これにより、水性液体１０中の外殻材料の濃度が、より確実に臨界ミセル濃度以上となるので、水性液体１０中に外殻２（リポソーム、ミセル）を確実に形成することができる。そのため、後述する工程（Ｓ４）において、リポソームやミセル内にガス３が簡単に取り込まれ、所望の径のバブル１を水性液体１０中に容易に生成させることができる。本実施形態で生成されるバブル１は、外殻２の存在により、バブル１内のガス３が水性液体１０（水性媒体）に溶け出すのを長期にわたって防止することができる。そのため、バブル１の安定性が高くなり、バブル１が不本意に破裂するのをより確実に防止することができる。さらに、生成されるバブル１の大きさのバラつきを小さくすることができる。すなわち、均一なサイズのバブル１を生成することができる。

調製される水性液体１０に含まれる水性媒体の含有量は、５０〜９９．９９ｗｔ％であるのが好ましく、８０〜９９．０ｗｔ％であるのがより好ましい。これにより、外殻材料を水性媒体に十分に溶解させることができ、より均一な水性液体１０を得ることができる。

次に、前述した第１および第２実施形態と同様の製造容器２０を準備する。
なお、上述した調製容器と製造容器２０とは、異なる容器でも同じ容器でもかまわない。

調製容器と製造容器２０とが異なる容器である場合には、例えば、調製容器としては、比較的容量の大きい容器を用い、一方、製造容器２０（容器本体２１）としては、比較的容量の小さい容器を用いることができる。この場合、調製容器内に均一な組成の水性液体１０を多量に調製して、この水性液体１０を複数の製造容器２０に小分けすることにより、各製造容器２０内で生成されるバブルのサイズ（径）、量を均一にすることができる。

また、調製容器と製造容器２０とが同一の容器である場合には、工程（Ｓ２）を省略することができる。したがって、プロセスを簡略化できる点で利点がある。
なお、本実施形態では、調製容器として、製造容器２０と異なる容器を用いる。

次に、前述した第１実施形態と同様に、工程（Ｓ２）〜（Ｓ５）または工程（Ｓ２）〜（Ｓ６）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０が得られる。

本実施形態では、工程（Ｓ４）において水性液体１０と製造容器２０とが衝突した際に発生する衝撃波の圧力により、ガス３が水性液体１０中に微分散または溶解し、水性液体１０中の外殻材料をバブル１にする。このバブル１（外殻２）内には、上記工程（Ｓ３）において水性液体１０中に微分散または溶解したガス３、および本工程の振動により水性液体１０に微分散または溶解したガス３が含まれる。

なお、工程（Ｓ３）において、第１実施形態と同様に、製造容器２０内を加圧しなくてもよいし（すなわち、製造容器２０内の圧力が大気圧）、第２実施形態と同様に製造容器２０内を加圧してもよい。
かかる第３実施形態のバブルの製造方法およびバブル製造用容器によっても、前記第１および第２実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第４実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第４実施形態について説明する。前述した図２（ｂ）および図２（ｃ）に示すバブル１は、本実施形態のバブルの製造方法により、製造することができる。

以下、第４実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第３実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態では、水性液体１０が、水性媒体、外殻材料および薬物４を含んでいる。すなわち、本実施形態のバブルの製造方法は、前述した第３実施形態の工程（Ｓ１）において調整する水性液体１０が、外殻材料、水性媒体に加え、薬物４を含んでいる以外は、前述した第３実施形態のバブルの製造方法と同様である。

［Ｓ１］ 準備工程
本実施形態では、外殻材料、薬物４および水性媒体を調製容器に入れて、外殻材料と薬物４とを水性媒体に溶解させて、水性液体１０を調製する。すなわち、調製容器内に外殻材料、薬物４および水性媒体を所定量加えた後、攪拌して、外殻材料および薬物４を水性媒体に溶解させる。外殻材料、薬物４、水性媒体を調製容器に入れる順番は、特に限定されない。外殻材料および薬物４を水性媒体に溶解させる方法としては、例えば、攪拌子による攪拌、超音波処理等を用いることができる。

薬物４としては、前述した遺伝子、薬剤等が使用される。調製される水性液体１０に含まれる薬物４の含有量は、０．１〜５０ｗｔ％であるのが好ましく、２０〜５０ｗｔ％であるのがより好ましい。これにより、製造されるバブル１に十分な量の薬物４を含ませることができる。その結果、患部に対する治療効果がより優れたバブル１を製造することができる。なお、薬物４が、外殻材料の代わりに、外殻２を構成する場合には、水性液体１０中に外殻材料を含まないでもよい。

このようにして調整された水性液体１０を用いて、前述した第３実施形態と同様に、工程（Ｓ２）〜（Ｓ５）または工程（Ｓ２）〜（Ｓ６）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１（図２（ｂ）および図２（ｃ）参照）を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０が得られる。

本実施形態では、バブル１（外殻２）内には、工程（Ｓ３）において水性液体１０中に微分散または溶解したガス３、および工程（Ｓ４）の振動により水性液体１０に微分散または溶解したガス３、薬物４が含まれる。その結果、生成されるバブル１は、薬物４がガス３とともに外殻２内に封入され、または、外殻２自体に含有または吸着している。

３．使用方法
上記のようにして得られたバブル含有容器は、患者の超音波治療、または超音波診断に用いられる。

具体的には、まず、注射器の注射針を蓋２２のゴム栓２２１に刺通する。次に、注射器を用いてバブル含有容器内からバブル含有液を吸引する。バブル含有液を吸引した注射器の注射針を患者の血管（例えば静脈）に穿刺して、バブル含有液を血管内に注入する。これによりバブル１は、血流により患部に運ばれる。

超音波治療の際には、バブル１が患部付近に到達した際に、外殻２が破裂する程度の周波数および強度を有する治療用超音波を照射して、外殻２を破裂させる。これより、バブル１内の薬物４を患部に集中的に供給（付与）して、患部を治療することができる。

また、この場合、超音波治療と超音波診断とを組み合わせて行うのも有効である。具体的には、血管内のバブル１に対して、診断用超音波を照射して、その反射波をモニタリングする。これにより、バブル１の血管内（体内）での位置や挙動を正確に把握することができる。バブル１が目的の患部付近に到達したときに、治療用超音波を照射してバブル１（外殻２）を破裂させる。これにより、患部に対して、より正確に薬物を供給して、治療することができる。

なお、ガス３として、前述した水性媒体に溶解性の高い成分（例えば、二酸化炭素等）を用いる場合には、バブル１を製造してから所定の時間経過すると、外殻２内のガス３が、水性媒体中に溶け出す。その後、外殻２内のガス３が完全に水性媒体中に溶け出すと、外殻２内に薬物４のみが封入された状態となる。すなわち、このような場合には、バブル１は、外殻２内に薬物４のみが封入されるリポソームまたはミセルとなる。このようにして得られたリポソームまたはミセルを薬剤として用いることもできる。

なお、治療用超音波の強度（出力）は、０．１〜３０Ｗ／ｃｍ^２程度であるのが好ましく、０．５〜１０Ｗ／ｃｍ^２程度であるのがより好ましい。治療用超音波の強度を上記範囲内とすることにより、より確実にバブル１を破裂させることができるとともに、患部周辺の正常細胞へ与えるダメージを無くすか低減することができる。また、治療用超音波の強度が上記範囲内である場合、その照射時間は、１０〜１２０秒程度であるのが好ましく、３０〜６０秒程度であるのがより好ましい。

また、超音波治療の際に照射する超音波の周波数は、１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ程度であるのが好ましく、７００ｋＨｚ〜１ＭＨｚ程度であるのがより好ましい。照射する超音波の周波数を上記範囲内とすることにより、より低い超音波出力でバブルを破裂させることができる。

かかる第４実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第３実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第５実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第５実施形態について説明する。

図８は、本発明のバブルの製造方法の第５実施形態を説明するためのフローチャートである。

以下、第５実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第４実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブルの製造方法は、図８に示すように、前述した第２実施形態の工程（Ｓ１）〜（Ｓ５）（または、工程（Ｓ１）〜（Ｓ６））の後に、工程（Ｓ７）、工程（Ｓ８）を有している。工程（Ｓ７）は、製造容器内の圧力を変化させる工程である。工程（Ｓ８）は、製造容器を振動させる回転数を設定する工程である。

本実施形態のバブルの製造方法は、工程（Ｓ８）において、回転数を変化させない場合には（図８中、工程（Ｓ８）で「ＮＯ」を選択）、さらに、工程（Ｓ４’）および工程（Ｓ５’）を有している。一方、工程（Ｓ８）において、回転数を変化させる場合には（図８中、工程（Ｓ８）で「ＹＥＳ」を選択）、さらに、工程（Ｓ９）および工程（Ｓ１０）を有している。さらに、本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器内の圧力を変化させる工程（Ｓ１１）を有している。以下、工程（Ｓ７）以降の各工程について順次説明する。

なお、本実施形態では、水性液体１０が、第１および第２実施形態のように、水性媒体のみであってもよいし、第３実施形態のように、水性媒体と外郭材料のみであってもよいし、または、第４実施形態のように水性媒体、外殻材料および薬物４を含んでいてもよい。

［Ｓ７］製造容器内の圧力を変化させる工程
前述した第１実施形態の工程（Ｓ５）後のバブル含有容器（製造容器２０）内の圧力を変化させる。

（１）製造容器内の圧力を工程（Ｓ３）における圧力より高くする場合
製造容器２０内を、前述した工程（Ｓ３）と同様にして加圧する。なお、注入するガス３は、工程（Ｓ３）で用いたガス３と同じでも、異なっていてもよいが、最終的に生成されるバブル１の安定性の観点から、同一のガス３を用いるのが好ましい。

