TW201831692A - 含有α，α-海藻糖二水合結晶之粉末的製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明之課題為提供一種製造方法，其能夠以澱粉為原料，以一貫之步驟，對澱粉產率良好地製造含有海藻糖二水合結晶之粉末。 其解決手段為，藉由提供一種以無水物換算含有α,α-海藻糖98.0質量%以上之含有α,α-海藻糖二水合結晶之粉末的製造方法，來解決上述課題，該製造方法係含有：使澱粉去支酵素及環狀麥芽糊精葡萄糖苷基轉移酶(cyclomaltodextrin glucanotransferase)，與來自節桿菌屬微生物之α-醣苷基海藻糖生成酵素與來自節桿菌屬微生物之海藻糖游離酵素一起作用於液化澱粉，接著，使葡萄糖澱粉酶作用而得到含有α,α-海藻糖之糖液之步驟；由前述糖液中使α,α-海藻糖二水合結晶晶析之步驟；及藉由離心分離採取經晶析之α,α-海藻糖二水合結晶，將其熟成、乾燥之步驟的含有α,α-海藻糖二水合結晶之粉末的製造方法，其特徵為，藉由使用來自類芽孢桿菌屬微生物之天然型或重組型酵素或該等之突變體酵素作為前述環狀麥芽糊精葡萄糖苷基轉移酶，不經過管柱層析之區分步驟，而使前述糖液中之α,α-海藻糖含量以無水物換算超過86.0質量%。

Description

含有α,α-海藻糖二水合結晶之粉末的製造方法

本發明係關於含有α,α-海藻糖二水合結晶之粉末的製造方法，詳細而言，係關於將高純度之含有α,α-海藻糖二水合結晶之粉末，以一貫的步驟由澱粉產率良好地工業化製造之含有α,α-海藻糖二水合結晶之粉末的製造方法、與藉由該製造方法而得之含有α,α-海藻糖二水合結晶之粉末。

含有α,α-海藻糖(以下、本說明書中略稱為「海藻糖」)之二水合結晶的粉末之製造方法，已知自以往有各種方法。例如，專利文獻1中揭示有使β-澱粉酶或β-澱粉酶與澱粉去支酵素一起作用於液化澱粉，接著，使麥芽糖．海藻糖轉換酵素作用而得到含有海藻糖之糖液，將其適當純化後，使海藻糖晶析而製造含有海藻糖二水合結晶之粉末的方法，專利文獻2中，揭示了使澱粉去支酵素與α-醣苷基海藻糖生成酵素(別名「非還原性糖質生成酵 素」)及海藻糖游離酵素一起作用於液化澱粉，進一步使葡萄糖澱粉酶作用，得到含有海藻糖之糖液，將其適當純化後，使海藻糖晶析而製造含有海藻糖二水合結晶之粉末的方法。

又，專利文獻3、4中，揭示了於專利文獻2揭示之前述製造方法中，合併使用澱粉去支酵素與環狀糊精葡萄糖苷基轉移酶(以下略稱為「CGTase」)，使α-醣苷基海藻糖生成酵素及海藻糖游離酵素與該等一起作用，藉以使前述含有海藻糖之糖液中之海藻糖含量提高之含有海藻糖二水合結晶之粉末的製造方法。進一步地，專利文獻5、6中，揭示了使來自屬於硫化葉菌(Sulfolobus)屬之微生物的耐熱性α-醣苷基海藻糖生成酵素、或耐熱性之α-醣苷基海藻糖生成酵素與耐熱性海藻糖游離酵素與液化澱粉作用，得到含有海藻糖之糖液，將其適當純化後，使海藻糖晶析而製造含有海藻糖二水合結晶之粉末的方法。

該等公知之製造方法中，專利文獻3、4揭示之前述各酵素之組合的情況時，以液化澱粉為原料，不經管柱層析之區分步驟，僅以酵素反應即可輕易調製海藻糖含量以無水物換算超過80質量%之含有海藻糖之糖液，而且經如此調製之含有海藻糖之糖液的組成，於海藻糖以外幾乎均為葡萄糖，因此具有海藻糖之晶析性良好的優點。因此，專利文獻3、4揭示之前述製造方法的情況時，由前述含有海藻糖之糖液中使海藻糖二水合結晶晶析，藉由以離心分離採取結晶之分蜜方式，可產率良好地製造比較高 純度之含有海藻糖二水合結晶之粉末。

特別是專利文獻3、4揭示之前述製造方法中，使用來自節桿菌(Arthrobacter)屬之微生物的酵素作為α-醣苷基海藻糖生成酵素及海藻糖游離酵素的情況時，屬於節桿菌屬之微生物發育較快，且前述酵素之生產性亦高，因此在以工業規模製造含有海藻糖二水合結晶之粉末上極為有利。因此，本申請人，現在使用來自節桿菌屬之微生物的酵素作為α-醣苷基海藻糖生成酵素及海藻糖游離酵素，藉由專利文獻3、4所揭示之前述製造方法，製造高純度含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『TREHA』、林原股份有限公司販賣、製品規格上之海藻糖純度：98.0質量%以上。以下稱為「食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末」)，主要作為食品材料、化粧品材料等來販賣。但是，本製造方法的情況時，藉由酵素反應而得之含有海藻糖之糖液中之海藻糖含量，目前即使使各種酵素反應之條件最佳化，亦僅止於以無水物換算約85質量%左右，對澱粉產率事實上未達40質量%。

另一方面，非專利文獻1、2中，揭示了組合將來自硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)之耐熱性α-醣苷基海藻糖生成酵素、耐熱性海藻糖游離酵素及耐熱性異澱粉酶之各基因分別在大腸菌表現藉以調製之重組酵素、及於該等進一步導入部位特異性突變而製造之突變體酵素，而作用於可溶性澱粉時，可得到海藻糖含量以無水物換算為87質量%左右之含有海藻糖之糖液。

但是，非專利文獻1、2中作為原料使用之可溶性澱粉，其係藉由將澱粉酸處理，將澱粉粒內之非晶質部分去除，藉以製造之非常特殊且高價格的原料，即使得到海藻糖含量增高之酵素反應液，要將可溶性澱粉作為含有海藻糖二水合結晶之粉末之工業生產用的原料來使用，成本上來說仍不可能。又，使非專利文獻1、2所揭示之重組酵素或突變體酵素不作用於可溶性澱粉，而作用於工業規模製造中使用的液化澱粉時，藉由酵素反應而得之含有海藻糖之糖液中之海藻糖含量，當然比87質量%左右更低。僅止於85質量%左右，無法期望將含有海藻糖二水合結晶之粉末之對澱粉產率提高至現行之製造方法以上。

附言之，只要將含有海藻糖之糖液中之海藻糖含量提高到86.0質量%以上，即可考慮於含有海藻糖之糖液應用使用管柱層析之管柱區分，來採取高度含有海藻糖之部分。但是，進行管柱區分時，隨著步驟增加，製造成本會增加，必然會發生在作為高度含有海藻糖部分而採取的部分以外之部分中所含的海藻糖之損失，因此就算藉由管柱區分而得到以無水物換算之海藻糖含量為超過86.0質量%之含有海藻糖之糖液，而採取由如此的糖液中晶析之海藻糖二水合結晶，製造含有海藻糖二水合結晶之粉末，亦無法避免對澱粉產率之大幅降低。

又，若僅單純提高對澱粉產率，亦可考慮採用將含有經晶析之結晶的糖膏(massecuite)取出至容器並使其全量結晶．固化而將之粉碎、或將糖膏噴霧乾燥而得到粉末之 所謂全糖方式，來取代將經晶析之結晶以離心分離採取之分蜜方式。但是，全糖方式的情況時，糖膏中所含之如葡萄糖的製法特有之雜質亦會與與經晶析之海藻糖一起粉末化，因此所得之含有海藻糖二水合結晶之粉末中之海藻糖含量，無法提高至糖膏中之海藻糖含量以上，會有無法得到高純度之含有海藻糖二水合結晶之粉末之不良狀況。

澱粉於現在雖為存在較為豐富，可輕易以便宜價格獲得的原料，但絕非無窮盡存在的物質，一年間地球上人類所生產的澱粉總量有所限制。另一方面，澱粉之用途廣泛，除了以往之工業用途、食材用、飼料用、或食品原料之用途，近年來由於環保的能源需求增加，亦新作為生質乙醇等燃料原料而使用。如此狀況下，提高製品亦即含有海藻糖二水合結晶之粉末之對澱粉產率，由有效利用有限的資源之觀點來看極為重要。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開平7-170977號公報

[專利文獻2]日本特開平7-213283號公報

[專利文獻3]日本特開平8-73504號公報

[專利文獻4]日本特開2000-228980號公報

[專利文獻5]日本特開平8-66188號公報

[專利文獻6]日本特開平8-66187號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1 Fang等人、Journal of Agricultural and Food Chemistry、2007年、第55卷、5588至5594頁

[非專利文獻2Fang等人、Journal of Agricultural and Food Chemistry、2008年、第56卷、5628至5633頁

本發明係以消除上述習知含有海藻糖二水合結晶之粉末的製造方法中的不良狀況，在保持海藻糖之純度同時，更提高含有海藻糖二水合結晶之粉末之對澱粉產率為目的而為者，其課題在於提供能夠將高純度之含有海藻糖二水合結晶之粉末，以澱粉為原料而以一貫之步驟產率良好地以工業規模製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造方法；與藉由該製造方法製造之新穎的含有海藻糖二水合結晶之粉末。

為了解決上述課題，本發明者等人，對於專利文獻3、4所揭示之前述製造方法中所用之複數個酵素的組合，進行重複各種探討與試行錯誤之結果，發現了使用來自微生物之培養容易且酵素生產性亦高的節桿菌屬之微生物的酵素，作為α-醣苷基海藻糖生成酵素及海藻糖游離酵素，且就與該等之酵素一起使用的CGTase而言，使用來自類芽孢桿菌(Paenibacillus)屬微生物之天然型或重組型CGTase或該等之突變體酵素以取代至今為止使用之來 自嗜熱桿菌(Geobacillus stearothermophilus)Tc-91株(FERM BP-11273)之CGTase，藉此，使海藻糖生成反應效率更為良好地進行，使葡萄糖澱粉酶處理步驟後之含有海藻糖之糖液中之海藻糖含量，不經過管柱層析之區分步驟即可提高至以無水物換算超過86.0質量%之等級、較佳為提高至87.0質量%以上。此外，發現了將如此方式所得之含有海藻糖之糖液，遵照一般方法脫色、去鹽、濃縮，使海藻糖二水合結晶晶析，藉由將所得之結晶離心分離而採取，將其熟成、乾燥，能夠以較以往更高之對澱粉產率製造以無水物換算含有98.0質量%以上之海藻糖的高純度之含有海藻糖二水合結晶之粉末，而完成了本發明。

亦即，本發明為包含：使澱粉去支酵素及CGTase與來自節桿菌屬微生物之α-醣苷基海藻糖生成酵素與來自節桿菌屬微生物之海藻糖游離酵素一起作用於液化澱粉，接著，使葡萄糖澱粉酶作用而得到含有海藻糖之糖液之步驟；使海藻糖二水合結晶由前述糖液晶析之步驟；及將經晶析之海藻糖二水合結晶藉由離心分離而採取，將其熟成、乾燥之步驟的含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造方法，其提供以藉由使用來自類芽孢桿菌屬微生物之天然型或重組型酵素或該等之突變體酵素作為前述CGTase，不經管柱層析之區分步驟而使前述糖液中之海藻糖含量以無水物換算超過86.0質量%為特徵之製造以無水物換算含有98.0質量%以上之海藻糖的海藻糖二水合結晶之製造方法，藉此解決上述課題。

