WO2013042587A1 - α,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法 - Google Patents

α,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法 Download PDF

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crystal
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渋谷 孝
精祐 伊澤
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    • C13K13/00Sugars not otherwise provided for in this class
    • C13K13/007Separation of sugars provided for in subclass C13K

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ⁇ , ⁇ -trehalose dihydrate crystal-containing powder, and more specifically, high purity ⁇ , ⁇ -trehalose dihydrate crystal-containing powder is industrially produced in high yield in a consistent process from starch.
  • the present invention relates to a method for producing an ⁇ , ⁇ -trehalose dihydrate crystal-containing powder to be produced, and an ⁇ , ⁇ -trehalose dihydrate crystal-containing powder obtained by the production method.
  • trehalose a method for producing a powder containing dihydrate crystals of ⁇ , ⁇ -trehalose
  • a starch debranching enzyme is allowed to act on liquefied starch together with ⁇ -amylase or ⁇ -amylase, and then a maltose / trehalose converting enzyme is allowed to act to obtain a trehalose-containing sugar solution, which is appropriately purified.
  • Patent Document 2 discloses an ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme (also known as “non-non-functional”) together with starch debranching enzyme in liquefied starch. Reducing saccharide-forming enzyme ”) and trehalose-releasing enzyme, and further glucoamylase to obtain a trehalose-containing sugar solution, which is appropriately purified, and then crystallized trehalose to obtain a powder containing trehalose dihydrate crystals.
  • a method of manufacturing is disclosed.
  • Patent Documents 3 and 4 in the production method disclosed in Patent Document 2, starch debranching enzyme and cyclodextrin / glucanotransferase (hereinafter abbreviated as “CGTase”) are used in combination.
  • CCTase cyclodextrin / glucanotransferase
  • Patent Documents 5 and 6 disclose that liquefied starch is released from a thermostable ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme derived from a microorganism belonging to the genus Sulfolobus, or a thermostable ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme and thermostable trehalose release.
  • a method is disclosed in which a trehalose-containing sugar solution is obtained by allowing an enzyme to act, purifying it appropriately, and then crystallizing trehalose to produce a trehalose-bihydrate crystal-containing powder.
  • Manufactures powder containing trehalose dihydrate crystals (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Co., Ltd., trehalose purity: 98.0% by mass or more, hereinafter referred to as “food grade trehalose dihydrate crystals containing powder”).
  • they are mainly sold as food materials and cosmetic materials.
  • the trehalose content in the trehalose-containing sugar solution obtained by the enzyme reaction is currently about 85% by mass in terms of anhydride even when various enzyme reaction conditions are optimized. The actual condition is that the yield to starch does not reach 40% by mass.
  • thermostable ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme thermostable trehalose-releasing enzyme
  • thermostable isoamylase derived from Sulfolobus solfataricus are expressed in Escherichia coli, respectively.
  • trehalose-containing sugars with a trehalose content of about 87% by weight in terms of anhydride It is disclosed that a liquid is obtained.
  • the soluble starch used as a raw material in Non-Patent Documents 1 and 2 is a very special and expensive raw material produced by removing the amorphous part in starch granules by acid treatment of starch. Yes, even if an enzyme reaction solution having an increased trehalose content is obtained, it is impossible to use soluble starch as a raw material for industrial production of trehalose dihydrate crystal-containing powder.
  • the recombinant enzymes and mutant enzymes disclosed in Non-Patent Documents 1 and 2 are allowed to act on liquefied starch used in production on an industrial scale rather than soluble starch, it is obtained by enzymatic reaction.
  • the trehalose content in the resulting trehalose-containing sugar solution is lower than about 87% by mass and stops at about 85% by mass, and the yield of starch containing trehalose dihydrate crystals is higher than that of the current production method. I can not hope to improve.
  • the mass kit containing the crystallized crystals is taken out into a container and crystallized and solidified in place of the honey method in which the crystallized crystals are collected by centrifugation. It is also possible to adopt a so-called whole sugar system in which the powder is pulverized or the mass kit is spray-dried to obtain a powder.
  • the crystallized trehalose is mixed together with the contaminants specific to the production method such as glucose contained in the mass kit, so the obtained trehalose dihydrated crystal-containing powder
  • the trehalose content therein is not higher than the trehalose content in the mass kit, and there is an inconvenience that a high-purity trehalose dihydrate crystal-containing powder cannot be obtained.
  • Starch is currently a relatively abundant, inexpensive and readily available raw material, but it is not an inexhaustible material, and the total amount of starch produced by humans on earth per year is There is a limit.
  • starch is widely used, and in addition to conventional industrial use, food use, feed use, or food raw materials, in recent years, due to the rise in demand for clean energy, new bioethanol, etc. It is also used as a fuel raw material. Under such circumstances, it is extremely important from the viewpoint of effective utilization of limited resources to improve the yield of the product, that is, the powder containing trehalose dihydrate crystals, with respect to starch.
  • the present invention has been made for the purpose of eliminating the inconvenience in the conventional method for producing a powder containing trehalose dihydrate crystals, and further increasing the yield of the starch containing trehalose dihydrate crystals while maintaining the purity of trehalose.
  • the trehalose-containing sugar solution thus obtained is decolored, desalted and concentrated according to a conventional method to crystallize trehalose dihydrate crystals, and the resulting crystals are collected by centrifugation, and this is aged. It was found that by drying, a high-purity trehalose dihydrate crystal-containing powder containing 98.0% by mass or more of trehalose in terms of anhydride could be produced with a higher starch yield than conventional, and the present invention was completed. .
  • the present invention allows liquefied starch to act together with starch debranching enzyme and CGTase together with ⁇ -glycosyl trehalose producing enzyme derived from Arthrobacter microorganism and trehalose releasing enzyme derived from Arthrobacter microorganism,
  • the trehalose content in the sugar solution is anhydrous.
  • the present invention solves the above problems by providing a method for producing trehalose dihydrate crystals containing 98.0% by mass or more of trehalose in terms of anhydride, characterized by being over 86.0% by mass in terms of conversion. is there.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by the production method of the present invention described above is not only the trehalose purity but also has good fluidity. Compared to powders containing water-containing crystals, these powders are comparable to conventional powders containing trehalose dihydrate crystals containing food grades, and can be used in a wide range of fields as food materials, cosmetic materials, etc. .
  • Examples of the microorganism belonging to the genus Paenibacillus, which is a source of CGTase, include Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus pabuli, and Paenibalus amylobylus pasobacillus.
  • Paenibacillus illinoisensis or Paenibacillus is preferable in terms of producing CGTase having a large effect of increasing the trehalose content in the reaction solution in the trehalose production reaction, and Paenibacillus illinoisensis is particularly preferable.
  • CGTase those having partial amino acid sequences shown in the following (a) to (d) are particularly preferably used: (A) Gly-Ser-X 1 -Ala-Ser-Asp; (B) Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn; (C) Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys; (D) Val-Asn-Ser-Asn-X 2 -Tyr. (However, X 1 means Ala or Ser, and X 2 means Ala or Thr.)
  • CGTase having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 12 or 13 in the sequence listing can be mentioned as a more preferable example of CGTase used in the present invention.
  • the present inventors crystallized trehalose dihydrate crystals from the trehalose-containing sugar solution containing trehalose in excess of 86.0 mass%, preferably 87.0 mass% or more in terms of anhydride.
  • the controlled cooling method or pseudo controlled cooling method described later is applied, the resulting trehalose dihydrated crystal is crystallized by a natural cooling method that naturally leaves the trehalose-containing sugar solution at a lower temperature. It was found that the yield with respect to starch of the dihydrate crystal-containing powder can be further increased.
  • the present invention provides a method for producing trehalose dihydrate crystal-containing powder, wherein in the production method of the present invention, the step of crystallizing the trehalose dihydrate crystal is performed by a controlled cooling method or a pseudo controlled cooling method.
  • the present inventors have surprisingly found that the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by applying the controlled cooling method or the pseudo controlled cooling method during crystallization of the trehalose dihydrate crystal as described above, The present inventors have found that it is superior in terms of being hard to solidify as compared with a powder containing trehalose dihydrate crystals produced by a natural cooling method or a conventional food grade powder containing trehalose dihydrate crystals. And, it was confirmed that such excellent physical properties were brought about by the difference in trehalose purity and the crystallinity of trehalose dihydrate crystal in the powder containing trehalose dihydrate crystal. The present invention was completed.
  • the present invention is a trehalose dihydrate crystal-containing powder obtained by the production method of the present invention to which the controlled cooling method or the pseudo controlled cooling method is applied when crystallizing trehalose dihydrate crystal, and is trehalose in terms of anhydride. Is 99.0% by mass or more and 99.6% by mass or less, and the crystallinity of the trehalose dihydrate crystal calculated based on the powder X-ray diffraction profile is 90.0% or more and 96.0% or less.
  • the above-mentioned problems are solved by providing a water-containing crystal-containing powder.
  • the crystallinity of trehalose dihydrate crystals containing 99.0% by mass or less and 99.6% by mass or less of trehalose in terms of anhydride and calculated based on the powder X-ray diffraction profile is 90.0% or more and 96.96%.
  • Trehalose dihydrate crystal-containing powder that is 0% or less confirmed that the trehalose content is about the same or slightly higher than the conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder, This is a novel powder that has a crystallinity of trehalose dihydrate crystals significantly higher than that of food-grade trehalose dihydrate crystals-containing powders, and is distinguished from conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powders.
  • the crystallinity of trehalose dihydrate crystals in the trehalose dihydrate crystal-containing powder of the present invention obtained by applying the controlled cooling method or the pseudo controlled cooling method is a powder obtained by natural cooling, This is also supported by the fact that the food grade trehalose dihydrate crystal-containing powders are significantly higher in crystallinity than the trehalose dihydrate crystals.
  • ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme and trehalose-releasing enzyme derived from microorganisms belonging to the genus Arthrobacter that are easy to culture and have high enzyme productivity are used in a consistent process using starch as a raw material.
  • High-purity trehalose dihydrate crystal-containing powder can be produced on an industrial scale with a high starch yield. Therefore, the outstanding advantage that it contributes to the effective utilization of the starch resource which is a raw material is brought about.
  • the yield of starch containing trehalose dihydrate crystals is improved.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by the production method of the present invention to which the controlled cooling method or the pseudo controlled cooling method is applied has trehalose purity and trehalose two-phase powder compared to the conventional food grade trehalose dihydrate crystal-containing powder. It is a powder excellent in that the degree of crystallinity of the water-containing crystal is high and the caking is difficult.
  • the powder X-ray diffraction pattern by the characteristic X-ray of the powder containing a trehalose dihydrate crystal substantially consisting of a trehalose dihydrate crystal It is an example of the powder X-ray diffraction pattern by the characteristic X-ray of the trehalose powder which consists of a substantially amorphous part. It is an example of the powder X-ray-diffraction pattern by the synchrotron radiation light of the powder containing a trehalose dihydrate crystal substantially consisting of a trehalose dihydrate crystal. It is an example of the powder X-ray diffraction pattern by the synchrotron radiation light of the trehalose powder which consists of a substantially amorphous part.
  • yield to starch refers to the percentage of the mass of the trehalose dihydrate-containing crystal-containing powder obtained per unit mass of the raw material starch in terms of anhydride, expressed as a percentage (%). It is a thing. In this specification, starch is used as a raw material, and an enzyme is allowed to act on it to produce trehalose, and the resulting trehalose is crystallized, collected, aged, and dried in a series of consistent steps. Since it is premised on producing powder, the term “yield to starch” as used in the present specification refers to the first crystallization from a trehalose-containing sugar solution obtained by allowing an enzyme to act on starch.
  • the sugar solution remaining after collecting the crystallized crystals and the nectar separated from the mass kit are returned to the sugar solution and crystallized again. It does not include trehalose dihydrate crystal-containing powder produced from the so-called second crystal.
  • the amount of the seed crystal in the calculation of the starch yield is included in the amount of the trehalose dihydrate crystal-containing powder obtained throughout this specification.
  • CGTase activity is defined as follows. That is, 0.2 ml of an enzyme solution appropriately diluted is added to 5 ml of a substrate aqueous solution containing 0.3% (w / v) soluble starch, 20 mM acetate buffer (pH 5.5), and 1 mM calcium chloride, and 40 ml of the substrate solution is added. While maintaining the temperature at 0 ° C., 0.5 ml of the substrate solution was sampled at 0 minutes and 10 minutes of reaction, and immediately added to 15 ml of 0.02N sulfuric acid solution to stop the reaction, and then 0.1N iodine was added to each sulfuric acid solution.
  • CGTase activity is defined as the amount of enzyme that completely eliminates the iodine coloration of 15 mg of starch in the solution under such measurement conditions.
  • controlled cooling method refers to a method of crystallizing crystals by “controlled cooling”.
  • the working time set as the crystallization process is “ ⁇ ”, and the liquid temperature at the start of crystallization is set.
  • T 0 the target liquid temperature at the end of crystallization
  • T f the liquid temperature at time “t”
  • T the liquid temperature T at time t is generally expressed by the following formula [7].
  • the controlled cooling method is expressed more specifically (schematically) using a graph in which the working time set as the crystallization step is the horizontal axis and the liquid temperature at the time of crystallization is the vertical axis, the symbol a in FIG.
  • the liquid temperature gradually decreases in the initial stage of crystallization with a high liquid temperature, and the liquid temperature rapidly increases in the latter stage of crystallization in which the liquid temperature has decreased to some extent.
  • the liquid temperature “T m ” at the time of t ⁇ / 2, that is, the intermediate point of the crystallization process, is at least T m > [(T 0 ⁇ T f ) / 2 + T f ] (That is, the temperature change at the midpoint of the crystallization process is less than 50% of the total temperature change).
  • the controlled cooling method includes linear cooling in which the liquid temperature decreases linearly over time ⁇ from T 0 to T f (symbol b in FIG. 5), and crystals with a high liquid temperature.
  • the liquid temperature is gradually cooled in the initial stage of crystallization after the addition of trehalose seed crystals.
  • the rise and the formation of secondary crystal nuclei are suppressed, and crystals having the added seed crystals as crystal nuclei can be preferentially grown.
  • the liquid crystals are rapidly cooled to grow the gathered crystals all at once. For example, there is an advantage that a mass kit including crystals with a small grain size and a uniform grain size can be obtained.
  • the “controlled cooling method” is described in detail, for example, in “Tokuaki Kubota,“ Easy-to-understand batch crystallization ”, Separation Technology Association, issued April 30, 2010, pages 32 to 47”.
  • the “pseudo controlled cooling method” as used in this specification is a cooling method that simulates the control cooling method literally described above, and the liquid temperature T is strictly changed according to the above equation [2] with respect to time t.
  • the liquid temperature T gradually decreases with respect to time t in the initial stage of crystallization with a high liquid temperature, and the latter stage of the crystallization in which the liquid temperature has decreased to some extent. In this case, the liquid temperature T rapidly decreases with respect to the time t.
  • the above-described controlled cooling method may not be achieved, there is a mass kit containing crystals with a small grain size and a uniform grain size. The obtained advantage is almost the same as that of the controlled cooling method.
  • the working time ⁇ is divided into at least two, preferably three or more sections, and in the initial section of the crystallization process, the temperature gradient in cooling is made gentle (the cooling rate is slow).
  • the liquid temperature T may be decreased continuously or stepwise with respect to time t so that the amount (T 0 -T f ) is 5% or more and less than 50%, preferably 10% or more and less than 30%.
  • the liquid temperature T may be decreased continuously or stepwise with respect to time t so that the liquid temperature T is less than 50%, preferably 10% or more and less than 30%. Even if there is no equipment to control precisely, there is an advantage that it can be carried out relatively easily.
  • crystals As used herein, “crystallinity of trehalose dihydrate crystals” means a numerical value defined by the following formula [3].
  • the powder X-ray diffraction profile that is the basis for obtaining the analytical values H 100 , H 0 , and Hs can be measured by a powder X-ray diffractometer equipped with a reflective or transmissive optical system. it can.
  • the powder X-ray diffraction profile includes the diffraction angle and the diffraction intensity for the trehalose dihydrate crystal contained in the test sample or standard sample.
  • Examples include the Hermans method and the Funk method. Of these analysis methods, the Hermans method is preferred in terms of simplicity and accuracy. Today, these analysis methods are all made into computer software, so it is convenient to use a powder X-ray diffractometer equipped with an analysis device equipped with any of such computer software.
  • the purity of trehalose is 99.9% by mass or more (hereinafter, unless otherwise specified, In this specification, mass% is abbreviated as “%.” However,% given to the crystallinity referred to in this specification is not limited to this.)
  • mass% is abbreviated as “%.” However,% given to the crystallinity referred to in this specification is not limited to this.
  • a powder containing trehalose dihydrate crystals (trade name “trehalose 999”, code number: TH224, trehalose purity 99.9% or more, sold by the applicant as an analytical reagent) Company Hayashibara Sales), or a trehalose dihydrate crystal-containing powder or a single crystal of trehalose dihydrate crystal obtained by recrystallizing it.
  • the analysis value H 100 when the powder X-ray diffraction profile of the trehalose dihydrate crystal-containing powder standard sample substantially consisting of trehalose dihydrate crystals is analyzed by computer software by the Hermans method is usually 50.6. It is about 50.9%.
  • the “trehalose-containing powder standard sample consisting essentially of an amorphous part” for obtaining the analysis value H 0 a trehalose purity of 99.9% or more and a substance consisting essentially of an amorphous part is used.
  • a powder for example, the above-mentioned standard sample for obtaining the analytical value H 100 is dissolved in an appropriate amount of purified water, concentrated, freeze-dried, and further, the moisture content determined by the Karl Fischer method is 2.0. The powder obtained by vacuum-drying until it becomes% or less is mentioned. Experience has shown that a powder consisting essentially of an amorphous part can be obtained when such a treatment is applied.
  • the analysis value H 0 when the powder X-ray diffraction profile of the trehalose-containing powder standard sample consisting essentially of an amorphous part is analyzed with computer software by the Hermans method is usually 8.5 to 8.7. %.
  • ⁇ Average crystallite size> In general, it is considered that one powder particle in a crystal-containing powder is composed of a plurality of single crystals, that is, a plurality of crystallites.
  • the crystallite size (crystallite diameter) in the crystal-containing powder is considered to be reflected in the characteristics of the crystal-containing powder.
  • the “average crystallite diameter of trehalose dihydrate crystal” (hereinafter simply referred to as “average crystallite diameter”) as used herein is obtained by subjecting a powder containing trehalose dihydrate crystal to powder X-ray diffraction analysis.
  • diffraction peaks detected in the powder X-ray diffraction pattern five diffraction peaks, that is, in a relatively low-angle region where the influence on the diffraction peak width due to the nonuniform strain of the crystallite is considered to be small
  • diffraction angle (2 ⁇ ) 13.7 ° (Miller index (hkl): 101), 17.5 ° (Miller index: 220), 21.1 ° (Miller index: 221) , 23.9 ° (Miller index: 231) and 25.9 ° (Miller index: 150) diffraction peaks (see symbols a to e in FIG. 1) are selected, and the respective half widths and diffraction angles are used.
  • the average of trehalose dihydrate crystals in the crystal-containing powder is obtained.
  • the crystallite diameter can be measured relatively easily.
  • the test sample Prior to powder X-ray diffraction analysis, the test sample is ground with a mortar, sieved with a 53 ⁇ m sieve, and powder that has passed through the sieve is used.
  • the “reducing power of the whole powder” as used herein refers to the amount of reducing sugar based on D-glucose conversion and the total amount of D-glucose using D-glucose as a standard substance by the Sommoji-Nelson method and the anthrone sulfate method, which are widely used in the field.
  • the amount of sugar can be obtained, and the percentage (%) of the amount of reducing sugar relative to the total amount of sugar contained in the powder can be obtained by calculating using the following formula [5].
  • the particle size distribution of the powder is determined as follows. That is, after accurately weighing metal mesh sieves (made by Iida Seisakusho Co., Ltd.) having openings of 425, 300, 212, 150, 106, 75 and 53 ⁇ m in accordance with Japanese Industrial Standards (JIS Z 8801-1) In this order, they are mounted on a low-tap sieve shaker (trade name “R-1”, manufactured by Tanaka Chemical Machinery Co., Ltd.), and then a fixed amount of the sample weighed is placed on the top sieve (opening) 425 ⁇ m), shake for 15 minutes with the sieves overlapped, then weigh each sieve again accurately, and subtract the mass before placing the sample from its mass to capture by each sieve. Determine the mass of the collected powder. Thereafter, the percentage (%) of the mass of the powder having each particle size collected by each sieve to the mass of the sample placed on the sieve is calculated and expressed as a particle size distribution.
  • the production method of the present invention basically includes the following steps (1) to (6): (1) An ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter and a trehalose-free enzyme derived from an Arthrobacter microorganism are added to the liquefied starch solution, a starch debranching enzyme, and a natural type derived from a microorganism belonging to the genus Paenibacillus.
  • a trehalose production step in which trehalose is produced by acting with recombinant CGTase or a mutant enzyme thereof; (2) A glucoamylase treatment step in which glucoamylase is allowed to act on the reaction solution containing trehalose obtained by the trehalose production step; (3) A purification and concentration step of filtering, decolorizing, desalting and concentrating the reaction solution containing trehalose; (4) a step of adding trehalose dihydrate crystals to a concentrated solution containing trehalose to crystallize trehalose dihydrate crystals; (5) A step of collecting trehalose dihydrate crystals by centrifugation from the mass kit obtained in the crystallization step; (6) A step of aging, drying and crushing the collected trehalose dihydrate crystal as necessary.
  • ⁇ Step (1) (Trehalose production step)>
  • liquefied starch as a raw material is converted to an ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme derived from an Arthrobacter genus microorganism, a trehalose-free enzyme derived from an Arthrobacter genus microorganism, a starch debranching enzyme, and a Paenibacillus genus microorganism.
  • This is a step of producing trehalose by acting together with natural or recombinant CGTase or mutant enzymes thereof.
  • ⁇ -Glycosyl trehalose-producing enzyme is an enzyme that acts on liquefied starch to produce ⁇ -glycosyl trehalose having a trehalose structure at the end of the molecule, while trehalose-releasing enzyme acts on ⁇ -glycosyl trehalose to release trehalose. It is an enzyme. Therefore, trehalose can be produced efficiently by allowing ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme and trehalose-releasing enzyme to act on liquefied starch obtained by gelatinizing and liquefying starch together with starch debranching enzyme.
  • the raw material starch used in the production of trehalose may be ground starch such as corn starch, rice starch and wheat starch, or ground starch such as potato starch, sweet potato starch and tapioca starch. Alternatively, it may be a partially decomposed starch obtained by partial decomposition with amylase.
  • the raw starch is usually gelatinized and liquefied by suspending in water to form starch milk having a concentration of about 10 to 50% and heating in the presence of heat-resistant ⁇ -amylase.
  • the degree of liquefaction of the liquefied starch is usually adjusted to less than 10 and more specifically less than 5 as dextrose equivalent (DE).
  • Examples of ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme derived from Arthrobacter microorganisms and trehalose-releasing enzyme derived from Arthrobacter microorganisms include those disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-143876 and Patent Documents 2 to 4 it can.
  • An ⁇ -glycosyl trehalose producing enzyme and a trehalose releasing enzyme may be used, and further, a mutant enzyme obtained by introducing a site-specific mutation into these enzymes may be used.
  • Arthrobacter sp. S34 (FERM BP-6450) disclosed in Patent Document 4 or an ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme and trehalose-releasing enzyme derived from a high-enzyme mutant thereof are preferably used. .
  • isoamylase or pullulanase widely used in the art can be used as the starch debranching enzyme.
  • Commercially available enzyme agents or those isolated from microorganisms may be used.
  • isoamylases for example, those derived from Pseudomonas amyloderamosa and Myroides odoratatus are well known, and in particular, an isoamylase derived from Pseudomonas amyloderamosa (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.). Is preferred.
  • pullulanase agent examples include pullulanase derived from Klebsiella pneumoniae (sales by Hayashibara Co., Ltd.), pullulanase derived from Bacillus amylopullulyticus (trade name “Promozyme”, Japan ) And the like.
  • CGTase in the above-mentioned trehalose production process is to disproportionate that CGTase catalyzes malto-oligosaccharide having a degree of glucose polymerization of 4 or less, which is inevitably produced in the process of trehalose production reaction by ⁇ -glycosyl trehalose synthase and trehalose release enzyme
  • the trehalose production reaction is further advanced to further increase the trehalose content in the reaction solution. .
  • CGTase has been isolated from various microorganisms, and its action and physicochemical properties have been clarified (“Industrial Glucose Enzyme Handbook”, edited by Kodansha Scientific, published by Kodansha, 28 to 32 pages (1999)).
  • the genes have been cloned, and the amino acid sequences have been determined from the nucleotide sequences of the genes, and the CGTase amino acid sequences are common to the enzymes classified into the ⁇ -amylase family. It is also known that there are four storage areas that are supposed to exist.
  • CGTase protein derived from Geobacillus stearothermophilus has already been clarified by X-ray crystal structure analysis.
  • the three catalytic residues of CGTase namely SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, The 225th aspartic acid residue (D225), the 253rd glutamic acid residue (E253), and the 324th aspartic acid residue (D324) in the amino acid sequence shown are also known ("Industrial Carbohydrate Enzyme Handbook") Edited by Kodansha Scientific, published by Kodansha, pages 56 to 63 (1999)).
  • CGTase derived from a microorganism belonging to the genus Paenibacillus or a mutant enzyme thereof is preferably used as CGTase.
  • Examples of the “natural CGTase derived from a microorganism belonging to the genus Paenibacillus” in the present invention include CGTase derived from known strains such as Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus experts, Paenibacillus amylolyticus, and Paenibacillus genus isolated from the natural world. CGTase derived from microorganisms can be used.
  • Paenibacillus illinoisensis NBRC15959 strain Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 strain, Paenibacillus experts NBRC13638 strain, and Paenibacillus amylolyticus NBRC15957 strain, respectively.
