CN103946386B

CN103946386B - 含有α,α‑海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法

Info

Publication number: CN103946386B
Application number: CN201280055581.8A
Authority: CN
Inventors: 涩谷孝; 伊泽精祐
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2018-01-02
Anticipated expiration: 2032-09-12
Also published as: KR20140077931A; AU2016204318A1; CN107446007A; EP2759600A1; US20150040889A1; JP5714764B2; JP2019129851A; AU2016204318B2; JP2015172079A; TWI585203B; PH12016501348A1; TW201723184A; TW201631149A; US10196416B2; PL2759600T3; ZA201402839B; MX2014003506A; JP5770956B2; US20160108075A1; WO2013042587A1

Abstract

提供的是制备方法，所述制备方法可以，将淀粉作为原料，通过连续的步骤，以优异的对淀粉收率，制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末。通过提供含有基于无水物换算的98.0质量％以上的α,α‑海藻糖的α,α‑海藻糖二水合物晶体粉末的制备方法而解决上述课题，所述含有α,α‑海藻糖二水合物的晶体粉末的制备方法含有如下步骤，使异淀粉酶和环麦芽糖糊精‑葡聚糖转移酶与来源于节杆菌属微生物的α‑糖基海藻糖合酶和来源于节杆菌属微生物的海藻糖分离酶作用于液化淀粉，接着，使葡糖淀粉酶发挥作用，得到含有α,α‑海藻糖的糖液的步骤，从上述糖液，使α,α‑海藻糖二水合物晶体结晶的步骤，以及，通过离心分离而收集结晶的α,α‑海藻糖二水合物晶体，使其熟化、干燥的步骤，所述方法特征是，通过使用作为上述环麦芽糖糊精‑葡聚糖转移酶的来源于类芽孢杆菌属微生物的天然型或者重组型酶或者它们的突变体酶，不经过采用柱色谱法的分馏步骤，使得上述糖液中的α,α‑海藻糖含量超过基于无水物换算的86.0质量％。

Description

含有α,α-海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法

【技术领域】

本发明，涉及含有α,α-海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法，详细地说，涉及含有α,α-海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法和通过所述制备方法得到的含有α,α-海藻糖二水合物晶体的粉末，所述方法从淀粉，通过连续的步骤，以优异收率，适于工业地制备含有高纯度的α,α-海藻糖二水合物晶体的粉末。

【背景技术】

作为含有α,α-海藻糖(在下文，本说明书简称为“海藻糖”。)的二水合物晶体的粉末的制备方法，迄今为止已知多种方法。例如，专利文献1中公开了制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末的方法，所述方法使β-淀粉酶或者β-淀粉酶和异淀粉酶作用于液化淀粉，接着，使麦芽糖·海藻糖转换酶作用于液化淀粉，得到含有海藻糖的糖液，将其适宜精制后，使海藻糖结晶，从而制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末，专利文献2中公开了制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末的方法，所述方法使异淀粉酶和α-糖基海藻糖合酶(别称“非还原性碳水化合物合酶”)以及海藻糖分离酶作用于液化淀粉，此外使葡糖淀粉酶作用于液化淀粉，得到含有海藻糖的糖液，将其适宜精制后，使海藻糖结晶，从而制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末。

此外，专利文献3、4中公开了含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法，所述方法在专利文献2中公开的上述制备方法中，联用异淀粉酶和环麦芽糖糊精-葡聚糖转移酶(在下文，简称为“CGT酶”。)，通过使上述的酶与α-糖基海藻糖合酶以及海藻糖分离酶一同发挥作用，使得上述含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量升高。此外，专利文献5、6中，公开了制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末的方法，所述方法使来自属于硫化叶菌属(Sulfolobus)的微生物的耐热性的α-糖基海藻糖合酶，或者耐热性的α-糖基海藻糖合酶和耐热性的海藻糖分离酶作用于液化淀粉，得到含有海藻糖的糖液，将其适宜精制后，使海藻糖结晶，从而制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末。

在这些公知的制备方法中，采用上述专利文献3、4中公开的各酶的组合情况下，将液化淀粉作为原料、不经过采用柱色谱法的分馏步骤，仅仅通过酶反应，可以容易地制备含有海藻糖的糖液，所述糖液海藻糖含量基于无水物换算超过80质量％，并且，如此制备的含有海藻糖的糖液的组分除海藻糖以外，大部分是葡萄糖，因此，具有海藻糖结晶性好的优点。因此，在采用上述专利文献3、4中公开的制备方法的情况下，使海藻糖二水合物晶体由上述含有海藻糖的糖液结晶，通过离心分离收集晶体的分蜜方式，可以以优异收率制备含有较高纯度海藻糖二水合物晶体的粉末。

具体地说，在上述专利文献3、4中公开的制备方法中，在使用α-糖基海藻糖合酶以及作为海藻糖分离酶的来自属于节杆菌属(Arthrobacter)的微生物的酶的情况下，属于节杆菌属的微生物繁殖较快，此外，上述酶生产力也高，因此，在适于工业规模制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末方面是极其有利的。由于这个原因，本申请人，现在，使用α-糖基海藻糖合酶以及作为海藻糖分离酶的来自属于节杆菌属的微生物的酶，通过上述专利文献3、4中公开的制备方法，制备含有高纯度海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“トレハ”、株式会社林原销售、制品规格的海藻糖纯度:98.0质量％以上。在下文，称为“食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末”。)，所述高纯度海藻糖二水合物晶体的粉末主要作为食品原料、化妆品原料等销售。但是，真实的情况是，在采用本发明制备方法情况下，目前，即使在将多种酶反应条件最优化的情况下，通过酶反应得到的含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量，基于无水物换算也仅仅为约85质量％左右，对淀粉收率达不到40质量％。

一方面，非专利文献1、2中公开了，通过使来自硫矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)的耐热性α-糖基海藻糖合酶、耐热性海藻糖分离酶以及耐热性异淀粉酶的各基因分别由大肠杆菌表达而制备的重组酶、或将部位特异的变异另外导入所述重组酶从而制造的突变体酶组合作用于可溶性淀粉，得到海藻糖含量基于无水物换算为87质量％左右的含有海藻糖的糖液。

但是，非专利文献1、2中，作为原料使用的可溶性淀粉是通过经由酸处理淀粉除去淀粉粒内无定形部分而制备的非常特殊且昂贵的原料，即使得到例如海藻糖含量升高的酶反应液，将可溶性淀粉用作含有海藻糖二水合物晶体的粉末的适于工业的生产用的原料，从成本的角度看，绝对是不可能的。此外，非专利文献1、2中公开的重组酶或突变体酶没有作用于可溶性淀粉，而是作用于适于工业规模制备中使用的液化淀粉，在这种情况下，通过酶反应得到的含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量当然少于87质量％左右，仅为85质量％左右，无法预期，可以将含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率提高至目前的制备方法所能得到的收率以上的程度。

此外，如果仅仅将含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量提高至86.0质量％以上，可以考虑，针对含有海藻糖的糖液应用使用柱色谱法的柱分馏，收集含有大量海藻糖的级分。但是，如果进行柱分馏，仅仅因为步骤增加就导致制备成本，此外，必然损失作为含有大量海藻糖的级分而收集的级分以外的级分中包含的海藻糖，因此，假设，即使通过柱分馏，得到基于无水物换算的海藻糖含量超过86.0质量％的含有海藻糖的糖液，收集由所述糖液结晶的海藻糖二水合物晶体，制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末，也不能避免对淀粉收率大幅度降低。

此外，如果仅仅提高单一的对淀粉收率，也可以考虑采用所谓的全糖方式:不采用通过离心分离收集结晶的晶体的分蜜方式，而将含有结晶的晶体的糖膏取出并将其放入容器，使全部糖膏进行晶体固化，将晶体固化的糖膏粉碎，或者，喷雾干燥糖膏，得到粉末。但是，存在以下不方便，在采用全糖方式情况下，结晶的海藻糖以及糖膏中包含的葡萄糖的这样的制备方法中特有的共同的杂质均共同被粉末化，因此，得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末中的海藻糖含量不高于糖膏的海藻糖含量以上，不能得到含有高纯度的海藻糖二水合物晶体的粉末。

虽然淀粉是现在较丰富存在、便宜、容易地获得的原料，但是，不是绝对无限存在的物质，限于一年期间地球人类生产的淀粉的总量。同时，淀粉的用途广泛，除了迄今为止的适于工业的用途、食品用，饲料用，或者作为食品原料的用途之外，近年，由于大量需要清洁能量，淀粉也被新用作生物乙醇等的燃料原料。在这样的情况下，从有效利用有限的资源方面来看，提高制品，即，含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率是极其重要的。

【现有技术文献】

【专利文献】

【专利文献1】特开平7-170977号公报

【专利文献2】特开平7-213283号公报

【专利文献3】特开平8-73504号公报

【专利文献4】特开2000-228980号公报

【专利文献5】特开平8-66188号公报

【专利文献6】特开平8-66187号公报

【非专利文献】

【非专利文献1】ファン(Fang)等人、ジャ一ナル·オブ·アグリカルチュラル·アンド·フ一ド·ケミストリ一(Journal of Agricultural and Food Chemistry)、2007年、第55卷、5588至5594页

【非专利文献2】ファン(Fang)等人、ジャ一ナル·オブ·アグリカルチュラル·アンド·フ一ド·ケミストリ一(Journal of Agricultural and Food Chemistry)、2008年、第56卷、5628至5633页

【发明概述】

【发明解决的课题】

本发明的目的是，克服上述以往含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法中的不方便，保持海藻糖的纯度，显著提高含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率，因此，本发明的课题是提供含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法和通过所述制备方法制备的新的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，所述方法可以将淀粉作为原料、通过连续的步骤、以优异收率、适于工业的规模制备含有高纯度的海藻糖二水合物晶体的粉末。

【为了解决课题的手段】

为了解决上述的课题，本发明人，针对上述专利文献3、4中公开的制备方法使用的多种酶的组合，反复进行多种研究和尝试失败，结果发现，当作为α-糖基海藻糖合酶以及海藻糖分离酶，使用来源于微生物培养容易、酶生产力也高的属于节杆菌属的微生物的酶时，作为与这些酶一同使用的CGT酶，不采用迄今使用的来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属(Geobacillus stearothermophilus)Tc-91株(FERM BP-11273)的CGT酶，而使用来源于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)微生物的天然型或者重组型CGT酶或者它们的突变体酶，从而使海藻糖生成反应效率更加优异地进行，不经过采用柱色谱法的分馏步骤，可以将葡糖淀粉酶处理步骤后的含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量提高至，基于无水物换算的86.0质量％水平以上，优选87.0质量％以上。发现，然后，按照常规方法，将如此得到的含有海藻糖的糖液脱色、脱盐，浓缩，使海藻糖二水合物晶体结晶、通过离心分离收集得到的晶体，使其熟化，干燥，可以以比以往更加高的对淀粉收率制备含有高纯度的海藻糖二水合物晶体的粉末，所述粉末含有基于无水物换算的98.0质量％以上的海藻糖，从而完成本发明。

即，本发明通过提供含有基于无水物换算的98.0质量％以上的海藻糖的海藻糖二水合物晶体的制备方法，解决上述课题，所述制备方法是含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法，所述方法含有如下步骤:使异淀粉酶、以及CGT酶、和来源于节杆菌属微生物的α-糖基海藻糖合酶、和来源于节杆菌属微生物的海藻糖分离酶作用于液化淀粉，接着，使葡糖淀粉酶发挥作用，从而得到含有海藻糖的糖液的步骤，从上述糖液使海藻糖二水合物晶体结晶的步骤，以及，通过离心分离而收集结晶的海藻糖二水合物晶体，使其熟化、干燥的步骤，所述方法特征是，通过使用作为上述CGT酶的来源于类芽孢杆菌属微生物的天然型或者重组型酶或者它们的突变体酶，不经过采用柱色谱法的分馏步骤，使得上述糖液中的海藻糖含量超过基于无水物换算的86.0质量％。

根据本发明人确认，通过上述本发明制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖纯度相当良好，流动性良好，是与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比毫不逊色的粉末，所述粉末，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末同样，可以在作为食品原料、化妆品原料等广泛的领域中使用。

此外，作为CGT酶的供给源的属于上述类芽孢杆菌属的微生物，包括例如，依利诺斯类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)、饲料类芽孢杆菌(Paenibacilluspabuli)，或者，溶淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)，其中，依利诺斯类芽孢杆菌或者饲料类芽孢杆菌，因为产生提高海藻糖生成反应反应液中的海藻糖含量效果大的CGT酶，所以是优选的，尤其是优选依利诺斯类芽孢杆菌。

此外，作为上述CGT酶，尤其是，适宜地使用的是具有下述(a)至(d)中显示的部分氨基酸序列的酶:

(a)Gly-Ser-X₁-Ala-Ser-Asp；

(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn；

(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys；

(d)Val-Asn-Ser-Asn-X₂-Tyr。

(其中，X₁意指Ala或者Ser，X₂意指Ala或者Thr。)

此外，为了举例说明作为本发明使用的CGT酶的其他适宜的酶，可以举出具有序列表序列编号1、2、3、12或者13中的任一个所示的氨基酸序列的CGT酶。

本发明人，进一步反复进行尝试经历失败，结果发现，当由含有基于无水物换算的超过86.0质量％、优选87.0质量％以上的海藻糖的上述含有海藻糖的糖液使海藻糖二水合物结晶时，如果应用下文所述的控制冷却法或者拟似控制冷却法，与通过使含有海藻糖的糖液的温度自然降低的自然冷却法而使海藻糖二水合物结晶的情况相比，可以进一步提高得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率。即，本发明也通过提供如下含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法，解决上述的课题，所述方法，在上述本发明制备方法中，使上述海藻糖二水合物晶体结晶的步骤，通过控制冷却法或者拟似控制冷却法进行。

此外，虽然当应用控制冷却法或者拟似控制冷却法时，提高对淀粉收率的原因不确定，但是，通过控制冷却法或者拟似控制冷却法，在结晶初期中，抑制冷却导致的突然的过饱和度的上升和第二次的晶体核的形成，大小几乎一致的微小晶体核多数生成，在微小晶体核多数都出现的结晶后期中通过快速冷却，使得大小一致的多数晶体核同时成长，因此，得到含有微晶体少的粒径连续的晶体的糖膏，采用离心分离容易地收集晶体，通过较少量的水可以洗涤收集的晶体，因此，可以推测的是，也减少洗涤时的海藻糖的损失。

另外，本发明人发现，如上所述地，在海藻糖二水合物晶体的结晶时，通过应用控制冷却法或者拟似控制冷却法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，与通过自然冷却法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末和以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，出人意料地在固结难方面出色。然后，确认这样的出色的物性是由含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖纯度和海藻糖二水合物晶体的结晶度的差异造成的，从而完成关于含有海藻糖二水合物晶体的粉末本身的本发明。

即，本发明通过提供含有海藻糖二水合物晶体的粉末，解决上述的课题，所述粉末通过本发明制备方法得到，所述方法当使海藻糖二水合物晶体结晶时，应用上述控制冷却法或者拟似控制冷却，所述海藻糖二水合物晶体的粉末含有基于无水物换算的99.0质量％以上且99.6质量％以下的海藻糖、基于粉末X射线衍射图谱算出的海藻糖二水合物晶体的结晶度是90.0％以上且96.0％以下。

