BR112014006682B1 - composição particulada compreendendo di-hidrato de alfa, alfa-trealose cristalino e seu método de produção - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO PARTICULADA COMPREENDE DI-HIDRATO DE ALFA, ALFA-TREALOSE CRISTALINO E SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO. É fornecido um método de produção, para produzir um pó contendo di hidrato de trealose cristalino com amido como um material de partida com rendimentos elevados de pó para amida. . No método de produção , uma enzima natural ou recombinante derivada de um micro-organismo pertencente ao gênero paenibacillus ou uma variante de uma tal enzima é utilizada de forma que o teor de alfa, alfa-trealose na solução de sacarídeo é mais de 86,0 % em massa em uma base sólida seca, sem ter que passar através de um etapa de fracionamento por cromatografia de coluna.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um processo para a produ ção de uma composição particulada contendo di-hidrato de α,α- trealose cristalino, em particular, a um processo para a produção de uma composição particulada de alta pureza que contém o di-hidrato de α,α-trealose cristalino, que produz uma composição particulada contendo di-hidrato de α,α-trealose cristalino a partir do amido em uma escala industrial e com um rendimento satisfatório através de etapas consistentes, e a uma composição particulada contendo di-hidrato de α,α-trealose cristalino assim obtida.

Antecedentes da Técnica

[0002] Vários métodos têm sido convencionalmente conhecidos como processos para a produção de composições particuladas contendo di-hidrato de α,α-trealose cristalino ("α,α-trealose" é abreviada como "trealose" em todo o relatório descritivo, a seguir). Por exemplo, a Literatura de Patente 1 divulga um processo para a produção de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino por deixar a β-amilase com ou sem uma enzima de desramificação de amido atuar sobre o amido liquefeito, permitindo uma enzima de conversão de maltose/trealose atuar sobre a mistura resultante para se obter uma solução de sacarídeo contendo trealose, que apropriadamente purifica a solução de sacarídeo, e cristaliza a trealose; e a Literatura de Patente 2 divulga um processo para a produção de uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino mediante a permissão de uma enzima de formação de α- glicosiltrealose (outro nome "uma enzima de formação de sacarídeos não redutores") e uma enzima de liberação de trealose juntamente com uma enzima de desramificação do amido para atuar sobre o amido liquefeito, o que permite a glucoamilase atuar sobre a mistura resultante para se obter uma solução de sacarídeo contendo trealose, apropriadamente a purificação da solução de sacarídeo, e a cristaliza- ção da trealose.

[0003] As Literaturas de Patente 3 e 4 divulgam os processos para a produção de composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino, que aumentam o teor de trealose na solução de sacarí- deo contendo contendo a trealose acima identificada através da modificação do processo divulgado na Literatura de Patente 2, em que uma enzima de desramificação de amido e uma ciclodextrina glucanotransferase (abreviada como "CGTase", a seguir) são deixadas atuar sobre os seus substratos, com um uso de combinação de uma enzima de formação de α-glicosiltrealose e uma enzima de liberação da trealose. As Literaturas de Patente 5 e 6 divulgam os processos para a produ- ção de composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino mediante a permissão de uma enzima de formação de α- glicosiltrealose termoestável derivada de um micro-organismo do gê- nero Sulfolobus ou uma enzima de formação de α-glicosiltrealose termoestável e uma enzima de liberação de trealose termoestável atuar no amido liquefeito para se obter uma solução de sacarídeo contendo trealose, purificando apropriadamente a solução, e cristalizando a trealose.

[0004] Entre estes processos de produção convencionais, no caso do uso combinacional que utiliza as enzimas divulgadas nas Literaturas de Patente 3 e 4, uma solução de sacarídeo contendo trealose com um teor de trealose de mais de 80 % em peso, em uma base sólida seca (d.s.b.), pode ser facilmente preparada a partir do amido liquefeito como um material com apenas reações enzimáticas sem passar através de uma etapa de fracionamento por cromatografia em coluna, e possui o mérito de que a solução de sacarídeo contendo trealose assim preparada possui uma capacidade de cristalização satisfatória de trealose, porque a sua composição de sacarídeo é composta aproximadamente de glicose, exceto para a trealose. Portanto, de acordo com os processos de produção acima divulgados nas Literaturas de Patente 3 e 4, uma composição particulada de pureza relativamente elevada contendo di-hidrato de trealose cristalino pode ser produzida mediante a precipitação do di-hidrato de trealose cristalino da solução de sacarídeo contendo trealose acima e sujeição da mistura resultante a um método de separação de sólido-líquido por centrifugação para coletar os cristais.

[0005] Particularmente, nos processos de produção acima divul gados nas Literaturas de Patente 3 e 4, quando as enzimas derivadas de micro-organismos do gênero Arthrobacter são utilizadas como a enzima de formação de α-glicosiltrealose e a enzima de liberação de trealose, tais enzimas podem ser vantajosamente utilizadas de forma distinta na produção de uma composição particulada contendo di- hidrato de trealose cristalino em uma escala industrial, porque os mi-cro-organismos podem se desenvolver relativamente rápido e também possuem uma elevada produtividade das enzimas acima. Assim, o re-querente da presente invenção continuou agora a produção de "TREHA", um nome de produto de uma composição particulada de alta pureza contendo di-hidrato de trealose cristalino com uma pureza de pelo menos 98,0 % em peso como um produto padrão, comercializado por Hayashibara Co. , Ltd., Okayama, Japan (denominado "um pó de grau alimentício contendo di-hidrato de trealose cristalino", a seguir), mediante o uso das enzimas derivadas de um micro-organismo do gê-nero Arthrobacter como a enzima de formação de α-glicosiltrealose e a enzima de liberação da trealose, e pelos processos divulgados nas Literaturas de Patente 3 e 4; e comercialização de "TREHA" principal-mente como um material para produtos alimentícios, cosméticos, etc. No momento, de acordo com o processo de produção acima, no en-tanto, o teor de trealose na solução de sacarídeo contendo trealose obtida pelas reações enzimáticas permanece ao redor de cerca de 85 % em peso, d.s.b., e o rendimento de trealose em comparação com o amido não chega a 40 % em peso mesmo quando as condições da reação enzimática forem variadamente otimizadas.

[0006] Embora as Literaturas não Patentes 1 e 2 divulguem que uma solução de sacarídeo contendo trealose com um teor de trealose de cerca de 87 % em peso, d.b.s., ela é obtida por deixar as enzimas recombinantes, que foram preparadas mediante a permissão dos res-pectivos genes para uma enzima de formação de α-glicosiltrealose termoestável, enzima de liberação de trealose termoestável e isoami- lase termoestável derivada de um micro-organismo da espécie Sul- folobus solfataricus expressar em Escherichia coli (E. coli), ou por dei-xar as enzimas mutantes, que foram construídos pela introdução adi-cional de mutações específicas do sítio nos genes acima descritos, atuarem sobre o amido solúvel.

[0007] No entanto, visto vez que o amido solúvel usado como um material nas Literaturas não Patentes 1 e 2, que é preparado através do tratamento de amido com um ácido para remover as partes amorfas em grânulos de amido, é um material bastante específico e caro, o uso de tal amido solúvel como um material para a produção em escala in-dustrial de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealo- se cristalino é dispendioso, dificilmente aceitável, mesmo se uma solu-ção de reação enzimática com um teor aumentado de trealose seja obtida. Quando as enzimas recombinantes ou as enzimas mutantes divulgadas nas Literaturas não Patentes 1 e 2 podem atuar em amido solúvel, mas não no amido liquefeito utilizado em uma produção em escala industrial, o teor de trealose na solução de sacarídeo contendo trealose obtida pelas reações enzimáticas é compreensivelmente tão baixo quanto cerca de 87 % em peso, e ainda permanece no nível de cerca de 85 % em peso, e não pode ser esperado de melhorar o ren-dimento de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealo-se cristalino em comparação com o amido mais do que aqueles dos processos de produção atuais.

[0008] Consequentemente, se apenas o teor de trealose em uma solução de sacarídeo contendo trealose for simplesmente aumentado para 86,0 % em peso ou mais, um fracionamento de coluna utilizando a cromatografia em coluna pode possivelmente ser aplicado na solução de sacarídeo contendo trealose para obter uma fração rica em tre- alose. Quando um tal fraccionamento de coluna for empregado, quanto mais etapas, tanto mais elevado se torna o custo de produção, e além do mais, uma perda inevitável de trealose contida nas frações diferentes das frações coletadas ricas em trealose pode ser induzida e não pode ser evitada a redução do rendimento de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino em comparação com o amido por uma grande margem, mesmo se uma solução de sa- carídeo contendo trealose com um teor de trealose de mais de 86,0 % em peso, d.b.s., for obtida pelo fracionamento de coluna acima de uma tal forma de preparação de uma composição particulada contendo di- hidrato de trealose cristalino mediante a coleta de di-hidrato de trealose cristalino precipitado a partir de uma tal solução de sacarídeo.

[0009] Se apenas simplesmente aumentar o rendimento de produ ção em comparação com o amido, o seguinte assim chamado método de açúcar total pode ser empregado em lugar de empregar o método de separação sólido-líquido para a coleta de cristais precipitados atra-vés da centrifugação; uma massa cozida contendo cristais precipitados é colocada em um recipiente e deixada cristalizar/solidificar o conteúdo total e pulverizar o produto resultante para se obter um pó, ou uma massa cozida é secada por pulverização para se obter um pó. No en-tanto, no caso de tal método de açúcar total, visto que mesmo os con-comitantes, que são característicos para o método usado, tais como a glicose contida em uma massa cozida, são pulverizados juntamente com a trealose cristalizada, o teor de trealose na composição particu- lada resultante contendo di-hidrato de trealose cristalino não é aumen-tado para um nível maior do que o teor de trealose na massa cozida, e uma composição particulada de alta pureza contendo di-hidrato de tre- alose cristalino não pode ser obtida como uma desvantagem.

[00010] O amido é um material que agora é relativamente abundante e facilmente disponível a um preço baixo, no entanto, não é uma substância inesgotável e está limitada na sua quantidade total produ-zida anualmente por seres humanos sobre a terra. Por outro lado, o amido é amplamente utilizado e tem sido utilizado recentemente como um novo material combustível para o bioetanol, etc., como um recente aumento da demanda com relação a energia limpa, além do uso con-vencional para as indústrias, produtos alimentícios, rações, e materiais alimentares. Sob estas circunstâncias, a melhora do rendimento de produção em comparação como o amido para um produto ou uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino é muito importante em termos de utilização eficaz dos recursos limitados. Literatura da Técnica Anterior Literatura de Patente [Literatura de Patente 1] Patente Japonesa Kokai No. 170977/95 [Literatura de Patente 2] Patente Japonesa Kokai No. 213283/95 [Literatura de Patente 3] Patente Japonesa Kokai No. 73504/96 [Literatura de Patente 4] Patente Japonesa Kokai No. 2000-228980 [Literatura de Patente 5] Patente Japonesa Kokai No. 66188/96 [Literatura de Patente 6] Patente Japonesa Kokai No. 66187/96 Literatura não Patente [Literatura não Patente 1] Journal of Agricultural and Food Chemistry, Fang et al., Vol. 55, pp. 5588-5594, 2007 [Literatura não Patente 2] Journal of Agricultural and Food Chemistry, Fang et al., Vol. 56, pp. 5628-5633, 2008

Descrição da Invenção Objetivo da Invenção

[00011] A presente invenção, que foi criada para resolver os incon-venientes nos processos convencionais acima identificados para a produção de composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino e para aumentar o rendimento de tais composições particu- ladas em comparação com o amido mantendo a pureza de trealose, possui o objetivo de fornecer um processo para a produção de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino que permite a produção de uma composição particulada de alta pureza contendo di-hidrato de trealose cristalino com um rendimento satisfató-rio, através das etapas consistentes utilizando o amido como um mate-rial, e para fornecer uma nova composição particulada contendo di- hidrato de trealose cristalino produzido pelo processo.

Meios para Alcançar o Objetivo

[00012] Para superar os objetivos acima, os presentes inventores continuaram a estudar através de considerações e tentativas e erros sobre a combinação das enzimas utilizadas nos métodos de produção acima divulgados nas Literaturas de Patente 3 e 4, revelando que, quando as enzimas derivadas de micro-organismos do gênero Arthrobacter, que são fáceis de cultivar e de alta produtividade em enzimas, são utilizadas como uma enzima de formação de α- glicosiltrealose e uma enzima de liberação de trealose, o uso de uma CGTase natural ou recombinante derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus ou uma enzima mutante deste, em lugar da CGTase derivada da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 (FERM BP-11273) que foi usado até agora, procede de forma mais eficiente de uma reação de formação de trealose e melhora o teor de trealose em uma solução de sacarídeo contendo trealose após o tratamento com glucoamilase até um nível de, em uma base sólida seca, mais de 86,0 % em peso, de preferência, 87,0 % em peso ou mais, sem passar através de uma etapa de fracionamento através da cromatografia de coluna. A solução de sacarídeo contendo trealose assim obtida está da maneira convencional descolorada, dessalinizada e concentrada antes da precipitação do di-hidrato de trealose cristalino, seguido pela coleta dos cristais resultantes por uma centrífuga, e o amadurecimento e secagem dos cristais para se obter uma composi-ção particulada de alta pureza contendo di-hidrato de trealose cristalino com um teor de trealose de 98,0 % em peso ou mais, d.s.b., em um rendimento de produção mais elevado do que nunca em comparação com o amido. Assim, eles concluíram a presente invenção.

[00013] A presente invenção resolve os objetivos acima fornecendo um processo para a produção de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino com um teor de trealose de 98,0 % em peso ou mais, d.s.b., caracterizado pelo fato de que o processo contém as etapas de deixar, juntamente com uma enzima de desrami- ficação do amido e CGTase, uma enzima de formação de α- glicosiltrealose e uma enzima de liberação de trealose que são derivadas de um micro-organismo do gênero Arthrobacter atuar sobre o amido liquefeito, deixar a glucoamilase atuar sobre a mistura resultante para se obter uma solução de sacarídeo contendo trealose, precipitar o di-hidrato de trealose cristalino da solução de sacarídeo, coletar o di- hidrato de trealose cristalino precipitado através de uma centrífuga, e amadurecer e secar os cristais, em que um derivado de CGTase natu- ral ou recombinante de um micro-organismo do gênero Paenibacillus ou um mutante deste é usado como a CGTase acima para aumentar o teor de trealose na solução de sacarídeo acima em mais de 86,0 % em peso, d.s.b., sem passar através de uma etapa de fraccionamento através da cromatografia de coluna.

[00014] De acordo com a confirmação dos presentes inventores, a composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino pro-duzida pelo processo acima da presente invenção não é de maneira nenhuma inferior à um pó convencional de qualidade alimentar con-tendo di-hidrato de trealose cristalino em vista da sua pureza satisfató-ria de trealose e capacidade de circução livre, e pode ser usada como um material para os produtos alimentícios e cosméticos semelhantes a um pó convencional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de tre- alose cristalino.

[00015] Exemplos do micro-organismo acima do gênero Paenibaci- llus como uma fonte para a CGTase incluem aqueles das espécies Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus pabuli e Paenibacillus amylolyticus, entre os quais aqueles das espécies Paenibacillus illinoi- sensis e Paenibacillus pabuli são preferíveis pelo fato de que eles pro-duzem CGTases tendo um efeito de melhora em alto grau do teor de trealose em uma solução de reação enzimática na reação de formação da trealose, em particular, aqueles da espécie Paenibacillus illinoisen- sis são preferíveis.

[00016] Como as CGTases acima, aquelas que possuem as seguintes sequências parciais de aminoácido de (a) a (d) são preferivelmente utilizadas: Gly-Ser-X1-Ala-Ser-Asp; Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn; Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys; and Val-Asn-Ser-Asn-X2-Tyr. (Em que X1 significa Ala ou Ser e X2 significa Ala ou Thr, respectiva-mente)

[00017] Exemplos de CGTases mais preferíveis utilizáveis na presente invenção são aqueles que possuem qualquer uma das sequências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, 12 e 13.

[00018] Os presentes inventores ainda repetiram a tentativa e erro e revelaram que, quando o di-hidrato de trealose cristalino é precipitado da solução de sacarídeo contendo trealose acima com um teor de trealose, sobre uma base sólida seca, de mais de 86,0 % em peso, de preferência, 87,0 % em peso ou mais, o rendimento de produção da composição particulada resultante contendo di-hidrato de trealose cris-talino em comparação com o amido pode ser aumentado em maior grau mediante a aplicação nesse particular do método de esfriamento controlado descrito mais tarde ou do método de esfriamento semicon- trolado, em comparação com o caso de precipitação do di-hidrato de trealose cristalino através de um método de esfriamento espontâneo para o esfriamento da temperatura de uma solução de sacarídeo con-tendo trealose por deixá-la na natureza. Com detalhes, a presente in-venção também resolve os objetivos acima por fornecer um processo para a produção de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, em que a etapa acima para a precipitação do di- hidrato de trealose cristalino é efetuada através de um método de es-friamento controlado ou um método de esfriamento semicontrolado.

[00019] O motivo pelo qual o rendimento de produção em comparação com o amido é aumentado pela aplicação de um tal método de esfriamento controlado ou método de esfriamento semicontrolado é incerto, no entanto, pode-se especular que qualquer um destes méto-dos pode inibir tanto um aumento rápido do grau de saturação quanto uma formação de núcleos de cristal secundários mediante o esfria- mento para formar uma pluralidade de núcleos de cristal diminutos classificados por tamanho substancialmente homogêneos na fase ini-cial de cristalização, e pode desenvolver uma pluralidade de núcleos de cristal classificados por tamanho homogêneos todos ao mesmo tempo mediante o esfriamento pontual de uma pluralidade de núcleos de cristal classificados por tamanho aproximadamente homogêneos na fase final de cristalização e, portanto, uma massa cozida contendo cristais com uma menor quantidade de microcristais e uma granulome- tria uniforme é obtida para facilitar a recuperação dos cristais por cen-trifugação, e os cristais recuperados podem ser lavados com uma quantidade relativamente pequena de água para reduzir a perda de trealose quando da lavagem.

[00020] Além disso, os presentes inventores observaram que a composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino pre-parado mediante a aplicação de um método de esfriamento controlado ou um método de esfriamento semicontrolado para a precipitação de di-hidrato de trealose cristalino de forma semelhante como no acima é surpreendentemente superior pelo fato de que é dificilmente aglutiná- vel em comparação com uma composição particulada contendo o di- hidrato de trealose cristalino e um pó convencional de qualidade ali-mentar contendo o di-hidrato de trealose cristalino, que são preparados por um método de esfriamento não forçado. Eles confirmaram que estas propriedades superiores são devido às diferenças na pureza da trealose e ao grau de cristalinidade com relação ao di-hidrato de trea-lose cristalino de uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino, e assim eles concluíram a presente invenção quanto a uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino per se.

[00021] Mais especificamente, a presente invenção resolve os obje-tivos acima por fornecer uma composição particulada contendo o di- hidrato de trealose cristalino, obtido pelo processo de empregar um método de esfriamento controlado ou um método de esfriamento se- micontrolado na precipitação de di-hidrato de trealose cristalino, o qual contém, em uma base de sólidos secos, 99,0 % em peso ou mais, mas não mais do que 99,6 % em peso de trealose e possui um grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino de 90,0 % ou mais elevado, mas não mais elevado do que 96,0 % quando determinado no seu perfil de difração de raio x em pó.

[00022] Para referência, uma composição particulada contendo di- hidrato de trealose cristalino, a qual contém, em uma base sólida seca, 99,0 % em peso ou mais, mas não mais do que 99,6 % em peso de trealose e possui um grau de cristalinidade com relação ao di-hidrato de trealose cristalino de 90,0 % ou mais elevado, mas não mais eleva-do do que 96,0 % quando determinado no seu perfil de difração de raio x em pó, é uma nova composição particulada distinguível de um pó convencional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino em que possui um grau significativamente maior de cristalini-dade para o di-hidrato de trealose cristalino do que aquele de um pó convencional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino, mesmo embora o teor em trealose seja substancialmente o mesmo ou um nível ligeiramente mais elevado do que aquele de um pó convencional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino.

[00023] A razão pela qual uma composição particulada dificilmente aglutinável contendo di-hidrato de trealose cristalino é obtida através da aplicação de um método de esfriamento controlado ou um método de esfriamento semicontrolado é incerto, no entanto, pode-se especular que o incremento tanto da pureza da trealose quanto do grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino pode executar so-bre o acima porque, como descrito acima, uma massa cozida que con- tém cristais com uma menor quantidade de microcristais e uma granu- lometria homogênea é obtida por um tal método de esfriamento contro-lado ou um tal método de esfriamento semicontrolado. Esta especula-ção também pode ser evidenciada ainda pelo fato de que o grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino da composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino da presente in-venção, obtido através da aplicação de um método de esfriamento controlado ou um método de esfriamento semicontrolado, é significati-vamente mais elevado do que aquele de uma composição particulada obtida através de um método de esfriamento não forçado e um pó convencional de qualidade alimentar contendo o di-hidrato de trealose cristalino.