  • CGTase derived from a high enzyme-producing mutant strain obtained by introducing a mutation by, for example, ultraviolet irradiation or mutation treatment with a chemical substance can be more suitably used.
  • CGTase derived from a microorganism belonging to the genus Paenibacillus for example, CENase derived from Paenibacillus sp.
  • CGTase conventionally used in the production of food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder is CGTase derived from Geobacillus stearothermophilus.
  • CGTase having partial amino acid sequences shown in the following (a) to (d) is preferably used as CGTase.
  • A Gly-Ser-X 1 -Ala-Ser-Asp;
  • B Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn;
  • C Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys;
  • D Val-Asn-Ser-Asn-X 2 -Tyr;
  • X 1 means Ala or Ser
  • X 2 means Ala or Thr.
  • the partial amino acid sequence is a characteristic amino acid sequence peculiar to CGTase derived from Paenibacillus sp.
  • the “recombinant CGTase derived from the genus Paenibacillus” referred to in the present invention is a group obtained by cloning the CGTase gene of the genus Paenibacillus and expressing it in an appropriate host microorganism such as Escherichia coli or Bacillus subtilis.
  • the replaceable CGTase can be preferably used.
  • CGTase derived from the aforementioned Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 strain, Paenibacillus experts NBRC13638 strain, or Paenibacillus amylolyticus NBRC15957 strain, the applicant has independently cloned the CGTase gene from these microorganisms. When the sequence was determined, it was found to have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3 in the sequence listing.
  • the recombinant CGTase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3 in the sequence listing can be used in the production method of the present invention in the same manner as the natural CGTase derived from the genus Paenibacillus.
  • mutant enzyme of CENase derived from Paenibacillus sp is a genetic engineering technique applied to the gene encoding CGTase derived from Paenibacillus sp. , Preferably using a mutant CGTase introduced with a deletion, substitution or insertion mutation of one or more amino acid residues in the amino acid sequence within a range that does not substantially change the substrate specificity and enzyme activity as CGTase Can do.
  • the number of amino acid residues that can be deleted, substituted or inserted in the amino acid sequence of the mutant CGTase is not particularly limited as long as the substrate specificity and enzyme activity as CGTase are substantially retained, but about 680 It is preferably less than 5% of the amino acid sequence of CGTase composed of amino acid residues, that is, up to about 30 amino acid residues, desirably 1 to less than 20, more desirably 1 or more. The number is preferably less than 10.
  • the site of mutation introduction on the amino acid sequence is not particularly limited as long as the substrate specificity and enzyme activity as CGTase are substantially maintained, but it is classified into the ⁇ -amylase family existing on the amino acid sequence of CGTase. It is desirable to avoid the introduction of mutations into the above-mentioned partial amino acid sequences (a) to (d), which are peculiar to Paenibacillus microorganism-derived CGTase, which are conserved in common in the enzyme group.
  • CGTase derived from a microorganism belonging to the genus Paenibacillus or a mutant enzyme thereof that can be suitably used in the production method of the present invention
  • SEQ ID NO: 1 in the aforementioned sequence listing SEQ ID NO: 12 or 13 in the sequence listing prepared by introducing a site-specific mutation into CGTase having the amino acid sequence represented by 2 or 3, respectively, or CENase of Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 strain described later in Examples.
  • liquefied starch (pH about 4 to 10) as a raw material is preferably used as a substrate, and the above-mentioned ⁇ -glycosyl trehalose-producing enzyme derived from an Arthrobacter microorganism is used as a substrate solid 1 0.5 to 10 units per gram, 2.5 to 25 units of trehalose-free enzyme derived from the aforementioned Arthrobacter microorganisms, 50 to 1,000 units of starch debranching enzyme, and the above-mentioned Paenibacillus genus 0.5 to 50 units of CGTase derived from microorganisms is added, and the reaction is carried out at a temperature range where the used enzyme is not inactivated, usually 30 to 60 ° C. for 10 to 100 hours.
  • the trehalose content of the reaction solution at the end of the reaction is usually around 86% in terms of anhydride.
  • a glucoamylase agent is further allowed to act on the reaction solution obtained in the trehalose production step (1) to increase the trehalose content in terms of anhydride. That is, the reaction solution obtained by the trehalose production step contains saccharides such as D-glucose, maltose, malto-oligosaccharide having a glucose polymerization degree of 3 or more, ⁇ -glucosyl trehalose, and ⁇ -maltosyl trehalose together with trehalose.
  • glucoamylase By causing glucoamylase to act on this reaction solution, maltose and malto-oligosaccharide having a glucose polymerization degree of 3 or more are decomposed to D-glucose, and ⁇ -glycosyl such as ⁇ -glucosyl trehalose and ⁇ -maltosyl trehalose.
  • ⁇ -glycosyl such as ⁇ -glucosyl trehalose and ⁇ -maltosyl trehalose.
  • glucoamylase used in the production method of the present invention, maltose and maltooligosaccharide having a glucose polymerization degree of 3 or more can be decomposed to D-glucose, and ⁇ -glycosyl trehalose such as ⁇ -glucosyl trehalose and ⁇ -maltosyl trehalose can be used. As long as it can be decomposed into D-glucose and trehalose, there are no particular restrictions on its origin or origin.
  • glucoamylase agents such as Amano Enzyme Co., Ltd., trade name “Gluczyme AF6”, Nagase ChemteX Co., Ltd., trade name “GlucoTeam” and the like can be suitably used.
  • the trehalose content in the reaction solution after the glucoamylase treatment usually exceeds 86.0%, preferably 87.0% or more in terms of anhydride.
  • the trehalose content in the trehalose-containing sugar solution after glucoamylase treatment is less than 86.0% in terms of anhydride. It will not stop and will not be over 86.0%.
  • Step (3) (Purification and Concentration Step)>
  • the trehalose-containing sugar solution whose trehalose content in terms of anhydride has been increased after finishing the glucoamylase treatment is subjected to filtration, centrifugation, etc., by an ordinary method to remove insoluble matters, and decolorized with activated carbon.
  • This is a step of desalting with a cation exchange resin (H + type) and an anion exchange resin (OH ⁇ type) and concentrating to a concentration suitable for crystallization.
  • the trehalose content in terms of anhydride in the reaction solution has already been increased to 86.0% or more by the glucoamylase treatment step of (2). Therefore, in the purification and concentration step of (3), it is determined by column chromatography. A step of further increasing the trehalose content such as a fractionation step is not necessary.
  • This step is a step of crystallizing trehalose dihydrate crystals in the presence of seed crystals of trehalose dihydrate crystals from the trehalose-containing sugar solution obtained through the steps (1) to (3). That is, the sugar liquid in which the trehalose content in terms of anhydride is increased to a predetermined level is usually adjusted after adjusting the supersaturation degree for trehalose to be in the range of 1.05 to 1.50, in other words, The trehalose concentration is adjusted to about 60 to 85% and the liquid temperature is adjusted to about 40 to 80 ° C., and then transferred to an auxiliary crystal can.
  • the seed crystals of trehalose dihydrate crystals are added to the concentrated sugar solution volume in the auxiliary crystal can.
  • 0.1 to 5% (w / v), more specifically 0.5 to 2% (w / v) is contained, and the liquid temperature is 5 to 5 over 3 to 48 hours with gentle stirring.
  • Crystallization of trehalose dihydrate crystals is promoted by natural cooling to 60 ° C.
  • seed crystals of trehalose dihydrate crystals already exist in the auxiliary crystal can etc. it is not necessary to add the seed crystals of trehalose dihydrate crystals. In terms of work efficiency, crystallization of trehalose dihydrate crystals from the concentrate is usually performed in the presence of seed crystals.
  • a controlled cooling method or a pseudo controlled cooling method can be advantageously used instead of the natural cooling method.
  • the trehalose-containing sugar solution adjusted to a predetermined temperature through the step (3) is transferred to an auxiliary crystal can, and then the trehalose dihydrate crystal
  • the seed crystal is usually contained in an amount of 0.1 to 5% (w / v), more specifically 0.5 to 2% (w / v) with respect to the volume of the concentrated sugar solution in the auxiliary crystal can.
  • the liquid temperature T is continuously or stepwise with respect to the time t so as to maintain a range of 5% or more and less than 50% of the total temperature change amount (T 0 -T f ), desirably 10% or more and less than 30%. It is good to reduce.
  • the cooling time is divided into two sections of 6 hours and 4 hours, and the liquid temperature is changed from 60 ° C. to 50 ° C. Cool to 6 hours and then cool from 50 ° C to 20 ° C over 4 hours, or divide the cooling time into two sections of 7 hours and 3 hours, and the liquid temperature from 60 ° C to 45 ° C It is preferable to cool for 7 hours, and then cool from 45 ° C. to 20 ° C. for 3 hours, and more preferably, the cooling time is divided into three intervals of 4 hours, 3 hours and 3 hours. Then, the liquid temperature is cooled from 60 ° C. to 55 ° C. over 4 hours. In the next section, the liquid temperature is cooled from 55 ° C. to 50 ° C. over 3 hours. It is preferable to cool to 20 ° C.
  • the controlled cooling method or the pseudo-controlled cooling method compared with the crystallization method in which natural cooling is performed without performing temperature control, trehalose dihydrated crystal microcrystals are less likely to be formed, and crystals having a uniform particle size are produced.
  • the resulting mass kit can be obtained, and as a result, the yield of trehalose dihydrate crystal-containing powder can be further increased compared to the case of using the natural cooling method.
  • the obtained trehalose dihydrated crystal powder is more in terms of crystallinity of trehalose dihydrated crystal, which is an important index of trehalose purity and solidification than the powder obtained by the natural cooling method. It has the feature of being high.
  • the controlled cooling method or the pseudo controlled cooling method there is an advantage that a powder having a more uniform particle size distribution can be obtained as compared with a powder obtained by a crystallization method in which natural cooling is performed.
  • This step is a step of collecting trehalose dihydrate crystals by centrifugation from the mass kit obtained in the crystallization step (4) according to a conventional honey method.
  • the collected trehalose dihydrate crystal is washed by spraying (showing) a small amount of purified water in order to remove amorphous nectar adhering to the surface.
  • the amount of purified water used for washing the crystals is usually preferably 3% to 10% with respect to the weight of the mass kit before centrifugation. That is, if the amount of purified water used for washing is less than 3%, washing is not performed sufficiently, amorphous nectar remains, and the desired trehalose purity may not be obtained. On the other hand, if the amount of purified water used for washing exceeds 10%, the amount of trehalose dihydrate crystals dissolved and removed by washing increases and the starch yield may decrease.
  • This step is a step in which the collected trehalose dihydrate crystal is kept in a predetermined temperature and humidity atmosphere for a certain period of time, and the crystal is aged and dried with hot air to obtain a trehalose dihydrate crystal-containing powder.
  • the relative humidity of the atmosphere is preferably maintained at 55 ° C. and 60 to 90%, and the aging and drying time is preferably about 5 to 24 hours.
  • the powder that has undergone the aging and drying steps is then naturally cooled to room temperature. Further, forced cooling to a product temperature of about room temperature by blowing clean air of about room temperature can be advantageously performed.
  • the obtained crystal powder is used as it is or after being pulverized as necessary.
  • a trehalose-containing sugar solution having a high trehalose content of more than 86.0% in terms of anhydride can be obtained by enzymatic reaction. A process is unnecessary, there is no loss of trehalose due to fractionation, and a powder containing trehalose dihydrate crystals can be obtained at a high starch yield.
  • a honey-type system that removes nectar containing impurities by centrifuging the crystallized crystals is used instead of a whole sugar system that crystallizes, solidifies or spray-drys the entire mass kit including crystallized crystals.
  • the trehalose content in the obtained trehalose dihydrate crystal-containing powder can be easily increased to 98.0% or more, and a high-purity trehalose dihydrate crystal-containing powder can be produced.
  • the thus-produced trehalose dihydrate crystal-containing powder is almost equivalent to conventional food-grade trehalose-containing powder in physical properties such as solidification during storage when crystallization is performed by natural cooling. It is a powder containing trehalose dihydrate crystals containing particles that normally have a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 425 ⁇ m occupying 70% or more of the whole powder, and particles having a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 300 ⁇ m of 50% or more .
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by the production method of the present invention is significantly more than the conventional food-grade trehalose-containing powder.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by the production method of the present invention usually has a reducing power of 0.5% or less of the whole powder obtained by the above formula [5], and is blended in foods and pharmaceuticals. However, it is an excellent powder with no fear of discoloration due to browning.
  • the powder produced by the production method of the present invention can be used as it is or after adjusting the particle size as appropriate, as a powdery food material, cosmetic material, quasi-drug material, or pharmaceutical material.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by the production method of the present invention that applies the controlled cooling method during crystallization is a powder that is significantly harder to set than the conventional food-grade trehalose-containing powder, as described above. It can be said that this is a completely new powder containing trehalose dihydrate crystals that has not been known so far.
  • the powder is a single or a plurality of other powdered foods in each of the fields of food production, cosmetic production, quasi-drug production, and pharmaceutical production using a production plant designed on the premise of handling powder raw materials. It has an excellent advantage that it can be contained safely in materials, cosmetic materials, quasi-drug materials, and pharmaceutical materials.
  • ⁇ Experiment 1-1 Preparation of enzyme solution containing ⁇ -glycosyl trehalose producing enzyme and trehalose releasing enzyme derived from Arthrobacter microorganism> Arthrobacter sp. S34 strain (FERM BP-6450) was cultured by the method described in Example 2-1 of Patent Document 4 (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-228980), 20 L was obtained. After adding 2 grams of lysozyme (trade name “egg white lysozyme”, manufactured by Nagase ChemteX Corporation) to 20 L of this culture solution, the bacteria in the culture solution are stirred at 37 ° C. at a speed of 260 rpm for 24 hours. The body was lysed.
  • lysozyme trade name “egg white lysozyme”, manufactured by Nagase ChemteX Corporation
  • the lysate was centrifuged and the supernatant was collected to obtain a bacterial cell extract.
  • This bacterial cell extract was salted out with ammonium sulfate by a conventional method, the resulting salted-out product was dialyzed against 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and the dialyzed solution was separated into “Separbeads FP DA13” gel (Mitsubishi Chemical Corporation).
  • the enzyme fraction was collected by anion exchange chromatography using a product manufactured by the company.
  • the collected fraction was a partially purified enzyme preparation containing about 15,600 units of trehalose releasing enzyme and about 3,100 units of ⁇ -glycosyl trehalose producing enzyme.
  • the activities of ⁇ -glycosyl trehalose producing enzyme and trehalose releasing enzyme were measured according to the method disclosed in Patent Document 4 (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-228980).
  • CGTase derived from various microorganisms The following CGTases were used as CGTases derived from various microorganisms. That is, as CGTase derived from Geobacillus stearothermophilus, CGTase derived from Geobacillus stearothermophilus Tc-91 strain (FERM BP-11273) (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.), Bacillus macerans (Bacillus macerans)
  • the CGTase derived from the market is CGTase (trade name “Contiszyme”, sold by Amano Enzyme Co., Ltd.), and the CGTase derived from Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes is the commercially available CGTase (trade name “Tolzame”). ”, Novozymes Japan Co., Ltd.).
  • CGTase was prepared as CGTase derived from a microorganism belonging to the genus Paenibacillus. That is, Paenibacillus illinoisensis NBRC15959 strain, Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 strain, Paenibacillus experts NBRC13638 strain, Paenibacillus amylolyticus NBRC15957 strain, dextrin 2%, potassium hydrogen chloride 0.5% Each suspension supernatant obtained by culturing at 27 ° C.
  • the crude enzyme solution of CGTase derived from each microorganism was obtained by analysis and dialysis.
  • the obtained CGTase crude enzyme solution was subjected to anion exchange column chromatography using DEAE-Toyopearl 650S gel (manufactured by Tosoh Corporation) and hydrophobic column chromatography using butyl-Toyopearl 650M gel (manufactured by Tosoh Corporation), respectively.
  • the activity of CGTase derived from each strain was measured according to the above-described method and calculated using the formula [1].
  • ⁇ Experiment 1-3 Trehalose Formation Reaction> Corn starch was suspended in water to a concentration of 30%, and 0.1% calcium carbonate was added to this suspension. After adjusting the pH of the suspension to 6.0, 0.2% heat-resistant ⁇ -amylase agent (trade name “Termamyl 60L”, sold by Novozymes Japan KK) per starch solid was added, and 95 ° C. For 15 minutes to gelatinize and liquefy the starch. The resulting liquefied starch solution was autoclaved at 120 ° C. for 30 minutes, then cooled to 51 ° C., adjusted to pH 5.7, and then maintained at the same temperature, with 2 units of ⁇ -glycosyl per gram of starch solids.
  • ⁇ -amylase agent trade name “Termamyl 60L”, sold by Novozymes Japan KK
  • Example 1-4 Measurement of trehalose content in reaction solution>
  • the reaction solutions obtained in Experiment 1-3 were designated as reaction solutions 1 to 8 shown in Table 1, and the trehalose content was determined as follows. That is, each of the reaction solutions 1 to 8 was made into 1% solution with purified water, filtered through a 0.45 ⁇ m membrane filter, subjected to HPLC analysis under the following conditions, and the reaction solution was determined from the area of the peak appearing in the chromatogram by the differential refractometer. The trehalose content of was calculated and converted to anhydride. The results are shown in Table 1.
  • the trehalose content in the reaction solution shown in Table 1 is a value obtained with good reproducibility within a range of slight variations even when trehalose production reaction and glucoamylase treatment are repeated 5 times under the same conditions for each CGTase. It is.
  • reaction solution 2 As shown in Table 1, when CGTase derived from Geobacillus stearothermophilus Tc-91 strain conventionally used for the production of trehalose was used (reaction solution 2), the trehalose content after glucoamylase treatment was When the CGTase derived from Bacillus macerans was used (reaction liquid 3), the trehalose content increased to 85.1%, but the increase was slight. When CGTase derived from Thermoanaerobacterium thermosulfrigenes is used (reaction solution 4), the trehalose content is 83.4%, and the Geobacillus stearothermophila conventionally used for the production of trehalose. This was lower than when CGTase derived from the strain Tc-91 was used (reaction solution 2).
  • each CGTase derived from Paenibacillus illinoisensis NBRC15959 strain (reaction solution 5), Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 strain (reaction solution 6), and Paenibacillus experts NBRC13638 strain (reaction solution 7) was used.
  • Experiment 2-1 Preparation of test sample> ⁇ Test samples 1 to 8> Reaction liquids 1 to 8 having different trehalose contents obtained in Experiment 1 were purified by decolorization using activated carbon and desalting using ion exchange resin, and concentrated to a solid concentration of about 60%. Corresponding to each of 8 to 8, trehalose-containing sugar solutions 1 to 8 (containing 82.8 to 87.6% trehalose in terms of anhydride) were obtained.
  • Each of the trehalose-containing sugar solutions 1 to 8 is concentrated under reduced pressure to a solid concentration of about 85%, taken into an auxiliary crystal can, and about 1% (w / v) trehalose dihydrate containing each sugar solution. Crystals were added as seed crystals, and the mixture was stirred and naturally cooled from 60 ° C. to 20 ° C. over about 10 hours to prepare a mass kit in which trehalose dihydrate crystals were crystallized. The trehalose dihydrate crystals are collected from the mass kit by a basket-type centrifuge by a conventional method, and the collected trehalose dihydrate crystals are washed with 8% deionized water with respect to the weight of the mass kit, and are heated at 40 ° C. for 8 hours.
  • Trehalose dihydrate crystal-containing powders obtained from trehalose-containing sugar solutions 1 to 8 were used as test samples 1 to 8, respectively.
  • ⁇ Test sample 9> As a test sample 9, a food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder (trade name “Treha”, lot number: 9I131, Hayashibara Sales Co., Ltd.) was used.
  • Example 2-2 Trehalose purity, starch yield and caking property of test samples 1 to 9> ⁇ Trehalose purity> The trehalose purity of test samples 1 to 9 was determined by the same HPLC method as in Experiment 1-3. The results are shown in Table 2.
  • the yield to starch in the test samples 2 to 4 using CGTase other than CGTase derived from the microorganism of the genus Paenibacillus, the yield to starch was only 39% at most, whereas that of Paenibacillus In the test samples 5 to 8 using the microorganism-derived CGTase, the starch yield was 41 to 42%, exceeding 40%, and a difference due to the origin of the CGTase used was observed. Moreover, when the results in Table 1 and Table 2 are compared, the trehalose dihydrate crystal-containing powder prepared from the enzyme reaction solution having a high trehalose content in the enzyme reaction solution after the glucoamylase treatment tends to have a higher starch yield. A correlation was observed between the trehalose content in the enzyme reaction solution and the yield with respect to starch.
  • test sample 1 produced from trehalose-containing sugar solution 1 not using CGTase, and CGTase are derived from Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes
  • the test sample 4 produced using CGTase was determined to be “consolidated (+)” in the caking test, whereas test samples 2, 3 and 4 produced using other CGTases were used.
  • Nos. 5 to 8 are determined to be “slightly consolidated” ( ⁇ ) in the caking test as in the case of food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powders (test sample 9) that have been commercially available. It was.
  • the powder containing trehalose dihydrate crystals (test samples 5 to 8) produced by the production method of the present invention using CGTase derived from a microorganism belonging to the genus Paenibacillus is a food-grade trehalose dihydrate crystals that have been commercially available.
  • the contained powder (test sample 9), it is a powder that is not inferior in caking property, and it is a food-grade powder that is commercially available as a powdery food material, cosmetic material, quasi-drug material, or pharmaceutical material. It shows that the powder can be used in the same manner as the powder containing trehalose dihydrate crystals.
  • Example 3-1 Preparation of test sample> Concentrate each of the trehalose-containing sugar solutions 1 to 8 with different trehalose contents in terms of anhydride prepared in Experiment 2-1 to a solid concentration of about 85% under reduced pressure. Except that it was auxiliary crystallized by adding about 1% (w / v) trehalose dihydrate crystal as a seed crystal and stirring the mixture while stirring for about 10 hours from 60 ° C to 20 ° C. In the same manner as in 2, a mass kit in which trehalose dihydrate crystals were crystallized was prepared. In addition, the pseudo control cooling is divided into three sections of 4 hours, 3 hours and 3 hours, and the liquid temperature is changed from 60 ° C. to 55 ° C.
  • the liquid temperature is lowered from 55 ° C to 50 ° C, and in the last section, the liquid temperature is lowered from 50 ° C to 20 ° C over 3 hours. Went by.
  • trehalose dihydrated crystals were collected by a conventional method using a basket-type centrifuge, and the collected trehalose dihydrated crystals were washed with 8% deionized water based on the weight of the mass kit at 40 ° C. After aging and drying for 8 hours, clean air at 25 ° C. was blown for 30 minutes to forcibly cool and pulverize to obtain a powder containing trehalose dihydrate crystals.
  • Trehalose dihydrate crystal-containing powders obtained from each of the trehalose-containing sugar solutions 1 to 8 by pseudo controlled cooling were used as test samples 1c to 8c, respectively.
  • the trehalose purity of the test samples 1c to 8c prepared by applying the pseudo controlled cooling method in the crystallization process was in the range of 99.0 to 99.6%.
  • the trehalose purity of the test samples 1 to 8 obtained by crystallization by the natural cooling method of Experiment 2 in the column of “trehalose purity” in Table 2
  • all of the test samples 1c to 8c were trehalose.
  • the purity increased by 0.2 to 0.6%. This result shows that the trehalose purity of the powder can be increased by applying pseudo controlled cooling in the crystallization process.
  • test samples 1c to 8c had a starch yield with respect to starch of 35 to 45%. This result was crystallized by the natural cooling method of Experiment 2 and the test samples 1 to 8 with respect to starch yield (Table 2). In comparison with the column of “yield to starch”, the yields of starch in test samples 1c to 8c were improved by about 2 to 4%. This result means that when the pseudo controlled cooling method is applied at the time of crystallization, the yield with respect to starch is increased as compared with the case of crystallization by the natural cooling method.
  • the trehalose dihydrate-containing powder obtained by applying the pseudo controlled cooling method increases the starch yield even though there is no change in trehalose content in the trehalose-containing sugar solution used for crystallization.
  • the pseudo controlled cooling method crystals with few crystallites and a uniform particle size can be obtained. Therefore, when collecting crystals from a mass kit by centrifugation and when washing the collected crystals with water, It is presumed that the loss of trehalose is reduced.
  • test samples 1c to 8c were subjected to the same caking test as in Experiment 2-2 to examine the caking properties of the powder. As shown in Table 3, all of the test samples 1c to 4c were “slightly”. “Solidified” ( ⁇ ) was determined, and all of the test samples 5c to 8c collapsed when taken out on a flat plate, and did not maintain the shape of the bottom of the tube, and were determined as “no consolidated” ( ⁇ ). It was. These results show that when the pseudo controlled cooling method is applied during crystallization, the solidification property of the obtained powder tends to be improved compared to the case of crystallization by the natural cooling method. Show.
  • the conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder (test sample 9) was determined to be “somewhat consolidated” ( ⁇ ) (see Table 2) in the caking test, whereas the trehalose content was 86
  • the trehalose dihydrated crystal-containing powders (test samples 5c to 8c) obtained by crystallization by applying a pseudo-controlled cooling method from 5 to 8 trehalose-containing sugar liquids 5 to 8 having a relatively high value of “No solidification”
  • the fact that it was determined to be (-) is that the conventional food-grade trehalose dihydrate crystals are contained by crystallizing the trehalose-containing sugar solution with a relatively high trehalose content exceeding 86% by applying a pseudo controlled cooling method. It shows that it is possible to produce trehalose dihydrate crystal-containing powders that are significantly less consolidated than powders and have excellent powder properties.
  • the trehalose dihydrated crystal-containing powder having a higher trehalose purity compared to the case of crystallization by the natural cooling method has a higher yield to starch. It was found that can be manufactured.
  • trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by crystallization from a sugar solution having a trehalose content exceeding 86.0% by a pseudo controlled cooling method is a conventional food grade trehalose dihydrate produced by a natural cooling method. It was found that the water-containing crystal-containing powder is a more excellent powder in that it does not solidify even under conditions judged to be “somewhat solidified” ( ⁇ ) and maintains fluidity as a powder.
  • test sample A a standard sample substantially composed of trehalose dihydrate crystals is recrystallized from reagent-grade trehalose dihydrate crystals-containing powder (trade name “trehalose 999”, code number: TH224, purity 99.9% or more). It was prepared by letting. That is, 1,840 g of the reagent-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder was heated and dissolved in 1,000 g of purified water, and the dissolved solution was placed in a constant temperature chamber at 20 ° C. and allowed to recrystallize overnight.
  • reagent-grade trehalose dihydrate crystals-containing powder trade name “trehalose 999”, code number: TH224, purity 99.9% or more
  • test sample A The trehalose dihydrate crystals crystallized by recrystallization were collected by a conventional method using a basket type centrifuge and dried at 40 ° C. for 8 hours to obtain about 950 g of trehalose dihydrate crystals. This was designated as test sample A.
  • test sample A When the trehalose purity of test sample A was measured by the HPLC method described in Experiment 1, it was 100%.
  • test sample B a standard sample consisting essentially of an amorphous part was prepared by the following procedure. That is, the test sample A was dissolved in an appropriate amount of purified water, freeze-dried over 3 days, and then vacuum-dried overnight at 40 ° C. or lower to obtain a powder consisting essentially of an amorphous part. This was designated as test sample B.
  • test sample B When the trehalose purity of test sample B was measured by the HPLC method described in Experiment 1, it was 100%. In addition, it was 2.0% when the moisture content of the test sample B was measured by the Karl Fischer method.
  • ⁇ Experiment 4-2 Crystallinity of test samples A and B, test samples 1 to 9, and test samples 1c to 8c> ⁇ Crystallinity>
  • the crystallinity of the trehalose dihydrate crystals in test samples A and B, test samples 1 to 9, and test samples 1c to 8c was determined as follows. That is, using a commercially available reflected X-ray powder diffractometer (Spectris Co., Ltd., trade name “X'Pert PRO MPD”), a CuK ⁇ ray (X-ray tube) that is a characteristic X-ray emitted from a Cu counter cathode.
  • X'Pert PRO MPD reflected X-ray powder diffractometer
  • test samples A and B were prepared using dedicated analysis computer software installed in the powder X-ray diffractometer. Analytical values of crystallinity by Hermans method were determined for each of 1 to 9 and test samples 1c to 8c. Prior to analysis of crystallinity by the Hermans method, software is set so that a baseline determined to be optimal can be obtained while taking into account the overlap of peaks, diffraction intensity, scattering intensity, etc. in each powder X-ray diffraction pattern The adjusted granularity and bending factor were adjusted to appropriate levels.
  • the analysis value H 100 is the analysis value of crystallinity for the test sample A
  • the analysis value H 0 is the analysis value of crystallinity for the test sample B
  • the analysis value of crystallinity for each test sample is Hs.
  • the degree of crystallinity was determined by substituting into the formula [3].
  • the analysis value (H 100 ) of the crystallinity by the Hermans method for the test sample A and the same analysis value (H 0 ) for the test sample B were 50.69% and 8.59%, respectively.
  • the results are shown in Table 4.
  • the powder X-ray-diffraction pattern was shown in FIG.1 and FIG.2, respectively.
  • Powder X-ray diffractometer High-speed powder X-ray diffractometer (Sold by Kozu Seiki, Model number “PDS-16”), Debye-Shera mode, Camera length: 497.2mm
  • X-ray source Synchrotron radiation from a deflecting electromagnet (Hyogo Prefecture Beamline (BL08 B2)) Measurement wavelength: 1.2394 mm (10.00 keV) Measurement intensity: 10 9 photons / second Measurement angle: 3 to 38 °
  • Exposure time 600 seconds
  • Image shooting Imaging plate (trade name “Imaging plate BAS-2040, manufactured by FUJIFILM Corporation)
  • Image reader Image analyzer (manufactured by FUJIFILM, “Bioimage Analyzer BAS-2500”)
  • test samples A and B Prior to powder X-ray diffraction measurement, the test samples A and B were ground with a mortar and then screened with a 53 ⁇ m sieve, and the powder that passed through the sieve was subjected to X-ray crystal diffraction capillary (trade name “Mark” Tube ", No. 14 (0.6 mm in diameter, made by Lindeman Glass)) was uniformly filled so that the filling length was about 30 mm. Next, the capillary is cut at the end of sample filling, and the opening is sealed with an adhesive, and then the capillary is fixed to the sample mount with clay, so that the longitudinal direction of the capillary is perpendicular to the optical axis of the powder X-ray diffractometer.
  • X-ray crystal diffraction capillary trade name “Mark” Tube ", No. 14 (0.6 mm in diameter, made by Lindeman Glass)
  • the sample mount was attached to a powder X-ray diffractometer. In order to eliminate the influence on the powder X-ray diffraction profile by the orientation of the trehalose dihydrate crystal, the sample mount was rotated at a constant speed of 2 times / second during the measurement.
  • the powder X-ray diffraction profiles are obtained from each powder X-ray diffraction profile according to a conventional method in order to increase measurement accuracy.
  • the background signal from the line diffractometer was removed.
  • the powder X-ray diffraction patterns for the test samples A and B thus obtained are shown in FIGS. 3 and 4, respectively.
  • the powder X-ray diffraction pattern of test sample A by powder X-ray diffraction using synchrotron radiation shows that the diffraction peak characteristic of trehalose dihydrate crystals is in the range of diffraction angle (2 ⁇ ) of 3 to 38 °. Appeared clearly and sharply.
  • the wavelength of the emitted light (1.2394 ⁇ ) is different from the wavelength of the characteristic X-ray (1.5405 ⁇ ).
  • each diffraction peak appears at the diffraction angle (2 ⁇ )
  • test samples A and B are suitable as samples for determining the analysis value H 100 and the analysis value H 0 in Equation [3]. That it is.
  • Example 4-4 Average crystallite size of test sample A, test samples 1 to 9 and test samples 1c to 8c>
  • the crystallite diameter can be calculated from the half-value width and diffraction angle (2 ⁇ ) of each diffraction peak in the powder X-ray diffraction pattern.
  • the present inventors consider that the average value of crystallite diameters (average crystallite diameter) calculated from a plurality of diffraction peaks can be a parameter that defines the physical properties of the crystal-containing powder, and testing the trehalose dihydrate crystal-containing powder. The average crystallite size was determined for the sample.
  • test sample A When the crystallinity was determined for test sample A, test samples 1 to 9, and test samples 1c to 8c, excluding test sample B, which is an amorphous powder and does not show a diffraction peak in the powder X-ray diffraction pattern
  • test sample B which is an amorphous powder and does not show a diffraction peak in the powder X-ray diffraction pattern
  • Each average crystallite diameter was further determined using each powder X-ray diffraction pattern.
  • the average crystallite diameter has little influence on the five diffraction peaks in each powder X-ray diffraction pattern of the powder containing trehalose dihydrate crystal, that is, the diffraction peak width caused by the nonuniform strain of the crystallite Diffraction angle (2 ⁇ ) 13.7 ° (Miller index (hkl): 101), 17.5 ° (Miller index: 220), 21.1 ° (which is well separated from other diffraction peaks) Miller indices: 221), 23.9 ° (Miller indices: 231) and 25.9 degrees (Miller indices: 150) diffraction peaks (symbols a to e shown in FIG. 1) are selected, and the half width of each is selected.
  • Table 4 the results of trehalose purity and powder caking test were reprinted from Tables 2 and 3 for Test Samples 1 to 9 and Test Samples 1c to 8c, respectively. Further, test samples A and B, which were standard samples for measuring the degree of crystallinity, were subjected to the same caking test as in Experiments 2-2 and 3-2, respectively, and their caking properties were evaluated. The results are also shown in Table 4.
  • analysis values H 100 test sample A (trehalose purity 100.0% crystallinity 100.0%) which was a standard sample to determine the average crystallite size of was 3,910 ⁇ . Further, as shown in Table 4, the test sample A was determined as “no consolidation” ( ⁇ ) in the caking test. On the other hand, the test sample B (trehalose purity 100.0%, crystallinity 0.0%) as a standard sample for determining the analysis value H 0 was taken out from the tube onto a flat plate in the caking test. However, the hemispherical shape of the inner bottom of the tube was clearly maintained, and it was judged as “consolidated” (+).
  • test sample 9 which is a food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder that has been commercially available, had a trehalose purity of 99.0% and a crystallinity of 85.4%.
  • the crystallinity of test samples 1 to 8 obtained by crystallization by the natural cooling method in the crystallization step is in the range of 78.7 to 88.1%.
  • the crystallinity of the test samples 1c to 8c prepared by applying the pseudo controlled cooling method in the crystallization step was in the range of 85.7 to 96.0%.
  • the test samples 1c to 8c obtained by the pseudo controlled cooling method vary among the samples. The crystallinity was found to be 3.1 to 7.9% higher than that of the test samples 1 to 8 obtained by the natural cooling method.
  • the results shown in Table 4 indicate that the crystallinity is correlated with the caking property of the powder. That is, as shown in Table 4, the test sample A and the test samples 5c to 8c each having a crystallinity of 90% or more were “not consolidated” ( ⁇ ), whereas the crystallinity was 85 The test samples 2, 3, 5 to 9 and the test samples 1c to 4c that are not less than 90% and less than 90% are all “slightly consolidated” ( ⁇ ) and the crystallinity is less than 85%. B and test samples 1 and 4 were all “consolidated” (+). This indicates that the degree of crystallinity can be a powerful indicator for defining a powder containing trehalose dihydrate crystals that are difficult to solidify.
  • this result shows that in the production of trehalose dihydrate crystal-containing powder, if the trehalose content in the reaction solution is increased to more than 86.0%, and the pseudo controlled cooling method is applied in the subsequent crystallization step, the obtained powder As a result, the crystallinity degree of the trehalose dihydrate crystal in the water is 90% or more, and as a result, the trehalose dihydrate crystal-containing powder that is harder to set than the conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder Tells you that you can get.
  • the average crystallite diameters of test samples 1 to 8 obtained by crystallization by the natural cooling method in the crystallization step are 2,150 to 2,830 mm.
  • the average crystallite diameters of the test samples 1c to 8c prepared by applying the pseudo controlled cooling method in the crystallization process were in the range of 2,540 to 3,580cm.
  • the test samples 1c to 8c obtained by the pseudo controlled cooling method were obtained by the natural cooling method although there were variations among the samples. It was found that the average crystallite diameter was increased by 190 to 750 mm more than the test samples 1 to 8. From this result, it can be said that the application of the pseudo controlled cooling method in the crystallization process of the trehalose dihydrate crystal is an excellent method for obtaining the trehalose dihydrate crystal-containing powder having a large average crystallite diameter.
  • test samples 1 to 8 and the test samples 1c to 8c it was recognized that the value of the average crystallite diameter was larger as the trehalose purity and the crystallinity of the trehalose dihydrate crystal in the powder were higher.
  • This tendency is that the test sample 1 having a trehalose purity of 100.0% and a crystallinity of 100.0% has an average crystallite size of 3,910 mm and is a food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder.
  • the average crystallite size of No. 9 was 2,590 mm, the average crystallite size in the trehalose dihydrate crystal-containing powder shows a certain correlation with trehalose purity and crystallinity.
  • the results shown in Table 4 indicate that the average crystallite size is also correlated with the powder solidification. That is, as shown in Table 4, the test sample A and test samples 5c to 8c having an average crystallite diameter of 3,210 mm or more were “no consolidation” ( ⁇ ), whereas the average crystallite The test samples 2, 3, 5 to 9 and the test samples 1c to 4c having a diameter in the range of 2,500 mm or more and less than 3,200 mm are all “solidified” ( ⁇ ), and the average crystallite diameter The test sample B and the test samples 1 and 4 having a hardness of less than 2,500 mm were both “consolidated” (+). This indicates that the average crystallite size as well as the degree of crystallinity can be an effective index for defining a powder containing trehalose dihydrate crystals that are difficult to consolidate.
  • Experiment 5-1 Preservability test> To confirm that the caking test conducted in Experiment 2-2, Experiment 3-2, etc. is a valid test for evaluating the caking property of trehalose dihydrate crystal-containing powder during actual storage.
  • the test samples A and B obtained by the method of Experiment 4-1, the test samples 1 to 9 obtained by Experiment 2, and the test samples 1c to 8c obtained by Experiment 3 A storability test was conducted assuming the state, environment, period, etc. in which the hydrated crystal-containing powder was actually stored.
  • test samples A and B, the test samples 1 to 9, and the test samples 1c to 8c are taken and separately taken in a polyethylene bag (trade name “Unipack F-4”, manufactured by Nippon Production Co., Ltd., 17 cm ⁇ 3 polyethylene bags were collected for each test sample, and the polyethylene bags were collected in a state where the air was removed. Then, a weight of 13.2kg such load is 648kg pieces area 1 m 2 per each polyethylene bag, placed as load is applied to the entire top surface on each polyethylene bag, in this state, the hot and humid Stored for 60 days in an avoiding environment.
  • a polyethylene bag trade name “Unipack F-4”, manufactured by Nippon Production Co., Ltd.
  • food grade trehalose two hydrous crystalline powder containing products are usually in Packing bags input of 20kg filling, where it is stored in a warehouse or the like in a state where the stacked about 10 stages, migraine area 1 m 2 per 648kg of polyethylene bags Is equivalent to the load applied to the product in the lowermost stage in the state where the ten stages are stacked.
  • each test sample is taken out from the polyethylene bag, passed through a sieve with an opening of 425 ⁇ m, and the mass of the powder that has passed through and the powder that has not passed through is measured. The mass ratio (%) was determined and the average value of the three bags tested for each test sample was taken to determine the presence or absence of caking in the powder after storage for 60 days.
  • Example 5-2 Water solubility test> Each test sample was weighed in an amount of 0.25 g, and placed in a polypropylene cylindrical tube with a cap having a hemispherical inner 14-ml lid (available from Becton Dickinson, trade name “Falcon Tube 2059”). 5 ml of deionized water was added to the tube, heated in a constant temperature water bath at 50 ° C. for 30 minutes, then turned down twice, further held at 50 ° C. for 15 minutes, and the solubility at that time was examined visually. The results are shown in Table 5. The results are shown in Table 5. The results are shown in Table 5. The results are shown in Table 5.
  • the crystallinity of trehalose was 90.0% in a preservability test in which each test sample was stored for 60 days in an environment avoiding high temperature and high humidity while applying a load.
  • Test samples 1 to 9 and test samples 1c to 4c having an average crystallite diameter of 2,850 mm or less were determined to be “consolidated” (+), while the crystallinity was 91.0% or more
  • Test sample A and test samples 5c to 8c having 96.0% or less and an average crystallite diameter of 3,210 mm or more were determined to be “no consolidation” ( ⁇ ).
  • test sample determined to be “consolidated” (+) or “somewhat consolidated” ( ⁇ ) in the caking test conducted in Experiment 2-2, Experiment 3-2, etc. Is determined to be “consolidated” (+), whereas in the solidification test conducted in Experiment 2-2, Experiment 3-2, etc., the test sample was determined to be “not consolidated” ( ⁇ ) Indicates that “no consolidation” ( ⁇ ) is also determined in this storage test. This fact is valid as a test for evaluating the caking property of the powder containing trehalose dihydrate crystals in the actual storage environment conducted in Experiment 2-2, Experiment 3-2, etc. It is shown that.
  • test sample A having a crystallinity of 100% and an average crystallite diameter of 3,910 ⁇ is said to be “poor”
  • Test samples 1 to 9 and test samples 1c to 8c having a crystallinity of 96.0% or less and an average crystallite size of 3,580 mm or less were determined to have good solubility. It was done.
  • This result shows that in the powder containing trehalose dihydrate crystals, the crystallinity and the average crystallite diameter are increased to the level of the test sample A, in other words, to the level of the reagent grade trehalose dihydrate crystals-containing powder. This indicates that a problem different from the caking property occurs, that is, the solubility becomes worse.
  • the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing used for the comparison of the amino acid sequences are all Paenibacillus illinoissis NBRC15379 strain, Paenibacillus experts NBRC13638 strain, and Paenibacillus amylolyticus NBRC15957 strain, respectively.
  • the amino acid sequence encoded by the base sequence determined by the applicant's original cloning and determination of the CGTase gene was used.
  • the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 and 5 in the sequence listing were determined by the applicant independently and disclosed in JP-A-61-135581 by the same applicant as the present application. It is an amino acid sequence of CGTase derived from Bc.
  • CGTase excellent in the effect of increasing the trehalose content in the enzyme reaction solution, that is, common to the Paenibacillus microorganism-derived CGTase, and has the effect of increasing the trehalose content in the enzyme reaction solution.
  • the following (a) to (d) are partial amino acid sequences not present in CGTase which are not so much, ie, CGTase derived from Geobacillus stearothermophilus, Bacillus mazellans and Thermoanaerobacter thermosulfrigenes, respectively. The amino acid sequence was observed.
  • CGTase capable of making the trehalose content in the enzyme reaction solution more than 86.0% is the above (a) to ( It can be characterized as having a partial amino acid sequence of d).
  • Corn starch was suspended in water to a concentration of 30%, and calcium carbonate was added to the suspension to a final concentration of 0.1% to adjust the pH to 6.0.
  • Thermostable ⁇ -amylase (trade name “Termamyl 60L”, sold by Novozymes Japan Co., Ltd.) was added to this at 0.2% per starch mass and reacted at 98-100 ° C. for 15 minutes to gelatinize and liquefy the starch.
  • the obtained liquefied starch solution was autoclaved at 125 ° C.
  • Glucoamylase agent (trade name “Glucoteam # 20000”, sold by Nagase ChemteX Corporation). ) was added for 10 units per gram of starch and allowed to react for 24 hours to obtain a reaction solution having a trehalose purity, that is, a trehalose content of 87.4% in terms of anhydride.
  • the reaction solution thus obtained is heated to deactivate the enzyme, decolorized and filtered with activated carbon by a conventional method, and the filtrate is desalted with a cation exchange resin (H + type) and an anion exchange resin (OH ⁇ type). Concentrated under reduced pressure to obtain a concentrated liquid having a solid concentration of about 85%.
  • auxiliary crystal Take this in an auxiliary crystal can and add 2% of reagent-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder (trade name “Trehalose 999”, code number: TH224, trehalose purity 99.9% or more, sold by Hayashibara Co., Ltd.) as a seed crystal.
  • the temperature was 55 ° C, and the mixture was naturally cooled to 15 ° C over 24 hours with gentle stirring to crystallize trehalose dihydrate crystals. Crystals are recovered with a basket-type centrifuge, and the crystals are sprayed and washed with about 5% purified water based on the weight of the mass kit, then aged and dried at 50 ° C. for 2 hours, and air at 20 ° C. is blown for 10 minutes.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder can be produced with a high starch yield of about 42%.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by this production method has a crystallinity of 88.4% for the trehalose dihydrate crystal, an average crystallite size of 2,850 mm, and a reducing power of the whole powder of 0.4%.
  • Met. Incidentally, the measurement of the crystallinity was conducted using Hermance method was performed using the analytical values H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • This product can be used as a food material, a cosmetic material, a quasi-drug material, a pharmaceutical material, and the like in the same manner as a conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder.
  • the obtained reaction solution is heated to deactivate the enzyme, and decolorized and filtered with activated carbon by a conventional method.
  • the filtrate is desalted with a cation exchange resin (H + type) and an anion exchange resin (OH ⁇ type), and concentrated under reduced pressure.
  • a concentrated solution having a solid concentration of about 85% was obtained.
  • the trehalose dihydrated crystal-containing powder of this trehalose dihydrated crystal had a crystallinity of 95.6%, an average crystallite size of 3,520 mm, and a reducing power of the entire powder of 0.15%.
  • the measurement of the crystallinity was conducted using Hermance method was performed using the analytical values H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • the particle size distribution of this product was measured, 83.3% of particles having a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 425 ⁇ m, 72.5% of particles having a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 300 ⁇ m, and 6.9% of particles having a particle size of 425 ⁇ m or more were measured. % Was included.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder can be produced with a high starch yield of about 45%.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by this production method is compared with the conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder that is commercially available as a food material (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Co., Ltd.). Even though there is no significant difference in trehalose purity, it is a powder that is significantly harder to set than conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powders, and is easy to store and handle.
  • This product is similar to the conventional food grade trehalose dihydrate crystal-containing powder in that it is a trehalose dihydrate crystal-containing powder, and it is easy to store and handle, so it is a food material, cosmetic material, quasi-drug. It can be more suitably used as a raw material, a pharmaceutical material, and the like.
  • a trehalose production reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that CGTase derived from Paenibacillus experts NBRC13638 strain prepared by the method of Experiment 1-2 was used as CGTase.
  • Anhydrous reaction in the reaction solution after glucoamylase treatment was performed.
  • the trehalose content in terms of product was 87.2%.
  • the reaction solution thus obtained is heated to deactivate the enzyme, decolorized and filtered with activated carbon by a conventional method, and the filtrate is desalted with a cation exchange resin (H + type) and an anion exchange resin (OH ⁇ type).
  • trehalose dihydrate crystal-containing powder (trade name “trehalose 999”, code number: TH224, trehalose purity 99.9% or more, sold by Hayashibara Co., Ltd.) as a seed crystal.
  • Trehalose dihydrated crystals were cooled for 24 hours by a two-stage pseudo-controlled cooling method in which the temperature was 60 ° C. and the mixture was gently stirred for 60 hours from 60 ° C. to 45 ° C. and cooled from 45 ° C. to 20 ° C. over 9 hours Was crystallized.
  • Crystals are recovered with a basket-type centrifuge, and the crystals are sprayed and washed with about 5% purified water based on the weight of the mass kit, then aged and dried at 50 ° C. for 2 hours, and air at 20 ° C. is blown for 10 minutes. Cool, grind, 99.2% trehalose, 0.4% D-glucose, 0.06% 4-O- ⁇ -glucosyl trehalose and 6-O- ⁇ -glucosyl in terms of anhydride A powder containing trehalose dihydrate crystals containing 0.10% trehalose was obtained at a starch yield of about 44%.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder of this trehalose dihydrate crystal had a crystallinity of 92.6%, an average crystallite size of 3,130 mm, and a reducing power of the whole powder of 0.5%.
  • the measurement of the crystallinity was conducted using Hermance method was performed using the analytical values H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • the particle size distribution of this product was measured, it was found that particles having a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 425 ⁇ m were 75.2%, particles having a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 300 ⁇ m were 69.3%, and particles having a particle size of 425 ⁇ m or more were 7.8%. % Was included.
  • trehalose dihydrate crystal-containing powder can be produced with a high starch yield of about 44%.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by this production method is compared with the conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder that is commercially available as a food material (trade name “Treha” sold by Hayashibara Co., Ltd.) Even though there is no significant difference in trehalose purity, it is a powder that is significantly harder to set than conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powders, and is easy to store and handle.
  • This product is similar to the conventional food grade trehalose dihydrate crystal-containing powder in that it is a trehalose dihydrate crystal-containing powder, and it is easy to store and handle, so it is a food material, cosmetic material, quasi-drug. It can be more suitably used as a raw material, a pharmaceutical material, and the like.
  • the filtrate is desalted with a cation exchange resin (H + type) and an anion exchange resin (OH ⁇ type), and concentrated under reduced pressure.
  • a concentrated liquid having a solid concentration of about 86% was obtained.
  • the trehalose-containing solution is cooled to 60 ° C. for 8 hours, from 50 ° C. to 50 ° C. for 8 hours, from 50 ° C. to 35 ° C. for 8 hours, and from 35 ° C.
  • the dihydrate crystal of trehalose was crystallized by cooling to 15 ° C. in a total of 24 hours by a pseudo controlled cooling method. Crystals are recovered with a basket-type centrifuge, and the crystals are sprayed and washed with about 5% purified water based on the weight of the mass kit, then aged and dried at 50 ° C. for 2 hours, and air at 20 ° C. is blown for 20 minutes.
  • This trehalose dihydrate crystal-containing powder had a crystallinity of 93.3% for the trehalose dihydrate crystal, an average crystallite size of 3,280 mm, and a reducing power of the whole powder of 0.13%.
  • the measurement of the crystallinity was conducted using Hermance method was performed using the analytical values H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • the particle size distribution of this product was measured, 80.7% of particles having a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 425 ⁇ m, 74.4% of particles having a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 300 ⁇ m, and 7.1 of particles having a particle size of 425 ⁇ m or more were measured. % Was included.
  • trehalose dihydrate crystal-containing powder can be produced with a high starch yield of about 43%.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by this production method is compared with the conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder that is commercially available as a food material (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Co., Ltd.). Even though there is no significant difference in trehalose purity, it is a powder that is significantly harder to set than conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powders, and is easy to store and handle.
  • This product is similar to the conventional food grade trehalose dihydrate crystal-containing powder in that it is a trehalose dihydrate crystal-containing powder, and it is easy to store and handle, so it is a food material, cosmetic material, quasi-drug. It can be more suitably used as a raw material, a pharmaceutical material, and the like.
  • the structure of the obtained recombinant DNA “pRSET-iPI” is shown in FIG.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) (Stratagene) is transformed by a conventional method to obtain a transformant “BL21-RSET-iPI” retaining the recombinant DNA. did.
  • the transformant was then added to T medium containing 100 ⁇ l / ml of ampicillin Na salt (containing 12 g of bacto-tryptone, 24 g of bacto-east extract, 5 ml of glycerol, 17 mM monopotassium phosphate, 72 mM dipotassium phosphate per liter of medium).