此外，根据本发明人确认，含有基于无水物换算的99.0质量％以上且99.6质量％以下的海藻糖、基于粉末X射线衍射图谱算出的海藻糖二水合物晶体的结晶度是90.0％以上且96.0％以下的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，海藻糖含量与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末具有相同程度或稍高程度，同时，海藻糖二水合物晶体的结晶度与食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比显著更高，是可以与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末区分开的新粉末。

此外，虽然不确定通过应用控制冷却法或者拟似控制冷却法，得到固结难的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的原因，但是，推测可能原因是，通过控制冷却法或者拟似控制冷却法，如上所述，得到了含有微晶体少的粒径连续的晶体的糖膏，因此，得到的粉末的海藻糖的纯度和海藻糖二水合物晶体的结晶度提高。所述推测也通过以下事实得到支持:通过应用控制冷却法或者拟似控制冷却法得到的本发明的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖二水合物晶体结晶度，与自然冷却得到的粉末和以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖二水合物晶体结晶度相比，显著更高。

【发明的效果】

通过本发明制备方法，使用培养容易、酶生产力也高的来自属于节杆菌属的微生物的α-糖基海藻糖合酶和海藻糖分离酶，将淀粉作为原料，通过连续的步骤，可以以优异的对淀粉收率、适于工业的规模制备含有高纯度的海藻糖二水合物晶体的粉末。因此，造成的出色的优点是，归功于作为原料的淀粉资源的有效利用。具体地说，存在如下优点，当使海藻糖二水合物晶体从含有海藻糖的糖液结晶时，在应用控制冷却法或者拟似控制冷却法的情况下，可以进一步提高制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率。此外，通过应用控制冷却法或者拟似控制冷却法的本发明制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，是海藻糖纯度以及海藻糖二水合物晶体的结晶度更高、在固结难方面出色的粉末。

【附图的简要说明】

【图1】是基本上由海藻糖二水合物晶体组成的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的由特征X射线产生的粉末X射线衍射图谱的一个例子。

【图2】是基本上由无定形部分组成的海藻糖粉末的由特征X射线产生的粉末X射线衍射图谱的一个例子。

【图3】是基本上由海藻糖二水合物晶体组成的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的由同步加速器放射光产生的粉末X射线衍射图谱的一个例子。

【图4】是基本上由无定形部分组成的海藻糖粉末的由同步加速器放射光产生的粉末X射线衍射图谱的一个例子。

【图5】是显示各种冷却图谱的图。

【图6】是表示含有来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株的CGT酶的基因的重组DNA“pRSET-iPI”的构成以及相同的重组DNA的制限酶识别部位的图。

【发明实施方式】

1.术语的定义

本说明书中以下的术语具有以下含义。

<对淀粉收率>

本说明书所说的“对淀粉收率”是以百分率(％)表示的比例，所述比例是得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的基于无水物换算的质量与单位质量的比例，所述单位质量是原料淀粉的基于无水物换算的单位质量。此外，在本说明书中，将淀粉作为原料，使酶作用于淀粉，通过所谓的生成海藻糖、使生成的海藻糖被结晶、收集、熟化、干燥的一系列的连续的步骤，制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末，这被作为前提，因此，本说明书所说的“对淀粉收率”含义是，由使酶作用于淀粉而得到的从含有海藻糖的糖液最初结晶的、所谓的由第一晶体制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率，本说明书所说的“对淀粉收率”不包含由第二晶体以后制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，所述第二晶体是将收集结晶的晶体之后残留的糖液或由糖膏分离的糖浆等返回糖液而进行再度结晶的、所谓的第二晶体。此外，在添加晶种而进行结晶的情况下，对淀粉收率的算出中的晶种的量，在本说明书的通篇，包含在得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的量中。

<CGT酶的活性>

在本说明书中“CGT酶的活性”如以下一样定义。即，对于含0.3％(w/v)可溶性淀粉、20mM醋酸缓冲液(pH5.5)、1mM氯化钙的底物水溶液5ml，加适宜稀释的酶液0.2ml，将底物溶液保持在40℃，反应第0分钟及反应第10分钟各采样0.5ml底物溶液，立即加至0.02N硫酸溶液15ml而停止反应之后，向各硫酸溶液各加0.2ml的0.1N碘溶液而呈色，10分钟后，由吸光光度计各自测定波长660nm中的吸光度，由下述式[1]作为淀粉分解活性算出。CGT酶的活性1单位定义为在这样的测定条件下，使溶液中的淀粉15mg的碘呈色完全地消失的酶的量。

式[1]:

【数学公式1】

<控制冷却法>

本说明书中所说的“控制冷却法”是指由“控制的冷却”使晶体结晶的方法，作为结晶步骤设定的操作时间设为“τ”、结晶开始时的液温设为“T₀”、结晶结束时的目标液温设为“T_f”、时间“t”中的液温设为“T”，则时间t中的液温T在原则上对应于下述式[7]表示的冷却方法。

式[2]:

【数学公式2】

T＝T₀-(T₀-T_f)(t/τ)³

如果使用作为结晶步骤设定的操作时间作为横轴、将结晶时的液温作为纵轴的图更加具体(模式化地)表示控制冷却法，如同图5的符号a所显示。如同图5的符号a中所显示的，通过控制冷却法，在液温高的结晶初期中，缓慢降低液温，在液温降低至某一程度的结晶后期中，快速降低液温，将t＝τ/2的时间点、即、结晶步骤的中间点的液温“T_m”维持在，至少T_m>[(T₀-T_f)/2+T_f]的关系(即、结晶步骤的中间点的温度变化不足总温度变化的50％)。在这种液温的对应于时间的变化图谱方面，控制冷却法明确地区别于，历经液温从T₀开始到T_f的时间τ直线降低的直线冷却(图5的符号b)和通常的自然冷却法(图5的符号c)，所述自然冷却法在液温高的结晶初期中，液温以指数函数方式快速降低，到了液温降低的结晶后期，则缓慢降低液温。此外，使液温T作为上述式[2]表示的时间t的函数而变化时，也可以使用例如，市售的广泛使用的结晶系统用程序恒温循环装置等。

在结晶步骤中应用这样的控制冷却法的情况下，添加海藻糖的晶种后，在结晶初期中，液温的冷却缓慢进行，因此，抑制了冷却导致的突然的过饱和度的上升和第二次的晶体核的形成，可以优先成长以添加的晶种作为晶体核的晶体。一方面，得到的优点是，在以添加的晶种作为晶体核的晶体都出现的结晶后期中，通过快速冷却液温，使得都出现的晶体同时成长，因此，通过控制冷却法，得到了含有微晶体少的粒径连续的晶体的糖膏。此外，关于“控制冷却法”，在例如，“久保田徳昭著、“分かり易いバッチ晶析”、分离技术会、平成22年4月30日公开、32～47页”中详细描述。

<拟似控制冷却法>

本说明书所说的“拟似控制冷却法”是指与上文文字所述的控制冷却法相拟似的冷却法，意指使液温T相对于时间t连续地或者分阶段地降低的冷却法，其中，液温T相对于时间t的变化不是严格地遵循上述式[2]，也根据结晶中使用的含有海藻糖的溶液的海藻糖纯度、浓度、过饱和度、晶种的量等使液温T相对于时间t连续地或者分阶段地降低，但是，优选的是在操作时间t＝τ/2的时间点(结晶步骤的中间点)，晶体核大部分都出现，因此，维持t＝τ/2的时间点的液温T的变化量(T₀-T_m)在总温度变化量(T₀-T_f)的5％以上但是不足50％，优选，10％以上但是不足30％的范围。在使液温T相对于时间t连续地或者分阶段地降低，使得t＝τ/2的时间点的液温T的变化量(T₀-T_m)是总温度变化量(T₀-T_f)的5％以上但是不足50％的情况下，在液温高的结晶初期中，液温T是相对于时间t缓慢降低，在液温降低至某一程度的结晶后期中，液温T是相对于时间t快速降低，结果是，虽然存在不如上述的控制冷却法的情况，但是，得到了与控制冷却法几乎同样的优点，即，得到了含有微晶体少的粒径连续的晶体的糖膏。

具体地说，存在的优点是，优选的是，例如，将操作时间τ分为至少2个，优选3个以上的区间，在结晶步骤的初期的区间中，使冷却的温度梯度温和(减慢冷却速度)，随着初期至由中期趋向后期，增大温度梯度(加快冷却速度)，使得液温T相对于时间t连续地或者分阶段地降低，使得t＝τ/2的时间点的液温T的变化量(T₀-T_m)是总温度变化量(T₀-T_f)的5％以上但是不足50％，优选，10％以上但是不足30％。在t＝τ/2的时间点的液温T的变化量(T₀-T_m)是总温度变化量(T₀-T_f)的50％以上的情况下，结晶初期的冷却速度过快，有可能通过冷却导致的突然的过饱和度的上升形成第二次的晶体核，在是不足5％的情况下，结晶初期的冷却速度是过慢，以添加的晶种作为晶体核的晶体不能充分都出现，迎接到的是快速的冷却开始的结晶后期，无论由于上述两种情形中的任何一种，都难以得到含有微晶体少的粒径连续的晶体的糖膏。

虽然，在进行上述的控制冷却法中，必要的是，使液温T作为式[2]表示的时间t的函数而变化，必须的是，通过设定的程序可以控制液温的装置和结晶罐，但是，优选的是，通过拟似控制冷却法，使得液温T相对于时间t连续地或者分阶段地降低，从而使得t＝τ/2的时间点的液温T的变化量(T₀-T_m)是总温度变化量(T₀-T_f)的5％以上但是不足50％，优选，10％以上但是不足30％，因此，在拟似控制冷却法中，即使在没有精密地控制液温的设备的情况下，也可以较容易地实施。

<结晶度>

本说明书所说的“海藻糖二水合物晶体的结晶度”是指下述式[3]所定义的数值。

式[3]:

【数学公式3】

H₁₀₀:对于由基本上由海藻糖二水合物晶体组成的含有海藻糖二水合物晶体的粉末标准样品粉末X射线衍射图谱求出的结晶度的解析值

H₀:对于由基本上由无定形部分组成的含有海藻糖二水合物晶体的粉末标准样品粉末X射线衍射图谱求出的结晶度的解析值

H_s:对于由成为被验样品的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的粉末X射线衍射图谱求出的结晶度的解析值

在式[3]中，成为求出解析值H₁₀₀、H₀、Hs的基础的粉末X射线衍射图谱，通常，可以通过具备反射式或者透过式的光学系统的粉末X射线衍射装置而被测定。粉末X射线衍射图谱包含受试样品或者标准样品中包含的海藻糖二水合物晶体的衍射角以及衍射强度，作为由这样的粉末X射线衍射图谱确定关于结晶度的解析值的方法，包括例如，Hermans法，Vonk法等。在这些解析方法中，因为Hermans法的简便和精度，适宜使用Hermans法。目前，这些解析方法，任何一个均被计算机软件化，因此，有利的是，使用具备装载有这样的计算机软件中的任一个的解析装置的粉末X射线衍射装置。

此外，作为求出解析值H₁₀₀的“基本上由海藻糖二水合物晶体组成的含有海藻糖二水合物晶体的粉末标准样品”，使用的是海藻糖纯度是99.9质量％以上(在下文，除非另有说明，在本说明书中，质量％略记为“％”。但是，本说明书所说的结晶度相关的％不在此限。)的粉末或者单晶，其粉末X射线衍射图谱中，显示海藻糖二水合物晶体所特有的衍射峰，所述粉末或者单晶基本上由海藻糖二水合物晶体组成。作为这样的粉末或者单晶，包括作为本申请人分析用试剂销售的含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“海藻糖999”、代码编号:TH224、海藻糖纯度99.9％以上、株式会社林原销售)，或者将其再结晶而得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末或者海藻糖二水合物晶体的单晶。此外，在通过采用Hermans法的计算机软件解析粉末标准样品的粉末X射线衍射图谱的情况下，解析值H₁₀₀，通常，为50.6至50.9％左右，所述粉末标准样品的粉末是基本上由海藻糖二水合物晶体组成的上述含有海藻糖二水合物晶体的粉末。

一方面，作为求出解析值H₀的“含有基本上由无定形部分组成的海藻糖的粉末标准样品”，使用的是海藻糖纯度是99.9％以上的、基本上由无定形部分组成的粉末。作为这样的粉末，包括如下得到的粉末，例如，将上述的求出解析值H₁₀₀的标准样品溶解于适量纯化水，浓缩后，冷冻干燥，进一步真空干燥直到根据卡尔·费歇尔法确定的水分含量为2.0％以下，由此得到粉末。根据经验可知，在实施了这样的处理的情况下，得到的是基本上由无定形部分组成的粉末。但是，一般而言，即使是基本上由无定形部分组成的粉末，如果借助粉末X射线衍射装置、通过Hermans法，Vonk法等解析得到的粉末X射线衍射图谱，由于实施这些各解析法的计算机软件的算法而运算来源于无定形部分的散射光的一部分，解析值不一定总是0％。此外，在通过采用Hermans法的计算机软件解析粉末X射线衍射图谱的情况下，解析值H₀通常是8.5至8.7％左右，所述粉末X射线衍射图谱是基本上由无定形部分组成的上述含有海藻糖的粉末标准样品的粉末X射线衍射图谱。

<平均微晶径>

一般而言，认为含有晶体的粉末的1个粉末粒子是通过多个单晶，即，多个微晶构成。可以认为，含有晶体的粉末的微晶的大小(微晶径)反映在含有晶体的粉末的特征。本说明书所说的“海藻糖二水合物晶体的平均微晶径”(在下文，仅仅称为“平均微晶径”。)是意指如下算出的微晶径的平均值，对含有海藻糖二水合物晶体的粉末进行粉末X射线衍射分析，在得到粉末X射线衍射图谱中检测出的衍射峰之中，选择 5个衍射峰，即，衍射角(2θ)13.7°(米勒指数(hkl):101)、17.5°(米勒指数:220)、21.1°(米勒指数:221)、23.9°(米勒指数:231)以及25.9°(米勒指数:150)的衍射峰(参照图1的符号a至e)，所述5个衍射峰在对起因于微晶的不均一失真的衍射峰幅的影响少的较低角度的范围中，与其他衍射峰良好分离，分别使用所述5个衍射峰的半宽度和衍射角，基于使用硅(美国国立标准技术研究所(NIST)、X射线衍射用标准样品(“Si640d”)作为标准品时的测定值进行补正后，通过下述式[4]中显示的“Scherrer(シェラ一)的公式”分别算出所述微晶径的平均值。

式[4]:

【数学公式4】

D:微晶的大小

λ:X射线的波长

β:衍射线幅(rad)

θ:衍射角(°)

K:常数(β使用半宽度(半宽)时为0.9)