このような製造容器２０では、製造容器２０内が工程（Ｓ３）における製造容器２０内の圧力よりもさらに加圧さているため、水性液体１０中に微分散または溶解するガス３の量が、工程（Ｓ３）での水性液体１０に微分散または溶解したガス３の量よりも多くなる。そのため、後述する工程（Ｓ４’）または工程（Ｓ９）において製造容器２０を再振動させる際に、生成されるバブル１中に水性液体１０中のガス３が取り込まれ易くなり、その結果、バブル１の生成量が多くなる。また、工程（Ｓ４）で生成されるバブル１に加えられる圧力よりも大きい圧力が水性液体１０に加えられる。これにより、生成過程のバブル１がより大きな圧力で圧縮されるため、バブル１の径が小さくなりやすい。そのため、工程（Ｓ４）において生成されるバブル１よりも、より小さい径のバブル１を生成させることができる。

この場合、製造容器２０内の圧力は、工程（Ｓ３）における圧力よりも、０．５ａｔｍ以上高くするのが好ましく、１〜１０ａｔｍ高くするのがより好ましい。これにより、前述した工程（Ｓ４）において生成されるバブル１の径よりも小さい径のバブル１をより確実に生成させることができる。

（２）製造容器内の圧力を１．０ａｔｍよりも大きくしつつ、工程（Ｓ３）における圧力より低くする場合
まず、空の注射器を準備する。次に、注射器の注射針でゴム栓２２１を刺通する。その後、注射器に製造容器２０内のガス３を吸引する。これにより、製造容器２０内が減圧され、製造容器２０内の圧力が減圧される。その後、ゴム栓２２１から注射針を抜去する。

このような製造容器２０では、後述する工程（Ｓ４’）または工程（Ｓ９）において製造容器２０を再振動させた際に、水性液体１０に加えられる圧力は、工程（Ｓ４）で生成される水性液体１０に加えられる圧力よりも小さい。これにより、生成過程のバブル１を圧縮する程度が小さくなり、バブル１の径が大きくなりやすい。そのため、工程（Ｓ４）において生成されるバブル１よりも、より大きい径のバブル１を生成させることができる。

この場合、製造容器２０内の圧力は、１．０ａｔｍより大きく、工程（Ｓ３）における圧力よりも低い圧力までの範囲内で適宜調整される。

［Ｓ８］製造容器を振動させる回転数の設定工程
上記のようにして製造容器２０内の圧力を変化させた後、容器を再振動させる際の回転数を設定する。

容器を再振動させる際の回転数は、前述した工程（Ｓ４）と同様に、５０００ｒｐｍ以上に設定される。

工程（Ｓ８）において、容器を再振動させる際の回転数を工程（Ｓ４）における回転数から変えない場合、すなわち、図８中の工程（Ｓ８）で「ＮＯ」を選択した場合、以下の工程（Ｓ４’）を行う。

一方、工程（Ｓ８）において、容器を再振動させる際の回転数を工程（Ｓ４）における回転数から変える場合、すなわち、図８中の工程（Ｓ８）で「ＹＥＳ」を選択した場合、以下の工程（Ｓ９）を行う。

［Ｓ４’］製造容器を再振動させる工程
上記のようにして、圧力を変化させた製造容器２０を、前述した工程（Ｓ４）と同じ回転数で再振動させる。これにより、工程（Ｓ４）において生成されるバブル１とは異なる径のバブル１が水性液体１０中に生成される。

本工程では、工程（Ｓ４）と同じ回転数で製造容器２０を再振動させるため、本実施形態で新たに生成するバブル１の径は、工程（Ｓ７）において変化させた圧力に応じて変化する。すなわち、圧力を変化させることによって、バブル１の径を調整することができるため、所望の異なる径（平均径）を有するバブル１を再現性良く製造することができる。また、製造容器２０を振動させる装置の設定を変更する必要がないため、より簡易的に異なる径を有するバブル１を製造することができる。

［Ｓ５’］製造容器を静置する工程
上記条件で製造容器２０を振動させた後、工程（Ｓ５）と同様にして製造容器２０を静置する。これにより、製造容器２０内に異なるサイズのバブル１を安定的に多量に製造することができる。また、同時に、このようなバブル１を多量に含有する製造容器２０（バブル含有容器）が得られる。
静置後、工程（Ｓ１１）が行われる。

［Ｓ９］製造容器を再振動させる工程
圧力を変化させた製造容器２０を、前述した工程（Ｓ４）とは異なる回転数で再振動させる。これにより、工程（Ｓ４）において生成されるバブル１とは異なる径のバブル１が水性液体１０中に生成される。

（１）製造容器を工程（Ｓ４）よりも高い回転数で再振動させる場合
製造容器２０を振動させる回転数を、工程（Ｓ４）での回転数よりも高くする以外は、前述した工程（Ｓ４）と同様にして、製造容器２０を再振動させる。

この場合、製造容器２０の回転数は、工程（Ｓ４）での回転数よりも高くする限り特に限定されないが、６０００〜２００００ｒｐｍであるのが好ましく、７０００〜２００００ｒｐｍであるのがより好ましい。これにより、工程（Ｓ４）での回転数よりも大きい回転数で製造容器２０を振動させるため、工程（Ｓ４）で生成されたバブル１よりも小さい径のバブル１を生成させることができる。また、製造容器２０の回転数を上記範囲内とすることにより、工程（Ｓ４）および本工程で生成したバブル１同士が、衝突により崩壊したり、合体して粗大化するのをより確実に防止することができる。これにより、工程（Ｓ４）において生成されたバブル１と、工程（Ｓ４）において生成されたバブル１よりも小さい径のバブル１とを製造することができる。

（２）製造容器を工程（Ｓ４）よりも低い回転数で再振動させる場合
製造容器２０を振動させる回転数を、工程（Ｓ４）での回転数よりも低くする以外は、前述した工程（Ｓ４）と同様にして、製造容器２０を再振動させる。

この場合、製造容器２０の回転数は、工程（Ｓ４）での回転数よりも低くする限り特に限定されないが、５０００〜９０００ｒｐｍであるのが好ましく、５５００〜７５００ｒｐｍであるのがより好ましい。これにより、工程（Ｓ４）での回転数よりも低い回転数で製造容器２０を振動させるため、工程（Ｓ４）で生成されたバブル１よりも大きい径のバブル１を生成させることができる。また、製造容器２０の回転数を上記範囲内とすることにより、工程（Ｓ４）および本工程で生成したバブル１同士が、衝突により崩壊したり、合体して粗大化するのをより確実に防止することができる。これにより、工程（Ｓ４）において生成されたバブル１と、工程（Ｓ４）において生成されたバブル１よりも大きい径のバブル１とを製造することができる。

本工程では、工程（Ｓ４）と異なる回転数で製造容器２０を再振動させるため、本実施形態で新たに生成するバブル１の径は、製造容器２０内の圧力の変化および再振動時の回転数によって変化する。このように、製造容器２０内の圧力および再振動時の回転数のいずれも変化させることにより、前述した第１実施形態で得られる径とは大きく異なる径のバブル１を製造することができる。したがって、平均径が大きく異なるバブル１を製造する際には、本工程は有利である。

［Ｓ１０］製造容器を静置する工程
工程（Ｓ９）で製造容器２０を振動させた後、工程（Ｓ５）と同様にして製造容器２０を静置する。これにより、製造容器２０内に異なるサイズのバブル１を安定的に製造することができる。また、同時に、このようなバブル１を多量に含有する製造容器２０（バブル含有容器）が得られる。
静置後、工程（Ｓ１１）が行われる。

［Ｓ１１］製造容器内の圧力を再度変化させる工程
製造容器２０内の圧力を変化させない場合、すなわち、図８中の工程（Ｓ１１）で「ＮＯ」を選択した場合、本実施形態のバブルの製造方法は終了する。これにより、平均径が１０ｎｍ〜１０００μｍの範囲で、それぞれ異なる平均径を有する第１のバブル１と、第２のバブル１とが製造される。

一方、製造容器２０内の圧力を変化させる場合、すなわち、図８中の工程（Ｓ１１）で「ＹＥＳ」を選択した場合、工程（Ｓ８）が行われる。その後、上述した工程（Ｓ４’）、（Ｓ５’）および（Ｓ１１）、または工程（Ｓ９）、（Ｓ１０）および（Ｓ１１）が繰り返し行われる。これにより、平均径が１０ｎｍ〜１０００μｍの範囲で、互いに異なる複数の平均径を有するバブル１を製造することができる。

なお、工程（Ｓ１１）において、繰り返し圧力を変化させる場合には、圧力を変化させる回数に応じた数の互いに異なる複数の平均径を有するバブル１を製造することができる。

以上のようにして得られたバブル含有容器は、水性液体１０中に異なる径を有するバブル１を含む。サイズの違いによりバブル１の血管内の通過のし易さ、また、運搬される部位も変わってくる（例えば、バブル１のサイズが小さいほど、毛細血管の先端まで運搬できる。）ため、上記のようにして得られたバブル含有液は、超音波治療の目的に合わせて多面的に用いることが可能である。

かかる第５実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第４実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第６実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第６実施形態について説明する。

図９は、本発明のバブルの製造方法の第６実施形態に用いられる製造容器の蓋付近を示す部分断面図である。
なお、以下の説明では、図９中の上側を「上」と言い、図９中の下側を「下」と言う。

以下、第６実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第５実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器２０（バブル製造用容器の第２実施形態）の蓋２２の構成が異なる以外は、前述した第１〜第５実施形態のバブルの製造方法と同様である。

図９に示す蓋２２は、前述したゴム栓２２１、締付部２２２に加え、ゴム栓２２１の下面に接着剤等により接着する底板部２２３を備えている。換言すれば、底板部２２３は、容器本体２１の開口部に、ゴム栓２２１と接着した状態で設けられている。本実施形態の製造容器２０は、底板部２２３を備えることにより、前述した第１実施形態の製造容器２０の蓋２２よりも、蓋２２の質量が大きくなる。すなわち、底板部２２は、製造容器２０の質量を増加させる錘部となる。