  • a single amino acid substitution mutant CGTase is obtained by introducing a site-specific mutation into the natural (wild-type) CGTase gene derived from the Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 strain by a conventional method and expressing the obtained mutant CGTase gene in Escherichia coli. Two types were prepared.
  • the amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing which is the amino acid sequence of CGTase derived from Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 strain, is changed from the 133th aspartic acid residue to the 138th aspartic acid residue.
  • Histidine residues (Asp133 to His138), 223rd glycine residue to 231st histidine residue (Gly223 to His231), 255th glutamic acid residue to 258th leucine residue (Glu255 to Leu258), and 321 Corresponds to the 326th aspartic acid residue (Phe321 to Asp326) from the 4th phenylalanine residue, that is, 4 conserved regions conserved in common to the enzymes classified into the ⁇ -amylase family Mino acid sequence and 259th glycine residue to 264th aspartic acid residue (Gly269 to Asp264), 331st lysine residue to 337th asparagine residue (Lys331 to Asn337), 375th lysine residue 381 to lysine residues (Lys375 to Lys381) and 567th valine residue to 572th tyrosine residue (Val567 to Tyr572), that is, the above-mentione
  • E. coli BL21 (DE3) (manufactured by Stratagene) was transformed by a conventional method using recombinant DNAs “pRSET-iPI (G178R)” and “pRSET-iPI (Y454H)” carrying the mutant CGTase gene, Transformants “BL21-RSET-iPI (G178R)” and “BL21-RSET-iPI (Y454H)” retaining the respective recombinant DNAs were obtained. These transformants were cultured in the same manner as in the case of “BL21-RSET-iPI”, disrupted and then partially purified to obtain partially purified preparations of the respective mutant CGTases.
  • CGTase activity starch degrading activity
  • BL21-RSET-iPI G178R
  • BL21-RSET-iPI Y454H
  • Trehalose content in reaction solution obtained using each CGTase, sugar composition in obtained trehalose dihydrate crystal-containing powder, starch yield, crystallinity of trehalose dihydrate crystal, average crystallite diameter, powder The total reducing power and particle size distribution were measured, and the powder was subjected to a caking test by the same method as in Experiment 2-2 and Experiment 3-2 and a solubility test in water by the same method as in Experiment 5. The results are summarized in Table 6.
  • the trehalose content in the enzyme reaction solution was 87.0% or more equivalent to that of natural CGTase.
  • a powder containing trehalose dihydrate crystals having almost the same trehalose purity, crystallinity, particle size distribution, etc. can be produced with a high starch yield of about 44% to 45%.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by this production method is commercially available as a food material or the like, similar to the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced using natural CGTase in Examples 1 to 4.
  • the conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder It is a powder that is significantly harder to set than the powder, and that is easy to store and handle.
  • a temperature-controlled heat medium is passed through a jack of an auxiliary crystal can to change the temperature from 60 ° C. to 20 ° C. 2] by applying a controlled cooling method in which cooling is performed over a period of 24 hours with a 20-stage cooling profile approximated to 2), except that trehalose dihydrate crystals are crystallized by the same method as in Example 2.
  • a water-containing crystal-containing powder was produced, and 99.7% trehalose, 0.05% D-glucose, 0.03% 4-O- ⁇ -glucosyl trehalose, and 6-O- ⁇ - in terms of anhydride
  • a powder containing trehalose dihydrate crystals containing 0.05% glucosyl trehalose was obtained at a starch yield of about 46%.
  • the crystal content of the trehalose dihydrate crystal-containing powder of this trehalose dihydrate crystal was 96.8%, the average crystallite size was 3,680 mm, and the reducing power of the whole powder was 0.13%.
  • the measurement of the crystallinity was conducted using Hermance method was performed using the analytical values H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder can be produced with a high starch yield of about 46%.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by this production method is compared with the conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder that is commercially available as a food material (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Co., Ltd.). Even though there is no significant difference in trehalose purity, it is a powder that is significantly harder to set than conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powders, and is easy to store and handle.
  • This product is similar to the conventional food grade trehalose dihydrate crystal-containing powder in that it is a trehalose dihydrate crystal-containing powder, and it is easy to store and handle, so it is a food material, cosmetic material, quasi-drug. It can be more suitably used as a raw material, a pharmaceutical material, and the like.
  • This reaction solution was decolorized and filtered with activated carbon by a conventional method, and the filtrate was desalted with a cation exchange resin (H + type) and an anion exchange resin (OH ⁇ type), concentrated under reduced pressure, and a solid concentration of about 84%. It was set as the concentrate.
  • a cation exchange resin H + type
  • an anion exchange resin OH ⁇ type
  • a solid concentration of about 84% It was set as the concentrate.
  • Take this in an auxiliary crystal can and add 1% of reagent-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder (trade name “trehalose 999”, code number: TH224, trehalose purity 99.9% or more, sold by Hayashibara Co., Ltd.) as a seed crystal.
  • the temperature was 55 ° C.
  • the trehalose-containing solution was naturally cooled from 55 ° C. to 15 ° C.
  • Crystals are recovered with a basket-type centrifuge, and the crystals are sprayed and washed with about 5% purified water based on the weight of the mass kit, then aged and dried at 50 ° C. for 2 hours, and air at 20 ° C. is blown for 20 minutes. Cool, grind, 98.5% trehalose, 0.8% D-glucose, 0.07% 4-O- ⁇ -glucosyl trehalose and 6-O- ⁇ -glucosyl in terms of anhydride Although a powder containing trehalose dihydrate crystals containing 0.1% trehalose was obtained, the starch yield was about 38%.
  • This trehalose dihydrate crystal-containing powder had a crystallinity of 88.3% for the trehalose dihydrate crystal, an average crystallite size of 2,580 kg, and a reducing power of the entire powder of 1.0%.
  • the measurement of the crystallinity was conducted using Hermance method was performed using the analytical values H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • H 100 and H 0 obtained in experiments 4-2.
  • the particle size distribution of the product was measured, 74.4% of particles having a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 425 ⁇ m, 69.4% of particles having a particle size of 53 ⁇ m or more and less than 300 ⁇ m, and 12.6 of particles having a particle size of 425 ⁇ m or more were measured. % Was included.
  • starch is used as a raw material, and trehalose that is high in purity and difficult to consolidate as in conventional food grade trehalose dihydrate crystal-containing powder.
  • a dihydrate crystal-containing powder can be produced with a high starch yield.
  • the controlled cooling method or the pseudo controlled cooling method is applied in the crystallization process of the trehalose dihydrate crystal, a higher-purity trehalose dihydrate crystal-containing powder can be produced at a higher starch yield. .
  • the production method of the present invention makes it possible to produce trehalose dihydrate crystal-containing powder more efficiently on an industrial scale using starch, which is a limited resource although it is abundant, as a raw material. And its industrial utility is exceptional.
  • the trehalose dihydrate crystal-containing powder produced by the production method of the present invention to which the controlled cooling method or the pseudo controlled cooling method is applied is a powder that hardly significantly solidifies compared with the conventional food-grade trehalose dihydrate crystal-containing powder. It has excellent industrial applicability that it can be used in various applications as a powdery food material, cosmetic material, quasi-drug material, or pharmaceutical material that is easier to handle. .
  • the industrial utility of the present invention that exhibits such remarkable effects is extremely great.
  • FIG. a Diffraction angle (2 ⁇ ) 13.7 ° (mirror index (hkl): 101) used for calculation of crystallite diameter b: Diffraction angle (2 ⁇ ) 17.5 ° (mirror) used for calculation of crystallite diameter Diffraction peak (index: 220) c: diffraction angle (2 ⁇ ) used for calculation of crystallite diameter 21.1 ° (mirror index: 221) diffraction peak d: diffraction angle (2 ⁇ ) used for calculation of crystallite diameter Diffraction peak of 9 ° (Miller index: 231) e: Diffraction angle (2 ⁇ ) used for calculation of crystallite diameter 25.9 ° (Miller index: 150) Diffraction peak
  • FIG. a Control cooling curve b: Linear cooling c: Natural cooling curve pUC ori: plasmid pUC origin of replication
  • T7 T7 promoter white arrow (Amp): ampicillin resistance gene black arrow: CGTase gene

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Abstract

 トレハロース二含水結晶含有粉末を、澱粉を原料に、一貫した工程で、対澱粉収率良く製造することを可能にする製造方法を提供する。 液化澱粉に、澱粉枝切酵素及びシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに、アルスロバクター属微生物由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素とアルスロバクター属微生物由来のトレハロース遊離酵素を作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させてα,α-トレハロース含有糖液を得る工程、前記糖液から、α,α-トレハロース二含水結晶を晶析させる工程、及び、晶析したα,α-トレハロース二含水結晶を遠心分離により採取し、これを熟成、乾燥する工程を含むα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法であって、前記シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとしてパエニバチルス属微生物由来の天然型若しくは組換え型酵素又はそれらの変異体酵素を用いることにより、カラムクロマトグラフィーによる分画工程を経ることなく、前記糖液中のα,α-トレハロース含量を無水物換算で86.0質量%超とすることを特徴とする、無水物換算でα,α-トレハロースを98.0質量%以上含有するα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法を提供することにより上記課題を解決する。

Description

α,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法
 本発明は、α,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法に関し、詳細には、高純度のα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末を、澱粉から一貫した工程で収率良く工業的に製造するα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法と、その製造方法によって得られるα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末に関する。
 α,α-トレハロース(以下、本明細書では「トレハロース」と略称する。)の二含水結晶含有粉末の製造方法としては、従来から種々の方法が知られている。例えば、特許文献1には、液化澱粉にβ-アミラーゼ又はβ-アミラーゼとともに澱粉枝切酵素を作用させ、次いで、マルトース・トレハロース変換酵素を作用させてトレハロース含有糖液を得、これを適宜精製した後、トレハロースを晶析させてトレハロース二含水結晶含有粉末を製造する方法が開示されており、特許文献2には、液化澱粉に、澱粉枝切酵素とともに、α-グリコシルトレハロース生成酵素(別名「非還元性糖質生成酵素」)及びトレハロース遊離酵素を作用させ、さらにグルコアミラーゼを作用させて、トレハロース含有糖液を得、これを適宜精製した後、トレハロースを晶析させてトレハロース二含水結晶含有粉末を製造する方法が開示されている。
 また、特許文献3、4には、特許文献2に開示された前記製造方法において、澱粉枝切酵素とサイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(以下、「CGTase」と略称する。)を併用し、それらとともにα-グリコシルトレハロース生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることによって前記トレハロース含有糖液中のトレハロース含量を高めるようにした、トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法が開示されている。さらに、特許文献5、6には、液化澱粉に、スルフォロブス(Sulfolobus)属に属する微生物由来の耐熱性のα-グリコシルトレハロース生成酵素、又は耐熱性のα-グリコシルトレハロース生成酵素と耐熱性のトレハロース遊離酵素を作用させて、トレハロース含有糖液を得、これを適宜精製した後、トレハロースを晶析させてトレハロース二含水結晶含有粉末を製造する方法が開示されている。
 これら公知の製造方法のうち、特許文献3、4に開示された前記各酵素の組み合わせによる場合には、液化澱粉を原料にして、カラムクロマトグラフィーによる分画工程を経ることなく、酵素反応だけでトレハロース含量が無水物換算で80質量%を超えるトレハロース含有糖液を容易に調製することができ、しかも、斯くして調製されたトレハロース含有糖液の組成はトレハロース以外は殆どがグルコースであるので、トレハロースの晶析性が良いという利点を有している。したがって、特許文献3、4に開示された前記製造方法による場合には、前記トレハロース含有糖液からトレハロース二含水結晶を晶析させ、遠心分離によって結晶を採取する分蜜方式によって、比較的高純度のトレハロース二含水結晶含有粉末を収率良く製造することができる。
 特に、特許文献3、4に開示された前記製造方法において、α-グリコシルトレハロース生成酵素及びトレハロース遊離酵素としてアルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物由来の酵素を用いる場合には、アルスロバクター属に属する微生物は生育が比較的早く、また、前記酵素の生産性も高いので、トレハロース二含水結晶含有粉末を工業的規模で製造する上では極めて有利である。このため、本出願人は、現在、α-グリコシルトレハロース生成酵素及びトレハロース遊離酵素としてアルスロバクター属に属する微生物由来の酵素を用い、特許文献3、4に開示された前記製造方法によって、高純度トレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハ』、株式会社林原販売、製品規格上のトレハロース純度:98.0質量%以上。以下、「食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末」という。)を製造し、主として、食品素材、化粧品素材などとして販売している。しかし、本製造方法による場合には、酵素反応によって得られるトレハロース含有糖液中のトレハロース含量は、現在のところ、種々酵素反応の条件を最適化した場合でも、無水物換算で約85質量%前後止まりであり、対澱粉収率は40質量%に達しないというのが実状である。
 一方、非特許文献1、2には、スルフォロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来の耐熱性α-グリコシルトレハロース生成酵素、耐熱性トレハロース遊離酵素及び耐熱性イソアミラーゼの各遺伝子をそれぞれ大腸菌で発現させることにより調製した組換え酵素や、それらにさらに部位特異的変異を導入して作製した変異体酵素を組み合わせて可溶性澱粉に作用させると、トレハロース含量が無水物換算で87質量%前後のトレハロース含有糖液が得られることが開示されている。
 しかしながら、非特許文献1、2において原料として用いられている可溶性澱粉は、澱粉を酸処理することにより澱粉粒内の非晶質部分を除去することにより製造される非常に特殊で高価な原料であり、たとえトレハロース含量が高まった酵素反応液が得られるとしても、可溶性澱粉をトレハロース二含水結晶含有粉末の工業的生産用の原料として使用することは、コスト的にみて到底不可能である。また、非特許文献1、2に開示されている組換え酵素や変異体酵素を、可溶性澱粉ではなく、工業的規模での製造において用いられる液化澱粉に作用させた場合には、酵素反応によって得られるトレハロース含有糖液中のトレハロース含量は、当然のことながら87質量%前後よりも低下し、85質量%前後に止まることとなり、現行の製造方法以上にトレハロース二含水結晶含有粉末の対澱粉収率を向上させることは望めない。
 因みに、トレハロース含有糖液中のトレハロース含量を単に86.0質量%以上に高めるのであれば、トレハロース含有糖液にカラムクロマトグラフィーを用いるカラム分画を適用してトレハロース高含有画分を採取することが考えられる。しかし、カラム分画を行うと、工程が増える分だけ製造コストが増す上に、トレハロース高含有画分として採取される画分以外の画分に含まれるトレハロースのロスが必然的に発生するので、仮にカラム分画によって無水物換算でのトレハロース含量が86.0質量%を超えるトレハロース含有糖液が得られたとしても、そのような糖液から晶析したトレハロース二含水結晶を採取してトレハロース二含水結晶含有粉末を製造しても、対澱粉収率が大幅に低下することは避けられない。
 また、単に対澱粉収率を高めるだけであれば、晶析した結晶を遠心分離で採取する分蜜方式に代えて、晶析した結晶を含むマスキットを容器に取り出してその全量を結晶・固化させてこれを粉砕するか、又は、マスキットを噴霧乾燥して粉末を得る、いわゆる全糖方式を採用することも考えられる。しかし、全糖方式による場合には、晶析したトレハロースとともに、マスキットに含まれるグルコースのような製法に特有の共雑物までもが一緒に粉末化されるので、得られるトレハロース二含水結晶含有粉末中のトレハロース含量はマスキットにおけるトレハロース含量以上に高まらず、高純度のトレハロース二含水結晶含有粉末を得ることができないという不都合がある。
 澱粉は、現在では、比較的豊富に存在し、安価で容易に入手し得る原料であるが、決して無尽蔵に存在する物質ではなく、一年間に地球上で人間によって生産される澱粉の総量には限りがある。その一方で、澱粉の用途は広く、従来からの工業的用途、食料用、飼料用、或いは食品原料としての用途に加えて、近年では、クリーンなエネルギー需要の隆盛から、新たにバイオエタノール等の燃料原料としても用いられるようになっている。斯かる状況下、製品、すなわち、トレハロース二含水結晶含有粉末の対澱粉収率を向上させることは、限りある資源の有効利用という点からみて極めて重要である。
特開平7-170977号公報 特開平7-213283号公報 特開平8-73504号公報 特開2000-228980号公報 特開平8-66188号公報 特開平8-66187号公報
ファン(Fang)ら、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー(Journal of Agricultural and Food Chemistry)、2007年、第55巻、5588乃至5594頁 ファン(Fang)ら、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー(Journal of Agricultural and Food Chemistry)、2008年、第56巻、5628乃至5633頁
 本発明は、上記従来のトレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法における不都合を解消し、トレハロースの純度を保ちつつ、トレハロース二含水結晶含有粉末の対澱粉収率をより高めることを目的として為されたもので、高純度のトレハロース二含水結晶含有粉末を、澱粉を原料に一貫した工程で収率良く工業的規模で製造することを可能にするトレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法と、その製造方法によって製造される新規なトレハロース二含水結晶含有粉末を提供することを課題とする。