在一般的粉末X射线衍射装置中，装载了用于算出这样的微晶径的计算机软件，因此，只要可以得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末，就可以较容易地测定所述含有晶体的粉末的海藻糖二水合物晶体的平均微晶径。此外，受试样品使用的是，在粉末X射线衍射分析之前，将受试样品通过乳钵磨碎后，通过53μm的筛而筛分，通过筛的粉末。

<还原力>

关于本说明书所说的“粉末全体的还原力”，可以如下通过使用下述式[5]计算而求出对于粉末中包含的全糖量的还原糖量的百分率(％)，使用D-葡萄糖作为标准物质，根据本领域中广泛使用的Somogyi-Nelson法以及anthrone硫酸法，分别求出基于D-葡萄糖换算的还原糖量以及全糖量。

式[5]:

【数学公式5】

<粒度分布>

本说明书中，粉末的粒度分布如下确定。即，依照日本工业规格(JISZ8801-1)，正确称量孔径(目開き)是425、300、212、150、106、75以及53μm的金属制网筛(株式会社飯田制作所制)之后，按照这种顺序将上述金属制网筛重叠并安装至Ro-tap筛振荡机(株式会社田中化学機械制备所制、商品名为“R-1”)，接着，将秤取的一定量的样品装载放置于最上层的筛(孔径425μm)上，在保持筛重叠的状态下，振荡15分钟后，再次正确称量各筛，从再次正确称量各筛所得的质量样品减去装载放置前的质量，从而，求出通过各筛筛除的粉末的质量。在这之后，计算由各筛筛除的具有各粒度的粉末质量对于装载放置于筛上的样品的质量的百分率(％)，用所述百分率表示粒度分布。

2.本发明的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法

本发明制备方法，基本上包含以下(1)至(6)的步骤:

(1)使来自属于节杆菌属的微生物的α-糖基海藻糖合酶和来源于节杆菌属微生物的海藻糖分离酶、异淀粉酶、以及来源于类芽孢杆菌属微生物的天然型或者重组型CGT酶或者它们的突变体酶一同作用于液化淀粉溶液，生成海藻糖的海藻糖生成步骤；

(2)使葡糖淀粉酶作用于含有通过海藻糖生成步骤得到的海藻糖的反应液的葡糖淀粉酶处理步骤；

(3)对含有海藻糖的反应液进行过滤、脱色、脱盐、浓缩的精制浓缩步骤；

(4)使含有海藻糖的浓缩液中含有海藻糖二水合物晶体晶种，使海藻糖二水合物晶体结晶的步骤；

(5)通过离心分离由在结晶步骤中得到的糖膏，收集海藻糖二水合物晶体的步骤；

(6)使收集的海藻糖二水合物晶体熟化，干燥，必要时使收集的海藻糖二水合物晶体粉碎的步骤。

在下文，依次说明上述(1)至(6)的步骤。

<(1)的步骤(海藻糖生成步骤)>

所述步骤，使来源于节杆菌属微生物的α-糖基海藻糖合酶、同样来源于节杆菌属微生物的海藻糖分离酶、异淀粉酶、以及来源于类芽孢杆菌属微生物的天然型或者重组型CGT酶或者它们的突变体酶一同作用于原料液化淀粉，生成海藻糖。

α-糖基海藻糖合酶是，作用于液化淀粉，生成在分子的末端具有海藻糖结构的α-糖基海藻糖的酶，另一方面，海藻糖分离酶是，作用于α-糖基海藻糖，分离海藻糖的酶。因此，如果使异淀粉酶和与之联用的α-糖基海藻糖合酶和海藻糖分离酶作用于，将淀粉糊化-液化而得到的液化淀粉，那么可以效率优异地制备海藻糖。

海藻糖的制备中使用的原料淀粉可以是，玉米(トゥモロコシ)淀粉、米淀粉、小麦淀粉等的地上淀粉，也可以是马铃薯淀粉、甘薯淀粉、木薯淀粉等的地下淀粉，此外，也可以是，采用酸或者淀粉酶将这些淀粉部分分解而得到的淀粉部分分解物。通常，将原料淀粉在水中悬浮，从而制成浓度约10至50％的淀粉乳，在耐热性α-淀粉酶的存在下，通过加热，糊化-液化原料淀粉。将液化淀粉的液化的程度调整为，葡萄糖·当量(DE)通常不足10，详细地说，不足5。

作为来源于节杆菌属微生物的α-糖基海藻糖合酶以及来源于节杆菌属微生物的海藻糖分离酶，可以利用例如，特开平7-143876号公报、专利文献2至4等中公开的酶。此外，也可以是本申请人的特开平7-322880号公报、特开平7-322883号公报、特开平7-298887号公报、特开平7-298880号公报、专利文献4等中公开的重组型的α-糖基海藻糖合酶以及海藻糖分离酶，此外，也可以是在这些酶中导入部位特异的变异等而改良的突变体酶。尤其是，适宜地使用的是，来源于专利文献4中公开的节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)S34(FERMBP-6450)或者其大量生产酶的变异株的α-糖基海藻糖合酶以及海藻糖分离酶。

本发明制备方法中，作为异淀粉酶，可以使用本领域广泛使用的异淀粉酶或者出芽短梗孢糖酶。可以使用市售的酶类试剂，也可以使用由微生物分离的酶类。作为异淀粉酶，适宜的是，例如，熟知的来源于淀粉皮假单胞菌(Pseudomonas amyloderamosa)的以及来源于樟味香味菌(Myroides odoratus)的异淀粉酶，尤其是，来源于淀粉皮假单胞菌的异淀粉酶类试剂(株式会社林原制)。作为出芽短梗孢糖酶类试剂，包括例如，来源于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的出芽短梗孢糖酶(株式会社林原销售)、来源于解淀粉出芽短梗孢糖芽孢杆菌(Bacillus amylopullulyticus)的出芽短梗孢糖酶(商品名为“プロモザイム”、ノボザイムズ·ジャパン株式会社销售)等。

上述海藻糖生成步骤的CGT酶的作用，主要是，通过CGT酶催化的歧化反应(直链糖分子间转变反应、Disproportionation)，将采用α-糖基海藻糖合酶以及海藻糖分离酶的海藻糖生成反应过程中必然生成的葡萄糖聚合度4以下的麦芽低聚糖转换为葡萄糖聚合度5以上的麦芽低聚糖，使上述海藻糖生成反应进一步进行，显著提高反应液中的海藻糖含量。

此外，CGT酶，由以往多种微生物分离，其作用，物理化学性质等是明确的(参照“工業用碳水化合物酶ハンドブック”、講談社サイェンテイフイク社编辑、講談社公开、28至32页(1999年)等)。此外，也已知，关于上述CGT酶的中的几种，克隆其基因，由基因的碱基序列确定氨基酸序列，其CGT酶的氨基酸序列中存在4个保守区，所述4个保守区在分类为α-淀粉酶家族的酶中共同存在。此外，关于来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌(ジォバチルス·ステアロサ一モフィルス)的CGT酶蛋白，通过X射线晶体结构解析，已经明确了所述酶蛋白的立体结构，也明确了所述CGT酶的3个催化残基，即，序列表序列编号4所示的氨基酸序列的第225的天冬氨酸残基(D225)、第253的谷氨酸残基(E253)、第324的天冬氨酸残基(D324)(参照“工業用碳水化合物酶ハンドブック”、講談社サイェンテイフイク社编辑、講談社公开、56至63页(1999年))。

本发明制备方法中，作为CGT酶，适宜地使用的是来源于类芽孢杆菌属微生物的天然型或者重组型CGT酶或者它们的突变体酶。作为本发明所说的“来源于类芽孢杆菌属微生物的天然型CGT酶”，可以使用的是例如，来源于依利诺斯类芽孢杆菌、饲料类芽孢杆菌、溶淀粉类芽孢杆菌等的公知菌株的CGT酶，和来源于由自然界分离的类芽孢杆菌属微生物的CGT酶。更加具体地说，更加适宜地可以利用的是，分别来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15959株、依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株、饲料类芽孢杆菌NBRC13638株以及溶淀粉类芽孢杆菌NBRC15957株的CGT酶，和来源于这些类芽孢杆菌属微生物变异株的CGT酶，所述变异株是，针对这些类芽孢杆菌属微生物，通过本领域中惯用的例如，紫外线照射、采用化学物质的变异处理等导入突变而取得的大量生产酶的变异株。此外，作为来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶，也可以使用的是例如，来源于类芽孢杆菌属物种(Paenibacillussp.)的CGT酶(商品名为“アルカリCD淀粉酶”、ナガセケムラックス株式会社制)。此外，食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备中迄今为止使用的CGT酶是，来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属的CGT酶。

此外，本发明制备方法中，作为CGT酶，适宜地使用的是具有下述(a)至(d)中显示的部分氨基酸序列的CGT酶。

(a)Gly-Ser-X₁-Ala-Ser-Asp；

(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn；

(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys；

(d)Val-Asn-Ser-Asn-X₂-Tyr；

(其中，X₁意指Ala或者Ser，X₂意指Ala或者Thr。)

上述部分氨基酸序列是，来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶特有的特征性氨基酸序列。

此外，作为本发明所说的“来源于类芽孢杆菌属微生物的重组型CGT酶”，适宜地可以使用的是，克隆上述类芽孢杆菌属微生物CGT酶基因，通过例如，大肠杆菌、枯草菌等适宜的宿主微生物表达而得到的重组型CGT酶。此外，关于分别来源于上述的依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株、饲料类芽孢杆菌NBRC13638株，或者溶淀粉类芽孢杆菌NBRC15957株的CGT酶，申请人独自地克隆来自这些微生物CGT酶的基因，确定基因的碱基序列之后，明确这些微生物CGT酶具有序列表序列编号1、2或者3分别所示的氨基酸序列。即，同样可以使用的是，具有序列表序列编号1、2或者3所示的氨基酸序列的重组型CGT酶，和本发明制备方法中来源于类芽孢杆菌属微生物的天然型CGT酶。

作为本发明所说的“来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶的突变体酶”(在下文，简称为“突变体CGT酶”。)，适宜地可以使用的是，针对编码上述来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶的基因，应用基因工程的手段，在基本上不改变作为CGT酶的底物特异性和酶活性的范围内，导入氨基酸序列中1个或者2个以上的氨基酸残基的缺失、置换或者插入变异的突变体CGT酶。突变体CGT酶的氨基酸序列中可以缺失、置换或者插入的氨基酸残基的个数，只要基本上保持作为CGT酶的底物特异性和酶活性，就没有特别限定，但是，所述氨基酸残基的个数优选不足约680个氨基酸残基构成的CGT酶的氨基酸序列的5％，即，氨基酸残基数为至多30个左右，优选，1个以上而不足20个，更优选，1个以上而不足10个。此外，关于氨基酸序列中的变异导入位置，只要基本上保持作为CGT酶的底物特异性和酶活性，就没有特别限定，但是，优选避免将变异导入CGT酶的氨基酸序列中存在的、分类为α-淀粉酶家族的酶中共同保守的4个结构域、和来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶特有的，上述的(a)至(d)的部分氨基酸序列。

作为本发明制备方法中可以适宜地使用的“来源于类芽孢杆菌属微生物的天然型或者重组型CGT酶或者它们的突变体酶”的其他具体的例子，包括具有上述的序列表序列编号1、2或者3分别所示的氨基酸序列的CGT酶、和实施例中下文所述的通过将部位特异的变异导入依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株的CGT酶基因，而制造的，具有序列表序列编号12或者13所示的氨基酸序列的突变体CGT酶。

本发明制备方法中，适宜地，将原料液化淀粉(pH约4至10)作为底物，向所述底物中，每1克底物固体添加上述的来源于节杆菌属微生物的α-糖基海藻糖合酶0.5至10单位，同样地添加，上述的来源于节杆菌属微生物的海藻糖分离酶2.5至25单位，此外添加，异淀粉酶50至1，000单位以及上述的来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶0.5至50单位，在使用的酶不失活的温度范围、通常、30至60℃，使反应进行10至100小时。反应结束时的反应液的海藻糖含量，通常，基于无水物换算为86％左右。

<(2)的步骤(葡糖淀粉酶处理步骤)>

这个步骤，使葡糖淀粉酶类试剂进一步作用于通过(1)的海藻糖生成步骤得到的反应液，升高基于无水物换算的海藻糖含量。即，通过海藻糖生成步骤得到的反应液中，含有海藻糖与、D-葡萄糖、麦芽糖、葡萄糖聚合度3以上的麦芽低聚糖、α-葡萄糖基海藻糖、以及α-麦芽糖基海藻糖等的碳水化合物，因此，通过使葡糖淀粉酶作用于这种反应液，使麦芽糖和葡萄糖聚合度3以上的麦芽低聚糖分解为D-葡萄糖与，使α-葡萄糖基海藻糖和α-麦芽糖基海藻糖等的α-糖基海藻糖分解为D-葡萄糖和海藻糖，从而可以提高反应液中的海藻糖纯度、换言之基于无水物换算的海藻糖含量。

本发明制备方法中，作为使用的葡糖淀粉酶，其范围是可以使麦芽糖和葡萄糖聚合度3以上的麦芽低聚糖分解为D-葡萄糖，也可以使α-葡萄糖基海藻糖和α-麦芽糖基海藻糖等的α-糖基海藻糖分解为D-葡萄糖和海藻糖的葡糖淀粉酶，而不特别限制其起源和来源。适宜地可以使用的是，市售的葡糖淀粉酶类试剂、例如，天野ェンザイム株式会社销售的、商品名为“グルクザイムAF6”、和ナガセケムテックス株式会社销售的、商品名为“グルコチ一ム”的葡糖淀粉酶类试剂等。

此外，葡糖淀粉酶处理后的反应液、即含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量，通常，超过基于无水物换算的86.0％，优选为87.0％以上。此外，在不使用来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶，而使用来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属的CGT酶的情况下，葡糖淀粉酶处理后的含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量，只能不足基于无水物换算的86.0％，不能达到86.0％以上。

<(3)的步骤(精制浓缩步骤)>

这个步骤，在结束葡糖淀粉酶处理后，针对基于无水物换算的海藻糖含量提高的含有海藻糖的糖液，根据常规方法，实施过滤，离心分离等，除去不溶物，通过活性炭脱色、采用阳离子交换树脂(H+型)、阴离子交换树脂(OH-型)脱盐，并且浓缩至适于结晶的浓度。反应液中的基于无水物换算的海藻糖含量，通过(2)的葡糖淀粉酶处理步骤，已经提高至86.0％以上，因此，(3)的精制浓缩步骤中，通过柱色谱法分馏步骤等的进一步提高海藻糖含量的步骤是不必要的。

<(4)的步骤(结晶步骤)>

这个步骤，在海藻糖二水合物晶体晶种的存在下，使海藻糖二水合物晶体，从经由上述(1)至(3)的步骤得到的含有海藻糖的糖液结晶。即，通常，调节提高至基于无水物换算的海藻糖含量所限定的水平的糖液，使得海藻糖的过饱和度为1.05至1.50的范围后，换言之，将海藻糖浓度调节至约60至85％，将液温调节至约40至80℃后，转移至辅助结晶罐，接着，使辅助结晶罐含有相对于辅助结晶罐中的浓缩糖液体积、通常为0.1至5％(w/v)、详细地说、0.5至2％(w/v)的海藻糖二水合物晶体晶种，缓慢搅拌的同时，液温保持在5至60℃，历经3至48小时，通过自然冷却，促使海藻糖二水合物晶体的结晶。此外，辅助结晶罐内等中已经存在海藻糖二水合物晶体晶种的情况下，没有必要特别添加海藻糖二水合物晶体晶种。因为操作效率，通常，在晶种的存在下，从浓缩液使海藻糖二水合物晶体进行结晶。

