JPH0240559A - 液体単一試薬アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、イムノアッセイ試薬、特に競合的阻害アッセ
イ用試薬に関する。

〔従来の技術およびその課題〕

種々様々なイムノアッセイは、試料中の分析体（ａｎａ
ｌｙｔｅ）が固定量の抗−分析体抗体を目当てに分析媒
体中に存在する既知量の分析体（通常ラベル化された分
析体）と競争する競合阻害に基づいている。酵素ラベル
が競合阻害アッセイにおいてしばしば利用されており、
この場合抗−分析体抗体と酵素−分析体接合体との結合
が、基質の酵素触媒的分解の速度を変化させ、普通は減
少させる。

幾つかのそのようなアッセイは、活性酵素を補完および
形成するβ−ガラクトシダーゼ断片の能力を基にしてい
る。特に、β−ガラクトシダーゼ酵素供与体（ＥＤ）は
β−ガラクトシダーゼ酵素受容体（ＥＡ）と結合すると
活性なβ−ガラクトシダーゼ酵素を形成する。小さい分
析体または分析体接合体をある部位でＨＤに接合しても
β−ガラクトシダーゼ触媒活性の速度に影響を及ぼさな
い。しかしながら、ＥＤ−分析体接合体が抗−分析体抗
体と結合すると、反応の初期状態の間の酵素触媒反応速
度が減少する。この酵素触媒反応速度の減少が複数の分
析体の定量に利用されており、ここでアッセイ媒質中に
存在するＥＤ−分析体接合体と試料中に存在する分析体
とが、ＥＡの添加前に抗−分析体抗体を目当てに競争す
る。β−ガラクトシダーゼ触媒反応速度は、試料中に存
在する分析体の量が増加するにつれて増加する。

競合アッセイでは、一般に試料の添加前にラベル化分析
体と抗−分析体抗体とを混合することはできない。補完
アッセイでは、普通、ＨＤ−分析体接合体および試料と
抗−分析体抗体とのインキュベーション後までＥＤとＥ
Ａとを分離しておく。これは、定量において使われるア
ッセイの試薬の最終使用者による注意深い配給を必要と
する。さらに、大抵のアナライザーは単一分析体−特異
的試薬および一般試薬を各試料ウェルに分配するだけで
あるため、そのようなアッセイはオートメーションにす
ぐには適応できない。

〔関連文献〕

改変されたβ−ガラクトシダーゼ酵素供与体および酵素
受容体は、化学合成および組換え操作により調製されて
いる。改変された断片は補完の際のβ−ガラクトシダー
ゼ活性を保持しており、そして該断片の生産および該断
片への分析体の結合を容易にする。例えば米国特許第４
，７０８，９２９号およびその中に引用された文献を参
照のこと。

シクロデキストリンは商業的に入手可能であり、そして
多数の有機分子をトラップできる、包接化合物（タラス
レート化合物）を形成する周知の化合物である。それら
の性質および製造方法の記載は、例えば、Ｂｅｎｄｅｒ
ら、Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅ１ｖ　Ｙｏｒ
ｋ、１９７８（９６ページの本）；Ｆｒｅｎｃｈ、　Ａ
ｄｖ、Ｃａｒｂｏｈ　ｄｒ、ｃｈｅｍ、　（１９５７）
　１２　：　１８９−２６０　；　　Ｔｈｏｍａら、５
ｔａｒｃｈ　：　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃ
ｈｎ。

１ｏｇｙ、第１巻、Ｗｈｉｓｔｌｅｒら編、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９６５．第２０９−２４９頁；並
びにＣｒａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓ、　（１９６
７）耳ｉ’４　：　６２５−６３５を参照のこと。

この化合物は天然に存在しており、そして寒天へのバシ
ラス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎ
ｓ）アミラーゼの作用により得られる。

ＧｉｂｂｏｎｓらのＥＰＯ出願第８７３０２５１１．８
号公開第０２４３００１号は、特異的結合ペア（ｓｂｐ
）メンバーを、限定されたｓｂｐメンバーとそれの相補
的メンバーとの結合を一時的に不可能にする物質の中に
可逆的に閉じ込めるという単一試薬アッセイ法を記載し
ている。好ましい態様においては、酵素ハプテン接合体
をリポソーム中に閉じ込めておき、そして界面活性剤の
添加によりアッセイ反応が開始される。

〔課題を解決するための手段〕

通常では相互に作用する試薬を液体単一試薬において一
緒にし、そして界面活性剤を使って複合体形成を阻害し
、次いでシクロデキストリンの添加により阻害を逆転さ
せるための方法が提供される。この方法は診断的なイム
ノアッセイにおいて特に用途を見出す。本発明を容易に
する試薬もまた提供される。