Efeito da Invenção

[00024] De acordo com o processo da presente invenção, uma composição particulada de alta pureza contendo di-hidrato de trealose cristalino pode ser obtida com um rendimento de produção satisfatório em comparação com o amido e em uma escala industrial através de etapas consistentes de se utilizar o amido como um material e uma enzima de formação de α-glicosiltrealose e uma enzima de liberação de trealose, derivada de um micro-organismo do gênero Arthrobacter, que é facilmente cultivado e poderoso em produtividades de enzima. Consequentemente, o processo concede uma contribuição vantajosa para o uso eficaz dos recursos de amido como um material. Em parti-cular, quando um método de esfriamento controlado ou um método de esfriamento semicontrolado é aplicado na precipitação de di-hidrato de trealose cristalino a partir de uma solução de sacarídeo contendo trea- lose, o rendimento de produção de uma composição particulada pro-duzida, contendo di-hidrato de trealose cristalino, em comparação com o amido é melhorado ainda mais como um mérito. A composição parti- culada contendo di-hidrato de trealose cristalino produzida pelo pro- cesso da presente invenção, que aplica um método de esfriamento controlado ou um método de esfriamento semicontrolado, é uma com-posição particulada superior em que é dificilmente aglutinável e eleva-da tanto na pureza de trealose quanto no grau de cristalinidade para o di-hidratado de trealose cristalino, em comparação com um pó con-vencional de grau alimentício contendo di-hidrato de trealose cristalino.

Breve Descrição dos Desenhos

[00025] A FIG. 1 é um exemplo de um padrão de difração de raio x em pó com um raio x característico para uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, a qual consiste substancial-mente de di-hidrato de trealose cristalino.

[00026] A FIG. 2 é um exemplo de um padrão de difração de raio x em pó com um raio x característico para uma composição particulada contendo trealose,,a qual consiste substancialmente de uma forma amorfa de trealose.

[00027] A FIG. 3 é um exemplo de um padrão de difração de raio x em pó com uma radiação de síncroton para uma composição particu- lada contendo di-hidrato de trealose cristalino, a qual consiste subs-tancialmente de didrato de trealose cristalino.

[00028] A FIG. 4 é um exemplo de um padrão de difração de raio x em pó com uma radiação de síncrotron para uma composição particu- lada contendo trealose, a qual consiste substancialmente de uma forma amorfa de trealose.

[00029] A FIG. 5 é uma figura de padrões de esfriamento.

[00030] A FIG. 6 é uma figura da estrutura e dos sítios de reconhe cimento da enzima de restrição de um DNA recombinante "pRSET-ipI", que contém um gene de CGTase derivado da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379.

Melhor Modo Para a Realização da Invenção Definição dos termos

[00031] Em todo o relatório descritivo, os seguintes termos significam como se segue: <Rendimento de produção em comparação com o amido>

[00032] O termo "rendimento de produção em comparação com o amido" como referido no relatório descritivo é expresso por uma por-centagem (%) com relação à taxa do peso, d.s.b., de uma composição particulada que contém di-hidrato de trealose cristalino por unidade de massa, d.s.b., de um amido do material. O relatório descritivo assume que uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cris-talino é produzida por etapas consistentes de deixar as enzimas atua-rem sobre o amido como um material para formar a trealose, cristalizar a trealose formado, e depois coletar, amadurecer e secar a trealose cristalizada; e o significado de "rendimento de produção em compara-ção com o amido" como referido no relatório descritivo significa o ren-dimento de produção de uma composição particulada contendo di- hidrato de trealose cristalino, a qual é produzida a partir dos cristais precipitados em primeiro lugar, isto é, os cristais do primeiro estágio precipitaram a partir da solução de sacarídeo contendo trealose obtida por deixar as enzimas atuarem sobre o amido, em comparação com o amido; e não inclui qualquer composição particulada contendo dihidra- to de trealose cristalino produzido pela recristalização de uma solução de sacarídeo que permaneceu após a coleta dos cristais precipitados ou daquela que retornou com um xarope separado de uma massa co-zida, isto é, não inclui qualquer composição particulada contendo di- hidrato de trealose cristalino preparado a partir do segundo e mais cristais representados. Para comparação, quando cristalizada através da adição de um cristal semente, a quantidade do cristal semente é incluída na quantidade da composição particulada obtida contendo di- hidrato de trealose cristalino, quando se calcula o rendimento de pro-dução em comparação com o amido, em todo o relatório descritivo. <Atividade de CGTase>

[00033] O termo "atividade de CGTase" como referido no relatório descritivo é definido como se segue: Para cinco mililitros de uma solu- ção aquosa de substrato contendo 0,3 % (p/v) de um amido solúvel, tampão de acetato a 20 mM (pH 5,5) e cloreto de cálcio a 1 mM, é adicionado 0,2 ml de uma solução de enzima diluída de forma apropriada, e a solução de substrato resultante é mantida a 40 °C e tirada amostra em 0 min e 10 min após o início da reação enzimática em quantidades respectivas de 0,5 ml, seguido imediatamente pela adição de 15 ml de solução de ácido sulfúrico a 0,02 N em cada amostra para interromper a reação enzimática. Cada uma das soluções de ácido sulfúrico resultantes é misturada com 0,2 ml de solução de iodo a 0,1 N para desenvolver cores, e, após 10 minutos, as soluções coloridas são respectivamente medidos com relação à absorvência em um comprimento de onda de 660 nm por um espectrofotômetro, seguido pelo cálculo da atividade de decomposição do amido com a seguinte fórmula geral [1]. Uma unidade de atividade da CGTase é definida como a quantidade de enzima que completamente diminui a cor de iodo de uma solu- ção contendo 15 mg de amido. Fórmula [1]: [Equação 1]

[00034] Observação: "AA" significa que a absorvência em um comprimento de onda de 660 nm de uma solução de reação a 0 min após o início da reação enzimática.

[00035] "Ab" significa que a absorvância em um comprimento de onda de 660 nm de uma solução de reação a 10 min após o início da reação enzimática. <Método de esfriamento controlado>

[00036] O termo "método de esfriamento controlado" como referido no relatório descritivo significa um método para a precipitação de cristais mediante o "esfriamento controlado" e significa um método de es-friamento onde a temperatura do líquido "T" no momento "t" é basica-mente expressa pela fórmula geral [7] , em que "T" é o tempo de ope-ração estabelecido para uma etapa de cristalização, "T0" representa a temperatura do líquido no início da cristalização, e "Tf" representa a temperatura do líquido direcionada no término da cristalização. Fórmula [2]: [Equação 2] T = TO - (To - Tf) (t/T)3

[00037] Um método de esfriamento controlado é expresso com "a" na FIG. 5, quando expresso com um gráfico que descreve concretamente (esquematicamente) o método de esfriamento controlado, em que o eixo das abcissas corresponde ao tempo de operação estabelecido para uma etapa de cristalização e o eixo longitudinal corresponde à temperatura do líquido quando da cristalização. Como mostrado no símbolo "a" na FIG. 5, de acordo com um método de esfriamento con-trolado, a temperatura do líquido diminui gradualmente na fase inicial de cristalização em que a temperatura do líquido é relativamente ele-vada, mas a temperatura do líquido diminui em pontualmente na fase posterior em que a temperatura do líquido diminuiu em certa medida. Consequentemente, no momento de t = T/2, isto é, a temperatura do líquido "Tm" no ponto médio da etapa de cristalização é mantida pelo menos sobre a conexão de Tm > [(To - Tf) / 2 + Tf] (ou a mudança de temperatura no ponto médio da etapa de cristalização torna-se menos do que 5o % da variação de temperatura total). No padrão de alteração da temperatura do líquido contra o tempo, o método de esfriamento controlado é claramente distinto tanto de um método de esfriamento linear (o símbolo "b" na FIG. 5) onde a temperatura do líquido diminui linearmente com o tempo "T" a partir da temperatura do líquido To para Tf, e um método de esfriamento não forçado habitual (o símbolo "c" na FIG. 5) onde a temperatura do líquido diminui exponencial e pontual-mente na fase inicial de cristalização, mas gradualmente diminui na fase mais posterior da cristalização com uma diminuição da temperatu-ra do líquido. Para alterar a temperatura do líquido "T" como uma fun-ção do tempo "t" representada na fórmula [2] acima, por exemplo, um circulador constante programado de propósito geral comercializado para o sistema de cristalização, etc, pode ser usado.

[00038] Quando um tal método de esfriamento controlado for aplicado na etapa de cristalização, o esfriamento da temperatura do líquido é gradualmente realizado na fase inicial de cristalização após a adição de cristais sementes de trealose, e isso inibe tanto um aumento pontial do grau de saturação de trealose quanto uma nucleação secundária de cristal mediante o esfriamento e resulta em um crescimento predominante dos cristais a partir dos cristais sementes adicionados como núcleos de cristal. Enquanto isso, na fase posterior de cristaliza-ção em que os cristais dos cristais sementes adicionados como nú-cleos de cristal foram homogeneamente gerados, os cristais homoge-neamente formados são deixados crescer completamente ao mesmo tempo quando a temperatura do líquido é pontualmente esfriada, e, portanto, dá o mérito de que um método de esfriamento controlado permite uma massa cozida contendo cristais com um tamanho de par-tícula homogêneo e uma menor quantidade de microcristais. Por referência, o "método de esfriamento controlado" é descrito com de-talhes em "Wakariyasui-Batch-Shoseki" (Accessible batch crystalliza-tion), edited by Noriaki KUBOTA, published by The Society of Separa-tion Process Engineers, Japan, published on April 30, 2010, pp. 32-47. <Método de esfriamento semicontrolado>

[00039] O termo "método de esfriamento semicontrolado" como re- ferido no relatório descritivo significa literalmente um método de semi- esfriamento do método de esfriamento controlado acima identificado, em que a temperatura do líquido "T" não é estritamente alterada contra o tempo "t" de acordo com a fórmula [2] acima, e mais especificamente significa um método de esfriamento, em que a temperatura do líquido "T" é deixada linear ou gradualmente diminuir contra o tempo "t" a fim de manter a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido "T" no ponto de "t = T/2" para ser pelo menos 5 %, mas menos do que 50% da mu-dança de temperatura total (T0-Tf), de preferência, pelo menos 10 %, mas menos do que 30 %, porque, a variação que dependendo da pu-reza, concentração, grau de saturação e teor de cristal semente da trealose em uma solução contendo trealose utilizada na cristalização, é preferível que os núcleos de cristal sejam quase completamente ge-rados no momento da operação "t = T/2" (no ponto médio na etapa de cristalização). No caso de deixar a temperatura do líquido "T" diminuir linear ou gradualmente contra o tempo "t" de modo a ajustar a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido "T" no ponto de "t = t/2" para ser pelo menos 5 %, mas menos do que 50% da mudança de temperatura total (T0-Tf), a temperatura do líquido "T" diminui gradualmente contra o tempo "t" na fase inicial de cristalização, onde a temperatura do líquido é relativamente alta , enquanto que a temperatura do líquido "T" imediatamente pontualmente diminui contra o tempo "t" em uma fase posterior de cristalização, onde a temperatura do líquido diminuiu em certa medida. Como um resultado, pode ser um pouco inferior em um método de esfriamento controlado, no entanto, um método de esfria-mento semicontrolado exerce substancialmente os mesmos méritos como o método de esfriamento controlado, em que o método de esfri-amento semicontrolado permite fornecer uma massa cozida contendo cristais com uma menor quantidade de microcristais e um tamanho de partícula homogênea.

[00040] Concretamente falando, por exemplo, a temperatura do líquido "T" é deixada linear ou gradualmente diminuir contra o tempo "t" de uma tal maneira para dividir o tempo de operação "T" em pelo menos dois, de preferência, pelo menos três zonas e depois, em uma zona de fase inicial da etapa de cristalização, deixar o gradiente térmico em esfriamento alterar gradualmente (para retardar a taxa de esfriamento); e ao mesmo tempo que muda da fase inicial ou da fase média para a fase posterior, deixando o gradiente térmico aumentar (para fixar a taxa de esfriamento) para efetuar a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido "T" no ponto de "t = t / 2" para ser pelo menos 5 %, mas menos do que 50 % da mudança total de temperatura (T0-Tf), de preferência, pelo menos 10 %, mas menos do que 30 %. No caso em que a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido "T" no ponto de "t = t / 2" é pelo menos 50 % da mudança total de temperatura (T0-Tf), a taxa de esfriamento na fase inicial da etapa de cristalização é tão rápido quanto possivel para pontualmente aumentar o grau de saturação mediante o esfriamento para formar os núcleos de cristal secundários, enquanto que no caso de menos do que 5 %, a taxa de esfriamento na fase inicial da etapa de cristalização é tão lenta quanto entrar na fase posterior da etapa de cristalização, onde um esfriamento pontual irá começar antes da conclusão da formação de cristais a partir dos nú-cleos de cristal que não foram suficientemente formados a partir dos cristais sementes adicionados. Em todo o caso, torna-se impossível obter uma massa cozida contendo cristais com uma menor quantidade de microcristais e um tamanho de partícula homogêneo.

[00041] Para conduzir o método de esfriamento controlado como descrito acima, a temperatura do líquido "T" deve ser alterada como uma função do tempo "t" representado na Fórmula [2], e um mecanis-mo ou um cristalizador, o qual pode controlar a temperatura do líquido por um programa predeterminado, é essencial; no entanto, de acordo com um método de esfriamento semicontrolado, a temperatura do lí-quido "T" pode ser linear ou gradualmente diminuída contra o tempo "t", de modo a ajustar a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido "T" no ponto de "t = T / 2" até um nível de pelo menos 5 %, mas menos do que 50 % da mudança total de temperatura (T0-Tf), preferivelmente, pelo menos 10 %, mas menos do que 30 % de modo que um tal método de esfriamento semicontrolado tenha o mérito de que ele pode ser conduzido de forma relativamente fácil mesmo no caso em que não exista nenhuma possibilidade de controlar a temperatura do líquido de forma precisa. <Grau de cristalinidade>

[00042] O termo "um grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino" tal como referido no relatório descritivo, significa um valor definido pela seguinte fórmula estrutural [3]. Fórmula [3]: [Equação 3]

[00043] H100: Um valor analítico para um grau de cristalinidade, de-terminado com base no perfil de difração de raio x em pó para uma amostra padrão pó contendo di-hidrato de trealose cristalino, onde a amostra padrão em pó consiste substancialmente de di-hidrato de trealose cristalino.

[00044] H0: Um valor analítico para um grau de cristalinidade, de-terminado com base no perfil de difração de raio x em pó para uma amostra padrão em pó contendo trealose, onde a amostra padrão em pó consiste substancialmente de uma forma amorfa de trealose.

[00045] Hs: Um valor analítico para um grau de cristalinidade, de-terminado com base no perfil de difração de raio x em pó para, como uma amostra de teste, um pó contendo trealose.

[00046] Na fórmula [3], os perfis de difração de raio x em pó para a base de determinação dos valores analíticos H100, H0, e Hs podem ser geralmente determinados por um difractômetro de raio x em pó equi-pado com um sistema ótico refletor ou transmissor. Os perfis de difra- ção de raio x em pó contêm dados para os ângulos de difração e in-tensidades de difração do di-hidrato de trealose cristalino contido em uma amostra de teste ou padrão. Exemplos de métodos para determi-nar os dados analíticos para os graus de cristalinidade de tais amostras incluem o método de Herman, o método de Vonk, etc. Entre as quais o método de Herman é preferível devido à sua facilidade e precisão. Visto que estes métodos analíticos foram agora fornecidos como softwares de computador, qualquer difractômetro de raio x em pó, equipado com um mecanismo analítico instalado com qualquer um dos softwares de computador acima, podem ser utilizados adequadamente.

[00047] Como "uma amostra padrão em pó contendo di-hidrato de trealose cristalino, onde a amostra padrão em pó consiste substanci-almente de di-hidrato de trealose cristalino", para a determinação do valor analítico H100, deve ser utilizado um di-hidrato de trealose cristali-no na forma de um pó ou de um cristal único, o qual possui uma pureza de 99,9 % em peso ou superior (em todo o relatório descritivo, "% em peso" é abreviado como "%", a não ser que de outra maneira es-pecificada, mas a "%" unida ao grau de cristalinidade não deve ser li-mitada por isso), apresenta picos de difração característicos inerentes ao di-hidrato de trealose cristalino em seu padrão de difração de raio x em pó, e consiste substancialmente de di-hidrato de trealose cristalino. Exemplos destes na forma de uma composição particulada ou um único cristal incluem "TREALOSE 999" (Código No: TH224, uma pure-za de trealose de pelo menos 99,9 %), um nome de produto de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, co- mercializado pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, ou vendido pelo presente requerente como reagente analítico; e aqueles na forma de uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cris-talino ou na forma de um cristal único, obtido pela recristalização do produto acima. Por referência, quando analisados com um software de computador para o método de Herman, o perfil de difração de raio x em pó de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, como a amostra padrão em pó acima identificada, que con-siste substancialmente de di-hidrato de trealose cristalino, fornece um valor analítico H100, que geralmente varia de cerca de 50,6 % a cerca de 50,9 %.

[00048] Como "uma amostra padrão em pó contendo trealose, onde a amostra padrão em pó consiste substancialmente de uma forma amorfa de trealose" para a determinação do valor analítico H0, esta, que possui uma pureza de trealose de 99,9 % ou superior e consiste substancialmente de trealose amorfa, é utilizada. Os exemplos de uma tal amostra padrão em pó incluem aqueles que são obtidos pela disso-lução da amostra padrão em pó acima identificada para a determinação do valor analítico H100 anteriormente mencionado em uma quantidade apropriada de água refinada, que concentra a solução, liofiliza- ção do concentrado, e secagem do produto resultante in vacuo até fornecer um teor de umidade de 2,0% ou mais baixo, quando determinado pelo método de Karl Fischer. Com estes tratamentos, é sabido por experiência que uma composição particulada que consiste subs-tancialmente de uma forma amorfa de trealose é obtida. Em geral, mesmo uma composição particulada que consiste substancialmente de uma forma amorfa de trealose, o valor de análise não deve ser ne-cessariamente 0 % porque, quando a composição particulada for sub-metida a um difractômetro de raio x em pó e o perfil de difração de raio x em pó resultante é analisado no método de Herman, no método de Vonk, etc., uma parte da dispersão de luz, derivada da forma amorfa inerente ao algoritmo de um software de computador para a operação dos métodos analíticos, é calculada. Por referência, quando analisado com um software de computador para o método de Herman, o perfil de difração de raio x em pó de perfil da composição particulada contendo trealose, como a amostra padrão em pó acima identificada, que con-siste substancialmente de uma forma amorfa de trealose, fornece um valor analítico H0, geralmente, variando de cerca de 8,5 % a cerca de 8,7 %. <Diâmetro médio do cristalito>

[00049] Em geral, uma partícula de pó é reconhecida como sendo constituída por uma pluralidade de cristais isolados, isto é, cristali- tos. O tamanho do cristalito (diâmetro do cristalito) em um pó contendo cristais é especulado para ser refletido em sua propriedade. O termo "um diâmetro médio de cristalito para o di-hidrato de trealose cristalino" (denominado simplesmente de "diâmetro do cristalito", em seguida) como referido na presente invenção, significa uma média dos diâme-tros de cristalito calculada de uma tal maneira de submeter uma com-posição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino à análise de difração de de o raio x em pó; selecionar cinco picos de difração entre os picos de difração detectados sobre os padrões de difração de raio x em pó obtidos, isto é, os picos de difração (os símbolos "a" a "e" na FIG. 1) em ângulos de difração (2θ) de 13,7 ° (índice de Miller (hkl): 101), 17,5 ° (índice de Miller (hkl): 220), 21,1 ° (índice de Miller (hkl): 221), 23,9 ° (índice de Miller (hkl): 231) e 25,9 ° (índice de Miller ( hkl): 150), os quais são localizados em uma região de ângulo relativamente baixo que deve ser menos prejudicial para a largura do pico de difra- ção devido à tensão heterogênea do cristalito, e que foram bem sepa-rados de outros picos de difração; calibrar as respectivas meias largu-ras (largura total em meia maxima) e os ângulos de difração com base nos valores medidos determinadas quando o silício ("Si640d", forneci-do pelo NIST: National Institute of Standards and Technology, como uma amostra padrão para a difração de raio x) for usado como uma amostra padrão; e calcular as respectivas médias de diâmetros do cristalito com a equação de Scherrer mostrada na seguinte Fórmula [4]: Fórmula [4]: [Equação 4]