藉由上述本發明之製造方法製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，依照本發明者等人確認後，無論是海藻糖純度，或就流動性良好之觀點，相較於習知食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末亦為毫不遜色之粉末，該粉末能夠與習知之食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末同樣地作為食品材料、化粧品材料等使用於廣泛之領域。

再者，作為CGTase之供給源之屬於前述類芽孢桿菌屬之微生物，可列舉例如類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis、類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli、或類芽孢桿菌Paenibacillus amylolyticus，其中，類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis或類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli，就海藻糖生成反應中，產生提高反應液中之海藻糖含量的效果大之CGTase的觀點而言較佳、特佳為類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis。

又，作為上述CGTase者，特別適合使用具有如下述(a)至(d)所示部分胺基酸序列者：(a)Gly-Ser-X₁-Ala-Ser-Asp；(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn；(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys；(d)Val-Asn-Ser-Asn-X₂-Tyr。(惟，X₁意指Ala或Ser，X₂意指Ala或Thr)。

又，若舉例更適合作為本發明所用之CGTase者，可列舉以具有序列表中之序列編號1、2、3、12或13之任一者所示之胺基酸序列的CGTase。

本發明者等人，進一步重複試行錯誤之結果，發現了若於由含有以無水物換算為超過86.0質量%、較佳為87.0質量%以上之海藻糖的前述含有海藻糖之糖液中使海藻糖二水合結晶晶析時，應用後述之控制冷卻法或擬控制冷卻法，則相較於藉由將含有海藻糖之糖液之降低溫度放任自然之自然冷卻法使海藻糖二水合結晶晶析的情況，可更提高所得之含有海藻糖二水合結晶之粉末之對澱粉產率。亦即，本發明藉由提供於前述本發明之製造方法中，藉由控制冷卻法或擬控制冷卻法來進行前述使海藻糖二水合結晶晶析之步驟的含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造方法，亦可解決上述課題。

再者，應用控制冷卻法或擬控制冷卻法時，對澱粉產率提高的理由雖未有定論，但推測為若依照控制冷卻法或擬控制冷卻法，於晶析之初期，會抑制冷卻所致之過飽和度的急遽上昇與二次結晶核之形成，會生成多數大小大致均勻之微小的結晶核，藉由在微小之結晶核多數析出之晶析的後期急速地冷卻，會成為使大小均勻之多數的結晶核一齊成長，因此可得到含有微結晶少之粒徑均勻的結晶之糖膏，離心分離之結晶的採取變得容易，能夠洗淨經比較少量之水採取之結晶，故洗淨時之海藻糖損失變少。

此外，本發明者等人意外發現，藉由如上述方式於海藻糖二水合結晶之晶析時應用控制冷卻法或擬控制冷卻法以製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，相較於藉由自然冷卻法而製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末或習知之食 品級的含有海藻糖二水合結晶之粉末，於難以固結的方面係為優良。此外，如此之優良物性，確認係由含有海藻糖二水合結晶之粉末中之海藻糖純度與海藻糖二水合結晶之結晶化度的不同所致，而完成了關於含有海藻糖二水合結晶之粉末本身的本發明。

亦即，本發明係於使海藻糖二水合結晶晶析時藉由應用前述控制冷卻法或擬控制冷卻法之本發明之製造方法而得到之含有海藻糖二水合結晶之粉末，藉由提供以無水物換算含有海藻糖99.0質量%以上、99.6質量%以下，且基於粉末X射線繞射輪廓而算出之海藻糖二水合結晶之結晶化度為90.0%以上、96.0%以下之含有海藻糖二水合結晶之粉末，而解決上述課題。

附言之，以無水物換算含有海藻糖99.0質量%以上、99.6質量%以下，且基於粉末X射線繞射輪廓而算出之海藻糖二水合結晶之結晶化度為90.0%以上、96.0%以下之含有海藻糖二水合結晶之粉末，依照本發明者等人確認後，海藻糖含量係與習知之食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末同樣程度或為稍高的程度，但海藻糖二水合結晶之結晶化度相較於食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末係顯著地高，係與習知之食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末區別的新穎粉末。

再者，藉由應用控制冷卻法或擬控制冷卻法，可得到難以固結之含有海藻糖二水合結晶之粉末的理由雖未有定論，但推測係因依照控制冷卻法或擬控制冷卻法，如上所 述，可得到含有微結晶少之粒徑均勻的結晶的糖膏，因此所得之粉末中海藻糖之純度與海藻糖二水合結晶之結晶化度有提高之作用。此由藉由應用控制冷卻法或擬控制冷卻法而得到之本發明之含有海藻糖二水合結晶之粉末中海藻糖二水合結晶之結晶化度相較於自然冷卻所得之粉末、或習知之食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末中海藻糖二水合結晶之結晶化度係顯著為高的事實亦得到支持。

依照本發明之製造方法，使用培養容易且酵素之生產性亦高的來自節桿菌屬之微生物的α-醣苷基海藻糖生成酵素與海藻糖游離酵素，以澱粉為原料，能夠以一貫的步驟，對澱粉產率良好地以工業規模製造高純度之含有海藻糖二水合結晶之粉末。因此，會帶來對原料之澱粉資源的有效利用帶來貢獻之優良的優點。特別是由含有海藻糖之糖液中使海藻糖二水合結晶晶析時，應用控制冷卻法或擬控制冷卻法的情況時，係有可更提高所製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末之對澱粉產率的優點。又，以應用控制冷卻法或擬控制冷卻法之本發明之製造方法所製造的含有海藻糖二水合結晶之粉末，相較於習知之食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末，海藻糖純度及海藻糖二水合結晶之結晶化度高、於難以固結的觀點係為優良的粉末。

圖1中

a‧‧‧用於算出微晶直徑之繞射角(2 θ)13.7°(米勒指數(hkl)：101)之繞射峰

b‧‧‧用於算出微晶直徑之繞射角(2 θ)17.5°(米勒指數：220)之繞射峰

c‧‧‧用於算出微晶直徑之繞射角(2 θ)21.1°(米勒指數：221)之繞射峰

d‧‧‧用於算出微晶直徑之繞射角(2 θ)23.9°(米勒指數：231)之繞射峰

e‧‧‧用於算出微晶直徑之繞射角(2 θ)25.9°(米勒指數：150)之繞射峰

圖5中

a‧‧‧控制冷卻曲線

b‧‧‧直線冷卻

c‧‧‧自然冷卻曲線

圖6中

pUC ori‧‧‧來自質體pUC之複製起始點

T7‧‧‧T7啟動子

白箭頭(Amp)‧‧‧安比西林耐性基因

黑箭頭‧‧‧CGTase基因

[圖1]實質由海藻糖二水合結晶所構成之含有海藻糖二水合結晶之粉末的特性X射線之粉末X射線繞射圖型的一例。

[圖2]實質由不定形部分所構成之海藻糖粉末之特性X射線之粉末X射線繞射圖型的一例。

[圖3]實質由海藻糖二水合結晶所構成之含有海藻糖二水合結晶之粉末的同步輻射光之粉末X射線繞射圖型的一例。

[圖4]實質由不定形部分所構成之海藻糖粉末之同步輻射光之粉末X射線繞射圖型的一例。

[圖5]顯示各種冷卻圖型之圖。

[圖6]顯示含有來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株之CGTase基因的重組DNA「pRSET-iPI」之構成及同重組DNA之限制酵素認識部位的圖。

1.用語之定義

本說明書中，以下之用語具有以下意義。

<對澱粉產率>

本說明書中所稱之「對澱粉產率」，係原料澱粉以無水物換算之每單位質量所得之含有海藻糖二水合結晶之粉末以無水物換算之質量比例以百分率(%)表示者。再者， 本說明書中，因為係以澱粉為原料，使酵素與其作用而生成海藻糖，將生成之海藻糖以晶析、採取、熟成、乾燥之一連串之一貫的步驟，製造含有海藻糖二水合結晶之粉末為前提，故本說明書中所稱之「對澱粉產率」，意指由使酵素與澱粉作用而得之含有海藻糖之糖液中最初晶析之所謂一次結晶中製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末的對澱粉產率，並非含有由使採取經晶析之結晶後所剩的糖液、或使由糖膏分離之蜜等回到糖液之狀態而再度晶析之所謂二次結晶以後所製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末者。附言之，添加種晶使其晶析時，算出對澱粉產率之種晶的量，係包含於通過本說明書而得之含有海藻糖二水合結晶之粉末的量。

<CGTase活性>

本說明書中，「CGTase活性」係如以下般定義。亦即，對於含有0.3%(w/v)可溶性澱粉、20mM乙酸緩衝液(pH5.5)、1mM氯化鈣之基質水溶液5ml，添加經適當稀釋之酵素液0.2ml，一邊將基質溶液保持於40℃，同時於反應第0分鐘及反應第10分鐘對基質溶液各取樣0.5ml，立即添加於0.02N硫酸溶液15ml中使反應停止後，於各硫酸溶液中各添加0.1N碘溶液0.2ml來呈色，10分鐘後，藉由吸光光度計分別測定波長660nm之吸光度，藉由下述式[1]作為澱粉分解活性而算出。CGTase活性1單位，係定義為在此測定條件下，使溶液中之澱粉15mg的 碘呈色完全消失之酵素量。

<控制冷卻法>

本說明書中所稱之「控制冷卻法」意指藉由「經控制之冷卻」使結晶晶析的方法，且指以作為晶析步驟而設定的作業時間為「τ」、晶析開始時之液溫為「T₀」、晶析結束時之作為目標之液溫為「T_f」、時間「t」時的液溫為「T」時，時間t時之液溫T原則上以下述式[7]表示之冷卻方法。

式[2]：[數2]T=T₀-(T₀-T_f)(t/τ)³

使用以作為晶析步驟而設定之作業時間為橫軸、以晶析時之液溫為縱軸之圖來更具體地(示意地)表示將控制冷卻法時，係如圖5之符號a所示。如圖5之符號a所示，依照控制冷卻法，於液溫高之晶析初期，液溫係緩慢地降低，於液溫降低某個程度之晶析後期，液溫會急速降低， 於t=τ/2之時點，換言之在晶析步驟之中間點的液溫「T_m」，至少係維持T_m>[(T₀-T_f)/2+T_f]之關係(換言之，晶析步驟之中間點的溫度變化係成為低於總溫度變化之50%)。相對於此液溫之時間之變化圖型中，控制冷卻法，與液溫由T₀至T_f為止，花費時間τ直線地降降低之直線冷卻(圖5中之符號b)、或於液溫高之晶析初期液溫呈指數函數地急速降低，愈成為液溫降低之晶析後期，液溫愈緩慢降低之通常的自然冷卻法(圖5中之符號c)係有明確地區別。再者，例如使用市售之通用晶析系統用程式恆溫循環裝置等，來使液溫T作為以上述式[2]表示之時間t的函數來變化即可。