在结晶步骤中，也可以有利地实施的是，使用控制冷却法或者拟似控制冷却法，代替上述的自然冷却法。通过控制冷却法或者拟似控制冷却法进行结晶的情况下，将经由上述(3)的步骤调整为所限定的温度的含有海藻糖的糖液转移至辅助结晶罐，接着，使辅助结晶罐含有相对于辅助结晶罐中的浓缩糖液体积、通常为0.1至5％(w/v)、详细地说、0.5至2％(w/v)的海藻糖二水合物晶体晶种，缓慢搅拌的同时、通过控制冷却，在结晶步骤的初期，缓慢地降低液温、在冷却步骤的后期中，快速降低液温，辅助结晶。虽然结晶中需要的时间，由于海藻糖二水合物晶体晶种的添加量也不同，但是，例如，在采用拟似控制冷却法情况下，将全部冷却时间分为至少2个，优选3个以上的区间，在各区间内，相对于时间，温度大概直线降低，良好的是，使液温T相对于时间t连续地或者分阶段地降低，使得维持，操作时间t＝τ/2的时间点(结晶步骤的中间点)的液温T的变化量(T₀-T_m)是总温度变化量(T₀-T_f)的5％以上但是不足50％，优选，10％以上但是不足30％的范围。例如，历经10小时，使液温从60℃冷却至20℃，在使晶体结晶情况下，将冷却时间分为6小时和4小时的2个区间，使液温历经6小时从60℃冷却至50℃，接着，历经4小时从50℃冷却至20℃，或者，优选，将冷却时间分为7小时和3小时的2个区间，使液温历经7小时从60℃冷却至45℃，接着，历经3小时从45℃冷却至20℃，此外优选，将冷却时间分为4小时、3小时、3小时的3个区间，优选，在最初的区间中，历经4小时使液温从60℃冷却至55℃，在接着的区间中，历经3小时使液温从55℃冷却至50℃，此外，在最后的区间中，历经3小时使液温从50℃冷却至20℃。

如此、在控制冷却法或者采用拟似控制冷却法的情况下，与不进行温度控制的自然冷却结晶法相比，海藻糖二水合物晶体的微晶体难以生成，可以得到含有粒径连续的晶体糖膏，另外的结果是，与采用自然冷却法情况相比，得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率可以显著提高。此外，如同下文所述的，得到的海藻糖二水合物晶体粉末，与自然冷却法得到的粉末相比，具有的特征是，海藻糖纯度、以及成为固结性重要指标的海藻糖二水合物晶体的结晶度均高。此外，在控制冷却法或者采用拟似控制冷却法的情况下，存在的优点是，与通过自然冷却结晶法得到的粉末相比，得到粒度分布更加连续的粉末。

<(5)的步骤(收集步骤)>

这个步骤，由通过(4)的结晶步骤得到的糖膏，按照常规方法的分蜜方式，通过离心分离而收集海藻糖二水合物晶体。为了除去表面上附着的无定形的糖浆，喷雾少量的纯化水(喷淋)，洗涤收集的海藻糖二水合物晶体。此外，用于晶体的洗涤的纯化水的量，通常，相对于离心分离前的糖膏的重量，为3％以上，优选至多10％。即，用于洗涤的纯化水的量不足3％，则洗涤没有充分进行，无定形的糖浆残留，可能不能得到所期的海藻糖纯度。一方面，如果用于洗涤的纯化水的量超过10％，通过洗涤溶解、除去的海藻糖二水合物晶体的量增加，对淀粉收率可能降低。

<(6)的步骤(熟化、干燥的步骤)>

这个步骤，在所限定的温度以及湿度气氛中，保持收集的海藻糖二水合物晶体一定时间，使晶体熟化，并且热风干燥，得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末。熟化以及干燥步骤的晶体的物品温度(品温)和气氛的相对湿度、以及保持时间，只要能得到所期望的粉末，就不特别限制，熟化、干燥的步骤中，优选，在晶体物品温度是20至55℃，气氛的相对湿度是60至90％的情况下保持晶体，优选，熟化、干燥时间是约5至24小时。经过熟化、干燥的步骤的粉末，接着，自然放冷至室温。此外，也可以有利地实施的是，喷出室温程度的洁净空气，强制冷却至室温程度的物品温度。得到晶体粉末，以其原样，或者，必要时进行粉碎，制成制品。

通过本发明的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法，通过酶反应，可以得到含有海藻糖的糖液，所述糖液的高海藻糖含量超过基于无水物换算的86.0％，因此，通过柱色谱法分馏步骤不是必要的，没有分馏导致的海藻糖的损失，可以以高对淀粉收率得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末。此外，没有采用使含有结晶的晶体的糖膏全体进行结晶、固化或者喷雾干燥的全糖方式，而是采用离心分离结晶的晶体而除去含有杂质的糖浆的分蜜方式，因此，得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末中的海藻糖含量容易地提高至98.0％以上，可以制备含有高纯度的海藻糖二水合物晶体的粉末。

如此制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，在通过自然冷却进行结晶的情况下，在保存时的固结性等的物性方面，是与以往食品级的含有海藻糖的粉末几乎同等的粉末，通常，是含有如下粒子的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，在所述含有海藻糖二水合物晶体的粉末中，粒径为53μm以上且不足425μm的粒子占粉末全体的70％以上，并且，所述含有海藻糖二水合物晶体的粉末含有占粉末全体的50％以上的粒径为53μm以上且不足300μm的粒子。此外，在通过控制冷却法或者拟似控制冷却法进行结晶的情况下，通过本发明制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，与以往食品级的含有海藻糖的粉末相比，是显著固结难的粉末，通常，是含有如下粒子的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，在所述含有海藻糖二水合物晶体的粉末中，粒径为53μm以上且不足425μm的粒子占粉末全体的80％以上，并且，所述含有海藻糖二水合物晶体的粉末含有占粉末全体的60％以上的粒径为53μm以上且不足300μm的粒子。此外，通过本发明制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末是出色的粉末，通常，根据上述式[5]求出的所述粉末全体的还原力是0.5％以下，即使将所述粉末配合入食品或医药品等中，也不可能有褐变导致的变色。

因此，通过本发明制备方法制备的粉末，以其原样的形式，或者适宜调整粒度，可以作为粉末状的食品原料、化妆品原料、准药物原料，或者医药品原料等使用。具体地说，通过当结晶时应用控制冷却法的本发明制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，如上所述，与以往食品级的含有海藻糖的粉末相比，是显著固结难的粉末，可以说是以往未知的全新的含有海藻糖二水合物晶体的粉末。所述粉末具有如下出色的优点，使用以处理粉末原料为前提而设计的制备设备的食品制备、化妆品制备、准药物制备，以及医药品制备的各领域中，可以放心地使所述粉末包含在其他单独或者多种的粉末状的食品原料、化妆品原料、准药物(医药部外品)原料、医药品原料等中。

在下文，关于本发明的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法，根据实验具体说明。

<实验1:CGT酶的来源对酶反应液的海藻糖含量的影响>

为了调查，在通过酶反应、生成海藻糖的酶反应体系中，使用的CGT酶的来源对通过酶反应得到的糖液中的海藻糖含量有怎样的影响，进行以下实验，所述酶反应中，使来源于节杆菌属微生物的α-糖基海藻糖合酶和同样来源于节杆菌属微生物的海藻糖分离酶、异淀粉酶以及CGT酶一同作用于液化淀粉，接着，使葡糖淀粉酶发挥作用。

<实验1-1:含有来源于节杆菌属微生物的α-糖基海藻糖合酶以及海藻糖分离酶的酶液的制备>

根据专利文献4(特開2000-228980号公报)的实施例2-1中记载的方法，培养节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)S34株(FERM BP-6450)，得到培养液约20L。相对于这种培养液20L加入2克的溶菌酶(商品名为“卵白溶菌酶”、ナガセケムケックス株式会社制)后，通过采用37℃以260rpm的速度搅拌24小时，使培养液中的菌体溶菌。离心分离这种溶菌处理液，回收上清液，得到菌体提取液。根据常规方法对这种菌体提取液进行硫酸铵盐析，相对于10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)对生成的盐析物进行透析，对透析液采用使用“セパビ一ズFPDA13”ゲル(三菱化学株式会社制)的阴离子交换色谱法，回收酶级分。回收的级分是含有约15，600单位的海藻糖分离酶和约3，100单位的α-糖基海藻糖合酶的部分精制酶标准品(標品)。此外，按照上述专利文献4(特開2000-228980号公报)中公开的方法测定α-糖基海藻糖合酶和海藻糖分离酶的活性。

<实验1-2:来源于各种微生物的CGT酶>

作为来源于各种微生物的CGT酶，使用的是以下CGT酶。即，作为来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属的CGT酶，使用的是来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属Tc-91株(FERM BP-11273)的CGT酶(株式会社林原制)，作为来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus macerans)的CGT酶，使用的是市售的CGT酶(商品名为“コンチザイム”、天野ェンザイム株式会社销售)、作为来源于热产硫磺热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)的CGT酶，使用的是市售的CGT酶(商品名为“トルザイム”、ノボザイムズ·ジャパン株式会社销售)。

此外，作为来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶，制备以下CGT 酶。即，以含有糊精2％，氯化铵0.5％，磷酸氢钾0.05％，硫酸镁0.025％以及碳酸钙0.5％的液体培养基，在27℃，将依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15959株、依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株、饲料类芽孢杆菌NBRC13638株以及溶淀粉类芽孢杆菌NBRC15957株分别培养3天，离心分离培养液，按照常规方法对得到的各个离心上清进行硫酸铵盐析、透析，从而得到来源于各微生物的CGT酶的粗制酶液。将得到CGT酶粗制酶液分别经历使用DEAE-トョパ一ル650Sゲル(東ソ一株式会社制)的阴离子交换柱色谱法以及使用ブチル-トョパ一ル650Mゲル(東ソ一株式会社制)的疏水柱色谱法，从而精制，分别制备部分精制CGT酶。此外，依照上述的方法测定，使用式[1]算出来源于各菌株的CGT酶的活性。

<实验1-3:海藻糖生成反应>

将玉米淀粉在水中悬浮以达到浓度30％，将0.1％碳酸钙加入这种悬浮液。将所述悬浮液的pH调整为6.0之后，每淀粉固体添加0.2％的耐热性α-淀粉酶类试剂(商品名为“ク一マミル60L”、ノボザイムズ·ジャパン株式会社销售)，在95℃反应15分钟，将淀粉糊化-液化。将得到的液化淀粉溶液在120℃经高压釜处理30分钟之后，冷却至51℃、调整为pH5.7之后，维持相同温度，同时，每1克淀粉固体、添加2单位的α-糖基海藻糖合酶、10单位的海藻糖分离酶、300单位的异淀粉酶类试剂(株式会社林原制)以及2单位的通过实验1-2中记载的CGT酶或者实验1-2制备的CGT酶中的任一个，使反应进行64小时。将得到的反应物在97℃加热30分钟，分别使酶失活之后，调整为pH4.5，每1克淀粉固体添加10单位的葡糖淀粉酶类试剂(商品名为“グルコチ一ム#20000”、ナガセケムテックス株式会社制)，使反应进行24小时。将如此得到的反应液在95℃加热10分钟，使酶失活，使所述反应液经历以下记载的反应液中的海藻糖含量的测定。此外，除了不添加CGT酶以外条件相同地进行酶反应，得到的反应液作为对照。

<实验1-4:反应液中的海藻糖含量的测定>

将通过实验1-3得到的反应液分别作为表1中显示的反应液1至 8，如下求出海藻糖含量。即，将反应液1至8分别通过纯化水制成1％溶液，通过0.45μm膜过滤器过滤之后，使其经历采用下述条件的HPLC分析，由采用差动式折射计的色谱图中出现的峰的面积，计算反应液的海藻糖含量，进行无水物换算。结果显示于表1中。此外，关于各CGT酶，在相同条件，反复5次海藻糖生成反应以及葡糖淀粉酶处理时，表1中显示的反应液中的海藻糖含量是，在若干偏差的范围内，得到再现性良好的值。

·分析条件

HPLC装置:“LC-10AD”(株式会社島津制作所制)

脱气装置:“DGU-12AM”(株式会社島津制作所制)

柱:“MCI GEL CK04SS”(三菱化学株式会社制)

样品注入量:20μl

洗脱液:纯化水

流速:0.4ml/分

温度:85℃

差动式折射计:“RID-10A”(株式会社岛津制作所制)

数据处理装置:“クロマトパックC-R7A”(株式会社島津制作所制)

【表1】

如同表1中所显示的，使用来源于迄今为止用于海藻糖的生成的嗜热脂肪土芽孢杆菌属Tc-91株的CGT酶(反应液2)时，葡糖淀粉酶处理后的海藻糖含量止于84.7％，在使用来源于巨大芽孢杆菌的CGT酶的情况(反应液3)中，虽然海藻糖含量提高至85.1％，但是，其増加量仅仅为一点点。此外，使用来源于热产硫磺热厌氧杆菌的CGT酶的情况(反应液4)中，海藻糖含量达到83.4％，与使用来源于迄今为止用于海藻糖生成的嗜热脂肪土芽孢杆菌属Tc-91株的CGT酶的情况(反应液2)相比，是降低的。

对此，在使用来源于属于类芽孢杆菌属的微生物的CGT酶的情况(反应液5至8)中，对于其中任何一个而言,葡糖淀粉酶处理后的海藻糖含量均超过基于无水物换算的86.0％，与使用迄今为止用于海藻糖生成的来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属Tc-91株的CGT酶的情况(反应液2)相比，显著増加。具体地说，明确的是，作为CGT酶，在使用来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15959株的(反应液5)、来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株的(反应液6)、以及来源于饲料类芽孢杆菌NBRC13638株的(反应液7)各CGT酶的情况下，通过酶反应得到的是，海藻糖含量超过87.0％，海藻糖含量高的含有海藻糖的糖液。此外，明确的是，在进行此次实验中，作为CGT酶，在使用来源于依利诺斯类芽孢杆菌的CGT酶的情况下，得到最高海藻糖含量，最优选的是，来源于依利诺斯类芽孢杆菌的CGT酶。

<实验2:由海藻糖含量不同的各糖液制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖纯度、对淀粉收率、以及物性>

<实验2-1:受试样品的制备>

<受试样品1至8>

通过使用活性炭的脱色处理以及使用离子交换树脂的脱盐处理，分别精制通过实验1得到的海藻糖含量不同反应液1至8，浓缩至固体浓度约60％，分别对应于反应液1至8，得到含有海藻糖的糖液1至8(含有基于无水物换算的82.8至87.6％的海藻糖)。