〔特定の実施態様〕 特異的結合ペア複合体を形成する特異的結合ペアの相補
的メンバー間の反応が界面活性剤の使用により可逆的に
阻害される方法が提供される。次にシクロデキストリン
の添加により反応が開始される。この方法は、特異的結
合ペアの相補的メンバーの混合物を複合体形成の開始前
に一緒にすることが望ましいようないかなる時にでも使
用できる。この方法は診断的アッセイにおいて特定の適
用を見出す。

この方法は、特異的結合ペアの相補的メンバー間の複合
体形成を利用する方法において、反応阻害量の界面活性
剤および該特異的結合ペアの相補的メンバーを含む調製
された液体単一試薬を提供することを含んで成る。この
方法を実施する間に、複合体形成を可能にするのに十分
な量のシクロデキストリンが前記単一試薬に添加される
。

この液体単一試薬は、阻害が可逆的であるため、複合体
形成を開始することなく特異的結合ペアの相補的メンバ
ーを一緒にすることが望ましい場合にいつても使用する
ことができる。この複合体形成の可逆的阻害は、特異的
結合ペアの相補的メンバーの正確な測定が要求される場
合、例えば一方または両方のメンバーが極限量で存在す
る場合に望ましいであろう。この方法は、アッセイ手順
の第一段階として特異的結合ペアのうちの一方または両
方の相補的メンバーをアッセイ媒質中で試料と一緒にす
るような診断的アッセイにおいて適用を見出す。本発明
によれば、試料と混合することになっている成分が液体
単一試薬として提供され、ここで複合体形成を開始する
ことなく特異的結合ペアの相補的メンバー゛が一緒にさ
れる。測定段階を削除することおよび複合体形成を開始
するためにシクロデキストリン溶液を添加すること以外
、単一試薬製剤を使うアッセイ方法、条件および試薬は
従来技術のものと大して違わないだろう。

前に言及したように、本発明の液体単一試薬は反応阻害
量の界面活性剤および特異的結合ペアの相補的メンバー
を含んで成る。アッセイ媒質の他の成分、例えば酵素基
質、緩衝液等が液体単一試薬組成物の中に含まれてもよ
い。これらの付加的成分は特定のアッセイプロトコール
に依存して異なることができる。アッセイ成分の機能を
妨害しないような安定剤、殺菌剤または防腐剤が存在し
ていてもよい。この液体単一試薬は液体の形でアッセイ
に使われるだろうが、液体単一試薬は液体として用意さ
れてもよくまたは乾燥もしくは凍結乾燥されて粉末とな
っていてもよい。粉末組成物は、アッセイに依存して緩
衝液、水または試料中に配合して再構成できる。

この液体単一試薬は、タンパク質、薬剤、ポリヌクレオ
チドまたは多糖を含むいずれかの分析体を従来技術によ
り定量するアッセイ方法において利用できる。この方法
は、そのような分析体を含有するどんな水性試料でも使
用できる。分析体は、体液、普通は患者の血清、血漿、
唾液、尿もしくは全血中に存在する小さい分析体である
ハプテン、またはタンパク質のような大きい分析体であ
ることもできる。試料の前処理は常法に準するであろつ
。

診断的アッセイに適用を見い出し得る多数の特異的結合
ペアが知られている。普通は、特異的結合ペアの少なく
とも一方の相補的メンバーがタンパク質またはタンパク
質断片であり、例えば、酵素供与体／酵素受容体、抗原
／抗体、レクチン／糖などであろう。多くの競合阻害ア
ッセイは既知量の分析体試薬（普通はラベル化された分
析体）を使用し、この分析体が予め決定された量の相補
的結合ペアメンバーを目当てに試料中の分析体と競争す
る。受容体として、ポリクローナルかまたはモノクロー
ナルの抗体が普通便われるだろう。

あるいは抗体の代わりに、分析体と特異的に結合するレ
セプター、例えばビタミンＢｉｇ−内因子、チロキシン
−チロキシン結合グロブリン、および葉酸−葉酸塩結合
タンパク質を使うことができる。

特異的結合ペアのどちらかのメンバーがラベルと結合し
ていてもよい。このラベルは酵素、蛍光物質、色素、基
質または化学発光物質であることができる。望ましくは
、ラベルは分析体または分析体類似体と結合して酵素−
分析体接合体を生ずるような酵素である。