 上記の課題を解決すべく、本発明者らは、特許文献3、4に開示された前記製造方法で用いられる複数の酵素の組み合わせについて種々検討と試行錯誤を重ねた結果、α-グリコシルトレハロース生成酵素及びトレハロース遊離酵素として、微生物の培養が容易で酵素の生産性も高いアルスロバクター属に属する微生物由来の酵素を用いる場合には、これらの酵素とともに用いるCGTaseとして、これまで使用していたジオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus) Tc-91株(FERM BP-11273)由来CGTaseに代えて、パエニバチルス(Paenibacillus)属微生物由来の天然型若しくは組換え型CGTase又はそれらの変異体酵素を用いることにより、トレハロース生成反応がさらに効率よく進行し、グルコアミラーゼ処理工程後のトレハロース含有糖液中のトレハロース含量を、カラムクロマトグラフィーによる分画工程を経ることなく、無水物換算で86.0質量%を超えるレベルにまで、好ましくは87.0質量%以上にまで向上させることができることを見出した。そして、このようにして得られたトレハロース含有糖液を、常法に従い、脱色、脱塩、濃縮し、トレハロース二含水結晶を晶析させ、得られる結晶を遠心分離によって採取し、これを熟成、乾燥することにより、無水物換算でトレハロースを98.0質量%以上含有する高純度のトレハロース二含水結晶含有粉末を、従来よりも高い対澱粉収率で製造できることを見出して、本発明を完成した。
 すなわち、本発明は、液化澱粉に、澱粉枝切酵素及びCGTaseとともに、アルスロバクター属微生物由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素とアルスロバクター属微生物由来のトレハロース遊離酵素を作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させてトレハロース含有糖液を得る工程、前記糖液からトレハロース二含水結晶を晶析させる工程、及び、晶析したトレハロース二含水結晶を遠心分離により採取し、これを熟成、乾燥する工程を含むトレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法であって、前記CGTaseとしてパエニバチルス属微生物由来の天然型若しくは組換え型酵素又はそれらの変異体酵素を用いることにより、カラムクロマトグラフィーによる分画工程を経ることなく、前記糖液中のトレハロース含量を無水物換算で86.0質量%超とすることを特徴とする、無水物換算でトレハロースを98.0質量%以上含有するトレハロース二含水結晶の製造方法を提供することによって、上記課題を解決するものである。
 上記本発明の製造方法によって製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末は、本発明者らが確認したところによれば、トレハロース純度はもとより、流動性良好である点で、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末に比べて何ら遜色のない粉末であり、当該粉末は、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末と同様に、食品素材、化粧品素材などとして広範な分野に使用することができる。
 なお、CGTaseの供給源である前記パエニバチルス属に属する微生物としては、例えば、パエニバチルス・イリノイセンシス(Paenibacillus illinoisensis)、パエニバチルス・パブリ(Paenibacillus pabuli)、又は、パエニバチルス・アミロリティカス(Paenibacillus amylolyticus)が挙げられ、このなかでは、パエニバチルス・イリノイセンシス又はパエニバチルス・パブリが、トレハロース生成反応において反応液中のトレハロース含量を高める効果の大きいCGTaseを産生する点で好ましく、とりわけパエニバチルス・イリノイセンシスが好ましい。
 また、上記CGTaseとしては、とりわけ、下記(a)乃至(d)に示す部分アミノ酸配列を有するものが好適に用いられる:
(a)Gly-Ser-X-Ala-Ser-Asp;
(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn;
(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys;
(d)Val-Asn-Ser-Asn-X-Tyr。
(但し、XはAla又はSerを、XはAla又はThrをそれぞれ意味する。)
 また、本発明で用いるCGTaseとしてさらに好適なものを例示するならば、配列表における配列番号1、2、3、12又は13のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するCGTaseが挙げられる。
 本発明者らは、さらに試行錯誤を重ねた結果、トレハロースを無水物換算で86.0質量%超、好ましくは87.0質量%以上含有する前記トレハロース含有糖液からトレハロース二含水結晶を晶析させるに際し、後述する制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用すれば、トレハロース含有糖液の温度低下を自然に任せる自然冷却法によってトレハロース二含水結晶を晶析させる場合に比較して、得られるトレハロース二含水結晶含有粉末の対澱粉収率をさらに高めることができることを見出した。すなわち、本発明は、前記本発明の製造方法において、前記トレハロース二含水結晶を晶析させる工程が、制御冷却法又は擬似制御冷却法によって行われるトレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法を提供することによっても、上記の課題を解決するものである。
 なお、制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用すると対澱粉収率が向上する理由は定かではないが、制御冷却法又は擬似制御冷却法によれば、晶析の初期においては、冷却による急激な過飽和度の上昇と二次的な結晶核の形成を抑制して、大きさのほぼ揃った微小な結晶核を多数生成させ、微小な結晶核が多数出揃った晶析の後期において急速に冷却することにより、大きさの揃った多数の結晶核を一斉に成長させることになるので、微結晶が少ない粒径が揃った結晶を含むマスキットが得られ、遠心分離による結晶の採取が容易となり、比較的少量の水で採取した結晶を洗浄することができるので、洗浄時のトレハロースのロスが少なくなるためではないかと推測される。
 加えて、本発明者らは、上記のようにしてトレハロース二含水結晶の晶析時に制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用することによって製造されたトレハロース二含水結晶含有粉末は、意外にも、自然冷却法によって製造されたトレハロース二含水結晶含有粉末や従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末に比べて、固結し難い点において優れていること見出した。そして、このような優れた物性が、トレハロース二含水結晶含有粉末におけるトレハロース純度とトレハロース二含水結晶についての結晶化度の違いによってもたらされるものであることを確認し、トレハロース二含水結晶含有粉末自体についての本発明を完成した。
 すなわち、本発明は、トレハロース二含水結晶を晶析させるに際して前記制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用する本発明の製造方法によって得られるトレハロース二含水結晶含有粉末であって、無水物換算でトレハロースを99.0質量%以上99.6質量%以下含有し、粉末X線回折プロフィルに基づき算出されるトレハロース二含水結晶についての結晶化度が90.0%以上96.0%以下であるトレハロース二含水結晶含有粉末を提供することによって、上記の課題を解決するものである。
 因みに、無水物換算でトレハロースを99.0質量%以上99.6質量%以下含有し、粉末X線回折プロフィルに基づき算出されるトレハロース二含水結晶についての結晶化度が90.0%以上96.0%以下であるトレハロース二含水結晶含有粉末は、本発明者らが確認したところによれば、トレハロース含量が従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末と同程度かやや高い程度でありながら、トレハロース二含水結晶についての結晶化度が食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末よりも有意に高く、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末とは区別される新規な粉末である。
 なお、制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用することによって、固結し難いトレハロース二含水結晶含有粉末が得られる理由は定かではないが、制御冷却法又は擬似制御冷却法によれば、上述したとおり、微結晶が少ない粒径が揃った結晶を含むマスキットが得られるので、得られる粉末におけるトレハロースの純度とトレハロース二含水結晶についての結晶化度が高まることが作用しているのではないかと推測される。このことは、制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用することによって得られる本発明のトレハロース二含水結晶含有粉末におけるトレハロース二含水結晶についての結晶化度が、自然冷却で得られた粉末や、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末におけるトレハロース二含水結晶についての結晶化度よりも有意に高いという事実によっても裏付けられる。
 本発明の製造方法によれば、培養が容易で酵素の生産性も高いアルスロバクター属に属する微生物由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素とトレハロース遊離酵素を用い、澱粉を原料にして一貫した工程で、高純度のトレハロース二含水結晶含有粉末を対澱粉収率良く工業的規模で製造することができる。したがって、原料である澱粉資源の有効利用に貢献するという優れた利点がもたらされる。特に、トレハロース含有糖液からトレハロース二含水結晶を晶析させるに際して、制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用する場合には、製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末の対澱粉収率をより向上させることができるという利点がある。また、制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用する本発明の製造方法で製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末は、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末に比べて、トレハロース純度及びトレハロース二含水結晶についての結晶化度が高く、固結し難い点において優れた粉末である。
実質的にトレハロース二含水結晶からなるトレハロース二含水結晶含有粉末の特性X線による粉末X線回折パターンの一例である。 実質的に無定形部分からなるトレハロース粉末の特性X線による粉末X線回折パターンの一例である。 実質的にトレハロース二含水結晶からなるトレハロース二含水結晶含有粉末のシンクロトロン放射光による粉末X線回折パターンの一例である。 実質的に無定形部分からなるトレハロース粉末のシンクロトロン放射光による粉末X線回折パターンの一例である。 各種冷却パターンを示す図である。 パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株由来CGTase遺伝子を含む組換えDNA「pRSET-iPI」の構成及び同組換えDNAにおける制限酵素認識部位を表す図である。
1.用語の定義
 本明細書において以下の用語は以下の意味を有している。
<対澱粉収率>
 本明細書でいう「対澱粉収率」とは、原料澱粉の無水物換算での単位質量当たりの得られるトレハロース二含水結晶含有粉末の無水物換算での質量の割合を百分率(%)で表したものである。なお、本明細書では、澱粉を原料とし、これに酵素を作用させてトレハロースを生成させ、生成したトレハロースを晶析、採取、熟成、乾燥するという一連の一貫した工程で、トレハロース二含水結晶含有粉末を製造することを前提としているので、本明細書でいう「対澱粉収率」とは、澱粉に酵素を作用させて得られるトレハロース含有糖液から最初に晶析する、いわゆる一番晶から製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末の対澱粉収率を意味しており、晶析した結晶を採取した後に残った糖液や、マスキットから分離された蜜などを糖液に戻して再度晶析させる、いわゆる二番晶以降から製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末を含めたものではない。因みに、種晶を添加して晶析させる場合、対澱粉収率の算出において種晶の量は、本明細書を通じて、得られるトレハロース二含水結晶含有粉末の量に含まれる。
<CGTase活性>
 本明細書において「CGTase活性」は以下のように定義される。すなわち、0.3%(w/v)可溶性澱粉、20mM酢酸緩衝液(pH5.5)、1mM塩化カルシウムを含む基質水溶液5mlに対し、適宜希釈した酵素液0.2mlを加え、基質溶液を40℃に保ちつつ、反応0分目及び反応10分目に基質溶液を0.5mlずつサンプリングし、直ちに0.02N硫酸溶液15mlに加えて反応を停止させた後、各硫酸溶液に0.1Nヨウ素溶液を0.2mlずつ加えて呈色させ、10分後、吸光光度計により波長660nmにおける吸光度をそれぞれ測定し、下記式[1]により澱粉分解活性として算出する。CGTase活性1単位は、斯かる測定条件で、溶液中の澱粉15mgのヨウ素呈色を完全に消失させる酵素量と定義する。
式[1]:
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
<制御冷却法>
 本明細書でいう「制御冷却法」とは、「制御された冷却」によって結晶を晶析させる方法をいい、晶析工程として設定した作業時間を「τ」、晶析開始時の液温を「T」、晶析終了時の目標とする液温を「T」、時間「t」における液温を「T」とすると、時間tにおける液温Tが原則として下記式[7]で表される冷却方法をいう。
式[2]:
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 制御冷却法を、晶析工程として設定する作業時間を横軸、晶析時の液温を縦軸としたグラフを用いてより具体的に(模式的に)表すならば、図5の符号aに示すごとくである。図5の符号aに示すとおり、制御冷却法によれば、液温が高い晶析の初期においては液温が緩やかに低下し、液温がある程度低下した晶析の後期においては液温が急速に低下することになり、t=τ/2の時点、つまり、晶析工程の中間点における液温「T」は、少なくとも T>[(T-T)/2+T] の関係(つまり、晶析工程の中間点における温度変化が総温度変化の50%未満となる)が維持される。この液温の時間に対する変化パターンにおいて、制御冷却法は、液温がTからTまで時間τをかけて直線的に低下する直線冷却(図5における符号b)や、液温が高い晶析の初期においては液温が指数関数的に急速に低下し、液温が低下した晶析の後期になるほど液温が緩やかに低下してゆく通常の自然冷却法(図5における符号c)とは明らかに区別される。なお、液温Tを上記式[2]で表される時間tの関数として変化させるには、例えば、市販されている汎用の晶析システム用プログラム恒温循環装置などを用いれば良い。
 晶析工程において斯かる制御冷却法を適用する場合には、トレハロースの種晶を添加した後、晶析の初期においては、液温の冷却が緩やかに行われるので、冷却による急激な過飽和度の上昇と二次的な結晶核の形成が抑制され、添加した種晶を結晶核とする結晶を優先的に成長させることができる。一方、添加した種晶を結晶核とする結晶が出揃った晶析の後期においては、液温を急速に冷却することにより、出揃った結晶を一斉に成長させることになるので、制御冷却法によれば、微結晶が少ない粒径が揃った結晶を含むマスキットが得られるという利点が得られる。なお、「制御冷却法」については、例えば、「久保田徳昭著、『分かり易いバッチ晶析』、分離技術会、平成22年4月30日発行、32~47頁」に詳述されている。
<擬似制御冷却法>
 本明細書でいう「擬似制御冷却法」とは、文字どおり上記した制御冷却法に擬似した冷却法であり、液温Tを時間tに対して厳密に上記式[2]にしたがって変化させるのではなく、晶析に用いるトレハロース含有溶液におけるトレハロース純度、濃度、過飽和度、種晶の量などにもよるけれども、作業時間t=τ/2の時点(晶析工程の中間点)で結晶核がおおむね出揃うことが望ましいことから、t=τ/2の時点における液温Tの変化量(T-T)が、総温度変化量(T-T)の5%以上50%未満、望ましくは、10%以上30%未満の範囲を維持するように液温Tを時間tに対して連続的又は段階的に低下させる冷却法を意味する。t=τ/2の時点における液温Tの変化量(T-T)が、総温度変化量(T-T)の5%以上50%未満であるように液温Tを時間tに対して連続的又は段階的に低下させる場合には、液温が高い晶析の初期においては液温Tが時間tに対して緩やかに低下し、液温がある程度低下した晶析の後期においては液温Tが時間tに対して急速に低下することになり、結果として、上述した制御冷却法には及ばない場合があるものの、微結晶が少ない粒径が揃った結晶を含むマスキットが得られるという、制御冷却法とほぼ同様の利点が得られる。
 具体的には、例えば、作業時間τを、少なくとも2つ、好ましくは3つ以上の区間に分け、晶析工程の初期の区間においては、冷却における温度勾配を緩やかに(冷却速度を遅く)し、初期乃至は中期から後期に向かうにしたがい、温度勾配を大きく(冷却速度を速く)して、t=τ/2の時点における液温Tの変化量(T-T)が総温度変化量(T-T)の5%以上50%未満、望ましくは、10%以上30%未満となるように液温Tを時間tに対して連続的又は段階的に低下させれば良い。t=τ/2の時点における液温Tの変化量(T-T)が総温度変化量(T-T)の50%以上である場合には、晶析の初期における冷却速度が早すぎて、冷却による急激な過飽和度の上昇によって二次的な結晶核が形成される恐れがあり、5%未満である場合には、晶析の初期における冷却速度が遅すぎて、添加した種晶を結晶核とする結晶が十分に出揃わないままに、急速な冷却が始まる晶析後期を迎えることになり、いずれにしても、微結晶が少ない粒径が揃った結晶を含むマスキットを得ることが困難になる。
 上述した制御冷却法を行うには、液温Tを式[2]で表される時間tの関数として変化させる必要があり、設定したプログラムで液温を制御することのできる装置や晶析缶が必須であるが、擬似制御冷却法によれば、t=τ/2の時点における液温Tの変化量(T-T)が総温度変化量(T-T)の5%以上50%未満、望ましくは、10%以上30%未満となるように液温Tを時間tに対して連続的又は段階的に低下させれば良いので、擬似制御冷却法には、液温を精密に制御する設備がない場合であっても、比較的容易に実行することができるという利点がある。
<結晶化度>
 本明細書でいう「トレハロース二含水結晶についての結晶化度」とは、下記式[3]によって定義される数値を意味する。
式[3]:
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 式[3]において、解析値H100、H、Hsを求める基礎となる粉末X線回折プロフィルは、通常、反射式又は透過式の光学系を備えた粉末X線回折装置により測定することができる。粉末X線回折プロフィルは被験試料又は標準試料に含まれるトレハロース二含水結晶についての回折角及び回折強度を含み、斯かる粉末X線回折プロフィルから結晶化度についての解析値を決定する方法としては、例えば、ハーマンス法、フォンク法などが挙げられる。これら解析方法のうち、ハーマンス法を用いるのが簡便さと精度の点で好適である。今日、これらの解析方法は、いずれもコンピューターソフトウェア化されていることから、斯かるコンピューターソフトウェアのいずれかが搭載された解析装置を備えた粉末X線回折装置を用いるのが好都合である。
 また、解析値H100を求める「実質的にトレハロース二含水結晶からなるトレハロース二含水結晶含有粉末標準試料」としては、トレハロースについての純度が99.9質量%以上(以下、特にことわらない限り、本明細書では質量%を「%」と略記する。ただし、本明細書でいう結晶化度に付された%はこの限りではない。)である粉末又は単結晶であって、粉末X線回折パターンにおいて、トレハロース二含水結晶に特有な回折ピークを示し、実質的にトレハロース二含水結晶からなるものを用いる。斯かる粉末又は単結晶としては、本出願人が分析用の試薬として販売しているトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハロース 999』、コード番号:TH224、トレハロース純度99.9%以上、株式会社林原販売)、又はこれを再結晶化して得られるトレハロース二含水結晶含有粉末又はトレハロース二含水結晶の単結晶が挙げられる。因みに、実質的にトレハロース二含水結晶からなる上記トレハロース二含水結晶含有粉末標準試料の粉末X線回折プロフィルを、ハーマンス法によるコンピューターソフトウェアにて解析した場合の解析値H100は、通常、50.6乃至50.9%程度となる。
 一方、解析値Hを求める「実質的に無定形部分からなるトレハロース含有粉末標準試料」としては、トレハロースについての純度が99.9%以上であり、実質的に無定形部分からなるものを用いる。斯かる粉末としては、例えば、上記した解析値H100を求める標準試料を適量の精製水に溶解し、濃縮した後、凍結乾燥し、さらに、カールフィッシャー法により決定される水分含量が2.0%以下となるまで真空乾燥することにより得られた粉末が挙げられる。斯かる処理を施した場合に、実質的に無定形部分からなる粉末が得られることは、経験上知られている。但し、一般に、実質的に無定形部分からなる粉末であっても、粉末X線回折装置にかけ、得られる粉末X線回折プロフィルをハーマンス法、フォンク法などで解析すると、それら各解析法を実行するコンピューターソフトウェアのアルゴリズムに起因して無定形部分に由来する散乱光の一部が演算され、解析値が必ずしも0%になるとはかぎらない。因みに、実質的に無定形部分からなる上記トレハロース含有粉末標準試料の粉末X線回折プロフィルを、ハーマンス法によるコンピューターソフトウェアにて解析した場合の解析値Hは、通常、8.5乃至8.7%程度となる。
<平均結晶子径>
 一般に、結晶含有粉末における1個の粉末粒子は複数の単結晶、すなわち、複数の結晶子により構成されると考えられている。結晶含有粉末における結晶子の大きさ(結晶子径)は結晶含有粉末の特性に反映されると考えられる。本明細書でいう「トレハロース二含水結晶についての平均結晶子径」(以下、単に「平均結晶子径」という。)とは、トレハロース二含水結晶含有粉末を粉末X線回折分析に供し、得られた粉末X線回折パターンにおいて検出される回折ピークの内、5個の回折ピーク、すなわち、結晶子の不均一歪に起因する回折ピーク幅への影響が少ないとされる比較的低角の領域で、他の回折ピークとよく分離した、回折角(2θ)13.7°(ミラー指数(hkl):101)、17.5°(ミラー指数:220)、21.1°(ミラー指数:221)、23.9°(ミラー指数:231)及び25.9°(ミラー指数:150)の回折ピーク(図1の符号a乃至eを参照)を選択し、それぞれの半値幅と回折角とを用い、標準品としてケイ素(米国国立標準技術研究所(NIST)、X線回折用標準試料(『Si640d』)を用いた場合の測定値に基づき補正した後、下記式[4]に示す「シェラー(Scherrer)の式」によりそれぞれ算出された結晶子径の平均値を意味する。
式[4]:
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 一般的な粉末X線回折装置には、斯かる結晶子径算出用のコンピューターソフトウェアが搭載されていることから、トレハロース二含水結晶含有粉末さえ入手できれば、当該結晶含有粉末におけるトレハロース二含水結晶の平均結晶子径は比較的容易に測定することができる。なお、被験試料は、粉末X線回折分析に先立ち、被験試料を乳鉢によりすり潰した後、53μmの篩によりふるい分け、篩を通過した粉末を用いる。
<還元力>
 本明細書でいう「粉末全体の還元力」とは、D-グルコースを標準物質として用い、斯界において汎用されるソモジ-ネルソン法及びアンスロン硫酸法によりそれぞれD-グルコース換算に基づく還元糖量及び全糖量を求め、粉末に含まれる全糖量に対する還元糖量の百分率(%)を、下記式[5]を用いて計算することにより求めることができる。
式[5]:
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
<粒度分布>
 本明細書において、粉末の粒度分布は以下のようにして決定する。すなわち、日本工業規格(JIS Z 8801-1)に準拠する、目開きが425、300、212、150、106、75及び53μmの金属製網ふるい(株式会社飯田製作所製)を正確に秤量した後、この順序で重ね合わせてロータップふるい振盪機(株式会社田中化学機械製造所製、商品名『R-1』)へ装着し、次いで、秤取した一定量の試料を最上段のふるい(目開き425μm)上に載置し、ふるいを重ね合わせた状態で15分間振盪した後、各ふるいを再度正確に秤量し、その質量から試料を載置する前の質量を減じることによって、各ふるいによって捕集された粉末の質量を求める。その後、ふるい上に載置した試料の質量に対する、各ふるいによって捕集された各粒度を有する粉末の質量の百分率(%)を計算し、粒度分布として表す。
2.本発明のトレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法
 本発明の製造方法は、基本的に以下の(1)乃至(6)の工程を含んでいる:
(1)液化澱粉溶液に、アルスロバクター属に属する微生物由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素とアルスロバクター属微生物由来のトレハロース遊離酵素を、澱粉枝切酵素、及び、パエニバチルス属微生物由来の天然型若しくは組換え型CGTase又はそれらの変異体酵素とともに作用させてトレハロースを生成させるトレハロース生成工程;
(2)トレハロース生成工程により得られたトレハロースを含有する反応液にグルコアミラーゼを作用させるグルコアミラーゼ処理工程;
(3)トレハロースを含有する反応液を濾過、脱色、脱塩、濃縮する精製濃縮工程;
(4)トレハロースを含有する濃縮液にトレハロース二含水結晶の種晶を含有せしめ、トレハロース二含水結晶を晶析する工程;
(5)晶析工程において得られたマスキットから遠心分離によりトレハロース二含水結晶を採取する工程;
(6)採取したトレハロース二含水結晶を熟成、乾燥し、必要に応じて粉砕する工程。
 以下、上記(1)乃至(6)の工程について順次説明する。
<(1)の工程(トレハロース生成工程)>
 当該工程は、原料である液化澱粉に、アルスロバクター属微生物由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素と、同じくアルスロバクター属微生物由来のトレハロース遊離酵素を、澱粉枝切酵素、及び、パエニバチルス属微生物由来の天然型若しくは組換え型CGTase又はそれらの変異体酵素とともに作用させてトレハロースを生成させる工程である。
 α-グリコシルトレハロース生成酵素は、液化澱粉に作用して分子の末端にトレハロース構造を有するα-グリコシルトレハロースを生成する酵素であり、一方、トレハロース遊離酵素はα-グリコシルトレハロースに作用してトレハロースを遊離する酵素である。したがって、澱粉を糊化・液化して得られる液化澱粉に、澱粉枝切酵素を併用しつつα-グリコシルトレハロース生成酵素とトレハロース遊離酵素を作用させれば、トレハロースを効率よく製造することができる。
 トレハロースの製造に用いる原料澱粉は、トウモロコシ澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉であっても、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉であってもよく、また、これら澱粉を酸又はアミラーゼで部分分解して得られる澱粉部分分解物であってもよい。原料澱粉は、通常、水に懸濁して濃度約10乃至50%の澱粉乳とし、耐熱性α-アミラーゼの存在下で加熱することにより糊化・液化される。液化澱粉の液化の程度はデキストロース・エクイバレント(DE)として、通常、10未満、詳細には、5未満に調整する。
 アルスロバクター属微生物由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素及びアルスロバクター属微生物由来のトレハロース遊離酵素としては、例えば、特開平7-143876号公報、特許文献2乃至4などに開示されたものが利用できる。また、本出願人による特開平7-322880号公報、特開平7-322883号公報、特開平7-298887号公報、特開平7-298880号公報、特許文献4などに開示された組換え型のα-グリコシルトレハロース生成酵素及びトレハロース遊離酵素であってもよく、さらにはこれら酵素に部位特異的変異などを導入して改良した変異体酵素であってもよい。とりわけ、特許文献4に開示されたアルスロバクター・スピーシーズ(Arthrobacter sp.) S34(FERM BP-6450)又はその酵素高産生変異株由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素及びトレハロース遊離酵素が好適に用いられる。
 本発明の製造方法においては、澱粉枝切酵素として、斯界で汎用されているイソアミラーゼ又はプルラナーゼを用いることができる。市販の酵素剤を用いても、微生物から単離したものを用いてもよい。イソアミラーゼとしては、例えば、シュードモナス・アミロデラモサ(Pseudomonas amyloderamosa)由来及びマイロイデス・オドラタス(Myroides odoratus)由来のものがよく知られており、とりわけ、シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼ剤(株式会社林原製)が好適である。プルラナーゼ剤としては、例えば、クレブシェラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)由来のプルラナーゼ(株式会社林原販売)、バチルス・アミロプルリティカス(Bacillus amylopullulyticus)由来のプルラナーゼ(商品名『プロモザイム』、ノボザイムズ・ジャパン株式会社販売)などが挙げられる。
 上記トレハロース生成工程におけるCGTaseの役割は、主としてα-グリコシルトレハロース生成酵素及びトレハロース遊離酵素によるトレハロース生成反応の過程で必然的に生成するグルコース重合度4以下のマルトオリゴ糖を、CGTaseが触媒する不均化反応(直鎖糖分子間転移反応、Disproportionation)によって、グルコース重合度5以上のマルトオリゴ糖に変換することにより、上記トレハロース生成反応をさらに進行させて、反応液中のトレハロース含量をより高めることにある。
 なお、CGTaseは、従来より種々の微生物から単離されており、その作用、理化学的性質などが明らかにされている(『工業用糖質酵素ハンドブック』、講談社サイエンティフィク社編集、講談社発行、28乃至32頁(1999年)などを参照)。また、上記CGTaseの内のいくつかについてはその遺伝子がクローニングされ、遺伝子の塩基配列からアミノ酸配列が決定されており、そのCGTaseのアミノ酸配列上にはα-アミラーゼファミリーに分類される酵素群に共通して存在するとされる4つの保存領域が存在することも知られている。さらに、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のCGTase蛋白については、X線結晶構造解析によってその立体構造が既に明らかにされており、当該CGTaseの3つの触媒残基、すなわち、配列表における配列番号4で示されるアミノ酸配列における225番目のアスパラギン酸残基(D225)、253番目のグルタミン酸残基(E253)、324番目のアスパラギン酸残基(D324)も判明している(『工業用糖質酵素ハンドブック』、講談社サイエンティフィク社編集、講談社発行、56乃至63頁(1999年)参照)。