D: Tamanho do cristalito (A) À: Comprimento de onda do raio x (A) β: Largura da linha de difração (rad) θ: Ângulo de difração (°) K: Constante (0,9 quando uma meia-largura (uma largura total na meia máxima) for usada para β)

[00050] Visto que um difractômetro de raio X em pó comum é instalado com um software de computador para o cálculo de tais diâmetros do cristalito, um diâmetro médio de cristalito de di-hidrato de trealose cristalino é de forma relativa facilmente determinado contanto que uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino es-teja disponível. Antes da análise de difração de raio x em pó, cada amostra de teste é pulverizada em um almofariz e peneirada com um peneiro de 53 μm até se obter um pó que passa através da peneira para uso. <Pó redutor>

[00051] O termo "um pó redutor da composição particulada inteira" como referido no relatório descritivo pode ser obtido por utilizar D- glicose como uma substância padrão; determinar o teor de açúcar re-dutor e o teor total de açúcar, respectivamente, com base na conver são de D-glicose, pelo método de Somogyi-Nelson e o método de an- trona-ácido sulfúrico amplamente utilizado na técnica; e calcular a por-centagem (%) do teor de sacarídeo redutor para o teor total de açúcar em uma composição particulada mediante o uso da seguinte Fórmula [5]. Fórmula [5]:

<Distribuição do tamanho de partícula>

[00052] A distribuição do tamanho de partícula de uma composição particulada é determinada como se segue no relatório descritivo: as peneiras de metal com tamanhos de abertura de 425, 300, 212, 150, 106, 75 e 53 μm, produzidas por Kabushiki Gaisha Iida Seisaku-sho, Tokyo, Japan, que são concordantes com os Padrões Industriais Ja-poneses (JIS Z 8801-1), são rigorosamente pesadas, empilhadas pela ordem acima identificada, e montadas em "R-1", um nome de produto de um agitador de peneiramento ro-tap, produzido pela Kabushi- ki Gaisha Tanaka Kagaku Kikai Seisaku-sho, Osaka, Japan. Uma quantidade prescrita de amostra pesada é colocada na peneira mais elevada (tendo um tamanho de abertura de 425 μm) nas peneiras em-pilhadas, seguido pela agitação das peneiras durante 15 min, enquanto mantém o estado empilhado. Depois disso, cada uma das peneiras empilhadas foi precisamente pesada novamente, e o peso da amostra coletada em cada uma das peneiras foi determinado mediante a sub-tração do peso de cada uma das peneiras antes de carregar sobre ela a amostra a partir do peso correspondente de cada uma das peneiras após a agitação. A distribuição de tamanho de partícula é expressa pelo cálculo da porcentagem em peso (%) de cada um dos pesos das composições particuladas com os respectivos tamanhos de partícula coletados em cada uma das peneiras para o peso da amostra carre-gada na peneira mais elevada. 2. Processo para a produção de di-hidrato de trealose cris-talino da presente invenção

[00053] O processo da presente invenção basicamente inclui as se-guintes etapas de (1) a (6): uma etapa de formação de trealose que permite uma enzi-ma de formação de α-glicosiltrealose e uma enzima de liberação de trealose, que são derivadas de um micro-organismo do gênero Ar- throbacter, juntamente com uma enzima de desramificação de amido e uma CGTase natural ou recombinante ou um mutante deste atuarem sobre uma solução de amido liquefeito para formar trealose; uma etapa de tratamento com glucoamilase que permite a glucoamilase atuar sobre a solução de reação resultante que contém trealose obtida na etapa de formação de trealose; uma etapa de purificação e concentração da solução de re-ação que contém trealose mediante a filtração, descoloração, dessali- nização e concentrando da solução de reação; uma etapa de precipitação do di-hidrato de trealose cristali-no mediante a incorporação de um cristal semente de di-hidrato de trealose cristalino no concentrado contendo trealose; uma etapa de coleta de um di-hidrato de trealose cristalino resultante da massa cozida obtida na etapa de precipitação; e uma etapa de amadurecimento, secagem, e opcionalmente, pulverização do di-hidrato de trealose cristalino coletado.

[00054] As etapas acima de (1) a (6) são subsequentemente expli-cadas abaixo: <Etapa (1) (Etapa de formação da trealose)>

[00055] Esta etapa é aquela que permite uma enzima de formação de α-glicosiltrealose e uma enzima de liberação de trealose, ambas das quais são derivadas de um micro-organismo do gênero Arthrobac- ter, juntamente com uma enzima de desramificação de amido e uma CGTase natural ou recombinante ou um mutante desta atuarem sobre o amido liquefeito como um material para formar trealose.

[00056] A enzima de formação de α-glicosiltrealose é uma enzima que forma α-glicosiltrealose tendo uma estrutura de trealose no terminal molecular através da atuação sobre o amido liquefeito, enquanto que a enzima de liberação de trealose é uma enzima que libera a trea- lose através da atuação sobre α-glicosiltrealose. Consequentemente, a trealose pode ser produzida de forma eficiente mediante a permissão da enzima de formação de α-glicosiltrealose e da enzima de liberação de trealose, juntamente com uma enzima de desramificação de amido de atuarem sobre o amido liquefeito obtido pela gelatinização e lique-fação do amido.

[00057] Exemplos do amido utilizado na produção de trealose incluem qualquer um dos amidos acima do solo tais como amido de milho, amido de arroz e amido de trigo; amidos subterrâneos tais como amido de batata, amido de ocarina e amido de tapioca; e hidrolisados parciais de amido obtidos pela hidrólise parcial destes amidos com ácidos ou amilases. O amido do material é geralmente colocado em suspensão em água em uma suspensão de amido de cerca de 10 a cerca de 50 % e gelatinizado/liquefeito através do aquecimento na presença de uma α-amilase termoestável. O grau de liquefação do amido liquefeito é geralmente controlado para um equivalente de dextrose (DE) de menos do quea 10, mais particularmente, menos do que 5.

[00058] Exemplos da enzima de formação de α-glicosiltrealose e da enzima de liberação de trealose, que são derivadas de microorganismos do gênero Arthrobacter, incluem aqueles divulgados na Patente Japonesa Kokai No. 143876/95, literaturas de patente de 2 a 4, etc. A enzima de formação de α-glicosiltrealose e a enzima de liberação de trealose recombinantes, que são divulgadas nas Patentes Japonesas Kokai Nos. 322880/95, 322883/95, 298887/95 e 298880/95, e na Literatura de Patente 4, etc., podem ser utilizadas e as enzimas mutantes positivamente modificadas preparadas através da introdução de mutações específicas do sítio nestas enzimas também podem ser utilizadas. Particularmente, uma enzima de formação de α-glicosiltrealose e uma enzima de liberação de trealose, que são derivadas da cepa de Arthrobacter sp. S34 (FERM BP-6450) divulgadas na Literatura de Patente 4 ou seus derivados de mutantes com elevada produtividade de enzima, podem ser adequadamente utilizados.

[00059] No processo da presente invenção, isoamilase e pululanase, que são amplamente utilizadas na técnica, podem ser usadas como enzimas de desramificação do amido. Qualquer uma das preparações de enzima comercializadas e aquelas isoladas de microorganismos podem ser utilizadas. Exemplos de tal isoamilase incluem aqueles que são derivados de micro-organismos da espécie Pseudomonas amyloderamosa e Myroides odoratus são bem conhecidos, particularmente, um espécime de isoamilase derivado de um microorganismo da espécie Pseudomonas amyloderamosa, produzido por Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan , é preferível. Exemplos de preparações de pululanase incluem uma pululanase derivada de um micro-organismo da espécie Klebsiella pneumoniae comercializada por Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan; e "PROMOZYME", um nome de produto de uma pululanase derivada de um micro-organismo da espécie Bacillus amylopullulyticus, comercializado pela Novozymes Japan Ltd., Tokyo, Japan.

[00060] O papel da CGTase nas etapas acima de formação de trealose é para proceder ainda mais a reação acima de formação de trea lose para aumentar ainda mais o teor de trealose na solução de rea- ção por principalmente converter os malto-oligossacarídeos tendo um grau de polimerização de glicose de quatro ou mais baixo, que são inevitavelmente formados no processo de reação de formação de trealose acima por uma enzima de formação de α-glicosiltrealose e uma enzima de liberação de trealose, em malto-oligossacarídeos, tendo um grau de polimerização de glicose de cinco ou mais, através de uma reação de desproporcionação (uma reação de disposição intermolecular de sacarídeos lineares) catalisada por CGTase.

[00061] As CGTases foram isoladas de diferentes microorganismos e as suas funções e propriedades físico-químicas foram reveladas (ver, por exemplo, "Kogyo-yo-Toshitsu-Handbook" (Handbook of Industrial Enzyme for Saccharides), edited by Kodansha Scientific Ltd., Tokyo, Japan, published by Kodansha Ltd., Tokyo, Japan, pp. 28-32, 1999, etc). Os genes para algumas das CGTases acima identificadas foram clonados e as sequências de aminoácido foram determinadas com base nas sequências de base dos genes clona- dos. Também se conheceu que existem quatro regiões conservadas que são reconhecidas para comumente existir no grupo de enzimas classificadas como família de α-amilase nas sequências de aminoáci- do das CGTases acima. A proteína de CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Geobacillus stearothermophilus já foi revelada a sua estereoestrutura por uma análise estrutural de cristal por raio x, e os três resíduos catalíticos da CGTase, isto é, o 225o resíduo de ácido aspártico (D225), o 253o resíduo de ácido glutâmico (E253), e o 324o resíduo de ácido aspártico (D324), na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 foram também revelados (ver, por exemplo, "Kogyo-yo- Toshitsu-Koso-Handbook" (Handbook of Industrial Enzyme for Saccha-rides), edited by Kodansha Scientific Ltd., Tokyo, Japan, published by Kodansha Ltd., Tokyo, Japan, pp. 56-63, 1999).

[00062] Uma CGTase natural ou recombinante, derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus, ou suas enzimas mutantes, pode ser adequadamente utilizada como CGTase no processo da presente invenção. Por exemplo, as CGTases derivadas das cepas até agora conhecidas de micro-organismos das espécies Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus pabuli e Paenibacillus amylolyticus, e aque-las derivadas de um micro-organismo do gênero Paenibacillus, isola-das do mundo natural, podem ser utilizadas como uma "CGTase natu-ral derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus" como referido na presente invenção. Mais concretamente, as CGTases deri-vadas da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15959, cepa de Pa- enibacillus illinoisensis NBRC15379, cepa de Paenibacillus pabuli NBRC13638 e cepa de Paenibacillus amylolyticus NBRC15957, e aquelas derivadas de suas cepas mutantes com alta produtividade de enzima, que são obtidas através da introdução de mutações nos micro-organismos acima do gênero Paenibacillus, por exemplo, por tais como tratamentos de mutação com irradiação ultravioleta e substâncias químicas, convencionalmente utilizadas na técnica, são utilizadas mais adequadamente. Além disso, "ALKALI CD AMYLASE", um nome de produto de uma CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Paenibacillus sp., produzido por Nagase Chemtex Corp, Osaka, Japan, pode também ser utilizado como uma CGTase derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus. Incidentalmente, a CGTase, que foi convencionalmente utilizada na produção de um pó de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino, é aquela derivada de um micro-organismo da espécie Geobacillus stearothermophi- lus.

[00063] No processo da presente invenção, as CGTases, tendo as seguintes sequências de aminoácido parciais de (a) a (d), são ade-quadamente utilizadas: Gly-Ser-X1-Ala-Ser-Asp; Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn; Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys; e Val-Asn-Ser-Asn-X2-Tyr. (Em que X1 significa Ala ou Ser e X2 significa Ala ou Thr, respectiva-mente.)

[00064] As sequências de aminoácido parciais acima são caracte-rísticas das CGTases derivadas de micro-organismos do gênero Pae- nibacillus.

[00065] Como exemplos de "uma CGTase recombinante derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus" como referido na presente invenção, aqueles que são obtidos por clonagem de um gene de CGTase derivado do micro-organismo acima do gênero Paenibaci- llus e que permitem expressar o gene de CGTase clonado em um mi-cro-organismo hospedeiro apropriado tal como E. coli e Bacillus subti- lis, podem ser adequadamente utilizados. Para comparação, as CGTases derivadas da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379, cepa de Paenibacillus pabuli NBRC13638 e cepa de Pa- enibacillus amylolyticus NBRC15957 são respectivamente os genes de CGTase clonados destes micro-organismos pelo presente requerente de forma independente e das sequências de base determinadas dos genes clonados, que revelam que eles possuem as sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente. As CGTases recombinantes tendo qualquer uma das sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 1 a 3, podem ser utilizadas de forma semelhante como uma CGTase natural derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus no processo da presente invenção.

[00066] Como exemplos de "uma enzima mutante de uma CGTase derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus" (abreviado como "uma CGTase mutante", a seguir) como referido na presente in- venção, as CGTases mutantes, em que a anulação, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos são introduzidas na sequência de aminoácido do micro-organismo acima dentro de uma faixa de especi-ficidade do substrato sem alteração substancial e de atividade da en-zima como CGTase, podem ser adequadamente utilizadas. O número de resíduos de aminoácido que podem ser anulados, substituídos ou adicionados na sequência de aminoácidos de um tal mutante de CGTase não deve ser especificamente restrito, contanto que a especi-ficidade do substrato e a atividade da enzima como CGTase possam ser mantidas, no entanto, de preferência são menos do que 5 % da sequência de aminoácido que consiste de cerca de 680 resíduos de aminoácidos, isto é, resíduos de aminoácidos de até cerca de 30, de preferência, pelo menos um, mas menos do que 20, mais preferivel-mente, pelo menos um, mas menos do que 10. Também referindo- se ao sítio introduzido por mutação na sequência de aminoácido, não deve ser especificamente restrito, contanto que a especificidade do substrato e a atividade da enzima como CGTase sejam substancial-mente mantidas, no entanto, deveria ser desejavelmente evitada qual-quer introdução de mutação nas quatro regiões conservadoras que são comuns em um grupo de enzimas classificadas como a família de alfa-amilase e presentes na sequência de aminoácido de CGTase e nas sequências parciais de aminoácido acima identificadas de (a) a (d) que são características para as CGTases derivadas de microorganismos do gênero Paenibacillus.

[00067] Exemplos mais concretos de "uma CGTase natural ou re- combinante derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus ou uma enzima mutante deste" incluem as CGTases acima identifica-das tendo qualquer uma das respectivas sequências de aminoácido acima mencionadas das SEQ ID NOs: 1 a 3, e as CGTases mutantes tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12 ou 13, prepara das pela introdução de uma mutação específica do sítio no gene de CGTase da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 divulgada no Exemplo descrito mais tarde.

[00068] No processo da presente invenção, a enzima de formação de α-glicosiltrealose acima identificada derivada de um microorganismo do gênero Arthrobacter, a enzima de liberação de trealose acima identificada derivada de um micro-organismo do gênero Ar- throbacter, uma enzima de desramificação de amido, e uma CGTase derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus são adequadamente adicionadas ao amido liquefeito (pH de cerca de 4 a cerca de 10) como um substrato nas respectivas quantidades de 0,5 a 10 unidades, de 2,5 a 25 unidades, de 50 a 1000 unidades, e de 0,5 a 50 unidades por grama de amido, em uma temperatura na faixa de 30 a 60 °C durante 10 a 100 horas. O teor de trealose na solução de reação resultante no momento após o término das reacções enzimáticas é geralmente de cerca de 86 %, d.s.b. <Etapa (2) (etapa de tratamento da glicoamilase)>

[00069] Esta etapa é aquela de ainda permitir que um espécime de glucoamilase atue sobre a solução de reação, obtida na etapa (1) de formação de trealose, para aumentar o teor de trealose, d.s.b. Eventualmente, a solução de reação obtida na etapa de formação de trealose contém, juntamente com a trealose, sacarídeos tais como D-glicose, maltose, maltooligossacarídeos tendo um grau de po- limerização de glicose de pelo menos três, α-glucosiltrealose, e α- maltosiltrealose, e, quando a glucoamilase for deixada atuar sobre a solução, maltose e maltooligossacarídeos tendo um grau de polimeri- zação da glicose de pelo menos três podem ser hidrolisados até a D- glicose, enquanto que a α-glicosiltrealose tal como α-glucosiltrealose e α-maltosiltrealose, pode ser hidrolisada até a D-glicose e trealose au-mentar a pureza da trealose, isto é, o teor de trealose, d.s.b., na solu- ção de reação.

[00070] As glucoamilases utilizáveis no processo da presente invenção não devem ser especificamente restritas dependendo das suas fontes e origens, coontanto que elas possam hidrolisar a maltose e os maltooligossacarídeos tendo um grau de polimerização de glicose de pelo menos três até a D-glicose e também hidrolisar a α- glicosiltrealose tal como α-glucosiltrealose e α-maltosiltrealose até a D- glicose e trealose. Os espécimes de glucoamilase comercializados, por exemplo, tal como "GLUCZYME AF6", um nome de produto destes comercializado por Amano Enzyme Inc., Aichi, Japan, e "GLU- COZYME", um nome de produto destes comercializado por Nagase Chemtex Corp., Osaka, Japan, podem ser adequadamente utilizados.

[00071] O teor de trealose na solução de reação após o tratamento da glucoamilase ou na solução de sacarídeo contendo trealose é ge-ralmente mais de 86,0 %, d.s.b., de preferência, 87,0 % ou mais ele-vado. Para comparação, quando a CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Geobacillus stearothermophilus for usada em lugar de usar a CGTase derivada de um micro-organismo do gênero Paenibacillus, o teor de trealose na solução de sacarídeo contendo trealose após o tratamento de glucoamilase é menor do que 86,0 %, d.s.b., e nunca será 86,0 % ou mais elevado. <Etapa (3) (etapa de purificação e concentração)>

[00072] Esta etapa é aquela de remover as impurezas mediante o tratamento de uma solução de sacarídeo contendo trealose tendo um teor de trealose aumentado, d.s.b., após o tratamento com glucoamila- se, com filtração, centrifugação, etc., da maneira usual; descoloração da solução de sacarídeo resultante com carvão vegetal ativado; dessanilização da solução com uma resina de troca catiônica (forma H+) e uma resina aniônica (forma OH-); e concentração da solução resultante até se obter uma concentração adequada para a cristaliza- ção. Visto que o teor de trealose, d.s.b., na solução de reação aumen-tou até um nível de 86,0 % ou mais elevado através da etapa (2) do tratamento de glucoamilase, na etapa (3) de purificação e concentra-ção, não requer nenhuma necessidade de uma etapa de aumentar ainda mais o teor de trealose, tal como uma etapa de fracionamento por cromatografia de coluna. <Etapa (4) (etapa de cristalização)>

[00073] Esta etapa é aquela de precipitar o di-hidrato de trealose cristalino a partir da solução de sacarídeo contendo trealose obtida através das etapas de (1) a (3) na presença de um cristal semente de di-hidrato de trealose cristalino. Após a solução de sacarídeo com um teor de trealose, d.s.b., que foi aumentado até um nível prescrito, é geralmente controlado para fornecer um grau de saturação de trealose na faixa entre 1,05 e 1,50, ou controlado para conceder uma concen-tração de trealose de cerca de 60 a cerca de 85% e para se fornecer uma temperatura do líquido de cerca de 40 a cerca de 80 °C, a solução de sacarídeo resultante é transferida para um cristalizador, incorporado com um cristal semente de di-hidrato de trealose cristalino em uma quantidade geralmente igual a 0,1 a 5 % (p/v), e em particular, de 0,5 a 2 % (p/v) do volume da solução de sacarídeo concentrada resul- tate no cristalizador, e a solução de sacarídeo concentrada é esfriada de modo natural para 5 a 60 °C ao longo de 3 a 48 horas sob condições suaves de agitação para induzir a precipitação do di-hidrato de trealose cristalino. Para comparação, quando um cristal semente de di- hidrato de trealose cristalino já está presente no cristalizador, etc., nenhum cristal semente adicional de di-hidrato de trealose cristalino deve ser especificamente requerido. A precipitação do di-hidrato de trealose cristalino a partir da solução concentrada é, devido a eficiência de tra-balho, geralmente efetuada na presença de um cristal semente.