特異的結合ペアの相補的メンバー同士の反応を阻害する
ために使用でき、そしてシクロデキストリンにより中和
することのできる多数の界面活性剤が存在する。例えば
、多数の生物学的洗浄剤（界面活性剤）がシグマ・ケミ
カル・カンパニーによる生化学および有機化合物の１９
８８年のカタログの第３１６−３２１頁に挙げられてい
る。そのような界面活性剤は４つの基本的なタイプ：陰
イオン型、陽イオン型、両性イオン型および非イオン型
に分類される。陰イオン界面活性剤の例としては、アル
ギン酸、カプリル酸、コール酸、１−デカンスルホン酸
、デオキシコール酸、ｌ−ドデカンスルホン酸、Ｎ−ラ
ウロイルサルコシンおよびタウロコール酸が挙げられる
。陽イオン界面活性剤の例には、ドデシルトリメチルア
ンモニウムブロマイド、ベンズアルコニウムクロライド
、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライ
ド、セチルピリジニウムクロライド、メチルベンズエト
ニウムクロライド、および４−ピコリンドデシルスルフ
ェートが含まれる。両性イオン界面活性剤の例としては
、３−（（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアン
モニオ〕−１−プロパンスルホネート（通例Ｃ）ＩＡＰ
ｓと略される）、３−（（コールアミドプロピル）−ジ
メチルアンモニオ〕２−ヒドロキシ−１−プロパンスル
ホネート（通常ＣＨＡＰＳＯと略される）、Ｎ−ドデシ
ル−Ｎ、　　Ｎジメチル−３−アンモニオ−１−プロパ
ンスルホネート、およびリゾ−α−ホスファチジルコリ
ンが含まれる。非イオン性界面活性剤の例としては、デ
カノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ジエチレングリコー
ルモノペンチルエーテル、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコ
ピラノシド、脂肪酸（特にｃｌ□Ｃ２゜脂肪酸）のポリ
オキシエチレンエーテル（例えば、商標Ｔｒｉｔｏｎの
固体）、脂肪酸アルコールのエチレンオキシド縮金物（
例えば商標名Ｌｕｂｒｏｌの固体）、ポリオキシエチレ
ンソルビタン脂肪酸エーテル（例えば商標名Ｔｗｅｅｎ
の固体）、およびソルビタン脂肪酸エーテル（例えば商
標名５ｐａｎの固体）が含まれる。

界面活性剤は、少なくとも特異的結合ペアの相補的メン
バー間の複合体形成を阻害するのに十分な濃度において
液体単一試薬中に存在するであろう。望ましくは、界面
活性剤の濃度は、特異的結合ペアの両メンバー、試料の
分析体または他のどんなアッセイ試薬でも変性させるに
は不十分であろう。どの場合でも界面活性剤の作用はシ
クロデキストリンの利用により逆転され、そしてアッセ
イ媒質の成分は永久的には変性されないであろう。

好ましい界面活性剤は、非イオン性界面活性則、望まし
くは脂肪酸、特にＣ＋ｚ　　Ｃｔ。脂肪酸のポリオキシ
エチレンエーテル（例えば商標名Ｔｒｉｔｏｎの固体）
であり、これは、液体単一試薬製剤の約０．２％〜約１
．０％（ｗ／ｗ）、普通的０．２％〜約０．５％（ｗ／
ｗ）において使われる。

シクロデキストリンは環状アミロースである。

３つのタイプが知られているニジクロへキサアミロース
（α−シクロデキストリン）、シクロへブタアミロース
（β−シクロデキストリン）、およびシクロオクタアミ
ロース（γ−シクロデキストリン）、３種のシクロデキ
ストリン全てが界面活性剤を除去するのに有効であるが
、シクロデキストリンの利用可能な内部空間において複
合体を形成する界面活性剤の部分の大きさに適合させる
ことにより有利な点が得られる。従って、比較的大きい
分子体積を限定する大きい界面活性剤、例えばコール酸
から誘導されたものは、最大の内部空間を有するγ−デ
キストリンを使うと最も容易に除去される。より小さい
界面活性剤、例えば、比較的小さい分子架橋を有する鎖
が伸びている脂肪酸の塩および脂肪スルホネート等は、
３種のシクロデキストリンの中で最も小さい内部空間を
有するα−シクロデキストリンにより最も容易に除去さ
れる。

十分な量のシクロデキストリンの使用は、界面活性剤で
誘導された複合体形成の阻害を逆転せしめ、従って界面
活性剤を中和し、そして特異的結合ペアのメンバー間の
複合体形成を可能にする。

実質的に完全に界面活性剤を封鎖しそして界面活性剤の
効果を逆転させるために、界面活性剤と比較してモル過
剰のデキストリンを使うことが好ましい。シクロデキス
トリンは、試料および液体単一試薬の容量の約０．１〜
５倍、普通０．５〜３倍の容量で添加されるだろう。便
利には、デキストリンは“出発”溶液と称される水溶液
として、アッセイ媒質において所望される濃度の約１．
２〜１０倍、普通所望される最終濃度の約１．５〜５倍
の濃度において調製される。この出発溶液は、アッセイ
における利用に適当であるか、又はアッセイ媒質の他の
成分を含有する溶液と混合する時に適当であるようない
ずれの緩衝液中にでも調製し得る。通常満足できる出発
溶液は、約０．５％〜約５．０％、普通的１．０％〜約
２．０％（Ｗ／Ｗ）のシクロデキストリンを含む水溶液
として調製できる。