分别在减压下，将上述含有海藻糖的糖液1至8浓缩至固体浓度约85％，置于辅助结晶罐，相对于各糖液的容量约1％(w/v)的海藻糖二水合物晶体作为晶种被添加，持续搅拌，从60℃至20℃约历经10小时，通过自然冷却辅助结晶，制备糖膏，所述糖膏用于使海藻糖二水合物晶体结晶。由上述糖膏，根据常规方法，通过篮式离心分离器收集海藻糖二水合物晶体，使用相对于糖膏重量的8％的脱离子水洗涤收集的海藻糖二水合物晶体，在40℃，进行熟化、干燥8小时后，喷出25℃的洁净空气30分钟，强制冷却，通过粉碎，形成含有海藻糖二水合物晶体的粉末。分别由含有海藻糖的糖液1至8得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末，将得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末分别作为受试样品1至8。

<受试样品9>

作为受试样品9，使用的是食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“トレハ”、批号:9I131、株式会社林原销售)。

<实验2-2:受试样品1至9的海藻糖纯度、对淀粉收率、以及固结性>

<海藻糖纯度>

受试样品1至9的海藻糖纯度，通过与实验1-3相同的HPLC法求出。结果显示于表2。

<对淀粉收率>

上述通过制备的受试样品1至8的对淀粉收率以百分比表示，由各受试样品的制备中使用的酶反应液的质量和原料淀粉装料时的浓度(30％)，算出原料淀粉的基于无水物换算的质量，将这种值除以得到的受试样品1至8的基于无水物换算的质量后，乘以100。将结果总结并显示于表2。

<固结性试验>

关于各个受试样品1至9，以调查各个粉末的固结性为目的，进行以下实验。即，各自称取1克受试样品1至9，将各个样品分别充填入内底部为半球状的14ml带有容器盖的聚丙烯制圆筒试管(ベクトン·デイツキンソン社销售的、商品名为“ファルコン试管2059”、直径1.7cm，高10cm)之中，将试管以直立状态放置在试管架中，放置入50℃的培养箱(アドバンテック東洋株式会社销售的、商品名为“CI-410”)，历经24小时静置后，由培养箱取出试管，由试管移除盖，将试管缓慢地倾倒，从而将受试样品取出，将其置于黑色塑料制平板上，肉眼观察取出的受试样品的状态。

判断固结的有无，将即使受试样品在平板上依然明确地保持试管内底部的半球状的情况判断为“存在固结”(+)，将受可以识别出试样品略微存在试管内底部的形状的情况判断为“稍微存在固结”(±)，将受试样品崩解，不保持试管内底部的形状的情况判断为“没有固结”(-)。结果显示于表2的“固结性”的栏。

【表2】

如同表2中所显示的，受试样品1至8的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的基于无水物换算的海藻糖含量、即海藻糖纯度、任何一个均超过98.0％，与是以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末的受试样品9同样地，是含有高纯度的海藻糖二水合物晶体的粉末。但是，从对淀粉收率来看，使用来源于类芽孢杆菌属的微生物的CGT酶以外的CGT酶的受试样品2至4中，对淀粉收率仅为高高的39％，与之相对的是，使用来源于类芽孢杆菌属的微生物的CGT酶的受试样品5至8中，对淀粉收率达到41至42％，超过40％，认定了使用CGT酶的来源导致的差异。此外，比较表1与表2的结果，发现，由葡糖淀粉酶处理后的酶反应液中海藻糖含量高的酶反应液制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末存在对淀粉收率高的倾向，认定了，酶反应液中的海藻糖含量和对淀粉收率之间的相关关系。

根据这些结果，观察到的是，作为CGT酶，使用来源于类芽孢杆菌属的微生物的CGT酶的情况(受试样品5至8)中，葡糖淀粉酶处理后的酶反应液中的海藻糖含量超过86.0％，其结果是，关于含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率也提高至41％以上。具体地说，明确的是，使用来源于依利诺斯类芽孢杆菌或者饲料类芽孢杆菌的CGT酶的情况(受试样品5至7)中，葡糖淀粉酶处理后的酶反应液中的海藻糖含量超过87.0％，关于含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率进一步提高至42％。此外，与使用迄今为止使用的来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属Tc-91株的CGT酶的情况(受试样品2)相比，使用来源于类芽孢杆菌属的微生物的CGT酶的情况的对淀粉收率(受试样品5至8的对淀粉收率)提高了3至4％，可以说，极其划时代的是，在含有海藻糖二水合物晶体的粉末的工业制备中，对淀粉收率也提高3至4％。

一方面，关于是作为粉末的使用方面的重要物性的固结性，确定了，由不使用CGT酶的含有海藻糖的糖液1制备的受试样品1以及作为CGT酶、使用来源于热产硫磺热厌氧杆菌的CGT酶制备的受试样品4，在上述固结性试验中“存在固结(+)”，与之相对的是，确定了，使用其他CGT酶制备的受试样品2、3、5至8，与迄今为止市售的食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末(受试样品9)同样地，在上述固结性试验中“稍微存在固结”(±)。这种结果显示的是，通过使用来源于类芽孢杆菌属的微生物的CGT酶的本发明制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末(受试样品5至8)，与迄今为止市售的食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末(受试样品9)相比，是固结性相当的粉末，与迄今为止市售的食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末同样地，可以用作粉末状的食品原料、化妆品原料、准药物原料，或者医药品原料。

<实验3:结晶时的拟似控制冷却对含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖纯度、对淀粉收率、以及固结性的影响>

本实验中，当由通过实验2-1制备的含有海藻糖的糖液1至8，使海藻糖二水合物晶体结晶时，应用拟似控制冷却法而制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末的情况中，研究对粉末的海藻糖纯度、对淀粉收率、以及固结性的影响。

<实验3-1:受试样品的制备>

分别将通过实验2-1制备的基于无水物换算的海藻糖含量不同的含有海藻糖的糖液1至8，在减压下，浓缩至固体浓度约85％，置于辅助结晶罐，相对于糖液的容量约1％(w/v)的海藻糖二水合物晶体作为晶种被添加，搅拌，同时，从60℃至20℃约历经10小时，通过拟似控制冷却辅助结晶，除此之外，与实验2同样地，制备糖膏，所述糖膏经过使海藻糖二水合物晶体结晶的步骤。此外，拟似控制冷却，将全部的10小时的冷却时间分为4小时、3小时、3小时的3个区间，在最初的区间中，历经4小时使液温从60℃至55℃，在接着的区间中，历经3小时使液温从55℃至50℃，此外，在最后的区间中，历经3小时使液温从50℃至20℃，过冷却以使液温相对于时间呈略微直线状地降低，从而实现上述任何一个区间中的液温变化。由得到的糖膏，根据常规方法，通过篮式离心分离器收集海藻糖二水合物晶体，使用相对于糖膏重量的8％的脱离子水洗涤收集的海藻糖二水合物晶体，在40℃，进行熟化、干燥8小时后，喷出25℃的洁净空气30分钟，强制冷却，通过粉碎，形成含有海藻糖二水合物晶体的粉末。分别由含有海藻糖的糖液1至8，通过拟似控制冷却得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末，将得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末分别作为受试样品1c至8c。

<实验3-2:受试样品1c至8c的海藻糖纯度、对淀粉收率、以及固结性>

<海藻糖纯度>

受试样品1c至8c的海藻糖纯度，通过与实验1-3相同的HPLC法求出。将结果显示于表3。

<对淀粉收率>

受试样品1c至8c的对淀粉收率，根据与实验2-2相同的方法算出。将结果总结并显示于表3。

<固结性试验>

受试样品1c至8c的固结性，通过与实验2-2相同的固结性试验进行评价。将结果总结并显示于表3。

【表3】

如同表3中所显示的，在结晶步骤中应用拟似控制冷却法而制备的受试样品1c至8c的海藻糖纯度是99.0至99.6％的范围。将这种结果，与通过实验2的自然冷却法结晶而得到的受试样品1至8的海藻糖纯度(表2的“海藻糖纯度”的栏)相比，受试样品1c至8c中任何一个的海藻糖纯度均提高0.2至0.6％。这种结果显示的是，通过在结晶步骤中应用拟似控制冷却，可以提高粉末的海藻糖纯度。

此外，受试样品1c至8c的对淀粉收率是35至45％，将这种结果，与通过实验2的自然冷却法结晶而得到的受试样品1至8的对淀粉收率(表2的“对淀粉收率”的栏)相比，受试样品1c至8c中的任何一个的对淀粉收率均提高2至4％左右。这种结果，与当结晶时应用拟似控制冷却法和根据自然冷却法结晶的情况相比，意味着对淀粉收率提高。尽管结晶中使用的含有海藻糖的糖液的海藻糖含量没有变化，还不确定通过应用拟似控制冷却法得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的对淀粉收率提高原因，但是，可以推测的是，上述如同的，通过拟似控制冷却法，得到了微晶体少、粒度全部出现的晶体，因此，也减少通过离心分离由糖膏收集晶体时，以及，通过水洗涤收集的晶体时的海藻糖的损失。

此外，关于受试样品1c至8c，与实验2-2同样地进行固结性试验，调查所述受试样品粉末的固结性之后，如表3中同所显示的，确定的是，受试样品1c至4c的任何一个均“稍微存在固结”(±)，受试样品5c至8c的任何一个在被放置到平板上时均崩解，没有保持试管内底部的形状，确定了“没有固结”(-)。这些结果显示的是，当结晶时应用拟似控制冷却法时出人意料地得到的粉末的固结性，与通过自然冷却法进行结晶的情况相比，具有改善的倾向。尤其是，确定了，以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末(受试样品9)在固结性试验中“稍微存在固结”(±)(表2参照)，与之相对的是，确定了，由海藻糖含量超过86％的含有更大量海藻糖的糖液5至8，通过应用拟似控制冷却法的结晶得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末(受试样品5c至8c)“没有固结”(-)，上述事实说明的是，由海藻糖含量超过86％的含有更大量海藻糖的糖液，通过应用拟似控制冷却法的结晶，可以制备，与以往的食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，显著固结难，作为粉末的特征出色的含有海藻糖二水合物晶体的粉末。

根据上述的结果，明确的是，在结晶步骤中通过应用拟似控制冷却法，与通过自然冷却法结晶的情况相比，可以以更高对淀粉收率制备，海藻糖纯度高的含有海藻糖二水合物晶体的粉末。此外，明确的是，由海藻糖含量超过86.0％的含有更大量海藻糖的糖液，根据拟似控制冷却法结晶而制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，即使在确定通过自然冷却法制备的以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末“稍微存在固结”(±)的条件下也不固结，维持了作为粉末的流动性，因此，是更出色的粉末。

<实验4:粉末的固结性的差异对的结晶度以及平均微晶径的影响>

实验3中，由海藻糖含量超过86％的较高含量糖液，应用拟似控制冷却法而制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末受试样品5c至8c，与另外的受试样品相比，尽管海藻糖纯度中没有显著不同，还具有所谓固结难的出色粉末特征。以明确其原因为目的，在本实验中，针对通过实验2得到的受试样品1至8以及通过实验3得到的受试样品1c至8c，测定粉末的海藻糖二水合物晶体结晶度和平均微晶径。此外，作为对照，也同样调查受试样品9。

<实验4-1:用于结晶度的测定的标准样品的制备>

<标准样品A>

通过使试剂级的含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“海藻糖999”、代码编号:TH224、纯度99.9％以上)再结晶，而制备作为受试样品A的，基本上由海藻糖二水合物晶体组成的标准样品。即，将840g上述试剂级的含有海藻糖二水合物晶体的粉末1在1,000g的纯化水中加热溶解，将溶解的溶液放入20℃的恒温室，放置一晩，使再结晶。根据常规方法，使用篮式离心分离器回收，通过再结晶而结晶出的海藻糖二水合物晶体，在40℃干燥8小时，得到海藻糖二水合物晶体约950g。将其作为受试样品A。通过实验1记载的HPLC法测定受试样品A的海藻糖纯度后，确定纯度是100％。

<标准样品B>

通过以下顺序制备，作为受试样品B的，基本上由无定形部分组成的标准样品。即，将受试样品A溶解于适量纯化水，历经3日冷冻干燥之后，在40℃以下真空干燥1晩，得到基本上由无定形部分组成的粉末。将其作为受试样品B。通过实验1记载的HPLC法测定受试样品B的海藻糖纯度之后，确定所述纯度是100％。此外，根据卡尔·费歇尔法测定受试样品B的水分含量之后，确定所述水分含量是2.0％。

<实验4-2:受试样品A以及B、受试样品1至9以及受试样品1c至8c的结晶度>

<结晶度>

如下求出受试样品A以及B、受试样品1至9、受试样品1c至8c的海藻糖二水合物晶体的结晶度。即，使用市售的采用反射光方式的粉末X射线衍射装置(スペクトリス株式会社制、商品名为“X’Pert PRO MPD”)，基于采用是由Cu对阴极放射的特征X射线的CuKα线(X射线管电流40mA、X射线管电压45kV、波长1.5405埃)的粉末X射线衍射图谱，使用装载于相同粉末X射线衍射装置的专用的解析计算机软件，求出受试样品A以及B、受试样品1至9、以及受试样品1c至8c各自的采用Hermans法的结晶度的解析值。在采用Hermans法的结晶度的解析之前，考虑各粉末X射线衍射图谱的峰的重叠、衍射强度、散射强度等，同时，为了得到明确为最佳的基线，将软件中设定的粒状度以及偏转因素分别调节至适当的水平。此外，关于Hermans法，在ピ-·ェィチ·ハーマンス(P.H.Harmans)和ェ-·ヮィジンガ-(A.Weidinger)、“ジャ-ナル·ォブ·ァプラィド·フィジクス”(Journal of Applied Physics)、第19卷、491～506页(1948年)以及ピ-·ェィチ·ハーマンス(P.H.Harmans)和ェ-·ヮィジンガ-(A.Weidinger)、“ジャ-ナル·ォブ·ポリマ-·サィェンス”(Journal of PolymerScience)、第4卷、135～144页(1949年)中有详细描述。

将关于受试样品A的结晶度的解析值作为解析值H₁₀₀，将关于受试样品B的结晶度的解析值作为解析值H₀，将关于各受试样品的结晶度的解析值作为Hs，将上述值代入上述的式[3]，由此求出结晶度。另外，关于受试样品A的采用Hermans法的结晶度的解析值(H₁₀₀)以及关于受试样品B的相同解析值(H₀)，分别是，50.69％以及8.59％。将结果显示于表4。此外，关于受试样品A以及B，将粉末X射线衍射图谱分别显示于图1以及图2。

如图1中所发现的，受试样品A的粉末X射线衍射图谱中，海藻糖二水合物晶体所特有的衍射峰在衍射角(2θ)5至50°的范围中明了且尖锐地出现，完全不能发现无定形部分特有的晕。一方面，如图2中所发现的，受试样品B的粉末X射线衍射图谱中，与图1的粉末X射线衍射图谱不同，无定形部分特有的晕是作为基线的膨胀显著地出现的，但是，完全不能发现，海藻糖的二水合物晶体或无水晶体特有的衍射峰。

