WO2015020210A1 - 溶血性レンサ球菌診断イムノクロマト試薬、キット及び検出方法 - Google Patents

溶血性レンサ球菌診断イムノクロマト試薬、キット及び検出方法 Download PDF

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acid
nitrite
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佑弥 加藤
久彦 岩本
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    • G01N2400/14—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar alpha-D-Glucans, i.e. having alpha 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. pullulan
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    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Definitions

  • the present invention relates to a treatment liquid and a detection method.
  • the present invention relates to an inspection method that improves inspection efficiency and inspection accuracy by generating nitrous acid necessary for extraction of polysaccharides necessary for streptococcal inspection on an inspection device without using ergonomic preparation each time.
  • immunochromatographic strip-type immunoassays are versatile as simple in-vitro diagnostic kits or portable diagnostic devices that detect the detection target (antigen, etc.) in a sample solution using the specific reactivity of antibodies.
  • detection target antigen, etc.
  • interest has been increased for a simple test tool based on an immunochromatography method for examining the presence or absence of infection with pathogens such as influenza viruses and bacteria, and research and development have been promoted.
  • Diagnosis of hemolytic streptococci (hereinafter also referred to as “streptococcus”) is performed by examining a group-specific polysaccharide as an antigen.
  • methods for extracting polysaccharides methods using enzymes, phages, hydrochloric acid, hypochlorous acid and the like are known, but extraction methods using nitrous acid are the most common.
  • the extraction method using nitrous acid is advantageous in that it has high extraction efficiency of saccharide polysaccharides and low price and easy handling, but nitrous acid itself is an unstable and easily decomposed compound.
  • nitrous acid itself is an unstable and easily decomposed compound.
  • sodium nitrite and an organic acid such as acetic acid must be mixed to prepare nitrous acid each time.
  • preparing nitrous acid each time is a heavy burden on doctors and laboratory technicians.
  • a mixing step is included, there is a possibility that correct and safe diagnosis cannot be performed due to mixing errors of reagents.
  • Patent Document 1 in a method for extracting a polysaccharide antigen from a living organism (in particular, Streptococcus A group or B group), a. A first absorbent material impregnated with a measured amount of nitrite and dried; b. A second absorbent material that is soaked and dried with a measured amount of neutralizing base and buffer, c. A simplified extraction method using a kit in which a measured amount of an acid aqueous solution is combined has been proposed (see Patent Document 1).
  • Patent Document 2 discloses an analysis apparatus and method for detecting carbohydrate antigens characteristic of microorganisms / bacterial organisms such as Streptococcus.
  • a. A sample receiving zone b. Extraction zone (extraction reagent; acid and nitrite immobilized or absorbed and dried), c. Neutralizing agent (neutralizing buffer; TRIS), d.
  • An apparatus including a substrate having a detection zone (capture / detection reagent) is provided (see Patent Document 2).
  • the first organism is a gram positive bacterium, such as A, B, F, or G group streptococci, enterococcus bacteria, etc.
  • the second organism is a virus, gram negative bacteria, or the like.
  • a method or kit for measuring a plurality of different species in a sample such that in one or more containers a. Nitrous acid or dried acid and nitrite b. A surfactant, c. A first binding reagent that binds to a first marker obtained from a first organism; d.
  • test efficiency can be doubled and pain associated with patient examination can be reduced. Reduction has been achieved (see Patent Document 3).
  • Some analytical devices and methods for detecting carbohydrate antigens characteristic of microorganisms / bacterial organisms such as Streptococcus are already on the market.
  • Quick View DipStick There are Strep A (DS Pharma Biomedical), Strep A Test Pack Plus OBC (Sanwa Chemical Research Laboratories), etc.
  • a Strept AD “Seiken” (Denka Seiken) is known as a slide latex agglutination reagent. Yes.
  • the direct method requires that the concentration of streptococci is 1 ⁇ 10 6 CFU / mL or more in order to be judged positive in the test of the specimen.
  • immunochromatographic test agents in which antibodies are labeled with an insoluble carrier are generally compared with EIA when they are less than 1 ⁇ 10 6 CFU / mL, even though they are positive. Since the sensitivity is low, the line that is observed in the case of positive is not clear, and furthermore, it is determined to be positive even though there is no object to be detected (antigen etc.) in the sample liquid. There is a problem that so-called false positive occurs.
  • a method of causing a sugar or a water-soluble polymer compound to exist in a developing solvent has been proposed.
  • at least one aggregation inhibitor such as saccharides, for example, monosaccharides, oligosaccharides and their sugar alcohols, and polyhydric alcohols in the latex composition
  • a latex composition for immunoassay containing a protein and a basic buffer and having a pH of 9.0 to 9.8 natural aggregation of latex particles is prevented, and specific gravity and viscosity are prevented. Therefore, it is possible to perform highly sensitive immunoassay by preventing an increase in osmotic pressure (see Patent Document 4).
  • HbA1c hemoglobin A1c
  • a measurement sample containing erythrocytes is treated with a surfactant to expose the N-terminus of the hemoglobin ⁇ chain on the protein surface, and
  • the obtained sample is washed with water.
  • a cyclic polysaccharide in an insoluble state for example, immobilized on a membrane or the like by chemical bonding.
  • the cyclic polysaccharide itself forms a polymer. Kneaded in a porous resin), and then (C) is obtained. There has been proposed a method in which the obtained sample is detected by bringing it into contact with an antibody or the like that recognizes the N-terminus of hemoglobin labeled with particles. By doing this, the antibodies do not aggregate and spread on the membrane, which is the reason why accurate measurement cannot be performed.
  • the cyclic polysaccharide comes into contact with water, the cyclic oligosaccharide molecules or cyclic molecules constituting the cyclic polysaccharide The polysaccharide molecules are prevented from dissolving in water and not diffusing (see Patent Document 5).
  • an immunochromatography method also referred to as “particle immunochromatography method” in which an antibody is labeled with an insoluble carrier (gold colloid particles, colored latex particles, etc.)
  • an insoluble carrier gold colloid particles, colored latex particles, etc.
  • the insolubility may still remain depending on the measurement sample, measurement environment, and measurement conditions.
  • the aggregation of the carrier occurs, a non-specific reaction may occur, and problems such as a slow development speed cannot be solved. Therefore, in the particle immunochromatography method using individual measurement samples, measurement environment, and measurement conditions, insoluble carrier aggregation does not occur, non-specific reaction does not occur, and search for a test agent with a high development speed has been eagerly desired. .
  • Japanese National Table No. 7-503543 Japanese National Table 2008-509384 Japanese National Table 2006-518990 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2007-315883 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2012-251789 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2009-36781
  • An object and problem of the present invention is to improve a sample extraction (dilution) solution (also referred to as “specimen treatment solution” or “development solution”) when testing Gram-positive bacteria, particularly streptococci, by immunochromatography.
  • the present invention provides a highly sensitive immunochromatographic test agent in which the color development in a negative sample in a development system is reduced and the color development in a positive sample is improved, that is, the S / N ratio is high, as compared with the prior art. There is.
  • the purpose of the present invention is to improve the development and extraction conditions when performing bacterial tests by immunochromatography, so that protein components present in the specimen or in the immunochromatographic device are denatured / precipitated (precipitation) during the development test.
  • the object is to provide a high-sensitivity and rapid development agent without causing it.
  • an object of the present invention is to improve the structure of the part to which the immunochromatography kit is attached when performing a bacterial test by the immunochromatography method, so that a sample (for example, a respiratory organ) can be obtained more quickly and accurately than in the prior art.
  • the Streptococcus test requires the extraction of polysaccharides with nitrous acid, and nitrite, which is an unstable compound, requires a complicated process of providing a nitrous acid production process in which nitrite is reacted with an acidic solution each time the test is performed.
  • the object of the present invention is to provide a simple and highly sensitive sample extract for immunochromatography (hereinafter referred to as “highly sensitive S / N ratio”) capable of rapid diagnosis of group A ⁇ -hemolytic streptococci, which is one of respiratory infections. , Also referred to as “sample diluent”), to provide an immunochromatography reagent, an immunochromatography kit using the same, and a test method.
  • highly sensitive S / N ratio a simple and highly sensitive sample extract for immunochromatography
  • sample diluent also referred to as “sample diluent”
  • the present inventors When examining the bacteria with an immunochromatographic test agent, the present inventors include a cyclic oligosaccharide and / or nitrite in the sample extract to be used, or retain the organic acid in the immunochromatography kit.
  • test agent that does not cause aggregation of antibody-immobilized particle colloids and has high test accuracy (hereinafter referred to as “S / N ratio”) and a high development speed. Is the first time that the knowledge that the kill.
  • the present invention provides an immunoassay reagent, an immunoassay method, an immunochromatography kit, and the like that can be tested without precipitation even under extraction conditions.
  • the present invention provides a sample treatment solution, an immunoassay reagent, an immunoassay method, an immunochromatography detection method, an immunochromatography kit, and an immunochromatography method using the same, which are used in the immunochromatography method according to the following (1) to (19).
  • the immunoassay method of the present invention has the following characteristics.
  • a first feature of the present invention is an immunoassay method in which an antigen of a detection target in a specimen is extracted and detected with an extractant, and is performed in the presence of a cyclic oligosaccharide. ,It is in.
  • the second feature of the present invention resides in an immunoassay characterized in that the extractant is nitrous acid produced on the device by the reaction of an organic acid and a nitrite compound.
  • a third feature of the present invention resides in an immunoassay method characterized in that the cyclic oligosaccharide is ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin and derivatives thereof.
  • a fourth feature of the present invention resides in an immunoassay method wherein the nitrite compound is a nitrite.
  • a fifth feature of the present invention resides in an immunoassay method wherein the organic acid is an organic carboxylic acid.
  • a sixth feature of the present invention resides in an immunoassay method in which the pH condition for extraction is less than 7.0 to 6.5.
  • a seventh feature of the present invention resides in an immunoassay method in which the antigen is a polysaccharide.
  • the eighth feature of the present invention resides in an immunoassay method in which the detection target is a Gram-positive bacterium.
  • a ninth feature of the present invention resides in an immunoassay method in which the Gram-positive bacterium is a hemolytic streptococcus.
  • the reagent for immunoassay of the present invention has the following characteristics.
  • the tenth feature of the present invention resides in an immunoassay reagent containing a cyclic oligosaccharide, which is used in any of the immunoassays described above.
  • the immunoassay device of the present invention has the following characteristics.
  • An eleventh feature of the present invention resides in an immunochromatography apparatus for performing the immunoassay described in any of the above.
  • the immunochromatography kit of the present invention has the following characteristics. (12)
  • the twelfth feature of the present invention comprises an analyte extraction solution, a sample dropping unit, an antigen extraction unit, a labeling substance holding unit, a chromatographic medium having a detection unit, and an absorption unit, and antigen extraction.
  • An immunochromatography kit for detecting an object to be detected in a specimen in which an organic acid is held in a part wherein either or both of a specimen diluent and / or a sample dropping part are provided with a cyclic oligosaccharide or a nitrite compound
  • the immunochromatography kit is characterized by containing a cyclic oligosaccharide and a nitrous acid compound by containing any one or more of a mixture thereof.
  • the thirteenth feature of the present invention resides in an immunochromatography kit, wherein the cyclic oligosaccharide is contained in an amount of 0.1 to 5 ⁇ g per immunochromatography kit.
  • the fourteenth feature of the present invention resides in an immunochromatography kit, wherein the cyclic oligosaccharide is one or more of ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin or derivatives thereof.
  • the fifteenth feature of the present invention resides in an immunochromatography kit characterized by holding a nonionic surfactant together with an organic acid.
  • the sixteenth feature of the present invention resides in an immunochromatography kit, wherein the nitrite compound is a nitrite.
  • the seventeenth feature of the present invention resides in an immunochromatography kit characterized in that citrate is held together with citric acid in the antigen extraction part.
  • An eighteenth feature of the present invention resides in the immunochromatography kit according to any one of the above, wherein the detection target is a Gram-positive bacterium.
  • the immunochromatographic detection method of the present invention has the following characteristics.
  • the nineteenth feature of the present invention resides in an immunochromatography kit used for performing the immunoassay described in any of the above. The present invention has been able to achieve the object by providing the above-described features.
  • a group existing in the cell surface of Gram-positive bacteria in particular, streptococci (groups A to U), using nitrous acid generated in advance during contact mixing of a measured amount of a nitrite compound and an organic acid.
  • Simple and versatile test kits and tests that extract specific polysaccharides and test them using the polysaccharides as antigens, so that there is no need to mix reagents wrongly or to prepare nitrous acid each time. Is the method.
  • the detection system for streptococci using the immunochromatography kit of the present invention the cyclic oligosaccharide is added, so that protein components in the extract and the sample are not precipitated even under the extraction / development conditions, The sensitivity can be inspected quickly.
  • an immunochromatographic sample extract containing cyclic oligosaccharide also referred to as “specimen diluent”
  • protein precipitation does not occur during development and the antibody-immobilized gold colloid is used. It is possible to provide a test agent that is accurate and has a high development speed without causing aggregation of particles.
  • a cyclic oligosaccharide in another reagent holding part, for example, an antigen in a sample which is a specimen (particularly, nasal discharge, nasal wipe or sputum) collected from a patient with respiratory disease (For example, Gram-positive bacteria, especially bacteria such as Streptococcus, etc.) without causing denaturation and precipitation even under conditions where acid is retained in the reagent retaining part and nitrous acid is generated,
  • a sample which is a specimen (particularly, nasal discharge, nasal wipe or sputum) collected from a patient with respiratory disease
  • a respiratory disease for example, Gram-positive bacteria, especially bacteria such as Streptococcus, etc.
  • each time of the inspection it eliminates the complexity of the inspection by generating nitrous acid on the inspection device without preparing a complicated nitrous acid generation step for reacting nitrite with an acidic solution.
  • an inspection method with improved inspection efficiency and inspection accuracy can be achieved.
  • FIG. 1 is a diagram showing the immunochromatography kit of the present application.
  • FIG. 1A is a three-dimensional perspective view of an immunochromatography kit.
  • FIG. 1B is a plan view of the immunochromatography kit.
  • FIG. 2 is a diagram showing the behavior of changes in color development of negative and positive samples when various cyclodextrins (CD) are contained in the nitrous acid-containing part.
  • CD cyclodextrins
  • a target substance (antigen) to be detected in various specimens is reacted with a binding substance (antibody) that specifically binds various labels and is reacted on a chromatographic medium.
  • a binding substance antibody
  • This is based on an immunochromatography method or a detection method applying it, in which a complex is formed by an antibody reaction, developed on the immunochromatographic medium in the direction of the absorption site, and confirmed by various detection means.
  • an antibody that reacts and binds most specifically to the antigen for example, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or other known antibodies that specifically bind to the antigen can be arbitrarily used.
  • an enzyme As the label, an enzyme, a coloring substance, a fluorescent substance, a radioactive substance, or the like can be used arbitrarily, but in order to bring out the characteristics of the immunochromatography method, which is easy to operate and shortens the assay time, an antibody, It may be determined in consideration of the type of antigen.
  • the detection means is characterized in that it is easy to operate and can be determined in a relatively short time, and has the ability to be accurately determined by visual determination in order to represent the characteristic of the immunochromatography method.
  • various detection means such as spectrophotometric detection and radiation detection can be attached for detection.
  • sample treatment solution also referred to as “sample treatment solution”
  • immunoassay reagent also referred to as “sample treatment solution”
  • immunochromatography detection method also referred to as “sample detection method”