底板部２２３は、ゴム栓２２１よりも小径の円盤状をなす部材である。また、底板部２２３は、締付部２２２の開口に対応するように、平面視において、その略中心に注射器の注射針が挿通する貫通孔２２４が形成されている。なお、貫通孔２２４のサイズは特に限定されない。ただし、貫通孔２２４が、締付部２２２から露出するゴム栓２２１と同じサイズである場合には、工程（Ｓ３）において注射針をゴム栓２２１の締付部２２２から露出する領域のどこにでも刺通することができる。また、図９に示すように、貫通孔２２４が、注射針が挿通可能なサイズであってもよい。この場合、ゴム栓２２１の上面には、貫通孔２２４に対応する位置にマークを付して（図示せず）、このマークを目印として注射針をゴム栓２２１に刺通すればよい。

また、底板部２２３には、複数の貫通孔２２４が設けられていてもよい。例えば、ガス３が充填された注射器の注射針および前述した減圧用注射器の注射針を挿通するための貫通孔、およびバブル吸引用注射器の注射針を挿通するための貫通孔の２つの貫通孔２２４を底板部２２３に設けてもよい。かかる構成では、減圧用注射器を用いることにより、バブル含有容器内の圧力を大気圧にした状態でバブル吸引用注射器によりバブル１を吸引することができる。そのため、吸引されたバブル含有液中のバブル１の粒径が変化したり、含有量が減少したりする等の悪影響の発生をより確実に防止することができる。また、底板部２２３に各注射器の注射針を挿通するための３つの貫通孔２２４を設けてもよい。また、ゴム栓２２１の上面には、各貫通孔２２４に対応する位置に、各注射器の注射針を刺通する目印としてマークを付してもよい。

このような底板部２２３の構成材料としては、例えば、各種セラミック材料、各種金属材料が挙げられるが、ガラス以上の密度（２０００ｋｇ／ｍ^３以上）を有する材料が好ましい。このような材料としては、鋳鉄（密度：７０００〜７７００ｋｇ／ｍ^３程度）、クロムニッケル鋼１８／８（密度：７９００ｋｇ／ｍ^３程度）、Ｖ２Ａ鋼（密度：７９００ｋｇ／ｍ^３程度）等のステンレス鋼、アルミニウム（密度：２７００ｋｇ／ｍ^３程度）、ジェラルミン（密度：２７００ｋｇ／ｍ^３程度）、鉛（密度：１１３４０ｋｇ／ｍ^３程度）、鉄（密度：７８７０ｋｇ／ｍ^３程度）、銅（密度：８９００ｋｇ／ｍ^３程度）、真鍮（密度：８２５０〜８５００ｋｇ／ｍ^３程度）、ニッケル（密度：８３５０ｋｇ／ｍ^３程度）、鋳鉄（密度：７０００〜７７００ｋｇ／ｍ^３程度）、亜鉛（密度：７１３０ｋｇ／ｍ^３程度）、すず（密度：７２８０ｋｇ／ｍ^３程度）等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの材料の中でも、比重が高く、水性液体１０の構成成分に対する高い耐腐食性を有するという観点から、鉄や、ステンレス鋼等の鉄合金を用いるのが特に好ましい。

このような材料で構成される底板部２２３は、合成ゴムや樹脂等の比重（密度）の小さい材料を用いて形成される部材よりも、その質量が大きくなる。底板部２２３の質量を大きくすることにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が製造容器２０の上面（底板部２２３）に衝突した際に発生する衝撃波の大きさをより大きくすることができる。その結果、水性液体１０中に微細なバブル１をより容易に、かつ安定的に生成することができる。

かかる蓋２２を用いる場合には、工程（Ｓ３）において、ガス３が充填された注射器の注射針が底板部２２３の貫通孔２２４を挿通するようにゴム栓２２１を刺通する。その後、上述した第２実施形態と同様に、注射器から製造容器２０内にさらにガス３を加えることにより、製造容器２０内を加圧する。その後、蓋２２（ゴム栓２２１）から注射針を抜くことにより、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる。

かかる構成の製造容器２０（本実施形態のバブル製造用容器）を用いて、前述した第１〜第５実施形態のバブルの製造方法と同様の工程を経て、バブル含有容器を得ることができる。

かかる第６実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第５実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第７実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第７実施形態について説明する。

図１０（ａ）〜（ｆ）は、本発明のバブルの製造方法の第７実施形態に用いられる容器を模式的に示す断面図である。

なお、以下の説明では、図１０（ａ）〜（ｆ）中の上側を「上」と言い、図１０（ａ）〜（ｆ）中の下側を「下」と言う。

以下、第７実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第６実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブルの製造方法は、容器（製造容器）の形状が異なる以外は、前述した第１〜第６実施形態のバブルの製造方法と同様である。

本実施形態では、製造容器２０（バブル製造用容器の第３実施形態）は、図１０（ａ）〜（ｄ）に示す様々な形状の容器本体２１と、各容器本体２１の上面の形状に合わせた蓋（図示せず）とを有している。図１０（ａ）〜（ｄ）に示すように、容器本体２１の内面は、凹面、凸面および凹凸面のうちの少なくとも１つを含んでいる。

図１０（ａ）に示す容器本体２１は、上面および下面が、内側に向かって突出した凸面である容器である。図１０（ｂ）に示す製造容器２０は、上面および下面が、凹凸面である容器である。図１０（ｃ）に示す製造容器２０は、上面および下面が、外側に向かって突出した凹面である容器である。図１０（ｄ）に示す製造容器は、側面が、製造容器２０の内側に向かって湾曲する凸面である容器である。

このような面（凹面、凸面、または凹凸面）は、平坦面に比べて表面積が大きい。そのため、前述した工程（Ｓ４）において、水性液体１０が、製造容器の内面と衝突できる面積が大きくなり、より多くの衝撃波を発生させることができる。また、このような面では、その形状によって、発生する衝撃波の圧力の程度が異なる。これにより、水性液体１０中に異なる径のバブル１を多量に生成させることができる。

また、容器本体２１の高さを、図１０（ｅ）に示すように、前述した第１〜第６実施形態の容器本体２１よりも高くすることができる。このような容器本体２１を用いた場合には、工程（Ｓ４、Ｓ４’およびＳ９）において製造容器を振動させる際に、水性液体１０の移動距離が長くなる。そのため、衝突時に発生する衝撃波の大きさを大きくすることができる。これにより、水性液体１０中に製造されるバブル１のサイズをより小さくすることができる。

一方、容器本体２１の高さを、図１０（ｆ）に示すように、前述した第１〜第６実施形態の容器本体２１よりも低くすることができる。このような容器本体２１を用いた場合には、工程（Ｓ４、Ｓ４’およびＳ９）において製造容器を振動させる際に、水性液体１０の移動距離が短くなる。そのため、水性液体１０が製造容器の内面と衝突する回数を多くすることができるので、水性液体１０に衝撃波による圧力をより多く付与することができる。これにより、水性液体１０中により多くのバブル１を製造することができる。

かかる第７実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第６実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第８実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第８実施形態について説明する。

図１１（ａ）〜（ｃ）は、本発明のバブルの製造方法の第８実施形態を説明するための斜視図である。図１２は、図１１（ａ）に示すミニナートバルブのゴム栓付近の構成（ハンドルは省略）を説明するための図であり、図１２（ａ）は、ミニナートバルブのゴム栓付近の上面図であり、図１２（ｂ）は、図１２（ａ）のＸ−Ｘ線断面図である。図１３は、図１１（ｃ）に示すバブル含有容器の断面図である。

なお、以下の説明では、図１１（ａ）〜（ｃ）、図１２（ｂ）、図１３中の上側および図１２（ａ）中の紙面手前側を「上」と言い、図１１（ａ）〜（ｃ）、図１２（ｂ）、図１３中の下側および図１２（ａ）中の紙面奥側を「下」と言う。また、図１１（ａ）〜（ｃ）中の左側を「左」と言い、図１１（ａ）〜（ｃ）中の右側を「右」と言う。

以下、第８実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第７実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器の構成が異なる以外は、前述した第１〜第５実施形態のバブルの製造方法と同様である。

［Ｓ１］ 準備工程
図１１（ａ）に示すような製造容器２０（バブル製造用容器の第４実施形態）を準備する。

本実施形態では、製造容器２０は、前述した第１実施形態の製造容器２０と同様に、容器本体２１と、蓋２２とを有している。この蓋２２は、図１１（ａ）に示すように、その上側にミニナートバルブ３０と、ゴム栓２２１とミニナートバルブ３０とを連結するチューブ３３とを備えている。

ミニナートバルブ３０は、貫通孔３１１を有するバルブ本体３１と、貫通孔３１１に埋設され、厚さ方向（上下方向）に貫通する管路３２１が形成されたゴム栓３２と、管路３２１の開閉を制御するハンドル（開閉機構）３４とを有している。

バルブ本体３１は、略直方体状をなしており、その長手方向の中央付近に、厚さ方向（上下方向）に貫通する貫通孔３１１が形成されている（図１２（ａ）、（ｂ）参照）。また、図１２（ｂ）に示すように、バルブ本体３１には、その長手方向に貫通する貫通孔３１２が形成されている。

ゴム栓３２は、略円筒状をなしており、例えば、シリコンゴム等で構成されている。このゴム栓３２は、バルブ本体３１の貫通孔３１１に挿入され、バルブ本体３１に固定（埋設）されている。ゴム栓３２の略中心には、注射器４０の注射針４１が挿入可能に形成された管路３２１が形成されている。また、ゴム栓３２には、管路３２１と直交し、ゴム栓３２の幅方向（左右方向）に貫通する貫通孔３２２が形成されている（図１２（ｂ）参照）。ゴム栓３２の貫通孔３２２とバルブ本体３１の貫通孔３１２とは互いに連通しており、貫通孔３２２および貫通孔３１２に、後述するハンドル３４のシャフト３４２が摺動可能に挿入される。