<实验4-3:采用受试样品A以及B的同步加速器放射的粉末X射线衍射>

为了进一步印证，本实验中，受试样品Ａ以及Ｂ分别是作为用于确定解析值Ｈ₁₀₀以及Ｈ₀的样品的适当的物质，将同步加速器放射光(在下文，称为“放射光”。)用作X射线源，使这些标准样品经历，可以检测出微弱的衍射和散射的信号的透过光方式的粉末X射线衍射。此外，测定条件如下所述。

＜测定条件＞

粉末Ｘ线衍射装置：高速粉末Ｘ线衍射装置(神津精机社销售、型号“ＰＤＳ－16”)、德拜-谢勒模式(デバイシェラモード)、

照相机长：497.2ｍｍ

X射线源：来自偏转电磁石的放射光(兵庫県ビームライン(ＢＬ08Ｂ2))

测定波长：(10.00ｋｅＶ)

测定强度：10⁹光子/秒

测定角：3至38°

曝光时间：600秒

图像拍照：成像板(富士フイルム社制、商品名为“イメージングプレートＢＡＳ－2040”

图像读取装置：成像分析仪(富士フイルム社制、“バイオイメージ分析仪ＢＡＳ－2500”)

利用大型放射光设施“ＳＰｒｉｎｇ－8”(兵庫県佐用郡佐用町光都1－1－1)内设有的“兵庫県ビームライン(ＢＬ08Ｂ2)”，实施了测定。

在粉末X射线衍射测定之前，受通过乳钵磨碎试样品Ａ以及Ｂ之后，通过53μｍ的筛而筛分，将通过筛的粉末均一充填入用于X射线晶体衍射的毛细管(株式会社トーホー销售的、商品名为“マーク试管”、Ｎｏ.14(直径0.6ｍｍ、林德曼玻璃(リンデマンガラス)制))内，以达到充填长度约为30ｍｍ。接着，将毛细管从样品的充填终端切断，通过粘合剂封住开口部之后，通过粘土将毛细管固定在样品支架，使得毛细管的较长方向垂直于粉末X射线衍射装置的光轴，将样品支架放置于粉末X射线衍射装置。为了消除海藻糖二水合物晶体的取向导致的对粉末X射线衍射图谱的影响，在测定中，使样品支架以2回/秒的周期等速旋转。

解析关于受试样品A以及B的得到的粉末X射线衍射图谱，在制成粉末X射线衍射图谱过程中，为了提高测定精度，按照常规方法，由各粉末X射线衍射图谱除去来源于粉末X射线衍射装置的背景信号。将如此得到关于受试样品A以及B的粉末X射线衍射图谱分别显示于图3以及图4。

如图3中所发现的，采用使用放射光的粉末X射线衍射的关于受试样品A的粉末X射线衍射图谱，海藻糖二水合物晶体所特有的衍射峰在衍射角(2θ)3至38°的范围中明了且尖锐地出现的。图3与图1相比较，放射光的波长()与特征X射线的波长()不同，因此，虽然在图3中，与图1相比，几乎5分之4的衍射角(2θ)处出现各衍射峰差异，但是，图1以及图3的衍射图谱是，极其良好一致的。此外，尽管图3的各衍射峰的强度，与图1的衍射峰的强度相比，强接近50倍，但是，各衍射峰的半宽度，与图1的相比，明确地狭窄、分离度也高。此外，图3的粉末X射线衍射图谱中，如同下文所述的图4，不能确认无定形部分特有的全部晕。这种情况显示的是，受试样品A中的海藻糖二水合物晶体的晶体性极其高，受试样品A是基本上由海藻糖二水合物晶体组成的。

一方面，如同图4中所显示的，采用使用放射光的粉末X射线衍射的关于受试样品B的粉末X射线衍射图谱中，无定形部分特有的晕作为基线的膨胀显著地出现，完全不能确认海藻糖二水合物晶体所特有的衍射峰。这种情况显示的是，受试样品B是基本上由无定形部分组成的。

使用同步加速器放射光作为X射线源，得到上述的结果，所述结果印证了，受试样品A以及B是，作为用于确定式[3]的解析值H₁₀₀以及解析值H₀的样品的适当物质。

<实验4-4:受试样品A、受试样品1至9以及受试样品1c至8c的平均微晶径>

由粉末X射线衍射图谱的各衍射峰的半宽度以及衍射角(2θ)，可以计算出微晶径。本发明人认为，由多个衍射峰算出的微晶径的平均值(平均微晶径)是规定含有晶体的粉末的物性的参数，针对含有海藻糖二水合物晶体的粉末，求出受试样品平均微晶径。

将是无定形粉末的、不显示粉末X射线衍射图谱中衍射峰的受试样品B除外，针对受试样品A、受试样品1至9以及关于受试样品1c至8c，使用求出结晶度时的各粉末X射线衍射图谱，进一步求出各个平均微晶径。选择含有海藻糖二水合物晶体的粉末的各个粉末X射线衍射图谱的5个衍射峰，即，在对起因于微晶的不均一失真的衍射峰幅的影响少的较低角度的范围内，与其他衍射峰良好分离的衍射角(2θ)13.7°(米勒指数(hkl):101)、17.5°(米勒指数:220)、21.1°(米勒指数:221)、23.9°(米勒指数:231)以及25.9°(米勒指数:150)的衍射峰(图1以符号a至e显示)，使用分别关于其的半宽度和衍射角(2θ)，使用附属于粉末X射线衍射装置的解析用计算机软件(“ェクスパ一トハイスコアプテス(X′pertHighscorePlus)”，使用X射线衍射用标准样品(“Si640d”)作为标准品硅(美国国立标准技术研究所(NIST)测定数值，基于所述测定值补正后，基于上述式[4]算出微晶径，作为5点的平均值，求出平均微晶径。将结果总结并显示于表4。

此外，表4中总结并显示的是，关于受试样品1至9以及受试样品1c至8c的，分别由表2以及3转记的海藻糖纯度和粉末的固结性试验的结果。此外，关于作为用于结晶度测定的标准样品的受试样品A以及B，分别使其经历与实验2-2、实验3-2相同的固结性试验，其评价固结性。结果总结并显示于表4。

【表4】

结晶度测定中，作为用于确定解析值H₁₀₀的标准样品的受试样品A(海藻糖纯度100.0％，结晶度100.0％)的平均微晶径是此外，确定了，如同表4中所示的，固结性试验中受试样品A是“没有固结”(-)。对此，作为用于确定解析值H₀的标准样品的受试样品B(海藻糖纯度100.0％，结晶度0.0％)，在固结性试验中，取出并置于试管平板上后，明确保持试管内底部的半球状，确定了“存在固结”(+)。此外，取出并置于平板上的受试样品B保持试管内底部的半球状的形态，以轻微程度振动平板的，不崩解。一方面，是迄今为止市售的食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末的受试样品9的海藻糖纯度是99.0％，结晶度是85.4％。

如同表4的“结晶度”的栏中所显示的，在结晶步骤中通过自然冷却法结晶而得到的受试样品1至8的结晶度达到78.7至88.1％的范围，此外，在结晶步骤中应用拟似控制冷却法而制备的受试样品1c至8c的结晶度，达到85.7至96.0％的范围。根据结晶方法差异的观点，对比上述受试样品1至8以及受试样品1c至8c的结晶度后，明确的是，虽然通过拟似控制冷却法得到的受试样品1c至8c，样品间存在偏差，但是，与通过自然冷却法得到的受试样品1至8相比，结晶度提高3.1至7.9％。

此外，显示于表4的结果说明的是，结晶度与粉末的固结性存在相关性。即，如同表4中所显示的，结晶度是90％以上的受试样品A、受试样品5c至8c中，任何一个均“没有固结”(-)，与之相对的是，结晶度85％以上且不足90％的受试样品2、3、5至9、以及受试样品1c至4c中，任何一个均“稍微存在固结”(±)，结晶度是不足85％的受试样品B、受试样品1以及4中，任何一个均“存在固结”(+)。这种情况说明的是，结晶度是，规定固结难的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的有力指标。

此外，这种结果可以说明的是，含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备中，反应液中的海藻糖含量提高至超过86.0％，如果在这之后的在结晶步骤中应用拟似控制冷却法，得到的粉末的海藻糖二水合物晶体结晶度达到90％以上，结果是，从固结方面来看，与以往的食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，得到显著固结难的含有海藻糖二水合物晶体的粉末。

一方面，如同表4的“平均微晶径”的栏中所显示的，在结晶步骤中通过自然冷却法结晶而得到的受试样品1至8的平均微晶径达到2,150至的范围，此外，在结晶步骤中应用拟似控制冷却法而制备的受试样品1c至8c的平均微晶径达到2,540至的范围。明确的是，关于平均微晶，将径受试样品1c至8c与受试样品1至8对比后，虽然通过拟似控制冷却法得到的受试样品1c至8c，样品间存在偏差，但是与通过自然冷却法得到的受试样品1至8相比，平均微晶径增大190至由这种结果，可以说，海藻糖二水合物晶体的结晶步骤中拟似控制冷却法的应用，即使得到平均微晶径的大的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，也是出色的方法。

此外，认定了，受试样品1至8以及受试样品1c至8c中，粉末的海藻糖纯度以及海藻糖二水合物晶体的结晶度越高，越有平均微晶径的值大的倾向。这种倾向说明的是，海藻糖纯度是100.0％、结晶度是100.0％的受试样品1的平均微晶径是是食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末的受试样品9的平均微晶径是综合考虑两者，含有海藻糖二水合物晶体的粉末的平均微晶径与海藻糖纯度以及结晶度存在一定的相关性。

此外，显示于表4的结果说明的是，平均微晶径也与粉末的固结性存在相关性。即，如同表4中所显示的，平均微晶径是以上的受试样品A、受试样品5c至8c中，任何一个均“没有固结”(-)，与之相对的是，平均微晶径在以上且不足的范围中的受试样品2、3、5至9、以及受试样品1c至4c中，任何一个均“稍微存在固结”(±)、平均微晶径是不足的受试样品B、受试样品1以及4中，任何一个均“存在固结”(+)。这种情况说明的是，结晶度以及平均微晶径也是，规定固结难的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的有力指标。

<实验5:受试样品的粉末特征(保存性、对水的溶解性)>

为了进一步明确受试样品1至9以及受试样品1c至8c的作为粉末的性质，进行保存性试验以及对水的溶解性试验。

<实验5-1:保存性试验>

为了确认，实验2-2、实验3-2等中进行的固结性试验适合于，作为评价含有海藻糖二水合物晶体的粉末的实时保存时的固结性的试验，通过实验4-1的方法得到的受试样品A以及B、通过实验2得到的受试样品1至9以及通过实验3得到的关于受试样品1c至8c，作为市场流通的制品的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，进行了实际上设想的保存的状态、环境、期间等的保存性试验。

即，受试样品A以及B、受试样品1至9以及受试样品1c至8c各自每次取出150g，分别收集入聚乙烯袋(商品名为“コニパツクF-4”、株式会社生产日本社制、17cm×12cm)，针对各受试样品，每个受试样品制造3袋的以除掉空气的状态封入的聚乙烯袋。接着，将13.2kg的锤负载于各个聚乙烯袋之上使得上面全体荷重，从而达到各聚乙烯袋的单片面积1m²的荷重为648kg，以上述的状态，在避免高温多湿的环境下保存60日。此外，食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末制品，通常，以20kg包装的装入袋中的包装外形，以10层程度堆积的状态，在仓库等中保存，每聚乙烯袋的片面积1m²的648kg称为荷重，相当于这种10层装载的状态的最下层的制品所承载的荷重。保存60日后，将各受试样品由聚乙烯袋取出，借助孔径425μm的筛，分别测定通过筛的粉末与没有通过粉末的质量，求出粒径425μm以上的粒子占粉末全体的质量比例(％)，通过取得关于各受试样品经过试验的3袋的平均值，确定60日保存后的粉末的固结的有无。粉末的固结判断如下，将粒径425μm以上的粒子不足粉末全体的30％的情况判断为“没有固结”(-)，将同样的粒子占粉末全体的30％以上的情况判断为“存在固结”(+)。此外，如果粉末的425μm以上的粒子的比例超过30％，那么，一般而言，因为对粉末的溶解或其他粉末状组分物的混合、混捏等产生障碍，将判定的基准设定为30％。结果显示于表5。

<实验5-2:对水的溶解性试验>

分别各称量0.25g受试样品，分别装入内底部为半球状的14ml带容器盖的聚丙烯制圆筒试管(ベクトン·ディッキンソン社销售的、商品名“ファルコン试管2059”。分别装入受试样品的试管中，添加5ml去离子水，采用50℃的恒温水槽，加热30分钟之后，颠倒2回，此外在50℃保持15分钟，调查此时的溶解性。通过目视，将观察到粉末完全溶解的情况判断为溶解性“好”，将确认不溶物残存的情况判断为溶解性“不好”。结果总结并显示于表5。

【表5】

受试样品	保存性	对水的溶解
			A	-	不好
B	+	好
			1	+	好
2	+	好
			3	+	好
4	+	好
			5	+	好
6	+	好
			7	+	好
8	+	好
			9	+	好
1c	+	好
			2c	+	好
3c	+	好
			4c	+	好
5c	-	好
			6c	-	好
7c	-	好
			8c	-	好

如同表5的“保存性”的栏中所示的，使各受试样品负重，同时在避免高温多湿环境下，保存60日的保存性试验中，判断的是关于海藻糖的结晶度不足90.0％、平均微晶径是以下的受试样品l至9以及受试样品lc至4c“存在固结”(+)，与之相对的是，判断的是，结晶度是91.0％以上且96.0％以下，平均微晶径是以上的受试样品A、受试样品5c至8c“没有固结”(-)。这种结果显示的是，确定了，实验2-2、实验3.2等中进行的固结性试验中被确定“存在固结”(+)或者“稍微存在固结”(士)的受试样品，在本保存试验中“存在固结”(+)，与之相对的是，确定了，实验2-2、实验3-2等中进行的固结性试验中被确定“没有固结”(-)的受试样品，在本保存试验中也同样“没有固结”(-)。这种事实显示的是，实验2-2、实验3-2等中进行的固结性试验，作为含有海藻糖二水合物晶体的粉末的实时保存环境下的固结性评价的试验，是适当的。

此外，如同表5的“对水的溶解性”的栏中所显示的，确定了，对水的溶解性试验中，结晶度100％，平均微晶径的受试样品 A溶解性“不良”，与之相对的是，确定了，结晶度是96.0％以下，平均微晶径是以下的受试样品1至9以及受试样品1c至8c中，任何一个均溶解性“良”。这种结果显示的是，如果含有海藻糖二水合物晶体的粉末的结晶度以及平均微晶径提高至受试样品A的水平，换言之，试剂级的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的水平，那么产生的问题是对水的溶解性恶化，而不是固结性。