  • immunochromatography kit that can be used in the immunochromatography method of the present invention is sequentially explained. To do.
  • the immunoassay reagent of the present invention is a reagent used for immunoassay, and is used by being contained in a sample diluent (6) (also referred to as “sample treatment solution” or “sample extract”). And / or a reagent that is contained and held in the sample dropping unit (2) (also referred to as a reagent holding unit (2)).
  • the reagent holding part (3) also referred to as “antigen extraction part” (3)
  • the labeling substance holding part (4), and the chromatographic medium (1) contain at one or more of these sites. You may hold it.
  • the organic acid-containing antigen extraction part (reagent holding part (3)), labeling substance holding part (4), chromatographic medium (1) , And the property of sequentially moving and expanding to the absorption part (5).
  • either or both of the sample diluent (6) and the reagent holding part (2) contain the cyclic oligosaccharide and the nitrite compound alone or simultaneously.
  • the cyclic oligosaccharide and nitrite compound forming the immunoassay reagent are contained in the sample extract and are present in the sample dropping part (reagent holding part (2)) include the following.
  • nitrite compound abbreviated as “sublimation”
  • ring o cyclic oligosaccharide
  • Examples such as Examples of possible embodiments (patterns) each containing a dilute and ring o compound in the sample dilution solution (sample treatment solution) (6); the sample dropping unit (reagent holding unit (2)), respectively.
  • Pattern Sample diluent (extract) part (6) Sample dropping part (2) 1 No sublimation / ring o 2 Sublimation ring o 3 Ring o sublimation 4 Sublimation / ring o No 5 Sublimation / ring o Sublimation / ring o 6 Sublimation / ring o Sublimation 7 Sublimation Sublimation / ring O 8 ring o sublimation / ring o 9 sublimation / ring o ring o The present invention can be implemented according to the above-described embodiment (pattern).
  • the reagent state of the sample dropping part (reagent holding part (2)) includes a solution state and a state of being held on the dropping pad by freeze drying or the like.
  • the content of the cyclic oligosaccharide constituting the immunoassay reagent of the present invention is 0.1 to 5 ⁇ g / test per immunochromatography kit.
  • the nitrite compound of the present invention is preferably a nitrite, which generates nitrous acid by reacting with an acid and is inorganic if it does not adversely affect the inspection in the inspection device system.
  • Nitrites such as sodium nitrite, potassium nitrite, calcium nitrite, magnesium nitrite and the like, organic nitrite compounds such as methyl nitrite, ethyl nitrite, butyl nitrite, amyl nitrite and the like
  • the nitrite compound contained in this immunoassay reagent is 10 to 100 ⁇ mol / test, preferably 20 to 80 ⁇ mol / test.
  • the cyclic oligosaccharide used in the present invention is not particularly limited as long as it is an oligosaccharide having a structure in which D-glucose and / or a derivative thereof are cyclically connected by ⁇ (1 ⁇ 4) glucoside bond.
  • cyclodextrins such as ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, hydroxyalkylated cyclodextrin, sulfoalkylated cyclodextrin, monochlorotriazinyl cyclodextrin, cluster cyclodextrin, ( ⁇ -, ⁇ - or ⁇ -) cyclodextrin derivatives such as modified cluster cyclodextrins, as well as water derivatives derived from cycloamylose, laurylated cycloamylose and cycloamylose in which about 20-50 glucoses are cyclically bound And cyclic glucans such as xylan.
  • the cyclic oligosaccharide generally has a specific structure in which the outside of the cyclic structure is hydrophilic and the inside of the cyclic structure is hydrophobic (lipophilic). Derived from the specific structure described above, cyclic oligosaccharides can be incorporated and complexed so as to enclose lipophilic molecules smaller than the internal diameter of the cyclic structure. It is also known that even if a molecule is larger than the inner diameter of the cyclic structure, if there is a lipophilic part smaller than the inner diameter of the cyclic structure, that part is taken into the inside of the cyclic oligosaccharide to be complexed.
  • a hydrocarbon functional group that is a lipophilic site in an organic acid molecule is incorporated into a cyclic oligosaccharide, and a detected substance in a sample, a protein component derived from another biological substance, or an additive in an immunochromatography kit Suppresses complex formation between protein components and organic acids, etc., and suppresses unsatisfactory development such as non-specific reactions resulting from the complex formation and slowdown of deployment due to complex precipitation or non-deployment. can do.
  • the cyclic oligosaccharide present in the immunoassay reagent of the present invention is ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin and derivatives thereof. It is preferable to use 0.02 to 0.5 ⁇ mol of cyclic oligosaccharide per test.
  • test sample in the present invention it is preferably used in a sample containing Gram-positive bacteria having a thick peptidoglycan layer.
  • Gram-positive bacteria having a thick peptidoglycan layer.
  • examples include staphylococci, streptococci, pneumococci, bacilli, anthrax, cereus, diphtheria, listeria, tetanus, botulinum and welsh.
  • the kit of the present invention is more preferably used among samples containing staphylococci, staphylococci, streptococci and pneumococci, and optimally used with streptococci.
  • Samples containing Gram-positive bacteria are only biological samples such as saliva, nasal discharge, nasal wipes, nasal aspirate, sputum, pharyngeal wipe, alveolar lavage, rectal wipe, stool suspension, urine, amniotic fluid, etc.
  • the sample may be a food extract, clean water, sewage waste water, culture solution, or the like, and is not particularly limited. This is useful when the causative bacteria contained in these specimens contain Gram-positive bacteria, particularly streptococci.
  • the detection system of the present invention which is characterized by adding a cyclic oligosaccharide, can be applied to any bacterium in which an antigen polysaccharide specific to the bacterium is extracted by the produced nitrous acid.
  • the Gram-positive bacterium for detection in the immunochromatography kit of the present invention is a hemolytic streptococcus.
  • the immunochromatographic detection of the present invention containing a cyclic oligosaccharide When the immunochromatographic detection of the present invention containing a cyclic oligosaccharide is performed, denaturation of highly viscous proteins contained in specimens such as nasal secretions or proteins present on a test device by organic acid or nitrous acid produced in the detection system ⁇ Prevents precipitation, does not cause reduction in development speed due to clogging of chromatographic pores, and further suppresses increase in viscosity due to high-viscosity proteins, etc., enabling rapid development without a reduction in sensitivity. Specimen detection is possible.
  • an immunoassay method of the present invention an immunoassay method characterized in that it is carried out in the presence of a cyclic oligosaccharide in detecting and detecting an antigen of a detection object in a sample with an extraction reagent.
  • This immunoassay is characterized by the fact that the extraction reagent is produced on the test device by the reaction between the organic acid and the nitrite compound, particularly in the organic acid-containing antigen extraction part (reagent holding part (3)). .
  • This organic acid is an organic carboxylic acid, but it is preferable to carry out an immunoassay by holding the following nonionic surfactant together with the organic acid.
  • the extraction reagent is based on nitrous acid produced by the reaction of an organic acid and a nitrite compound, and the extraction pH is preferably less than 7.0 to 6.5 for the following reasons.
  • the present invention is an extract having the specifications of common extract [1) enzyme, 2) added salt, 3) surfactant, 4) ionic liquid, 5) (nitrite production) catalyst, 6) nitrous acid].
  • common extract [1) enzyme, 2) added salt, 3) surfactant, 4) ionic liquid, 5) (nitrite production) catalyst, 6) nitrous acid].
  • the pH conditions under which nitrous acid is generated, and proteins such as casein and the like, and high-viscosity proteins contained in samples are included.
  • the pH conditions that do not precipitate are pH less than 7.0 to 6.5, preferably less than 7.0 to 6.6, and most preferably less than 7.0 to 6.8. If the pH condition is less than 7, the production of nitrous acid will not be reduced, and the extraction efficiency of the antigen will not be lowered, so that the detection sensitivity will not be lowered.
  • the pH condition due to nitrous acid generation is 6.5 or more, there is no possibility that proteins such as casein and the high-viscosity protein contained in the specimen will be precipitated, and the situation where detection cannot be performed can be avoided.
  • the immunochromatography kit of the present invention is designed to develop a sample under neutral to weakly acidic conditions in order to produce nitrous acid. In addition, it is designed to be able to test with extracts already used in other respiratory infections. However, since the component (casein) contained in the extract is precipitated under weakly acidic conditions, there is a problem that the development becomes uneven. In order to solve this problem, the present inventors have various compounds. To suppress the precipitation of components.
  • Common components of the antigen extract used in the present invention include nitrite compounds (nitrite, etc.), neutralization Can contain base (sodium hydroxide, etc.) or buffer (TRIS, etc.), and also has the effect of suppressing side reactions based on biological affinity and canceling hydrophobic bonds and electrical interactions Substances such as surfactants, ammonium salts, saccharides and pH buffering agents, and various additives for suppressing non-specific reactions, such as proteins or polymers for promoting antigen-antibody reactions or suppressing non-specific reactions A compound etc. can be contained.
  • FIG. 2 shows the effects of various compounds belonging to the category of the cyclic oligosaccharide on the developing solution and the behavior thereof.
  • the experiment conditions in FIG. 2 were as follows. Cyclodextrin (CD), which is a typical cyclic oligosaccharide, was added to each site containing nitrous acid (2; reagent holding part (2)). The test device containing each CD was evaluated with a negative / positive sample by holding it at .75 ⁇ g / test.
  • CD Cyclodextrin
  • ⁇ -cyclodextrin (abbreviated as “ ⁇ -CD”), amino- ⁇ -cyclodextrin (abbreviated as “Amino- ⁇ -CD”), 6-0- ⁇ -D-maltosyl- ⁇ -cyclodextrin Citrine: each CD having a molecular weight of 1459 (abbreviated as “m ⁇ -CD”) and ⁇ -cyclodextrin (abbreviated as “ ⁇ -CD”) was evaluated. The result is as shown in FIG.
  • FIG. 2 shows an inspection device that does not contain a CD and is evaluated by comparison.
  • the present invention aims to be able to inspect the protein components in the extract and the specimen without precipitation even under acidic conditions, and by repeating trial and error of adding various oligosaccharides, cyclic oligosaccharides are obtained.
  • CD cyclodextrin
  • the acid used in the extract system retained in the organic acid-containing antigen extraction unit (reagent holding unit (3)) of the present invention is one that reacts with a nitrite compound to produce nitrous acid, and is a test device system.
  • Organic acids such as acetic acid, tartaric acid, itaconic acid, oxalic acid, succinic acid, citric acid, glycolic acid, chloroacetic acid, fluoroacetic acid, benzoic acid and benzenesulfonic acid Etc.
  • an immobilized acid such as polysulfonic acid, polycarboxylic acid, polystyrene and polyacrylic acid, and is not limited at all.
  • An organic acid is preferable, and tartaric acid, itaconic acid or citric acid is preferable, and citric acid is most preferable. It is also possible to use a mixture of these.
  • the use ratio of acid and nitrite is in the range of 0.1 to 4:10 to 100 in terms of molar ratio.
  • Citric acid is preferably used in an amount of 0.1 to 4 ⁇ mol, more preferably 0.1 to 3 ⁇ mol per test.
  • Nitrite is preferably used in an amount of 10 to 100 ⁇ mol per test.
  • the cyclic oligosaccharide used in the present invention may be contained in a sample extract for immunochromatography (hereinafter also referred to as “development extract”) or a sample diluent (hereinafter also referred to as “sample treatment solution”). Well, it may be contained in other reagent holding parts in the immunochromatography kit, or may be contained in both of them, as long as the function of the cyclic oligosaccharide can be exhibited. It is preferable in terms of function to be contained in a certain sample processing solution or upstream of development.
  • an immunochromatographic detection method for detecting Gram-positive bacteria in a sample using the immunochromatography kit of the present invention (I) a step of bringing a specimen into contact with a specimen diluent containing a buffer and a surfactant to prepare a specimen diluent mixture; (Ii) supplying the sample treatment liquid mixture to the sample dropping unit; (Iii) A step of developing a sample treatment liquid mixture on an immunochromatographic medium, and extracting an antigen in a Gram-positive bacterium with nitrous acid generated on the medium by a reaction between an organic acid and a nitrite compound present in the antigen extraction part.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene / polyoxypropylene alkyl ether, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid.
  • Esters trade name “Tween” series
  • polyoxyethylene pt-octylphenyl ether trade name “Triton” series
  • polyoxyethylene pt-nonylphenyl ether trade name “Triton N” series
  • alkylpoly Examples include glucoside, fatty acid diethanolamide, and alkyl monoglyceryl ether.
  • the organic acid-containing antigen extraction part in the immunochromatography kit of the present invention requires a surfactant to make the development uniform, but the storage stability of the antigen extraction part is poor due to the inclusion of the surfactant. I know it will be.
  • a reagent having an antigen extraction part containing various surfactants was prepared and subjected to a severe test (80 ° C., 12 hours). As a result, polyoxyethylene pt-octyl was obtained.
  • the content of the nonionic surfactant used in the specimen diluent or immunochromatographic reagent of the present invention is in the range of 0.01 to 10% by weight, preferably in the range of 0.05 to 5% by weight.
  • an immunochromatographic reagent If it is 0.01% by weight or more, accurate determination is possible. If it is 0.05% by weight or more, non-specific reaction can be suppressed and accurate determination is possible. If it is 10% by weight or less, it has a favorable effect on the suppression of non-specific reactions and is economical.
  • Typical examples of salts used in immunochromatographic reagents such as the extract developing solution and the sample treatment solution of the present invention include sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride. Sodium chloride is preferred.
  • the concentration of the salt used in the immunochromatographic reagent such as the extraction developing solution of the present invention is in the range of 1 mM to 500 mM, preferably in the range of 5 mM to 200 mM, and more preferably in the range of 10 mM to 50 mM.
  • concentration is 1 mM or more, the protein extraction action is sufficient. If it is 500 mM or less, it is economical.
  • a salt used in the reagent for immunochromatography of the present invention not only one kind but also two or more kinds can be blended and used.
  • examples of the buffer include a phosphate buffer (phosphate + sodium phosphate), an acetate buffer (acetic acid + sodium acetate), a citrate buffer (citric acid + sodium citrate), and a borate buffer.
  • Tris-HCl buffer Tris (hydroxylmethyl) aminomethane + hydrochloric acid
  • TE buffer Tris + ethylenediaminetetraacetic acid
  • TAE buffer Tris + acetic acid + ethylenediaminetetraacetic acid
  • TBE buffer Tris + boric acid
  • HEPES buffer 2, [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid
  • Bicine buffer N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine buffer
  • two or more kinds of buffering agents can be used as long as they do not have an adverse effect, and are not limited at all.
  • the concentration of the buffer used in the present invention is preferably in the range of 10 to 500 mM, more preferably in the range of 10 to 300 mM, and further preferably in the range of 30 to 100 mM.
  • concentration is 10 mM or more, the buffering action is sufficient, and the suppression of protein component precipitation and the suppression of aggregation of labeled particles are also sufficient. If it is 500 mM or less, it is economical. Also, it is optimal to make a buffer having a pH range of 7.1 to 9.8.
  • the immunochromatographic reagent of the present invention includes additives known to suppress side reactions based on biological affinity or to suppress nonspecific reactions, such as promotion of antigen-antibody reactions or nonspecific reactions.
  • Protein for example, bovine serum albumin, gelatin and casein
  • polymer compounds for example, polyethylene glycol, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol and dextran
  • ionic surfactants or polyanions for example, It is possible and effective to add one or two or more of dextran sulfate, heparin, polystyrene sulfonic acid, chondroitin sulfate, etc.
  • antibacterial agent for example, bovine serum albumin, gelatin and casein
  • it is possible and effective to add one or two or more of dextran sulfate, heparin, polystyrene sulfonic acid, chondroitin sulfate, etc.
  • one or more of proteins, polymer compounds, ionic surfactants, polyanions, or antibacterial agents for promoting these antigen-antibody reactions or suppressing non-specific reactions are added to the stationary phase. It is possible and effective to keep it on the moving phase of the mobile phase on the chromatographic medium to be constructed, and it does not prevent anything.
  • the concentration of the additive contained in the immunochromatographic reagent composition of the present invention is preferably in the range of 0.01 to 20% by weight, more preferably in the range of 0.1 to 10% by weight, and 0.5 to A range of 5% by weight is more preferred. If it is 0.01% by weight or more, non-specific reaction can be suppressed and accurate determination can be made. If it is 20% by weight or less, it is economical.
  • the method for using the immunochromatographic reagent of the present invention can be optimally used as a developing solution, and can also be suitably used as a diluent for a specimen sample. Furthermore, it is not limited to said usage method, It can also be used in the aspect which provides the component of the reagent for immunochromatography on the movement path
  • a developing solution or a diluting solution water is usually used as a solvent, and a buffer solution, protein, salt and nonionic surfactant are added thereto. The order of addition is not particularly specified, and they can be added simultaneously.
  • a sample (specimen) to be detected and the solution mixed in advance can be supplied and dropped on a sample pad (sample dropping unit) for development. After the sample (specimen) is supplied / dropped on the sample pad (sample dropping portion), the developing solution may be supplied / dropped on the sample pad (sample dropping portion) for development.