ハンドル３４は、バルブ本体３１の長手方向（左右方向）の両端側に設けられた一対のノブ３４１と、各ノブ３４１と接続し、ゴム栓３２の貫通孔３２２およびバルブ本体３１の貫通孔３１２に摺動可能に挿入されるシャフト３４２とを有している。このシャフト３４２には、その一部に、厚さ方向（図１１（ａ）中、上下方向）に貫通する貫通孔３４３が形成されている。

チューブ３３は、特に限定されないが、例えば、シリコン製のチューブで構成されている。チューブ３３の上端部は、ゴム栓３２の管路３２１と連通しており、チューブ３３の下端部は、ゴム栓２２１を介して、容器本体２１の内部空間（空隙部１１）と連通している。言い換えれば、管路３２１と容器本体２１の内部空間とは、チューブ３３を介して連通している。

本実施形態の製造容器２０では、図１１（ａ）に示すように、左側のノブ３４１を右側に押して、左側のノブ３４１とバルブ本体３１の左側の端部とを接触した状態とすることにより、平面視（上面視）においてシャフト３４２の貫通孔３４３と管路３２１とが重なる（連通する）。これにより、管路３２１が開けられ、管路３２１、チューブ３３および容器本体２１の内部空間が連通した状態となる（図１１（ａ）、図１２（ｂ）参照）。一方、図１１（ｂ）に示すように、右側のノブ３４１を左側に押して、右側のノブ３４１とバルブ本体３１の右側の端部とを接触した状態とすることにより、平面視（上面視）においてシャフト３４２の貫通孔３４３の位置と管路３２１の位置とがずれる。これにより、管路３２１が閉じられ、製造容器２０内は密閉される。

また、本実施形態では、蓋２２は、図９に示す蓋２２と同様に、ゴム栓２２１と、締付部２２２と、底板部２２３とを備えている（図１３参照）。図１３に示すように、チューブ３３の下端部（ゴム栓２２１と接続される側の端部）が、底板部２２３の貫通孔２２４に対応する位置に配置されている。そのため、チューブ３３は、容器本体２１の内部と連通する。

［Ｓ３］製造容器を密閉する工程
水性液体１０が注入された容器本体２１の空隙部１１を、ガス３でパージした後、蓋２２を容器本体２１の開口部（瓶口）に挿着する。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。

次に、ガス３が充填された注射器４０を準備する。図１１（ａ）に示すように、ハンドル３４の左側のノブ３４１を右側に押圧操作して管路３２１を開き、管路３２１とチューブ３３とを連通させる。そして、注射器４０の注射針４１を管路３２１に挿入し、その後、ミニナートバルブ３０およびチューブ３３を介して、注射器４０から製造容器２０内にさらにガス３を加える。これにより、製造容器２０内が加圧される。

その後、注射針４１を管路３２１から抜くと同時に、ハンドル３４の右側のノブ３４１を左側に押圧操作して管路３２１を閉めて、管路３２１とチューブ３３とを非連通状態とする。

次に、チューブ３３の一部に熱処理を行い、チューブ３３内の空間が閉塞されたシーリング部３３１を形成する（図１１（ｂ）参照）。

その後、チューブ３３を、シーリング部３３１のミニナートバルブ３０側（図中、上側）で切断し、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる（図１１（ｃ）参照）。

その後の工程は、前述した第１〜第５実施形態と同様に行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器（密閉容器）２０（バブル含有容器）が得られる。

本実施形態では、工程（Ｓ３）において、注射針４１を蓋２２のゴム栓２２１に直接刺通することなく、製造容器２０内を加圧することができる。すなわち、本実施形態では、蓋２２およびチューブ３３（ゴム栓２２１からシーリング部３３１までの区間）に貫通孔がないため、製造容器２０内の密閉性を向上させることができる。製造容器２０内の密閉性が向上することにより、最終的に得られるバブル含有容器では、バブル１が水性液体１０中により安定的に存在することができる。すなわち、バブル含有容器の長期保存性がより向上する。

かかる第８実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第７実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第９実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第９実施形態について説明する。

図１４は、本発明のバブルの製造方法の第９実施形態に用いられる製造容器を説明するための斜視図である。

なお、以下の説明では、図１４中の上側を「上」と言い、図１４中の下側を「下」と言う。また、図１４中の左側を「左」と言い、図１４中の右側を「右」と言う。

以下、第９実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第８実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブルの製造方法は、ミニナートバルブ３０が、容器本体２１の側面に設けられている点で、前述した第８実施形態のバブルの製造方法と異なる。

本実施形態で用いられる製造容器２０（バブル製造用容器の第５実施形態）は、図１４に示すように、前述した第８実施形態のバブルの製造方法で用いた容器本体２１と、蓋２２と、ミニナートバルブ３０と、容器本体２１とミニナートバルブ３０とを連結するチューブ３３とを有している。さらに、本実施形態の製造容器２０は、ミニナートバルブ３０が、水性液体１０の液面よりも蓋２２側（図中、上側）に設けられている。

チューブ３３は、ガラス製のチューブ（管）で構成されており、容器本体２１（バイアル瓶）と一体的に形成されている。

図１４に示すように、チューブ３３の左側の端部は、容器本体２１の内部空間（空隙部１１）と連通しており、チューブ３３の右側の端部は、ゴム栓３２の管路３２１と連通している。したがって、本実施形態においても、管路３２１と容器本体２１の内部空間とは、チューブ３３を介して連通している。

かかる構成の製造容器２０を用いて、前述した第８実施形態のバブルの製造方法と同様の工程を経て、バブル含有容器を得ることができる。

かかる第９実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第８実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第１０実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第１０実施形態について説明する。

図１５は、本発明のバブルの製造方法の第１０実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。

なお、以下の説明では、図１５中の上側を「上」と言い、図１５中の下側を「下」と言う。また、図１５中の左側を「左」と言い、図１５中の右側を「右」と言う。

以下、第１０実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第９実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブル製造用容器は、その長手方向がほぼ水平方向（前述した第１〜第９実施形態では、製造容器２０の長手方向が鉛直方向）となるように構成されている。また、工程（Ｓ４）において、製造容器を水平方向に振動させる。以上の点で、本実施形態のバブルの製造方法は、前述した第１〜第９実施形態のバブルの製造方法と相違する。具体的には、工程（Ｓ４）において、図１５に示す製造容器２０を、ほぼその水平方向に往復運動するように、製造容器２０を振動させる。

［Ｓ１］ 準備工程
図１５に示すような製造容器２０（バブル製造用容器の第６実施形態）を準備する。

本実施形態の製造容器２０は、上部に円筒部２１１を有する容器本体２１と、円筒部２１１の開口を封止するゴム栓２３と、容器本体２１の両端部に固定される２つの錘部５とを備えている。

容器本体２１は、水平方向（図１５中、左右方向）に長尺な略円筒状をなしている。容器本体２１の略中央には、容器本体２１の上面から鉛直上方に突出した円筒部（突出部）２１１が形成されている。なお、本実施形態の容器本体２１は、円筒部２１１の開口のみが外部に開放している。また、容器本体２１の両端側には、ネジ溝２１２が形成されている。

ゴム栓２３は、特に限定されないが、例えば、シリコン製のゴム栓を用いることができる。

錘部５は、円盤状をなす平板部５１と、平板部５１の縁部から立設する筒状部５２とを有しており、その外形が断面視した際に略Ｃ字状をなす部材である。筒状部５２の内周側には、容器本体２１のネジ溝２１２に螺合可能なネジ溝５２１が形成されている。錘部５のネジ溝５２１を容器本体２１のネジ溝２１２に螺合させることにより、平板部５１が容器本体２１の各端部に密着した状態で錘部５が容器本体２１に取り付けられる（固定される）。

このような錘部５は、前述した図９に示す蓋２２の底板部２２３と同様に、セラミック材料、金属材料等の比重の大きい材料で構成されている。そのため、錘部５を容器本体２１に取り付けることにより、容器本体２１の両端部の質量を大きくすることができる。これにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が容器本体２１の錘部５に固定された部分（特に、両端部）に衝突した際に発生する衝撃波の大きさをより大きくすることができる。その結果、水性液体１０中に微細なバブル１をより容易に、かつ安定的に生成することができる。

なお、錘部５の構成材料としては、比重が高く、水性液体１０の構成成分に対する高い耐腐食性を有するという観点から、金属材料の中でも鉄、または、ステンレス鋼等の鉄合金を用いるのが特に好ましい。

また、このような錘部５は、容器本体２１に容易に脱着可能である。錘部５の構成材料および／またはサイズを変更することにより、錘部５の質量を適宜調整することができる。この錘部５の質量を調整することにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０中に生成されるバブル１のサイズおよび生成量を調整することができる。すなわち、本実施形態のバブルの製造方法では、様々なサイズおよび含有量のバブル１を、同一の製造容器２０を用いて製造することができる。そのため、目的とするサイズおよび含有量のバブル１に合わせて、サイズの異なる複数種の製造容器２０を準備する必要がないため、バブル含有容器の生産性が向上する。

［Ｓ３］製造容器を密閉する工程
水性液体１０が注入された容器本体２１内を、ガス３でパージした後、ゴム栓２３を容器本体２１の円筒部２１１の開口に挿着する。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。

次に、ガス３が充填された注射器４０を準備する。そして、注射器４０の注射針４１をゴム栓２３に刺通する。その後、注射器４０から製造容器２０内にさらにガス３を加える。これにより、製造容器２０内が加圧される。その後、ゴム栓２３から注射針を抜くことにより、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる。

［Ｓ４］製造容器を振動させる工程
次に、水性液体１０が、製造容器２０の両端部および側面（特に、両端部）に繰り返し衝突するように、製造容器２０を振動させる。本実施形態では、製造容器２０が、製造容器２０の水平方向（長手方向）にほぼ往復運動するように、製造容器２０を振動させる。

なお、本実施形態における製造容器２０の振動は、前述した第１実施形態の工程（Ｓ４）と同様の条件で行うことができる。

その後の工程は、前述した第１〜第５実施形態と同様に行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器（密閉容器）２０（バブル含有容器）が得られる。

かかる第１０実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第９実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第１１実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第１１実施形態について説明する。