晶析步驟中應用此控制冷卻法的情況時，於添加海藻糖之種晶後，在晶析初期，液溫之冷卻係緩慢地進行，因此，會抑制冷卻所致之急驟的過飽和度上昇與二次結晶核之形成，可使以添加之種晶作為結晶核之結晶優先地成長。另一方面，在以添加之種晶作為結晶核之結晶析出之晶析後期，藉由使液溫急速地冷卻，會使析出之結晶一齊成長，因此，依照控制冷卻法，可得到含有微結晶少之粒徑均勻的結晶之糖膏之優點。再者，關於「控制冷卻法」，例如詳述於「久保田德昭著『容易了解的批式晶析』、分離技術會、平成22(2010)年4月30日發行、32~47頁」。

<擬控制冷卻法>

本說明書中所稱之「擬控制冷卻法」，如字面所述係意指擬似於上述控制冷卻法之冷卻法，其係並非使液溫T對時間t嚴密地遵照上述式[2]而變化者，雖亦隨著晶析所用之含有海藻糖溶液中之海藻糖純度、濃度、過飽和度、種晶之量等而變化，由希望於作業時間t=τ/2之時點(晶析步驟之中間點)中結晶核大致析出，而使t=τ/2之時點中之液溫T的變化量(T₀-T_m)，以維持於總溫度變化量(T₀-T_f)之5%以上、未達50%；較佳為10%以上、未達30%之範圍的方式，使液溫T對時間t連續地或階段地降低的冷卻法。以t=τ/2之時點中液溫T之變化量(T₀-T_m)，成為總溫度變化量(T₀-T_f)之5%以上、未達50%的方式使液溫T對時間t連續地或階段地降低的情況時，於液溫高之晶析初期使液溫T對時間t緩慢地降低，於液溫降低某個程度之晶析後期，液溫T對時間t急速地降低，結果，雖有時不及上述控制冷卻法，但可得到可得含有微結晶少之粒徑均勻的結晶之糖膏的與控制冷卻法大致同樣的優點。

具體而言，例如將作業時間τ至少分為2個、較佳為3個以上之區間，於晶析步驟之初期區間中，將冷卻中之溫度坡度變和緩(使冷卻速度變慢)，隨著初期或中期朝向後期，將溫度坡度變大(使冷卻速度變快)，使t=τ/2之時點之液溫T的變化量(T₀-T_m)成為總溫度變化量(T₀-T_f)之5%以上、未達50%；較佳為10%以上、未達30%的方式使液溫T對時間t連續地或階段地降低即可。t=τ/2之時點的液溫T之變化量(T₀-T_m)為總溫度變化量(T₀-T_f)之50% 以上的情況時，於晶析初期之冷卻速度過快，會有因冷卻而過飽和度急遽上昇使得二次結晶核形成之虞，未達5%時，晶析初期之冷卻速度過慢，以添加之種晶為結晶核之結晶尚未充分析出，即迎接開始急速冷卻之晶析後期，不管何種情況，均難以得到含有微結晶少之粒徑均勻之結晶的糖膏。

為了進行上述控制冷卻法，必須將液溫T作為以式[2]表示之時間t的函數來變化，能夠以設定之程式控制液溫之裝置或晶析罐係為必須，但依照擬控制冷卻法，係只要以t=τ/2之時點中之液溫T的變化量(T₀-T_m)成為總溫度變化量(T₀-T_f)之5%以上、未達50%，較佳為10%以上、未達30%的方式使液溫T相對於時間t連續地或階段地降低即可，因此擬控制冷卻法中，即使並無精密地控制液溫的設備的情況，亦具有能夠比較容易地實行的優點。

<結晶化度>

本說明書中所稱之「海藻糖二水合結晶之結晶化度」，意指藉由下述式[3]定義之數值。

式[3]：[數3]

H100：由實質由海藻糖二水合結晶所構成之含有海藻糖二水合結晶之粉末標 準試樣的粉末X射線繞射輪廓所求得之結晶化度之解析值

H0：由實質由不定形部分所構成之含有海藻糖之粉末標準試樣的粉末X射線繞射輪廓所求得之結晶化度之解析值

Hs：由被驗試樣之含有海藻糖之粉末的粉末X射線繞射輪廓所求得之結晶化度之解析值

式[3]中，求得解析值H₁₀₀、H₀、Hs之基礎的粉末X射線繞射輪廓，通常可藉由具備反射式或透過式之光學系統的粉末X射線繞射裝置來測定。粉末X射線繞射輪廓係包含被驗試樣或標準試樣中所含之海藻糖二水合結晶之繞射角及繞射強度，作為由如此之粉末X射線繞射輪廓中決定結晶化度之解析值的方法，可列舉例如荷曼斯法(Harmans’method)、馮克法(Vonk’s method)等。該等解析方法中，就簡便度與精度觀點，使用荷曼斯法較適合。今日，該等解析方法均已電腦軟體化，故使用具備搭載如此電腦軟體之任一者的解析裝置之粉末X射線繞射裝置即為合適。

又，求得解析值H₁₀₀之「實質由海藻糖二水合結晶所構成之含有海藻糖二水合結晶之粉末標準試樣」，係海藻糖之純度為99.9質量%以上(以下，若無特別指明，本說明書中將質量%略記為「%」。惟，本說明書中所稱之結晶化度所記載之%不在此限。)之粉末或單結晶，於粉末X射線繞射圖型中，係使用顯示海藻糖二水合結晶特有的繞射峰，且實質由海藻糖二水合結晶所構成者。如此之粉末 或單結晶，可列舉本申請人作為分析用試藥所販賣的含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『海藻糖999』、編碼編號：TH224、海藻糖純度99.9%以上、林原股份有限公司販賣)、或使其再結晶化而得之含有海藻糖二水合結晶之粉末或海藻糖二水合結晶之單結晶。附言之，將實質由海藻糖二水合結晶所構成之上述含有海藻糖二水合結晶之粉末標準試樣之粉末X射線繞射輪廓，以荷曼斯法之電腦軟體解析時的解析值H₁₀₀，通常為50.6至50.9%左右。

另一方面，求得解析值H₀之「實質由不定形部分所構成之含有海藻糖之粉末標準試樣」，係使用海藻糖之純度為99.9%以上、且實質由不定形部分所構成者。如此之粉末，可列舉例如將上述求得解析值H₁₀₀之標準試樣溶解於適量之精製水，濃縮後、冷凍乾燥，進一步地，藉由真空乾燥至以卡爾-費雪法(Karl-Fischer method)決定之水分含量成為2.0%以下而得到之粉末。施以如此處理時，經驗上已知可得到實質由不定形部分所構成之粉末。惟，一般而言，即使實質由不定形部分所構成之粉末，以粉末X射線繞射裝置，將所得之粉末X射線繞射輪廓以荷曼斯法、馮克法等解析時，實行該等各解析法之電腦軟體之演算法所造成之來自不定形部分之散射光之一部分係被演算，解析值並不一定會成為0%。附言之，將實質由不定形部分所構成之上述含有海藻糖之粉末標準試樣之粉末X射線繞射輪廓，以荷曼斯法之電腦軟體解析時的解析值H₀通常為8.5至8.7%左右。

<平均微晶直徑>

一般而言，可認為含有結晶之粉末中之1個粉末粒子，係由複數個單結晶、亦即、複數個微晶所構成。含有結晶之粉末中之微晶的大小(微晶直徑)，可認為係反映了含有結晶之粉末的特性。本說明書中所稱之「海藻糖二水合結晶之平均微晶直徑」(以下，僅稱為「平均微晶直徑」)，意指將含有海藻糖二水合結晶之粉末供粉末X射線繞射分析，所得之粉末X射線繞射圖型中，檢測出之繞射峰當中，選擇5個繞射峰，亦即於對微晶之不均應變所造成之繞射峰寬度的影響少之比較低角度的區域，選擇與其他繞射峰良好分離之繞射角(2 θ)13.7°(米勒指數(hkl)：101)、17.5°(米勒指數：220)、21.1°(米勒指數：221)、23.9°(米勒指數：231)及25.9°(米勒指數：150)之繞射峰(參照圖1之符號a至e)，使用各自的半值寬與繞射角，基於使用矽(美國國立標準技術研究所(NIST)、X射線繞射用標準試樣(『Si640d』)作為標準品時的測定值進行修正後，藉由下述式[4]所示「謝樂(Scherrer)公式」分別算出之微晶直徑的平均值。

式[4]：[數4]

D：微晶之大小(Å)

λ：X射線之波長(Å)

β：繞射線寬(rad)

θ：繞射角(°)

K：常數(β使用半值寬(半價寬)時為0.9)

一般之粉末X射線繞射裝置中，係搭載有如此之微晶直徑算出用電腦軟體，因而只要可獲得含有海藻糖二水合結晶之粉末，該含有結晶之粉末中海藻糖二水合結晶之平均微晶直徑即可比較容易地測定。再者，被驗試樣係在粉末X射線繞射分析之前，將被驗試樣以研缽搗碎後，過53μm之篩，而使用通過篩之粉末。

<還原力>

本說明書中所稱之「粉末整體之還原力」，係可使用D-葡萄糖作為標準物質，藉由此領域通用之Somogyi-Nelson法及蔥酮硫酸法分別求得以D-葡萄糖換算之還原糖量及全糖量，且可使用下述式[5]計算以求得還原糖量相對於粉末中所含之全糖量之百分率(%)。

<粒度分布>

本說明書中，粉末之粒度分布係如以下方式決定。亦即，將根據日本工業規格(JIS Z 8801-1)，篩孔孔目為425、300、212、150、106、75及53μm之金屬製網篩(飯田製作所股份有限公司製)正確秤量後，以此順序疊合，裝置於ro-tap振盪篩(田中化學機械製造所股份有限公司製、商品名『R-1』)，接著，將經秤取之一定量的試樣裝載於最上段之篩(篩孔孔目425μm)上，於將篩疊合之狀態下振盪15分鐘後，將各篩再度正確地秤量，由其質量減去載置試樣之前的質量，藉以求得以各篩收集之粉末的質量。之後，計算以各篩收集之具有各粒度之粉末質量相對於篩上所載置之試樣質量的百分率(%)，作為粒度分布而表示。

2.本發明之含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造方法

本發明之製造方法，基本上包含以下之(1)至(6)之步驟：(1)使來自節桿菌屬之微生物的α-醣苷基海藻糖生成酵素與來自節桿菌屬微生物之海藻糖游離酵素，與澱粉去支酵素、及來自類芽孢桿菌屬微生物之天然型或重組型CGTase或該等之突變體酵素一起作用於液化澱粉溶液，以生成海藻糖之海藻糖生成步驟；(2)使葡萄糖澱粉酶與含有藉由海藻糖生成步驟而得到之海藻糖的反應液作用之葡萄糖澱粉酶處理步驟； (3)將含有海藻糖之反應液過濾、脫色、去鹽、濃縮之精製濃縮步驟；(4)使含有海藻糖之濃縮液中含有海藻糖二水合結晶之種晶，使海藻糖二水合結晶晶析之步驟；(5)藉由自晶析步驟中得到之糖膏離心分離，採取海藻糖二水合結晶之步驟；(6)將採取之海藻糖二水合結晶熟成、乾燥，依照需要粉碎的步驟。