界面活性剤で誘導された複合体形成の阻害を逆転させる
ためにはシクロデキストリンの利用が好ましい一方、他
の界面活性剤阻害剤もまた利用を見出す。例えば、界面
活性剤の阻害作用は過剰のタンパク質の添加により逆転
され得る。あるいは、ある種の界面活性剤が別の界面活
性剤の効果を中和することが知られている。例えば、Ｄ
ｉｍｉｔｒｉａｄｉｓ。

Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ、　（１９７９）　９８　：　４
４５　４５１を参照のこと。

本発明の液体単一試薬組成物は、試薬類の性質および特
異的結合ペア（ｓｂｐ）の２つの相補的メンバーの比率
に依存して、大きく異なるであろう。

また、他の物質の量がｓｂｐメンバーの濃度に影響を及
ぼすかもしれないし、逆もまたあり得る。特異的結合ペ
アの相補的メンバーの各々は、乾燥成分（充填剤及び賦
形剤を除く）の通常５Ｘ１０−６〜０．１重量％におい
て存在するだろう。酵素ラベルの場合に、基質が存在す
るとすれば、それは約１〜１５％の量で存在するであろ
う、緩衝液は普通５〜３０％を含んで成るだろう。最終
的には、界面活性剤は約１０〜３０％の量で存在するで
あろう。

試料中に存在する分析体（３１ａｌｙｔｅ）の量を測定
するのに好ましい態様は、酵素−分析体接合体、抗−分
析体抗体および反応阻害量の界面活性剤を含んで成る液
体単一試薬組成物を、試料、酵素基質および複合体形成
を開始するのに十分な量のシクロデキストリンと一緒に
することを含んで成る。

アッセイ測定間の酵素触媒反応速度は、酵素接合体が抗
体と結合する時、例えば酵素供与体（ＥＤ）および酵素
受容体（ＥＡ）断片として存在するグルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）またはβ−
ガラクトシダーゼと結合する時に変化し、普通減少する
。シクロデキストリンは、試料の添加の前に該単一試薬
成分に添加されない。

酵素触媒反応の速度は、試料中に存在する分析体の量の
指標として測定される。Ｇ６ＰＤ−分析体接合体を利用
するアッセイは米国特許第３，８１７，８３７号に記載
されている。β−ガラクトシダーゼＥＤ−分析体接合体
を利用するアッセイは以下におよび米国特許第４，７０
８，９２９号に記載されている。

β−ガラクトシダーゼ補完アッセイ法は、反応緩衝液；
β−ガラクトシダーゼＥＤ−分析体接合体；抗−分析体
抗体；並びに分析体と抗−分析体抗体との間の複合体形
成およびＥＤとＥＡとの間の補完を阻害するのに十分な
濃度の界面活性剤；を含んで成る液体単一試薬を利用す
る。この単一試薬は、β−ガラクトシダーゼＥＡおよび
／または酵素基質を更に含んでもよい。あるいは、特定
の分析体に特異的ではない成分を、第二の一般試薬とし
て用意することができる。生物学的流体の場合、即時の
アッセイ法の目的上、粒状物質の除去以外は試料の前処
理を普通全く行わないであろう。

本発明の方法は、β−ガラクトシダーゼＥＤ−分析体接
合体、抗−分析体抗体、反応阻害量の界面活性剤、並び
に最適には単一試薬の一部分としてまたは別々にβ−ガ
ラクトシダーゼＨＡおよび酵素基質、を含んで成る液体
単一試薬を、試料およびシクロデキストリンと一緒にす
ることを含んで成る。シクロデキストリンは、試料と一
緒にもしくは試料の添加後のどちらかで、試料の存在下
で液体単一試薬に添加される。β−ガラクトシダーゼで
触媒される基質の生成物への変換は、予め選択された時
間において試料中に存在する分析体の量の指標として測
定される。

酵素供与体および酵素受容体はβ−ガラクトシダーゼの
部分配列である。どちらか一方の部分配列を変更して、
該配列の調製、分析体の付加等を容易にすることが可能
である。酵素受容体および酵素供与体分析体接合体は、
−緒にした時に活性な酵素複合体を形成することにより
特徴付けられる。酵素供与体接合体が抗−分析体抗体と
結合すると、観察される酵素活性が、抗−分析体抗体の
非存在下で観察されるものと異なる。従って、酵素供与
体接合体と結合する抗体の利用可能性はアッセイ媒質中
の分析体の量と共に変化す゛るであろβ−ガラクトシダ
ーゼ酵素供与体および受容体は、米国特許第４，７０８
，９２９号（この開示は引例として本明細書に組み込ま
れる）に記載されており、分析体および酵素供与体−分
析体接合体も同様である。１９８８年２月２日に出願さ
れた同時係属米国特許出願箱１５１，４１２号は、反応
条件および補完アッセイ用試薬を記載している。その明
細書に記載されたアッセイ条件は本発明にも適用できる
。