図１６は、本発明のバブルの製造方法の第１１実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。図１６（ａ）は、分解した状態の製造容器を示しており、図１６（ｂ）は、組立てた状態の製造容器を示している。

なお、以下の説明では、図１６（ａ）および（ｂ）中の上側を「上」と言い、図１６（ａ）および（ｂ）中の下側を「下」と言う。また、図１６（ａ）および（ｂ）中の左側を「左」と言い、図１６（ａ）および（ｂ）中の右側を「右」と言う。

以下、第１１実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第１０実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブルの製造方法は、図１６（ａ）および（ｂ）に示すように、製造容器２０（バブル製造用容器の第７実施形態）の容器本体２１の両端が外部に開放される以外は、前述した第１０実施形態の図１５に示す製造容器２０を用いたバブルの製造方法と同じである。すなわち、容器本体２１は、両端が外部に開口した円筒状をなす部材で構成されている。

かかる構成の製造容器２０を用いる場合には、まず、錘部５のネジ溝５２１を容器本体２１のネジ溝２１２に螺合させることにより、錘部５を容器本体２１に取り付ける。なお、図１６（ｂ）に示すように、錘部５が容器本体２１に取り付けられた状態では、平板部５１が容器本体２１の各端部に密着する。

なお、図示しないが、平板部５１と容器本体２１の各端部との間に、錘部５と容器本体２１との密着性を高めるためのパッキンを配置してもよい。これにより、製造容器２０の密閉性を向上させることができる。

その後、上述した本実施形態のバブルの製造方法と同様の工程を経て、バブル含有容器を得ることができる。

このようにして得られたバブル含有容器は、ゴム栓２３に注射器の注射針を刺通した後、バブル含有液を吸引して使用することができる。また、かかる構成では、錘部５を容器本体２１から外し、注射器を用いることなく、直接バブル含有容器からバブル含有液を取り出すことができる。

かかる第１１実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第１０実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
＜第１２実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第１２実施形態について説明する。

図１７は、本発明のバブルの製造方法の第１２実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。
なお、以下の説明では、図１７中の上側を「上」と言い、図１７中の下側を「下」と言う。

以下、第１２実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第１１実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器の構成が異なる以外は、前述した第１〜第５実施形態のバブルの製造方法と同じである。

［Ｓ１］ 準備工程
図１７に示すような製造容器２０（バブル製造用容器の第８実施形態）を準備する。

本実施形態の製造容器２０は、容器本体２１と、容器本体２１を密閉する蓋２２と、容器本体２１の他端側に、容器本体２１の長手方向に移動可能に設けられた錘部５と、錘部５を固定する一対のＯリング６とを有している。なお、蓋２２は、前述した第１実施形態の製造容器２０の蓋２２と同じ構成を有している

容器本体２１は、略有底円筒状をなしている。容器本体２１は、蓋２２が取り付けられる上部本体部２１５と、錘部５が取り付けられ、上部本体部２１５よりも小さい内径を有する下部本体部２１６とを有する。また、図１７に示すように、上部本体部２１５は、その下端部に、下部本体部２１６と同じ内径となるように縮径している縮径部２１７を有する。上部本体部２１５の一端側（上端側）の外周面には、蓋２２の締付部２２２（締付部２２２の内周面）と螺合可能なネジ溝２１３が形成されている。また、下部本体部２１６の外周面の全体にわたって、錘部５（錘部５の内周面）と螺合可能なネジ溝２１４が形成されている。
また、容器本体２１を構成する材料は、特に限定されないが、ガラス等の各種セラミックス材料、樹脂材料等を用いることができる。

上部本体部２１５の長手方向の長さは、特に限定されないが、１０〜６０ｍｍ程度であるのが好ましく、１５〜３０ｍｍ程度であるのがより好ましい。また、上部本体部２１５の内径は、５〜２０ｍｍ程度であるのが好ましく、８〜１５ｍｍ程度であるのがより好ましい。また、下部本体部２１６の長手方向の長さは、特に限定されないが、１０〜３５ｍｍ程度であるのが好ましく、１３〜２３ｍｍ程度であるのがより好ましい。また、下部本体部２１６の内径は、上部本体部２１５の内径よりも小さければ、特に限定されないが、２〜１５ｍｍ程度であるのが好ましく、３〜８ｍｍ程度であるのがより好ましい。

かかる寸法の容器本体２１を用いることにより、容器本体２１内の密閉空間で適切な圧力が水性液体１０に付与されるので、均一なサイズのバブル１を安定的に得ることができる。また、この場合、超音波診断の際に、１つの製造容器２０内のバブル含有液を使い切ることができるため、製造されるバブル含有液の無駄をなくすことができる。
また、上部本体部２１５の内径と下部本体部２１６の内径とが上記範囲内であると、上部本体部２１５の内径と下部本体部２１６の内径との差が大きくなり、縮径部２１７が大きくなる。そのため、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が上部本体部２１５から下部本体部２１６側へと移動する際に、水性液体１０が、この縮径部２１７に衝突して、衝撃波が発生する。このように、縮径部２１７の存在により、一定の内径を有する容器を用いる場合に比べて、製造容器２０内に発生する衝撃波の発生頻度を高くすることができる。
さらに、製造容器２０の振動工程において、上部本体部２１５から下部本体部２１６へと水性液体１０が移動するため、水性液体１０の移動速度が速くなる。そのため、キャビテーション効果により、下部本体部２１６内の水性液体１０にバブルがより生成し易くなる。これらの相乗効果により、より短時間で、均一な粒径のバブル１をより効率良く生成することができる。

また、ネジ溝２１４が、下部本体部２１６の外周面の全体にわたって形成されるので、長手方向の長さが上記範囲内であれば、錘部５を容器本体２１の下端から中央付近まで移動させることができる。
錘部５を容器本体２１の下端付近に設けた場合には、容器本体２１の下端部の重量が大きくなる。そのため、前述した第１０実施形態と同様に、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が容器本体２１の下端部と衝突した際に発生する衝撃波を大きくすることができる。
一方、錘部５の位置を容器本体２１の中央付近に設けた場合には、縮径部２１７の重量が大きくなる。そのため、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が縮径部２１７と衝突した際に発生する衝撃波を大きくすることができる。
また、錘部５が設けられる位置が、容器本体２１の下端部に近いほど、水性液体１０が容器本体２１の下端部と衝突した際に発生する衝撃波が大きくなる。すなわち、本実施形態では、下部本体部２１６に錘部５を設置する位置を調整することにより、製造容器２０内に発生する衝撃波の大きさを制御することができ、所望のサイズのバブル１をより安定的に生成させることができる。
なお、容器本体２１全体の長手方向の長さは、特に限定されないが、２０〜８５ｍｍ程度であるのが好ましく、３０〜５３ｍｍ程度であるのがより好ましい。

錘部５は、リング状をなす部材である。錘部５を下部本体部２１６のネジ溝２１４に螺合させた状態において、錘部５を回転させることにより、錘部５は、下部本体部２１６のネジ溝２１４が形成された領域を長手方向（図１７中、上下方向）に移動する。

上述したように、本実施形態のバブルの製造方法では、容器本体２１に錘部５を設ける位置を設定することにより、製造容器２０内に発生する衝撃波の大きさを制御することができる。これにより、得られるバブル１のサイズおよび含有量を調整することができる。
錘部５の質量は、特に限定されないが、上述した寸法の容器本体２１に対しては、３〜３０ｇ程度であるのが好ましく、５〜２０ｇ程度であるのがより好ましい。錘部５の質量が上記範囲内であれば、得られるバブル１のサイズおよび含有量を、より効率良く調整することができる。

Ｏリング６は、錘部５を挟むように錘部５の上側と下側とに設けられ、製造容器２０の振動等により錘部５が移動するのを防止するための部材である。なお、Ｏリング６としては、シリコン製のＯリングを用いることができる。
錘部５およびＯリングは、以下のようにして、容器本体２１と取り付けることができる。まず、１つ目のＯリング６を下部本体部２１６の下端側から挿通し、所定の位置で止める。次に、錘部５を下部本体部２１６の下端部に取り付け、取り付けたＯリング６と接触するまで移動させる。その後、２つ目のＯリング６を下部本体部２１６の下端側から挿通し、錘部５に接触するまで移動させることにより、２つのＯリング６により錘部５が固定される。

その後の工程は、前述した第１〜第５実施形態と同様に行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器（密閉容器）２０（バブル含有容器）が得られる。

かかる第１２実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第１１実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

＜第１３実施形態＞
次に、本発明のバブルの製造方法の第１３実施形態について説明する。

図１８は、本発明のバブルの製造方法の第１３実施形態に用いられる製造容器を説明するための断面図である。図１８（ａ）は、分解した状態の製造容器を示しており、図１８（ｂ）は、組立てた状態の製造容器を示している。図１９は、図１８（ｂ）に示す製造容器の蓋に形成される開口部の位置を説明するための図である。図１９（ａ）は、注射器の注射針をゴム栓に刺通する前の状態を説明するための図であり、図１９（ｂ）は、注射針をゴム栓から抜いた後に締付部を底板部に締め付けた状態を説明するための図である。

なお、以下の説明では、図１８（ａ）および（ｂ）中の上側を「上」と言い、図１８（ａ）および（ｂ）中の下側を「下」と言う。また、図１８（ａ）および（ｂ）中の左側を「左」と言い、図１８（ａ）および（ｂ）中の右側を「右」と言う。

以下、第１３実施形態のバブルの製造方法について、前記第１〜第１２実施形態のバブルの製造方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。

本実施形態のバブルの製造方法は、製造容器の蓋の構成が異なる以外は、前述した第１〜第５実施形態のバブルの製造方法と同様である。

［Ｓ１］ 準備工程
図１８（ｂ）に示すような製造容器２０（バブル製造用容器の第９実施形態）を準備する。

本実施形態の製造容器２０は、前述した第１実施形態の製造容器２０と同様の容器本体２１と、蓋２２とを有している。

本実施形態では、蓋２２は、容器本体２１の瓶口に固定される底板部２２３と、底板部２２３の容器本体２１とは反対側に配置されるゴム栓２２１と、ゴム栓２２１を底板部２２３に固定する締付部２２２とを備えている。