[00074] Um método de esfriamento controlado ou um método de esfriamento semicontrolado pode ser vantajosamente utilizado na eta-pa de cristalização, em em lugar do método de esfriamento não forçada acima. No caso da condução da cristalização por um tal método de esfriamento controlado ou método de esfriamento semicontrolado, a solução de sacarídeo contendo trealose, que foi ajustada para uma temperatura prescrita através da etapa acima (3), é transferida para um cristalizador, incorporada com um cristal semente de di-hidrato de trealose cristalino em uma quantidade igual a 0,1 a 5 % (p/v), em parti-cular, de 0,5 a 2 % (p/v) do volume da solução concentrada de sacarí- deo no cristalizador, e deixada efetuar a cristalização por permitir que a temperatura do líquido diminua gradualmente no estágio inicial da etapa de cristalização e diminua pontualmente no estágio posterior da etapa de esfriamento mediante o controle do esfriamento sob condi-ções de agitação suave. O tempo necessário para a cristalização varia dependendo da quantidade de um cristal semente de di-hidrato de tre-alose cristalino a ser adicionado; por exemplo, no caso de um método de esfriamento semicontrolado, o tempo de esfriamento total é seg-mentado em pelo menos duas zonas, de preferência, pelo menos três zonas, e depois, em cada zona a temperatura é aproximadamente re-duzida linearmente contra o tempo; a temperatura do líquido "T" é dei-xada diminuir linear ou gradualmente contra o tempo "t" de uma tal maneira de permitir que a variação (T0-Tm) da temperatura do líquido em "T" no ponto de "t = T / 2" seja pelo menos 5 %, mas menos do que 50 % da variação total de temperatura (T0-Tf), preferivelmente, pelo menos 10 %, mas menos do que 30 %. Por exemplo, quando os cris-tais são precipitados por esfriamento da solução de sacarídeo conten-do trealose de 60 °C para 20 °C durante 10 horas, o tempo de esfria-mento é dividido em duas zonas de 6 horas e 4 horas, onde a solução é preferivelmente esfriada de 60 °C para 50 °C durante 6 horas e de-pois a solução é esfriada de 50 °C para 20 °C durante 4 horas, ou o tempo de esfriamento é dividido em duas zonas de 7 horas e 3 horas, onde a solução também é de preferência esfriada de 60 °C para 45 °C durante 7 horas e depois a solução é esfriada de 45 °C para 20 °C ao longo de 3 horas. Mais preferivelmente, o tempo de esfriamento é divi-dido em três zonas de 4, 3 e 3 horas, e a solução é sucessivamente esfriada de 60 °C para 55 °C durante 4 horas na primeira zona, esfria-da de 55 °C para 50 °C durante 3 horas na próxima zona, e esfriada de 50 °C para 20 °C durante 3 horas na última zona.

[00075] Desta maneira, de acordo com um método de esfriamento controlado ou método de esfriamento semicontrolado, uma massa co-zida, que dificilmente gera microcristais de di-hidrato de trealose crista-lino e contém cristais com um diâmetro de partícula substancialmente homogêneo, pode ser obtida, em comparação com um método de cris-talização que esfria de modo natural a solução líquida sem controlar a temperatura. Como um resultado, o rendimento da produção de di- hidrato de trealose cristalino obtido em comparação com o amido pode ser aumentado ainda mais do que aquele alcançado por um método de esfriamento natural. Como descrito mais tarde, a composição parti- culada obtida contendo di-hidrato de trealose cristalino possui aspectos característicos de ter tanto uma pureza mais elevada de trealose quanto um grau mais elevado de cristalinidade com relação ao di- hidrato de trealose cristalino que se torna um importante índice quanto a capacidade de aglutinação do que aqueles de um pó obtido por um método de esfriamento natural. No caso de um método de esfriamento controlado, ou método de esfriamento semicontrolado, uma composição particulada com mais distribuição homogênea do tamanho de partícula é obtida como um mérito, em comparação com um pó ob-tido por um método de cristalização de esfriamento natural. <Etapa (5) (etapa de coleta)>

[00076] Esta etapa é aquele que se coleta o di-hidrato de trealose cristalino através da centrifugação de acordo com um método de sepa-ração de sólido-líquido convencional a partir da massa cozida obtida na etapa de cristalização (4). O di-hidrato de trealose cristalino coletado é lavado por pulverização (banho) com uma pequena quantidade de água refinada para remover um xarope com sacarídeos amorfos, aderido à superfície do di-hidrato de trealose cristalino. A quantidade de água refinada utilizada para a lavagem dos cristais é de preferência geralmente pelo menos 3 %, mas não mais do que 10 % do peso de uma massa cozida antes da centrifugação. Quando a quantidade de água acima de refinada for menor do que 3 %, uma lavagem suficiente pode não ser conseguida, resultando em resto de xarope com sacarí- deos amorfos e um receio de não se obter uma pureza desejada de trealose. Ao contrário, quando a quantidade de água refinada usada para a lavagem for superior a 10 %, a quantidade de di-hidrato de trea-lose cristalino a ser dissolvida e removida pela lavagem aumenta e re-sulta em um receito de reduzir o rendimento de produção em compa-ração com o amido. <Etapa (6) (etapa de amadurecimento e secagem)>

[00077] Esta etapa é aquela de se obter uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino, que permite o di-hidrato de trealose cristalino coletado se manter em uma atmosfera com uma temperatura e umidade prescrita durante um período de tempo recomendado para amadurecer os cristais enquanto se seca com ar quente. A temperatura do produto de cristais, a umidade relativa da atmosfera, e o tempo de retenção na etapa de amadurecimento e secagem não são especificamente restritos, contanto que uma composição particulada desejada seja obtida, no entanto, os cristais devem preferivelmente ser mantidos em uma temperatura de 20 a 55 °C como uma temperatura de produto e em uma umidade relativa de 60 a 90 %, e o tempo de amadurecimento e secagem deve ser de preferência de cer ca de 5 a cerca de 24 horas. A composição particulada obtida através da etapa de amadurecimento e secagem é depois esfriada de modo natural para uma temperatura ambiente. A composição particulada pode ser vantajosamente esfriada de modo não natural para tornar a temperatura do produto na temperatura ambiente mediante a ventila- ção dos conteúdos de um ar limpo com uma temperatura próxima da ambiente. A composição particulada assim obtido pode ser usada intacta ou opcionalmente pulverizada em um produto final.

[00078] De acordo com o processo de produção da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino da presente invenção, uma solução de sacarídeo contendo trealose com um teor de trealose tão elevado quanto mais de 86,0 %, d.s.b., e sem requerer qualquer etapa de fracionamento por cromatografia de coluna e sem perda pelo fracionamento. Assim, uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino pode ser obtida com um alto rendimento de produção em comparação com o amido. Visto que o processo emprega um método de separação por centrifugação que separa os cristais precipitados para remover um xarope contendo impurezas, sem empregar um método de açúcar total de cristalização de uma massa cozida inteira contendo cristais precipitados e de solidificação ou secagem por pulverização do resultante, o teor de trealose na composição particulada resultante contendo di-hidrato de trealose cristalino pode ser facilmente aumentado para um nível de 98,0 % ou mais para produzir uma composição particulada de alta pureza contendo o dihidrato de trealose cristalino.

[00079] Quando a cristalização for efetuada por um método de esfriamento natural, a composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino assim produzido é substancialmente o mesmo pó como um pó convencional de qualidade alimentar contendo trealose em termos da propriedade de capacidade de aglutinação, etc., quando armazenado, e geralmente contém partículas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 425 μm em uma quantidade de 70 % ou mais da composição particulada inteira, e aquele com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 300 μm em uma quantidade de 50 % ou mais da composição particulada inteira. Quando a cristalização for efetuada por um método de esfriamento controlado ou método de esfriamento semicontrolado, a composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino produzida pelo processo da presente invenção é um pó significativamente difícil de se aglutinar em comparação com o pó convencional de qualidade alimentar contendo trealose, e geralmente contém partículas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 425 μm em uma quantidade de 80 % ou mais de toda a composição particulada, e aquele com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 300 μm em uma quantidade de 60 % ou mais de toda a composição particulada. A composição particulada contendo dihidrato de trealose cristalino produzida pelo processo da presente invenção geralmente possui um poder de redução de 0,5 % ou inferior, quando calculado pela Fórmula [5] acima mencionada, e é uma composição particulada superior livre de induzir alteração da cor induzida pelo escurecimento mesmo quando incorporada nos produtos alimentícios, produtos farmacêuticos, etc.

[00080] Consequentemente, a composição particulada produzida pelo processo do presente invenção pode ser utilizada intacta ou utilizada após o controle apropriado do tamanho de partícula como um material em pó para produtos alimentícios, cosméticos, quase- medicamentos, produtos farmacêuticos, etc. Em particular, como descrito acima, a composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino produzida pelo processo da presente invenção que emprega um método de esfriamento controlado quando na cristalização, é uma composição particulada significativamente difícil de se aglutinar em comparação com um pó convencional de qualidade alimentar contendo trealose e pode ser dito de ser uma composição particulada con-vencionalmente desconhecida completamente nova contendo di- hidrato de trealose cristalino. A composição particulada possui um mérito superior, que pode ser incorporado em um único ou uma pluralidade de outros materiais em pó para produtos alimentícios, cosméticos, quase-medicamentos, produtos farmacêuticos, etc., nos campos de produção de produtos alimentícios, cosméticos, quase- medicamentos e produtos farmacêuticos, os quais são produzidos através do uso de usinas de produção que são projetadas onde os materiais em pó serão utilizados na premissa.

[00081] As seguintes experiências concretamente explicam o processo para a produção da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino da presente invenção: <Experiência 1: Efeito da origem de CGTase sobre o teor de trealose na solução de reação enzimática>

[00082] As seguintes experiências foram conduzidas para examinar de que maneira a origem da CGTase usada faz efeito sobre o teor de trealose em uma solução de sacarídeo, formada por uma reação en- zimática, em um sistema de reação enzimática, onde uma enzima de formação de α-glicosiltrealose derivada de um micro-organismo do gênero Arthrobacter e uma enzima de liberação de trealose também derivada de um micro-organismo do gênero Arthrobacter são deixadas atuar sobre o amido liquefeito, juntamente com uma enzima de desramificação de amido e CGTase, e em seguida a glucoamilase é deixada atuar sobre a mistura resultante para formar a trealose. <Experiência 1-1: Preparação da solução de enzima contendo a enzima de formação de α-glicosiltrealose e a enzima de liberação de trea- lose derivadas do micro-organismo do gênero Arthrobacter>

[00083] Pelo método divulgado no Exemplo 2-1 da Literatura de Patente 4 (Patente Japonesa Kokai No. 2000-228980), a cepa de Ar- throbacter sp. S34 (FERM BP-6450) foi cultivada para se obter uma cultura ao redor de 20 L. À cultura de 20 L foi adicionado dois gramas de "EGG WHITE LYSOZYME", um nome de produto de um espécime de lisozima produzido por Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japan, para efetuar a lise celular na cultura mediante a agitação em 260 rpm a 37 °C durante 24 horas. A solução de lise celular resultante foi centrifugada para coletar um sobrenadante para se obter um extrato de células, o qual foi depois na forma usual precipitado por saturação de sal com sulfato de amônio. A precipitação formada foi submetida a diálise junto ao tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,0), e o dialisado foi submetido a uma cromatografia de troca aniônica utilizando "SEPABEADS FP DA13", um gel produzido pela Mitsubishi Chemical Industries, Co., Tokyo, Japan, para coletar uma fração da enzima. A fração coletada foi uma preparação de enzima parcialmente purificada contendo apro-ximadamente 15.600 unidades de uma enzima de liberação de trealo- se e aproximadamente 3.100 unidades de uma enzima de formação de α-glicosiltrealose. As atividades da enzima de formação de α- glicosiltrealose e da enzima de liberação de trealose foram determinadas de acordo com os métodos divulgados na Literatura da Patente 4 acima (Patente Japonesa Kokai No. 2000-228980). <Experiência 1-2: CGTases derivadas de vários micro-organismos>

[00084] As seguintes CGTases foram utilizadas como aquelas derivadas de vários micro-organismos. Uma CGTase derivada da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 (FERM BP-11273), produzida pela Hayashibara Co., Ltd., de Okayama, Japan, foi utilizada como uma CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Geobacillus stearothermophilus; "CONTIZYME", um nome de produto de uma CGTase comercializada vendida pela Amano Enzyme Inc., Aichi, Ja pan, foi usado como uma CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Bacillus macerans; e "TORUZYME", um nome de produto de uma CGTase comercializada vendida pela Novozymes Japan Ltd., To-kyo, Japan, foi utilizado como uma CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes.

[00085] As seguintes CGTases foram preparadas como CGTases derivadas de micro-organismos do gênero Paenibacillus: cepa de Pa- enibacillus illinoisensis NBRC15959, cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379, cepa de Paenibacillus pabuli NBRC13638, e cepa de Paenibacillus amylolyticus NBRC15957 foram respectivamente culti-vadas em um meio de cultura líquida contendo 2 % de dextrina, 0,5 % de cloreto de amônio, 0,05 % de hidrogênio fosfato de potássio, 0,025 % de sulfato de magnésio, e 0,5 % de carbonato de cálcio a 27 °C durante três dias. As culturas resultantes foram centrifugadas, e os respectivos sobrenadantes foram da maneira habitual precipitados por saturação de sal com sulfato de amônio e submetidos a diálise para se obter soluções de enzima em estado natural de CGTases derivadas de diferentes micro-organismos. As soluções de enzima em estado natural de CGTases assim obtidas foram respectivamente submetidas a uma cromatografia de coluna de troca aniônica utilizando DEAE- TOYOPEARL 650S GEL comercializado pela Tosoh Corp, Tokyo, Japan, e uma cromatografia de coluna hidrofóbica utilizando BUTYL- TOYOPEARL 650M GEL comercializado pela Tosoh Corp , Tokyo, Japan, para se obter CGTases parcialmente purificadas. A atividade de cada uma das CGTases derivadas de diferentes micro-organismos foi determinada de acordo com o método acima identificado e calculada com a Fórmula [1]. <Experiência 1-3: Reação de formação de trealose>

[00086] O amido de milho foi colocado em suspensão em água para fornecer uma concentração de 30 % e misturado com carbonato de cálcio a 0,1 %. A suspensão resultante foi ajustada para pH 6,0 e mis-turada com "TERMAMEAL 60L", um nome de produto de um espécime de α-amilase termoestável comercializado pela Novozymes Japan Ltd., Tokyo, Japan, em uma quantidade igual a 0,2 % do amido, d.s.b., para gelatinizar e liquefazer o amido através da reação enzimática a 95 °C durante 15 min. A solução de amido liquefeito resultante foi submetido a autoclave a 120 °C durante 30 min, esfriado para 51 °C, ajustado para pH 5,7, misturado com duas unidades/g de amido, d.s.b., de uma enzima de formação de α-glicosiltrealose, 10 unidades/g de amido, d.s.b., de uma enzima de liberação de trealose, 300 unidades/g de amido, d.s.b., de um espécime de isoamilase comercializado pela Ha- yashibara Co., Ltd., de Okayama, Japan, e 2 unidades/g de amido, d.s.b., de qualquer uma das CGTases divulgadas na Experiência 1-2 ou preparadas na Experiência 1-2, e enzimaticamente reagidas durante 64 horas. A solução de reação resultante foi aquecida a 97 °C durante 30 minutos para inativar as respectivas enzimas remanescentes, ajustada para pH 4,5, misturada com 10 unidades/g de amido, d.s.b., de "GLUCOZYME #20000", um nome de produto de um espécime de glucoamilase comercializado pela Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japan, e enzimaticamente reagida durante 24 horas. A solução de reação assim obtida foi aquecida a 95 °C durante 10 min para inativar a enzima remanescente, e submetida ao ensaio com relação ao teor de trealose na solução de reação divulgada mais abaixo. Eventualmente, uma solução de reação, obtida através da condução de uma reação enzimática sob a mesma condição como acima, exceto para a não adição de CGTase, foi preparada como um controle. <Experiência 1-4: Ensaio com relação ao teor de trealose na solução de reação>

[00087] As soluções de reação obtidas na Experiência 1-3 foram respectivamente preparadas em soluções de reação de 1 a 8 apresen- tadas na Tabela 1, e o teor de trealose em cada solução de reação foi determinada como se segue: As soluções de reação de 1 a 8 foram respectivamente preparadas em soluções de 1 % com água refinada, filtradas com um filtro de membrana de 0,45 μm, e submetidas a análise por HPLC sob as seguintes condições, seguido pelo cálculo do teor de trealose em cada solução de reação com base nas áreas de pico mostradas nos cromatogramas por um refractômetro diferencial e con-vertidas nos valores baseados em um base sólida seca. Os resultados estão na Tabela 1. Os teores de trealose nas soluções de reação mos-tradas na Tabela 1 são os valores que podem ser obtidos em uma ca-pacidade de reprodução relativamente alta dentro de uma variabilidade considerável mesmo quando as respectivas CGTases são repetida-mente submetidas à reação de formação de trealose e ao tratamento de glucoamilase cinco vezes sob as mesmas condições. Condições analíticas: Sistema de HPLC: "LC-10AD", comercializado pela Shi- madzu Corp., Kyoto, Japan; Desgaseificador: "DGU-12AM", comercializado pela Shi- madzu Corp., Kyoto, Japan; Coluna: "MCL GEL CK04SS", comercializado pela Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Japan; Volume de injeção de amostra: 20 μl; Eluente: água refinada; Taxa de fluxo: 0,4 ml/min; Temperatura: 85 °C; Refractômetro diferencial: "RID-10A", comercializado pela Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan; Mecanismo de processamento de dados: "CHROMATO- PAC C-R 7A", comercializado pela Shimadzu Corp., Kyoto, Japan; Tabela 1

[00088] Como evidente a partir da Tabela 1, quando a CGTase derivou da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 que foi con-vencionalmente usada para formar a trealose (solução de reação 2), o teor de trealose após o tratamento com glucoamilase foi até 84,7 %, enquanto que o teor de trealose foi aumentado para 85,1 %, quando a CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Bacillus mace- rans foi utilizada (solução de reação 3), mesmo embora a quantidade aumentada tenha sido insignificante. Quando a CGTase derivou de um micro-organismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes (solução de reação 4), o teor de trealose foi de 83,4 %, que foi mais baixo do que o caso de se usar uma CGTase convencionalmente utili-zada, derivada da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 (so-lução de reação 2), na formação de trealose.

[00089] Ao contrário, quando as CGTases derivadas de micro-organismos do gênero Paenibacillus foram utilizadas (soluções de rea-ção de 5 a 8), o teor de trealose de qualquer uma das soluções após o tratamento com glucoamilase foi superior a 86,0 %, d.s.b., que foi sig-nificativamente aumentado em comparação com aquele de uso da CGTase derivada da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 que foi convencionalmente usada na formação de trealose (solução de reação 2). Particularmente, quando as CGTases derivadas da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15959 (solução de reação 5), cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 (solução de reação 6), e cepa de Paenibacillus pabuli NBRC13638 (solução de reação 7) foram utilizadas como CGTases, os teores de trealose foram superiores a 87,0 %, revelando que as soluções de sacarídeo contendo trealose com um elevado teor de trealose são obtidas por tais reações enzimáti- cas. Entre os resultados desta experiência, quando uma CGTase derivada de um micro-organismo da espécie foi utilizada, o teor de trealo- se mais elevado foi obtido, revelando que as CGTases derivadas de micro-organismos da espécie Paenibacillus illinoisensis são mais preferíveis. <Experiência 2: Pureza da trealose, rendimento de produção em com-paração com o amido, e propriedades das composições particuladas contendo o di-hidrato de trealose cristalino, preparado a partir de solu-ções de sacarídeo com diferentes teores de trealose> <Experiência 2-1: Preparação das amostras de teste> <Amostras de teste de 1 a 8>

[00090] As soluções de reação de 1 a 8 com diferentes teores de trealose, obtidas na Experiência 1, foram respectivamente purificadas pelo tratamento de descoloração utilizando um carvão vegetal ativado e tratamento de dessalinização utilizando uma resina de troca iônica, e concentradas até fornecer uma concentração de sólidos de cerca de 60 %, d.s.b., para se obter soluções de sacarídeo contendo trealose de 1 a 8 (contendo de 82,8 a 87,6 % de trealose, d.s.b.) que correspondem às soluções de reação de 1 a 8, respectivamente.