以下，依次說明上述(1)至(6)之步驟。

<(1)之步驟(海藻糖生成步驟)>

該步驟係使來自節桿菌屬微生物之α-醣苷基海藻糖生成酵素、與同樣來自節桿菌屬微生物之海藻糖游離酵素，與澱粉去支酵素、及來自類芽孢桿菌屬微生物之天然型或重組型CGTase或該等之突變體酵素一起作用於原料之液化澱粉，以生成海藻糖之步驟。

α-醣苷基海藻糖生成酵素，係作用於液化澱粉而生成於分子末端具有海藻糖構造之α-醣苷基海藻糖的酵素，另一方面，海藻糖游離酵素係作用於α-醣苷基海藻糖而使海藻糖游離之酵素。因此，若一邊合併使用澱粉去支酵素，同時使α-醣苷基海藻糖生成酵素與海藻糖游離酵素作用於將澱粉糊化．液化而得之液化澱粉，即可效率良好地製造海藻糖。

海藻糖之製造所用之原料澱粉，可為玉米澱粉、米澱 粉、小麥澱粉等之地上澱粉、亦可為馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、樹薯澱粉等之地下澱粉，又，亦可為將該等澱粉以酸或澱粉酶部分分解而得之澱粉部分分解物。原料澱粉通常係懸濁於水而成為濃度約10至50%之澱粉乳，在耐熱性α-澱粉酶之存在下加熱藉以糊化．液化。液化澱粉之液化程度，以葡萄糖當量(DE)計，通常調整為未達10、更詳細為調整為未達5。

作為來自節桿菌屬微生物之α-醣苷基海藻糖生成酵素及來自節桿菌屬微生物之海藻糖游離酵素。例如可利用日本特開平7-143876號公報、專利文獻2至4等所揭示者。又，亦可為本申請人在日本特開平7-322880號公報、日本特開平7-322883號公報、日本特開平7-298887號公報、日本特開平7-298880號公報、專利文獻4等所揭示之重組型之α-醣苷基海藻糖生成酵素及海藻糖游離酵素，進一部地，亦可為於該等酵素導入部位特異性突變等而改良之突變體酵素。特別適合使用來自專利文獻4所揭示之節桿菌Arthrobacter sp.S34(FERM BP-6450)或其酵素高產生突變株之α-醣苷基海藻糖生成酵素及海藻糖游離酵素。

本發明之製造方法中，可使用本領域所通用之異澱粉酶或支鏈澱粉酶(pullulanase)作為澱粉去支酵素。可使用市售之酵素劑，亦可使用由微生物單離者。異澱粉酶已知例如有來自假單胞菌Pseudomonas amyloderamosa及來自香味菌Myroides odoratus者，特別以來自Pseudomonas amyloderamosa之異澱粉酶劑(林原股份有限公司製)為宜。支鏈澱粉酶劑可列舉例如來自克留氏菌Klebsiella pneumoniae之支鏈澱粉酶(林原股份有限公司販賣)、來自芽孢桿菌Bacillus amylopullulyticus之支鏈澱粉酶(商品名『Promozyme』、Novozymes Japan股份有限公司販賣)等。

上述海藻糖生成步驟中CGTase之角色，主要係將以α-醣苷基海藻糖生成酵素及海藻糖游離酵素之海藻糖生成反應之過程中必然生成之葡萄糖聚合度4以下之麥芽寡糖，藉由以CGTase為觸媒之歧化反應(直鏈糖分子間轉移反應、Disproportionation)，轉換為葡萄糖聚合度5以上之麥芽寡糖，藉以使上述海藻糖生成反應進一步進行，而更提高反應液中之海藻糖含量。

再者，CGTase係以往即由各種微生物中單離，其作用、理化學性質等已然明確(參照『工業用糖質酵素手冊』、講談社Scientific社編集、講談社發行、28至32頁(1999年)等)。又，上述CGTase之內的數個之基因被選殖，由基因鹼基序列決定胺基酸序列，亦已知其CGTase之胺基酸序列上存在有與分類為α-澱粉酶家族之酵素群共通而存在之4個保留區域。進一步地，關於來自嗜高溫菌Geobacillus stearothermophilus之CGTase蛋白，藉由X射線結晶構造解析，其立體構造已然明確，該CGTase之3個觸媒殘基，亦即序列表中以序列編號4所示之胺基酸序列中第225號之天門冬胺酸殘基(D225)、第253號之 麩胺酸殘基(E253)、第324號之天門冬胺酸殘基(D324)亦以判明(參照『工業用糖質酵素手冊』、講談社Scientific社編集、講談社發行、56至63頁(1999年))。

本發明之製造方法中，適合使用來自類芽孢桿菌屬微生物之天然型或重組型CGTase或該等之突變體酵素作為CGTase。本發明所稱之「來自類芽孢桿菌屬微生物之天然型CGTase」，可使用例如來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis、類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli、類芽孢桿菌Paenibacillus amylolyticus等公知菌株之CGTase、或來自由自然界單離之類芽孢桿菌屬微生物之CGTase。更具體而言，可更適合使用分別來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15959株、類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株、類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli NBRC13638株、及類芽孢桿菌Paenibacillus amylolyticus NBRC15957株之CGTase、或對於該等類芽孢桿菌屬微生物，以該領域慣用之例如以紫外線照射、化學物質之突變處理等藉以導入突變以取得之來自酵素高產生突變株之CGTase。進一步地，作為來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase，亦可使用例如來自類芽孢桿菌Paenibacillus sp.之CGTase(商品名『Alkali CD Amylase』、Nagase Chemtex股份有限公司製)。附言之，於食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末的製造中，自以往所用之CGTase，係來自嗜熱桿菌之CGTase。

又，本發明之製造方法中，適合使用具有如下述(a)至(d)所示之部分胺基酸序列之CGTase作為CGTase。

(a)Gly-Ser-X₁-Ala-Ser-Asp；(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn；(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys；(d)Val-Asn-Ser-Asn-X₂-Tyr；(惟，X₁意指Ala或Ser，X₂意指Ala或Thr)。

上述部分胺基酸序列，係來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase所特有之特徵胺基酸序列。

又，本發明所稱之「來自類芽孢桿菌屬微生物之重組型CGTase」，可適合使用選殖上述類芽孢桿菌屬微生物之CGTase基因，於例如大腸菌、枯草菌等適當之宿主微生物中表現以得到之重組型CGTase。再者，分別來自前述類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株、類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli NBRC13638株、或類芽孢桿菌Paenibacillus amylolyticus NBRC15957株之CGTase，申請人獨自由該等微生物選殖CGTase基因，決定基因之鹼基序列後，得知具有序列表中分別以序列編號1、2或3所示之胺基酸序列。亦即，具有以序列表中之序列編號1、2或3所示之胺基酸序列的重組型CGTase，能夠與本發明之製造方法中來自類芽孢桿菌屬微生物之天然型CGTase同樣地使用。

本發明所稱之「來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase之突變體酵素」(以下略稱為「突變體CGTase」)，可適 合使用對編碼來自上述類芽孢桿菌屬微生物之CGTase的基因應用基因工程手法，在不實質變更作為CGTase之基質特異性或酵素活性的範圍內導入胺基酸序列上1個或2個以上之胺基酸殘基的缺失、取代或插入突變之突變體CGTase。可於突變體CGTase之胺基酸序列中缺失、取代或插入之胺基酸殘基的個數，只要係實質上保持作為CGTase之基質特異性或酵素活性，則無特殊限定，但較佳為以約680個胺基酸殘基構成之CGTase胺基酸序列的低於5%、亦即以胺基酸殘基數計至多30個左右；較佳為1個以上、低於20個；更佳為1個以上、低於10個。又，胺基酸序列上之突變導入位置，亦只要係實質上保持作為CGTase之基質特異性或酵素活性，則無特殊限定，但較佳為避免導入突變至存在於CGTase胺基酸序列上之分類為α-澱粉酶家族之酵素群所共通保留的4個區域、或來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase所特有之前述(a)至(d)之部分胺基酸序列。

本發明之製造方法中可適合使用之「來自類芽孢桿菌屬微生物之天然型或重組型CGTase或該等之突變體酵素」的更具體的例子，可列舉具有上述序列表中分別以序列編號1、2或3所示之胺基酸序列的CGTase、或實施例中藉由於後述類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株之CGTase基因導入部位特異性突變而製造之具有序列表中以序列編號12或13所示之胺基酸序列的突變體CGTase。

本發明之製造方法中，較適合為以原料之液化澱粉(pH約4至10)作為基質，以基質固體成分每1克而言，於其中添加來自上述節桿菌屬微生物之α-醣苷基海藻糖生成酵素0.5至10單位、同樣地來自上述節桿菌屬微生物之海藻糖游離酵素2.5至25單位、進一步添加澱粉去支酵素50至1,000單位、及來自上述類芽孢桿菌屬微生物之CGTase0.5至50單位，使用之酵素係在不失活的溫度範圍、通常為於30至60℃反應10至100小時。反應結束時之反應液的海藻糖含量，以無水物換算通常為86%左右。

<(2)之步驟(葡萄糖澱粉酶處理步驟)>

此步驟係進一步使葡萄糖澱粉酶劑與於(1)之海藻糖生成步驟中所得之反應液作用，使以無水物換算之海藻糖含量提高的步驟。亦即，藉由海藻糖生成步驟所得之反應液中，除海藻糖外，尚含有D-葡萄糖、麥芽糖、葡萄糖聚合度3以上之麥芽寡糖、α-葡萄糖基海藻糖、及α-麥芽糖基海藻糖等之糖質，因此藉由使葡萄糖澱粉酶與此反應液作用，可使麥芽糖與葡萄糖聚合度3以上之麥芽寡糖分解為D-葡萄糖，而且使α-葡萄糖基海藻糖或α-麥芽糖基海藻糖等之α-醣苷基海藻糖分解為D-葡萄糖與海藻糖，藉以提高反應液中之海藻糖純度、亦即以無水物換算之海藻糖含量。

本發明之製造方法中，所用之葡萄糖澱粉酶，只要係 能夠使麥芽糖與葡萄糖聚合度3以上之麥芽寡糖分解為D-葡萄糖，且使α-葡萄糖基海藻糖或α-麥芽糖基海藻糖等之α-醣苷基海藻糖分解為D-葡萄糖與海藻糖，則並無特別限制其起源或來源。可適合使用市售之葡萄糖澱粉酶劑、例如天野Enzyme股份有限公司販賣、商品名『Gluczyme AF6』、或Nagase Chemtex股份有限公司販賣、商品名『Glucozyme』等。

再者，葡萄糖澱粉酶處理後之反應液、亦即含有海藻糖之糖液中之海藻糖含量，通常以無水物換算超過86.0%、較佳為87.0%以上。附言之，使用來自嗜熱桿菌之CGTase而非來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase時，葡萄糖澱粉酶處理後之含有海藻糖之糖液中的海藻糖含量，以無水物換算僅止於未達86.0%，不會成為86.0%以上。

<(3)之步驟(精製濃縮步驟)>

此步驟係於結束葡萄糖澱粉酶處理，於以無水物換算之海藻糖含量經提高之含有海藻糖之糖液中，藉由一般方法施以過濾、離心分離等來去除不溶物，以活性碳脫色，以陽離子交換樹脂(H⁺型)、陰離子交換樹脂(OH^-型)去鹽，並且濃縮至適於晶析之濃度的步驟。反應液中之以無水物換算之海藻糖含量，藉由(2)之葡萄糖澱粉酶處理步驟已提高至86.0%以上，因此於(3)之精製濃縮步驟中，不需要管柱層析之區分步驟等的進一步提高海藻糖含量之步驟。