底板部２２３は、円盤状をなす平板部２２５と、平板部２２５の縁部から立設する筒状部２２６とを有しており、その外形が断面視した際に略Ｃ字状をなす部材である。本実施形態では、平面視（上面視）における底板部２２３（平板部２２５）の形状と、ゴム栓２２１との形状がほぼ等しく、互いにほぼ同じ径を有している。また、筒状部２２６の内周面および容器本体２１の瓶口側の外周面には、互いに螺合可能に形成されたネジ溝が、それぞれ形成されており、これらを螺合させることにより、底板部２２３（平板部２２５）が容器本体２１の瓶口と密着した状態で固定される。

また、底板部２２３には、平面視（上面視）において、その中心から所定の距離離間した位置に、注射器の注射針が挿通可能なサイズを有する貫通孔２２４が形成されている。すなわち、図１９（ａ）に示すように、蓋２２の平面視において、ゴム栓２２１の中心Ｃと底板部２２３の貫通孔２２４とはズレている。

かかる底板部２２３は、前述した図９に示す蓋２２の底板部２２３と同様に、セラミック材料、金属材料等の比重の大きい材料で構成されている。底板部２２３の質量を大きくすることにより、工程（Ｓ４）において、水性液体１０が製造容器２０の上面（底板部２２３）に衝突した際に発生する衝撃波の大きさをより大きくすることができる。その結果、水性液体１０中に微細なバブル１をより容易に、かつ安定的に生成することができる。

ゴム栓２２１としては、前述した第１実施形態のバブルの製造方法で用いたゴム栓２２１と同様のゴム栓を用いることができる。このゴム栓２２１の表面には、蓋２２を容器本体２１に取り付けた状態において、底板部２２３の貫通孔２２４に対応する位置に注射針を刺通するためのマークＸが付されている（図１９（ａ）参照）。

締付部２２２は、ゴム栓２２１の縁部を覆うように構成されている。また、締付部２２２および底板部２２３（平板部２２５）の外周面には、互いに螺合可能に形成されたネジ溝が、それぞれ形成されており、これらを螺合させることにより、ゴム栓２２１が底板部２２３（平板部２２５）と密着した状態で固定される。

［Ｓ３］製造容器を密閉する工程
まず、水性液体１０が注入された容器本体２１の空隙部１１を、ガス３でパージした後、蓋２２を容器本体２１の開口部（瓶口）に挿着する（図１９（ａ）に示す状態）。これにより、製造容器２０内に水性液体１０とガス３とが密閉される。

図１９（ａ）に示す状態において、ゴム栓２２１のマークＸに、ガス３が充填された注射器の注射針を刺通して、注射針を底板部２２３の貫通孔２２４に挿通させる。その後、注射器から製造容器２０内にさらにガス３を加えて、製造容器２０内を加圧した後、ゴム栓２２１から注射針を抜く。

次に、締付部２２２を回して、締付部２２２を底板部２２３に締め付ける（図１９（ｂ）に示す状態）。締付部２２２を底板部２２３に締め付けることにより、ゴム栓２２１が、底板部２２３に対して回転（例えば、１８０°回転）しながら、底板部２２３側に圧縮される。そのため、平面視における、注射針の刺通によりゴム栓２２１に形成された貫通孔２２７の位置と底板部２２３の貫通孔２２４の位置とがずれる（図１９（ｂ）参照）。これにより、底板部２２３の貫通孔２２４がゴム栓２２１により閉じられ、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる。

本実施形態では、製造容器２０の内部と外部とを連通する部分が存在しないため、製造容器２０内の密閉性を向上させることができる。製造容器２０内の密閉性が向上することにより、最終的に得られるバブル含有容器では、バブル１が水性液体１０中により安定的に存在することができる。すなわち、バブル含有容器の長期保存性がより向上する。

上述したように、締付部２２２を底板部２２３に締め付けることにより、ゴム栓２２１は底板部２２３側に圧縮される。締付部２２２を底板部２２３に締め付ける前の状態におけるゴム栓２２１の厚さをｔ_１（ｍｍ）とし、締付部２２２を底板部２２３に締め付けた状態におけるゴム栓２２１の厚さをｔ_２（ｍｍ）としたとき、ゴム栓２２１の圧縮率（（ｔ_１−ｔ_２）／ｔ_１×１００）は、５〜６０％であるのが好ましく、１０〜３０％であるのがより好ましい。これにより、締付部２２２の締付けによるゴム栓２２１への負荷を抑えつつ、ゴム栓２２１と底板部２２３との密着性をより向上させることができる。その結果、製造容器２０内の密閉性をより向上させることができる。

本実施形態においても、製造容器２０内に均一なサイズのバブル１を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズのバブル１を多量に含有する製造容器２０（バブル含有容器）が得られる。

かかる第１３実施形態のバブルの製造方法によっても、前記第１〜第１２実施形態のバブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。

以上、本発明のバブルの製造方法およびバブル製造用容器を図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明は、これに限定されるものではなく、各工程は、同様の機能を発揮し得る任意の工程と置換することができる。
例えば、前記第１〜第１３実施形態の任意の構成を組み合わせることもできる。

ここで、製造容器２０内に封入するガス３の容量および製造容器２０の回転数が、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量に与える影響を解明するために、以下の実験を行った。

（実施例１）
まず、製造容器２０の回転数と、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量との関係を調べた。

（バブルの製造方法）
［準備工程］
まず、アルブミンが２５０ｍｇ／ｍｌ含まれるアルブミン溶液（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ社製 アルブミナー２５％）を１２０μｌ準備するとともに、２５％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１２ｍｌ準備した。また、１５ｍｌのバイアル瓶（高さＸ：５０ｍｍ、外径Ｒ：２５ｍｍ）を準備した。なお、このバイアル瓶は、図４に示す製造容器２０と同様の形状をなしている。

［水性液体を容器に注入する工程］
準備したバイアル瓶内に、アルブミン溶液と２５％リン酸緩衝生理食塩水とを全量注入した。なお、アルブミン溶液と２５％リン酸緩衝生理食塩水とを混合してなる水性液体の液面の高さＹは、２５ｍｍであった。

［容器を密閉する工程］
次に、水性液体が注入されたバイアル瓶内の空隙をパーフルオロブタンでパージした後、バイアル瓶の瓶口に図４に示す蓋２２と同様の形状の蓋を挿着した。次に、パーフルオロブタンが充填された注射器を準備した。注射器の注射針で蓋のゴム栓を刺通して、注射器からバイアル瓶内にさらに２ｍｌのパーフルオロブタンを加えた。これにより、内部の圧力が２ａｔｍの密閉バイアル瓶を得た。

［容器を振動させる工程］
次に、上記の密閉バイアル瓶を２つ準備した。ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（高速細胞破砕システム）を用いて、一方の密閉バイアル瓶を回転数５０００ｒｐｍで３０秒間振動させ、他方の密閉バイアル瓶を回転数６５００ｒｐｍで３０秒間振動させた。その際、密閉バイアル瓶は、上下方向に往復運動し、水性液体がバイアル瓶の上下面に繰り返し衝突することを確認した。なお、密閉バイアル瓶を振動させる際に、密閉バイアル瓶の長手方向（鉛直方向）の振動幅は、４０ｍｍであり、密閉バイアル瓶の短手方向（水平方向）の振動幅は、２０ｍｍであった。上記条件に設定することにより、いずれのバイアル瓶についても、バイアル瓶と水性液体との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるようにした。

［容器を静置させる工程］
振動後、密閉バイアル瓶を静置させ、バブル含有容器を得た。

（バブル径分布測定）
上記のようにして得られたバブル含有容器から、バブルを含有する水性液体（バブル含有液）を注射器で取出した、次に、バブル測定装置（ナノ粒子解析システム ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を用いて、水性液体に含まれるバブルのバブル径分布測定を行った。その結果を、図２０に示す。

図２０（ａ）は、５０００ｒｐｍおよび６５００ｒｐｍの回転数でバブルを製造した時のバブルのバブル径分布を示すグラフである。図２０（ｂ）は、図２０（ａ）に示すグラフにおいて、横軸が０〜７００ｎｍの範囲である部分拡大図である。

図２０（ａ）に示すように、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させることにより、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合に比べて、水性液体中のバブルの含有量を大幅に多くすることができた。特に、径が６００ｎｍ程度よりも小さいバブルの含有量は、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合に比べて、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合の方が、３〜５倍以上多くなった。

密閉バイアル瓶の回転数が５０００ｒｐｍの場合でも、その振動時間を長くすることにより、水性液体中のバブルの含有量をある程度多くすることはできる。ただし、回転数が６５００ｒｐｍの場合のバブルの含有量に比べると少ない。

また、図２０（ｂ）に示すように、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合には、径が１００〜１５０ｎｍ程度の極小のバブルを多量に生成させることができた。

以上の結果は、以下のような作用・効果によるものと考えられる。すなわち、密閉バイアル瓶の回転数に応じて、水性液体とバイアル瓶とが衝突する際に生じる衝撃波の圧力の大きさが変化する。この衝撃波の圧力の大きさが、水性液体中に生成されるバブルの径および含有量を決定する大きな要因となっている。一般的な攪拌子を用いた攪拌や、５０００ｒｐｍよりも小さい回転数での振動では、このような衝撃波が発生しない、または、発生したとしても発生量がわずかである。そのため、本願発明のように十分に小さい径を有するバブルを、十分な含有量で水性液体中に生成させることはできない。

図２１は、図２０（ａ）に示すバブル径分布のグラフを解析した結果である。
図２１（ａ）は、密閉バイアル瓶の回転数とバブルの平均径との関係を示すグラフである。図２１（ｂ）は、密閉バイアル瓶の回転数とバブルの含有量との関係を示すグラフである。