[00091] As soluções de sacarídeo contendo trealose acima de 1 a 8 foram respectivamente concentradas in vacuo para fornecer uma con-centração de sólidos ao redor de 85 %, d.s.b., colocadas em um crista- lizador, misturadas com cerca de 1 % p/v de di-hidrato de trealose cris-talino como um cristal semente ao volume de cada solução de sacarí- deo, e cristalizadas sob condições de agitação mediante o esfriamento natural da mistura de 60 °C para 20 °C durante cerca de 10 horas para se obter as massas cozidas com di-hidrato de trealose cristalino preci-pitado. De cada uma das massas cozidas anteriores, um di-hidrato de trealose cristalino foi coletado da maneira habitual por uma centrífuga do tipo cesta, lavado com 8 % de água desionizada de acordo com o peso de cada massa cozida, amadurecido e secado a 40 °C durante oito horas, esfriado de forma não natural através da ventilação com o ar limpo a 25 °C resultante durante 30 min, e pulverizado para se obter composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino. As composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino, o qual foi respectivamente preparado a partir das soluções de sacarídeo contendo trealose de 1 a 8, foram respectivamente preparadas em amostras de teste de 1 a 8. <Amostra de teste 9>

[00092] "TREHA" (Lote No.: 91131), um nome de produto de um pó de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino, co-mercializado pela Hayashibara Co., Ltd., de Okayama, Japan, foi utili-zado como amostra de teste 9. <Experiência 2-2: Pureza de trealose, rendimento de produção em comparação com o amido, e capacidade de aglutinação das amostras de 1 a 9> <Pureza da trealose>

[00093] A pureza de trealose das amostras de teste de 1 a 9 foram determinadas pelo mesmo método de HPLC conforme na Experiência 1-3. Os resultados estão na Tabela 2. <Rendimento de produção em comparação com o amido>

[00094] Os rendimentos de produção em comparação com o amido das amostras de teste de 1 a 8 preparadas acima foram obtidos pelo cálculo do peso, d.s.b., de um amido do material com base no peso de cada uma das soluções de reação enzimática utilizadas na preparação das amostras de teste e na concentração (30 %) de um amido do material na produção inicial, dividindo o peso, d.s.b., de cada uma das amostras de teste de 1 a 8 pelo peso calculado acima, e multiplicando os valores resultantes por 100. Os resultados estão na Tabela 2. <Teste de aglutinação>

[00095] Para cada uma das amostras de teste de 1 a 9, as seguintes experiências foram conduzidas para o propósito de examinar a ca-pacidade de aglutinação de cada pó. As amostras de teste de 1 a 9 foram respectivamente pesadas em um grama, colocadas separada-mente em "FALCON TUBE 2059", um nome de produto de um tubo cilíndrico de polipropileno de 14 ml, 1,7 cm de diâmetro e 10 cm de altura, tendo uma forma de fundo hemisférico e uma tampa, comercia-lizado pela Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA. Os tubos foram fixados a um suporte de tubo verticalmente e alojados em "IC-410", um nome de produto de uma incubadora comercializada pela Advantec Toyo Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan, controlada a 50 °C. Após deixar em repouso durante 24 horas, os tubos foram retirados da incu-badora, seguido pela remoção da tampa de cada tubo, tirada cada amostra de teste dos tubos para colocá-la em uma placa preta plana de plástico através do giro dos tubos de cabeça para baixo lentamente, e macroscopicamente observando as condições das amostras de teste tiradas de dentro.

[00096] O grau de aglutinação de cada amostra de teste foi avaliado com base nos seguintes critérios: "Aglutinado", (+): a amostra de teste claramente manteve a forma hemisférica do fundo do tubo, mesmo quando colocada sobre a placa plana; "Levemente aglutinado", (±): A amostra de teste de forma ligeira, reconhecidamente apresentou a forma hemisférica do fundo do tubo; e "Não aglutinado", (-): A amostra de teste se deformou e não manteve nenhuma forma hemisférica do fundo do tubo. Os resultados são mostrados na coluna de "aglutinação" na Tabela 2. Tabela 2

[00097] Como mostrad o na Tabela 2, os teores de trealose, d.s.b., das composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino das amostras de teste de 1 a 8, isto é, as purezas de trealose, foram ao todo 98,0 %, e elas eram composições particuladas de alta pu- reza contendo di-hidrato de trealose cristalino da mesma forma como a amostra de teste 9 como um pó convencional de grau alimentício con-tendo di-hidrato de trealose cristalino. No entanto, quanto ao rendimento da produção em comparação com o amido, aqueles nas amostras de teste de 2 a 4, onde as CGTases diferentes daquelas derivadas de micro-organismos do gênero Paenibacillus, permaneceu em um rendimento de produção em comparação com o amido tão elevado quanto 39 %, enquanto que as amostras de teste de 5 a 8, preparadas com CGTases derivadas de micro-organismos do gênero Paenibaci- llus, apresentaram um rendimento de produção em comparação com o amido de 41 a 42 % mais elevado do que 40 %, revelando que foi observado uma diferença entre as origens da CGTases utilizadas. Comparando os resultados na Tabela 1 com aqueles na Tabela 2, as composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino preparadas a partir de soluções de reação enzimática com teores de trealose mais elevados após o tratamento com glucoamilase, foram cuidadas de ter um rendimento de produção mais elevado em comparação com o amido, e foi observada uma conexão entre os teores de trealose nas soluções de reação enzimática e os rendimentos de produção em comparação com o amido.

[00098] Com base nestes resultados, quando as CGTases derivadas de micro-organismos do gênero Paenibacillus (amostras de teste de 5 a 8) são utilizadas como CGTases, os teores de trealose nas soluções de reação enzimática após o tratamento com glucoamilase são mais de 86,0 %, e como um resultado, foi revelado que os rendimentos de produção em comparação com o amido para composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino também aumentaram para 41 % ou mais elevado. Em particular, quando as CGTases derivadas de micro-organismos da espécie Paenibacillus illinoisensis ou Paenibacillus pabuli (amostras de teste de 5 a 7), os teores de trealose em soluções de reação enzimática após o tratamento com glucoamilase são mais de 87,0 % e os rendimentos de produção em comparação com o amido aumentaram ainda mais para 42 %. Quando CGTases derivadas de micro-organismos do gênero Paenibacillus são utilizadas, os níveis de melhora nos rendimentos de produção em comparação com o amido (os rendimentos de produção em comparação com o amido para amostras de teste de 5 a 8) são de 3 a 4 % em relação àquele com uma CGTase convencionalmente usada derivada da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 (amostra de teste 2), no entanto, deve ser nitidamente extraordinário o fato de que os rendimentos de produção em comparação com o amido são melhorados ainda mais em 3 a 4 % sobre uma produção em escala industrial de composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino.

[00099] Quanto para a capacidade de aglutinação como uma propriedade importante na manipulação de um pó, a amostra de teste 1 preparada a partir de uma solução de sacarídeo contendo trealose sem utilizar qualquer CGTase e a amostra de teste 4 preparada com uma CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes foram avaliadas como "aglutinadas"(+) no teste de aglutinação acima, enquanto que as amostras de teste 2, 3 e 5 a 8 preparadas com outras CGTases foram avaliadas como apenas "ligeiramente aglutinadas" (±) no teste de aglutinação acima da mesma forma como um pó convencional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino (amostra de teste 9). Os resultados indicam que as composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino preparadas utilizando CGTases derivadas de microorganismos do gênero Paenibacillus (amostras de teste de 5 a 8) não são de maneira alguma inferiores àquelas de um pó convencional de qualidade alimentar comercializado contendo di-hidrato de trealose cristalino (amostra de teste 9 ) e elas são composições particuladas que podem ser utilizadas como materiais em pó para produtos alimentícios, cosméticos, quase-medicamentos, produtos farmacêuticos ou similarmente como um pó de grau alimentício convencionalmente comercializado contendo di-hidrato de trealose cristalino. <Experiência 3: Efeito do esfriamento semicontrolado quando da cris-talização na pureza de trealose, rendimento de produção em compa-ração com o amido e capacidade de aglutinação>

[000100] Nesta experiência, foi examinado o efeito da aplicação de um método de esfriamento semicontrolado para a preparação de uma com-posição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino na pureza de trealose, no rendimento de produção em comparação com o amido, e na capacidade de aglutinação da composição particulada, quando o di- hidrato de trealose cristalino é precipitado a partir das soluções de saca- rídeo contendo trealose de 1 a 8 preparadas na Experiência 2-1. <Experiência 3-1: Preparação das amostras de teste>

[000101] As soluções de sacarídeo contendo trealose de 1 a 8 com diferentes teores de trealose, d.s.b., preparadas na Experiência 2-1, fo-ram respectivamente concentradas in vacuo até fornecer uma concen-tração de sólidos de cerca de 85 %, d.s.b., colocadas em um cristaliza- dor, misturadas com cerca de um por cento de di-hidrato de trealose cristalino como um cristal semente no volume de cada solução de saca- rídeo, seguido pela preparação de massa cozidas tendo di-hidrato de trealose cristalino precipitado de modo similar como na Experiência 2, exceto para a cristalização através de um método de esfriamento semi- controlado de esfriamento das soluções de 60 °C para 20 °C durante cerca de 10 horas. O método de esfriamento semicontrolado foi realiza-do de um tal modo de dividir o total de 10 horas de tempo de esfriamen-to em três zonas com quatro, três, e três horas, aproximadamente esfri-ando de modo linear a temperatura do líquido contra o tempo de forma decrescente a partir de 60 °C até 55 °C durante quatro horas na primei- ra zona, a partir de 55 °C até 50 °C durante três horas na próxima zona, e a partir de 50 °C até 20 °C durante três horas na última zona. O di- hidrato de trealose cristalino foi coletado de cada uma das massas co-zidas obtidas da maneira habitual por uma centrífuga tipo cesta, lavado com oito por cento de água desionizada em peso de cada massa cozi-da, amadurecido e secado a 40 °C durante oito horas, esfriado de modo não natural por ventilação de ar limpo a 25 °C durante 30 min, e pulveri-zado nas composições particuladas contendo o di-hidrato de trealose cristalino. As composições particuladas contendo o di-hidrato de trealo- se cristalino, obtidas das respectivas soluções de sacarídeo contendo trealose de 1 a 8 pelo método de esfriamento semicontrolado, foram preparadas em amostras de teste de 1c a 8c. <Experiência 3-2: Pureza de trealose, rendimento de produção em comparação com o amido, e capacidade de aglutinação das amostras de teste de 1c a 8c> <Pureza de trealose>

[000102] As purezas de trealose das amostras de teste de 1c a 8c foram determinadas pelo mesmo método de HPLC conforme na Experiência 1-3. Os resultados estão na Tabela 3. <Rendimento de produção em comparação com o amido>

[000103] Os rendimentos de produção em comparação com o amido das amostras de teste de 1c a 8c foram calculados pelo mesmo método como na Experiência 2-2. Os resultados estão na Tabela 3 em analogia. <Teste de aglutinação>

[000104] A capacidade de aglutinação das amostras de teste de 1c a 8c foi avaliada pelo mesmo teste de aglutinação como na Experiência 2-2. Os resultados estão na Tabela 3 em analogia. Tabela 3

[000105] Como fica evidente a partir da Tabela 3, as purezas de trea- lose das amostras de teste de 1c a 8c, preparadas mediante a aplicação de um método de esfriamento semicontrolado nas suas etapas de cristalização, estavam na faixa de 99,0 a 99,6 %. Comparando o resul-tado com as purezas de trealose das amostras de teste de 1 a 8 obtidas através de cristalização por um método de esfriamento natural na Experiência 2 (a coluna de "pureza de trealose" na Tabela 2), a pureza de trealose de qualquer uma das amostras de teste de 1c a 8c foi au-mentada de 0,2 para 0,6 %. O resultado indica que a pureza de trealo- se de uma composição particulada pode ser aumentada pela aplicação de um método de esfriamento semicontrolado na sua etapa de cristali-zação.

[000106] Os rendimentos de produção em comparação com o amido das amostras de teste de 1c a 8c foram de 35 a 45 %. Comparando o resultado com os rendimentos de produção em comparação com o amido das amostras de teste de 1 a 8 obtidas através de precipitação por um método de esfriamento natural na Experiência 2, os rendimentos de produção em comparação com o amido de amostras de teste de 1c a 8c foram aumentados ao redor de 2 a 4 %. O resultado significa que a aplicação de um método de esfriamento semicontrolado para a cristalização irá aumentar o rendimento de produção em comparação com o amido, em comparação com o caso de cristalização por um método de esfriamento natural. A razão pela qual o rendimento de produção em comparação com o amido de uma composição partículas resultante contendo di-hidrato de trealose cristalino é aumentado através da aplicação de um método de esfriamento semicontrolado, mesmo embora não se encontre nenhuma alteração no teor de trealose em uma solução de sacarídeo contendo trealose utilizada na cristalização, não é confiante; no entanto, pode-se especular que uma perda de trealose é reduzida quando da coleta de cristais a partir de uma massa cozida mediante a centrifugação e lavagem dos cristais coletados com água, visto que os cristais que possuem uma quantidade menor de microcristais e um tamanho de partícula uniforme são obtidos por um método de esfriamento semicontrolado, como mencionado acima.

[000107] Quando as amostras de teste de 1c a 8c foram submetidas ao teste de aglutinação da mesma forma como na Experiência 2-2 para examinar a sua capacidade de aglutinação, as amostras de teste de 1c a 4c como mostrada na Tabela 3 foram todas avaliadas como "ligei-ramente aglutinadas" (±), enquanto que nenhuma das amostras de teste de 5c a 8c se deformou quando retirada de uma placa plana e não manteve as suas formas com o fundo do tubo, e assim foram avaliadas como "não aglutinadas" (-). Estes resultados indicam que, quando um método de esfriamento semicontrolado for aplicado na cristalização, a capacidade de aglutinação de uma composição particulada resultante tende a ser surpreendentemente melhorada em comparação com o caso de cristalização por um método esfriamento natural. Entre os quais, o pó convencional de qualidade alimentar contendo di- hidrato de trealose cristalino (amostra de teste 9) foi avaliado como "ligeiramente aglutinado" (±) (ver, por exemplo, a Tabela 2) no teste de aglutinação, enquanto que as composições particuladas contendo di- hidrato de trealose cristalino obtidas de soluções de sacarídeo contendo trealose de 5 a 8, com um teor de trealose relativamente elevado tão excedente quanto 86 % (amostras de experiência de 5c a 8c) através da aplicação de um método de esfriamento semicontrolado, foram avaliadas como "não aglutinadas" (-). O fato indica que uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, que é signifi-cativamente difícil de se aglutinar em comparação com um pó conven-cional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino e é superior em propriedade como uma composição particulada, pode ser produzida por ser precipitada de uma solução de sacarídeo contendo trealose com um teor de trealose relativamente elevado tão excedente quanto 86 % mediante a aplicação de um método de esfriamento semicontrolado.

[000108] Com base nos resultados acima, foi revelado que uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino com uma pureza de trealose superior, pode ser obtida com um rendimento de produção mais elevado em comparação com o amido através da aplicação de um método de esfriamento semicontrolado na etapa de cristalização, em comparação com o caso de ser precipitada por um método de esfriamento natural. Foi revelado que uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, produzida de uma solução de sacarídeo com um teor de trealose relativamente elevado tão excedente quanto 86 % através da cristalização por um método de esfriamento semicontrolado, é uma composição particulada vantajosa pelo fato de que não é aglutinada mesmo sob as condições onde um pó de grau alimentar convencional contendo di-hidrato de trealose cristalino produzido por um método de esfriamento natural é avaliado como "ligeiramente aglutinado" (±), e retém uma capacidade de circulação livre como uma composição particulada. <Experiência 4: Efeito do grau de cristalinidade e do diâmetro médio do cristalito sobre a diferença da capacidade de aglutinação da composição particulada>

[000109] As amostras de teste de 5c a 8c como composições parti- culadas contendo di-hidrato de trealose cristalino, que foram preparadas a partir de uma solução de sacarídeo com um teor de trealose re-lativamente elevado de mais de 86 % mediante a aplicação de um mé-todo de esfriamento semicontrolado na Experiência 3, tiveram uma propriedade de pó superior de difícil aglutinação, embora elas não fos-sem tão diferentes de outras amostras de teste em termos de pureza de trealose. Para o propósito de revelar a razão, os graus de cristalini- dade e os diâmetros médios do cristalito das composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino das amostras de teste de 1 a 8 obtidas na Experiência 2 e das amostras de teste de 1c a 8c obtidas na Experiência 3, foram medidos nesta experiência. Como um controle, a amostra de teste 9 também foi examinada de forma semelhante. <Experiência 4-1: Preparação de amostras padrão usadas para medir o grau de cristalinidade> <Amostra padrão>

[000110] Como amostra de teste A, um espécime padrão que consiste substancialmente de di-hidrato de trealose cristalino foi preparado através da recristalização "TREALOSE 999" (Código No.: TH224, pu-reza de 99,9 % ou superior), um nome de produto de um pó de grau reagente contendo di-hidrato de trealose cristalino: Em 1000 g de água refinada foram dissolvidos por aquecimento 1840 g do pó de grau rea-gente acima contendo di-hidrato de trealose cristalino, e a solução foi colocada em uma câmara de temperatura constante controlada em 20 °C e deixada repousar durante a noite para efetuar a recristalização. O di-hidrato de trealose cristalino precipitado pela recristalização foi cole-tado da maneira habitual, mediante a utilização de uma centrífuga tipo cesta, secado a 40 °C durante oito horas para se obter ao redor de 950 g de di-hidrato de trealose cristalino para uso como amostra de teste A. A pureza de trealose da amostra de teste A foi revelada de ser 100 % quando determinada no método de HPLC divulgado na Experiência 1. <Amostra padrão B>

[000111] Um espécime padrão consistindo substancialmente de trea- lose amorfa como amostra de teste B foi preparado pelo seguinte pro-cedimento: A amostra de teste A foi dissolvida em uma quantidade adequada de água refinada, liofilizada durante três dias, e secada in vacuo a 40 °C ou mais baixa durante a noite para se obter um pó con-sistindo substancialmente de trealose amorfo para uso como amostra de teste B. A pureza de trealose da amostra de teste B foi revelada de ser 100 % quando determinada no método de HPLC divulgado na Ex-periência 1. O teor de umidade da amostra de teste B foi de 2,0 % quando determinado pelo método de Karl Fischer. <Experiência 4-2: Grau de cristalinidade das amostras de teste A e B, amostras de teste de 1 a 9, e amostras de teste de 1c a 8c> <Grau de cristalinidade>

[000112] Os graus de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cris-talino das amostras de teste A e B, amostras de teste de 1 a 9, e amostras de teste de 1c a 8c foram determinados como se segue: Os valores analíticos para os graus de cristalinidade das amostras A e B, amostras de teste de 1 a 9, e amostras de teste de 1c a 8c foram, res-pectivamente, determinados pelo método de Herman baseado nos perfis de difração de raio X em pó obtidos através da utilização de "X’ Pert PRO MPD", um nome de produto de um difractômetro de raio x em pó de luz refletida comercialmente disponível comercializado pela Spectris Co., Ltd., Tokyo, Japan, que irradia um raio de CuKα (corrente elétrica de raio x: 40 mA, voltagem de tubo de raio x: 45 kV, compri-mento de onda: 1,5405 A), como um raio x característico irradiado de um alvo de Cu; e da utilização de um software de análise de computa-dor exclusivamente instalado no difractômetro. Antes da análise do grau de cristalinidade pelo método de Herman, o grau de partículas e o fator de curvatura pré-definido no software foram respectivamente ajustados em níveis apropriados para a obtenção de uma linha de base considerada de ser a mais preferível, enquanto que se considera os picos de sobreposição mútua, a intensidade de difração e a intensida-de de dispersão nos respectivos padrões de difração de raio x em pó. O método de Herman é descrito com detalhes em P. H. Hermans and A. Weidinger, "Journal of Applied Physics, Vol. 19, pp. 491-506 (1948) and P. H. Hermans and A. Weidinger, "Journal of Polymer Science", Vol. 4, pp. 135-144 (1949).

[000113] Os graus de cristalinidade foram determinados pela substi-tuição na Fórmula [3] supracitada dos valores analíticos pelos graus de cristalinidade da amostra de teste A, amostra de teste B, e cada amostra de teste como respectivos valores analíticos H100, H0 e Hs. Incidentalmente, quando analisados pelo método de Herman, o valor analítico do grau de cristalinidade para a amostra de teste A (H100) e para a amostra de teste B (H0) foram, respectivamente, 50,69 % e 8,59 %. Os resultados estão na Tabela 4. Para as amostras de teste A e B, os seus padrões de difração de raio x em pó são respectivamente apresentados nas Figs. 1 e 2.

[000114] Como observado na FIG. 1, os picos de difração claros e nítidos específicos para o di-hidrato de trealose cristalino foram obser-vados na faixa de ângulos de difração (2θ) de 5 a 50 ° no padrão de difração de raio x em pó da amostra de teste A, mas nenhum halo es-pecífico para uma forma amorfa de trealose foi observado. Embora, como observado na FIG. 2, ao contrário do padrão de difração de raio X em pó da FIG. 1, um halo específico para uma forma amorfa de trea- lose foi claramente observado como um grupo de valor básico no padrão de difração de raio x em pó da amostra de teste B, mas nenhum pico de difração específico para o di-hidrato de trealose cristalino ou trealose cristalina anidra foi observado. <Experiência 4-3: Difrações de raio x em pó de amostras de teste A e B utilizando a radiação síncroton>

[000115] Esta experiência foi realizada para confirmar ainda mais que as amostras de teste A e B foram as amostras apropriadas para a determinação dos valores analíticos H100 e H0, respectivamente: Essas amostras foram submetidas a uma difração de raio x em pó de luz transmitida, que detecta a difração e o sinal de dispersão fracos, utili-zando uma radiação de síncrotron (chamado "radiação", a seguir), como uma fonte de raio x. As condições analíticas foram como se segue. <Condições analíticas>

[000116] Difractômetro de raio x em pó: Modelo "PDS-16", um difrac- tômetro de raio x em pó de alta velocidade (Modo debye Scherrer, comprimento de câmara: 497,2 mm) comercializado por Kohzu Precision Co., Ltd., Kanagawa, Japan; Fonte de raio x: "Linha do feixes da Hyogo Prefecture (BL08B2)", uma luz de radiação da curvatura do eletroímã; Comprimento de onda: 1,2394Â (10,00 keV); Força: 109 fótons/seg; Ângulo de medição: 3 a 38 °; Tempo de exposição: 600 seg; Gravação de imagem: "IMAGING PLACA BAS-2040", uma placa de formação de imagem comercializado pela Fujifilm Corp., Tokyo, Japan; e Sistema de leitura de imagem: "BIO-IMAGE ANALYZER BAS-2500", um analisador de imagem comercializado pela Fujifilm Corp., Tokyo, Japan.