<(4)之步驟(晶析步驟)>

此步驟，係由經過上述(1)至(3)步驟而得之含有海藻糖之糖液中，在海藻糖二水合結晶之種晶存在下，使海藻糖二水合結晶晶析之步驟。亦即，將以無水物換算之海藻糖含量提高至指定之等級的糖液，通常將海藻糖之過飽和度調節至成為1.05至1.50之範圍後，換言之，將海藻糖濃度調節至約60至85%、將液溫調節至約40至80℃後，移至助晶罐，接著，使相對於助晶罐中之濃縮糖液體積，通常含有0.1至5%(w/v)、詳細而言為0.5至2%(w/v)之海藻糖二水合結晶之種晶，一邊緩慢地攪拌，同時花費3至48小時使液溫自然冷卻至5至60℃，藉以促進海藻糖二水合結晶之晶析。再者，助晶罐內等中已存在有海藻糖二水合結晶之種晶的情況時，不需要特別添加海藻糖二水合結晶之種晶。就作業效率的觀點，由濃縮液使海藻糖二水合結晶晶析，通常在種晶之存在下進行。

晶析步驟中，亦可有利地實施使用控制冷卻法或擬控制冷卻法來取代上述之自然冷卻法。藉由控制冷卻法或擬控制冷卻法進行晶析時，係將經過上述(3)之步驟調整為指定溫度之含有海藻糖之糖液移至助晶罐，接著，使海藻糖二水合結晶之種晶相對於助晶罐中之濃縮糖液體積，通常含有0.1至5%(w/v)、詳細而言係含有0.5至2%(w/v)，藉由一邊緩慢地攪拌，同時控制冷卻，使晶析步驟初期，液溫緩慢地降低，於冷卻步驟之後期，使液溫急速降低而 幫助結晶。晶析所需要時間雖亦隨著海藻糖二水合結晶之種晶的添加量不同而相異，但例如擬控制冷卻法的情況時，將全冷卻時間至少分為2個、較佳為3個以上之區間，於各區間內使溫度相對於時間大致呈直線的降低，以作業時間t=τ/2之時點(晶析步驟之中間點)之液溫T的變化量(T₀-T_m)維持在總溫度變化量(T₀-T_f)之5%以上、未達50%，較佳為10%以上、未達30%之範圍的方式，使液溫T相對於時間t連續地或階段地降低即可。例如，花費10小時使液溫由60℃冷卻至20℃使結晶晶析的情況時，較佳為將冷卻時間分為6小時與4小時之2個區間，使液溫由60℃至50℃花費6小時冷卻，接著，由50℃至20℃花費4小時冷卻；或將冷卻時間分為7小時與3小時之2個區間，使液溫由60℃至45℃花費7小時冷卻，接著，由45℃至20℃花費3小時冷卻；更佳為，將冷卻時間分為4小時、3小時、3小時之3個區間，於最初之區間係花費4小時使液溫由60℃冷卻至55℃，於下一個區間係花費3小時由55℃冷卻至50℃，進一步地，於最後之區間係花費3小時將液溫由50℃冷卻至20℃為佳。

如此地，以控制冷卻法或擬控制冷卻法的情況時，相較於不進行溫度控制而自然冷卻之晶析法，海藻糖二水合結晶之微結晶不易產生，可得到含有粒徑均勻之結晶的糖膏，且結果相較於自然冷卻法的情況時，可更提高所得之含有海藻糖二水合結晶之粉末的對澱粉產率。又，如後所述，所得之海藻糖二水合結晶粉末，相較於以自然冷卻法 所得之粉末，具備海藻糖純度、及固結性之重要指標的海藻糖二水合結晶之結晶化度之點亦高的特徵。又，以控制冷卻法或擬控制冷卻法的情況時，相較於藉由自然冷卻之晶析法所得之粉末，係有可得到粒度分布更均勻之粉末的優點。

<(5)之步驟(採取步驟)>

此步驟係由(4)之晶析步驟中所得之糖膏，遵照一般方法之分蜜方式，藉由離心分離來採取海藻糖二水合結晶之步驟。為了除去表面附著之非晶質蜜，而以少量之精製水噴霧(噴水)洗淨所採取之海藻糖二水合結晶。再者，結晶洗淨所用之精製水的量，通常，相對於離心分離前之糖膏重量較佳為3%以上、10%以下。亦即，洗淨所用之精製水量未達3%時，洗淨不會充分進行，會殘留非晶質之蜜，會有無法得到所期望之海藻糖純度之虞。另一方面，洗淨所用之精製水量超過10%時，藉由洗淨而溶解、去除之海藻糖二水合結晶的量會增加，對澱粉產率會有降低之虞。

<(6)之步驟(熟成、乾燥步驟)>

此步驟係將所採取之海藻糖二水合結晶保持於指定之溫度及濕度環境中一定時間，使結晶熟成，同時熱風乾燥，得到含有海藻糖二水合結晶之粉末之步驟。熟成及乾燥步驟中之結晶的物溫或環境之相對濕度、以及保持時 間，只要係能夠得到所期望之粉末，則無特別限制，但較佳為於熟成、乾燥步驟中，結晶其物溫保持在20至55℃、環境之相對濕度保持在60至90%，且熟成、乾燥時間為約5至24小時。經過熟成、乾燥步驟之粉末，接著自然放冷至室溫。又，亦可有利地實施吹拂室溫程度之清潔空氣，強制冷卻至室溫程度之物溫。所得之結晶粉末係直接地，或依需要粉碎而成為製品。

依照本發明之含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造方法，藉由酵素反應可得到以無水物換算超過86.0%之高海藻糖含量之含有海藻糖之糖液，因此不需要管柱層析之區分步驟，不會有區分所致之海藻糖的損失，能夠以高的對澱粉產率得到含有海藻糖二水合結晶之粉末。又，並非將含有經晶析之結晶的糖膏整體晶析、固結或噴霧乾燥之全糖方式，而係採用將經晶析之結晶離心分離，去除含有雜質之蜜的分蜜方式，因此可將所得之含有海藻糖二水合結晶之粉末中的海藻糖含量輕易地提高到98.0%以上，可製造高純度之含有海藻糖二水合結晶之粉末。

如此方式所製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，當晶析藉由自然冷卻進行時，關於保存時之固結性等物性，係與習知之食品級含有海藻糖之粉末為大致同等之粉末，通常係粒徑53μm以上、未達425μm之粒子佔了粉末整體之70%以上，且含有粉末整體之50%以上之粒徑53μm以上、未達300μm之粒子的含有海藻糖二水合結晶之粉末。又，藉由控制冷卻法或擬控制冷卻法進行晶析的情況 時，藉由本發明之製造方法所製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，係相較於習知之食品級含有海藻糖之粉末顯著地更不易固結之粉末，且通常為粒徑53μm以上、未達425μm之粒子佔了粉末整體之80%以上，且含有粉末整體之60%以上之粒徑53μm以上、未達300μm之粒子的含有海藻糖二水合結晶之粉末。又，藉由本發明之製造方法所製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，通常，以前述式[5]求得之粉末整體之還原力為0.5%以下，且係即使摻合於食品或醫藥品等，亦無褐變所致之變色之虞的優良粉末。

因此，藉由本發明之製造方法所製造之粉末，可直接地，或將粒度適當調整，作為粉末狀之食品材料、化粧品材料、準醫藥品材料、或醫藥品材料等來使用。特別是藉由於晶析時應用控制冷卻法之本發明之製造方法所製造的含有海藻糖二水合結晶之粉末，如上所述，係相較於以往之食品級之含有海藻糖之粉末顯著地更不易固結之粉末，可說是以往所未知之完全新穎的含有海藻糖二水合結晶之粉末。該粉末係具備於使用以操作粉末原料為前提而設計之製造設備的食品製造、化粧品製造、準醫藥品製造、進一步於醫藥品製造之各領域中，可安心地含有於其他單獨或複數之粉末狀食品材料、化粧品材料、準醫藥品材料、醫藥品材料之優良的優點。

以下藉由實驗，具體地說明本發明之含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造方法。

<實驗1：CGTase之來源對酵素反應液中之海藻糖含量帶來的影響>

使來自節桿菌屬微生物之α-醣苷基海藻糖生成酵素、與同樣地來自節桿菌屬微生物之海藻糖游離酵素，與澱粉去支酵素及CGTase一起作用於液化澱粉，接著，在藉由使葡萄糖澱粉酶作用之酵素反應而生成海藻糖之酵素反應系統中，為了調查所使用之CGTase的來源對於酵素反應所得之糖液中之海藻糖含量帶來何種影響，進行了以下實驗。

<實驗1-1：調製含有來自節桿菌屬微生物之 α-醣苷基海藻糖生成酵素及海藻糖游離酵素之酵素液>

藉由專利文獻4(日本特開2000-228980號公報)之實施例2-1所記載之方法，培養節桿菌Arthrobacter sp.S34株(FERM BP-6450)，得到培養液約20L。對此培養液20L添加2克之溶菌酶(商品名『卵白Lysozyme』、Nagase Chemtex股份有限公司製)後，於37℃以260rpm之速度攪拌24小時藉以使培養液中之菌體溶菌。將此溶菌處理液離心分離，回收上清液，得到菌體萃取液。將此菌體萃取液藉由一般方法以硫酸銨鹽析，將產生之鹽析物對10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)透析，對透析液進行使用了『Sepabeads FP DA13』凝膠(三菱化學股份有限公司製)之陰離子交換層析，回收酵素部分。回收之部分為含有約15,600單位之海藻糖游離酵素與約3,100單位之α-醣苷 基海藻糖生成酵素的部分精製酵素樣品。再者，α-醣苷基海藻糖生成酵素與海藻糖游離酵素之活性係根據上述專利文獻4(日本特開2000-228980號公報)所揭示之方法來測定。

<實驗1-2：來自各種微生物之CGTase>

作為來自各種微生物之CGTase，係使用以下之CGTase。亦即，作為來自嗜熱桿菌之CGTase，係使用來自嗜熱桿菌Tc-91株(FERM BP-11273)之CGTase(林原股份有限公司製)；作為來自芽孢桿菌Bacillus macerans之CGTase，係使用市售之CGTase(商品名『Contizyme』、天野Enzyme股份有限公司販賣)；作為來自嗜高溫菌Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes之CGTase，係使用市售之CGTase(商品名『Toruzyme』、Novozymes Japan股份有限公司販賣)。

又，作為來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase，係調製以下之CGTase。亦即，將類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15959株、類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株、類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli NBRC13638株、及類芽孢桿菌Paenibacillus amylolyticus NBRC15957株分別以含有糊精2%、氯化銨0.5%、磷酸氫鉀0.05%、硫酸鎂0.025%及碳酸鈣0.5%之液體培養基於27℃、培養3日，將使培養液離心分離而得之各自的離心上清液體遵照一般方法硫酸銨鹽析、透 析，藉以得到來自各微生物之CGTase的粗酵素液。將所得之CGTase粗酵素液，分別進行使用了DEAE-Toyopearl 650S凝膠(Tosoh股份有限公司製)之陰離子交換管柱層析及使用了丁基-Toyopearl 650M凝膠(Tosoh股份有限公司製)之疏水管柱層析以精製，分別調製部分精製CGTase。再者，來自各菌株之CGTase之活性，係遵照前述方法測定，使用式[1]算出。