 本発明の製造方法においては、CGTaseとして、パエニバチルス属微生物由来の天然型若しくは組換え型CGTase又はそれらの変異体酵素が好適に用いられる。本発明でいう「パエニバチルス属微生物由来の天然型CGTase」としては、例えば、パエニバチルス・イリノイセンシス、パエニバチルス・パブリ、パエニバチルス・アミロリティカスなどの公知菌株に由来するCGTaseや、自然界から単離したパエニバチルス属微生物に由来するCGTaseが使用できる。より具体的には、パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15959株、パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株、パエニバチルス・パブリ NBRC13638株、及び、パエニバチルス・アミロリティカス NBRC15957株にそれぞれ由来するCGTaseや、これらパエニバチルス属微生物に対し、斯界において慣用される、例えば、紫外線照射、化学物質による変異処理などにより突然変異を導入することにより取得した酵素高産生変異株由来のCGTaseがより好適に利用できる。さらに、パエニバチルス属微生物由来のCGTaseとしては、例えば、パエニバチルス・エスピー(Paenibacillus sp.)由来CGTase(商品名『アルカリCDアミラーゼ』、ナガセケムテックス株式会社製)も使用することができる。因みに、食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末の製造において従来から用いられているCGTaseは、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来のCGTaseである。
 また、本発明の製造方法において、CGTaseとしては、下記(a)乃至(d)に示す部分アミノ酸配列を有するCGTaseが好適に用いられる。
(a)Gly-Ser-X-Ala-Ser-Asp;
(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn;
(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys;
(d)Val-Asn-Ser-Asn-X-Tyr;
(但し、XはAla又はSerを、XはAla又はThrをそれぞれ意味する。)
 上記部分アミノ酸配列は、パエニバチルス属微生物由来CGTaseに特有の特徴的なアミノ酸配列である。
 また、本発明でいう「パエニバチルス属微生物由来の組換え型CGTase」としては、上記パエニバチルス属微生物のCGTase遺伝子をクローニングし、例えば、大腸菌、枯草菌など適宜の宿主微生物で発現させることにより得られる組換え型CGTaseを好適に用いることができる。なお、前述したパエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株、パエニバチルス・パブリ NBRC13638株、又は、パエニバチルス・アミロリティカス NBRC15957株にそれぞれ由来するCGTaseは、出願人が独自にこれら微生物からCGTase遺伝子をクローニングし、遺伝子の塩基配列を決定したところ、配列表における配列番号1、2又は3でそれぞれ示されるアミノ酸配列を有していることが判明した。すなわち、配列表における配列番号1、2又は3で示されるアミノ酸配列を有する組換え型CGTaseは、本発明の製造方法においてパエニバチルス属微生物由来の天然型CGTaseと同様に用いることができる。
 本発明でいう「パエニバチルス属微生物由来CGTaseの変異体酵素」(以下、「変異体CGTase」と略称する。)としては、上記パエニバチルス属微生物由来CGTaseをコードする遺伝子に遺伝子工学的手法を適用して、CGTaseとしての基質特異性や酵素活性を実質的に変更しない範囲でアミノ酸配列上1個又は2個以上のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入変異を導入した変異体CGTaseを好適に用いることができる。変異体CGTaseのアミノ酸配列において欠失、置換又は挿入させることのできるアミノ酸残基の個数は、CGTaseとしての基質特異性や酵素活性が実質的に保持される限り特に限定されないものの、約680個のアミノ酸残基で構成されるCGTaseのアミノ酸配列の5%未満、すなわち、アミノ酸残基数で30個程度までとするのが好ましく、望ましくは、1個以上20個未満、より望ましくは、1個以上10個未満とするのが好ましい。また、アミノ酸配列上の変異導入箇所についても、CGTaseとしての基質特異性や酵素活性が実質的に保持される限り、特に限定されないものの、CGTaseのアミノ酸配列上に存在する、α-アミラーゼファミリーに分類される酵素群に共通して保存される4つの領域や、パエニバチルス属微生物由来CGTaseに特有の、前述した(a)乃至(d)の部分アミノ酸配列への変異導入は避けるのが望ましい。
 本発明の製造方法において好適に用いることのできる、「パエニバチルス属微生物由来の天然型若しくは組換え型CGTase又はそれらの変異体酵素」のさらに具体的な例としては、上述した配列表における配列番号1、2又は3でそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するCGTaseや、実施例において後述したパエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株のCGTase遺伝子に部位特異的変異を導入することにより作製した、配列表における配列番号12又は13で示されるアミノ酸配列を有する変異体CGTaseが挙げられる。
 本発明の製造方法においては、好適には、原料である液化澱粉(pH約4乃至10)を基質とし、これに上述したアルスロバクター属微生物由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素を基質固形物1グラム当たり0.5乃至10単位、同じく上述したアルスロバクター属微生物由来のトレハロース遊離酵素を2.5乃至25単位、さらに、澱粉枝切酵素を50乃至1,000単位、及び、上述したパエニバチルス属微生物由来のCGTaseを0.5乃至50単位添加し、使用した酵素が失活しない温度範囲、通常、30乃至60℃で10乃至100時間反応させる。反応終了時の反応液のトレハロース含量は、通常、無水物換算で、86%前後となる。
<(2)の工程(グルコアミラーゼ処理工程)>
 この工程は、(1)のトレハロース生成工程で得られた反応液に、さらにグルコアミラーゼ剤を作用させ、無水物換算でのトレハロース含量を高める工程である。すなわち、トレハロース生成工程により得られる反応液には、トレハロースとともに、D-グルコース、マルトース、グルコース重合度3以上のマルトオリゴ糖、α-グルコシルトレハロース、及びα-マルトシルトレハロースなどの糖質が含まれているので、この反応液にグルコアミラーゼを作用させることにより、マルトースとグルコース重合度3以上のマルトオリゴ糖をD-グルコースにまで分解するとともに、α-グルコシルトレハロースやα-マルトシルトレハロースなどのα-グリコシルトレハロースをD-グルコースとトレハロースにまで分解することによって、反応液中のトレハロース純度、つまりは無水物換算でのトレハロース含量を高めることができる。
 本発明の製造方法において、用いるグルコアミラーゼとしては、マルトースとグルコース重合度3以上のマルトオリゴ糖をD-グルコースにまで分解でき、また、α-グルコシルトレハロースやα-マルトシルトレハロースなどのα-グリコシルトレハロースをD-グルコースとトレハロースにまで分解できる限り、その起源や由来に特段の制限はない。市販のグルコアミラーゼ剤、例えば、天野エンザイム株式会社販売、商品名『グルクザイムAF6』や、ナガセケムテックス株式会社販売、商品名『グルコチーム』などを好適に用いることができる。
 なお、グルコアミラーゼ処理後の反応液、すなわちトレハロース含有糖液中のトレハロース含量は、通常、無水物換算で86.0%を超え、好ましくは87.0%以上となる。因みに、パエニバチルス属微生物由来のCGTaseではなく、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来CGTaseを用いる場合には、グルコアミラーゼ処理後のトレハロース含有糖液中のトレハロース含量は無水物換算で86.0%未満に止まり、86.0%以上となることはない。
<(3)の工程(精製濃縮工程)>
 この工程は、グルコアミラーゼ処理を終えて無水物換算でのトレハロース含量が高められたトレハロース含有糖液に、常法により、濾過、遠心分離などを施して不溶物を除去し、活性炭で脱色し、カチオン交換樹脂(H型)、アニオン交換樹脂(OH型)にて脱塩するとともに、晶析に適した濃度まで濃縮する工程である。反応液中の無水物換算でのトレハロース含量は、(2)のグルコアミラーゼ処理工程によって既に86.0%以上にまで高められているので、(3)の精製濃縮工程においては、カラムクロマトグラフィーによる分画工程などのトレハロース含量をさらに高める工程は不要である。
<(4)の工程(晶析工程)>
 この工程は、上記(1)乃至(3)の工程を経て得られたトレハロース含有糖液から、トレハロース二含水結晶の種晶の存在下、トレハロース二含水結晶を晶析させる工程である。すなわち、無水物換算でのトレハロース含量が所定のレベルにまで高められた糖液を、通常、トレハロースについての過飽和度を1.05乃至1.50の範囲になるように調節した後、言い換えれば、トレハロース濃度を約60乃至85%、液温を約40乃至80℃に調節した後、助晶缶に移し、次いで、トレハロース二含水結晶の種晶を助晶缶中の濃縮糖液体積に対して、通常、0.1乃至5%(w/v)、詳細には、0.5乃至2%(w/v)含有せしめ、緩やかに撹拌しつつ、3乃至48時間かけて液温を5乃至60℃まで自然冷却することによりトレハロース二含水結晶の晶析を促す。なお、助晶缶内等に既にトレハロース二含水結晶の種晶が存在する場合には、トレハロース二含水結晶の種晶は特段添加する必要はない。作業効率の点で、濃縮液からのトレハロース二含水結晶の晶析は、通常、種晶の存在下で行われる。
 晶析工程においては、上記の自然冷却法に代えて、制御冷却法又は擬似制御冷却法を用いることも有利に実施できる。晶析を制御冷却法又は擬似制御冷却法によって行う場合には、上記(3)の工程を経て所定の温度に調整したトレハロース含有糖液を、助晶缶に移し、次いで、トレハロース二含水結晶の種晶を助晶缶中の濃縮糖液体積に対して、通常、0.1乃至5%(w/v)、詳細には、0.5乃至2%(w/v)含有せしめ、緩やかに撹拌しつつ、冷却を制御することによって、晶析工程の初期は液温をゆるやかに低下させ、冷却工程の後期においては液温を急速に低下させ助晶する。晶析に要する時間はトレハロース二含水結晶の種晶の添加量によっても異なるものの、例えば、擬似制御冷却法による場合には、全冷却時間を少なくとも2つ、好ましくは3つ以上の区間に分け、各区間内では時間に対して温度を概ね直線的に低下させ、作業時間t=τ/2の時点(晶析工程の中間点)における液温Tの変化量(T-T)が、総温度変化量(T-T)の5%以上50%未満、望ましくは、10%以上30%未満の範囲を維持するように液温Tを時間tに対して連続的又は段階的に低下させるのが良い。例えば、10時間かけて液温を60℃から20℃まで冷却して結晶を晶析させる場合には、冷却時間を6時間と4時間の2つの区間に分け、液温を60℃から50℃まで6時間かけて冷却し、次いで、50℃から20℃まで4時間かけて冷却するか、又は、冷却時間を7時間と3時間の2つの区間に分け、液温を60℃から45℃まで7時間かけて冷却し、次いで、45℃から20℃まで3時間かけて冷却するのが好ましく、さらに好ましくは、冷却時間を4時間、3時間、3時間の3つの区間に分け、最初の区間では4時間かけて液温を60℃から55℃まで冷却し、次の区間では3時間かけて55℃から50℃まで冷却し、さらに、最後の区間では3時間かけて液温を50℃から20℃まで冷却するのが好ましい。
 このように、制御冷却法又は擬似制御冷却法による場合には、温度制御を行うことなく自然冷却する晶析法に比べ、トレハロース二含水結晶の微結晶が生じ難く、粒径の揃った結晶を含むマスキットを得ることができ、また結果として、自然冷却法による場合よりも、得られるトレハロース二含水結晶含有粉末の対澱粉収率をより高めることができる。また、後述するとおり、得られるトレハロース二含水結晶粉末は、自然冷却法で得られる粉末に比べ、トレハロース純度、及び固結性の重要な指標となるトレハロース二含水結晶についての結晶化度の点でも高いという特徴を備えている。また、制御冷却法又は擬似制御冷却法による場合には、自然冷却する晶析法によって得られる粉末に比べて、より粒度分布の揃った粉末が得られるという利点がある。
<(5)の工程(採取工程)>
 この工程は、(4)の晶析工程で得られたマスキットから、常法の分蜜方式に従い、トレハロース二含水結晶を遠心分離により採取する工程である。採取されたトレハロース二含水結晶は、表面に付着している非晶質の蜜を除去するため、少量の精製水をスプレー(シャワー)して洗浄される。なお、結晶の洗浄に用いる精製水の量は、通常、遠心分離前のマスキットの重量に対して、3%以上、10%までとするのが好ましい。すなわち、洗浄に用いられる精製水の量が3%未満では、洗浄が十分に行われず、非晶質の蜜が残り、所期のトレハロース純度が得られない恐れがある。一方、洗浄に用いられる精製水の量が10%を超えると、洗浄によって溶解、除去されるトレハロース二含水結晶の量が増し、対澱粉収率が低下する恐れがある。
<(6)の工程(熟成、乾燥工程)>
 この工程は、採取されたトレハロース二含水結晶を、所定の温度及び湿度雰囲気中に一定時間保持し、結晶を熟成させるとともに熱風乾燥して、トレハロース二含水結晶含有粉末を得る工程である。熟成及び乾燥工程における結晶の品温や雰囲気の相対湿度、並びに保持時間は、所期の粉末が得られる限り、特段の制限はないが、熟成、乾燥工程において、結晶はその品温が20乃至55℃、雰囲気の相対湿度は60乃至90%に保たれるのが好ましく、熟成、乾燥時間は約5乃至24時間とするのが好ましい。熟成、乾燥工程を経た粉末は、次いで、室温まで自然放冷される。また、室温程度の清浄な空気を吹き付けて室温程度の品温にまで強制冷却することも有利に実施できる。得られた結晶粉末はそのまま、若しくは、必要に応じて粉砕して製品とされる。
 本発明のトレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法によれば、酵素反応によって無水物換算で86.0%超という高いトレハロース含量のトレハロース含有糖液を得ることができるので、カラムクロマトグラフィーによる分画工程が不要であり、分画によるトレハロースのロスがなく、トレハロース二含水結晶含有粉末を高い対澱粉収率で得ることができる。また、晶析した結晶を含むマスキット全体を晶析、固化又は噴霧乾燥する全糖方式ではなく、晶析した結晶を遠心分離して不純物を含む蜜を除去する分蜜方式を採用しているので、得られるトレハロース二含水結晶含有粉末中のトレハロース含量を容易に98.0%以上に高め、高純度のトレハロース二含水結晶含有粉末を製造することができる。
 斯くして製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末は、晶析が自然冷却によって行われた場合には、保存時の固結性などの物性において、従来の食品級のトレハロース含有粉末とほぼ同等の粉末であり、通常、粒径53μm以上425μm未満の粒子が粉末全体の70%以上を占め、且つ、粒径53μm以上300μm未満の粒子を粉末全体の50%以上含むトレハロース二含水結晶含有粉末である。また、晶析が制御冷却法又は擬似制御冷却法によって行われた場合には、本発明の製造方法によって製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末は、従来の食品級のトレハロース含有粉末よりも有意に固結し難い粉末であり、通常、粒径53μm以上425μm未満の粒子が粉末全体の80%以上を占め、且つ、粒径53μm以上300μm未満の粒子を粉末全体の60%以上含むトレハロース二含水結晶含有粉末である。また、本発明の製造方法によって製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末は、通常、前記式[5]で求められる粉末全体の還元力が0.5%以下であり、食品や医薬品等に配合しても、褐変による変色の恐れがない優れた粉末である。
 したがって、本発明の製造方法によって製造される粉末は、そのままで、或いは粒度を適宜調整して、粉末状の食品素材、化粧品素材、医薬部外品素材、又は医薬品素材などとして使用することができる。特に、晶析に際して制御冷却法を適用する本発明の製造方法によって製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末は、上述したとおり、従来の食品級のトレハロース含有粉末よりも有意に固結し難い粉末であり、従来未知の全く新規なトレハロース二含水結晶含有粉末であると言える。当該粉末は、粉末原料を取り扱うことを前提に設計された製造プラントを用いる食品製造、化粧品製造、医薬部外品製造、さらには医薬品製造の各分野において、他の単独若しくは複数の粉末状の食品素材、化粧品素材、医薬部外品素材、医薬品素材などに安心して含有せしめることができるという優れた利点を備えている。
 以下、本発明のトレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法について、実験により具体的に説明する。
<実験1:CGTaseの由来が酵素反応液におけるトレハロース含量に及ぼす影響>
 液化澱粉に、アルスロバクター属微生物由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素と、同じくアルスロバクター属微生物由来のトレハロース遊離酵素を、澱粉枝切酵素及びCGTaseとともに作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させる酵素反応によってトレハロースを生成させる酵素反応系において、使用するCGTaseの由来が、酵素反応で得られる糖液中のトレハロース含量にどのような影響を及ぼすかを調べるべく、以下の実験を行った。
<実験1-1:アルスロバクター属微生物由来α-グリコシルトレハロース生成酵素及びトレハロース遊離酵素を含有する酵素液の調製>
 特許文献4(特開2000-228980号公報)の実施例2-1に記載された方法により、アルスロバクター・スピーシーズ(Arthrobacter sp.) S34株(FERM BP-6450)を培養し、培養液約20Lを得た。この培養液20Lに対して2グラムのリゾチーム(商品名『卵白リゾチーム』、ナガセケムテックス株式会社製)を加えた後、37℃にて260rpmの速度で24時間攪拌することにより培養液中の菌体を溶菌させた。この溶菌処理液を遠心分離して上清を回収し、菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を常法により硫安塩析し、生じた塩析物を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に対して透析し、透析液を『セパビーズ FP DA13』ゲル(三菱化学株式会社製)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供して酵素画分を回収した。回収した画分は約15,600単位のトレハロース遊離酵素と約3,100単位のα-グリコシルトレハロース生成酵素を含む部分精製酵素標品であった。なお、α-グリコシルトレハロース生成酵素とトレハロース遊離酵素の活性は上記特許文献4(特開2000-228980号公報)に開示された方法に準じて測定した。
<実験1-2:各種微生物由来CGTase>
 各種微生物由来のCGTaseとして、以下のCGTaseを用いた。すなわち、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来のCGTaseとしては、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス Tc-91株(FERM BP-11273)由来のCGTase(株式会社林原製)を、バチルス・マセランス(Bacillus macerans)由来のCGTaseとしては、市販のCGTase(商品名『コンチザイム』、天野エンザイム株式会社販売)を、サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)由来のCGTaseとしては、市販のCGTase(商品名『トルザイム』、ノボザイムズ・ジャパン株式会社販売)を用いた。
 また、パエニバチルス属微生物由来のCGTaseとして、以下のCGTaseを調製した。すなわち、パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15959株、パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株、パエニバチルス・パブリ NBRC13638株、及び、パエニバチルス・アミロリティカス NBRC15957株をそれぞれ、デキストリン2%、塩化アンモニウム0.5%、リン酸水素カリウム0.05%、硫酸マグネシウム0.025%及び炭酸カルシウム0.5%を含む液体培地で27℃、3日間培養し、培養液を遠心分離して得たそれぞれの遠心上清を常法に従い硫安塩析、透析することにより各微生物由来のCGTaseの粗酵素液を得た。得られたCGTase粗酵素液を、それぞれDEAE-トヨパール 650Sゲル(東ソー株式会社製)を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及びブチル-トヨパール 650Mゲル(東ソー株式会社製)を用いた疎水カラムクロマトグラフィーに供して精製し、部分精製CGTaseをそれぞれ調製した。なお、各菌株由来のCGTaseの活性は、前記した方法に従い測定し、式[1]を用いて算出した。
<実験1-3:トレハロース生成反応>
 トウモロコシ澱粉を濃度30%となるように水に懸濁し、この懸濁液に炭酸カルシウムを0.1%加えた。当該懸濁液のpHを6.0に調整した後、澱粉固形物当たり0.2%の耐熱性α-アミラーゼ剤(商品名『ターマミル60L』、ノボザイムズ・ジャパン株式会社販売)を加え、95℃で15分間反応させて澱粉を糊化・液化した。得られた液化澱粉溶液を120℃で30分間オートクレーブした後、51℃に冷却し、pH5.7に調整した後、同温度で維持しつつ、澱粉固形物1グラム当たり、2単位のα-グリコシルトレハロース生成酵素、10単位のトレハロース遊離酵素、300単位のイソアミラーゼ剤(株式会社林原製)、及び、実験1-2に記載したCGTase又は実験1-2で調製したCGTaseのいずれかを2単位加え、64時間反応させた。得られた反応物を97℃で30分間加熱してそれぞれ酵素を失活させた後、pH4.5に調整し、澱粉固形物1グラム当たり10単位のグルコアミラーゼ剤(商品名『グルコチーム#20000』、ナガセケムテックス株式会社製)を加えて24時間反応させた。斯くして得た反応液を95℃で10分間加熱して酵素を失活させ、以下に記す反応液中のトレハロース含量の測定に供した。なお、CGTaseを添加しない以外は同一条件で酵素反応を行って得た反応液を対照とした。
<実験1-4:反応液中のトレハロース含量の測定>
 実験1-3で得た反応液をそれぞれ表1に示す反応液1乃至8とし、トレハロース含量を以下のようにして求めた。すなわち、反応液1乃至8をそれぞれ精製水により1%溶液とし、0.45μmメンブランフィルターにより濾過した後、下記条件によるHPLC分析に供し、示差屈折計によるクロマトグラムに出現したピークの面積から反応液のトレハロース含量を計算し、無水物換算した。結果を表1に示す。なお、表1に示す反応液中のトレハロース含量は、各CGTaseについて同一の条件でトレハロース生成反応及びグルコアミラーゼ処理を5回繰り返した場合にも、若干のばらつきの範囲内で再現性よく得られる値である。
・分析条件
   HPLC装置:『LC-10AD』(株式会社島津製作所製)
   デガッサー:『DGU-12AM』(株式会社島津製作所製)
   カラム:『MCI GEL CK04SS』(三菱化学株式会社製)
   サンプル注入量:20μl
   溶離液:精製水
   流 速:0.4ml/分
   温 度:85℃
   示差屈折計:『RID-10A』(株式会社島津製作所製)
   データ処理装置:『クロマトパックC-R7A』(株式会社島津製作所製)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 表1に示すとおり、従来からトレハロースの生成に用いられているジオバチルス・ステアロサーモフィラス Tc-91株由来のCGTaseを用いた場合(反応液2)には、グルコアミラーゼ処理後のトレハロース含量は84.7%にとどまり、バチルス・マセランス由来のCGTaseを用いた場合(反応液3)には、トレハロース含量は85.1%に高まったものの、その増加量は僅かであった。また、サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス由来のCGTaseを用いた場合(反応液4)には、トレハロース含量は83.4%となり、従来からトレハロースの生成に用いられているジオバチルス・ステアロサーモフィラス Tc-91株由来のCGTaseを用いた場合(反応液2)よりも低下した。
 これに対し、パエニバチルス属に属する微生物由来のCGTaseを用いた場合(反応液5乃至8)には、いずれも、グルコアミラーゼ処理後のトレハロース含量は無水物換算で86.0%を上回り、従来からトレハロースの生成に用いられているジオバチルス・ステアロサーモフィラス Tc-91株由来のCGTaseを用いた場合(反応液2)よりも有意に増加した。特に、CGTaseとして、パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15959株由来(反応液5)、パエニバチルス・イリノイセンシスNBRC15379株由来(反応液6)、及びパエニバチルス・パブリ NBRC13638株由来(反応液7)の各CGTaseを用いた場合には、トレハロース含量は87.0%を超え、トレハロース含量が高いトレハロース含有糖液が酵素反応によって得られることが判明した。また、今回の実験を行った中では、CGTaseとして、パエニバチルス・イリノイセンシス由来のCGTaseを用いた場合に、最も高いトレハロース含量が得られ、パエニバチルス・イリノイセンシス由来のCGTaseが最も好ましいことが判明した。
<実験2:トレハロース含量が異なる各糖液から製造したトレハロース二含水結晶含有粉末のトレハロース純度、対澱粉収率、及び物性>
<実験2-1:被験試料の調製>
<被験試料1乃至8>
 実験1で得たトレハロース含量が異なる反応液1乃至8のそれぞれを、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製し、固形物濃度約60%まで濃縮して、反応液1乃至8のそれぞれに対応して、トレハロース含有糖液1乃至8(トレハロースを無水物換算で82.8乃至87.6%含有)を得た。
 上記トレハロース含有糖液1乃至8を、それぞれ減圧下で固形物濃度約85%にまで濃縮し、助晶缶にとり、各糖液の容量に対して約1%(w/v)のトレハロース二含水結晶を種晶として加えて攪拌しつつ60℃から20℃まで約10時間かけて自然冷却することにより助晶し、トレハロース二含水結晶を晶析させたマスキットを調製した。前記マスキットから、常法により、バスケット型遠心分離機によりトレハロース二含水結晶を採取し、採取したトレハロース二含水結晶をマスキット重量に対し8%の脱イオン水を用いて洗浄し、40℃で8時間、熟成、乾燥させた後、25℃の清浄な空気を30分間吹き付けて強制冷却し、粉砕することにより、トレハロース二含水結晶含有粉末とした。トレハロース含有糖液1乃至8のそれぞれから得られたトレハロース二含水結晶含有粉末をそれぞれ被験試料1乃至8とした。
<被験試料9>
 被験試料9として、食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハ』、ロット番号:9I131、株式会社林原販売)を用いた。
<実験2-2:被験試料1乃至9のトレハロース純度、対澱粉収率、及び固結性>
<トレハロース純度>
 被験試料1乃至9のトレハロース純度は、実験1-3と同じHPLC法にて求めた。結果は表2に示した。
<対澱粉収率>
 上記で調製した被験試料1乃至8の対澱粉収率は、各被験試料の調製に用いた酵素反応液の質量と原料澱粉の仕込み時の濃度(30%)とから原料澱粉の無水物換算での質量を算出し、この値で得られた被験試料1乃至8の無水物換算での質量を除した後、100を乗じることでパーセント表示した。結果は表2に併せて示した。
<固結性試験>
 被験試料1乃至9の各々について、それぞれの粉末の固結性を調べる目的で、以下の実験を行った。すなわち、被験試料1乃至9を1グラムずつ秤取し、それぞれ別個に内底部が半球状の14ml容蓋つきポリプロピレン製円筒チューブ(ベクトン・ディッキンソン社販売、商品名『ファルコンチューブ2059』、直径1.7cm、高さ10cm)の内部に充填し、チューブを試験管立てに直立させた状態で50℃のインキュベーター(アドバンテック東洋株式会社販売、商品名『CI-410』)の内部に収容し、24時間にわたって静置した後、チューブをインキュベーター外に取り出し、チューブから蓋を外し、チューブを緩慢に転倒させることにより、被験試料を黒色プラスチック製平板上に取り出し、取り出された被験試料の状態を肉眼観察した。
 固結の有無は、被験試料が平板上でもなおチューブ内底部の半球状を明らかに保っている場合を「固結あり」(+)、被験試料がチューブ内底部の形状をわずかではあるが識別できる場合を「やや固結あり」(±)、被験試料が崩壊し、チューブ内底部の形状を保っていない場合を「固結なし」(-)と判定した。結果は、表2における「固結性」の欄に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 表2に示すとおり、被験試料1乃至8のトレハロース二含水結晶含有粉末における無水物換算でのトレハロース含量、すなわちトレハロース純度は、いずれも98.0%を超え、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末である被験試料9と同様に、高純度のトレハロース二含水結晶含有粉末であった。しかし、対澱粉収率についてみると、パエニバチルス属の微生物由来のCGTase以外のCGTaseを用いた被験試料2乃至4においては、対澱粉収率は、高々39%にとどまったのに対し、パエニバチルス属の微生物由来のCGTaseを用いた被験試料5乃至8においては、対澱粉収率は41乃至42%となって40%を超え、用いるCGTaseの由来による差異が認められた。また、表1と表2における結果を比較すると、グルコアミラーゼ処理後の酵素反応液中のトレハロース含量が高い酵素反応液から調製されたトレハロース二含水結晶含有粉末ほど、対澱粉収率が高いという傾向が見られ、酵素反応液中のトレハロース含量と対澱粉収率との間には相関関係が認められた。
 これらの結果から、CGTaseとして、パエニバチルス属の微生物由来のCGTaseを用いる場合(被験試料5乃至8)には、グルコアミラーゼ処理後の酵素反応液中のトレハロース含量が86.0%を超え、その結果、トレハロース二含水結晶含有粉末についての対澱粉収率も41%以上に高まるとの知見が得られた。特に、パエニバチルス・イリノイセンシス又はパエニバチルス・パブリ由来のCGTaseを用いる場合(被験試料5乃至7)には、グルコアミラーゼ処理後の酵素反応液中のトレハロース含量が87.0%を超え、トレハロース二含水結晶含有粉末についての対澱粉収率はさらに42%に高まることが判明した。なお、パエニバチルス属の微生物由来のCGTaseを用いた場合の対澱粉収率(被験試料5乃至8の対澱粉収率)の向上は、従来から用いられているジオバチルス・ステアロサーモフィラス Tc-91株由来のCGTaseを用いた場合(被験試料2)に比べて3乃至4%であるが、トレハロース二含水結晶含有粉末の工業的製造において、対澱粉収率が3乃至4%も向上することは、極めて画期的なことであるといえる。
 一方、粉末としての取り扱い上の重要な物性である固結性に関しては、CGTaseを用いないトレハロース含有糖液1から製造された被験試料1、及び、CGTaseとして、サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス由来のCGTaseを用いて製造された被験試料4は、上記固結性試験において「固結あり(+)」と判定されたのに対し、その他のCGTaseを用いて製造された被験試料2、3、5乃至8は、従来から市販されている食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末(被験試料9)と同様に、上記固結性試験において「やや固結あり」(±)と判定されるに止まった。この結果は、パエニバチルス属の微生物由来のCGTaseを用いる本発明の製造方法によって製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末(被験試料5乃至8)は、従来から市販されている食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末(被験試料9)と比べて固結性において遜色のない粉末であり、粉末状の食品素材、化粧品素材、医薬部外品素材、又は医薬品素材として、従来から市販されている食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末と同様に使用することができる粉末であることを示している。