[000117] A medição foi conduzida mediante a utilização da "linha de feixes da Hyogo Prefecture (BL08B2)" colocada em "Spring-8", uma instalação de radiação síncroton, 1-1-1, Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo, Japan.

[000118] Antes da medição de difração de raio x em pó, as amostras de teste A e B foram respectivamente trituradas em um almofariz e peneiradas com uma peneira de malha 53 μm. Depois, cada uma das composições particuladas resultantes que passou através da peneira foi homogeneamente injetada no "MARKTUBE No. 14", um nome de produto de um tubo capilar para a difração de raio x em pó (diâmetro: 0,6 mm, vidro Lindeman), comercializado pela Toho KK, Tokyo, Japan, para fornecer um comprimento da amostra injetada de cerca de 30 mm. Sucessivamente, o tubo capilar foi cortado na extremidade final da amostra injetada e a extremidade abertura foi selada com um adesivo. Em seguida, o tubo capilar foi fixado sobre uma armação de amostra com uma argila, e a armação de amostra foi ajustada ao di- fractômetro de raio x em pó para fornecer a direcção longitudinal do tubo capilar de forma perpendicular em relação ao eixo ótico do difrac- tômetro de raio x em pó. Para remover o efeito adverso da orientação do di-hidrato de trealose cristalino em seu perfil de difração de raio x em pó, a medição da difração de raio x em pó foi realizada por permitir a armação de amostra girar em uma velocidade uniforme e em um ciclo de duas vezes/seg.

[000119] Nos processos de análise dos perfis de difração de raio x em pó e preparação dos padrões de difração de raio x em pó das amostras de teste A e B, os sinais de formação inerentes ao difractô- metro de raio x em pó foram eliminados de cada perfil de difração de raio x em pó de acordo com a maneira convencional para melhorar a precisão da medição. Os padrões de difração de raio x em pó resultan-tes das amostras de teste A e B são respectivamente mostrados nas FIGs. 3 e 4.

[000120] Como observado na FIG. 3, os picos de difração específicos para o di-hidrato de trealose cristalino apareceram clara e nitidamente na faixa de ângulos de difração (2θ) de 3 a 38 ° para o padrão de difração de raio x em pó da amostra de teste A, medido na difração de raio x em pó de usando a radiação síncroton. Visto que o comprimento de onda da radiação síncrotron (1,2394 Á) foi diferente daquele do raio x característico (1,5405 Á) em comparação com as FIGs. 3 e 1, cada pico de difração na FIG. 3 apareceu em cerca de quatro quintos do ângulo de difração (2θ) de cada um dos picos correspondentes na FIG. 1. No entanto, os padrões de difração de raio x em pó nas FIGs. 1 e 3 foram extremamente bem coincidentes entre si. A meia largura a meia altura de cada pico de difração na FIG. 3 foi evidentemente mais estreita do que na FIG. 1 e cada pico de difração na FIG. 3 apresentou uma resolução maior do que aquela da FIG. 1, embora a força de cada pico de difração na FIG. 3 fosse mais elevada do que aquela na FIG. 1 em quase 50 vezes. O padrão de difração de raio x em pó na FIG. 3 não mostrou nenhum halo específico para uma forma amorfa de trea- lose, como mostrado na FIG. 4 descrita mais tarde. O resultado indica que a amostra de teste A possui uma cristalinidade distintamente elevada para o di-hidrato de trealose cristalino e consiste substancialmente de di-hidrato de trealose cristalino.

[000121] Como mostrado na FIG. 4, o padrão de difração de raio x em pó da amostra de teste B, obtido por difração de raio x em pó utilizando radiação síncrotron, mostrou um halo notável específico para uma forma amorfa de trealose como um grupo de valor de referência, mas nenhum pico de difração específico para o di-hidrato de trealose cristalino foi observado. O fato indica que a amostra de teste B é com-posta substancialmente de uma forma amorfa de trealose.

[000122] Os resultados acima, obtidos pelo uso da radiação síncro- ton como uma fonte de raio x, sustentam que as amostras de teste A e B são amostras apropriadas para definir os valores analíticos H100 e H0, respectivamente, para uso na Fórmula [3]. <Experiência 4-4: diâmetros médios de cristalito da amostra de teste A, amostras de teste de 1 a 9, e amostras de teste de 1c a 8c>

[000123] Com base nas meias larguras e nos ângulos de difração (2θ) de cada pico de difração em um padrão de difração de raio x em pó, os diâmetros de cristalito podem ser calculados. Os presentes inventores consideraram que um valor médio de diâmetros de cristalito (diâmetro médio de cristalito) calculado a partir dos picos de difração seria um parâmetro que define a propriedade física de uma composição particulada contendo cristais, e eles determinaram os diâmetros médios de cristalito para as amostras de teste como composições par- ticuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino.

[000124] A amostra de teste A, as amostras de teste de 1 a 9, e as amostras de teste de 1c a 8c, excluindo a amostra de teste B que é um pó amorfo e que não apresenta nenhum pico de difração em seu padrão de difração de raio x em pó, foram ainda determinadas em seus respectivos diâmetros médios de cristalito através do uso de cada um de seus padrões de difração de raio x em pó que foram usados para determinar seus graus de cristalinidade. Cada diâmetro médio de cris- talito foi determinado pela seleção de cinco picos de difração nos pa-drões de difração de raio x em pó para cada composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, isto é, picos de difração (os símbolos de "a" a "e" na Fig. 1) em ângulos de difração (2θ) de 13,7 ° (índice de Miller (hkl): 101), 17,5 ° (índice de Miller (hkl): 220), 21,1 ° (índice de Miller (hkl): 221), 23,9 ° (índice de Miller (hkl): 231) e 25,9 ° (índice de Miller (hkl): 150), que são localizados em uma região de ân-gulo relativamente baixo que foi considerada de ser menos prejudicial à largura do pico de difração devido à cepa heterogênea de cristalite, e que foram bem separados dos outros picos de difração; calibragem das meias larguras e ângulos de difração (2θ) dos picos de difração com base em um valor medido determinado mediante o uso de "X’ pert Highscore Plus" como um software de computador de processamento analítico exclusivamente instalado no difractômetro de raio x em pó, e um silício ("Si640d ", fornecido pelo NIST: National Institute of Stan-dards and Technology, como uma amostra padrão para a difração de raios x) como uma amostra padrão; cálculo dos diâmetros de cristalito com base na Fórmula [4] acima; e cálcula da média dos cinco dados acima. Os resultados estão na Tabela 4 em analogia.

[000125] Os resultados sobre a pureza de trealose e o teste de aglu-tinação nas composições particuladas para as amostras de teste de 1 a 9 e para as amostras de teste de 1c a 8c são, respectivamente, transcritos nas Tabelas 2 e 3, e mostrados em paralelo na Tabela 4. As amostras de teste A e B, utilizadas como espécimes padrão para a determinação do grau de cristalinidade, foram respectivamente sub-metidas ao mesmo teste de aglutinação como nas Experiências 2-2 e 3-2 e avaliadas a sua capacidade de aglutinação. Os resultados estão na Tabela 4 em analogia. Tabela 4

[000126] O diâmetro médio do cristalito da amostra de teste A (pureza de trealose: 100,0 %, grau de cristalinidade: 100,0 %), utilizado como uma amostra padrão para a determinação do valor analítico H100 na medição do grau de cristalinidade, foi de 3910 Á. Como mostrado na Tabela 4, a amostra de teste A foi avaliada como "não aglutinada" (- ) no teste de aglutinação. Ao contrário, a amostra de teste B utilizada como uma amostra padrão para a determinação do valor analítico H0 (pureza de trealose: 100,0 %, grau de cristalinidade: 0,0 %) foi avaliada como "Aglutinada" (+) visto que ainda manteve a sua forma hemisférica do fundo de um tubo mesmo quando tirada do tubo e colocada sobre uma placa plana. A forma hemisférica da amostra de teste B não sofreu um colapso quando uma ligeira vibração foi simplesmente lan- çada sobre a placa. Enquanto isso, a pureza de trealose e o grau de cristalinidade da amostra de teste 9 como um di-hidrato de trealose cristalino de grau alimentício convencionalmente comercializado foram respectivamente 99,0 % e 85,4 %.

[000127] Como mostrado na coluna de "grau de cristalinidade" na Tabela 4, os graus de cristalinidade das amostras de teste de 1 a 8, que foram obtidas por precipitação através de um método de esfriamento natural na etapa de cristalização, foram na faixa de 78,7 a 88,1 %, enquanto que aqueles das amostras de teste de 1c a 8c, que foram obtidas por um método de esfriamento semicontrolado na etapa de cristalização, foram na faixa de 85,7 a 96,0 %. Em comparação com os graus de cristalinidade das amostras de teste de 1 a 8 com aqueles das amostras de teste de 1c a 8c em termos da diferença de métodos de cristalização, revelou-se que os graus de cristalinidade das amostras de teste de 1c a 8c obtidas por um método de arrefecimento semicontrolado, foram aumentados de 3,1 para 7,9 % em comparação com aqueles das amostras de teste de 1 a 8 obtidas através de um método de esfriamento natural, embora o grau de cristalinidade das amostras de teste de 1c a 8c variasse entre si.

[000128] Os resultados na Tabela 4 indicam que o grau de cristalini- dade de uma composição particulada se correlaciona com a sua capa-cidade de aglutinação. Mais especificamente, como mostrado na Tabela 4, cada uma da amostra de teste A e das amostras de teste de 5c a 8c com um grau de cristalinidade de 90 % ou superior, foi considerada como "não aglutinada" (-), enquanto que cada uma das amostras de teste 2, 3, e 5 a 9 e das amostras de teste de 1c a 4c com um grau de cristalinidade de 85 % ou superior, mas menos do que 90 %, foi considerada como "ligeiramente aglutinada" (±), e a cada uma da amostra de teste B e das amostras de teste 1 e 4 com um grau de cris- talinidade de menos de 85 %, foi considerada como "aglutinada" (+). O fato indica que o grau de cristalinidade pode ser um índice potente para a definição de uma composição particulada dificilmente aglutinável contendo di-hidrato de trealose cristalino.

[000129] Além disso, o resultado acima indica que, no processo para a produção de uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino, o grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino torna-se 90 % ou mais elevada através do aumento do teor de trealose em solução de reação de até mais de 86,0 %, e depois através da aplicação de um método de esfriamento semicontrolado na seguinte etapa de cristalização, o que resulta na obtenção de uma composição particulada significativamente difícil de aglutinar contendo di-hidrato de trealose cristalino em comparação com um pó convencional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino.

[000130] Como mostrado na coluna de "diâmetro médio do cristalito" na Tabela 4, os diâmetros médios do cristalito das amostras de teste de 1 a 8 obtidas pela cristalização por um método de esfriamento natural na etapa de cristalização, foram na faixa de 2150 a 2830 Á, enquanto que aqueles das amostras de teste de 1c a 8c preparadas por um método de esfriamento semicontrolado na etapa de cristalização, foram na faixa de 2540 a 3580 Á. Em comparação com as amostras de teste de 1c a 8c com as amostras de teste de 1 a 8 em termos de diâmetro médio do cristalito, revelou-se que os diâmetros médio do cristalito das amostras de teste de 1c a 8c, obtidas por um método de esfriamento semicontrolado, foram aumentados de 190 a 750 Â em comparação com aqueles das amostras de teste de de 1 a 8 obtidas através de um método de esfriamento natural, embora os diâmetros médios do cristalito das amostras de teste de 1c a 8c variassem entre si. O resultado mostra que a aplicação de um método de esfriamento semicontrolado na etapa de cristalização para o di-hidrato de trealose cristalino é um método superior para a obtenção de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino com um diâmetro médio de cristalito relativamente grande.

[000131] Nas amostras de teste de 1 a 8 e nas amostras de teste de 1c a 8c, observou-se uma tendência de que quanto maior for a pureza da trealose e o grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cris-talino nas composições particuladas, tanto maior o diâmetro médio do cristalito. Esta tendência indica que o diâmetro médio do cristalito de uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino possui uma certa correlação tanto com a pureza de trealose quanto com o grau de cristalinidade de uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino, considerando tanto o fato de que o diâmetro médio do cristalito da amostra de teste 1, a qual tinha uma pureza de trealose de 100,0 % e um grau de cristalinidade de 100,0 %, foi de 3910 Á quanto o fato de que a amostra de teste de 9 como um pó de grau alimentício contendo di-hidrato de trealose cristalino foi de 2590 Á.

[000132] Além disso, os resultados na Tabela 4 indicam que o diâmetro médio do cristalito também se correlaciona com o capacidade de aglutinação de uma composição particulada. Em detalhes, como mostrado na Tabela 4, a amostra de teste A e as amostras de teste de 5c a 8c, que tinham um diâmetro médio do cristalito de 3210 Á ou maior, foram todas avaliadas como "não aglutinadas" (-); as amostras de teste 2, 3, e 5 a 9 e as amostras de teste de 1c a 4c, que tinham um diâmetro médio do cristalito na faixa de 2500 Á ou maior, mas menor do que 3200 Á, todas foram avaliadas como "ligeiramente aglutinadas" (±); e a amostra de teste B e as amostras de teste de 1 a 4, que tinham um diâmetro médio do cristalito de menos do que 2500 Â, todas foram avaliadas como "aglutinadas" (+). O fato indica que, além do grau de cristalinidade, o diâmetro médio do cristalito também pode ser um índice potente para a definição de um di-hidrato de trealose cristalino dificilmente aglutinável. <Experiência 5: Características do pó das amostras de teste (estabili-dade de armazenagem, solubilidade em água)>

[000133] Os testes com relação à estabilidade de armazenagem e solubilidade em água foram conduzidos para o propósito de revelar ainda mais a propriedade das amostras de teste de 1 a 9 e das amos-tras de teste de 1c a 8c. <Experiência 5-1: Teste de estabilidade ao armazenamento>

[000134] Para confirmar se o teste de aglutinação conduzido nas Ex-periências 2-2, 3-2, etc. são aceitáveis como um teste para avaliar a capacidade de aglutinação de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino quando em armazenagem real, as amostras de teste A e B obtidas pelo método na Experiência 4-1, as amostras de teste de 1 a 9 obtidas na Experiência 2, e as amostras de teste de 1c a 8c obtidas na Experiência 3 foram submetidas a um teste de estabilidade ao armazenamento concebido mediante a consideração das condições, circunstâncias e período para as composições par- ticuladas em armazenamento real contendo o di-hidrato de trealose cristalino como produtos comercialmente distribuídos.

[000135] Cento e cinquenta gramas de qualquer uma das amostras de teste A e B, amostras de teste de 1 a 9, e amostras de teste de 1c a 8c foram pesadas, colocadas em "UNI-PACK F-4", um nome de produto de um saco de polietileno, 17 cm x 12 cm, comercializado pela Sei- sannipponsha Ltd., Tokyo, Japan, e nele seladas em uma condição desarejada para obter três sacos de polietileno para cada amostra de teste. Um peso de 13,2 kg foi colocado em cada saco de polietileno para homogeneamente colocar uma carga sobre a superfície superior de cada saco de modo a fornecer uma carga de 648 kg/m2 para uma superfície de cada saco e armazenado nas condições durante 60 dias sob circunstâncias livres de uma temperatura e umidade relativamente altas. Por comparação, um produto de um pó de grau alimentício con-tendo di-hidrato de trealose cristalino geralmente possui um modelo de embalagem de 20 kg, e cerca de 10 sacos dos quais são empilhados quando armazenados em um depósito, etc. A carga de 648 kg/m2 para um superfície de um saco de polietileno corresponde à carga recebida pelo menor saco entre os 10 sacos empilhados. Após 60 dias de ar-mazenamento, cada amostra de teste foi tirada a partir de cada saco de polietileno, peneirada com uma peneira tendo um tamanho de poro de 425 μm, e os pesos dos pós passados ou não passados através da peneira foram respectivamente pesados, seguido pela determinação da porcentagem em peso (%) das partículas com um tamanho de partícula de 425 μm ou maior para todo o pó e cálculo da média dos dados de três sacos de cada uma das amostras de teste testadas para avaliar a aglutinação de cada composição particulada após o armazenamento de 60 dias. A aglomeração das composições particuladas foi avaliada como se segue: "Não aglutinada" (-), onde as partículas com um tamanho de partícula de 425 μm ou maior são menos do que 30 % de toda a composição particulada; e "Aglutinada" (+), onde as partículas com um tamanho de partícula de 425 μm ou maior são 30 % ou mais de toda a composição particulada. O critério de avaliação foi efetuado como 30 % devido à dissolução de uma composição particulada, e a sua mistura ou amassamento com outra composição particulada geralmente será afetada quando a relação de partículas com um tamanho de partícula de 425 μm ou maior na composição particulada exceder a 30 %. Os resultados estão na Tabela 5. <Experiência 5-2: Teste para solubilidade em água>

[000136] Cada amostra de teste foi pesada em 0,25 g e colocada no "FALCON TUBE 2059", um nome de produto de um tubo cilíndrico de polipropileno de 14 ml tendo uma forma de fundo hemisférica e uma tampa, comercializado por Becton, Dickinson and Company, New Jer-sey, USA. Para cada tubo com cada amostra de teste foi adicionado cinco mililitros de água desionizada, e os tubos foram incubados durante 30 minutos em um banho de água com temperatura constante de 50 °C, virados duas vezes, e depois mantidos a 50 °C durante 15 mi-nutos para examinar a solubilidade sob as condições. Foi avaliado como "Admissível" quando uma composição particulada for macrosco-picamente avaliada de ser completamente dissolvida, ao mesmo tempo que foi avaliada como "Impraticável" quando um resíduo insolúvel for macroscopicamente observado. Os resultados estão na Tabela 5, em analogia. Tabela 5

[000137] Como apresentado na coluna de "estabilidade ao armaze- namento", no teste de estabilidade ao armazenamento, onde cada amostra de teste foi armazenada durante 60 dias sob uma circunstância livre de uma temperatura e umidade relativamente elevadas, amostras de teste de 1 a 9, e amostras de teste de 1c a 4c, que tinham um grau de cristalinidade para a trealose de menos do que 90,0 % e um diâmetro médio do cristalito de 2850 Á ou menor, foram avaliadas como "Aglutinadas" (+), enquanto que a amostra de teste A e as amostras de teste de 5c a 9c, que tinham um grau de cristalinidade de 91,0 % ou mais, mas não mais do que 96,0 %, e um diâmetro médio do cristalito de 3210 Â ou maior, foram avaliadas como "Não aglutinadas" (-). Os resultados indicam que as amostras de teste que foram avaliadas como "Aglutinadas" (+) ou "Ligeiramente aglutinadas" (±) nos testes de aglutinação conduzidos nas Experiências 2-2 e 3-2, etc., são avaliadas como "Aglutinadas" ( +) neste teste de armazenamento, enquanto que as amostras de teste que foram avaliadas como "não aglutinadas" (-) nos testes de aglutinação conduzidos nas Experiências 2-2 e 3-2, etc., são avaliadas como "não aglutinadas" (-) neste teste de armazenagem. O fato indica que o teste de aglutinação conduzido nas Experiências 2-2 e 3-2, etc., é apropriado como um teste para avaliar a capacidade de aglutinação das composições particuladas contendo di- hidrato de trealose cristalino sob as suas reais circunstâncias de armazenagem.