<實驗1-3：海藻糖生成反應>

將玉米澱粉懸濁於水使成為濃度30%，於此懸濁液中添加碳酸鈣0.1%。將該懸濁液之pH調整為6.0後，依澱粉固體成分添加0.2%之耐熱性α-澱粉酶劑(商品名『Termamyl 60L』、Novozymes Japan股份有限公司販賣)，於95℃反應15分鐘使澱粉糊化．液化。將所得之液化澱粉溶液於120℃高壓蒸煮30分鐘後，冷卻至51℃，調整至pH5.7後，一邊維持同溫度，同時每1克澱粉固體成分添加2單位之α-醣苷基海藻糖生成酵素、10單位之海藻糖游離酵素、300單位之異澱粉酶劑(林原股份有限公司製)、及實驗1-2記載之CGTase或實驗1-2中調製之CGTase的任一者2單位，反應64小時。將所得之反應物於97℃加熱30分中分別使酵素失活後，調整為pH4.5，每1克澱粉固體成分添加10單位之葡萄糖澱粉酶劑(商品名『Glucozyme#20000』、Nagase Chemtex股份有限公司製)，反應24小時。將如此方式得到反應液於95℃加熱 10分鐘使酵素失活，進行以下所述之反應液中海藻糖含量的測定。再者，以除了不添加CGTase以外為以同一條件進行酵素反應而得之反應液作為對照。

<實驗1-4：反應液中之海藻糖含量之測定>

以實驗1-3中得到之反應液分別為表1所示之反應液1至8，由以下方式求得海藻糖含量。亦即，將反應液1至8分別以配製1%溶液，以0.45μm膜濾器過濾後，進行下述條件之HPLC分析，由出現於示差折射計之層析圖的波峰面積來計算反應液之海藻糖含量，以無水物換算。結果如表1所示。再者，表1所示反應液中之海藻糖含量，即使對各CGTase以同樣條件重複5次海藻糖生成反應及葡萄糖澱粉酶處理時，在若干變動範圍內係可再現性良好地得到的值。

．分析條件

HPLC裝置：『LC-10AD』(島津製作所股份有限公司製)

除氣器：『DGU-12AM』(島津製作所股份有限公司製)

管柱：『MCI GEL CK04SS』(三菱化學股份有限公司製)

樣品注入量：20μl

溶離液：精製水

流速：0.4ml/分

溫度：85℃

示差折射計：『RID-10A』(島津製作所股份有限公司製)

數據處理裝置：『Chromatopac C-R7A』(島津製作所股份 有限公司製)

如表1所示，使用自以往即用於海藻糖生成之來自嗜熱桿菌Tc-91株的CGTase(反應液2)時，葡萄糖澱粉酶處理後之海藻糖含量僅止於84.7%，使用來自芽孢桿菌Bacillus macerans之CGTase(反應液3)時，海藻糖含量雖高達85.1%，但其增加量稀少。又，使用來自嗜高溫菌Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes之CGTase(反應液4)時，海藻糖含量成為83.4%，比使用自以往即用於海藻糖生成之來自嗜熱桿菌Tc-91株的CGTase(反應液2)時更為降低。

相對於此，使用來自類芽孢桿菌屬之微生物的CGTase(反應液5至8)時，葡萄糖澱粉酶處理後之海藻糖 含量以無水物換算均超過86.0%，相較於使用自以往即用於海藻糖生成之來自嗜熱桿菌Tc-91株的CGTase(反應液2)時係顯著的增加。特別是各使用來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15959株(反應液5)、來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株(反應液6)、及來自類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli NBRC13638株(反應液7)之各CGTase作為CGTase時，海藻糖含量超過87.0%，可知藉由酵素反應得到了海藻糖含量高之含有海藻糖之糖液。又，本次實驗進行中，得知使用來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis之CGTase作為CGTase時，可得到最高的海藻糖含量，得知來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis之CGTase最佳。

<實驗2：由海藻糖含量不同之各糖液所製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末的海藻糖純度、對澱粉產率、及物性> <實驗2-1：被驗試樣之調製> <被驗試樣1至8>

將實驗1中得到之海藻糖含量不同的反應液1至8分別藉由使用活性碳之脫色處理及使用離子交換樹脂之去鹽處理來精製，濃縮至固體成分濃度約60%，分別對應於反應液1至8，得到含有海藻糖之糖液1至8(含有以無水物換算82.8至87.6%之海藻糖)。

將上述含有海藻糖之糖液1至8，分別在減壓下濃縮 至固體成分濃度約85%，採入助晶罐，添加相對於各糖液之容量為約1%(w/v)之海藻糖二水合結晶作為種晶，一邊攪拌，同時由60℃至20℃花費約10小時自然冷卻藉以幫助結晶，調製使海藻糖二水合結晶晶析之糖膏。遵照一般方法由前述糖膏以籃型離心分離機採取海藻糖二水合結晶，將採取之海藻糖二水合結晶使用相對於糖膏重量為8%之去離子水洗淨，於40℃熟成、乾燥8小時後，吹拂25℃之清潔空氣30分鐘以強制冷卻，粉碎藉以成為含有海藻糖二水合結晶之粉末。以分別由含有海藻糖之糖液1至8所得之含有海藻糖二水合結晶之粉末分別為被驗試樣1至8。

<被驗試樣9>

使用食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『TREHA』、批號：9I131、林原股份有限公司販賣)作為被驗試樣9。

<實驗2-2：被驗試樣1至9之海藻糖純度、對澱粉產率、及固結性> <海藻糖純度>

被驗試樣1至9之海藻糖純度，係與實驗1-3相同之HPLC法求得。結果如表2所示。

<對澱粉產率>

上述調製之被驗試樣1至8之對澱粉產率，係由使用於各被驗試樣之調製的酵素反應液質量與原料澱粉饋入時之濃度(30%)算出以原料澱粉之無水物換算的質量，將所得之被驗試樣1至8以無水物換算之質量除以此值後，乘100以百分率表示。結果一併示於表2。

<固結性試驗>

對各被驗試樣1至9，以調查各自之粉末之固結性為目的，進行以下實驗。亦即，將被驗試樣1至9各秤取1克，分別填充製不同的內底部為半球狀之14ml容量有蓋之聚丙烯製圓筒管(Becton Dickinson公司販賣、商品名『Falcon Tube 2059』、直徑1.7cm、高10cm)的內部，以將管直立於試驗管架之狀態下容納於50℃之恆溫箱(Advantec東洋股份有限公司販賣、商品名『CI-410』)之內部，持續24小時靜置後，將管取出恆溫箱外，移除管蓋，將管緩慢地傾倒，藉以將被驗試樣取出於黑色塑膠製平板上，用肉眼觀察取出之被驗試樣的狀態。

關於固結之有無，將即使被驗試樣在平板上，管內底部仍明顯保持有半球狀的情況判定為「有固結」(+)、將被驗試樣在管內底部之形狀雖僅有少許但仍可識別者判定為「稍有固結」(±)、將被驗試樣崩解，未保持管內底部之形狀者判定為「無固結」(-)。結果如表2之「固結性」欄所示。

如表2所示，被驗試樣1至8之含有海藻糖二水合結晶之粉末中以無水物換算之海藻糖含量、亦即海藻糖純度，均超過98.0%，與習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末之被驗試樣9同樣地為高純度之含有海藻糖二水合結晶之粉末。但是，考慮對澱粉產率時，使用來自類芽孢桿菌屬之微生物的CGTase以外之CGTase的被驗試樣2至4中，對澱粉產率僅止於最高39%，相對於此，使用來自類芽孢桿菌屬之微生物的CGTase之被驗試樣5至8中，對澱粉產率成為41至42%而超過40%，觀察到所用之CGTase的來源所致之差異。又，比較表1與表2之結果時，由葡萄糖澱粉酶處理後之酵素反應液中之海藻糖含量愈高之酵素反應液中調製之含有海藻糖二水合結晶之粉末，可見對澱粉產率愈高之傾向，酵素反應液中之海藻糖含量與對澱粉產率之間可觀察到相關關係。

由該等結果，可得到使用來自類芽孢桿菌屬之微生物的CGTase(被驗試樣5至8)作為CGTase時，葡萄糖澱 粉酶處理後之酵素反應液中之海藻糖含量會超過86.0%，結果，含有海藻糖二水合結晶之粉末之對澱粉產率亦高達41%以上之見解。特別是使用來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis或類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli之CGTase(被驗試樣5至7)時，葡萄糖澱粉酶處理後之酵素反應液中之海藻糖含量超過87.0%，得知含有海藻糖二水合結晶之粉末之對澱粉產率進一步高達42%。再者，使用來自類芽孢桿菌屬之微生物之CGTase時對澱粉產率(被驗試樣5至8之對澱粉產率)的提高，雖比起使用來自以往即所用之嗜熱桿菌Tc-91株之CGTase(被驗試樣2)時為3至4%，然在含有海藻糖二水合結晶之粉末的工業製造上，對澱粉產率提高達3至4%，此可說是極為劃時代的成果。

另一方面，關於就作為粉末之操作上為重要物性之固結性而言，由不使用CGTase之含有海藻糖之糖液1中製造之被驗試樣1、及使用來自嗜高溫菌Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes之CGTase作為CGTase所製造之被驗試樣4，在上述固結性試驗中被判定為「有固結(+)」，相對於此，使用其他CGTase來製造之被驗試樣2、3、5至8，與自以往即有市售之食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(被驗試樣9)同樣地，在上述固結性試驗中僅被判定為「稍有固結」(±)。此結果顯示了藉由使用來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase的本發明之製造方法所製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末 (被驗試樣5至8)，相較於自以往即有市售之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末(被驗試樣9)，於固結性而言為毫不遜色的粉末，係可作為粉末狀之食品材料、化粧品材料、準醫藥品材料、或醫藥品材料，與自以往即有市售之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末同樣地來使用之粉末。

<實驗3：晶析時之擬控制冷卻，對含有海藻糖二水合結晶之粉末之海藻糖純度、對澱粉產率、及固結性的影響>

本實驗中，探討了於實驗2-1中調製之含有海藻糖之糖液1至8中使海藻糖二水合結晶晶析時，應用擬控制冷卻法來調製含有海藻糖二水合結晶之粉末時對粉末之海藻糖純度、對澱粉產率、及固結性所造成的影響。