  • the method can be applied, for example, to a sample pad (sample dropping site) in an immunochromatographic apparatus. Alternatively, it can be carried or held in the sample pad by a method of drying after impregnation.
  • an additive (reagent) holding part is provided at an arbitrary position between the end of the sample dropping part and the absorption part. And it can be set as the aspect held there. For example, it can be on the sample dropping part, the labeling substance holding part and the immunochromatographic medium.
  • the detection target of the present invention is not particularly limited as long as a substance that specifically binds to it, for example, a substance that specifically binds like an antigen-antibody reaction exists or can be produced. Even if the object to be detected is an antigenicity such as a complete antigen, or an antigenicity such as a hapten (incomplete antigen) is not a antigenic antigen, It may be something that you have.
  • the detection target of the present invention is a polysaccharide antigen specific to the detection target that can be extracted with the produced nitrous acid.
  • Gram-positive bacteria having a thick peptidoglycan layer can be mentioned.
  • cocci are preferable, and particularly preferable are bacterial antigens such as streptococcal antigens.
  • the optimal specimen of the present invention is nasal discharge, nasal wipe, pharyngeal wipe or sputum. These specimens are pre-diluted using the specimen diluent of the present invention, supplied onto the test device, and extracted to accurately detect streptococcal antigens collected from patients with respiratory diseases, etc. can do.
  • the immunochromatography kit of the present invention detects a gram-positive bacterium in a sample composed of a sample treatment liquid and an immunochromatographic medium having a sample dropping part, an antigen extraction part, a labeling substance holding part, a detection part and an absorption part.
  • a kit comprising an immunochromatographic medium for containing a cyclic oligosaccharide and / or a sample dripping part either or both of the cyclic oligosaccharide and the nitrite compound alone or simultaneously.
  • the immunochromatography kit includes an sugar and a nitrite compound, and has an antigen extraction site that generates nitrite by a reaction between the nitrite compound and an organic acid held in the antigen extraction section.
  • the content of cyclic oligosaccharide per immunochromatography kit is preferably 0.1 to 5 ⁇ g.
  • the organic acid-containing antigen extraction part (reagent holding part (3)) preferably holds citrate together with citric acid.
  • a test kit used for an immunochromatography method for detecting a substance to be detected in a specimen has a known structure, operation and detection method.
  • a sample sample obtained by diluting a sample in advance using the sample treatment solution of the present invention is dropped into a sample pad of a conventional immunochromatography kit, and the sample is developed on the immunochromatographic medium in the direction of the absorption site.
  • An antigen in a specimen can be extracted during development, and a test such as identification and quantification of a substance to be detected in the specimen can be performed by an antigen-antibody reaction.
  • an immunochromatography kit includes a chromatographic medium (1) (having a “detection unit (determination unit)”), a sample dropping unit (2) (“sample pad (2)”, and “reagent holding unit (2)”).
  • Antigen extractor (3) also referred to as “organic acid-containing antigen extractor (3)” and “reagent holder (3)”
  • label substance holder (4) conjuggate pad (4)
  • the absorption section (5) also referred to as "development speed control section (5)"
  • a specimen diluent (extract) (6) and a backing sheet (7).
  • the immunochromatography apparatus will be described below. It shows the structure of a kit devised specifically for improving the antigen extraction efficiency in properly carrying out the so-called immunochromatographic detection method in which the components of the immunochromatographic reagent of the present invention are carried out on an immunochromatographic medium.
  • the components of the structure of the kit shown in FIG. 1 are 1; a chromatographic medium (1), 2; a reagent dropping unit (reagent holding unit) (2) (also collectively referred to as a sample pad).
  • the present invention is an immunochromatography kit having a structure composed of at least each of these 1 to 5 elements.
  • the present invention has been found that the arrangement order of such components influences the performance, and the arrangement of elements constituting this structure and the action of expansion are sequentially compared in the following two points and illustrated. if, Structure (1) 2 3 4 1 5 good development of the present invention Comparative structure (2) 3 2 4 1 5 poor development As described above, if the order of the constituent elements 1 to 5 is arbitrarily changed, the behavior such as the unfolding action is particularly affected. In the combination of these constituent elements, FIG. , (B) is the most preferable mode of development of the combination of the elements, and if the development is not a problem, a structure in which the order of the components is changed is also possible.
  • the immunochromatography kit shown in FIGS. 1 (a) and 1 (b) is basically a test tool comprising the components shown in FIG. 1, but in particular the element part of “3; antigen extraction part (3)” is used. If omitted, in this case, the preparation of nitrous acid is complicated and hinders smooth inspection. Thus, the present inventors have found that the kit as shown in FIG. 1 of the present invention performs an exceptional function in the performance of inspection and the handling on inspection.
  • the sample dropping part (2) and the antigen extracting part (3) absorb the sample quickly, but the holding power is weak, such as a glass filter paper that has a property that the sample quickly moves to the reaction part. It is composed of a porous sheet.
  • the sample dropping part (2) can contain nitrite which reacts with the organic acid contained in the antigen extraction part (3) to produce nitrite, but nitrite is not contained here It may be contained in the specimen diluent (6), or may be contained in both of them. In order to function effectively, nitrite can be contained if it is a site upstream of the site containing the organic acid.
  • the sample diluent (6) can contain a cyclic oligosaccharide, but the cyclic oligosaccharide may be contained in the sample dropping part (2) instead of being contained here, or in both of them. May be.
  • nitrite can be contained if it is a site upstream of the site containing the organic acid.
  • the antigen extraction part (3) functions as an antigen extraction part, it contains an organic acid, and a nonionic surfactant TritonX-100 (trade name) is used for uniform development. ) And Triton X-114 (trade name). Storage stability was also improved.
  • the labeling substance holding unit (4) holds a labeling reagent in which the reagent component is labeled with the labeling component.
  • the label component include metal colloid particles, latex particles, enzymes, fluorescent compounds, and the like, and metal colloid particles are the most suitable.
  • the reagent component is a particle or molecule having the ability to recognize an analyte, preferably a monoclonal antibody or a polyclonal antibody or a fragment thereof (second reagent).
  • the metal colloid particles single particles or composite particles of noble metals such as silver, platinum, germanium, rhodium and palladium can be preferably used.
  • Gold is particularly suitable because it is sensitive to changes in hue.
  • the average particle size is 1 to 500 nm, preferably 10 to 250 nm, more preferably about 35 to 100 nm, and 0.0001 to 0.08% by weight, preferably Those containing a concentration of about 0.002 to 0.06% by weight are preferably used.
  • the gold nanoparticles of the present invention refer to various gold colloidal particles having such an average particle diameter and having a gold nano diameter.
  • the colloidal gold particles are supported on the surface of the gold colloid particles to obtain gold colloid composite particles. It can be used to increase the usefulness as a label for measurement and as a protein stain.
  • a so-called sensitizer such as a colloidal gold-labeled amplifying agent having a functional group capable of binding to the metal particle surface and a reactive group capable of binding to an antibody is used, the measurement sensitivity can be increased.
  • a detection site is prepared on a membrane carrier.
  • the membrane carrier is not particularly limited as long as it can absorb and move the sample specimen by capillary action.
  • nitrocellulose, cellulose acetate, nylon, polyethersulfone, polyvinyl alcohol, polyester, glass fiber, polyolefin, cellulose, and an artificial polymer composed of a mixed fiber thereof are selected.
  • a monoclonal antibody or a polyclonal antibody or a fragment thereof (first reagent) is supported and fixed on a nitrocellulose sheet.
  • filter paper made of glass fiber, cellulose fiber or the like, which is a material having the ability to absorb excess sample quickly, is widely used, but the ability to hold the absorbed liquid so that it does not flow back. It is more preferable to use a material having the above (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2012-189346).
  • the backing sheet (7) is a base material. One side has adhesiveness by applying an adhesive on one side or sticking an adhesive tape. On the adhesive side, a sample dropping part (2), an antigen extraction part (3), a labeling substance holding part (4 ), A chromatographic medium (1) having a detection unit, and a part or all of the absorption unit (5) are provided in close contact with each other.
  • the backing sheet (7) is not particularly limited as long as the backing sheet (7) becomes impermeable and impermeable to the sample solution by the adhesive.
  • One or both of the reagent component (first reagent) used for the detection site and the reagent component (second reagent) used for the labeling reagent may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies and polyclonal antibodies or fragments thereof are known and available, and can be prepared by known methods.
  • Examples of antibody-producing animal species include humans, mice, rats, rabbits, goats and horses.
  • the immunoglobulin may be any of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD.
  • a predetermined amount (usually 0.1 to 2 ml) of a sample dilution liquid mixture obtained by diluting the sample (sample) with the sample dilution liquid (6) is dropped on the sample dropping part (2).
  • the specimen diluent mixture is dropped, the specimen diluent mixture is rapidly absorbed by the sample dropping section (2), but starts to move quickly.
  • the reagent composition containing nitrite and cyclodextrin that has been dried and held in the sample dropping part (2) is dissolved in the water of the specimen diluent mixture and starts moving together with the specimen (sample).
  • the specimen diluent mixture containing dissolved nitrite first moves to the antigen extraction section (3).
  • the organic acid dried and held in the antigen extraction section (3) is contact-reacted with nitrite dissolved in the moving specimen diluent mixture to generate nitrous acid.
  • This nitrous acid extracts polysaccharides on the surface of bacterial cells when streptococci are present in the specimen (sample).
  • the specimen diluent mixture containing nitrous acid moves uniformly and smoothly to the labeling substance holding unit (4).
  • the labeling reagent (second reagent) held in the labeling substance holding part (4) is dissolved in the moisture of the specimen dilution liquid mixture and moves together with the specimen (sample).
  • the labeling reagent dissolved in the water of the sample diluent mixture passes through the detection site on the chromatographic medium (1).
  • the non-specific binding reaction is suppressed by the immunochromatographic reagent composition dissolved in the sample diluent mixture, and the target substance (for example, When the polysaccharide is present, it specifically reacts and binds so as to be sandwiched between the antibody supported and immobilized at the detection site and the labeling reagent, and the detection portion is colored.
  • the labeled reagent dissolved in the water of the specimen diluent mixture is specific even if it passes through the detection section on the chromatographic medium (1). Since no binding reaction occurs, the detection site is not colored.
  • the present invention has a sample dropping part (2) containing sodium nitrite and an antigen extraction part (3) containing citric acid, and a development speed control member (water absorption 80-200 mg / cm for optimizing extraction efficiency) 2 )
  • An immunochromatography kit having an absorption part (5).
  • Example 1 Preparation of determination part on chromatographic medium (1)
  • a sheet made of nitrocellulose manufactured by Millipore, trade name: HF120, 250 mm ⁇ 25 mm
  • a rabbit-derived anti-streptococcal polyclonal antibody (first antibody) is diluted with 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 5% by mass of isopropanol to a concentration of 1.0 mg / ml, and the diluted solution 150 ⁇ L was applied to the membrane in a width of 1 mm using an antibody coater (manufactured by BioDot), dried at 50 ° C. for 30 minutes, and dried overnight at room temperature to prepare a determination unit on the chromatographic medium (1).
  • an antibody coater manufactured by BioDot
  • An aqueous solution containing ⁇ -cyclodextrin (0.6 mL) was applied and freeze-dried to prepare a sample dropping part (reagent holding part) (2).
  • the sample dropping part (2) and the antigen extraction part (3) were pasted together in the order shown in Table 1 from the upstream in the immunochromatographic development direction (the development direction is from right to left). And it cut
  • ⁇ -cyclodextrin (hereinafter abbreviated as “ ⁇ -CD”) contained in the reagent dropping part (2), ⁇ -cyclodextrin, Amino-
  • ⁇ -CD ⁇ -cyclodextrin
  • Amino- the test device was evaluated as a negative / positive sample.
  • Each CD was held at 0.75 ⁇ g / test in the nitrous acid-containing part.
  • an inspection device not including a CD was also prepared and evaluated. The result is shown in FIG. It carried out on the following inspection conditions. Positive: 4 ⁇ 10 5 org / mL streptococci (determination time 8 minutes)
  • Negative Developing solution (determination time 30 minutes)
  • the numbers 1 to 5 are 1; chromatographic medium (1), 2; sample dropping part (2), 3; antigen extraction part (3), 4; labeled substance holding part (4), 5; Represents part (5).
  • Example 4 Sodium nitrite, cyclic cyclodextrin, and citric acid per test (test) were used in various amounts shown in Table 2, and the same procedure as in Example 1 was performed.
  • As the positive specimen 150 ⁇ L of an inactive lytic streptococcus having a concentration of 2 ⁇ 10 6 org / mL per test (test) was used. And it determined in accordance with the same visual criteria. The determination result is shown in Table 2.
  • Example 13 The same procedure as in Example 1 was performed except that tartaric acid was contained in the antigen extraction section (3) instead of citric acid. And it determined in accordance with the same visual criteria. The determination result is shown in Table 2.
  • Example 14 The procedure was the same as that of Example 1, except that sodium nitrite was not contained in the reagent dropping part (2), and 50 ⁇ mol / test potassium nitrite was added to the sample diluent. And it determined in accordance with the same visual criteria. The determination result is shown in Table 2.
  • Example 15 ⁇ -cyclodextrin was not added to the reagent dropping part (2), but 0.1 ⁇ mol of ⁇ -cyclodextrin was added to the sample diluent, and itaconic acid was added to the antigen extraction part (3) instead of citric acid. Except for this, the procedure was performed in the same manner as in Example 1. And it determined in accordance with the same visual criteria. The determination result is shown in Table 2. Examples 14 and 15 are in a form in which nitrite or cyclic oligosaccharide is held in a specimen diluent.
  • Example 16 Example 1 except that ⁇ -cyclodextrin and sodium nitrite were not contained in the reagent dropping part (2), and 50 ⁇ mol sodium nitrite and 0.1 ⁇ mol ⁇ -cyclodextrin were added to the sample diluent. Performed in the same procedural manner. And it determined in accordance with the same visual criteria. The determination result is shown in Table 2.
  • Example 16 is a form in which nitrite and a cyclic oligosaccharide are held in a specimen diluent.
  • Example 17 to 21 The procedure was performed in the same manner as in Example 4 except that citric acid was used as a mixture of citric acid and trisodium citrate at various ratios described in Table 3. And it determined in accordance with the same visual criteria. The determination results are shown in Table 3.
  • citric acid is used as a mixture of citric acid and an alkali metal salt of citric acid, and the ratio is more preferably 5: 1 to 1: 3 when performing streptococcal examination by immunochromatography. It has been found that the use of 4: 1 to 2: 3 is preferable. Further, when used in these modes, the S / N ratio is improved and accurate determination can be made while keeping the protein component colloidal, no aggregation of the antibody-sensitized gold colloid and keeping the development speed fast.
  • Example 22 The test was conducted in the same manner as in Example 4 except that 1% by mass of casein was used in place of bovine serum albumin in the preparation of the sample dilution. As a result, no false positive was observed in the negative sample, no development failure due to precipitation by reaction of casein with nitrous acid was confirmed, and detection sensitivity equivalent to Example 4 was obtained with the positive sample (5 In all repeated tests, all positive specimens are judged as positive or higher).
  • Na nitrite is preferably used in an amount of 10 to 100 ⁇ mol per test
  • citric acid is preferably used in an amount of 0.1 to 4 ⁇ mol per test. It is more preferable to use ⁇ 3 ⁇ mol
  • the cyclic oligosaccharide is preferably used in an amount of 0.02 to 0.5 ⁇ mol per test.
  • the present invention has an excellent advantage that it can be used for rapid and simple examination and diagnosis of Gram-positive bacteria, particularly group A ⁇ -hemolytic streptococci, which is one of respiratory infections. Even individuals who do not have special skills as well as clinics can perform high-sensitivity and rapid clinical examinations, and can be used for early diagnosis and treatment of infected persons. Furthermore, nitrous acid, which is an unstable compound, does not require complicated preparation at the time of nitrite generation in which nitrite is reacted with an acidic solution for each inspection. This not only increases handling, inspection efficiency and inspection accuracy, but also improves inspection efficiency and labor saving, and thus contributes significantly to the development of industrial fields related to inspection institutions and medical fields.
  • Chromatographic medium (1) 2. Sample dropping part (2) (reagent holding part (2)) 3. Antigen extraction part (3) (reagent holding part (3)) 4). Labeling substance holding part (4) 5. Absorption part (5) 6). Sample diluent (extract) (6) 7). Backing sheet