<実験3:晶析時の擬似制御冷却がトレハロース二含水結晶含有粉末のトレハロース純度、対澱粉収率、及び固結性に及ぼす影響>
 本実験では、実験2-1で調製されたトレハロース含有糖液1乃至8からトレハロース二含水結晶を晶析させるに際し、擬似制御冷却法を適用してトレハロース二含水結晶含有粉末を調製した場合の、粉末のトレハロース純度、対澱粉収率、及び固結性に及ぼす影響を検討した。
<実験3-1:被験試料の調製>
 実験2-1で調製した無水物換算でのトレハロース含量が異なるトレハロース含有糖液1乃至8のそれぞれを、減圧下で固形物濃度約85%にまで濃縮し、助晶缶にとり、糖液の容量に対して約1%(w/v)のトレハロース二含水結晶を種晶として加えて攪拌しつつ、60℃から20℃まで約10時間かけて擬似制御冷却することにより助晶した以外は、実験2におけると同様にして、トレハロース二含水結晶を晶析させたマスキットを調製した。なお、擬似制御冷却は、全10時間の冷却時間を4時間、3時間、3時間の3つの区間に分け、最初の区間では4時間かけて液温を60℃から55℃まで、次の区間では3時間かけて55℃から50℃まで、さらに、最後の区間では3時間かけて液温を50℃から20℃まで、いずれも液温が時間に対して略直線状に低下するように冷却することによって行った。得られたマスキットから、常法により、バスケット型遠心分離機によりトレハロース二含水結晶を採取し、採取したトレハロース二含水結晶をマスキット重量に対し8%の脱イオン水を用いて洗浄し、40℃で8時間、熟成、乾燥させた後、25℃の清浄な空気を30分間吹き付けて強制冷却し、粉砕することにより、トレハロース二含水結晶含有粉末とした。トレハロース含有糖液1乃至8のそれぞれから擬似制御冷却によって得られたトレハロース二含水結晶含有粉末をそれぞれ被験試料1c乃至8cとした。
<実験3-2:被験試料1c乃至8cのトレハロース純度、対澱粉収率、及び固結性>
<トレハロース純度>
 被験試料1c乃至8cのトレハロース純度は、実験1-3と同じHPLC法にて求めた。結果は表3に示した。
<対澱粉収率>
 被験試料1c乃至8cの対澱粉収率は、実験2-2と同じ方法により算出した。結果は表3に併せて示した。
<固結性試験>
 被験試料1c乃至8cの固結性は、実験2-2と同じ固結性試験により評価した。結果は表3に併せて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 表3に示すとおり、晶析工程において擬似制御冷却法を適用して調製した被験試料1c乃至8cのトレハロース純度は、99.0乃至99.6%の範囲であった。この結果を実験2の自然冷却法にて晶析して得た被験試料1乃至8のトレハロース純度(表2の「トレハロース純度」の欄)と対比すると、被験試料1c乃至8cでは、いずれもトレハロース純度が0.2乃至0.6%高まっていた。この結果は、晶析工程において擬似制御冷却を適用することにより、粉末のトレハロース純度を高めることができることを示している。
 また、被験試料1c乃至8cの対澱粉収率は35乃至45%であり、この結果を実験2の自然冷却法にて晶析して得た被験試料1乃至8の対澱粉収率(表2の「対澱粉収率」の欄)と対比すると、被験試料1c乃至8cでは、いずれも対澱粉収率が2乃至4%程度向上していた。この結果は、晶析に際して擬似制御冷却法を適用すると、自然冷却法により晶析した場合に比べて対澱粉収率が高まることを意味している。晶析に用いたトレハロース含有糖液におけるトレハロース含量に変化がないにもかかわらず、擬似制御冷却法を適用することによって得られるトレハロース二含水結晶含有粉末の対澱粉収率が高まる理由は定かではないが、前述のとおり、擬似制御冷却法によれば微結晶が少なく粒度のそろった結晶が得られるため、遠心分離によってマスキットから結晶を採取する時、及び、採取した結晶を水で洗浄する時におけるトレハロースのロスが少なくなるためではないかと推測される。
 さらに、被験試料1c乃至8cについて、実験2-2におけると同様の固結性試験を行いその粉末の固結性を調べたところ、表3に示すとおり、被験試料1c乃至4cはいずれも「やや固結あり」(±)と判定され、被験試料5c乃至8cは、いずれも平板上に取り出すと崩壊し、チューブ内底部の形状を保っておらず、「固結なし」(-)と判定された。これらの結果は、晶析に際して擬似制御冷却法を適用すると、意外にも、得られる粉末の固結性が、自然冷却法にて晶析させた場合に比べて改善される傾向にあることを示している。中でも、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末(被験試料9)が固結性試験において「やや固結あり」(±)(表2参照)と判定されたのに対し、トレハロース含量が86%超と比較的高いトレハロース含有糖液5乃至8から擬似制御冷却法を適用して晶析することにより得られたトレハロース二含水結晶含有粉末(被験試料5c乃至8c)が、「固結なし」(-)と判定されたという事実は、トレハロース含量が86%超と比較的高いトレハロース含有糖液から擬似制御冷却法を適用して晶析することにより、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末よりも有意に固結し難い、粉末としての特性に優れたトレハロース二含水結晶含有粉末を製造できることを物語っている。
 上記の結果から、晶析工程において擬似制御冷却法を適用することにより、自然冷却法によって晶析された場合に比べて、トレハロース純度が高いトレハロース二含水結晶含有粉末を、より高い対澱粉収率で製造できることが判明した。また、トレハロース含量が86.0%超と比較的高い糖液から擬似制御冷却法により晶析して製造したトレハロース二含水結晶含有粉末は、自然冷却法で製造される従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末が「やや固結あり」(±)と判定される条件下でも固結せず、粉末としての流動性を維持している点で、より優れた粉末であることが判明した。
<実験4:粉末の固結性の違いに及ぼす結晶化度及び平均結晶子径の影響>
 実験3において、トレハロース含量が86%超と比較的高い糖液から擬似制御冷却法を適用して調製したトレハロース二含水結晶含有粉末被験試料5c乃至8cは、それ以外の被験試料と比べトレハロース純度において大差ないにもかかわらず、固結し難いという優れた粉末特性を有していた。その理由を解明する目的で、本実験では実験2で得た被験試料1乃至8、及び、実験3で得た被験試料1c乃至8cについて、粉末のトレハロース二含水結晶についての結晶化度と平均結晶子径を測定した。また、対照として、被験試料9についても同様に調べた。
<実験4-1:結晶化度の測定に用いる標準試料の調製>
<標準試料A>
 被験試料Aとして、実質的にトレハロース二含水結晶からなる標準試料を、試薬級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハロース 999』、コード番号:TH224、純度99.9%以上)を再結晶させることによって調製した。すなわち、上記試薬級のトレハロース二含水結晶含有粉末1,840gを1,000gの精製水に加熱・溶解し、溶解した溶液を20℃の恒温チャンバーに入れて一晩放置して再結晶させた。再結晶により晶出したトレハロース二含水結晶を常法によりバスケット型遠心分離機を用いて回収して、40℃で8時間乾燥してトレハロース二含水結晶約950gを得た。これを被験試料Aとした。被験試料Aのトレハロース純度を実験1記載のHPLC法で測定したところ、100%であった。
<標準試料B>
 被験試料Bとして、実質的に無定形部分からなる標準試料を、以下の手順で調製した。すなわち、被験試料Aを適量の精製水に溶解し、3日間かけて凍結乾燥した後、40℃以下で1晩真空乾燥して、実質的に無定形部分からなる粉末を得た。これを被験試料Bとした。被験試料Bのトレハロース純度を実験1記載のHPLC法で測定したところ、100%であった。なお、被験試料Bの水分含量をカールフィッシャー法により測定したところ、2.0%であった。
<実験4-2:被験試料A及びB、被験試料1乃至9、及び、被験試料1c乃至8cの結晶化度>
<結晶化度>
 被験試料A及びB、被験試料1乃至9、被験試料1c乃至8cにおけるトレハロース二含水結晶についての結晶化度を以下のようにして求めた。すなわち、市販の反射光方式による粉末X線回折装置(スペクトリス株式会社製、商品名『X’Pert PRO MPD』)を用い、Cu対陰極から放射される特性X線であるCuKα線(X線管電流40mA、X線管電圧45kV、波長1.5405オングストローム)による粉末X線回折プロフィルに基づき、同粉末X線回折装置に搭載された専用の解析コンピューターソフトウェアを用い、被験試料A及びB、被験試料1乃至9、及び被験試料1c乃至8cの各々につきハーマンス法による結晶化度の解析値を求めた。ハーマンス法による結晶化度の解析に先立ち、各粉末X線回折パターンにおけるピーク同士の重なり、回折強度、散乱強度などを勘案しながら、最適と判断されるベースラインが得られるように、ソフトウェアに設定された粒状度及びベンディングファクターをそれぞれ適切なレベルに合わせた。なお、ハーマンス法については、ピー・エイチ・ハーマンス(P.H.Harmans)とエー・ワイジンガー(A. Weidinger)、「ジャーナル・オブ・アプライド・フィジクス」(Journal of Applied Physics)、第19巻、491~506頁(1948年)、及び、ピー・エイチ・ハーマンス(P.H.Harmans)とエー・ワイジンガー(A. Weidinger)、「ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス」(Journal of Polymer Science)、第4巻、135~144頁(1949年)に詳述されている。
 被験試料Aについての結晶化度の解析値を解析値H100、被験試料Bについての結晶化度の解析値を解析値Hとし、各被験試料についての結晶化度の解析値をHsとして前記した式[3]に代入することにより結晶化度を求めた。因みに被験試料Aについてのハーマンス法による結晶化度の解析値(H100)及び被験試料Bについての同解析値(H)は、それぞれ、50.69%及び8.59%であった。結果は表4に示した。なお、被験試料A及びBについては、粉末X線回折パターンをそれぞれ図1及び図2に示した。
 図1に見られるとおり、被験試料Aの粉末X線回折パターンにおいては、トレハロース二含水結晶に特有な回折ピークが回折角(2θ)5乃至50°の範囲に明瞭かつシャープに出現し、無定形部分に特有なハローは一切認められなかった。一方、図2に見られるとおり、被験試料Bの粉末X線回折パターンにおいては、図1の粉末X線回折パターンとは異なり、無定形部分に特有なハローがベースラインの膨らみとして著明に出現したものの、トレハロースの二含水結晶や無水結晶に特有な回折ピークが一切認められなかった。
<実験4-3:被験試料A及びBのシンクロトロン放射による粉末X線回折>
 本実験では、被験試料A及びBがそれぞれ、解析値H100及びHを決定するための試料として適切なものであることをさらに裏付ける目的で、これら標準試料をシンクロトロン放射光(以下、「放射光」と言う。)をX線源に用い、微弱な回折や散乱のシグナルを検出することができる透過光方式の粉末X線回折に供した。なお、測定条件は次のとおりであった。
<測定条件>
  粉末X線回折装置:高速粉末X線回折装置(神津精機社販売、
           型番『PDS-16』)、デバイシェラモード、
           カメラ長:497.2mm
  X線源 :偏向電磁石からの放射光(兵庫県ビームライン(BL08
B2))
  測定波長:1.2394Å(10.00keV)
  測定強度:10フォトン/秒
  測定角 :3乃至38°
  露光時間:600秒間
  画像撮影:イメージングプレート(富士フイルム社製、商品名『イメー
       ジングプレート BAS-2040』
  画像読取装置:イメージアナライザー(富士フイルム社製、『バイオイ
         メージアナライザーBAS-2500』)
 測定は、大型放射光施設「SPring-8」(兵庫県佐用郡佐用町光都1-1-1)内に設けられた「兵庫県ビームライン(BL08B2)」を利用して実施した。
 粉末X線回折の測定に先立ち、被験試料A及びBを乳鉢によりすり潰した後、53μmの篩によりふるい分け、篩を通過した粉末をX線結晶回折用のキャピラリー(株式会社トーホー販売、商品名『マークチューブ』、No.14(直径0.6mm、リンデマンガラス製))内に充填長が略30mmとなるように均一に充填した。次いで、キャピラリーを試料の充填終端で切断し、開口部を接着剤により封じた後、試料マウントへキャピラリーを粘土により固定し、キャピラリーの長手方向が粉末X線回折装置の光軸に対して垂直になるように、試料マウントを粉末X線回折装置に取り付けた。トレハロース二含水結晶の配向による粉末X線回折プロフィルへの影響を除くため、測定中、試料マウントを2回/秒の周期で等速回転させた。
 被験試料A及びBについて得られた粉末X線回折プロフィルを解析し、粉末X線回折パターンを作成する過程においては、測定精度を上げるため、常法にしたがい、各粉末X線回折プロフィルから粉末X線回折装置に由来するバックグラウンドシグナルを除去した。斯くして得られた被験試料A及びBについての粉末X線回折パターンをそれぞれ図3及び図4に示す。
 図3に見られるとおり、放射光を用いた粉末X線回折による被験試料Aについての粉末X線回折パターンはトレハロース二含水結晶に特有な回折ピークが回折角(2θ)3乃至38°の範囲に明瞭かつシャープに出現した。図3と図1とを比較すると、放射光の波長(1.2394Å)、と特性X線の波長(1.5405Å)とが異なるため、図3においては、図1におけるほぼ5分の4の回折角(2θ)で各回折ピークが出現するという違いはあるものの、図1及び図3における回折パターンは極めてよく一致していた。また、図3における各回折ピークの強度は、図1における回折ピークの強度より50倍近く強いにもかかわらず、各回折ピークの半値幅は図1におけるよりも明らかに狭く、分離度も高かった。また、図3の粉末X線回析パターンにおいては、後述する図4におけるがごとき、無定形部分に特有なハローは一切認められなかった。このことは、被験試料A中のトレハロース二含水結晶の結晶性が極めて高く、被験試料Aが実質的にトレハロース二含水結晶からなることを示している。
 一方、図4に示すとおり、放射光を用いた粉末X線回折による被験試料Bについての粉末X線回折パターンにおいては、無定形部分に特有なハローがベースラインの膨らみとして著明に出現し、トレハロース二含水結晶に特有な回折ピークは一切認められなかった。このことは、被験試料Bが実質的に無定形部分からなることを示している。
 シンクロトロン放射光をX線源として用いて得られた上記の結果は、被験試料A及びBが、式[3]における解析値H100及び解析値Hを決定するための試料として適切なものであることを裏付けている。
<実験4-4:被験試料A、被験試料1乃至9及び被験試料1c乃至8cの平均結晶子径>
 粉末X線回折パターンにおける各回折ピークの半値幅及び回折角(2θ)から、結晶子径を算出することができる。本発明者らは、複数の回折ピークから算出される結晶子径の平均値(平均結晶子径)が、結晶含有粉末の物性を規定するパラメータとなり得ると考え、トレハロース二含水結晶含有粉末の被験試料について平均結晶子径を求めた。
 無定形粉末であり、粉末X線回折パターンにおいて回折ピークを示さない被験試料Bを除く、被験試料A、被験試料1乃至9、及び、被験試料1c乃至8cについて、結晶化度を求めた際の各粉末X線回折パターンを用いてさらにそれぞれの平均結晶子径を求めた。平均結晶子径は、トレハロース二含水結晶含有粉末のそれぞれの粉末X線回折パターンにおける5個の回折ピーク、すなわち、結晶子の不均一歪に起因する回折ピーク幅への影響が少ないとされる比較的低角の領域で、他の回折ピークとよく分離した回折角(2θ)13.7°(ミラー指数(hkl):101)、17.5°(ミラー指数:220)、21.1°(ミラー指数:221)、23.9°(ミラー指数:231)及び25.9°(ミラー指数:150)の回折ピーク(図1に示した符号a乃至e)を選択し、それぞれについてその半値幅と回折角(2θ)を用い、粉末X線回折装置に付属する解析用コンピューターソフトウェア(『エクスパート ハイスコア プラス(X´pert Highscore Plus)』を用い、標準品としてケイ素(米国国立標準技術研究所(NIST)、X線回折用標準試料(『Si640d』)を用いた場合の測定値に基づき補正した後、前記式[4]に基づき結晶子径を算出し、5点の平均値として求めた。結果は表4に併せて示した。
 なお、表4には、被験試料1乃至9及び被験試料1c乃至8cについて、トレハロース純度と粉末の固結性試験の結果を表2及び3からそれぞれ転記し、併せて示した。また、結晶化度測定のための標準試料とした被験試料A及びBについても、それぞれを実験2-2、実験3-2と同じ固結性試験に供し、その固結性を評価した。結果は併せて表4に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 結晶化度測定において、解析値H100を決定するための標準試料とした被験試料A(トレハロース純度100.0%、結晶化度100.0%)の平均結晶子径は3,910Åであった。また、表4に示されるとおり、固結性試験において被験試料Aは「固結なし」(-)と判定された。これに対し、解析値Hを決定するための標準試料とした被験試料B(トレハロース純度100.0%、結晶化度0.0%)は、固結性試験において、チューブから平板上に取り出してもチューブ内底部の半球状を明確に保っており、「固結あり」(+)と判定された。なお、平板上に取り出された被験試料Bが保っているチューブ内底部の半球状の形態は、平板に軽く振動を与えた程度では崩壊しないほどであった。一方、従来から市販されている食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末である被験試料9のトレハロース純度は99.0%、結晶化度は85.4%であった。
 表4の「結晶化度」の欄に示すとおり、晶析工程において自然冷却法にて晶析して得た被験試料1乃至8の結晶化度は78.7乃至88.1%の範囲となり、また、晶析工程において擬似制御冷却法を適用して調製した被験試料1c乃至8cの結晶化度は、85.7乃至96.0%の範囲となった。晶析方法の違いの観点から上記被験試料1乃至8及び被験試料1c乃至8cの結晶化度を対比すると、擬似制御冷却法にて得た被験試料1c乃至8cでは、試料間でばらつきはあるものの、自然冷却法にて得た被験試料1乃至8よりも結晶化度が3.1乃至7.9%高まっていることが判明した。
 また、表4に示す結果は、結晶化度が粉末の固結性と相関性があることを物語っている。すなわち、表4に示すとおり、結晶化度が90%以上である被験試料A、被験試料5c乃至8cが、いずれも「固結なし」(-)であったのに対し、結晶化度が85%以上90%未満である被験試料2、3、5乃至9、及び被験試料1c乃至4cは、いずれも「やや固結あり」(±)であり、結晶化度が85%未満である被験試料B、被験試料1及び4は、いずれも「固結あり」(+)であった。このことは、結晶化度が、固結し難いトレハロース二含水結晶含有粉末を規定する有力な指標となり得ることを物語っている。
 さらに、この結果は、トレハロース二含水結晶含有粉末の製造において、反応液中のトレハロース含量を86.0%超にまで高め、その後の晶析工程において擬似制御冷却法を適用すれば、得られる粉末におけるトレハロース二含水結晶についての結晶化度が90%以上となり、結果として、固結の点で、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末よりも有意に固結し難いトレハロース二含水結晶含有粉末を得ることができることを物語っている。
 一方、表4の「平均結晶子径」の欄に示すとおり、晶析工程において自然冷却法にて晶析して得た被験試料1乃至8の平均結晶子径は2,150乃至2,830Åの範囲となり、また、晶析工程において擬似制御冷却法を適用して調製した被験試料1c乃至8cの平均結晶子径は、2,540乃至3,580Åの範囲となった。平均結晶子径について被験試料1c乃至8cと被験試料1乃至8とを対比すると、擬似制御冷却法にて得た被験試料1c乃至8cでは、試料間でばらつきはあるものの自然冷却法にて得た被験試料1乃至8よりも平均結晶子径が190乃至750Å増大していることが判明した。この結果から、トレハロース二含水結晶の晶析工程における擬似制御冷却法の適用は、平均結晶子径の大きいトレハロース二含水結晶含有粉末を得る上でも優れた方法であると言える。
 また、被験試料1乃至8及び被験試料1c乃至8cにおいては、粉末におけるトレハロース純度及びトレハロース二含水結晶についての結晶化度が高いほど平均結晶子径の値が大きい傾向が認められた。この傾向は、トレハロース純度が100.0%で結晶化度が100.0%である被験試料1の平均結晶子径が3,910Åであり、食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末である被験試料9の平均結晶子径が2,590Åであったことを併せると、トレハロース二含水結晶含有粉末における平均結晶子径は、トレハロース純度及び結晶化度と一定の相関性があることを物語っている。
 さらに、表4に示す結果は、平均結晶子径も粉末の固結性と相関性があることを物語っている。すなわち、表4に示すとおり、平均結晶子径が3,210Å以上である被験試料A、被験試料5c乃至8cが、いずれも「固結なし」(-)であったのに対し、平均結晶子径が2,500Å以上3,200Å未満の範囲にある被験試料2、3、5乃至9、及び被験試料1c乃至4cは、いずれも「やや固結あり」(±)であり、平均結晶子径が2,500Å未満である被験試料B、被験試料1及び4は、いずれも「固結あり」(+)であった。このことは、結晶化度とともに平均結晶子径も、固結し難いトレハロース二含水結晶含有粉末を規定する有力な指標となり得ることを物語っている。
<実験5:被験試料の粉末特性(保存性、水への溶解性)>
 被験試料1乃至9及び被験試料1c乃至8cの粉末としての性質をさらに明らかにすることを目的とし、保存性試験及び水への溶解性試験を行った。
<実験5-1:保存性試験>
 実験2-2、実験3-2等において行われた固結性試験が、トレハロース二含水結晶含有粉末の実際の保存時における固結性を評価する試験として妥当なものであることを確認すべく、実験4-1の方法で得た被験試料A及びB、実験2で得た被験試料1乃至9、及び、実験3で得た被験試料1c乃至8cについて、市場に流通する製品としてのトレハロース二含水結晶含有粉末が実際に保存される状態、環境、期間などを想定した保存性試験を行った。
 すなわち、被験試料A及びB、被験試料1乃至9、及び、被験試料1c乃至8cを各々150gずつ取り、別々にポリエチレン袋(商品名『ユニパック F-4』、株式会社生産日本社製、17cm×12cm)に採取し、空気を抜いた状態で封入したポリエチレン袋を各被験試料について3袋ずつ作製した。次いで、各ポリエチレン袋の片面積1m当たりの荷重が648kgになるように13.2kgの錘を、それぞれのポリエチレン袋の上に上面全体に荷重が掛かるように載せ、その状態で、高温多湿を避けた環境下にて60日間保存した。なお、食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末製品は、通常、20kg詰めの袋入の荷姿で、10段程度積み重ねた状態で倉庫等において保存されるところ、ポリエチレン袋の片面積1m当たり648kgという荷重は、この10段積みした状態における最下段の製品にかかる荷重に相当する。60日間保存後、各被験試料をポリエチレン袋から取り出し、目開き425μmの篩にかけ、篩を通過した粉末と通過しなかった粉末の質量をそれぞれ測定し、粉末全体に占める粒径425μm以上の粒子の質量割合(%)を求め、各被験試料について試験した3袋の平均値をとることにより、60日間保存後の粉末における固結の有無を判定した。粉末の固結は、粒径425μm以上の粒子が粉末全体の30%未満の場合を「固結なし」(-)、同粒子が粉末全体の30%以上の場合を「固結あり」(+)と判定した。なお、粉末における425μm以上の粒子の割合が30%を超えると、一般に、粉末の溶解や他の粉末状組成物との混合、混捏などに支障が生じるため、判定の基準を30%とした。結果を表5に示した。
<実験5-2:水への溶解性試験>
 各被験試料を各0.25g秤量し、それぞれ内底部が半球状の14ml容蓋付きポリプロピレン製円筒チューブ(ベクトン・ディッキンソン社販売、商品名「ファルコンチューブ2059」に入れた。各被験試料を入れたチューブに、脱イオン水を5ml加え、50℃の恒温水槽で、30分間加温した後、2回転倒させ、さらに50℃で15分保持し、その時の溶解性を調べた。目視により、粉末が完全に溶解したと見なされる場合を溶解性「良」、不溶物の残存が確認される場合を溶解性「不良」と判定した。結果を併せて表5に示した。
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 表5の「保存性」の欄に示されるとおり、各被験試料を荷重を掛けながら高温多湿を避けた環境下で60日間保存した保存性試験において、トレハロースについての結晶化度が90.0%未満、平均結晶子径が2,850Å以下である被験試料1乃至9及び被験試料1c乃至4cが「固結あり」(+)と判断されたのに対し、結晶化度が91.0%以上96.0%以下、平均結晶子径が3,210Å以上である被験試料A、被験試料5c乃至8cは「固結なし」(-)と判断された。この結果は、実験2-2、実験3-2等において行った固結性試験において「固結あり」(+)若しくは「やや固結あり」(±)と判定された被験試料は本保存試験においては「固結あり」(+)と判定されるのに対し、実験2-2、実験3-2等において行った固結性試験において「固結なし」(-)と判定された被験試料は、本保存試験においても同様に「固結なし」(-)と判定されることを示している。この事実は、実験2-2、実験3-2等において行った固結性試験が、トレハロース二含水結晶含有粉末の実際の保存環境下での固結性を評価する試験として妥当なものであることを示している。
 また、表5の「水への溶解性」の欄に示すとおり、水への溶解性試験において、結晶化度100%、平均結晶子径3,910Åの被験試料Aが溶解性「不良」と判定されたのに対し、結晶化度が96.0%以下、平均結晶子径が3,580Å以下である被験試料1乃至9及び被験試料1c乃至8cは、いずれも溶解性「良」と判定された。この結果は、トレハロース二含水結晶含有粉末において、結晶化度及び平均結晶子径が被験試料Aのレベル、換言すれば、試薬級のトレハロース二含水結晶含有粉末のレベルにまで高まると、水への溶解性が悪くなるという、固結性とは違った問題が生じることを示している。
<実験6:トレハロースの製造により好適なCGTaseに共通する部分アミノ酸配列>
 トレハロースの製造により好適なCGTaseを特徴づける目的で、酵素反応液中のトレハロース含量を高める効果に優れる前記パエニバチルス属微生物由来CGTase、すなわち、パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株、パエニバチルス・パブリ NBRC13638株、及び、パエニバチルス・アミロリティカス NBRC15957株にそれぞれ由来するCGTaseのアミノ酸配列(配列表における配列番号1、2及び3)と、酵素反応液中のトレハロース含量を高める効果がパエニバチルス属微生物由来CGTaseに比べると弱い前記ジオバチルス・ステアロサーモフィラス Tc-91株、とバチルス・マゼランス、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネスにそれぞれ由来するCGTaseのアミノ酸配列(配列表における配列番号4、5及び6)を比較した。なお、アミノ酸配列の比較に用いた配列表における配列番号1乃至3で示されるアミノ酸配列はいずれも、パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株、パエニバチルス・パブリ NBRC13638株、及び、パエニバチルス・アミロリティカス NBRC15957株のそれぞれのCGTase遺伝子を出願人が独自にクローニングし決定した塩基配列にコードされるアミノ酸配列を用いた。また、配列表における配列番号4及び5で示されるアミノ酸配列は、出願人が独自に決定し本願と同じ出願人による特開昭61-135581号公報に開示されたジオバチルス・ステアロサーモフィラス(旧分類ではバチルス・ステアロサーモフィラス) Tc-91株由来、及び、バチルス・マゼランス由来CGTaseのアミノ酸配列である。因みに、配列表における配列番号5で示されるアミノ酸配列は、実験1で用いたバチルス・マゼランス由来CGTase(商品名『コンチザイム』、天野エンザイム株式会社販売)のものではないものの、同じバチルス・マゼランス由来CGTaseのアミノ酸であることから代用した。また、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来CGTaseのアミノ酸配列としては、遺伝子データベース『GenBank』にアクセッションNo.35484として登録されているものを用いた。
 上記したアミノ酸配列の比較において、酵素反応液中のトレハロース含量を高める効果に優れるCGTase、すなわち、前記パエニバチルス属微生物由来CGTaseに共通して存在し、且つ、酵素反応液中のトレハロース含量を高める効果がそれほどでもないCGTase、すなわち、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・マゼランス、及び、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネスにそれぞれ由来するCGTaseに存在しない部分アミノ酸配列として、下記(a)乃至(d)の部分アミノ酸配列が認められた。
(a)Gly-Ser-X-Ala-Ser-Asp;
(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn;
(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys;
(d)Val-Asn-Ser-Asn-X-Tyr;
(但し、XはAla又はSerを、XはAla又はThrをそれぞれ意味する。)
 以上の結果から、本発明の製造方法によるトレハロースの製造において、より好適なCGTase、すなわち、酵素反応液中のトレハロース含量を86.0%超とすることのできるCGTaseは、上記(a)乃至(d)の部分アミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。
 以下、実施例に基づき本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例によってなんら限定されるものではない。
<トレハロース二含水結晶含有粉末の製造>
 トウモロコシ澱粉を30%になるように水中に懸濁し、この懸濁液に終濃度0.1%となるように炭酸カルシウムを添加し、pH6.0に調整した。これに耐熱性α-アミラーゼ(商品名『ターマミル60L』、ノボザイムズ・ジャパン株式会社販売)を澱粉質量当たり0.2%加えて98乃至100℃、15分間反応させ、澱粉を糊化・液化した。得られた液化澱粉溶液を125℃で15分間オートクレーブした後、51℃に冷却し、これに実験1-1の方法で調製したα-グリコシルトレハロース生成酵素とトレハロース遊離酵素を含む部分精製酵素液を、澱粉1グラム当たりそれぞれ2単位及び10単位になるよう加え、さらに、澱粉1グラム当たり300単位のイソアミラーゼ(株式会社林原製)及び2単位の実験1-2の方法で調製したパエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15959株由来のCGTaseを加え、さらに、約70時間反応させた。次いで、この反応液を97℃で30分間加熱して酵素を失活させた後、pH4.5に調整し、これにグルコアミラーゼ剤(商品名『グルコチーム#20000』、ナガセケムテックス株式会社販売)を澱粉1グラム当り10単位加えて24時間反応させたところ、トレハロース純度、すなわち無水物換算でのトレハロース含量が87.4%の反応液が得られた。斯くして得た反応液を加熱し酵素を失活させ、常法により活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂(H型)及びアニオン交換樹脂(OH型)にて脱塩し、減圧濃縮し、固形物濃度約85%の濃縮液とした。これを助晶缶にとり、試薬級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハロース 999』、コード番号:TH224、トレハロース純度99.9%以上、株式会社林原販売)を種晶として2%加えて55℃とし、穏やかに撹拌しつつ24時間かけて15℃まで自然冷却し、トレハロース二含水結晶を晶析させた。バスケット型遠心分離機で結晶を回収し、結晶をマスキット重量に対し約5%の精製水でスプレーし洗浄した後、50℃で2時間、熟成、乾燥し、20℃の空気を10分間吹き付けて冷却し、粉砕して、無水物換算でトレハロースを99.4%、D-グルコースを0.3%、4-O-α-グルコシルトレハロースを0.06%、及び、6-O-α-グルコシルトレハロースを0.09%含有するトレハロース二含水結晶含有粉末を対澱粉収率約42%で得た。