図２１（ａ）に示すように、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合には、生成されるバブルの平均径は、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合に比べて、８０ｎｍ程度小さくなった。また、図２１（ｂ）に示すように、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合には、生成されるバブルの含有量は、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合に比べて、９×１０^７個（ｐａｒｔｉｃｌｅ）／ｍｌ程度小さくなった。この結果からも、密閉バイアル瓶を６５００ｒｐｍで振動させた場合に、密閉バイアル瓶を５０００ｒｐｍで振動させた場合よりも、小さい径のバブルを多量に生成することができることが分かった。

（実施例２）
次に、製造容器２０内に封入するガス３の容量と、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量との関係を調べた。

（バブルの製造方法）
実施例１の容器を密閉する工程において、バイアル瓶内に封入するパーフルオロブタンの容量を、０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌ、２ｍｌにそれぞれ変更した４つの密閉バイアル瓶を準備した以外は、前記実施例１と同様にしてバブル含有容器を得た。

なお、各密閉バイアル瓶について、封入するガス（パーフルオロブタン）の容量（ｍｌ）、密閉バイアル瓶内の圧力（ａｔｍ）および容器を振動させる工程における密閉バイアル瓶の回転数（ｒｐｍ）を、下記表１に示す。

（バブル径分布測定）
実施例１と同様にして、得られた各バブル含有容器内のバブル含有液のバブル径分布測定を行った。得られたバブル径分布のグラフを解析した結果を、図２２に示す。

図２２（ａ）は、密閉バイアル瓶内に封入されるガスの容量とバブルの平均径との関係を示すグラフである。図２２（ｂ）は、密閉バイアル瓶内に封入されるガスの容量とバブルの含有量との関係を示すグラフである。

図２２（ａ）に示すように、密閉バイアル瓶を振動させる回転数が同じであっても、密閉バイアル瓶内の圧力を大きくすることによって、生成されるバブルの平均径が小さくなった。具体的には、密閉バイアル瓶内の圧力が２ａｔｍである場合には、生成されるバブルの平均径は、密閉バイアル瓶内の圧力が１．２ａｔｍである場合に比べて、１００ｎｍ程度小さくなった。

また、図２２（ｂ）に示すように、密閉バイアル瓶内の圧力を大きくすることによって、バブルの含有量が多くなった。特に、密閉バイアル瓶内の圧力が２ａｔｍである場合には、バブルの含有量は、密閉バイアル瓶内の圧力が１．２ａｔｍである場合に比べて、２倍以上多くなった。

密閉バイアル瓶内の圧力を大きくなることによって、水性液体とバイアル瓶とが衝突する際に生じる衝撃波の圧力が、生成されるバブルの径および含有量に大きく作用すると考えられる。そのため、密閉バイアル瓶を振動させる回転数が同じであっても、密閉バイアル瓶内の圧力に応じて、生成されるバブルの平均径が変化する。また、密閉バイアル瓶内の圧力を大きくなることによって、ガスが水性液体中に多量に取り込まれる。そのため、前述したような衝撃波の作用により、水性液体中に生成されるバブルの含有量を多くすることができた。

（実施例３）
（ＧＦＰ遺伝子を含有するナノバブルの製造方法）
［準備工程］
まず、前述した第１実施形態と同様に、１２０μｌのアルブミン溶液（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ社製 アルブミナー２５％）と、１２ｍｌの２５％リン酸緩衝生理食塩水を準備した。さらに、ＧＦＰ遺伝子を２μｇ準備した。また、１５ｍｌのバイアル瓶（高さＸ：５０ｍｍ、外径Ｒ：２５ｍｍ）を準備した。なお、このバイアル瓶は、図４に示す製造容器２０と同様の形状をなしている。

［水性液体を容器に注入する工程］
準備したバイアル瓶内に、アルブミン溶液と、２５％リン酸緩衝生理食塩水と、ＧＦＰ遺伝子とを全量注入した。なお、アルブミン溶液、２５％リン酸緩衝生理食塩水およびＧＦＰ遺伝子を混合してなる水性液体の液面の高さＹは、２５ｍｍであった。

［容器を密閉する工程］
次に、水性液体が注入されたバイアル瓶内の空隙をパーフルオロブタンでパージした後、バイアル瓶の瓶口に図４に示す蓋２２と同様の形状の蓋を挿着した。次に、パーフルオロブタンが充填された注射器を準備した。注射器の注射針で蓋のゴム栓を刺通して、注射器からバイアル瓶内にさらに２ｍｌのパーフルオロブタンを加えた。これにより、これにより、内部の圧力が２ａｔｍの密閉バイアル瓶を得た。

［容器を振動させる工程］
次に、上記の密閉バイアル瓶を、ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰｒｅｃｅｌｌｙｓを用いて、回転数７０００ｒｐｍで３０秒間振動させた。その際、密閉バイアル瓶は、上下方向に往復運動し、水性液体がバイアル瓶の上下面に繰り返し衝突することを確認した。なお、密閉バイアル瓶を振動させる際に、密閉バイアル瓶の長手方向（鉛直方向）の振動幅は、４０ｍｍであり、密閉バイアル瓶の短手方向（水平方向）の振動幅は、２０ｍｍであった。上記条件に設定することにより、バイアル瓶と水性液体との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるようにした。

［容器を静置させる工程］
振動後、密閉バイアル瓶を静置させ、バブル含有容器を得た。なお、バブルを含有する水性液体（バブル含有液）を注射器で取出し、バブル測定装置（ナノ粒子解析システム ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を用いて、バブルのサイズを確認した。その結果、バブルの平均径は、６００ｎｍであった。

＜細胞内への蛍光タンパク質発現遺伝子の導入の評価＞
脳血管周皮細胞（ペリサイト）（タカラバイオ株式会社製 製品コード：Ｃ−１２９８０）を培養したシャーレーに、実施例３で得られた０．２μｇの水性液体を添加し、脳血管周皮細胞培地を得た。なお、ペリサイトは、遺伝子導入が非常に難しい細胞として知られている。

このような脳血管周皮細胞培地を４サンプル準備した。これらのサンプルに対して、周波数：１．０ＭＨｚの超音波（正弦波、パルス繰り返し周波数（ＰＲＦ）：１００Ｈｚ、デューティー比（ＤＣ）：１０％）を以下の出力で６０秒間照射した。

［照射出力］
０．６Ｗ／ｃｍ^２、０．８Ｗ／ｃｍ^２、０．９Ｗ／ｃｍ^２、１．０Ｗ／ｃｍ^２
その後、３７℃において４８時間にわたって脳血管周皮細胞培地を培養させた後の各サンプルを蛍光顕微鏡で観察した。

図２３は、３７℃において４８時間培養させた脳血管周皮細胞培地の蛍光顕微鏡画像であり、図２３（ａ）は、照射強度：０．６Ｗ／ｃｍ^２で超音波照射したサンプルの画像であり、図２３（ｂ）は、照射強度：０．８Ｗ／ｃｍ^２で超音波照射したサンプルの画像である。また、図２４は、３７℃において４８時間培養させた脳血管周皮細胞培地の蛍光顕微鏡画像であり、図２４（ａ）は、照射強度：０．９Ｗ／ｃｍ^２で超音波照射したサンプルの画像であり、図２４（ｂ）は、照射強度：１．０Ｗ／ｃｍ^２で超音波照射したサンプルの画像である。

図２３（ａ）、（ｂ）および図２４（ａ）、（ｂ）に示すように、いずれの照射出力で超音波照射されたサンプルにおいても、緑色に発色した領域が確認された。これは、各サンプルにおいて、脳血管周皮細胞内で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が発現していることを示している。したがって、いずれのサンプルにおいても、超音波照射によってバブルが破裂し、バブルに包含されたＧＦＰ遺伝子が脳血管周皮細胞内に導入されたことが示された。

次に、水性液体１０の種類と、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量との関係を調べた。

（実施例４）
（バブルの製造方法）
［準備工程］
まず、水性液体としての蒸留水を１２ｍｌ準備した。また、１５ｍｌのバイアル瓶（高さＸ：５０ｍｍ、外径Ｒ：２５ｍｍ）を準備した。なお、このバイアル瓶は、図４に示す製造容器２０と同様の形状をなしている。

［水性液体を容器に注入する工程］
準備したバイアル瓶内に、蒸留水（水性液体）を注入した。なお、水性液体の液面の高さＹは、２５ｍｍであった。

次に、バイアル瓶内に充填するガスとして、パーフルオロプロパンを用いて［容器を密閉する工程］を行った後、前記第１実施形態と同様に、［容器を振動させる工程］および［容器を静置させる工程］を行うことにより、バブル含有容器を得た。

（実施例５）
蒸留水を１ｗ／ｖ％のデキストラン水溶液に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例６）
蒸留水を１００％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例７）
蒸留水をソルデム３Ａ輸液（テルモ株式会社製）に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例８）
蒸留水をソルデム１輸液（テルモ株式会社製）に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例９）
蒸留水を生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％ＮａＣｌ水溶液）に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例１０）
蒸留水を０．２５ｗ／ｖ％のアルブミン水溶液に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例１１）
蒸留水を２０ｗ／ｖ％のグルコース水溶液に変更した以外は、前記実施例４と同様にして、バブル含有容器を得た。

（バブル径分布測定）
上記のようにして得られた実施例４〜実施例１１のバブル含有液に対して、前記第１実施形態と同様にして、バブル径分布測定を行った。その結果を、図２５に示す。