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Abstract

　検体中の検出対象物の抗原を抽出剤により抽出して検出する免疫測定法において、環状オリゴ糖の存在下に行う免疫測定法を特徴とするものであり、また、検体希釈液と、試料滴下部、抗原抽出部、標識物質保持部、検出部を有するイムノクロマトグラフ媒体、及び吸収部から構成されていて、かつ抗原抽出部に有機酸が保持されてなる検体中のグラム陽性菌を検出するためのイムノクロマトキットであって、検体希釈液及び／又は試料滴下部のいずれか一方又は両方に環状オリゴ糖、亜硝酸化合物及びそれらの混合物のうちのいずれか一つ以上を含有することにより、環状オリゴ糖及び亜硝酸化合物を含有するようにしたイムノクロマトキットを用いることを特徴とする。

Description

溶血性レンサ球菌診断イムノクロマト試薬、キット及び検出方法
　試料液中の被検出物（抗原等）としてグラム陽性菌、特に、溶血性レンサ球菌を検出する簡便な体外診断キットもしくは携帯用診断装置として重要性が高いイムノクロマトキット、それに用いる試薬組成物又は検体処理液及び検出方法に関する。特に、溶連菌検査において必要な多糖体の抽出に必要な亜硝酸の調製をその都度用事調製によることなく検査デバイス上で生成させることにより検査効率及び検査精度を向上させた検査方法に関する。
　近年、イムノクロマトグラフ用ストリップ形式のイムノアッセイは、抗体の持つ特異的反応性を利用して、試料液中の被検出物（抗原等）を検出する簡便な体外診断キットもしくは携帯用診断装置として汎用性が高まっている。特に、最近では、インフルエンザウィルスや細菌といった病原体に対する感染の有無を検査するためのイムノクロマト法に基づく簡便な検査具についても関心が高まり、研究開発が進められてきた。
　溶血性レンサ球菌（以下、「溶連菌」ともいう。）の診断は、群特異的である多糖体を抗原として検査することで行う。多糖体の抽出法としては、酵素やファージ、塩酸や次亜塩素酸などを用いた方法が知られているが、亜硝酸を用いる抽出法が最も一般的である。
　亜硝酸による抽出法は、糖多糖体の高い抽出効率と亜硝酸が低価格で取り扱いが容易である点にメリットがあるが、亜硝酸自体が不安定で分解しやすい化合物であるため、抽出前に亜硝酸ナトリウムと酢酸などの有機酸と混合し、その都度亜硝酸を調製しなければならない点にデメリットがある。また、恒常的に診断を行う場合、その都度亜硝酸を調製することは医師や検査技師の大きな負担となる。加えて、混合工程を含むため、試薬の混合間違いなどにより正しい安全な診断を行えない場合の可能性もある。
　この問題点を克服するために、レンサ球菌からの多糖抗原を抽出する工程を簡易化するための簡便な検査具についても研究開発が進められてきた。
　例えば、特許文献１では、生物（特に、連鎖球菌Ａ群又はＢ群）からの多糖抗原を抽出する方法において、ａ．測定量の亜硝酸塩が滲み込ませて乾燥されている第１吸収性物質、ｂ．測定量の中和塩基及び緩衝液が滲み込ませて乾燥されている第２吸収性物質、ｃ．測定量の酸の水溶液、を組み合わせたキットを用いた簡易化した抽出方法が提案されている（特許文献１参照）。
　また、連鎖球菌感染の診断に当っては、まず多糖抗原の抽出工程を行った後に、次いで得られた溶液を免疫アッセイ装置と接触させて抗原の検出工程を行うという面倒な処理工程が必要であるため、多糖抗原の抽出工程、及びマーカーの測定工程を含む試料中の生物を簡便に測定検査する方法やその為のキットの開発が課題になっている。
　例えば、特許文献２においては、レンサ球菌科などの微生物／細菌性生物体に特徴的な炭水化物抗原を検出するための分析装置や方法が開示されている。この側方流動分析装置では、ａ．サンプル受領ゾーン、ｂ．抽出ゾーン（抽出試薬；固定化又は吸収して乾燥させた酸及び亜硝酸塩）、ｃ．中和剤（中和緩衝剤；ＴＲＩＳ）、ｄ．検出ゾーン（捕捉／検出試薬）を有する基材を含む装置が提供されている（特許文献２参照）。
　さらに、連鎖球菌を含む複数の異なる生物を、同時に測定検査する方法やその為のキットの開発もなされている。
　例えば、特許文献３では、第１の生物がグラム陽性細菌、例えば、Ａ，Ｂ，Ｆ，又はＧ群連鎖球菌、腸球菌細菌等であり、第２の生物がウイルス類やグラム陰性細菌類等であるような試料中の複数の異なる生物種を測定する方法やキットであり、１つ以上の容器内に、ａ．亜硝酸、又は乾燥状態になっている酸及び亜硝酸塩、ｂ．界面活性剤、ｃ．第１の生物から得られる第１のマーカーに結合する第１の結合試薬、ｄ．第２の生物から得られる第２のマーカーに結合する第２の結合試薬、を備えたキットによる複数の検体の同時検出を可能にすることにより、検査効率の倍増と患者の検査に伴う苦痛の軽減を達成している（特許文献３参照）。
　レンサ球菌科などの微生物／細菌性生物体に特徴的な炭水化物抗原を検出するための分析装置や方法に関しては、既に上市販売されているものもあって、例えば、イムノクロマト試薬としては、クイックビュー　ＤｉｐＳｔｉｃｋ　ＳｔｒｅｐＡ（ＤＳファーマバイオメディカル）やストレップＡ　テストパック・プラスＯＢＣ（三和化学研究所）等があり、また、スライドラテックス凝集法試薬としてはＡストレプトＡＤ「生研」（デンカ生研）などが知られている。
　イムノクロマト試薬の市販品にあっては、一般的に検体の試験において陽性と判定されるためには、直接法では溶連菌濃度が１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ以上であることが必要とされている。その為、１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ未満の場合には、陽性であるにも拘らず陰性と判定されたり、また、不溶性担体で抗体を標識したイムノクロマト法検査薬は、一般的にＥＩＡと比較して感度が低い為、陽性の場合に観察されるラインが明瞭でないという問題点や、さらには、試料液中に被検出物（抗原等）が存在しないにも拘らず、陽性と判定される、所謂、偽陽性が生じるという問題点があった。
　かかる問題点を解決するために、展開溶媒に糖又は水溶性高分子化合物を存在させる方法等が提案されている。例えば、抗体を結合した着色ラテックス粒子を用いるメンブレンアッセイ法において、ラテックス組成物中に糖類、例えば、単糖類、オリゴ糖並びにそれらの糖アルコール、及び多価アルコールといった少なくとも１種の凝集防止剤と、タンパク質を添加すると共に塩基性の緩衝剤とを含み、そのｐＨが９．０～９．８である免疫測定用ラテックス組成物を用いることにより、ラテックス粒子の自然凝集を防止して、比重、粘度、浸透圧の上昇を防いで高感度な免疫測定を可能にしている（特許文献４参照）。
　また、最近では、糖尿病の診断に適した指標として広く使用されている血中のヘモグロビンに糖が結合した糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（「ＨｂＡ１ｃ」という。）の粒子イムノクロマト測定法において、（Ａ）赤血球を含有する測定試料を、界面活性剤で処理してヘモグロビンβ鎖のＮ末端をタンパク質表面に露出させ、（Ｂ）得られた試料を水不溶性の状態にある環状多糖類（例えば、メンブレン等に化学結合により固定化。環状多糖類自体がポリマーを形成。多孔性樹脂に練りこまれている状態）と接触させ、次いで、（Ｃ）得られた試料を、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体等と接触させて検出する方法が提案されている。こうすることにより、抗体どうしが凝集してメンブレン上を展開せず、正確な測定ができない原因である、環状多糖類が水と接触した際に、環状多糖類を構成する環状オリゴ糖分子又は環状多糖分子が水に溶解して拡散しない状態になるのを防止している（特許文献５参照）。
　さらに、メンブレンアッセイ法を用いた検体の簡易な検査方法において、感度を保ちながら偽陽性や詰まりを防止できる検体試料のろ過法が提案されている（特許文献６参照）。
　しかしながら、不溶性担体（金コロイド粒子、着色ラテックス粒子等）で抗体を標識したイムノクロマト法（「粒子イムノクロマト法」ともいう。）にあっては、測定試料とか測定環境、測定条件によっては、依然として該不溶性担体の凝集が起き、非特異反応が起きることがあり、展開速度が遅い等の問題点は解決できない場合がある。そのため、個々の測定試料とか測定環境、測定条件を採用した粒子イムノクロマト法において、不溶性担体の凝集が起きず、非特異反応が起きることがなく、展開速度が速い検査薬の探求が切望されていた。
日本国特表平７－５０３５４３号公報 日本国特表２００８－５０９３８４号公報 日本国特表２００６－５１８９９０号公報（日本国特許第４６６７８７４号公報） 日本国特開２００７－３１５８８３号公報 日本国特開２０１２－２５１７８９号公報 日本国特開２００９－３６７８１号公報
　本発明の目的及び課題は、イムノクロマト法によりグラム陽性菌、特に、溶連菌検査を行うに当り、試料抽出（希釈）液（「検体処理液」、「展開液」ともいう。）を改良することによって、従来技術に比して、展開系中の陰性検体での発色が低下し、陽性検体での発色が向上した、即ち、Ｓ／Ｎ比が高い、高感度なイムノクロマトグラフ用検査薬を提供することにある。
　また、本発明の目的は、イムノクロマト法により細菌検査を行うに当り、展開抽出条件を改良することによって、検体中又はイムノクロマトデバイス中に存在するタンパク成分が展開検査中に変性／析出（沈殿）を起こすことなく、高感度かつ展開速度の速い検査薬を提供することにある。
　さらに、本発明の目的は、イムノクロマト法により細菌検査を行うに当り、イムノクロマトキットの貼り合わせる部位の構成を改良することによって、従来技術に比して、迅速かつ高精度に試料（例えば、呼吸器疾患患者から採取される検体、特に、鼻汁、鼻腔拭い液又は痰等）中の微生物若しくは微生物に由来する抗原又は抗体等（例えば、グラム陽性菌、特に溶血性レンサ球菌等々の細菌）、特に、溶連菌検査は亜硝酸による多糖体の抽出が必要であり、不安定な化合物である亜硝酸は、その検査の都度に、亜硝酸塩を酸性溶液と反応させる亜硝酸生成工程を設けるという煩雑な用時調製をする必要があったが、亜硝酸の調製をその都度用時調製をすることなく、検査デバイス上で環状オリゴ糖の存在下で亜硝酸を生成させることにより検査効率、検査精度及び省力化を向上させることができる免疫測定用試薬、免疫測定法、イムノクロマト検出方法及びイムノクロマトキットを提供することにある。
　さらに詳しくは、本発明の目的は、呼吸器系感染症の一つであるＡ群β溶血性レンサ球菌の迅速診断ができる簡便且つＳ／Ｎ比が高い高感度なイムノクロマト用試料抽出液（以下、「試料希釈液」ともいう。）、イムノクロマト用試薬、それを用いたイムノクロマトキット及び検査方法を提供することにある。
　本発明者等は、イムノクロマト法検査薬で細菌を検査するに当っては、使用する試料抽出液中に環状オリゴ糖及び／又は亜硝酸塩を含有させること、もしくは、イムノクロマトキットにおける有機酸を保持する試薬保持部の試料展開方向上流に位置する他の試薬保持部に環状オリゴ糖及び／又は亜硝酸塩を含有させることにより、試料抽出液である展開液が検査デバイス展開中に保持されている有機酸や生成してくる亜硝酸によってｐＨ条件が変化しても、検体又はイムノクロマトデバイス中のタンパク成分等が変性・析出して、判定ラインに引掛かり、非特異的な反応を誘発することがなく、かつ、抗体固定粒子コロイドの凝集を起こすことがない、検査精度（以下「Ｓ／Ｎ比」という。）が高い展開速度の速い検査薬を提供することができることを初めて知見したものである。
　本発明の検出系では、環状オリゴ糖を添加することで、抽出液及び検体中の若しくはデバイス中のタンパク成分等を、試薬成分として有機酸を含有し、かつ亜硝酸が発生するような展開／抽出条件下でも析出させることなく検査できる免疫測定用試薬、免疫測定方法及びイムノクロマトキットなどを提供するものである。
　本発明は、下記の（１）～（１９）に係るイムノクロマト法に使用する検体処理液、免疫測定用試薬、免疫測定法、イムノクロマト検出方法、イムノクロマトキット、及びそれを使用するイムノクロマト法を提供するものである。
　本発明の免疫測定法としては、次のような特徴を有する。
　（１）本発明の第１の特徴は、検体中の検出対象物の抗原を抽出剤により抽出して検出する免疫測定法において、環状オリゴ糖の存在下に行うことを特徴とする免疫測定法、にある。
　（２）本発明の第２の特徴は、抽出剤が、有機酸と亜硝酸化合物の反応によりデバイス上で生成される亜硝酸であることを特徴とする免疫測定法、にある。
　（３）本発明の第３の特徴は、環状オリゴ糖がα－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン及びそれらの誘導体であることを特徴とする免疫測定法、にある。
　（４）本発明の第４の特徴は、亜硝酸化合物が、亜硝酸塩であることを特徴とする免疫測定法、にある。
　（５）本発明の第５の特徴は、有機酸が有機カルボン酸であることを特徴とする免疫測定法、にある。
　（６）本発明の第６の特徴は、抽出するｐＨ条件が、７．０未満～６．５である免疫測定法、にある。
　（７）本発明の第７の特徴は、抗原が、多糖体である免疫測定法、にある。
　（８）本発明の第８の特徴は、検出対象物が、グラム陽性菌である免疫測定法、にある。
　（９）本発明の第９の特徴は、グラム陽性菌が、溶血性レンサ球菌である免疫測定法、にある。
　本発明の免疫測定用試薬としては、次のような特徴を有する。
　（１０）本発明の第１０の特徴は、上記のいずれかに記載の免疫測定法において使用する、環状オリゴ糖を含有する免疫測定用試薬、にある。
　本発明の免疫測定用装置としては、次のような特徴を有する。
　（１１）本発明の第１１の特徴は、上記のいずれかに記載の免疫測定法を行うためのイムノクロマトグラフィー装置、にある。
　本発明のイムノクロマトキットとしては、次のような特徴を有する。
　（１２）本発明の第１２の特徴は、検体希釈液と、試料滴下部、抗原抽出部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体、及び吸収部から構成されていて、かつ抗原抽出部に有機酸が保持されてなる検体中の検出対象物を検出するためのイムノクロマトキットであって、検体希釈液及び／又は試料滴下部のいずれか一方又は両方に、環状オリゴ糖、亜硝酸化合物又はそれらの混合物のうちのいずれか一つ以上を含有することにより、環状オリゴ糖及び亜硝酸化合物を含有するようにしたことを特徴とするイムノクロマトキット、にある。