<實驗3-1：被驗試樣之調製>

除了將實驗2-1中調製之以無水物換算的海藻糖含量不同之含有海藻糖之糖液1至8，分別在減壓下濃縮至固體成分濃度約85%，採入助晶罐，添加相對於糖液之容量為約1%(w/v)之海藻糖二水合結晶作為種晶，一邊攪拌，同時由60℃至20℃花費約10小時來擬控制冷卻借以幫助結晶以外，係與實驗2同樣方式，調製使海藻糖二水合結晶晶析之糖膏。再者，擬控制冷卻，係將全10小時之冷卻時間分為4小時、3小時、3小時之3個區間，於最初之區間係花費4小時將液溫由60℃至55℃、下個區間中 花費3小時由55℃至50℃、且在最後區間中花費3小時使液溫由50℃至20℃，均使液溫對時間呈現大致直線狀地降低的方式來冷卻而進行。藉由一般方法，藉由籃型離心分離機由所得之糖膏中採取海藻糖二水合結晶，使用相對於糖膏重量為8%之去離子水洗淨所採取之海藻糖二水合結晶，於40℃熟成、乾燥8小時後，吹拂25℃之清潔空氣30分鐘以強制冷卻，粉碎藉以成為含有海藻糖二水合結晶之粉末。將藉由擬控制冷卻分別由含有海藻糖之糖液1至8中所得之含有海藻糖二水合結晶之粉末分別作為被驗試樣1c至8c。

<實驗3-2：被驗試樣1c至8c之海藻糖純度、對澱粉產率、及固結性> <海藻糖純度>

被驗試樣1c至8c之海藻糖純度，係以與實驗1-3同樣的HPLC法求得。結果如表3所示。

<對澱粉產率>

被驗試樣1c至8c之對澱粉產率，係藉由與實驗2-2同樣的方法算出。結果一併示於表3。

<固結性試驗>

被驗試樣1c至8c之固結性，係藉由與實驗2-2相同的固結性試驗來評估。結果一併示於表3。

如表3所示，晶析步驟中應用擬控制冷卻法而調製之被驗試樣1c至8c之海藻糖純度為99.0至99.6%之範圍。將此結果與以實驗2之自然冷卻法晶析而得之被驗試樣1至8之海藻糖純度(表2之「海藻糖純度」欄)對比時，被驗試樣1c至8c中，海藻糖純度均高了0.2至0.6%。此結果顯示藉由晶析步驟中應用擬控制冷卻，可提高粉末之海藻糖純度。

又，被驗試樣1c至8c之對澱粉產率為35至45%，將此結果與實驗2之以自然冷卻法晶析而得之被驗試樣1至8之對澱粉產率(表2之「對澱粉產率」欄)對比時，被驗試樣1c至8c中，對澱粉產率均提高2至4%左右。此結果意指於晶析時應用擬控制冷卻法時，相較於藉由自然冷卻法而晶析的情況時，對澱粉產率會提高。用於晶析之含有海藻糖之糖液中海藻糖含量雖無變化，但藉由應用擬控制冷卻法而得之含有海藻糖二水合結晶之粉末的對澱粉 產率會提高的理由雖未有定論，但推測如前所述，依照擬控制冷卻法，可得到微結晶少且粒度均勻的結晶，因此藉由離心分離由糖膏採取結晶時、及以水洗淨採取之結晶時的海藻糖損失少。

進一步，對於被驗試樣1c至8c，進行與實驗2-2中同樣的固結性試驗，調查其粉末之固結性後，如表3所示，被驗試樣1c至4c均被判定為「稍有固結」(±)，被驗試樣5c至8c，取出於平板上時均崩解，無法保持管內底部之形狀，被判定為「無固結」(-)。該等之結果，顯示了於晶析時應用擬控制冷卻法時，所得之粉末的固結性意外地具有比以自然冷卻法晶析時改善的傾向。其中，相對於習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末(被驗試樣9)在固結性試驗中被判定為「稍有固結」(±)(參照表2)，尤以由海藻糖含量超過86%之較高之含有海藻糖之糖液5至8中應用擬控制冷卻法來晶析藉此得到之含有海藻糖二水合結晶之粉末(被驗試樣5c至8c)被判定為「無固結」(-)之事實，表示藉由自海藻糖含量超過86%之較高之含有海藻糖之糖液中應用擬控制冷卻法來晶析，藉此可製造相較於習知食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末顯著地不易固結，作為粉末之特性優良的含有海藻糖二水合結晶之粉末。

由上述結果，得知了藉由於晶析步驟中應用擬控制冷卻法，相較於藉由自然冷卻法來晶析的情況時，能夠以較高之對澱粉產率製造海藻糖純度高之含有海藻糖二水合結 晶之粉末。又，自海藻糖含量超過86.0%之較高之糖液中藉由擬控制冷卻法來晶析而製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，就以自然冷卻法製造之習知食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末於被判定為「稍有固結」(±)的條件下亦不固結，維持作為粉末之流動性的關點而言，得知係優良的粉末。

<實驗4：結晶化度及平均微晶直徑對粉末之固結性不同的影響>

實驗3中，應用擬控制冷卻法由海藻糖含量超過86%之較高之糖液中調製的含有海藻糖二水合結晶之粉末被驗試樣5c至8c，相較於其以外之被驗試樣，於海藻糖純度即使無大差距，亦具有不易固結之優良粉末特性。以解明該理由為目的，本實驗中對於實驗2中得到之被驗試樣1至8、及於實驗3中得到之被驗試樣1c至8c，測定粉末之海藻糖二水合結晶之結晶化度與平均微晶直徑。又，亦同樣地調查被驗試樣9作為對照。

<實驗4-1：結晶化度之測定所用之標準試樣之調製> <標準試樣A>

使試藥級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『海藻糖999』、編碼號：TH224、純度99.9%以上)再結晶藉以調製實質由海藻糖二水合結晶所構成之標準試樣，作為被驗試樣A。亦即，將上述試藥級之含有海藻糖二水 合結晶之粉末1,840g加熱．溶解於1,000g之精製水，將經溶解之溶液放入20℃之恆溫室，放置一晚以再結晶。將藉由再結晶而結晶之海藻糖二水合結晶，藉由一般方法使用籃型離心分離機回收，於40℃乾燥8小時得到海藻糖二水合結晶約950g。以其為被驗試樣A。以實驗1記載之HPLC法測定被驗試樣A之海藻糖純度後，係100%。

<標準試樣B>

將實質由不定形部分所構成之標準試樣以以下之順序調製作為被驗試樣B。亦即，將被驗試樣A溶解於適量之精製水，花費3日冷凍乾燥後，於40℃以下真空乾燥一晚，得到實質由不定形部分所構成之粉末。以其為被驗試樣B。以實驗1記載之HPLC法測定被驗試樣B之海藻糖純度後，係100%。再者，藉由卡爾-費雪法測定被驗試樣B之水分含量後，係2.0%。

<實驗4-2：被驗試樣A及B、被驗試樣1至9、及、被驗試樣1c至8c之結晶化度> <結晶化度>

以如下方式求得被驗試樣A及B、被驗試樣1至9、被驗試樣1c至8c中海藻糖二水合結晶之結晶化度。亦即，使用市售之反射光方式之粉末X射線繞射裝置(Spectris股份有限公司製、商品名『X’Pert PRO MPD』)，基於由Cu對陰極所放射之特性X射線之CuK α線(X射線管電流40mA、X射線管電壓45kV、波長1.5405埃)的粉末X射線繞射輪廓，使用搭載於同粉末X射線繞射裝置之專用的解析電腦軟體，對被驗試樣A及B、被驗試樣1至9、及被驗試樣1c至8c各求得荷曼斯法之結晶化度的解析值。在荷曼斯法之結晶化度解析前，一邊考慮各粉末X射線繞射圖型中波峰彼此的疊合、繞射強度、散射強度等，同時將軟體所設定之粒狀度及彎曲因子(bending factor)分別擬合至適當程度以得到判斷為最佳之基線。再者，關於荷曼斯法，係詳述於P.H.Harmans與A.Weidinger、「Journal of Applied Physics、第19卷、491~506頁(1948年)」、及P.H.Harmans與A.Weidinger、「(Journal of Polymer Science)、第4卷、135~144頁(1949年)」。

以被驗試樣A之結晶化度的解析值為解析值H₁₀₀、被驗試樣B之結晶化度的解析值為解析值H₀，以各被驗試樣之結晶化度的解析值為Hs，代入前述式[3]藉以求得結晶化度。附言之，被驗試樣A之荷曼斯法的結晶化度之解析值(H₁₀₀)及被驗試樣B之同解析值(H₀)分別為50.69%及8.59%。結果如表4所示。再者，關於被驗試樣A及B，將粉末X射線繞射圖型分別示於圖1及圖2。

如圖1可見，於被驗試樣A之粉末X射線繞射圖型中，海藻糖二水合結晶所特有之繞射峰係在繞射角(2 θ)5至50°之範圍清楚且銳利地出現，不定形部分所特有的繞射暈全無觀察到。另一方面，如圖2可見，被驗試樣B之 粉末X射線繞射圖型中，與圖1之粉末X射線繞射圖型不同地，不定形部分所特有之繞射暈係作為基線之膨脹而顯著出現，但海藻糖之二水合結晶或無水結晶所特有之繞射峰全無被觀察到。

<實驗4-3：被驗試樣A及B之同步加速器放射的粉末X射線繞射>

本實驗中，為了以進一步支持被驗試樣A及B分別為適合作為用以決定解析值H₁₀₀及H₀之試樣為目的，將該等標準試樣，以同步輻射光(以下、稱為「放射光」)作為X射線源，進行可檢測微弱之繞射或散射信號的穿透光方式之粉末X射線繞射。再者，測定條件如下所述。

<測定條件>

粉末X射線繞射裝置：高速粉末X射線繞射裝置(神津精機公司販賣、型號『PDS-16』)、Debye-Scherrer模式、相機長：497.2mm

X射線源：來自彎曲磁鐵之放射光(兵庫縣Beamline(BL08B2))

測定波長：1.239(10.00keV)

測定強度：10⁹光子/秒

測定角：3至38°

曝光時間：600秒

影像攝影：影像板(富士軟片公司製、商品名『Imaging Plate BAS-2040』

影像讀取裝置：影像分析器(富士軟片公司製、『Bio Image Analyzer BAS-2500』)

測定係利用設於大型放射光設施「SPring-8」(日本兵庫縣佐用郡佐用町光都1-1-1)內之「兵庫県Beamline(BL08B2)」來實施。

在粉末X射線繞射之測定前，藉由研缽將被驗試樣A及B搗碎後，以53μm之篩過篩，將通過篩之粉末均勻地填充至X射線結晶繞射用毛細管(Toho股份有限公司販賣、商品名『MARKTUBE』、No.14(直徑0.6mm、林得曼玻璃製))內，使得填充長成為大致30mm。接著，將毛細管於試樣之填充終端切斷，將開口部以接著劑封閉後，藉由黏土將毛細管對試樣置放具固定，以使毛細管之長度方向對粉末X射線繞射裝置之光軸呈垂直的方式，將試樣置放具安裝於粉末X射線繞射裝置。為了去除海藻糖二水合結晶之配向對粉末X射線繞射輪廓之影響，測定中，使試樣置放具以2次/秒之週期等速旋轉。

對被驗試樣A及B解析所得之粉末X射線繞射輪廓，於製成粉末X射線繞射圖型的過程中，為了提高測定精度，遵照一般方法，由各粉末X射線繞射輪廓中去除來自粉末X射線繞射裝置之背景信號。關於如此方式所得之被驗試樣A及B的粉末X射線繞射圖型分別如圖3及圖4所示。