使用するアッセイ条件および反応緩衝液は、酵素供与体
と酵素受容体との間の補完のために用意される。一般に
、生理的緩衝液、例えばリン酸塩緩衝化塩類溶液、トリ
ス緩衝液および類似の緩衝液が有用である。イオン強度
は重要ではない。好ましい緩衝液は、約１１０１Ｗ〜約
３００１１ＭのＮａＰＯ，、約５ｍＭ〜約１０ｍＭのＥ
ＧＴＡおよび約１１０１Ｗ〜約２０ｍＭのＮａＮｚを含
んで成り、６〜８のｐＨを有するものである。アッセイ
の温度は、普通少なくとも約２０°Ｃ１好ましくは高め
られた温度であるが、６０°Ｃ以下である。酵素アッセ
イは、通常室温（２５°Ｃ）〜約４０°Ｃ以下、最も普
通には約３７°Ｃで実施される。該アッセイは大気圧に
て行われる。

アッセイ媒質中の酵素供与体接合体の濃度は、普通約１
ｎＭ〜約６０ｎＭ、より普通には約５ｎＭ〜約５０ｎＭ
、最も普通には１０〜２５ｎＭの範囲内であろう。酵素
受容体は、普通実質上モル過剰において存在するだろう
。ＥＡ濃度は、約０．５〜約５．０岸、普通約１〜約２
岸で異なるであろう。酵素供与体接合体対酵素受容体の
モル比は、普通１：３０〜１：８０、より普通には１：
５０〜１：６０であろう。酵素供与体−分析体接合体の
濃度は、試料中に含まれると予想される分析体の最高濃
度を普通上回るであろつ。

ＨＤ−分析体接合体と抗−分析体抗体との最適比率は、
アッセイリガンドの範囲を拡大するようにそしてまたバ
ックグラウンド活性を最小にするようにしてＥ＾の存在
下で決定されるだろう。バックグラウンドレベルに関係
して分析体濃度に対する酵素触媒反応速度の応答は最適
化される。

ＥＤ−分析体接合体と抗−分析体抗体の濃度の比は、分
析体濃度によって変わる酵素速度の直線性をアッセイ範
囲に渡って維持したまま、アッセイ条件下で実質的に最
低の酵素速度になるように設定されるだろう。普通、前
記抗体および前記接合体の濃度は、条件を最適化するの
に必要な濃度の少なくとも８５％、より普通には少なく
とも９５％の範囲内であろう。

様／、な量の試料を使用することができる。試料が血清
である場合、試料がアッセイ媒質の容量の普通約１％〜
約ｌθ％、より普通には約２％〜約５％を含んで成るだ
ろう。

酵素媒質は、酵素により開裂された時にア・ンセイ媒質
の吸光（光学濃度）または発光の量の変化を生じるもの
が使われる。即ち、基質の開裂が着色生成物または蛍光
生成物の出現または消失を生む。好ましい酵素基質はオ
ルト−ニトロフェニルガラクトシド（ＯＮＰＧ）および
クロロフェニルレッド−β−ガラクトシド（ＣＰＲＧ）
を包含する。　０ＮＰＧおよびＣＰＲＧの吸光度は、そ
れぞれ４２０ｎｓおよび５７４ｎｍで測定される。０Ｎ
ＰＧ　、　ＣＰＲＧおよび他の同等の酵素基質は商業的
に入手可能である。０ＮＰＧは通常約０．５〜約２．０
■／ｄ、より普通には約１．０〜約１．５■／　ｍｌの
濃度で使用されるだろう。０ＮＰＧまたはＣＰＲＧを使
う時、便利にはシクロデキストリンの添加後筒−回の測
定までアッセイ媒質が約１〜ＩＯ分間、普通１〜４分間
インキュベートされるだろう。１回目と２回目との読み
取りの間に普通は１〜１０分間、より普通には３〜８分
間、最も普通には３〜６分間置くであろう。