　（１３）本発明の第１３の特徴は、環状オリゴ糖は、イムノクロマトキットの１キット当り含有量が０．１～５μｇであることを特徴とするイムノクロマトキット、にある。
　（１４）本発明の第１４の特徴は、環状オリゴ糖がα－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン又はそれらの誘導体の１以上であることを特徴とするイムノクロマトキット、にある。
　（１５）本発明の第１５の特徴は、有機酸と共に非イオン性界面活性剤を保持することを特徴とするイムノクロマトキット、にある。
　（１６）本発明の第１６の特徴は、亜硝酸化合物が、亜硝酸塩であることを特徴とするイムノクロマトキット、にある。
　（１７）本発明の第１７の特徴は、抗原抽出部に、クエン酸と共にクエン酸塩を保持することを特徴とするイムノクロマトキット、にある。
　（１８）本発明の第１８の特徴は、検出対象物がグラム陽性菌である上記のいずれかに記載のイムノクロマトキット、にある。
　本発明のイムノクロマト検出方法としては、次のような特徴を有する。
　（１９）本発明の第１９の特徴は、上記のいずれかに記載の免疫測定法を行うために使用するイムノクロマトキット、にある。
　本発明は以上のような特徴点を備えることにより、課題を達成することができたものである。
　本発明では、予め測定量の亜硝酸化合物と有機酸との接触混合時に生成する亜硝酸を用いて、グラム陽性菌、特に、溶連菌（Ａ群～Ｕ群）の菌体表面に存在する、群特異的である多糖体を抽出し、その多糖体を抗原として検査を行うものであるから、試薬の混合間違いやその都度亜硝酸を調製する必要がないという簡便且つ汎用性のある検査キット及び検査方法である。そして、本発明のイムノクロマトキットを用いた溶連菌の検出系では、環状オリゴ糖を添加することで、抽出液及び検体中のタンパク成分を抽出／展開条件下であっても析出させることがなく、高感度に、かつ迅速に検査できるものである。
　即ち、本発明では、環状オリゴ糖を含有するイムノクロマトグラフ用試料抽出液（「検体希釈液」ともいう。）を使用することにより、展開中にタンパク質の析出を生じることなく、且つ抗体固定金コロイド粒子の凝集を起こすことなく、正確に且つ、展開速度の速い検査薬を提供することができるものである。また、本発明では、他の試薬保持部に環状オリゴ糖を含有することによって、例えば、呼吸器疾患患者から採取される検体（特に、鼻汁、鼻腔拭い液又は痰等）である試料中の抗原（例えば、グラム陽性菌、特に、溶連菌等々の細菌）を、試薬保持部に酸が保持され、かつ、亜硝酸を生成するような条件下であっても変性や沈殿を起こすことなく、迅速、簡便及び高感度に、結果の判定が可能である。
　さらに、その検査の都度に、亜硝酸塩を酸性溶液と反応させる亜硝酸生成工程を設けるという煩雑な用時調製をすることなく、検査デバイス上で亜硝酸を生成させることにより検査の煩雑を省略し、検査効率及び検査精度を向上させた検査方法を達成することができる。
図１は、本願イムノクロマトキットを示す図である。図１（ａ）は、イムノクロマトキットの立体斜視図である。図１（ｂ）は、イムノクロマトキットの平面図である。 図２は、亜硝酸含有部に各種シクロデキストリン（ＣＤ）を含有した場合の、陰性検体及び陽性検体の発色性の変化の挙動を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において「質量」とは「重量」のことをいう。
　本発明の実施形態は、各種検体中の被検出物質である検出対象物（抗原）に各種の標識をつけた特異的に結合する結合物質（抗体）を、クロマトグラフ媒体上で反応させる抗原－抗体反応により複合体を形成させ、イムノクロマトグラフ媒体上を吸収部位の方向へ展開させて、それを各種の検出手段により確認するという、イムノクロマト法又はそれを応用した検出法に基づくものである。その抗原と最も特異的に反応して結合する抗体としては、それと特異的に結合する、例えば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体若しくはその他の公知の抗体を任意に使用することができる。
　その標識としては、酵素、発色物質、蛍光物質、又は放射性物質などを任意に使用することができるが、操作が簡単で、検定時間も短くするという、イムノクロマト法の特色を出す為や、抗体、抗原の種類を考慮して決めればよい。
　また、検出手段は、操作が簡単で、比較的短時間で判定できると言う、イムノクロマト法の特色を表すためには、目視判定で、正確に判定できると言う性能を有することを特徴とするが、時間、精度などが要求される場合には、分光光度検出、放射線検出など、各種の検出手段を付帯させて、検出することができる。
　本発明のイムノクロマト法に使用可能な検体希釈液（「検体処理液」ともいう。）、免疫測定用試薬、免疫測定法、イムノクロマト検出方法、イムノクロマトキットを実施するための最良の形態を順次説明をする。
　本発明の、この免疫測定用試薬とは、免疫測定に際して使用する試薬であって、検体希釈液（６）（「検体処理液」、「検体抽出液」ともいう。）中に含有させて用いるか、及び／又は、試料滴下部（２）（試薬保持部（２）ともいう。）に含有保持させて用いる試薬である。しかし、これに加えて試薬保持部（３）（「抗原抽出部」（３）ともいう。）、標識物質保持部（４）、及びクロマトグラフ媒体（１）におけるこれらの１以上の部位に含有保持させても構わない。この試薬を検体希釈液中に、もしくは試料滴下部に含有させた場合には、有機酸含有抗原抽出部（試薬保持部（３））、標識物質保持部（４）、クロマトグラフ媒体（１）、及び吸収部（５）へと順次移動及び展開する性質を備えたものである。
　本発明の免疫測定用試薬としては、検体希釈液（６）及び試薬保持部（２）のいずれか一方に又は両方に環状オリゴ糖及び亜硝酸化合物のそれぞれを単独に又は同時に含有させるものである。この免疫測定用試薬を形成する環状オリゴ糖及び亜硝酸化合物を検体抽出液中に含む及び試料滴下部（試薬保持部（２））に存在させる実施態様としては次のようなものが挙げられる。
　本発明の亜硝酸化合物（「亜化」と略記する。）と環状オリゴ糖（「環オ」と略記する。）を含有する成分及び構成部位に関する態様を詳細に具体的に例示すれば、以下のような態様が例示できる。検体希釈液（検体処理液）（６）；試料滴下部（試薬保持部（２））にそれぞれ亜化、環オの化合物を含有する可能な各実施態様（パターン）を例示する。
 
　　パターン　　　　検体希釈液（抽出液）部（６）　　試料滴下部（２）
　　　　１　　　　　　　　　無　　　　　　　　　　　　　亜化・環オ
　　　　２　　　　　　　　　亜化　　　　　　　　　　　　環オ
　　　　３　　　　　　　　　環オ　　　　　　　　　　　　亜化
　　　　４　　　　　　　　　亜化・環オ　　　　　　　　　無
　　　　５　　　　　　　　　亜化・環オ　　　　　　　　　亜化・環オ
　　　　６　　　　　　　　　亜化・環オ　　　　　　　　　亜化
　　　　７　　　　　　　　　亜化　　　　　　　　　　　　亜化・環オ
　　　　８　　　　　　　　　環オ　　　　　　　　　　　　亜化・環オ
　　　　９　　　　　　　　　亜化・環オ　　　　　　　　　環オ
 
　以上のような実施態様（パターン）に従って、本発明は実施できる。
　なお、この試料滴下部（試薬保持部（２））の試薬状態は、溶液状のものや、凍結乾燥などにより滴下パッドに保持された状態のものを包含する。
　本発明の免疫測定用試薬を構成する環状オリゴ糖の含有量は、イムノクロマトキットの１キット当り含有量が０．１～５μｇ／試験である。
　同様に、本発明の亜硝酸化合物とは、好ましくは、亜硝酸塩であり、酸と反応して亜硝酸を生成するものであって、検査デバイス系において検査に悪影響が及ばないものであれば無機亜硝酸塩、例えば、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸カルシウム、亜硝酸マグネシウム等が挙げられ、有機亜硝酸化合物、例えば、亜硝酸メチル、亜硝酸エチル、亜硝酸ブチル、亜硝酸アミル等々であってもよく、何ら限定されるものではない。さらにはそれらを混合して使用することも可能である。好ましくは、無機亜硝酸塩であって、なかでも、亜硝酸のアルカリ金属塩が好ましく、亜硝酸ナトリウムが最も好ましい。
　この免疫測定用試薬中に含有する亜硝酸化合物の含有量は、１０～１００μｍｏｌ／試験であり、好ましくは２０～８０μｍｏｌ／試験である。
　本発明で使用する環状オリゴ糖としては、Ｄ－グルコース及び／又はその誘導体がα（１→４）グルコシド結合により環状につながった構造を有するオリゴ糖であれば特に限定されるものではない。具体的には、シクロデキストリン類、例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン及び、ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン、スルホアルキル化シクロデキストリン、モノクロロトリアジニルシクロデキストリン、クラスターシクロデキストリン、修飾クラスターシクロデキストリン、等の（α－、β－又はγ－）シクロデキストリン誘導体並びに、約２０～５０個のグルコースが環状に結合したシクロアミロース、ラウリル化シクロアミロース、シクロアミロースの派生産物である水溶性キシラン、等の環状グルカンを挙げることができる。これらシクロデキストリン類や環状グルカンの混合物を使用してもよい。中でも、β－シクロデキストリン及びγ－シクロデキストリンから選ばれる少なくとも１種が好ましい（日本国特開２０１２－１８８５７３号公報、日本国特開２０１２－２５１７８９号公報を参照）。
　環状オリゴ糖類は、一般に、その環状構造の外部が親水性を示し、その環状構造の内部が疎水性（親油性）を示すという特異的な構造を有している。上記の特異的な構造に由来して、環状オリゴ糖類は環状構造の内径より小さい親油性分子を包みこむように取り込み、複合化することができる。また前記環状構造の内径より大きい分子であっても、環状構造の内径より小さい親油性部分があれば、その部分が環状オリゴ糖類内部に取り込まれ、複合化することが知られている。
　本発明では、有機酸分子中の親油性部位である炭化水素官能基が環状オリゴ糖内に取り込まれ、試料中の被検出物質、他の生体物質由来のタンパク質成分、又はイムノクロマトキット中の添加剤等に含まれるたんぱく質成分と、有機酸との複合体形成を抑制し、その複合体形成に起因する非特異的な反応や複合体の析出による展開速度の低下や展開しない等の展開不良を抑制することができる。
　本発明の免疫測定用試薬に存在する環状オリゴ糖がα－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン及びそれらの誘導体であることが特に好ましい。
　環状オリゴ糖は、一試験あたり０．０２～０．５μｍｏｌ用いることが好ましい。
　本発明における検査試料としては、厚いペプチドグリカン層を有するグラム陽性菌を含む試料において好ましく用いられる。例えば、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、かん菌、たんそ菌、セレウス菌、ジフテリア菌、リステリア、破傷風菌、ボツリヌス菌及びウェルシュ菌等が挙げられる。本発明のキットは、中でも球菌類であるブドウ球菌、連鎖球菌及び肺炎球菌を含む試料でより好ましく用いられ、最適には連鎖球菌で用いられる。
　グラム陽性菌を含む試料は、例えば、唾液、鼻汁、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、痰、咽頭拭い液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、便懸濁液、尿及び羊水等といった生体試料のみならず、食品抽出液、上水、下廃水及び培養液等といった試料であることができ、特に限定されるものではない。これらの検体中に含まれ、原因となる菌がグラム陽性菌、特に、溶連菌を含む場合に有用である。環状オリゴ糖を添加することを特徴とする本発明の検出系では、生成する亜硝酸によって、細菌に特異な抗原多糖体が抽出されるような細菌であれば適用可能である。特に本発明のイムノクロマトキットにおける検出用グラム陽性菌とは、溶血性レンサ球菌である。
　環状オリゴ糖を含有させた本発明のイムノクロマトグラフ検出を行えば、有機酸あるいは検出系中で生成する亜硝酸による鼻汁などの検体に含まれる高粘性タンパク質や検査デバイス上に存在するタンパク等の変性・析出が抑制され、クロマト材の孔の目詰まりによる展開速度の低下を生じず、更に、高粘性タンパク質などによる粘度の増大も抑制するため、感度の低下を伴わず高速の展開が可能となり迅速な検体検出を可能とする。
　次に、本発明の免疫測定法としては、試料中の検出対象物の抗原を抽出試薬により抽出して検出するに於いて環状オリゴ糖の存在下に行うことを特徴とする免疫測定法を実施することにある。この免疫測定法の特徴は、抽出試薬が有機酸と亜硝酸化合物の反応により検査デバイス上で、特に有機酸含有抗原抽出部（試薬保持部（３））において生成される亜硝酸によるものである。
　この有機酸とは、有機カルボン酸であるが、有機酸と共に下記の非イオン性界面活性剤を保持することにより免疫測定法を実施することが好ましい。
　そして、この抽出試薬が有機酸と亜硝酸化合物の反応により生成される亜硝酸によるものであって、下記の理由により、その抽出ｐＨが７．０未満～６．５であることが好ましい。
　そのイムノクロマト法による溶連菌の検出においては、菌体表面に存在する群特異的である多糖体を抗原とするのが一般的であり、抗原抽出に当っては、亜硝酸による抽出が、各種酵素を含む抽出液に比べて格段に抽出効率が高いが、展開中に試薬保持部に保持されている酸や亜硝酸の生成に起因してｐＨ条件が酸性となった場合に問題が生じる。即ち、イムノクロマトグラフ検出系中に存在する、例えば、カゼイン等といったタンパク質、又はその塩や検体中に含まれる高粘性タンパク質等が析出してくるといった問題点が生じる。
　そこで、本発明は、共通抽出液［１）酵素、２）添加塩、３）界面活性剤、４）イオン液体、５）（亜硝酸生成）触媒、６）亜硝酸］の仕様の抽出液で、１）酵素の挙動に着目して、多面的に検討した結果、やはり、１）～５）の抽出液系では、６）亜硝酸に比べて、抗原抽出効率が低いことを確認することができた。このため、抗原抽出の為には、亜硝酸が必要であり、亜硝酸は、酸性条件で生成するが、酸性条件では共通抽出液中のタンパク質のカゼインが析出するために、併用が非常に難しい。そこで、本発明はカゼインが析出しない程度の酸性条件で亜硝酸を生成する条件を模索した。
 