<实验6:海藻糖的制备产生的适宜的CGT酶中共有的部分氨基酸序列>

为了表征海藻糖的制备产生的适宜的CGT酶，将来源于在提高酶反应液中的海藻糖含量的效果中出色的上述类芽孢杆菌属微生物的CGT酶，即，分别来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株、饲料类芽孢杆菌NBRC13638株以及溶淀粉类芽孢杆菌NBRC15957株的CGT酶的氨基酸序列(序列表序列编号1、2以及3)，与分别来源于上述嗜热脂肪土芽孢杆菌属Tc-91株、软化芽孢杆菌(バチルス·マゼランス)、热产硫磺热厌氧杆菌(サーモアナエロバクター·サーモスルフリゲネス)的CGT酶的氨基酸序列(序列表序列编号4、5以及6)相比较，所述嗜热脂肪土芽孢杆菌属Tc-91株、软化芽孢杆菌、热产硫磺热厌氧杆菌提高酶反应液中的海藻糖含量效果，弱于来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶的效果。此外，氨基酸序列的比较中使用的序列表序列编号1至3所示的氨基酸序列各自使用的是，申请人独自地克隆依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株、饲料类芽孢杆菌NBRC13638株以及溶淀粉类芽孢杆菌NBRC15957株的各个CGT酶基因，从而确定的碱基序列编码的氨基酸序列。此外，序列表序列编号4以及5所示的氨基酸序列是，申请人独自地确定的，来源于与本申请相同的申请人的特開昭61-135581号公报中公开的嗜热脂肪土芽孢杆菌属(旧分类为嗜热脂肪芽孢杆菌(バチルス·ステアロサーモフィラス))Tc-91株的以及来源于软化芽孢杆菌的CGT酶的氨基酸序列。此外，虽然序列表序列编号5所示的氨基酸序列，不是实验1中使用的来源于软化芽孢杆菌的CGT酶(商品名为“コンチザイム”、天野ェンザイム株式会社销售)的氨基酸序列，但是，存在相同的来源于软化芽孢杆菌的CGT酶的氨基酸，因此，作为代替使用。此外，作为来源于热产硫磺热厌氧杆菌的CGT酶的氨基酸序列使用的是，采用登录号No.35484登录基因数据数据库“GenBank”而获得的氨基酸序列。

上述的氨基酸序列的比较中，作为提高酶反应液中的海藻糖含量的效果中出色的CGT酶，即，上述来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶中共同存在的，并且，在分别来源于提高酶反应液中的海藻糖含量的效果没有那种程度的CGT酶，即，嗜热脂肪土芽孢杆菌、软化芽孢杆菌以及热产硫磺热厌氧杆菌的CGT酶中不存在的部分氨基酸序列，认定了，下述(a)至(d)的部分氨基酸序列。

(a)Gly-Ser-X₁-Ala-Ser-Asp；

(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn；

(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys；

(d)Val-Asn-Ser-Asn-X₂-Tyr；

(其中，X₁意指Ala或者Ser，X₂意指Ala或者Thr。)

由以上的结果，可以表征的是，本发明的采用制备方法海藻糖的制备中，更加适宜的CGT酶，即，酶反应液中的海藻糖含量可以超过86.0％的CGT酶，具有上述(a)至(d)的部分氨基酸序列。

在下文，基于实施例进一步详细说明本发明。但是，本发明不限于这些实施例。

【实施例1】

<含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备>

将玉米将淀粉悬浮于水中以达到30％，向这种悬浮液中添加终浓度达到0.1％的碳酸钙，调整为pH6.0。向此悬浮液中，添加基于淀粉质量0.2％的耐热性α-淀粉酶(商品名为“ク一マミル60L”、ノボザイムズ·ジャパン株式会社销售)，在98至100℃，反应15分钟，将淀粉糊化-液化。将得到的液化淀粉溶液在125℃经高压釜处理15分钟之后，冷却至51℃，向此溶液中，添加每1克淀粉分别2单位以及10单位的通过实验1-1方法制备的含有α-糖基海藻糖合酶和海藻糖分离酶的部分精制酶液，此外，添加每1克淀粉300单位的异淀粉酶(株式会社林原制)，以及2单位的来源于通过实验1-2的方法制备的依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15959株的CGT酶，进一步，使反应进行约70小时。接着，在97℃加热这种反应液30分钟，使酶失活之后，调整为pH4.5，向此反应液中，添加每淀粉1克10单位的葡糖淀粉酶类试剂(商品名为“グルコチ一ム#20000”、ナガセケムテックス株式会社销售)，使反应进行24小时之后，得到海藻糖纯度、即基于无水物换算的海藻糖含量为87.4％的反应液。将如此得到的反应液加热，使酶失活，根据常规方法，通过活性炭脱色过滤，将滤液采用阳离子交换树脂(H+型)以及阴离子交换树脂(OH-型)脱盐，减压浓缩，形成固体浓度约85％的浓缩液。将其置于辅助结晶罐，添加2％试剂级的含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“海藻糖999”、代码编号:TH224、海藻糖纯度99.9％以上、株式会社林原销售)作为晶种，达到55℃，同时温和搅拌，历经24小时，自然冷却至15℃，使海藻糖二水合物晶体结晶。通过篮式离心分离器，回收晶体，通过相对于糖膏重量的约5％的纯化水喷雾洗涤晶体之后，在50℃2小时，熟化，干燥，喷出20℃的空气10分钟，以冷却，粉碎，以对淀粉收率约42％得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末，所述晶体粉末含有，基于无水物换算的99.4％的海藻糖，0.3％的D-葡萄糖，0.06％的4-O-α-葡萄糖基海藻糖，以及，0.09％的6-O-α-葡萄糖基海藻糖。

通过本例的制备方法，以所谓约42％的高对淀粉收率可以制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末。此外，通过本制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖二水合物晶体，结晶度是88.4％，平均微晶径是粉末全体的还原力是0.4％。此外，上述结晶度的测定采用Hermans法而进行，使用根据实验4-2求出的解析值H₁₀₀以及H₀进行。测定本品的粒度分布后，发现含有的是，73.1％的粒径为53μm以上且不足425μm的粒子，68.6％的粒径为53μm以上且不足300μm的粒子，以及，8.2％的粒径425μm以上的粒子。本品，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末同样地，可以用作食品原料、化妆品原料、准药物原料、以及医药品原料等。

【实施例2】

<含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备>

使用每1克淀粉分别3单位以及15单位的α-糖基海藻糖合酶和海藻糖分离酶的反应时间达到40小时，作为CGT酶，使用通过实验1-2的方法得到的来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株的CGT酶，除此之外，根据与实施例1同样地的方法进行海藻糖生成反应以及葡糖淀粉酶处理，由此，得到海藻糖纯度、即基于无水物换算的海藻糖含量87.6％的反应液。加热得到的反应液，使酶失活，根据常规方法，通过活性炭脱色过滤，将滤液采用阳离子交换树脂(H+型)以及阴离子交换树脂(OH-型)脱盐，减压浓缩，形成固体浓度约85％的浓缩液。将其置于辅助结晶罐，添加1％试剂级的含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“海藻糖999”、代码编号:TH224、海藻糖纯度99.9％以上、株式会社林原销售)作为晶种，达到60℃，接着，同时温和搅拌该含有海藻糖的溶液，通过拟似控制冷却法，历经共计24小时，将所述含有海藻糖的溶液冷却至15℃，所述拟似控制冷却法使所述含有海藻糖的溶液，历经12小时从60℃冷却至50℃，历经6小时从50℃冷却至40℃，此外历经6小时从40℃冷却至15℃，使海藻糖的二水合物晶体结晶。通过篮式离心分离器，回收晶体，通过相对于糖膏重量的约5％的纯化水喷雾洗涤晶体之后，在50℃2小时，熟化，干燥，喷出20℃的空气20分钟，冷却，粉碎，以对淀粉收率约45％得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末，所述粉末含有，基于无水物换算的99.6％的海藻糖，0.07％的D-葡萄糖，0.04％的4-O-α-葡萄糖基海藻糖，以及，0.06％的6-O-α-葡萄糖基海藻糖。

本发明含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖二水合物晶体结晶度是95.6％，平均微晶径是粉末全体的还原力是0.15％。此外，上述结晶度的测定采用Hermans法而进行，使用根据实验4-2求出的解析值H₁₀₀以及H₀进行。测定本品的粒度分布后，发现含有的是，83.3％的粒径为53μm以上且不足425μm的粒子，72.5％的粒径为53μm以上且不足300μm的粒子，以及，6.9％的粒径425μm以上的粒子。使用本品，根据与实验2-2、实验3-2等相同的方法，进行固结性试验，之后，确定了“没有固结”(-)。此外，根据与实验5相同的方法检验对水的溶解性，之后，确定了溶解性“良”。

通过本例的制备方法，以所谓约45％的高对淀粉收率可以制备，含有海藻糖二水合物晶体的粉末。此外，通过本制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，与作为食品原料等的市售的以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“トレハ”、株式会社林原销售)相比，海藻糖纯度中尽管没有那种程度的差异，但是，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，是显著固结难的粉末，保存和使用是容易的。本品，因为是海藻糖的二水合物含有晶体粉末，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末同样地是，保存和使用是容易的，因此，可以更加适宜地用作食品原料、化妆品原料、准药物原料、以及医药品原料等。

【实施例3】

<含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备>

作为CGT酶，使用来源于通过实验1-2的方法制备的饲料类芽孢杆菌NBRC13638株的CGT酶，除此之外，与实施例1同样地，进行海藻糖生成反应，之后，葡糖淀粉酶处理后的反应液的基于无水物换算的海藻糖含量是87.2％。将如此得到的反应液加热，使酶失活，根据常规方法，通过活性炭脱色过滤，将滤液采用阳离子交换树脂(H+型)以及阴离子交换树脂(OH-型)脱盐，减压浓缩，形成固体浓度约85％的浓缩液。将其置于辅助结晶罐，添加1％试剂级的含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“海藻糖999”、代码编号:TH224、海藻糖纯度99.9％以上、株式会社林原销售)作为晶种，达到60℃，同时温和搅拌，通过历经15小时从60℃冷却至45℃，历经9小时从45℃冷却至20℃的2个阶段的拟似控制冷却法，历经24小时，进行冷却，使海藻糖二水合物晶体结晶。通过篮式离心分离器，回收晶体，通过相对于糖膏重量的约5％的纯化水喷雾洗涤晶体之后，在50℃2小时，熟化，干燥，喷出20℃的空气10分钟，以冷却，粉碎，以对淀粉收率约44％得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末，所述粉末含有基于无水物换算的99.2％的海藻糖，0.4％的D-葡萄糖，0.06％的4-O-α-葡萄糖基海藻糖，以及，0.10％的6-O-α-葡萄糖基海藻糖。

本发明含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖二水合物晶体结晶度是92.6％，平均微晶径是粉末全体的还原力是0.5％。此外，上述结晶度的测定采用Hermans法而进行，使用根据实验4-2求出的解析值H₁₀₀以及H₀进行。测定本品的粒度分布后，发现含有的是，75.2％的粒径为53μm以上且不足425μm的粒子，69.3％的粒径为53μm以上且不足300μm的粒子，以及，7.8％的粒径425μm以上的粒子。使用本品，根据与实验2-2、实验3-2等相同的方法，进行固结性试验，之后，确定了“没有固结”(-)。此外，根据与实验5相同的方法检验对水的溶解性，之后，确定了溶解性“良”。

通过本例的制备方法，以所谓约44％的高对淀粉收率可以制备，含有海藻糖二水合物晶体的粉末。此外，通过本制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，与作为食品原料等的市售的以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“トレハ”、株式会社林原销售)相比，海藻糖纯度中尽管没有那种程度的差异，但是，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，是显著固结难的粉末，保存和使用是容易的。本品，因为是海藻糖的二水合物含有晶体粉末，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末同样地是，保存和使用是容易的，因此，可以更加适宜地用作食品原料、化妆品原料、准药物原料、以及医药品原料等。

【实施例4】

<含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备>

使用木薯淀粉作为原料淀粉，作为CGT酶，使用通过实验1-2的方法得到的来源于溶淀粉类芽孢杆菌NBRC15957株的CGT酶，除此之外，根据与实施例1同样的方法，进行海藻糖生成反应以及葡糖淀粉酶处理，由此得到，海藻糖纯度、即基于无水物换算的海藻糖含量是86.6％的反应液。加热得到的反应液，使酶失活，根据常规方法，通过活性炭脱色过滤，将滤液采用阳离子交换树脂(H+型)以及阴离子交换树脂(OH-型)脱盐，减压浓缩，形成固体浓度约86％的浓缩液。将其置于辅助结晶罐，添加1％试剂级的含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“海藻糖999”、代码编号:TH224、海藻糖纯度99.9％以上、株式会社林原销售)作为晶种，达到60℃，接着，同时温和搅拌该含有海藻糖的溶液，通过历经8小时从60℃冷却至50℃、历经8小时从50℃冷却至35℃、历经8小时从35℃冷却至15℃的3阶段的拟似控制冷却法，历经共计24小时，将所述含有海藻糖的溶液冷却至15℃，使海藻糖的二水合物晶体结晶。通过篮式离心分离器，回收晶体，通过相对于糖膏重量的约5％的纯化水喷雾洗涤晶体之后，在50℃2小时，熟化，干燥，喷出20℃的空气20分钟，冷却，粉碎，以对淀粉收率约43％得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末，所述粉末含有基于无水物换算的99.4％的海藻糖，0.06％的D-葡萄糖，0.04％的4-O-α-葡萄糖基海藻糖，以及，0.06％的6-O-α-葡萄糖基海藻糖。

本发明含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖二水合物晶体结晶度是93.3％，平均微晶径是粉末全体的还原力是0.13％。此外，上述结晶度的测定采用Hermans法而进行，使用根据实验4-2求出的解析值H₁₀₀以及H₀进行。测定本品的粒度分布后，发现含有的是，80.7％的粒径为53μm以上且不足425μm的粒子，74.4％的粒径为53μm以上且不足300μm的粒子，以及，7.1％的粒径425μm以上的粒子。使用本品，根据与实验2-2、实验3-2等相同的方法，进行固结性试验，之后，确定了“没有固结”(-)。此外，根据与实验5相同的方法检验对水的溶解性，之后，确定了溶解性“良”。

通过本例的制备方法，以所谓约43％的高对淀粉收率可以制备，含有海藻糖二水合物晶体的粉末。此外，通过本制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，与作为食品原料等的市售的以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“トレハ”、株式会社林原销售)相比，海藻糖纯度中尽管没有那种程度的差异，但是，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，是显著固结难的粉末，保存和使用是容易的。本品，因为是海藻糖的二水合物含有晶体粉末，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末同样地是，保存和使用是容易的，因此，可以更加适宜地用作食品原料、化妆品原料、准药物原料、以及医药品原料等。

【实施例5】

<重组型CGT酶以及突变体CGT酶的制备与使用这些的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备>

不使用实施例2中使用的来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株的CGT酶，而使用将大肠杆菌作为宿主、表达来源于同株的CGT酶基因而得到的重组型(野生型)CGT酶，和2种突变体CGT酶，进行含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备，所述2种突变体CGT酶，根据常规方法、通过向所述CGT酶基因导入部位特异的变异而制备，所述2种突变体CGT酶的氨基酸序列的氨基酸残基的1个残基置换为其他氨基酸残基。