アッセイを実施するために、液体単一試薬を調製する。

試料をこの液体単一試薬と一緒にしてアッセイ媒質を形
成せしめ、そしてシクロデキストリンの添加前に約３７
°Ｃで約１０〜３０分間インキュベートするか、または
シクロデキストリンを試料と同時に添加してもよい。シ
クロデキストリン出発？′８液および液体単一試薬中に
存在しない全てのアッセイ成分の添加後、アッセイ媒質
を予め決められた時間の間インキュベートする。予め指
定された２つの時点でのアッセイ媒質の光学濃度の差が
、試料中の分析体の量の指標として測定される。試料中
に存在する分析体の量の指標として、β−ガラクトシダ
ーゼ活性を測定するための標準法に従って酵素活性の量
が測定される。

このアッセイを検量する便利な方法は、既知の分析体濃
度を有する対照試料を使って、濃度対光学濃度変化率の
グラフを作成することである０分析体対照試料は、便利
には０％分析体の溶液および、無限濃度の分析体を有す
る溶液、即ち更なる分析体の添加が反応速度に影響を与
えないような分析体濃度を有する溶液を調製する。望ま
しくは、１つまたは複数の中間濃度の分析体対照、便利
には試料の普通程度における濃度の対照もまた、検量線
を作成するのに使われるだろう。

本発明を容易にする試薬含有キットもまた期待される。

このキットは、第一容器中に特異的結合ペアの相補的メ
ンバーを含み、ここで普通、特異的結合ペアは分析体／
抗−分析体抗体である。シクロデキストリンは第二容器
中に用意される。補完アッセイへの利用のためには、第
一容器はＥＤ−分析体接合体、抗−分析体抗体および界
面活性剤を含む。この第一容器は、酵素基質およびＥＡ
などアッセイ用混合物に存在する他の試薬を更に含んで
いてもよい、しかしながら便利には、複数の分析体に有
用な一般試薬は第三容器中かまたはシクロデキストリン
と共に存在する。前記キットは、予想される試料濃度範
囲内で異なる濃度の１つまたは複数゛の分析体対照を更
に含んで成ることができる。

試薬類は液体の形で、または粉末もしくは１つの試料の
アッセイに適する量の試薬を含む単位用量錠剤として乾
燥形で処方することができる。乾燥試薬が緩衝塩を含ん
でもよいし、または乾燥試薬を再構成するための緩衝液
を用意することができる。乾燥試薬は、常用の添加剤、
例えば安定剤、乾燥剤、賦形剤等と共に処方できる。

〔実施例〕

次の例は例示のつもりで提示され限定のつもりではない
。

・Ｔ４再構成用緩衝液 胛」１黴辰 ６０　ｍＭ　ＰＯｎ’− １９，４ｍＭ ０　ｍＭ ０．４１６　ｍＭ 緩衝剤 ａＮｉ ＥＧＴＡ Ｎ５ ｐＨ＝７．０ ＩＬ直液 ９０　ｍＭ　ＰＯ４３ １９，４謡Ｈ ４，３ｍＭ 緩衝剤 ａＮ２ Ｍｇ（ＯＡｃ）　ｚ・４Ｈ２０ １０１１Ｍ　　　　　　ＥＧＴＡ ｐＨ＝７．６ ・Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−３０１界面活性剤として・０ＮＰ
Ｇ　　　　　　酵素基質として・ＥＡ２２　　　　　　
米国特許第４．７０８，９２９号中に記載 ・ＥＤａ　　Ｔ４　　　　米国特許第４．７０８，９２
９号中に記載のようにしてチロキシン 誘導体とＥＤ、から調製 ・モノクローナル抗−Ｔ４抗体 ・β−シクロデキストリン　シグマ・ケミカルカンパニ
ーから商業的に人手 可能 ・ＥＧＴＡ　　　　　　エチレン−ビス−オキシ−エチ
レン−ニトリロ四酢酸 ヱｌ」Ｌ仁り順 次の成分を混合することにより５　ｍｌの試薬溶液を調
製した。

・ＥＤ緩衝液　３３２３μｌ； ・４％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−３０１溶液（ＥＤ緩衝液によ
る２０％試薬原液の希釈により４％溶液を得る）３１２
．５ｍ； ・ＥＤ緩衝液中１０■／−〇〇ＮＰに原液　７５０Ｉ１
１；・６Ｘ１０−’ＭのＥＡ２２　１０２．４パ；・Ｈ
Ｄ緩衝液中１．３５Ｘ１０−’ＭのＥＤ４　　Ｔ４の１
：３００希釈液　２００ｄ　； ・ＨＤ緩衝液中の抗−Ｔ４抗体　１：１００希釈液３１
２．５１１！。

１％β−シクロデキストリン“出発”溶液は、５０ｍ２
のＥＡ緩衝液中に０．５０ｇを使って作製した。０゜２
．５．５．１０．２０．２４．２００　ｎ／ａに変化す
る濃度の血清キャリブレータ−１０μｌを前記試薬溶液
１００Ｉに添加し、そして３７°Ｃで（オーブンインキ
ュベーター）１５分間インキヱベートした。β−シクロ
デキストリン出発溶液２００ｊ１１の添加によりＢａｋ
ｅｒＥｎｃｏｒｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ａｎａｌｙｚ
ｅｒにおいて反応を開始した。シクロデキストリンの添
加後３６０秒目台上び５４０秒目台上２０ｎ＊で吸光度
を読みとった。