　　　［共通抽出液と亜硝酸併用系の挙動］
　ｐＨ　　　　　　　６　　６．５　　６．８　　７　　８
　気泡（亜硝酸）　　有　　　　有　　やや有　　無　　無
　沈殿（カゼイン）　有　　やや有　　　　無　　無　　無
 
　この解析結果から、亜硝酸と共通抽出液との併用可能な条件を、ｐＨ＝６．５～７程度にすれば、対応できることが判明した。このように、本発明は、抗原抽出効率の向上の為に、共通抽出液の面からの対策と、以下に示す、キットの構成の面という、両面からの改良を検討したものである。
　これらの問題点について更なる検討、研究を重ねた結果、本発明にあっては、亜硝酸が生成するｐＨ条件であって、かつ、カゼイン等々といったタンパク質や検体中に含まれる高粘性タンパク質などが析出してこないｐＨ条件としては、ｐＨが７．０未満～６．５、好ましくは７．０未満～６．６、最も好ましくは７．０未満～６．８である。ｐＨ条件が７未満であれば、亜硝酸生成が少なくなることはなく、抗原の抽出効率が低くならないため、検出感度が低くなることがない。亜硝酸生成によるｐＨ条件が６．５以上では、カゼイン等といったタンパク質や検体中に含まれる高粘性タンパク質などが析出してくるおそれがなく、検出ができなくなる状況を回避できる。
　本発明のイムノクロマトキットは、亜硝酸を生成するために中性から弱酸性条件で検体を展開する設計になっている。また、他の呼吸器感染症で既に使用されている抽出液での検査を行なえる設計となっている。しかし、抽出液に含まれる成分（カゼイン）が弱酸性条件で析出してしまうため、展開が不均一になるという問題があり、この問題を解決する為に、本発明者等は、種々の化合物を加えて、成分の析出を抑える検討を行った。
　その結果、検出系中に、例えば、亜硝酸塩含有部中にあるいは検体希釈液中に、環状オリゴ糖を含有させることで、成分の析出を抑えることができ、展開の均一性を向上させることができることを知見したものである。
　本発明を適正に実施する為に、本発明では、亜硝酸を生成する条件として、中性から弱酸性条件（ｐＨ＝６．８）で展開することが好ましいことを確認することができたが、これは呼吸器感染症で既に使用されている抽出液での検査にも対応できる設計条件である。
　しかし、抽出液に含まれる成分（カゼイン）は弱酸性条件では、析出してしまう為に、展開が不均一になる問題を抱えている。この成分の析出を抑える為に、種々の化合物を加えて、成分の析出を抑えることを検討した結果、シクロデキシトリン（ＣＤ）として、特に、代表的なβ－シクロデキシトリン（β－ＣＤ）を含有することで成分の析出を抑えることができ、展開の均一性が向上することを知見したものであり、その傾向を以下に示す。注．ＢＳＡ：牛血清アルブミン、ＰＥＧ；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００）、ＴＨ；トレハロースを示す。
 
　　　　　　　　無添加　　ＢＳＡ　ＰＥＧ　　ＴＨ　　　β－ＣＤ
　展開均一性　やや不均一　不均一　不均一　やや不均一　　均一
 
　これらの傾向は、環状オリゴ糖に包含される各種のＣＤに於いて、同様の傾向を示すことを確認することができる。
　本発明に使用する抗原抽出液、即ち、試料抽出（検体希釈）液や展開抽出液としての役割を果たすものである該抽出液の共通成分としては、亜硝酸化合物（亜硝酸塩等）、中和塩基（水酸化ナトリウム等）又は緩衝液（ＴＲＩＳ等）を含有させることができ、その他に、生物学的親和性に基づく副反応を抑制したり、疎水結合や電気的相互作用を打ち消す効果のある物質、例えば界面活性剤、アンモニウム塩、糖類及びｐＨ緩衝剤、さらに非特異反応を抑制するために種々の添加剤、例えば、抗原抗体反応の促進若しくは非特異反応の抑制のための蛋白質又は高分子化合物等を含有させることができる。
　この環状オリゴ糖の範疇に属する各種化合物の展開液に与える影響及びその挙動を解析したのが図２である。図２の実験の実施条件は、環状オリゴ糖の代表的な一つであるシクロデキシトリン（ＣＤ）を、亜硝酸を含有させた部位（２；試薬保持部（２））に各ＣＤを０．７５μｇ／ｔｅｓｔとなるように保持させて、各ＣＤを含ませた検査デバイスの陰性・陽性検体での評価を行った。β－シクロデキシトリン（「β－ＣＤ」と略す。）、アミノ－β－シクロデキシトリン（「Ａｍｉｎｏ－β－ＣＤ」と略す。）、６－０－α－Ｄ－マルトシル－β－シクロデキシトリン；分子量１４５９（「ｍβ－ＣＤ」と略す。）、γ－シクロデキシトリン（「γ－ＣＤ」と略す。）の各ＣＤについて評価した。その結果は図２に示すとおりである。
　また、比較のために、ＣＤを含まない検査デバイスを作製して、対比評価したものを図２に示した。
　β－ＣＤ、γ－ＣＤを、亜硝酸を含有させた部位に保持することで、陰性検体での発色が低下し、陽性検体での発色が向上することが確認できる。このようにβ－ＣＤ類により感度の向上が容易に確認することができる。しかし、非特異反応の抑制が達成できるかは、これだけのデータだけでは確認することができない。亜硝酸を検査デバイス上で生成させることで、検査効率の向上を指向する一方で、問題点として、展開液が検査デバイス展開中に酸性となる為に、検体中の蛋白質成分が変性、析出して、判定ラインに引っかかり、非特異的反応を誘発することが予測される。
　そこで、本発明は、抽出液及び検体中のタンパク成分を酸性条件下でも析出することなく検査することができることを目的として、各種のオリゴ糖を添加するという試行錯誤を繰り返すことにより、環状オリゴ糖の一種であるＣＤを含有させることで、Ｓ／Ｎ比の改善が見られるという結果を達成したものである。というのも、シクロデキシトリン（ＣＤ）は、環状オリゴ糖の一種であるから、内部が疎水性である構造を有する為、様々な疎水性化合物を包接する機能を有していることに起因していることが予測される。
　本発明の有機酸含有抗原抽出部（試薬保持部（３））に保持させる抽出液系に使用する酸としては、亜硝酸化合物と反応して亜硝酸を生成するものであって、検査デバイス系において存在するタンパク質等を変性・析出させないものであれば有機酸、例えば、酢酸、酒石酸、イタコン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、グリコール酸、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、安息香酸及びベンゼンスルホン酸等が挙げられる。
　また、固定化した酸、例えば、ポリスルホン酸、ポリカルボン酸、ポリスチレン及びポリアクリル酸等であってもよく、何ら限定されるものではない。好ましくは、有機酸であって、酒石酸、イタコン酸又はクエン酸が好ましく、クエン酸が最も好ましい。これらを混合して使用することも可能である。
　酸と亜硝酸塩の使用割合は、モル比で０．１～４：１０～１００の範囲である。クエン酸は、一試験あたり０．１～４μｍｏｌ用いることが好ましく、０．１～３μｍｏｌ用いることがより好ましい。亜硝酸塩は、一試験あたり１０～１００μｍｏｌ用いることが好ましい。
　本発明で使用する環状オリゴ糖は、イムノクロマトグラフ用試料抽出液（以下、「展開抽出液」ともいう。）又は検体希釈液（以下、「検体処理液」ともいう。）中に含有させてもよく、イムノクロマトキットにおける他の試薬保持部に含有させてもよく、又はそれら両方に含有させてもよく、環状オリゴ糖の機能が発揮できる限り、何処に含有させてもよいが、展開初期段階である検体処理液あるいは展開上流部に含有させるのが、機能上好ましい。
　本発明のイムノクロマトキットを用いて検体中のグラム陽性菌を検出するためのイムノクロマト検出方法としては、
（ｉ）検体を緩衝液及び界面活性剤を含む検体希釈液と接触混合して検体希釈液混合物を作成する工程、
（ｉｉ）検体処理液混合物を試料滴下部に供給する工程、
（ｉｉｉ）検体処理液混合物をイムノクロマト媒体上で展開して、抗原抽出部に存在する有機酸と亜硝酸化合物の反応によって媒体上で生成される亜硝酸によりグラム陽性菌中の抗原を抽出する工程、
（ｉｖ）標識物質保持部において抗原を標識化する工程、及び
（ｖ）クロマトグラフ媒体上を移動して検出部において標識化抗原を検出する工程、
（ｖｉ）検体処理液混合物が、吸収部により吸収される工程、
からなるイムノクロマト検出方法により達成することができる。
　本発明のイムノクロマトグラフ用検体希釈液又はイムノクロマトキットの試薬中に使用できる非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－ノニルフェニルエーテル（商品名「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズ）、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド及びアルキルモノグリセリルエーテル等を挙げることができる。また、悪影響を及ぼさない範囲内において非イオン性界面活性剤以外のイオン性界面活性剤などを配合して使用することも可能である。
　特に、本発明のイムノクロマトキットにおける有機酸含有抗原抽出部には、展開を均一にするために界面活性剤が必要であるが、界面活性剤を含ませることによって抗原抽出部の保存安定性が悪くなることが分かっている。この問題を解決する為に、種々の界面活性剤を含有させた抗原抽出部を有する試薬を作製して、過酷試験（８０℃、１２時間）を行った結果、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、例えば、ポリオキシエチレン（１０）－ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（商品名）、ＨＬＢ＝１３．５）、「ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４」（商品名）（ＨＬＢ＝１２．４）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－ノニルフェニルエーテル（商品名「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズ）が好ましいことが分かった。最も好ましくは、ポリオキシエチレン（１０）－ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（商品名））である。
　本発明の検体希釈液やイムノクロマトグラフ用試薬中に使用する非イオン性界面活性剤の含有量としては、０．０１～１０重量％の範囲であり、好ましくは０．０５～５重量％の範囲でイムノクロマトグラフ用試薬に含有させることができる。０．０１重量％以上であれば、正確な判定が可能となる。０．０５重量％以上では、非特異的反応を抑制でき、正確な判定が可能となる。１０重量％以下であれば、、非特異的反応の抑制には好ましい影響を与え経済的である。
　本発明の抽出展開液、検体処理液などのイムノクロマトグラフ用試薬中に使用される塩としては、代表的なものとしては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び塩化マグネシウム等が挙げられる。好ましくは塩化ナトリウムである。
　本発明の抽出展開液などのイムノクロマトグラフ用試薬中に使用される塩の濃度としては、１ｍＭ～５００ｍＭの範囲であり、５ｍＭ～２００ｍＭの範囲が好ましく、１０ｍＭ～５０ｍＭの範囲がより好ましい。濃度が１ｍＭ以上だと、タンパク質の抽出作用が十分になる。５００ｍＭ以下であれば、経済的である。
　本発明のイムノクロマトグラフ用試薬中に使用される塩としては、１種のみならず２種以上配合して使用することもできる。
　本発明の抽出展開液中に使用する緩衝剤としては、試料の添加や試料の蒸発や希釈による濃度の変化、外部からの多少の異物の混入によっても致命的な影響を生じない作用（緩衝作用）を持つものであれば特に制限はない。
　本発明において、緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液（リン酸＋リン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液（酢酸＋酢酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸＋クエン酸ナトリウム）、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液（トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン＋塩酸）、ＴＥ緩衝液（トリス＋エチレンジアミン四酢酸）、ＴＡＥ緩衝液（トリス＋酢酸＋エチレンジアミン四酢酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス＋ホウ酸＋エチレンジアミン四酢酸）又はＨＥＰＥＳ緩衝液（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルフォン酸）、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤）等が挙げられる。好ましくは、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液及び酢酸緩衝液等であり、より好ましくは、トリス塩酸緩衝液である。本発明のイムノクロマト検出系においては、悪影響を及ぼさない範囲内であれば２種以上の緩衝剤を用いることも可能であって、何ら制限されない。
　本発明で使用する緩衝剤の濃度としては、１０～５００ｍＭの範囲が好ましく、１０～３００ｍＭの範囲がより好ましく、３０～１００ｍＭの範囲がさらに好ましい。濃度が１０ｍＭ以上であると緩衝作用が十分であり、タンパク成分の析出抑制や標識粒子の凝集抑制も十分となる。５００ｍＭ以下であれば、経済的である。また、緩衝液として、ｐＨ範囲７．１～９．８のものを作るのが最適である。
　本発明のイムノクロマトグラフ用試薬には、生物学的親和性に基づく副反応を抑制したり、非特異的反応を抑制することが公知の添加剤、例えば、抗原抗体反応の促進若しくは非特異的反応を抑制するための蛋白質（例えば、牛血清アルブミン、ゼラチン及びカゼイン等）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及びデキストラン等）、イオン性界面活性剤又はポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、コンドロイチン硫酸等）、又は抗菌剤等の１種若しくは２種以上を添加して使用することも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。
　また、これらの抗原抗体反応の促進若しくは非特異的反応を抑制するための蛋白質、高分子化合物、イオン性界面活性剤、ポリアニオン、又は、抗菌剤等の１種若しくは２種以上を、固定相を構成するクロマトグラフ媒体上の、移動相の移動経路上に保持させておくことも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。
　本発明のイムノクロマトグラフ用試薬組成物中に含有させる上記添加剤の濃度としては、０．０１～２０重量％の範囲が好ましく、０．１～１０重量％の範囲がより好ましく、０．５～５重量％の範囲がさらに好ましい。０．０１重量％以上であれば、非特異的反応を抑制でき、正確な判定が可能である。２０重量％以下であれば、経済的である。
　本発明のイムノクロマトグラフ用試薬の使用方法としては、展開液として最適に用いることができるものであり、また、検体試料の希釈液としても好適に使用することができるものである。さらに、上記の使用方法に限定されるものではなく、イムノクロマトグラフ用試薬の成分をイムノクロマトグラフ媒体上の、移動相の移動経路上に設ける態様で使用することもできる。
　展開液や希釈液として用いる場合には、通常、溶媒として水を用い、これに緩衝液、蛋白質、塩及び非イオン性界面活性剤を加える。加える順序は特に特定されず、同時に加えても差支えない。展開液や希釈液として用いる場合には、検出する試料（検体）と該液を予め混合したものを、サンプルパッド（試料滴下部）上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に試料（検体）をサンプルパッド（試料滴下部）上に供給・滴下して後、展開液をサンプルパッド（試料滴下部分）上に供給・滴下して展開させてもよい。
　本発明のイムノクロマトグラフ用試薬をイムノクロマトグラフ媒体上の、移動相の移動経路上に設けて使用する場合には、その方法としては、例えば、イムノクロマトグラフィー装置におけるサンプルパッド（試料滴下部位）中へ塗布又は含浸させた後、乾燥させる方法により、サンプルパッド中へ担持又は保持させる態様とすることができる。
　本発明のイムノクロマトグラフ用試薬をイムノクロマトグラフ媒体上に保持又は担持させる他の態様としては、試料滴下部の端部と吸収部との間の任意の場所に、添加剤（試薬）保持部を設けて、そこに保持させる態様とすることができる。例えば、試料滴下部、標識物質保持部及びイムノクロマトグラフ媒体上とすることもできる。
　本発明の検出対象物としては、それと特異的に結合する、例えば、抗原－抗体反応のように特異的に結合する物質が存在する又は製造できるものであればよく、特に限定されない。検出対象物が完全抗原といったそれ自体が抗原性を有するものであっても、又はハプテン（不完全抗原）といったそれ自体が抗原性を有しなくても化学的変成物とすることにより抗原性を持つに至るものであってもよい。
　これらの検出対象物と特異的に結合する物質が存在する又は製造できるものであればよく、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体とすることができる。本発明の検出対象物としては、生成する亜硝酸により抽出が可能であるような検出対象物に特異な多糖体抗原である。例示すれば、厚いペプチドグリカン層を有するグラム陽性菌が挙げられ、なかでも、球菌類が好ましく、特に好ましいものとしては、溶連菌抗原等の細菌抗原が挙げられる。
　本発明の最適な検体は、鼻汁、鼻腔拭い液、咽頭拭い液又は痰である。これらの検体を本発明の検体希釈液を使用して予め希釈処理し、検査デバイス上に供給して抽出することにより、呼吸器疾患患者等から採取される溶連菌抗原を被検出物質として的確に検出することができる。
　本発明のイムノクロマトキットとしては、検体処理液と、試料滴下部、抗原抽出部、標識物質保持部、検出部及び吸収部を有するイムノクロマトグラフ媒体から構成される、試料中のグラム陽性菌を検出するためのイムノクロマトグラフ媒体よりなるキットであって、検体処理液及び／又は試料滴下部のいずれか一方に又は両方に環状オリゴ糖及び亜硝酸化合物のそれぞれを単独に又は同時に含有させることにより、環状オリゴ糖及び亜硝酸化合物を含むものであり、かつ該亜硝酸化合物と抗原抽出部に保持されている有機酸との反応によって亜硝酸を生成する抗原抽出部位を備えたイムノクロマトキット、にある。
　このイムノクロマトキットは、環状オリゴ糖をイムノクロマトキットの１キット当り含有量が０．１～５μｇであることが好ましい。このキットを構成する試料滴下部（２）及び抗原抽出部（３）が、標識物質保持部（４）の試薬展開方向上流に位置するように配置されたイムノクロマトキットである。有機酸含有抗原抽出部（試薬保持部（３））は、クエン酸と共にクエン酸塩を保持することが好ましい。
　検体中の被検出物質を検出するためのイムノクロマト法に用いる検査キット（以下、「イムノクロマトキット」と略す。）は、その構造及びその動作・検出手法は、公知である。
　従来のイムノクロマトキットのサンプルパッド中へ、本発明の検体処理液を使用して予め検体を希釈処理して得られた検体試料を滴下して、イムノクロマトグラフ媒体上を吸収部位の方向へ展開させて展開中に検体中の抗原を抽出し、抗原抗体反応により検体中の被検出物質の同定・定量等の検査をすることができる。
　イムノクロマトキットについて、以下に説明をする。
　通常、イムノクロマトキットは、クロマトグラフ媒体（１）（「検出部（判定部）」を有する。）、試料滴下部（２）（「サンプルパッド（２）」、「試薬保持部（２）」ともいう。）、抗原抽出部（３）（「有機酸含有抗原抽出部（３）」、「試薬保持部（３）」ともいう。）、標識物質保持部（４）（コンジュゲートパッド（４）ともいう。）、吸収部（５）（「展開速度コントロール部（５）」ともいう。）、検体希釈液（抽出液）（６）及びバッキングシート（７）から構成されている。
　イムノクロマトグラフィー装置について、以下に説明をする。
　本発明のイムノクロマトグラフ用試薬の成分をイムノクロマトグラフ媒体上で実施する、いわゆるイムノクロマトグラフ検出法を適正に実施するに於いて、特に抗原抽出効率の向上のために工夫したキットの構造を示すのが図１（ａ）、（ｂ）である。この図１（ａ）、（ｂ）に基づいて説明をする。
　図１に示すキットの構造の構成要素は、１；クロマトグラフ媒体（１）であり、２；試薬滴下部（試薬保持部）（２）であり（サンプルパッドと総称することもできる。）、３；抗原抽出部（試薬保持部）（３）であり（有機酸含有抗原抽出部（３）と総称することができる。）、４；標識物質保持部（４）であり（コンジュゲートパッドと総称することができる。）、５；吸収部（５）、６；検体希釈液（抽出液）（６）及び７；バッキングシート（７）より構成される。本発明は、少なくともこの１～５の各要素から構成される構造を有するイムノクロマトキットである。
　本発明は、このような構成要素の配列順序が性能に影響することを知見したものであり、この構造を構成する要素の並びと、展開の作用を、下記の二点で順次比較して例示すれば、
 