[000138] Como mostrado na coluna de "solubilidade em água" na Tabela 5, a solubilidade em água da amostra de teste A, que tinha um grau de cristalinidade de 100 % e um diâmetro médio do cristalito de 3910 Ǻ, foi avaliada como "impraticável", enquanto aquelas das amostras de teste de 1 a 9 e amostras de teste de 1c a 8c, que tinham um grau de cristalinidade de 96,0 % ou inferior e um grau médio do cristalito de 3580 Ǻ ou inferior, todas foram avaliadas como "Admissível". O resultado indica que, quando o grau de cristalinidade e o diâmetro mé- dio do cristalito de uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino são aumentados para os níveis de amostra de teste A, e em outras palavras, quando elas são aumentadas nos níveis de um pó de grau reagente contendo di-hidrato de trealose cristalino, a solubilidade em água torna-se pior que um problema diferente da capacidade de aglutinação. <Experiência 6: Sequências parciais de aminoácido comuns nas CGTases mais adequadas para a produção de trealose>

[000139] Para caracterizar uma CGTase mais adequada para a produção de trealose, as sequências de aminoácido (SEQ ID NOs: 1 a 3) das CGTases supracitadas, derivadas de micro-organismos do gênero Paenibacillus tendo um efeito melhorado de aumentar o teor de trealose nas soluções de reação enzimática, isto é, as quais são, respectivamente, derivadas da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379, cepa de Paenibacillus pabuli NBRC13638, e cepa de Paenibacillus amylolyticus NBRC15957, foram comparadas com as sequências de aminoácido (SEQ ID NOs: 4 e 6) das CGTases, que são respectivamente derivadas da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 e micro-organismos das espécie Bacillus macerans e Thermoanaerobacter thermosulfurigenes supracitados, que possuem um menor efeito de aumentar o teor de trealose em uma solução de reação enzimática do que aqueles dos micro-organismos do gênero Paenibacillus. Todas as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 1 a 3, que foram utilizadas na comparação de sequências de aminoácido acima, são aquelas que são codificados pelas sequências de base determinadas pela clonagem independente do presente requerente para os respectivos genes de CGTase derivados da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379, cepa de Paenibacillus pabuli NBRC13638 e cepa de Paenibacillus amylolyticus NBRC15957. As sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 4 e 5 são as CGTases derivadas da cepa de Geobacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus conforme a classificação antiga) Tc-91, divulgadas na Patente Japonesa Kokai No. 135581/86 e determinadas de forma independente pelo mesmo requerente da presente invenção, e de um micro-organismo da espécie Bacillus macerans. Para comparação, embora a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 não seja para "CONTIZYME", um nome de produto de uma CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Bacillus macerans, comercializada pela Amano Enzyme Inc., Aichi, Japan, utilizada na Experiência 1, foi utilizada como uma substituição por que é uma sequência de aminoá- cido de uma CGTase derivada de um micro-organismo que pertence à mesma espécie Bacillus macerans. Como a sequência de aminoácido de uma CGTase derivada de um micro-organismo da espécie Thermoanaerobacter thermosulfurigenes, a única registrada no "GenBank", um banco de dados de genes, sob o número de acesso de 35484, foi utilizada.

[000140] Na comparação acima mencionada das sequências de aminoácido, a seguinte sequência parcial de aminoácido de (a) a (d) foi observada em CGTases que possuem um efeito superior de aumentar o teor de trealose em uma solução de reação enzimática, isto é, tais sequências parciais de aminoácido comumente existem nas CGTases derivadas dos micro-organismos acima do gênero Paeniba- cillus, mas não existem nas CGTases, cujos efeitos de aumento do teor de trealose nas soluções de reação enzimática não são tão elevados, isto é, as CGTases derivadas dos respectivos Geobacillus stea- rothermophilus, Bacillus macerans e Thermoanaerobacter thermosulfu- rigenes: Gly-Ser-X1-Ala-Ser-Asp; Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn; Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys; e Val-Asn-Ser-Asn-X2-Tyr. (Em que X1 significa Ala ou Ser e X2 significa Ala ou Thr, respectivamente.)

[000141] Com base nos resultados acima, as CGTases que são mais adequadas para o processo de produção de trealose da presente in-venção, isto é, as CGTases que podem aumentar o teor de trealose em mais de 86,0 % em uma solução de reação enzimática, podem ser caracterizadas de ter as sequências parciais de aminoácido acima identificadas de (a) a (d).

[000142] A presente invenção será explicada com maiores detalhes com base nos seguintes exemplos, mas não deve ser limitada desse modo. Exemplo 1 <Produção da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino>

[000143] Amido de milho foi colocado em suspensão em água para fornecer uma suspensão a 30 %, misturado com carbonato de cálcio para forncer uma concentração final de 0,1 %, e o pH ajustado para 6,0. À solução resultante foi adicionado "TERMAMEAL 60L", um nome de produto de um espécime de α-amilase termoestável comercializado pela Novozymes Japan Ltd., Tokyo, Japan, em uma quantidade igual a 0,2 % do peso, d.s.b., do amido, e submetida a uma reação enzimática em 98 a 100 °C durante 15 min para gelatinizar e liquefazer o amido. A solução de amido liquefeito resultante foi submetida a autoclave a 125 °C durante 15 min, esfriada para 51 °C, misturada com uma solução de enzima parcialmente purificada contendo uma enzima de formação de α-glicosiltrealose e uma enzima de liberação de trealose, peparada pelo método da Experiência 101, nas respectivas quantidades de 2 e 10 unidades/g de amido, ainda misturada com uma isoamilase produ-zida pela Hayashibara Co., Ltd., de Okayama, Japan, em uma quanti- dade de 300 unidades/g de amido e uma CGTase derivada da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15959, preparada pelo método da Ex-periência 1-2, em uma quantidade de duas unidades/g de amido, e ainda enzimaticamente reagida durante cerca de 70 horas. Depois dis-so, a solução de reação enzimática foi aquecida a 97 °C durante 30 minutos para inativar as enzimas remanescentes, ajustada para pH 4,5, misturada com "GLUCOZYME #20000", um nome de produto de um espécime de glucoamilase comercializado pela Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japan, em uma quantidade de 10 unidades/g de amido, e enzimaticamente reagida durante 24 horas para se obter uma solu-ção de reação enzimática com uma pureza de trealose ou um teor de trealose de 87,4 %, d.s.b. A solução de reação enzimática assim obtida foi aquecida para inativar a enzima remanescente e, de um modo habitual, descolorada e filtrada com um carvão vegetal ativado. O fil-trado foi dessalinizado com uma resina de troca catiônica (forma H+) e uma resina de troca aniônica (forma OH-), concentrado in vacuo em um concentrado com um teor de sólidos ao redor de 85 %. O concentrado foi colocado em um cristalizador, misturado com "TREHALOSE 999" (Código No.: TH224, pureza de trealose: 99,9 % ou mais elevada), um nome de produto de um pó de grau reagente contendo o di- hidrato de trealose cristalino, comercializado pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, como um cristal semente, em uma quantidade igual a dois por cento do teor de sólidos, ajustado para 55 °C, e esfriado de forma natural para 15 °C durante 24 horas sob condições de agitação suave, para precipitar o di-hidrato de trealose cristalino. Os cristais foram coletados por uma centrífuga do tipo cesta, removidos com água refinada em uma quantidade igual a cerca de cinco por cento do peso de uma massa cozida, amadurecidos e secados a 50 °C durante duas horas, esfriados por ventilação de ar a 20 °C durante 10 min, e pulverizados para se obter uma composição particula- da contendo di-hidrato de trealose cristalino, a qual continha em uma base de sólidos secos, 99,4 % de trealose, 0,3 % de D-glicose, 0,06 % de 4-O-α-glucosiltrealose, e 0,09 % de 6-O-α-glucosiltrealose, com um rendimento de produção em comparação com o amido de cerca de 42 %.

[000144] De acordo com o processo de produção deste exemplo, uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino pode ser produzida com um rendimento de produção elevado em comparação com o amido ao redor de 42 %. O grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino, o diâmetro médio do cristalito, e o poder de redução de toda a composição particulada da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino produzida pelo processo deste exemplo, foram respectivamente 88,4 %, 2850 Â, e 0,4 %. Para comparação, a medida para o grau de cristalinidade acima foi determinada no método de Herman utilizando os valores analíticos H100 e HO obtidos na Experiência 4-2. A medição da distribuição do tamanho de partícula do produto revelou que ele continha partículas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 425 μm em uma quantidade de 73,1 %, aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 300 μm em uma quantidade de 68,6 %, e aquelas com um tamanho de partícula de 425 μm ou mais em uma quantidade de 8,2 %. O produto pode ser usado como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase- medicamentos, produtos farmacêuticos e similares para um pó convencional de qualidade alimentar contendo o di-hidrato de trealose cristalino. Exemplo 2 <Produção da composição particulada contendo o di-hidrato de trealo-se cristalino>

[000145] Uma solução de reação enzimática com uma pureza de trealose ou um teor de trealose de 87,6 %, d.s.b., foi obtida através da condução de uma reação de formação de trealose e um tratamento de glucoamilase por um método semelhante ao do Exemplo 1, exceto para a fixação de uma reação enzimática de 40 horas mediante o uso de uma enzima de formação de α-glicosiltrealose e uma enzima de libera-ção de trealose nas respectivas quantidades de 3 unidades e 15 uni-dades por g de amido e utilizando uma CGTase derivada da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 obtida pelo método na Experi-ência 1-2. A solução de reação enzimática assim obtida foi aquecida para inativar as enzimas remanescentes e, de um modo habitual, des-colorada e filtrada com carvão vegetal ativado. O filtrado foi dessalini- zado com uma resina de troca catiônica (forma H+) e uma resina de troca aniônica (forma OH-), concentrado in vacuo em um concentrado com um teor de sólidos ao redor de 85 %. O concentrado foi colocado em um cristalizador, misturado com "TREALOSE 999" (Código No: TH224, pureza de trealose: 99,9 % ou maior), um nome de produto de um pó de grau reagente contendo di-hidrato de trealose cristalino, co-mercializado pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, como um cristal semente, em uma quantidade igual a um por cento do teor de sólidos, e ajustado a 60 °C. Depois disso, a solução contendo trealose resultante foi esfriada até 15 °C ao longo de um tempo total de 24 ho-ras por um método de esfriamento de semicontrolado de esfriamento, sucessivo de 60 °C para 50 °C durante 12 horas, de 50 °C para 40 °C durante seis horas, e depois de 40 °C para 15 °C durante seis horas sob condições de agitação suave para precipitar o di-hidrato de trealo- se cristalino. Os cristais foram coletados por uma centrífuga tipo cesta, removidos com água refinada em uma quantidade igual a cerca de 5 % do peso de uma massa cozida, amadurecidos e secados a 50 oC durante duas horas, esfriados por ventilação de ar a 20 °C durante 20 min, e pulverizados para se obter uma composição particulada con tendo di-hidrato de trealose cristalino, a qual continha em uma base de sólidos secos, 99,6 % de trealose, 0,07 % de D-glicose, 0,04 % de 4- O-α-glucosiltrealose, e 0,06 % de 6-O-α-glucosiltrealose, com um ren-dimento de produção em comparação com o amido de cerca de 45 %.

[000146] O grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose crista-lino, o diâmetro médio do cristalito, e o poder de redução de toda a composição particulada da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino produzida, foram respectivamente 95,6 %, 3520 Â, e 0,15 %. Para comparação, a medida para o grau de cristalinidade acima foi determinada no método de Herman utilizando os valores analíticos H100 e H0 obtidos na Experiência 4-2. A medição da distribui-ção do tamanho de partícula do produto revelou que ele continha par-tículas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 425 μm em uma quantidade de 83,3 %, aquelas com um tama-nho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 300 μm em uma quantidade de 72,5 %, e aquelas com um tamanho de partícula de 425 μm ou mais em uma quantidade de 6,9 %. Quando submetido a um teste de aglutinação pelo mesmo método como nas Experiências 2-2, 3-2, etc., o produto foi avaliado como "não aglutinado" (-). Também, o produto foi avaliado como "Admissível" quando testado com relação à solubilidade em água pelo mesmo método como na Experiência 5.

[000147] De acordo com o processo de produção deste exemplo, uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino pode ser produzida com um rendimento de produção em comparação com o amido tão elevado quanto cerca de 45 %. Embora, em termos da pureza de trealose, a composição particulada contendo di- hidrato de trealose cristalino produzida pelo processo deste exemplo não seja tão diferente de "TREHA", um nome de produto de um pó convencional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino, comercializado pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, como um material alimentício ou coisa parecida, é uma composição particulada significativamente difícil de aglutinar em comparação com o pó de grau alimentício convencional, assim como sendo facilmente armazenado e manuseado. O produto é semelhante ao pó de grau alimentício convencional em que é uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino; o mais facilmente armaze-nado e manuseado, o mais preferivelmente utilizado como material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-medicamentos, produtos farmacêuticos, etc. Exemplo 3 <Produção da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino>

[000148] Quando uma reação de formação de trealose foi realizada de forma semelhante como no Exemplo 1, exceto para uso, como uma CGTase, do único derivado da cepa de Paenibacillus pabuli NBRC13638 preparado pelo método na Experiência 1-2, o teor de trealose na solução de reação enzimática resultante após o tratamento de glicoamilase foi de 87,2 %, d.s.b. A solução de reação enzimática assim obtida foi aquecida para inativar a enzima remanescente e, de um modo habitual, descolorada e filtrada com um carvão vegetal ativado. O filtrado foi dessalinizado com uma resina de troca catiônica (forma H+) e uma resina de troca aniônica (forma OH-), concentrado in vacuo em um concentrado com um teor de sólidos ao redor de 85 %. O concentrado foi colocado em um cristalizador, misturado com "TREHALOSE 999" (Código No.: TH224, pureza de trealose: 99,9 % ou mais elevada), um nome de produto de um pó de grau reagente contendo o di-hidrato de trealose cristalino, comercializado pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, como um cristal semente, em uma quantidade igual a um por cento do teor de sólidos, ajustado para 60 °C, e esfriado durante 24 horas de uma tal maneira de esfriamento de 60 oC para 45 oC durante 15 horas e de 45 oC para 20 oC durante 9 horas sob condições de agitação suave por um método de esfriamento semicontrolado de duas etapas, para precipitar o di-hidrato de trealose cristalino. Os cristais foram coletados por uma centrífuga do tipo cesta, removidos com água refinada em uma quantidade igual a cerca de 5 % do peso de uma massa cozida, amadurecidos e secados a 50 °C durante duas horas, esfriados por ventilação de ar a 20 °C durante 10 min, e pulverizados para se obter uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, a qual continha em uma base de sólidos secos, 99,2 % de trealose, 0,4 % de D-glicose, 0,06 % de 4-O- α-glucosiltrealose, e 0,10 % de 6-O-α-glucosiltrealose, com um rendimento de produção em comparação com o amido de cerca de 44 %.

[000149] O grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino, o diâmetro médio do cristalito, e o poder de redução de toda a composição particulada da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino produzida, foram respectivamente 92,6 %, 3130 Å, e 0,5 %. Para comparação, a medida para o grau de cristalinidade acima foi determinada no método de Herman utilizando os valores analíticos H100 e H0 obtidos na Experiência 4-2. A medição da distribui- ção do tamanho de partícula do produto revelou que ele continha partículas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 425 μm em uma quantidade de 75,2 %, aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 300 μm em uma quantidade de 69,3 %, e aquelas com um tamanho de partícula de 425 μm ou maior em uma quantidade de 7,8 %. Quando submetido a um teste de aglutinação pelo mesmo método como nas Experiências 2-2, 3-2, etc., o produto foi avaliado como "não aglutinado" (-). Também, o produto foi avaliado como "Admissível" quando testado com relação à solubilidade em água pelo mesmo método como na Experiência 5.

[000150] De acordo com o processo de produção deste exemplo, uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino pode ser produzida com um rendimento de produção elevado em comparação com o amido ao redor de 44 %. Embora, em termos da pureza de trealose, a composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino produzida pelo processo deste exemplo não seja tão diferente de "TREHA", um nome de produto de um pó convencional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino, comercializado pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, como um material alimentício ou coisa parecida, é uma composição particulada significativamente difícil de aglutinar em comparação com o pó de grau alimentício convencional, assim como sendo facilmente armazenado e manuseado. O produto é semelhante ao pó de grau alimentício convencional em que é uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino; o mais facilmente armazenado e manuseado, o mais preferivelmente utilizado como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-medicamentos, produtos farmacêuticos, etc. Exemplo 4 <Produção da composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino>

[000151] Uma solução de reação enzimática com uma pureza de trealose ou um teor de trealose de 86,6 %, d.s.b., foi obtida através da condução de uma reação de formação de trealose e um tratamento de glucoamilase similarmente como o método no Exemplo 1, exceto com relação ao uso de amido de tapioca como um material de amido e uma CGTase derivada da cepa de Paenibacillus amylolyticus NBRC15957, como uma CGTase, obtida pelo método na Experiência 1-2. A solução de reação enzimática assim obtida foi aquecida para inativar a enzima remanescentes e, de maneira habitual, descolorada e filtrada com um carvão vegetal ativado. O filtrado foi dessalinizado com uma resina de troca catiônica (forma H+) e uma resina de troca aniônica (forma OH-), concentrado in vacuo em um concentrado com um teor de sólidos ao redor de 86 %. O concentrado foi colocado em um cristalizador, mistu-rado com "TREALOSE 999" (Código No: TH224, pureza de trealose: 99,9 % ou maior), um nome de produto de um pó de grau reagente contendo di-hidrato de trealose cristalino, comercializado pela Ha- yashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, como um cristal semente, em uma quantidade igual a um por cento do teor de sólidos, ajustado a 60 °C. e esfriado para 15 °C ao longo de 24 horas no total de uma tal maneira de esfriamento de 60 °C para 50 °C durante oito horas, de 50 °C para 35 °C durante oito horas, e de 35 °C para 15 °C durante oito horas sob condições de agitação suave por um método de esfriamento semicontrolado de três etapas para precipitar o di-hidrato de trealose cristalino. Os cristais foram coletados por uma centrífuga tipo cesta, removidos com água refinada em uma quantidade igual a cerca de 5 % do peso de uma massa cozida, amadurecidos e secados a 50 oC durante duas horas, esfriados por ventilação de ar a 20 °C durante 20 min, e pulverizados para se obter uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, a qual continha em uma base de sólidos secos, 99,4 % de trealose, 0,06 % de D-glicose, 0,04 % de 4- O-α-glucosiltrealose, e 0,06 % de 6-O-α-glucosiltrealose, com um rendimento de produção em comparação com o amido ao redor de 43 %.

[000152] O grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino, o diâmetro médio do cristalito, e o poder de redução de toda a composição particulada da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino produzida, foram respectivamente 93,3 %, 3280 Â, e 0,13 %. Para comparação, a medida para o grau de cristalinidade acima foi determinada no método de Herman utilizando os valores analíticos H100 e H0 obtidos na Experiência 4-2. A medição da distribui- ção do tamanho de partícula do produto revelou que ele continha par-tículas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 425 μm em uma quantidade de 80,7 %, aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 300 μm em uma quantidade de 74,4 %, e aquelas com um tamanho de partícula de 425 μm ou maior em uma quantidade de 7,1 %. Quando submetido a um teste de aglutinação pelo mesmo método como nas Experiências 2-2, 3-2, etc., o produto foi avaliado como "não aglutinado" (-). Também, o produto foi avaliado como "Admissível" quando testado com relação à solubilidade em água pelo mesmo método como na Experiência 5.