持−果 結果を第１表に要約する。この表において使用する時、
変化率はどれも２つのキャリブレータ−間の差；即ち、
高い方のキャリブレータ−の速度により割った正味の差
である。

Ｔ４　（硝／ａ） ２．５ 男−」−一表 Δ５４０−３６０秒（ｍＡ） ％変化 １１．１１ ２０．００ ３３．３３ ４５．７６ ４６．２２ ６４．０４ ６９．７６ 第１表に示されるように、このアッセイは患者試料中Ｏ
〜２０ｎ／ａのＴ４の濃度で有効である。

ＥＤａ　　Ｂ＋ｚ 接合体−３ｎＭ 固有のファクター−１：６０００希釈 基ｆ　（ＣＰＲＧ）−１，３ｍｇ／ｒｎｌＴｒｉｔｏｎ
−例１に記載のＥＤ緩衝液中０．２％、０．４％または
０．８％ 二層式１搭丘 Ｅ＾２□−１，ＯＸｌｏ−６Ｍ β−シクロデキストリン−例１に記載のＥＡＩ衝液中１
．０％ １ツ」葺←Ｌ順 １０Ｉの試料（０または１ｎ／ｄの分析体対照試料）を
１００ｔｌ！の前記単一試薬溶液および１５０Ｉｌｌの
前記一般試薬溶液と混合した。シクロデキストリンの添
加後６０秒台上よび１８０秒目台上光度変化を読みとっ
た。

結−来 結果を第２表に示す。この表において使用する時、正味
速度はゼロキャリブレータ−速度と高キャリブレータ−
速度との差として定義され、そして阻害率は高キャリブ
レータ−速度に対する正味速度の比率として定義される
。

】工」Ｌ−表 Ｔｒｉｔｏｎ　　　　　４ｉ、■ヤリ　　　高キャリ　
　　正味濃度　　　　　フレーター　　　プレーター　
　　速度０％　　　　　　　　４２　　　　　１６１　
　　　１１９０．２　％　　　　　−２５−２１Ｎ／Ａ
Ｏ１４％　　　　　−５５−５４Ｎ／Ａ％阻害 ７３．９％ Ｎ／Ａ Ｎ／Ａ ０％　　　　　１１　　　　７９　　　　６８　　８６
．１％０．２％　　　３５　　　１３７　　　１０２　
　７４．５％０．４％　　　２８　　　１１２　　　８
４　　７５．０％この結果は、約０．２％より高いＴｒ
ｉｔｏｎ　Ｘ−３０１濃度が効果的に補完を阻害したこ
とを示している。

ニー　　　ｉン　・・セイ 試薬 一オフィ　ン ０％、０．２％または０．３％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−３
０１中に調製： 〔ＥＤ４−チオフィリン接合体）　＝４６ｎｍ〔抗−チ
オフィリン抗体）＝１：９００希釈基質ＣＰＲＧ　（ク
ロロフェノールレッドガラクトシド）＝０．５■／ｄ Ｍ欣 （ＥＡ２□）＝０．０．５．１または２％のβ−シクロ
デキストリン（β−ｃｄ）を含 む１．２声 拭−且 ０または２００羅／　ｍｌの分析体対照ヱヱ立不王皿 １０μｌの試料を１５０Ｊｌｌの一般試薬と共に２００
ｐｌのチオフィリン用単一試薬溶液と混合した。吸光度
の変化を４分および８分目に読み取った。

慧−果 結果を第３表に示す。これは０．０．２および０．３％
のＴｒｉｔｏｎ界面活性剤を含む０および２００　ｔｒ
ｉ　／　ａｌｌ（無限量）のキャリブレータ−について
の値を説明している。反応速度の阻害率は次のようにし
て算出した。０％分析体対照試料の光学濃度の変化を１
００％分析体対照試料の光学濃度の変化から差し引いた
。その数を、ｌｏｏ％分析体対照の光学濃度の変化で割
り、阻害率を決定した。各Ｔｒｉｔｏｎ濃度は２つの表
を有する。１つの表は、種々のシクロデキストリン濃度
〔β−ｃｄ）の存在下における用ｔｔｏの時の速度につ
いてであり；もう一方は無限量についてのものである。