　　本発明の構造（１）　　　２　　３　　４　　１　　５　　展開良好
　　比較対象構造（２）　　　３　　２　　４　　１　　５　　展開不良
 
というように、この１～５の構成要素の順位を任意に変えれば、特に展開作用のような挙動に影響を与えることになり、それらの構成要素の組み合わせにおいて、本発明の図１（ａ）、（ｂ）に見るような要素の組み合わせの展開順序が、最も好ましい態様であり、若干展開性などを問題にしない場合には、構成要素の順序を変えた構造にすることも可能である。
　一方、図１（ａ）、（ｂ）のイムノクロマトキットは、基本的には、図１に示す構成要素からなる検査具であるが、特に「３；抗原抽出部（３）」の要素部分を省略すれば、この場合に、亜硝酸の用事調製が複雑であり、円滑な検査に支障となる。
　このように、本発明の図１に見るようなキットは、検査の性能や検査上の取り扱いにおいて格別の機能を果たすことを本発明者等は知見したものである。
　試料滴下部（２）及び抗原抽出部（３）は、試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに反応部へと試料が移動していくような性質の、ガラス濾紙等の多孔質シートで構成されている。
　試料滴下部（２）には、抗原抽出部（３）に含有されている有機酸と反応して亜硝酸を生成する亜硝酸塩を含有することができるが、亜硝酸塩はここに含有する代わりに検体希釈液（６）中に含有してもよく、又はそれら両方に含有させてもよい。亜硝酸塩は、有効に機能するためには、有機酸を含有する部位より展開上流部位であれば含有させることができる。
　検体希釈液（６）には、環状オリゴ糖を含有することができるが、環状オリゴ糖はここに含有する代わりに試料滴下部（２）中に含有してもよく、又はそれら両方に含有させてもよい。亜硝酸塩は、有効に機能するためには、有機酸を含有する部位より展開上流部位であれば含有させることができる。
　抗原抽出部（３）は、抗原抽出部としての機能を果たすものであるから、有機酸を含有しており、また展開を均一にするために非イオン性界面活性剤のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（商品名）やＴｒｉｔｏｎＸ－１１４（商品名）を含有させた。保存安定性も向上した。
　標識物質保持部（４）には、標識成分によって試薬成分を標識した標識試薬を保持させてなる。標識成分としては、例えば、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、酵素及び蛍光化合物等があり、なかでも金属コロイド粒子が最適である。試薬成分としては、分析物を認識する能力を有する粒子又は分子であり、好ましくはモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体又はそのフラグメントである（第二試薬）。
　金属コロイド粒子とは、銀、白金、ゲルマニウム、ロジウム及びパラジウムのような貴金属の単粒子又は複合粒子が任意に好ましく使用できる。特に金が色相の変化に敏感であり、最も適している。金属コロイド粒子の状態を見れば、平均粒径は１～５００ｎｍ、好ましくは１０～２５０ｎｍ、より好ましくは３５～１００ｎｍ程度であり、媒体に対して、０．０００１～０．０８重量％、好ましくは０．００２～０．０６重量％程度の濃度で含むものが好適に使用される。
　本発明の金ナノ粒子とは、このような平均粒径を有する、金のナノ径の各種金コロイド粒子をさす。免疫学的測定においては、この金コロイドの粒径、粒度分布及び色調等を考慮して、金コロイド粒子の表面に白金コロイド粒子を担持させた、金コロイド複合粒子とすることにより、免疫学的測定用の標識とすること、蛋白質の染色剤としての有用性を高める為に使用することができる。さらに、金属粒子表面に結合できる官能基と抗体と結合できる反応基を有するコロイド状金標識増幅剤のような、いわゆる増感剤を使用すれば測定感度を高めることができる。
　クロマトグラフ媒体（１）は、膜担体上に検出部位を作製したものである。膜担体としては、毛細管現象により試料検体を吸収し移動させることができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース及びこれらの混合繊維からなる人工ポリマーからなる群から選択される。
　検出部位には、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体又はそのフラグメント（第一試薬）が、ニトロセルロースのシート上に担持固定されている。
　吸収部（５）には、過剰の試料を迅速に吸収する能力を有する材料であるガラス繊維、セルロース繊維等からなる濾紙が汎用されているが、さらに吸収した液体が逆流しないように保持する能力を有する材料を用いればより好ましい（日本国特開２０１２－１８９３４６号公報）。
　バッキングシート（７）は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより片面が粘着性を有し、該粘着面上に、試料滴下部（２）、抗原抽出部（３）、標識物質保持部（４）、検出部を有するクロマトグラフ媒体（１）、及び吸収部（５）の一部又は全部が密着して設けられている。バッキングシート（７）は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。
　検出部位に用いる試薬成分（第一試薬）及び標識試薬に用いる試薬成分（第二試薬）は、その一方又は両方がモノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。
　モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体若しくはそのフラグメントは、公知であり、入手可能であり、公知の方法により調整することができる。抗体産生動物種としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ及びウマ等である。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのいずれでもよい。
　本発明の実施例においては、標識物質保持部（４）に用いる試薬成分（第二試薬）及び検出部位に用いる試薬成分（第一試薬）の両方に、ウサギ由来抗溶連菌ポリクローナル抗体を用いた場合を記載しているが、これに限定されるものではない。
　典型的なキット構成における判定の原理を概説すると、
１．検体（試料）を検体希釈液（６）で希釈処理した検体希釈液混合物を、試料滴下部（２）上に、所定量（通常、０．１～２ｍｌ）滴下する。検体希釈液混合物が滴下されると、検体希釈液混合物は試料滴下部（２）に迅速に吸収されるが、速やかに移動を始める。また、試料滴下部（２）中に乾燥・保持されていた亜硝酸塩及びシクロデキストリンを含む試薬組成物は、検体希釈液混合物の水分に溶解し、検体（試料）と共に移動を始める。
　２．亜硝酸塩を溶解含有した検体希釈液混合物は、まず抗原抽出部（３）へと移動する。ここで抗原抽出部（３）中に乾燥・保持されていた有機酸は、移動してきた検体希釈液混合物中に溶解している亜硝酸塩と接触反応して亜硝酸を生成する。この亜硝酸は検体（試料）中に溶連菌が存在する場合に、該菌体表面の多糖体を抽出する。
　３．次いで、亜硝酸を生成含有する検体希釈液混合物は、標識物質保持部（４）へと均一且つスムーズに移動する。ここを検体希釈液混合物が通過する際、標識物質保持部（４）に保持されていた標識試薬（第二試薬）が検体希釈液混合物の水分に溶解し、検体（試料）と共に移動する。
　４．ついで、検体希釈液混合物の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフ媒体（１）上の検出部位を通過する。ここでは、検体希釈液混合物中に溶解しているイムノクロマトグラフ用試薬組成物により非特異的結合反応は抑制され、抗原・抗体の特異的結合反応により、検体希釈液混合物中に被検出物質（例えば、多糖体）が存在する場合には、検出部位に担持固定されている抗体と標識試薬とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が着色する。検体試料中に被検出物質（例えば、多糖体）が存在しない場合には、検体希釈液混合物の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフ媒体（１）上の検出部を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部位が着色しない。
　５．最後に、検体希釈液混合物の水分は、吸収部（５）へと移動する。
このように、検体（試料）中の被検出物質（例えば、多糖体）の有無を正確に判定することができる。
　以下、本発明の有効性を、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明は、亜硝酸ナトリウムを含む試料滴下部（２）とクエン酸を含む抗原抽出部（３）を有し、抽出効率を最適化するための展開速度コントロール部材（吸水量８０－２００ｍｇ／ｃｍ２）からなる吸収部（５）を有するイムノクロマトキットである。
　［実施例１］
（１）クロマトグラフ媒体（１）上への判定部の作製
　メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、２５０ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。５質量％のイソプロパノールを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにウサギ由来抗溶連菌ポリクローナル抗体（第一抗体）を希釈し、その希釈された溶液１５０μＬを抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）によりメンブレン上に１ｍｍの幅で塗布し、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体（１）上に判定部を作製した。
（２）標識物質溶液の作製
　金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：平均粒子径４０ｎｍ）０．５ｍＬに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈したウサギ由来抗溶連菌ポリクローナル抗体（第二抗体）抗体０．１ｍＬ加え、室温で１０分間静置した。次いで、１０質量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．１ｍＬを加え、標識物質溶液を作製した。
（３）亜硝酸ナトリウム及び環状オリゴ糖を含む試料滴下部（試薬保持部）（２）の作製
　１２×１００ｍｍのグラスファイバーコンジュゲートパッド（メルク社製）に、１ｍｍｏｌの亜硝酸ナトリウムを含む２μｍｏｌのβ－シクロデキストリンを含む水溶液０．６ｍＬを塗布し、凍結乾燥させ、試料滴下部（試薬保持部）（２）を作製した。
（４）クエン酸を含む抗原抽出部（試薬保持部）（３）の作製
　１２×１００ｍｍのグラスファイバーコンジュゲートパッド（メルク社製）に、５０μｍｏｌのクエン酸を含む１．７質量％の非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００水溶液０．６ｍＬを塗布し、凍結乾燥させ、抗原抽出部（試薬保持部）（３）を作製した。
（５）イムノクロマトグラフ用試験片の作製
　上記作製した標識物質溶液２００μｌに１００μｌの２５質量％トレハロース水溶液と８０μｌの５質量％のカゼイン（終濃度：１質量％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えたものを１２×１００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部（４）を作製した。次に、バッキングシート（７）から成る基材に、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部（５）、上記作製した判定部を有するクロマトグラフ媒体（１）、標識物質保持部（４）、試料滴下部（２）、抗原抽出部（３）、をイムノクロマトグラフ展開方向上流から表１に示す順（展開方向は右から左）に貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、イムノクロマトグラフ用試験片とした。
（６）検体希釈液の作製
　０．５質量％のＴｗｅｅｎ２０、０．６質量％ポリビニルピロリドン（平均分子量３６万）、１質量％の牛血清アルブミンと１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）から成る検体を希釈しイムノクロマトグラフ試験片へ添加し展開するための検体希釈液とした。
（７）測定