<重组型CGT酶的制备>

本发明人，使用由依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株克隆、保守的来源于同株的CGT酶基因(具有序列表序列编号7所示的碱基序列)，不改变编码其的氨基酸序列，使变异发生，导入制限酶部位等或者使之缺失，之后，将其重组于表达用プラスミドベクタ一“pRSET-A”(インビトロジェン社制)，制成含有编码天然型(野生型)CGT酶的基因的表达用重组DNA。得到的重组DNA“pRSET-iPI”的结构显示于图6。使用所述重组DNA“pRSET-iPI”，根据常规方法，将大肠杆菌BL21(DE3)(ストラタジ一ン社制)遗传转化，取得保持同样的重组DNA的遗传转化体“BL21-RSET-iPI”。接着，使用含有氨苄西林Na盐100μl/ml的T培养基(每培养基1L，含有细菌用胰蛋白胨12g、细菌用酵母提取物24g、甘油5ml、17mM磷酸一钾、72mM磷酸二钾)，在37℃，需氧条件下，培养所述遗传转化体24小时。离心分离培养液，使用超音波破碎器(商品名为“Ultra Sonic Homogenizer UH-600”、ェムェスケ一株式会社制)破碎处理得到的菌体，针对通过离心分离得到的破碎液上清，测定CGT酶活性(淀粉分解活性)，基于培养液1ml换算，之后，得到约12.8单位/ml的酶活性。按照常规方法硫酸铵盐析破碎液上清，通过透析得到重组型CGT酶的粗制酶液后，使所述粗制酶液经历使用DEAE-トョパ一ル650Sゲル(東ソ一株式会社制)的阴离子交换柱色谱法以及使用ブチル-トョパ一ル650Mゲル(東ソ一株式会社制)的疏水柱色谱法，从而精制，形成重组型CGT酶的部分精制标准品。

<突变体CGT酶的制备>

根据常规方法，将部位特异的变异导入上述来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株的天然型(野生型)CGT酶基因，由大肠杆菌表达得到的变异CGT酶基因，由此，制备2种1个氨基酸置换突变体CGT酶。此外，当将氨基酸置换导入所述CGT酶中时，避免对来源于类芽孢杆菌属微生物的CGT酶特有的上述(a)至(d)的部分氨基酸序列的氨基酸进行置换变异，选择这些的位置以外的变异位置，所述氨基酸序列如下：

是来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株的CGT酶的氨基酸序列的序列表序列编号1所示的氨基酸序列的、第133的天冬氨酸残基至第138的组氨酸残基(Asp133～His138)、第223的甘氨酸残基至第231的组氨酸残基(Gly223～His231)、第255的谷氨酸残基至第258的亮氨酸残基(Glu255～Leu258)以及第321的苯丙氨酸残基至第326的天冬氨酸残基(Phe321～Asp326)，即，相当于分类为α-淀粉酶家族的酶中共同保存的4个保守区氨基酸序列，第259的甘氨酸残基至第264的天冬氨酸残基(Gly269～Asp264)、第331的赖氨酸残基至第337的天冬酰胺残基(Lys331～Asn337)、第375的赖氨酸残基至第381的赖氨酸残基(Lys375～Lys381)以及567第的缬氨酸残基至第572的酪氨酸残基(Val567～Tyr572)。

基于上述的方针，制备了，将序列表序列编号1所示的氨基酸序列的178第的甘氨酸残基置换为精氨酸残基的突变体CGT酶(G178R)，将第454的酪氨酸残基置换为组氨酸残基的突变体CGT酶 (Y454H)的2种酶。将保持来源于依利诺斯类芽孢杆菌NBRC15379株的天然型(野生型)CGT酶基因的重组DNA“pRSET-iPI”用作模型，将具有序列表序列编号8以及9分别所示的碱基序列的合成核苷酸分别作为同义引物以及反义引物，使用市售的“QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit”(ストラタジ一ン社制)，通过常规方法的PCR法，DpnI法，将部位特异的变异导入CGT酶基因，由此，得到编码突变体CGT酶(G178R)的重组DNA“pRSET-iPI(G178R)”。此外，将具有序列表序列编号10以及11分别所示的碱基序列的合成核苷酸分别作为同义引物以及反义引物，除此之外，与上述同样地得到，编码突变体CGT酶(Y454H)的重组DNA“pRSET-iPI(Y454H)”。

分别使用保持突变体CGT酶基因的重组DNA“pRSET-iPI(G178R)”以及“pRSET-iPI(Y454H)”，根据常规方法，将大肠杆菌BL21(DE3)(ストラタジ一ン社制)遗传转化，分别取得保持重组DNA的遗传转化体“BL21-RSET-iPI(G178R)”以及“BL21-RSET-iPI(Y454H)”。与上述“BL21-RSET-iPI”的情况同样地，培养这些遗传转化体，破碎菌体之后，部分精制，得到各个突变体CGT酶的部分精制标准品。另外，测定各个菌体破碎液上清的CGT酶活性(淀粉分解活性)，换算为每培养液1ml的酶活性，之后，“BL21-RSET-iPI(G178R)”的酶活性是约10.3单位/ml、“BL21-RSET-iPI(Y454H)”的酶活性是约13.7单位/ml。

<含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备>

使用上述得到的重组型(野生型)CGT酶，作为突变体CGT酶的G178R(具有序列表序列编号12所示的氨基酸序列的CGT酶)，或者，Y454H(具有序列表序列编号13所示的氨基酸序列的CGT酶)，除此之外，根据与实施例2同样的方法，制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末。测定使用各个CGT酶得到反应液中的海藻糖含量、得到的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的糖组分、对淀粉收率、海藻糖二水合物晶体的结晶度、平均微晶径、粉末全体的还原力、粒度分布，使粉末经历，采用与实验2-2、实验3-2等相同的方法的固结性试验以及与采用实验5相同的方法的对水的溶解性试验。结果总结于表6。

【表6】

如同表6中所显示的，即使在使用重组型CGT酶和1氨基酸置换突变体CGT酶的情况下，通过酶反应液中的海藻糖含量是与天然型CGT酶的情况同等的87.0％以上的相同的制备方法，以所谓约44％～45％的高对淀粉收率可以制备，具有几乎同等的海藻糖纯度、结晶度、粒度分布等的含有海藻糖二水合物晶体的粉末。此外，通过本制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，与实施例1至4中使用天然型CGT酶制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末同样地、与作为食品原料等的市售的以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“トレハ”、株式会社林原销售)相比，海藻糖纯度中尽管没有那种程度的差异，但是，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，是显著固结难的粉末，是保存和使用容易的粉末。

【实施例6】

在海藻糖二水合物晶体的结晶步骤中，使用广泛使用的结晶系统用程序恒温循环装置，使控制温度的热介质流入辅助结晶罐的夹套，采用近似于上述式[2]的20阶段的冷却曲线，历经24小时，通过应用控制冷却法，将温度从60℃冷却至20℃，使海藻糖二水合物晶体结晶，除此之外，根据与实施例2同样的方法，制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末，以对淀粉收率约46％得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末，所述粉末含有基于无水物换算的99.7％的海藻糖，0.05％的D-葡萄糖，0.03％的4-O-α-葡萄糖基海藻糖，以及，0.05％的6-O-α-葡萄糖基海藻糖。

本发明含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖二水合物晶体结晶度是96.8％，平均微晶径是粉末全体的还原力是0.13％。此外，上述结晶度的测定采用Hermans法而进行，使用根据实验4-2求出的解析值H₁₀₀以及H₀进行。测定本品的粒度分布后，发现含有的是，84.5％的粒径为53μm以上且不足425μm的粒子，76.2％的粒径为53μm以上且不足300μm的粒子，以及，6.4％的粒径425μm以上的粒子。使用本品，根据与实验2-2、实验3-2等相同的方法，进行固结性试验，之后，确定了“没有固结”(-)。此外，根据与实验5相同的方法检验对水的溶解性，之后，确定了溶解性“良”。

通过本例的制备方法，以所谓约46％的高对淀粉收率可以制备，含有海藻糖二水合物晶体的粉末。此外，通过本制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，与作为食品原料等的市售的以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“トレハ”、株式会社林原销售)相比，海藻糖纯度中尽管没有那种程度的差异，但是，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，是显著固结难的粉末，保存和使用是容易的。本品，因为是海藻糖的二水合物含有晶体粉末，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末同样地是，保存和使用是容易的，因此，可以更加适宜地用作食品原料、化妆品原料、准药物原料、以及医药品原料等。

【比较例】

<含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备>

作为CGT酶，使用来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属Tc-91株的CGT酶酶类试剂(株式会社林原制)的，除此之外，与实施例1同样地，进行海藻糖生成反应以及葡糖淀粉酶处理，之后，葡糖淀粉酶处理后的反应液的基于无水物换算的海藻糖含量是85.2％。将这种反应液，根据常规方法，通过活性炭脱色过滤，将滤液采用阳离子交换树脂(H+型)以及阴离子交换树脂(OH-型)脱盐，减压浓缩，形成固体浓度约84％的浓缩液。将其置于辅助结晶罐，添加1％试剂级的含有海藻糖二水合物晶体的粉末(商品名为“海藻糖999”、代码编号:TH224、海藻糖纯度99.9％以上、株式会社林原销售)作为晶种，达到55℃。接着，同时温和搅拌该含有海藻糖的溶液，通过自然冷却使所述含有海藻糖的溶液，历经20小时从55℃至15℃，使海藻糖的二水合物晶体结晶。通过篮式离心分离器，回收晶体，通过相对于糖膏重量的约5％的纯化水喷雾洗涤晶体之后，在50℃2小时，熟化，干燥，喷出20℃的空气20分钟，冷却，粉碎，虽然得到含有海藻糖二水合物晶体的粉末含有，基于无水物换算的98.5％的海藻糖，0.8％的D-葡萄糖，0.07％的4-O-α-葡萄糖基海藻糖，以及，0.1％的6-O-α-葡萄糖基海藻糖，但是，所述粉末对淀粉收率是约38％。

本发明含有海藻糖二水合物晶体的粉末的海藻糖二水合物晶体结晶度是88.3％，平均微晶径是粉末全体的还原力是1.0％。此外，上述结晶度的测定采用Hermans法而进行，使用根据实验4-2求出的解析值H₁₀₀以及H₀进行。测定本品的粒度分布后，发现含有的是，74.4％的确粒径为53μm以上且不足425μm的粒子，69.4％的粒径为53μm以上且不足300μm的粒子，以及，12.6％的粒径425μm以上的粒子。使用本品，通过与实验2-2、实验3-2等相同的方法，进行固结性试验，之后，确定了“稍微存在固结”(±)。此外，根据与实验5相同的方法检验对水的溶解性，之后，判断的是溶解性“良”。

【产业上的利用可能性】

如上所述，通过本发明的含有海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法，将淀粉作为原料，以高对淀粉收率可以制备，以与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末同样高纯度，并且，固结难的含有海藻糖二水合物晶体的粉末。具体地说，在海藻糖二水合物晶体的结晶步骤中应用控制冷却法或者拟似控制冷却法的情况下，以更高对淀粉收率可以制备，含有更高纯度的海藻糖二水合物晶体粉末。如此，本发明制备方法，将有限地说是丰富存在的资源的淀粉作为原料，可以更加效率地，以适于工业的规模制备含有海藻糖二水合物晶体的粉末，其在产业上的有用性方面是特别的。此外，通过应用控制冷却法或者拟似控制冷却法的本发明制备方法制备的含有海藻糖二水合物晶体的粉末，与以往食品级含有海藻糖二水合物晶体的粉末相比，是显著固结难的粉末，作为使用更加容易的粉末状的食品原料、化妆品原料、准药物原料，或者医药品原料，可以用于各种用途，这具有出色的产业上的利用可能性。这也使得，产生显著作用效果的本发明具有极其大的产业上的有用性。

【符号的说明】

图1中，

a:用于微晶径的算出的衍射角(2θ)13.7°(米勒指数(hkl):101)的衍射峰

b:用于微晶径的算出的衍射角(2θ)17.5°(米勒指数:220)的衍射峰

c:用于微晶径的算出的衍射角(2θ)21.1°(米勒指数:221)的衍射峰

d:用于微晶径的算出的衍射角(2θ)23.9°(米勒指数:231)的衍射峰

e:用于微晶径的算出的衍射角(2θ)25.9°(米勒指数:150)的衍射峰图5中，

a:控制冷却曲线

b:直线冷却

c:自然冷却曲线

图6中，

pUC ori:来源于质粒pUC的复制开始点

T7:T7启动子

白色箭头(Amp):氨苄西林耐性基因

黑色箭头:CGT酶基因

Claims

1.含有α,α-海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法，

所述含有α,α-海藻糖二水合物晶体的粉末含有基于无水物换算的99.0质量％以上的α,α-海藻糖，

基于粉末X射线衍射图谱算出的α,α-海藻糖二水合物晶体的结晶度是90.0％以上，

所述方法包括如下步骤：

使异淀粉酶和环麦芽糖糊精-葡聚糖转移酶与来源于节杆菌属微生物的α-糖基海藻糖合酶和来源于节杆菌属微生物的海藻糖分离酶作用于液化淀粉，接着，使葡糖淀粉酶发挥作用，得到含有α,α-海藻糖的糖液的步骤，

从上述糖液，使α,α-海藻糖二水合物晶体结晶的步骤，以及，

通过离心分离而收集结晶的α,α-海藻糖二水合物晶体，使其熟化、干燥的步骤，

所述方法特征是，

通过使用上述环麦芽糖糊精-葡聚糖转移酶，不经过采用柱色谱法的分馏步骤，使得上述糖液中的α,α-海藻糖含量超过基于无水物换算的86.0质量％，所述环麦芽糖糊精-葡聚糖转移酶

具有序列表中序列编号1、2、3、12或者13中的任一个所示的氨基酸序列、或

在不实质性地变更该酶的底物特异性或酶活性的范围内具有在序列表中序列编号1、2、3、12或者13中的任一个所示的氨基酸序列中缺失、置换或插入1个以上至30个的氨基酸残基的氨基酸序列，

通过控制冷却法或者拟似控制冷却法进行上述使α,α-海藻糖二水合物晶体结晶的步骤，其中

所述控制冷却法是指当将作为结晶步骤设定的操作时间设为“τ”、将结晶开始时的液温设为“T₀”、将结晶结束时的目标液温设为“T_f”、将时间“t”中的液温设为“T”时，时间t中的液温T由下述式表示的冷却方法：

T＝T₀-(T₀-T_f)(t/τ)³，且

所述拟似控制冷却法是指，当将t＝τ/2的时间点的液温设为T_m时，使液温T相对于时间t连续地或者分阶段地降低至在t＝τ/2的时间点的液温的变化量“T₀-T_m”维持在总温度变化量“T₀-T_f”的5％以上但不足50％的范围的冷却方法。

2.含有α,α-海藻糖二水合物晶体的粉末，其

含有基于无水物换算的99.0质量％以上99.7质量％以下的α,α-海藻糖，

基于粉末X射线衍射图谱算出的α,α-海藻糖二水合物晶体的结晶度是90.0％以上96.8％以下，

含有占粉末全体的80％以上的粒径为53μm以上且不足425μm的粒子、占粉末全体的60％以上的粒径为53μm以上且不足300μm的粒子。