図２５は、実施例４〜１１で得られたバブルのバブル径分布を示すグラフである。
図２５に示すように、水性液体中の水の濃度が高いほど、生成されるバブル１の径が小さくなるとともに、その生成量が多くなる傾向があることが分かった。特に、水性液体として蒸留水を用いた実施例４では、そのバブルの平均径が１００ｎｍ程度であり、また、バブル含有液中に生成されるバブルの含有量が２７×１０^６個／ｍｌ程度となった。より具体的には、実施例４では、バブル径が１００ｎｍ程度のバブルが最も多く生成された。さらに、実施例４では、１００ｎｍをピーク中心として、０〜２００ｎｍ程度のバブル径を有するバブルが生成された。
また、水性液体として、ソルデム３A輸液を用いた実施例７およびソルデム１輸液を用いた実施例８では、実施例４に比べて、生成されるバブルの数が少なかったが、実施例４と類似した形状のバブル径分布が得られた。
一方、水性液体として、２０ｗ／ｖ％のグルコース水溶液を用いた実施例１１では、２００ｎｍ程度のバブル径を有するバブルが最も多く生成された。また、実施例１１で得られたバブルは、そのバブル径分布が広く、１００〜４００ｎｍ程度のバブル径を有していた。さらに、水性液体として、０．２５％アルブミンを用いた実施例１０では、１００〜５００ｎｍ程度のバブル径を有するバブルが均等に生成された。
また、実施例４〜１１のバブル含有液は、いずれも、５００ｎｍよりも大きいサイズのバブルがほとんど存在しなかった。そのため、このようなバブル含有液を超音波造影剤として用いることにより、解像度が高く、高精細な画像を得ることができる。

次に、ガス３の種類と、水性液体１０中に生成されるバブル１の径および含有量との関係を調べた。

（実施例１２）
前記実施例４において、蒸留水を生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％ＮａＣｌ水溶液）に変更して、［準備工程］および［水性液体を容器に注入する工程］を行った。次に、バイアル瓶内に充填するガスとして、空気を用いて［容器を密閉する工程］を行った後、前記第１実施形態と同様に、［容器を振動させる工程］および［容器を静置させる工程］を行うことにより、バブル含有容器を得た。

（実施例１３）
空気をエチレン（Ｃ_２Ｈ_４）に変更した以外は、前記実施例１２と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例１４）
水素をエチレン（Ｃ_２Ｈ_４）に変更した以外は、前記実施例１３と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例１５）
水素をエタン（Ｃ_２Ｈ_６）に変更した以外は、前記実施例１３と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例１６）
水素をメタン（ＣＨ_４）に変更した以外は、前記実施例１３と同様にして、バブル含有容器を得た。

（実施例１７）
水素を亜酸化窒素（Ｎ_２Ｏ）に変更した以外は、前記実施例１３と同様にして、バブル含有容器を得た。

（バブル径分布測定）
上記のようにして得られた実施例１２〜実施例１７のバブル含有液に対して、前記第１実施形態と同様にして、バブル径分布測定を行った。その結果を、図２６に示す。

図２６は、実施例１２〜１７で得られたバブルのバブル径分布を示すグラフである。
図２６に示すように、バイアル瓶内に封入するガスの種類を変更することにより、バブルの生成量が変化した。バイアル瓶内に封入されるガスがエチレンである場合（実施例１２）、封入されるガスとして空気を用いる場合（実施例１４）に比べて、バブル生成量が２倍程度多くなった。また、特に、ガスとして水素やエタンを用いた実施例１３および１５では、バブル生成量が多くなることが分かった。
次に、図１７に示す製造容器２０を用いて生成されるバブル１の径および含有量を調べた。

（実施例１８）
（バブルの製造方法）
［準備工程］
まず、前述した第１実施形態と同様に、１２０μｌのアルブミン溶液（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ社製 アルブミナー２５％）と、１２ｍｌの２５％リン酸緩衝生理食塩水とを準備した。また、図１７に示す製造容器２０（上部本体部の長さ：２３．８２ｍｍ、上部本体部の内径：１０．２６ｍｍ、下部本体部の長さ２０ｍｍ、下部本体部の内径：５．９ｍｍ）を準備した。

［水性液体を容器に注入する工程］
準備した製造容器内に、アルブミン溶液と、２５％リン酸緩衝生理食塩水とを全量注入した。なお、アルブミン溶液および２５％リン酸緩衝生理食塩水を混合してなる水性液体の液面の高さは、製造容器２０の底面から２５ｍｍであった。

［容器を密閉する工程］
次に、水性液体が注入された製造容器２０の瓶口（開口部）に図１７に示す蓋２２と同様の形状の蓋を挿着した。これにより内部の圧力が１ａｔｍの密閉容器（密閉された製造容器２０）を得た。

［容器を振動させる工程］
次に、上記の密閉容器を２つ準備した。一方の密閉容器（製造容器２０）にのみ、１３．５ｇの錘部５を取り付けた。これら２つの密閉容器を、ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰｒｅｃｅｌｌｙｓを用いて、回転数６５００ｒｐｍで３０秒間振動させた。その際、密閉容器は、上下方向に往復運動し、水性液体が密閉容器の上下面に繰り返し衝突することを確認した。なお、密閉容器を振動させる際に、密閉容器の長手方向（鉛直方向）の振動幅は、４０ｍｍであり、密閉容器の短手方向（水平方向）の振動幅は、２０ｍｍであった。上記条件に設定することにより、製造容器２０と水性液体との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるようにした。

［容器を静置させる工程］
振動後、密閉容器を静置させ、バブル含有容器を得た。

（実施例１９）
前記実施例１８と同様にして、図１７に示す製造容器２０にアルブミン溶液および２５％リン酸緩衝生理食塩水からなる水性液体を注入した。
その後、前記実施例１２と同様にして製造容器２０内に空気を充填して［容器を密閉する工程］を行った。その後、前記実施例１８と同様に、［容器を振動させる工程］および［容器を静置させる工程］を行うことにより、バブル含有容器を得た。

（実施例２０）
空気をパーフルオロプロパンに変更した以外は、前記実施例１９と同様にして、バブル含有容器を得た。

（バブル径分布測定）
上記のようにして得られた実施例１８〜実施例２０のバブル含有液に対して、前記第１実施形態と同様にして、バブル径分布測定を行った。また、実施例１８〜２０で得られたバブル含有液を、注射器を用いてプレパラートに数滴垂らし、光学顕微鏡で観察した。その結果を、図２７および２８に示す。

図２７（ａ−１）は、実施例１８の錘無しの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。図２７（ａ−２）は、実施例１８の錘有りの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。図２７（ｂ−１）は、実施例１９の錘無しの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。図２７（ｂ−２）は、実施例１９の錘有りの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。
また、図２８（ａ−１）は、実施例２０の錘無しの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。図２８（ａ−２）は、実施例２０の錘有りの容器を用いて得られたバブルの顕微鏡像およびバブル径分布グラフである。
なお、図２７および２８に示すバブル径分布グラフの横軸は、測定されたバブルの径を示し、横軸の左側から右側へと径が大きくなる。横軸の最も左側の棒グラフが、平均径１μｍ以下のバブルの量を示している。
図２７および２８に示すように、実施例１８〜２０のいずれの実施例においても、錘を取り付けた容器を用いた場合に、バブル生成量が多くなった。特に、径の小さいバブル（径：１μｍ以下）の生成量が顕著に多くなることが分かった。また、図２７（ｂ−２）と図２８（ｃ−２）との比較から、容器内に封入するガスとしてパーフルオロプロパンを用いることにより、ガスとして空気を用いる場合よりも、より径の小さいバブルの生成量が多くなることが分かった。したがって、図１７に示すような、一部に錘が取り付けられた製造容器を用いることにより、径の小さいバブル（１μｍ以下のバブル）を効率良く製造することができることが分かった。

本発明によれば、容器を所定の回転数で振動させるだけで、水性液体中に均一なサイズのバブルを多量に安定的に生成することができる。このようにして得られたバブルは、医療、食品、魚介類の養殖、排水処理等の様々な分野に用いることができる。したがって、本発明のバブルの製造方法は、産業上の利用可能性を有する。

Claims (10)

1. 水性液体を、長尺状をなす容器の所定の高さまで注入する工程と、
   前記水性液体が前記容器の内面に繰り返し衝突するように、５０００ｒｐｍ以上の回転数で前記容器を振動させる工程とを有し、
   前記容器を振動させる工程は、前記容器を、該容器の長手方向への往復運動または主として前記長手方向への回転運動によって振動させるように行われ、
   前記容器の高さをＸ（ｍｍ）としたとき、前記容器の長手方向の振動幅は、０．７Ｘ〜１．５Ｘ（ｍｍ）であることを特徴とするバブルの製造方法。
2. 前記容器を振動させる工程は、前記容器内を１．０ａｔｍより大きい圧力にした状態で行われる請求項１に記載のバブルの製造方法。
3. 前記容器を振動させる工程は、さらに、前記容器を、該容器の短手方向への往復運動または主として前記短手方向への回転運動によって振動させるように行われる請求項１または２に記載のバブルの製造方法。
4. 前記容器の前記短手方向の振動幅は、０．３Ｘ〜０．８Ｘ（ｍｍ）である請求項３に記載のバブルの製造方法。
5. 前記容器を密閉した状態において、所定のガスを前記容器に注入する工程をさらに有する請求項１ないし４のいずれかに記載のバブルの製造方法。
6. 前記所定の高さは、前記水性液体が注入された前記容器を水平に静置した状態において、前記容器の高さをＸ（ｍｍ）とし、前記容器における前記水性液体の液面の高さをＹ（ｍｍ）としたとき、０．２≦Ｙ／Ｘ≦０．７の関係を満足する請求項１ないし５のいずれかに記載のバブルの製造方法。
7. 前記容器を振動させる工程後、前記容器内の圧力を変化させた後に、５０００ｒｐｍ以上の回転数で前記容器を再振動させる工程をさらに有する請求項１ないし６のいずれかに記載のバブルの製造方法。
8. 前記容器を再振動させる工程は、前記圧力を、前記容器を振動させる工程における前記圧力よりも１〜１０ａｔｍ高くなるように行われる請求項７に記載のバブルの製造方法。
9. 前記容器を再振動させる工程は、前記容器を振動させる工程における前記回転数と異なる回転数で行われる請求項７または８に記載のバブルの製造方法。
10. 前記水性液体は、アルブミンを含む請求項１ないし９のいずれかに記載のバブルの製造方法。

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