　上記作製したイムノクロマトグラフィー用試験片及び検体希釈液を用いて、以下の方法で検体中の抗原である溶連菌の存在の有無を測定した。即ち、抗原を加えない検体希釈液を陰性検体試料とし、また、陰性検体試料に、不活化したＡ群β溶血性レンサ球菌（溶連菌）を２×１０６ｏｒｇ／ｍＬとなるように加えたものを陽性検体試料とした。
　陰性検体試料、陽性検体試料とも１５０μＬをイムノクロマトグラフィー用試験片の展開方向の最上流部、具体的には、実施例１、２では、試薬滴下部（２）上に、比較例１、２では、抗原抽出部（３）上に、比較例３及び実施例３では、標識物質保持部（４）上に添加し展開させ、１５分後に目視判定をした。テストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、鮮明に確認できるものを「＋＋」、赤い線は確認できるが、非常に色が薄いものを「±」、赤い線を確認できないものを「－」とした。展開性の評価は、展開液がクロマトグラフィー媒体上へ流れなかったもの、展開液はクロマトグラフィー媒体上で展開されるが金ナノ粒子標識試薬が流れなかったもの、クロマトグラフィー媒体上での展開中の液の先端流形にムラが生じたもの、を展開不良と判定し、不良がなかったものを良好と判定した。表１に結果を示す。
　同様に、上記実施例１のクロマトグラフキットの構成において、試薬滴下部（２）に含有させるβ－シクロデキストリン（以下、「β－ＣＤ」と略す。）に替えてγ－シクロデキストリン、Ａｍｉｎｏ－β－シクロデキストリン、ｍβ－シクロデキストリン、シクロデキストリン無添加の各場合について検査デバイスの陰性・陽性検体での評価を行った。亜硝酸含有部に各ＣＤを０．７５μｇ／ｔｅｓｔとなるように保持した。
　比較のため、ＣＤを含まない検査デバイスも作成し、合わせて評価を行った。その結果を図２に示す。下記の検査条件で実施した。
　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ：４×１０５ｏｒｇ／ｍＬ溶連菌（判定時間８分）
　Ｎｅｇａｔｉｖｅ：展開液（判定時間３０分）
　図２の結果から明らかなように、β－ＣＤ、γ－ＣＤを亜硝酸含有部に保持することで、陰性検体での発色が低下し、陽性検体での発色が向上した。β－ＣＤ誘導体では感度の向上は見られるものの、陰性検体での発色がβ－ＣＤ、γ－ＣＤを用いた場合より高くなっているため、Ｓ／Ｎ比がβ－ＣＤ、γ－ＣＤを用いた場合より小さくなっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表中、１～５の数字は、１；クロマトグラフ媒体（１）、２；試料滴下部（２）、３；抗原抽出部（３）、４；標識物質保持部（４）、５；吸収部（５）を表わす。
　これらの結果から、実施例１～３は、クエン酸を含む抗原抽出部（３）が試薬滴下部（２）の展開方向下流になっているため、試料中のタンパク成分が酸の影響を受けず展開性は良好であった。
　比較例１～３では、展開性は不良であった。これらの場合は、クエン酸を含む抗原抽出部（３）が試薬滴下部（２）の展開方向上流になっているため、試料中のタンパク成分が酸により析出し、目詰まりを起こすなどの理由が推察される。上記の試験結果から、試薬滴下部（２）は、抗原抽出部（３）の展開方向上流であることが必須条件である。
［実施例４～１２］
　一試験（ｔｅｓｔ）あたりの亜硝酸ナトリウム、環状シクロデキストリン及びクエン酸を表２に記載の各種量とし、実施例１と同じ手順態様で実施した。陽性検体は、不活性溶連菌を一試験（ｔｅｓｔ）あたり濃度が２×１０６ｏｒｇ／ｍＬのものを１５０μＬ用いた。
　そして、同じ目視判定基準に従って判定した。その判定結果を表２に示す。
［実施例１３］
　抗原抽出部（３）へクエン酸の代わりに酒石酸を含有させたこと以外は、実施例１と同じ手順態様で実施した。そして、同じ目視判定基準に従って判定した。その判定結果を表２に示す。
［実施例１４］
　試薬滴下部（２）へ亜硝酸ナトリウムを含有させず、検体希釈液中に５０μｍｏｌ／ｔｅｓｔの亜硝酸カリウムを加えたこと以外は、実施例１と同じ手順態様で実施した。そして、同じ目視判定基準に従って判定した。その判定結果を表２に示す。
［実施例１５］
　試薬滴下部（２）へβ－シクロデキストリンを含有させず、検体希釈液中に０．１μｍｏｌのβ－シクロデキストリンを加え、抗原抽出部（３）へクエン酸の代わりにイタコン酸を含有させたこと以外は、実施例１と同じ手順態様で実施した。そして、同じ目視判定基準に従って判定した。その判定結果を表２に示す。
　実施例１４及び１５は亜硝酸塩又は環状オリゴ糖を検体希釈液に保持させた形態である。
［実施例１６］
　試薬滴下部（２）へβ－シクロデキストリン及び亜硝酸ナトリウムを含有させず、検体希釈液中に５０μｍｏｌの亜硝酸ナトリウム及び０．１μｍｏｌのβ－シクロデキストリンを加えたこと以外は、実施例１と同じ手順態様で実施した。そして、同じ目視判定基準に従って判定した。その判定結果を表２に示す。
　実施例１６は亜硝酸塩及び環状オリゴ糖を検体希釈液に保持させた形態である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　　　・　陽性検体は、不活化溶連菌を一試験あたり濃度が２×１０６ｏｒｇ／ｍＬのものを１５０μＬ用いた。
　　　・　Ａｍｉｎｏ－β－シクロデキストリン：　３Ａ－アミノ－３Ａ－デオキシ－（２ＡＳ，３ＡＳ）－β－シクロデキストリン水和物
　　　・　ｍβ－シクロデキストリン：　６－０－α－Ｄ－マルトシル－β－シクロデキストリン　（分子量　１４５９）
　　　・　クエン酸の代わりに酒石酸を用いた。
　　　・　亜硝酸ナトリウムの代わりに亜硝酸カリウムを用いた。
　　　・　クエン酸の代わりにイタコン酸を用いた。
　亜硝酸ナトリウムは、一試験当り１０～１００μｍｏｌ用いることが好ましい。
［実施例１７～２１］
　クエン酸をクエン酸とクエン酸３ナトリウムの混合物として表３に記載の各種比率で用いたこと以外は、実施例４と同じ手順態様で実施した。そして、同じ目視判定基準に従って判定した。その判定結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　この結果から、イムノクロマト法による溶連菌検査を行うにおいて、クエン酸は、クエン酸とクエン酸のアルカリ金属塩との混合物として用いることが好ましく、その比率が５：１～１：３で用いることがより好ましく、４：１～２：３で用いることが最適であることが明らかとなった。また、これら態様で用いれば、タンパク成分の析出もなく、抗体感作金コロイドの凝集が起きず、展開速度も速く保ったまま、Ｓ／Ｎ比が向上し正確な判定ができる。
［実施例２２］
　検体希釈液の作製において、牛血清アルブミンの代わりにカゼインを１質量％用いたこと以外は、実施例４と同様に試験を行った。結果は、陰性検体での偽陽性は見られず、カゼインの亜硝酸との反応による析出に由来する展開不良も確認されず、陽性検体で実施例４と同等の検出感度が得られた（５回の繰り返し試験で、陽性検体は全て＋以上の判定）。
　これらの結果から、イムノクロマト法による溶連菌検査を行うにおいて、亜硝酸Ｎａは、一試験あたり１０～１００μｍｏｌ用いることが好ましく、クエン酸は、一試験あたり０．１～４μｍｏｌ用いることが好ましく、０．１～３μｍｏｌ用いることがより好ましいこと、また、環状オリゴ糖は、一試験あたり０．０２～０．５μｍｏｌ用いることが好ましく、この範囲内で用いれば、タンパク成分の析出がなく、抗体感作金コロイドの凝集が起きず、展開速度も速く、Ｓ／Ｎ比が高い正確な判定ができるという顕著な効果を奏することが明らかとなった。
　本発明は、呼吸器系感染症の一つであるグラム陽性菌、特に、Ａ群β溶血性レンサ球菌の迅速且つ簡便な検査、診断に使用することができるという優れた利点を有するため、病院、クリニックのみならず格別な技能を有しない個人であっても、高感度で迅速な臨床検査が可能であり、感染者の早期診断や治療に繋がるという利用可能性を有する。さらに、　不安定な化合物である亜硝酸は、その検査の都度に、亜硝酸塩を酸性溶液と反応させる亜硝酸生成工程を設けるという煩雑な用時調製をする必要がないので、本発明のキットの取り扱い、検査効率及び検査精度を上げるばかりでなく、検査の効率化、省力化も向上するので、検査機関に係わる産業分野、医療分野に係わる産業分野の発展に著しく寄与するものである。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１３年８月８日付で出願された日本特許出願（特願２０１３－１６４８１９）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　　１．クロマトグラフ媒体（１）
　　２．試料滴下部（２）（試薬保持部（２））
　　３．抗原抽出部（３）（試薬保持部（３））
　　４．標識物質保持部（４）
　　５．吸収部（５）
　　６．検体希釈液（抽出液）（６）
　　７．バッキングシート

Claims (19)

  1. 　検体中の検出対象物の抗原を抽出剤により抽出して検出する免疫測定法において、環状オリゴ糖の存在下に行うことを特徴とする免疫測定法。
  2. 　抽出剤が、有機酸と亜硝酸化合物の反応によりデバイス上で生成される亜硝酸であることを特徴とする請求項１に記載の免疫測定法。
  3. 　環状オリゴ糖がα－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン又はそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫測定法。
  4. 　亜硝酸化合物が、亜硝酸塩であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫測定法。
  5. 　有機酸が有機カルボン酸である請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫測定法。
  6. 　抽出するｐＨ条件が、７．０未満～６．５である請求項１～５のいずれか１項に記載の免疫測定法。
  7. 　抗原が、多糖体である請求項１～６のいずれか１項に記載の免疫測定法。
  8. 　検出対象物が、グラム陽性菌である請求項１～７のいずれか１項に記載の免疫測定法。
  9. 　グラム陽性菌が、溶血性レンサ球菌である請求項１～８のいずれか１項に記載の免疫測定法。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫測定法において使用する、環状オリゴ糖を含有する免疫測定用試薬。
  11. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫測定法を行うためのイムノクロマトグラフィー装置。
  12. 　検体希釈液と、試料滴下部、抗原抽出部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体、及び吸収部から構成されていて、かつ抗原抽出部に有機酸が保持されてなる検体中の検出対象物を検出するためのイムノクロマトキットであって、検体希釈液及び／又は試料滴下部のいずれか一方又は両方に、環状オリゴ糖、亜硝酸化合物又はそれらの混合物のうちのいずれか一つ以上を含有することにより、環状オリゴ糖及び亜硝酸化合物を含有するようにしたことを特徴とするイムノクロマトキット。
  13. 　環状オリゴ糖は、イムノクロマトキットの１キット当り含有量が０．１～５μｇであることを特徴とする請求項１２に記載のイムノクロマトキット。
  14. 　環状オリゴ糖がα－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン又はそれらの誘導体の１以上であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載のイムノクロマトキット。
  15. 　有機酸と共に非イオン性界面活性剤を保持することを特徴とする請求項１２～１４のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  16. 　亜硝酸化合物が、亜硝酸塩であることを特徴とする請求項１２～１５のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  17. 　抗原抽出部に、クエン酸と共にクエン酸塩を保持することを特徴とする請求項１２～１６のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  18. 　検出対象物がグラム陽性菌である請求項１２～１７のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
  19. 　請求項１～９のいずれかに記載の免疫測定法を行うために使用する請求項１２～１８のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。
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