[000153] De acordo com o processo de produção deste exemplo, uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino pode ser produzida com um rendimento de produção em comparação com o amido tão elevado quanto cerca de 43 %. Embora, em termos da pureza de trealose, a composição particulada contendo di- hidrato de trealose cristalino produzida pelo processo deste exemplo não seja tão diferente de "TREHA", um nome de produto de um pó convencional de qualidade alimentar contendo di-hidrato de trealose cristalino, comercializado pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, como um material alimentício ou coisa parecida, é uma composição particulada significativamente difícil de aglutinar em comparação com o pó de grau alimentício convencional, assim como sendo facilmente armazenado e manuseado. O produto é semelhante ao pó de grau alimentício convencional em que é uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino; o mais facilmente armazenado e manuseado, o mais preferivelmente utilizado como material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-medicamentos, produtos farmacêuticos, etc. Exemplo 5 <Preparação da CGTase recombinante e da CGTase mutante e pro-dução da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cris-talino através do seu uso>

[000154] Uma produção de uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino foi conduzida pela utilização, em lugar da CGTase derivada da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 usada no Exemplo 2, de dois tipos de enzimas de uma CGTase recombinante (tipo silvestre) obtidas pela expressão de um gene de CGTase derivado do micro-organismo acima em E. coli como um hospedeiro, e uma CGTase mutante, tendo uma substituição de um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácido com outro resíduo de aminoácido, preparado pela introdução de uma mutagênese específica do sítio na CGTase tipo silvestre acima. <Preparação da CGTase recombinante>

[000155] Mediante o uso de um gene de CGTase tendo a sequência de bases da SEQ ID NO: 7, derivado da cepa de Paenibacillus illinoi- sensis NBRC15379, que foi clonada a partir do micro-organismo e dominada pelos presentes inventores, um DNA recombinante para a expressão, que contém um gene que codifica uma CGTase natural (tipo silvestre), foi construído através da mutação do gene de CGTase acima sem alterar a sequência de aminoácido codificada pelo gene de CGTase para introduzir ou eliminar um sítio de restrição de enzima, etc., e recombinação do produto resultante em um vetor plas- mídeo de expressão "pRSET-A", produzido pela Invitrogen Corporation, CA, USA. A estrutura do DNA recombinante obtido "pRSET-ipI" é mostrada na FIG. 6. E. coli BL21 (DE3), produzido pela Stratagene, CA, USA, foi transformada de forma habitual com o DNA recombinante "pRSET-ipI" para obter um "BL21-RSET-ipI" transformante tendo o DNA recombinante. Depois disso, o transformante foi aerobicamente cultivado a 37 °C durante 24 horas em meio T (contendo 12 g de bac- to-triptona, 24 g de extrato de bacto-levedura, 5 ml de glicerol, 17 mM fosfato de potássio, e 72 mM fosfato de dipotássio, por litro do meio) contendo 100 μl/ml de ampicilina (sal de Na). A cultura resultante foi centrifugada, e as células obtidas foram submetidas a um tratamento de disrupção com "ULTRA SONIC HOMOGENIZER UH-600", um nome de produto de um disruptor de ultra-sons, comercializado pela MST Co., Ltd., Tokyo, Japan, e centrifugadas, seguido pela avaliação do sobrenadante com relação à atividade de CGTase (atividade de de-composição do amido) para ter uma atividade enzimática de cerca de 12,8 unidades/ml, quando convertido na atividade por um mililitro do líquido de cultura. O sobrenadante da solução submetido a disrupção foi da maneira habitual coagulado com sulfato de amônio e submetido a diálise para obter uma solução de enzima em estado natural de uma CGTase recombinante, seguido pela purificação da solução de enzima em estado natural por submetê-la a uma cromatografia de coluna de troca aniônica usando DEAE-TOYOPEARL 650S GEL, produzido pela Tosoh Corp., Tokyo, Japan, e uma cromatografia de coluna hidrofóbica utilizando BUTYL-TOYOPEARL 650M GEL comercializado pela Tosoh Corp., Tokyo, Japan, em um espécime parcialmente purificado de uma CGTase recombinante. <Preparação da CGTase mutante>

[000156] Dois tipos de CGTases mutantes com uma substituição de aminoácido foram preparados através da introdução de uma mutação específica do sítio em um gene de CGTase natural (tipo silvestre) de-rivado da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 acima identi-ficada da maneira habitual, e expressão do gene de CGTase mutante obtido em E. coli. Quando da introdução da substituição de aminoácido na CGTase, qualquer mutação de substituição de aminoácido é evitada a partir dos seguintes sítios e um sítio de mutação é selecionado daqueles diferentes dos seguintes sítios: os resíduos de aminoácidos do 133o resíduo de ácido aspártico até o 138o resíduo de histidina (Asp 133 a His 138), do 223o resíduo de glicina até o 231o resíduo de histidina (Gly 223 a His 231), do 255o resíduo de ácido glutâmico até o 258o resíduo de leucina (Glu 255 a Leu 258), e do 321o resíduo de fe- nilalanina até o 326o resíduo de ácido aspártico (Phe 321 a Asp 326) na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 que corresponde à se-quência de aminoácido de um derivado de CGTase da cepa de Paeni- bacillus illinoisensis NBRC15379, isto é, sequências de aminoácido que correspondem a quatro regiões conservadas geralmente conservadas no grupo de enzima classificado como família α-amilase; e os resíduos de aminoácido do 259o resíduo de glicina até o 264o resíduo de ácido aspártico (Gly 269 a Asp 264), do 331o resíduo de lisiina até o 337o resíduo de asparagina (Lys 331 a Asp 337), do 375o resíduo de lisina até o 381o resíduo de lisina (Lys 375 a Lys 381), e do 567o resíduo de valina até o 572o resíduo de tirosina (Val 567 a Tyr 572) na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, isto é, as sequências parciais de aminoácido acima identificadas de (a) a (d) que são características das CGTases derivadas de micro-organismos do gênero Paeniba- cillus.

[000157] Com base na diretriz acima, os seguintes dois tipos de CGTases mutantes foram determinadas de se preparar; uma CGTase mutante (G178R) com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 em que o 178o resíduo de glicina foi substituída com o resíduo de argi- nina, e uma CGTase mutante (Y454H) com a sequência de aminoáci- do da SEQ ID NO: 1, em que a 454o resíduo de tirosina foi substituído com o resíduo de histidina. Um DNA recombinante "pRSET-iPI (G178R)" que codifica uma CGTase mutante (G178R) foi obtido mediante o uso como um modelo genético de um DNA recombinante "pRSET-ipI" tendo um gene de CGTase natural (do tipo silvestre) derivado da cepa de Paenibacillus illinoisensis NBRC15379 estirpe e o uso de oligonucleotídeos sintéticos tendo as sequências de base das SEQ ID NOs: 8 e 9 como um iniciador de sentido e anti-sentido, res-pectivamente; e a introdução de uma mutação específica do sítio no gene de CGTase por métodos convencionais de PCR e Dpnl utilizando um "QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit" comercializado pro-duzido pela Stratagene, CA, USA. Um DNA "pRSET-iPI (Y454H)" que codifica a CGTase mutante (Y454H) foi obtido de modo semelhante como acima, excepto para a utilização de oligonucleotídeos sintéticos tendo as sequências de base da SEQ ID NOs: 10 e 11 como um inici-ador sentido e anti-sentido, respectivamente.

[000158] E. coli BL21 (DE3), produzido pela Stratagene, CA, USA, foi transformada de forma habitual através do uso do DNA recombinante "pRSET-iPI (G178R)" ou "pRSET-iPI (Y454H)", que tinha um gene de CGTase mutante, para obter transformantes de "BL21-RSET-iPI (G178R)" e "BL21-RSET-iPI (Y454H)", que tinham os respectivos DNAs recombinantes acima. Similarmente como o "BL21-RSET-ipI" acima, estes transformantes foram respectivamente cultivados, seguido pela disrupção das células e purificação parcial dos resultantes para obter espécimes parcialmente purificados das CGTases mutantes, respectivamente. Por falar nisso, os sobrenadantes de cada uma das soluções de disrupção celular foram analisados com relação à atividade de CGTase (atividade de hidrolisação do amido) e convertidos em atividades de enzima por mililitro das soluções de cultura, revelando que eles tinham cerca de 10,3 unidades/ml para "BL21-RSET-iPI ( G178R)" e cerca de 13,7 unidades/ml para "BL21-RSET-iPI (Y454H)". <Produção de composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino>

[000159] Uma composição particulada contendo o di-hidrato de trea- lose cristalino foi produzido pelo método de forma semelhante como no Exemplo 2, exceto com relação ao uso da CGTase recombinante (tipo silvestre), e, como uma CGTase mutante, G178R, uma CGTase tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12; ou Y454H, uma CGTase tendo a sequência de amino ácido da SEQ ID NO: 13, ambas das quais foram na totalidade obtidas no acima. Os teores de trealose nas soluções de reação enzimáticas obtidas através do uso das respectivas CGTases, as composições de sacarídeo das composições particuladas obtidas contendo di-hidrato de trealose cristalino, os rendimentos de produção em comparação com o amido, os graus de cris- talinidade para o di-hidrato de trealose cristalino, os diâmetros médios do cristalito, os pós redutores da totalidade dos pós, e as distribuições do tamanho de partícula foram determinados; e as composições parti- culadas foram submetidas tanto a um teste de aglutinação pelo mesmo método como nas Experiências 2-2, 3-2, etc., quanto a um teste para a solubilidade em água pelo mesmo método como na Experiência 5. Os resultados são dispostos em forma de tabela na Tabela 6. Tabela 6

: Após o tratamento de glucoamilase ** : Em uma base de sólidos secos

[000160] Como mostrado na Tabela 6, mesmo no caso de se utilizar a CGTase recombinante e as CGTases mutantes com uma substitui- ção de aminoácido, os teores de trealose nas soluções de reação enzimática são substancialmente o mesmo nível de 87,0 % ou mais como no caso das CGTase naturais; e as composições particuladas, contendo di-hidrato de trealose cristalino tendo substancialmente a mesma pureza de trealose, grau de cristalinidade, distribuição do tamanho de partícula, etc., podem ser produzidas com um rendimento de produção em comparação com o amido de tão elevada quanto cer ca de 44 % a cerca de 45 % de acordo com o mesmo processo de produção. Similarmente como as composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino produzidas com as CGTases naturais nos Exemplos de 1 a 4, embora as composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino produzido no processo de produção deste exemplo não seja tão diferente de "TREHA", um pó de grau alimentício convencional contendo di-hidrato de trealose cristalino, comercializado pela Hayashibara Co., Ltd., de Okayama, Japan, que foi comercializado como um material alimentar, etc., em termos de pureza de trealose, elas são composições particuladas significativamente difí- ceis de aglutinar em comparação com o pó de grau alimentar convencional, assim como sendo facilmente armazenadas e manuseadas. Exemplo 6

[000161] Uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, contendo, em uma base de sólidos secos, 99,7 % de trealose, 0,05 % de D-glicose, 0,03 % de 4-O-α-glucosiltrealose, e 0,05 % de 6-O-α-glucosiltrealose, foi obtida com um rendimento de produ- ção em comparação com o amido de cerca de 46 % pelo método similar como no Exemplo 2, a não ser que a precipitação do di-hidrato de trealose cristalino através da aplicação de um método de esfriamento controlado para esfriar os conteúdos durante 24 horas, em um perfil de esfriamento de 20 etapas aproximado pela equação [2] supracitada, de uma tal maneira de esfriamento dos teores de 60 °C para 20 °C mediante o uso, na etapa de cristalização para o di-hidrato de trealose cristalino, de um circulador convencional de temperatura constante programado pelo sistema de cristalização e circulação de um meio de aquecimento controlado pela temperatura para um invólucro de um cristalizador.

[000162] A composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino tinha o grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino de 96,8 %, um diâmetro médio de cristalito de 3,680 Ǻ, e um poder de redução da totalidade do pó de 0,13 %. Para comparação, a determinação do grau de cristalinidade acima foi realizada pelo método de Herman usando os valores analíticos H100 e H0 determinados na Experiência 4-2. A medição da distribuição do tamanho de partícula da composição particulada revelou que ela continha partículas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 425 μm em uma quantidade de 84,5 %, aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 300 μm em uma quantidade de 76,2 %, e aquelas com um tamanho de partícula de 425 μm ou maior em uma quantidade de 6,4 %. Quando submetido a um teste de aglutinação pelo mesmo método como nas Experiências 2-2, 3-2, etc., a composição particulada foi avaliada como "não aglutinada" (-). Também, a composição particulada foi avaliada como "Admissível" quando testada com relação à solubilidade em água pelo mesmo método como na Experiência 5.

[000163] De acordo com o processo de produção deste exemplo, uma composição particulada contendo o di-hidrato de trealose cristalino é produzida com um rendimento de produção em comparação com o amido tão elevado quanto cerca de 46 %. Embora a composição par- ticulada contendo di-hidrato de trealose cristalino produzida pelo processo deste exemplo não seja tão diferente de "TREHA", um nome de produto de um pó convencional de qualidade alimentar contendo di- hidrato de trealose cristalino, comercializado pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, que foi comercializado como um material alimentício, etc., em termos de pureza de trealose, é uma composição particulada significativamente difícil de aglutinar em comparação com o pó de grau alimentício convencional, assim como sendo facilmente armazenado e manuseado. O produto é semelhante ao pó de grau alimentício convencional em que é uma composição particulada con- tendo o di-hidrato de trealose cristalino; o mais facilmente armazenado e manuseado, o mais preferivelmente utilizado como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-medicamentos, produtos farmacêuticos, etc. Exemplo para Referência <Produção da composição particulada contendo a trealose cristalina dihydrate>

[000164] Quando se conduz uma reação de formação de trealose e um tratamento de glucoamilase similarmente como no Exemplo 1, a não ser que se use, como uma CGTase, um espécime de enzima CGTase derivado da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91, produzido pela Hayashibara Co., Ltd., de Okayama, Japan, uma solução de reação enzimática após o tratamento de glucoamilase teve um teor de trealose de 85,2 %, d.s.b. A solução de reação enzimática foi da maneira habitual descolorada e filtrada com carvão vegetal ativado, e o filtrado foi dessalinizado com uma resina de troca catiônica (forma H+) e uma resina de troca aniônica (forma OH-), concentrado in vacuo em um concentrado com um teor de sólidos ao redor de 84 %. O concentrado foi colocado em um cristalizador, misturado com "TREALOSE 999" (Código No: TH224, pureza de trealose: 99,9 % ou maior), um nome de produto de um pó de grau reagente contendo di-hidrato de trealose cristalino, comercializado pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, como um cristal semente, em uma quantidade igual a um por cento do teor de sólidos, ajustado a 60 °C, e esfriado de modo natural de 55 oC para 15 oC durarnte 20 horas sob condições de agitação suave para precipitar o di-hidrato de trealose cristalino. Os cristais foram coletados por uma centrífuga tipo cesta, removidos com água refinada em uma quantidade igual a cerca de 5 % do peso de uma massa cozida, amadurecidos e secados a 50 oC durante duas horas, esfriados por ventilação de ar a 20 °C durante 20 min, e pulverizados para se obter uma composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino, a qual continha em uma base de sólidos secos, 98,5 % de trealose, 0,08 % de D-glicose, 0,07 % de 4-O-α-glucosiltrealose, e 0,1 % de 6-O-α-glucosiltrealose, com um rendimento de produção em comparação com o amido ao redor de 38 %.

[000165] O grau de cristalinidade para o di-hidrato de trealose cristalino, o diâmetro médio do cristalito, e o poder de redução da totalidade do pó da composição particulada contendo di-hidrato de trealose cristalino foram respectivamente 88,3 %, 2580 Â, e 1,0 %. Para comparação, a medida para o grau de cristalinidade acima foi determinada no método de Herman utilizando os valores analíticos H100 e H0 obtidos na Experiência 4-2. A medição da distribuição do tamanho de partícula do produto revelou que ele continha partículas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 425 μm em uma quantidade de 74,4 %, aquelas com um tamanho de partícula de 53 μm ou maior, mas menor do que 300 μm em uma quantidade de 69,4 %, e aquelas com um tamanho de partícula de 425 μm ou maior em uma quantidade de 12,6 %. Quando submetido a um teste de aglutinação pelo mesmo método como nas Experiências 2-2, 3-2, etc., o produto foi avaliado como "ligeiramente aglutinado" (±-). Também, o produto foi avaliado como "Admissível" quando testado com relação à solubilidade em água pelo mesmo método como na Experiência 5.

Aplicabilidade Industrial

[000166] Conforme descrito acima, de acordo com o processo de produção para a produção de composições particuladas contendo o di- hidrato de trealose cristalino anidro, aquelas que são relativamente elevadas na pureza de forma semelhante como no pó convencional de grau alimentar que contém di-hidrato de trealose cristalino e são difi-cilmente aglutináveis, podem ser produzidas com um alto rendimento de produção em comparação com o amido. Em particular, quando um método de esfriamento controlado, ou o método de esfriamento semi- controlado for aplicado na etapa de cristalização para o di-hidrato de trealose cristalino, as composições particuladas contendo um di- hidrato de trealose cristalino de pureza mais elevada são produzidas com um rendimento de produção mais elevado em comparação com o o amido. Como descrito acima, o processo de produção de acordo com a presente invenção permite produzir de forma mais eficiente as composições particuladas contendo o di-hidrato de trealose cristalino em uma escala industrial mediante o uso de amido, como um material, o qual está presente em abundância, mas uma fonte restrita, e assim possui uma utilidade industrial particular. As composições particuladas contendo di-hidrato de trealose cristalino produzidas pelo processo de produção da presente invenção, que emprega um método de esfriamento controlado ou método de esfriamento semicontrolado, são composições particuladas significativamente difíceis de aglutinar em comparação com os pós de grau alimentício convencionais contendo di- hidrato de trealose cristalino, e elas possuem um disponibilidade industrial superior em que eles podem ser usadas em diversas utilizações como materiais em pó mais facilmente manipuláveis para produtos alimentares, cosméticos, quase-medicamentos ou produtos farmacêuticos. Assim, a presente invenção, a qual possui uma tal função e efeito destacados, possui utilidades industriais distintas. Explicação dos Símbolos

[000167] Na FIG. 1, os símbolos de "a" a "e" significam como se segue: a: um pico de difração em um ângulo de difração (2θ) de 13,7 ° (índice de Miller (hkl): 101) para o cálculo do diâmetro de crista- lito; b: um pico de difração em um ângulo de difração (2θ) de 17,5 ° (índice de Miller (hkl): 220) para o cálculo do diâmetro de crista- lito; c: um pico de difração em um ângulo de difração (2θ) de 21,1 ° (índice de Miller (hkl): 221) para o cálculo do diâmetro de crista- lito; d: um pico de difração em um ângulo de difração (2θ) de 23,9 ° (índice de Miller (hkl): 231) para o cálculo do diâmetro de crista- lito; e e: um pico de difração em um ângulo de difração (2θ) de 25,9 ° (índice de Miller (hkl): 150) para o cálculo do diâmetro de crista- lito. Na FIG. 5, os símbolos de "a" a "c" significam como se se-gue: a: curva de esfriamento controlado; b: Esfriamento linear; e c: curva de esfriamento natural. Na FIG. 6, os seguintes símbolos significam como se se-gue: pUC ori: Origem de replicação derivada do pUC plasmídeo; T7: Promotor T7; Seta branca (Amp): Gene resistente a ampicilina; e Seta preta: Gene de CGTase.

Claims (6)

1. Processo para a produção de uma composição particulada compreendendo di-hidrato de α,α-trealose cristalino com um teor de α,α-trealose de 98,0 % em peso ou mais, em uma base sólida seca, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - deixar atuar sobre o amido liquefeito uma enzima de formação de α- glicosiltrealose e uma enzima de liberação da trealose ambas sendo derivadas de um microorganismo do gênero Arthrobacter juntamente com uma enzima de desramificação de amido e uma ciclomaltodextrina glucanotransferase (CGTase) sendo uma CGTase natural ou recombinante derivada de um microorganismo do gênero Paenibacillus; - deixar uma glicoamilase atuar sobre a mistura resultante para se obter uma solução de sacarídeo compreendendo α,α-trealose; - precipitar o di-hidrato de α,α-trealose cristalino a partir da referida solução de sacarídeo por um método de resfriamento controlado ou método de resfriamento semi-controlado; - coletar o di-hidrato de α,α-trealose cristalino precipitado através de uma centrifugação; e - amadurecer e secar os cristais coletados para obter uma composição em partículas compreendendo di-hidrato de α,α-trealose cristalino, em que a referida ciclomaltodextrina glucanotransferase é utilizada para aumentar o teor de α,α-trealose na referida solução de sacarídeo em mais de 86,0 % em peso, sobre uma base sólida seca, sem passar através de uma etapa de fracionamento pela cromatografia de coluna.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido método de resfriamento controlado é um método de resfriamento em que a temperatura do líquido “T” no tempo “t” é basicamente expressa pela fórmula: T = To- (To-Tf) (t /T)3 em que “T” é o tempo de operação estabelecido para a etapa de cristalização, “To” é a temperatura do líquido no início da cristalização e “Tf” é a temperatura do líquido alvo na terminação da cristalização; e em que o referido método de resfriamento semi-controlado é um método de resfriamento, em que a temperatura do líquido “T” é permitida para diminuir linear ou gradualmente contra o tempo “t” para manter a variação (To-Tm) da temperatura do líquido “T” no ponto de “t=T/2” sendo pelo menos 5%, mas inferior a 5o% da mudança total de temperatura (To-Tf), e em que “Tm” é a temperatura do líquido no tempo “t=T/2”.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição particulada compreendendo di-hidrato de α,α-trealose cristalino é obtido com um rendimento de produção contra amido de 39% em peso ou superior.

4. Composição particulada compreendendo di-hidrato de α,α-trealose cristalino, caracterizada pelo fato de que (1) compreende α,α-trealose em uma quantidade de 98,o % em peso ou mais, mas não mais do que 99,7 % em peso, em uma base sólida seca, (2) possui um grau de cristalinidade para o di-hidrato de α,α-trealose cristalino de 9o,o % ou superior, mas não mais elevado do que 96,8 %, quando calculado com base no seu perfil de difração de raio x em pó; e (3) compreende pelo menos um segundo componente sendo D-glicose.

5. Composição particulada compreendendo di-hidrato de α,α-trealose cristalino de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que (4) contém partículas com um tamanho de partícula de pelo menos 53 μm, porém menor do que 425 μm em uma quantidade de 80% em peso ou mais para toda a composição particulada, e aquelas com um tamanho de partícula de pelo menos 53 μm, porém menor do que 300 μm em uma quantidade de 60% em peso ou maior para toda a composição particulada.

6. Composição particulada compreendendo di-hidrato de α,α-trealose cristalino de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que (5) possui um poder de redução da composição particulada toda de não mais que 0,5 % em peso.

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