０　％ ０．５０％ １　％ ２　％ ０．４７ ０．５１ Ｏ０５２ ０，５９ ０％ ０．５０％ １　％ ２　％ ０、２０Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−３０１０ ０，３％　Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ ０％ ０．５０％ １　％ ２　％ ０．３４ ０．５２ ０．５３ ０．５５ ０　％　　　　　９９１１５１６ ０．５０％　　３３３　　６９７　　　　３６４１　％
　　　　４４３　　１５６９　　　　１１２６２　％　
　　　３２７　　１１３７　　　　　８１００　％ ０．５０％ １　％ ２　％ ０　％ ０．５０％ １　％ ２　％ ０．５６ ０．５５ ０．５５ ０．５６ 表に示されるように、０．２％〜０．３％のＴｒｉｔｏ
ｎＸ−３０１が１％〜２％のβ−シクロデキストリンに
より効果的に中和された。

今までの例により示されたように、本発明のアッセイ方
法は迅速で且つ正確であり、そして最少比の操作および
短縮されたインキュベーション時間を必要とする。本発
明の試薬溶液の配合は、アッセイを開始するのに数種の
試薬と試料との混合のみを必要とするので、特に便利で
ある。この液体単一試薬混合物は、自動分析機器におけ
る利用にも適している。

本発明を今まで十分に記載してきたが、本発明の精神お
よび特許請求の範囲を逸脱することなく、様々な変更お
よび改良を行えることは当業者に明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分析体に関してアッセイするための液体単一試薬組
   成物であって、前記分析体が前記分析体と前記分析体に
   対して相補的な結合相手メンバーとを含んで成る特異的
   結合ペアのメンバーであり、（ａ）前記特異的結合ペア
   の前記相補的メンバー；（ｂ）酵素供与体／分析体接合
   体；および （ｃ）前記接合体と前記特異的結合ペアの前記相補的メ
   ンバーとの間の結合を阻害するのに十分な量の界面活性
   剤； を含んで成る前記試薬組成物。 ２、前記酵素供与体／分析体接合体が、β−ガラクトシ
   ダーゼ供与体／分析体接合体である、請求項１に記載の
   試薬組成物。 ３、前記特異的結合ペアが抗原／抗体ペアである、請求
   項１に記載の試薬組成物。 ４、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請
   求項１に記載の試薬組成物。 ５、酵素受容体および、所望により、前記酵素受容体と
   前記酵素供与体との間の補完反応により形成される酵素
   のための酵素基質を更に含んで成る、請求項１に記載の
   試薬組成物。 ６、アミノアッセイにおける利用のためのキットであっ
   て、 （ａ）第一容器中に、請求項１に記載の液体単一試薬組
   成物；および （ｂ）第二容器中にシクロデキストリン； を含んで成るキット。 ７、前記第一容器が、酵素受容体および、所望により、
   前記酵素受容体と前記酵素供与体との間の補完反応によ
   り形成される酵素のための酵素基質を更に含んで成る、
   請求項６に記載のキット。 ８、試料中の分析体の量を測定するための方法であって
   、前記分析体が前記分析体と前記分析体に対して相補的
   な結合相手メンバーとを含んで成る特異的結合ペアのメ
   ンバーであり、 （ａ）（１）請求項１に記載の試薬組成物；（２）前記
   接合体と前記特異的結合ペアの相補的メンバーとの間の
   結合における前記界面活性剤の作用を逆転させるのに十
   分な量のシクロデキストリン； （３）前記試料； （４）酵素受容体；および （５）前記酵素受容体と前記酵素供与体との補完により
   形成される酵素のための酵素基質；を混合することによ
   りアッセイ媒質を形成せしめ、ただしここで、前記試料
   の添加前に前記シクロデキストリンを前記アッセイ媒質
   に添加しないことを条件とし；そして （ｂ）前記試料中の分析体の量の指標として前記酵素と
   前記基質との反応の速度を測定する；ことを含んで成る
   方法。 ９、前記試薬組成物が、前記アッセイ媒質の他のメンバ
   ーと一緒にする前に液体単一試薬の中に酵素受容体およ
   び、所望により、酵素基質を更に含んで成る、請求項８
   に記載の方法。 １０、前記特異的結合ペアが抗原／抗体ペアである、請
   求項９に記載の方法。 １１、前記速度が、酵素触媒反応の生成物により影響を
   受ける吸光または発光の変化を測定することにより決定
   される、請求項９に記載の方法。 １２、前記酵素がβ−ガラクトシダーゼである、請求項
   ９に記載の方法。 １３、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、
   そして前記シクロデキストリンがβ−シクロデキストリ
   ンである、請求項９に記載の方法。 １４、前記試料が血清であり、そして前記血清が前記ア
   ッセイ媒質の約１〜約１０容量％を含んで成る、請求項
   ９に記載の方法。 １５、前記分析体がＢ１２、チオフィリンまたはＴ４で
   ある、請求項９に記載の方法。