 本例の製造方法によれば、トレハロース二含水結晶含有粉末を、約42%という高い対澱粉収率で製造することができる。また、本製造方法によって製造されたトレハロース二含水結晶含有粉末のトレハロース二含水結晶についての結晶化度は88.4%、平均結晶子径は2,850Å、粉末全体の還元力は0.4%であった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験4-2で求めた解析値H100及びHを用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径53μm以上425μm未満の粒子が73.1%、粒径53μm以上300μm未満の粒子が68.6%、及び、粒径425μm以上の粒子が8.2%含まれていた。本品は、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末と同様に、食品素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとして用いることができる。
<トレハロース二含水結晶含有粉末の製造>
 澱粉1グラム当たりそれぞれ3単位及び15単位のα-グリコシルトレハロース生成酵素とトレハロース遊離酵素を用いて反応時間を40時間とし、CGTaseとして実験1-2の方法で得たパエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株由来CGTaseを用いた以外は、実施例1と同様の方法によりトレハロース生成反応及びグルコアミラーゼ処理を行うことにより、トレハロース純度、すなわち無水物換算でのトレハロース含量が87.6%の反応液を得た。得られた反応液を加熱し酵素を失活させ、常法により活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂(H型)及びアニオン交換樹脂(OH型)にて脱塩し、減圧濃縮し、固形物濃度約85%の濃縮液とした。これを助晶缶にとり、試薬級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハロース 999』、コード番号:TH224、トレハロース純度99.9%以上、株式会社林原販売)を種晶として1%加えて60℃とし、次いで、このトレハロース含有溶液を、穏やかに撹拌しつつ60℃から50℃まで12時間、50℃から40℃まで6時間、さらに40℃から15℃まで6時間かけて冷却する擬似制御冷却法にて計24時間で15℃まで冷却することにより、トレハロースの二含水結晶を晶析させた。バスケット型遠心分離機で結晶を回収し、結晶をマスキット重量に対し約5%の精製水でスプレーし洗浄した後、50℃で2時間、熟成、乾燥し、20℃の空気を20分間吹き付けて冷却し、粉砕して、無水物換算でトレハロースを99.6%、D-グルコースを0.07%、4-O-α-グルコシルトレハロースを0.04%、及び、6-O-α-グルコシルトレハロースを0.06%含有するトレハロース二含水結晶含有粉末を対澱粉収率約45%で得た。
 本トレハロース二含水結晶含有粉末のトレハロース二含水結晶についての結晶化度は95.6%、平均結晶子径は3,520Å、粉末全体の還元力は0.15%であった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験4-2で求めた解析値H100及びHを用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径53μm以上425μm未満の粒子が83.3%、粒径53μm以上300μm未満の粒子が72.5%、及び、粒径425μm以上の粒子が6.9%含まれていた。本品を用い、実験2-2、実験3-2等と同じ方法により固結性試験を行ったところ、「固結なし」(-)と判定された。また、実験5と同じ方法により水への溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判定された。
 本例の製造方法によれば、トレハロース二含水結晶含有粉末を、約45%という高い対澱粉収率で製造することができる。また、本製造方法によって製造されたトレハロース二含水結晶含有粉末は、食品素材などとして市販されている従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハ』、株式会社林原販売)と比べて、トレハロース純度においてそれほどの違いがないにもかかわらず、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末に比べて有意に固結し難い粉末であり、保存や取扱いが容易である。本品は、トレハロースの二含水結晶含有粉末である点では従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末と同様であり、保存や取り扱いが容易である分、食品素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとしてより好適に用いることができる。
<トレハロース二含水結晶含有粉末の製造>
 CGTaseとして、実験1-2の方法で調製したパエニバチルス・パブリ NBRC13638株由来のCGTaseを用いた以外は実施例1におけると同様にしてトレハロース生成反応を行ったところ、グルコアミラーゼ処理後の反応液における無水物換算でのトレハロース含量は87.2%であった。斯くして得た反応液を加熱し酵素を失活させ、常法により活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂(H型)及びアニオン交換樹脂(OH型)にて脱塩し、減圧濃縮し、固形物濃度約85%の濃縮液とした。これを助晶缶にとり、試薬級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハロース 999』、コード番号:TH224、トレハロース純度99.9%以上、株式会社林原販売)を種晶として1%加えて60℃とし、穏やかに撹拌しつつ60℃から45℃まで15時間、45℃から20℃まで9時間かけて冷却する2段階の擬似制御冷却法にて24時間かけて冷却し、トレハロース二含水結晶を晶析させた。バスケット型遠心分離機で結晶を回収し、結晶をマスキット重量に対し約5%の精製水でスプレーし洗浄した後、50℃で2時間、熟成、乾燥し、20℃の空気を10分間吹き付けて冷却し、粉砕して、無水物換算でトレハロースを99.2%、D-グルコースを0.4%、4-O-α-グルコシルトレハロースを0.06%、及び、6-O-α-グルコシルトレハロースを0.10%含有するトレハロース二含水結晶含有粉末を対澱粉収率約44%で得た。
 本トレハロース二含水結晶含有粉末のトレハロース二含水結晶についての結晶化度は92.6%、平均結晶子径は3,130Å、粉末全体の還元力は0.5%であった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験4-2で求めた解析値H100及びHを用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径53μm以上425μm未満の粒子が75.2%、粒径53μm以上300μm未満の粒子が69.3%、及び、粒径425μm以上の粒子が7.8%含まれていた。本品を用い、実験2-2、実験3-2等と同じ方法により固結性試験を行ったところ、「固結なし」(-)と判定された。また、実験5と同じ方法により水への溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判定された。
 本例の製造方法によれば、トレハロース二含水結晶含有粉末を、約44%という高い対澱粉収率で製造することができる。また、本製造方法によって製造されたトレハロース二含水結晶含有粉末は、食品素材などとして市販されている従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハ』、株式会社林原販売)と比べて、トレハロース純度においてそれほどの違いがないにもかかわらず、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末に比べて有意に固結し難い粉末であり、保存や取扱いが容易である。本品は、トレハロースの二含水結晶含有粉末である点では従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末と同様であり、保存や取り扱いが容易である分、食品素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとしてより好適に用いることができる。
<トレハロース二含水結晶含有粉末の製造>
 原料澱粉としてタピオカ澱粉を用い、CGTaseとして実験1-2の方法で得たパエニバチルス・アミロリティカス NBRC15957株由来CGTaseを用いた以外は、実施例1と同様の方法によりトレハロース生成反応及びグルコアミラーゼ処理を行うことにより、トレハロース純度、すなわち無水物換算でのトレハロース含量が86.6%の反応液を得た。得られた反応液を加熱し酵素を失活させ、常法により活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂(H型)及びアニオン交換樹脂(OH型)にて脱塩し、減圧濃縮し、固形物濃度約86%の濃縮液とした。これを助晶缶にとり、試薬級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハロース 999』、コード番号:TH224、トレハロース純度99.9%以上、株式会社林原販売)を種晶として1%加えて60℃とし、次いで、このトレハロース含有溶液を、穏やかに撹拌しつつ60℃から50℃まで8時間、50℃から35℃まで8時間、35℃から15℃まで8時間かけて冷却する3段階の擬似制御冷却法にて計24時間で15℃まで冷却することにより、トレハロースの二含水結晶を晶析させた。バスケット型遠心分離機で結晶を回収し、結晶をマスキット重量に対し約5%の精製水でスプレーし洗浄した後、50℃で2時間、熟成、乾燥し、20℃の空気を20分間吹き付けて冷却し、粉砕して、無水物換算でトレハロースを99.4%、D-グルコースを0.06%、4-O-α-グルコシルトレハロースを0.04%、及び、6-O-α-グルコシルトレハロースを0.06%含有するトレハロース二含水結晶含有粉末を対澱粉収率約43%で得た。
 本トレハロース二含水結晶含有粉末のトレハロース二含水結晶についての結晶化度は93.3%、平均結晶子径は3,280Å、粉末全体の還元力は0.13%であった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験4-2で求めた解析値H100及びHを用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径53μm以上425μm未満の粒子が80.7%、粒径53μm以上300μm未満の粒子が74.4%、及び、粒径425μm以上の粒子が7.1%含まれていた。本品を用い、実験2-2、実験3-2等と同じ方法により固結性試験を行ったところ、「固結なし」(-)と判定された。また、実験5と同じ方法により水への溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判定された。
 本例の製造方法によれば、トレハロース二含水結晶含有粉末を、約43%という高い対澱粉収率で製造することができる。また、本製造方法によって製造されたトレハロース二含水結晶含有粉末は、食品素材などとして市販されている従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハ』、株式会社林原販売)と比べて、トレハロース純度においてそれほどの違いがないにもかかわらず、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末に比べて有意に固結し難い粉末であり、保存や取扱いが容易である。本品は、トレハロースの二含水結晶含有粉末である点では従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末と同様であり、保存や取り扱いが容易である分、食品素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとしてより好適に用いることができる。
<組換え型CGTase及び変異体CGTaseの調製とそれらを用いたトレハロース二含水結晶含有粉末の製造>
 実施例2において用いたパエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株由来のCGTaseに替えて、同株由来のCGTase遺伝子を大腸菌を宿主として発現させて得た組換え型(野生型)CGTaseと、当該CGTase遺伝子に常法により部位特異的変異を導入することにより調製したアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の1残基が他のアミノ酸残基に置換した変異体CGTase2種を用い、トレハロース二含水結晶含有粉末の製造を行った。
<組換え型CGTaseの調製>
 本発明者らがパエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株からクローニングし保有している同株由来のCGTase遺伝子(配列表における配列番号7で示される塩基配列を有する)を用い、そのコードするアミノ酸配列を変えることなく変異させて制限酵素部位などを導入又は欠失させた後、それを発現用プラスミドベクター「pRSET-A」(インビトロジェン社製)に組換え、天然型(野生型)CGTaseをコードする遺伝子を含む発現用組換えDNAを作成した。得られた組換えDNA「pRSET-iPI」の構造を図6に示した。当該組換えDNA「pRSET-iPI」を用いて常法により大腸菌BL21(DE3)(ストラタジーン社製)を形質転換し、同組換えDNAを保持する形質転換体「BL21-RSET-iPI」を取得した。次いで、当該形質転換体をアンピシリンNa塩100μl/mlを含むT培地(培地1L当り、バクト-トリプトン12g、バクト-イーストエキストラクト24g、グリセロール5ml、17mM リン酸一カリウム、72mM リン酸二カリウムを含有)を用いて37℃で24時間好気的に培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕器(商品名『Ultra Sonic Homogenizer UH-600』、エムエステー株式会社製)を用いて破砕処理し、遠心分離により得た破砕液上清についてCGTase活性(澱粉分解活性)を測定し、培養液1ml当たりに換算したところ、約12.8単位/mlの酵素活性が得られた。破砕液上清を常法に従い硫安塩析、透析することにより組換え型CGTaseの粗酵素液を得た後、DEAE-トヨパール 650Sゲル(東ソー株式会社製)を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及びブチル-トヨパール 650Mゲル(東ソー株式会社製)を用いた疎水カラムクロマトグラフィーに供して精製し、組換え型CGTaseの部分精製標品とした。
<変異体CGTaseの調製>
 上記パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株由来の天然型(野生型)CGTase遺伝子に、常法により部位特異的変異を導入し、得られた変異CGTase遺伝子を大腸菌で発現させることにより、1アミノ酸置換変異体CGTaseを2種調製した。なお、当該CGTaseにアミノ酸置換を導入するに際しては、パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株由来CGTaseのアミノ酸配列である配列表における配列番号1で示されるアミノ酸配列の、133番目のアスパラギン酸残基から138番目のヒスチジン残基(Asp133~His138)、223番目のグリシン残基から231番目のヒスチジン残基(Gly223~His231)、255番目のグルタミン酸残基から258番目のロイシン残基(Glu255~Leu258)、及び、321番目のフェニルアラニン残基から326番目のアスパラギン酸残基(Phe321~Asp326)、すなわち、α-アミラーゼファミリーに分類される酵素群に共通して保存されている4つの保存領域に相当するアミノ酸配列と、259番目のグリシン残基から264番目のアスパラギン酸残基(Gly269~Asp264)、331番目のリジン残基から337番目のアスパラギン残基(Lys331~Asn337)、375番目のリジン残基から381番目のリジン残基(Lys375~Lys381)、及び、567番目のバリン残基から572番目のチロシン残基(Val567~Tyr572)、すなわち、パエニバチルス属微生物由来CGTaseに特有の前述した(a)乃至(d)の部分アミノ酸配列へのアミノ酸置換変異は避け、これら以外の箇所から変異箇所を選択することとした。
 上記の指針に基づき、配列表における配列番号1で示されるアミノ酸配列における178番目のグリシン残基をアルギニン残基に置換した変異体CGTase(G178R)と、454番目のチロシン残基をヒスチジン残基に置換した変異体CGTase(Y454H)の2種類を調製することとした。パエニバチルス・イリノイセンシス NBRC15379株由来の天然型(野生型)CGTase遺伝子を保持する組換えDNA「pRSET-iPI」を鋳型に用い、配列表における配列番号8及び9でそれぞれ示される塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、市販の『QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit』(ストラタジーン社製)を用いて常法のPCR法、DpnI法にてCGTase遺伝子に部位特異的変異を導入することにより変異体CGTase(G178R)をコードする組換えDNA「pRSET-iPI(G178R)」を得た。また、配列表における配列番号10及び11でそれぞれ示される塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとした以外は上記と同様にして変異体CGTase(Y454H)をコードする組換えDNA「pRSET-iPI(Y454H)」を得た。
 変異体CGTase遺伝子を保持する組換えDNA「pRSET-iPI(G178R)」及び「pRSET-iPI(Y454H)」をそれぞれ用いて常法により大腸菌BL21(DE3)(ストラタジーン社製)を形質転換し、それぞれの組換えDNAを保持する形質転換体「BL21-RSET-iPI(G178R)」及び「BL21-RSET-iPI(Y454H)」を取得した。これら形質転換体を上記「BL21-RSET-iPI」の場合と同様に培養し、菌体破砕した後、部分精製してそれぞれの変異体CGTaseの部分精製標品を得た。因みにそれぞれの菌体破砕液上清についてCGTase活性(澱粉分解活性)を測定し、培養液1ml当たりの酵素活性に換算したところ、「BL21-RSET-iPI(G178R)」では約10.3単位/ml、「BL21-RSET-iPI(Y454H)」では約13.7単位/mlであった。
<トレハロース二含水結晶含有粉末の製造>
 上記で得た組換え型(野生型)CGTase、変異体CGTaseとしてのG178R(配列表における配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するCGTase)、又は、Y454H(配列表における配列番号13で示されるアミノ酸配列を有するCGTase)を用いた以外は実施例2と同様の方法によりトレハロース二含水結晶含有粉末を製造した。それぞれのCGTaseを用いて得られた反応液中のトレハロース含量、得られたトレハロース二含水結晶含有粉末における糖組成、対澱粉収率、トレハロース二含水結晶についての結晶化度、平均結晶子径、粉末全体の還元力、粒度分布を測定するとともに、粉末を実験2-2、実験3-2等と同じ方法による固結性試験及び実験5と同じ方法による水への溶解性試験に供した。結果を表6にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 表6に示すとおり、組換え型CGTaseや1アミノ酸置換変異体CGTaseを用いた場合であっても、酵素反応液中のトレハロース含量は天然型CGTaseの場合と同等の87.0%以上であり、同じ製造方法によれば、ほぼ同等のトレハロース純度、結晶化度、粒度分布などを有するトレハロース二含水結晶含有粉末を、約44%~45%という高い対澱粉収率で製造することができる。また、本製造方法によって製造されたトレハロース二含水結晶含有粉末は、実施例1乃至4において天然型CGTaseを用いて製造したトレハロース二含水結晶含有粉末と同様に、食品素材などとして市販されている従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハ』、株式会社林原販売)と比べて、トレハロース純度においてそれほどの違いがないにもかかわらず、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末に比べて有意に固結し難い粉末であり、保存や取扱いが容易な粉末である。
 トレハロース二含水結晶の晶析工程において、汎用の晶析システム用プログラム恒温循環装置を用い、温度制御した熱媒体を助晶缶のジャッケットに流して、温度を60℃から20℃へ、前記式[2]に近似させた20段階の冷却プロファイルにて24時間かけて冷却する制御冷却法を適用することにより、トレハロース二含水結晶を晶析させた以外は、実施例2と同様の方法によりトレハロース二含水結晶含有粉末を製造し、無水物換算でトレハロースを99.7%、D-グルコースを0.05%、4-O-α-グルコシルトレハロースを0.03%、及び、6-O-α-グルコシルトレハロースを0.05%含有するトレハロース二含水結晶含有粉末を対澱粉収率約46%で得た。
 本トレハロース二含水結晶含有粉末のトレハロース二含水結晶についての結晶化度は96.8%、平均結晶子径は3,680Å、粉末全体の還元力は0.13%であった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験4-2で求めた解析値H100及びHを用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径53μm以上425μm未満の粒子が84.5%、粒径53μm以上300μm未満の粒子が76.2%、及び、粒径425μm以上の粒子が6.4%含まれていた。本品を用い、実験2-2、実験3-2等と同じ方法により固結性試験を行ったところ、「固結なし」(-)と判定された。また、実験5と同じ方法により水への溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判定された。
 本例の製造方法によれば、トレハロース二含水結晶含有粉末を、約46%という高い対澱粉収率で製造することができる。また、本製造方法によって製造されたトレハロース二含水結晶含有粉末は、食品素材などとして市販されている従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハ』、株式会社林原販売)と比べて、トレハロース純度においてそれほどの違いがないにもかかわらず、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末に比べて有意に固結し難い粉末であり、保存や取扱いが容易である。本品は、トレハロースの二含水結晶含有粉末である点では従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末と同様であり、保存や取り扱いが容易である分、食品素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとしてより好適に用いることができる。
比較例
<トレハロース二含水結晶含有粉末の製造>
 CGTaseとして、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス Tc-91株由来のCGTase酵素剤(株式会社林原製)を用いた以外は実施例1におけると同様にしてトレハロース生成反応及びグルコアミラーゼ処理を行ったところ、グルコアミラーゼ処理後の反応液における無水物換算でのトレハロース含量は85.2%であった。この反応液を、常法により活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂(H型)及びアニオン交換樹脂(OH型)にて脱塩し、減圧濃縮し、固形物濃度約84%の濃縮液とした。これを助晶缶にとり、試薬級のトレハロース二含水結晶含有粉末(商品名『トレハロース 999』、コード番号:TH224、トレハロース純度99.9%以上、株式会社林原販売)を種晶として1%加えて55℃とした。次いで、このトレハロース含有溶液を、穏やかに撹拌しつつ55℃から15℃まで20時間かけて自然冷却することにより、トレハロースの二含水結晶を晶析させた。バスケット型遠心分離機で結晶を回収し、結晶をマスキット重量に対し約5%の精製水でスプレーし洗浄した後、50℃で2時間、熟成、乾燥し、20℃の空気を20分間吹き付けて冷却し、粉砕して、無水物換算でトレハロースを98.5%、D-グルコースを0.8%、4-O-α-グルコシルトレハロースを0.07%、及び、6-O-α-グルコシルトレハロースを0.1%含有するトレハロース二含水結晶含有粉末を得たものの、その対澱粉収率は約38%であった。
 本トレハロース二含水結晶含有粉末のトレハロース二含水結晶についての結晶化度は88.3%、平均結晶子径は2,580Å、粉末全体の還元力は1.0%であった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験4-2で求めた解析値H100及びHを用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径53μm以上425μm未満の粒子が74.4%、粒径53μm以上300μm未満の粒子が69.4%、及び、粒径425μm以上の粒子が12.6%含まれていた。本品を用い、実験2-2、実験3-2等と同じ方法で固結性試験を行ったところ、「やや固結あり」(±)と判定された。また、実験5と同じ方法により水への溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判断された。
 以上のとおり、本発明のトレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法によれば、澱粉を原料として、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末と同様に高純度で、かつ、固結し難いトレハロース二含水結晶含有粉末を、高い対澱粉収率で製造することができる。特に、トレハロース二含水結晶の晶析工程において制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用する場合には、より高純度のトレハロース二含水結晶含有粉末を、より高い対澱粉収率で製造することができる。このように本発明の製造方法は、豊富に存在するとはいえ限られた資源である澱粉を原料として、より効率的にトレハロース二含水結晶含有粉末を工業的規模で製造することを可能にするものであり、その産業上の有用性には格別のものがある。また、制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用する本発明の製造方法によって製造されるトレハロース二含水結晶含有粉末は、従来の食品級のトレハロース二含水結晶含有粉末に比べ有意に固結し難い粉末であり、より取り扱いが容易な粉末状の食品素材、化粧品素材、医薬部外品素材、又は医薬品素材として、各種用途に使用することができるという優れた産業上の利用可能性を有している。斯くも顕著な作用効果を奏する本発明の産業上の有用性は極めて大きい。
図1において、
a:結晶子径の算出に用いる回折角(2θ)13.7°(ミラー指数(hkl):101)の回折ピーク
b:結晶子径の算出に用いる回折角(2θ)17.5°(ミラー指数:220)の回折ピーク
c:結晶子径の算出に用いる回折角(2θ)21.1°(ミラー指数:221)の回折ピーク
d:結晶子径の算出に用いる回折角(2θ)23.9°(ミラー指数:231)の回折ピーク
e:結晶子径の算出に用いる回折角(2θ)25.9°(ミラー指数:150)の回折ピーク
図5において、
a:制御冷却曲線
b:直線冷却
c:自然冷却曲線
図6において、
pUC ori:プラスミドpUC由来複製開始点
T7:T7プロモーター
白矢印(Amp):アンピシリン耐性遺伝子
黒矢印:CGTase遺伝子

Claims (6)

  1.  液化澱粉に、澱粉枝切酵素及びシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに、アルスロバクター属微生物由来のα-グリコシルトレハロース生成酵素とアルスロバクター属微生物由来のトレハロース遊離酵素を作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させてα,α-トレハロース含有糖液を得る工程、前記糖液から、α,α-トレハロース二含水結晶を晶析させる工程、及び、晶析したα,α-トレハロース二含水結晶を遠心分離により採取し、これを熟成、乾燥する工程を含むα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法であって、前記シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとしてパエニバチルス属微生物由来の天然型若しくは組換え型酵素又はそれらの変異体酵素を用いることにより、カラムクロマトグラフィーによる分画工程を経ることなく、前記糖液中のα,α-トレハロース含量を無水物換算で86.0質量%超とすることを特徴とする、無水物換算でα,α-トレハロースを98.0質量%以上含有するα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法。
  2.  前記パエニバチルス属微生物が、パエニバチルス・イリノイセンシス、パエニバチルス・パブリ、又は、パエニバチルス・アミロリティカスである請求項1記載のα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法。
  3.  前記シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼが、下記(a)乃至(d)に示す部分アミノ酸配列を有する酵素である請求項1又は2記載のα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法:
    (a)Gly-Ser-X-Ala-Ser-Asp;
    (b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn;
    (c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys;
    (d)Val-Asn-Ser-Asn-X-Tyr。
    (但し、XはAla又はSerを、XはAla又はThrをそれぞれ意味する。)
  4.  前記シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼが、配列表における配列番号1、2、3、12又は13のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼである請求項1乃至3のいずれかに記載のα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法。
  5.  前記α,α-トレハロース二含水結晶を晶析させる工程が、制御冷却法又は擬似制御冷却法によって行われる請求項1乃至4のいずれかに記載のα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末の製造方法。
  6.  請求項5記載の製造方法によって得られる、無水物換算でα,α-トレハロースを99.0質量%以上99.6質量%以下含有し、粉末X線回折プロフィルに基づき算出されるα,α-トレハロース二含水結晶についての結晶化度が90.0%以上96.0%以下であるα,α-トレハロース二含水結晶含有粉末。
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