如圖3可見，使用放射光之粉末X射線繞射之關於被驗試樣A之粉末X射線繞射圖型，海藻糖二水合結晶特有之繞射峰在繞射角(2 θ)3至38°之範圍清楚且銳利地出現。比較圖3與圖1時，放射光之波長(1.239)、與特性X射線之波長(1.540)係相異，因此圖3中，雖有各繞射峰係出現於圖1中大致5分之4的繞射角(2 θ)的不同，但圖1及圖3中之繞射圖型極為一致。又，圖3中各繞射峰之強度，雖為圖1中繞射峰強度之近50倍強，然而各繞射峰之半值寬比圖1中更明顯地狹窄，分離度亦高。又，圖3之粉末X射線繞射圖型中，如後述圖4，不定形部分所特有之繞射暈全無被觀察到。此顯示了被驗試樣A中之海藻糖二水合結晶的結晶性極高，被驗試樣A係實質由海藻糖二水合結晶所構成。

另一方面，如圖4所示，在使用放射光之粉末X射線繞射之關於被驗試樣B之粉末X射線繞射圖型，不定形部分所特有之繞射暈係作為基線之膨脹而顯著出現，海藻糖二水合結晶所特有之繞射峰全無被觀察到。此顯示了被驗試樣B係實質由不定形部分所構成。

使用同步輻射光作為X射線源而得之上述結果，係支持被驗試樣A及B為適合作為用以決定式[3]中之解析值H₁₀₀及解析值H₀的試樣者。

<實驗4-4：被驗試樣A、被驗試樣1至9及被驗試樣1c至8c之平均微晶直徑>

由粉末X射線繞射圖型中之各繞射峰之半值寬及繞射角(2 θ)，可算出微晶直徑。本發明者等人，考慮由複數之繞射峰算出之微晶直徑的平均值(平均微晶直徑)可成為規定含有結晶之粉末之物性的參數，而對含有海藻糖二水合結晶之粉末之被驗試樣求得平均微晶直徑。

為不定形粉末，且粉末X射線繞射圖型中不顯示繞射峰的被驗試樣B除外，而對被驗試樣A、被驗試樣1至9、及被驗試樣1c至8c使用在求取結晶化度時的各粉末X射線繞射圖型，進一步求得各自的平均微晶直徑。選擇含有海藻糖二水合結晶之粉末的各自粉末X射線繞射圖型中之5個繞射峰、亦即於對微晶之不均應變所造成的繞射峰幅之影響少的較為低角度區域中，與其他繞射峰良好分離之繞射角(2 θ)13.7°(米勒指數(hkl)：101)、17.5°(米勒指數：220)、21.1°(米勒指數：221)、23.9°(米勒指數：231)及25.9°(米勒指數：150)之繞射峰(圖1所示之符號a至e)，對各繞射峰，使用其半值寬與繞射角(2 θ)，使用附屬於粉末X射線繞射裝置之解析用電腦軟體(『X′pert Highscore Plus』，基於使用矽(美國國立標準技術研究所(NIST)、X射線繞射用標準試樣(『Si640d』)作為標準品時之測定值進行修正後，基於前述式[4]，算出微晶直徑，以5點的平均值求出平均微晶直徑。結果一併示於表4。

再者，表4中，針對被驗試樣1至9及被驗試樣1c至8c，分別由表2及3轉錄海藻糖純度與粉末之固結性 試驗的結果而一併顯示。又，對於作為用以測定結晶化度之標準試樣之被驗試樣A及B，亦分別進行與實驗2-2、實驗3-2相同的固結性試驗，評估其固結性。結果一併示於表4。

結晶化度測定中，作為用以決定解析值H₁₀₀之標準試樣的被驗試樣A(海藻糖純度100.0%、結晶化度100.0%)之平均微晶直徑為3,91。又，如表4所示，固結性試驗中被驗試樣A係被判定為「無固結」(-)。相對於此，作為用以決定解析值H₀之標準試樣的被驗試樣B(海藻糖純度100.0%、結晶化度0.0%)，於固結性試驗中，即使由管中取出至平板上，亦明確保持管內底部之半球狀，被判 定為「有固結」(+)。再者，取出至平板上之被驗試樣B所保持的管內底部之半球狀形態，其係即使輕輕對平板賦予振動的程度亦不會崩解。另一方面，自以往所市售之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末之被驗試樣9的海藻糖純度為99.0%、結晶化度為85.4%。

如表4之「結晶化度」欄所示，晶析步驟中以自然冷卻法晶析而得之被驗試樣1至8的結晶化度成為78.7至88.1%之範圍，又，晶析步驟中應用擬控制冷卻法而調製之被驗試樣1c至8c的結晶化度，成為85.7至96.0%之範圍。由晶析方法之不同的觀點而言，對比上述被驗試樣1至8及被驗試樣1c至8c之結晶化度時，以擬控制冷卻法得到之被驗試樣1c至8c中，於試樣間雖有變異，但得知相較於以自然冷卻法而得之被驗試樣1至8，結晶化度提高3.1至7.9%。

又，表4所示之結果，表示了結晶化度係與粉末之固結性具有相關性。亦即，如表4所示，結晶化度為90%以上之被驗試樣A、被驗試樣5c至8c，均為「無固結」(-)，相對於此，結晶化度為85%以上、未達90%之被驗試樣2、3、5至9、及被驗試樣1c至4c，均為「稍有固結」(±)，結晶化度為未達85%之被驗試樣B、被驗試樣1及4，均為「有固結」(+)。此表示了結晶化度可成為規定不易固結之含有海藻糖二水合結晶之粉末的有力指標。

進一步地，此結果表示了，含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造中，反應液中之海藻糖含量提高至超過 86.0%，於之後的晶析步驟中若應用擬控制冷卻法，所得之粉末中之海藻糖二水合結晶的結晶化度會成為90%以上，結果，就固結的觀點，表示可得到相較於習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末更顯著地不易固結的含有海藻糖二水合結晶之粉末。

另一方面，如表4之「平均微晶直徑」欄所示，晶析步驟中以自然冷卻法晶析而得之被驗試樣1至8的平均微晶直徑係成為2,150至2,83之範圍，又，晶析步驟中應用擬控制冷卻法而調製之被驗試樣1c至8c的平均微晶直徑係成為2,540至3,58之範圍。就平均微晶直徑將被驗試樣1c至8c與被驗試樣1至8對比時，得知以擬控制冷卻法而得之被驗試樣1c至8c中，試樣間雖有變異，但相較於以自然冷卻法而得之被驗試樣1至8，平均微晶直徑增大了190至75。由此結果，可說海藻糖二水合結晶之晶析步驟中應用擬控制冷卻法，就得到平均微晶直徑大之含有海藻糖二水合結晶之粉末而言亦為優良的方法。

又，被驗試樣1至8及被驗試樣1c至8c中，粉末中之海藻糖純度及海藻糖二水合結晶之結晶化度愈高，可觀察到平均微晶直徑之值愈大的傾向。將此傾向與海藻糖純度為100.0%且結晶化度為100.0%之被驗試樣1之平均微晶直徑為3,91、食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末之被驗試樣9的平均微晶直徑為2,59來合併考慮時，表示含有海藻糖二水合結晶之粉末中之平均微晶直 徑，與海藻糖純度及結晶化度有一定之相關性。

進一步地，表4所示之結果，表示了平均微晶直徑亦與粉末之固結性具有相關性。亦即，如表4所示，平均微晶直徑為3,21以上之被驗試樣A、被驗試樣5c至8c，均為「無固結」(-)，相對於此，平均微晶直徑在2,50以上、未達3,20之範圍的被驗試樣2、3、5至9、及被驗試樣1c至4c，均為「稍有固結」(±)，平均微晶直徑為未達2,50之被驗試樣B、被驗試樣1及4，均為「有固結」(+)。此係表示了，與結晶化度相同地，平均微晶直徑亦可成為規定不易固結之含有海藻糖二水合結晶之粉末的有力指標。

<實驗5：被驗試樣之粉末特性(保存性、對水之溶解性)>

以進一步解明作為被驗試樣1至9及被驗試樣1c至8c之粉末的性質為目的，進行保存性試驗及對水之溶解性試驗。

<實驗5-1：保存性試驗>

於實驗2-2、實驗3-2等當中進行的固結性試驗，為了確認其作為評估含有海藻糖二水合結晶之粉末之實際保存時的固結性之試驗係妥當的，對以實驗4-1之方法得到的被驗試樣A及B、於實驗2得到之被驗試樣1至9、及於實驗3得到之被驗試樣1c至8c，進行假設作為市場流通製品之含有海藻糖二水合結晶之粉末實際上被保存之狀 態、環境、期間等的保存性試驗。

亦即，將被驗試樣A及B、被驗試樣1至9、及被驗試樣1c至8c各取150g，分別採取入聚乙烯袋(商品名『Uni-Pack F-4』、股份有限公司生產日本社製、17cm×12cm)，對各被驗試樣各製造3袋於抽去空氣之狀態下密封之聚乙烯袋。接著，以各聚乙烯袋之片面積每1m²之荷重成為648kg的方式將13.2kg之重物以於各自之聚乙烯袋之上對上側面整體施以荷重的方式置放，在該狀態下，於避開高溫多濕之環境下保存60日。再者，食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末製品，通常係以裝入20kg裝之袋的包裝方式，於堆積10層左右的狀態下保存於倉庫等後，聚乙烯袋之片面積每1m²為648kg的荷重，係相當於此10層堆積之狀態中對最下層製品所施予的荷重。60日保存後，將各被驗試樣由聚乙烯袋中取出，通過篩孔孔目425μm之篩，分別測定通過篩之粉末與未通過之粉末的質量，求得粒徑425μm以上之粒子佔粉末整體之質量比例(%)，藉由取對各被驗試樣試驗之3袋之平均值，判定60日保存後粉末中固結之有無。粉末之固結係將粒徑425μm以上之粒子佔粉末整體之未達30%時判定為「無固結」(-)、同樣粒子佔粉末整體之30%以上時判定為「有固結」(+)。再者，粉末中425μm以上之粒子比例超過30%時，一般而言粉末之溶解或與其他之粉末狀組成物的混合、混捏等會產生障礙，因此將判定基準設為30%。結果如表5所示。

<實驗5-2：對水之溶解性試驗>

將各被驗試樣各秤量0.25g，分別置入內底部為半球狀之14ml容量之有蓋聚丙烯製圓筒管(Becton Dickinson公司販賣、商品名「Falcon Tube 2059」。於置入有各被驗試樣之管中添加去離子水5ml，於50℃之恆溫水槽中加溫30分鐘後，傾倒2次，進一步在50℃保持15分鐘，調查此時之溶解性。藉由目視，將視為粉末完全溶解時判定為溶解性「良」、將確認有不溶物殘存時判定為溶解性「不良」。結果一併示於表5。

如表5之「保存性」欄所示，於對各被驗試樣施予荷重同時在避開高溫多濕之環境下保存60日之保存性試驗中，海藻糖之結晶化度未達90.0%，平均微晶直徑為2,85以下之被驗試樣1至9及被驗試樣1c至4c判斷為「有固結」(+)，相對於此，結晶化度為91.0%以上、96.0%以下，平均微晶直徑為3,21以上之被驗試樣A、被驗試樣5c至8c係判斷為「無固結」(-)。此結果表示，於在實驗2-2、實驗3-2等進行之固結性試驗中判定為「有固結」(+)或「稍有固結」(±)之被驗試樣，在本保存試驗中判定為「有固結」(+)，相對於此，在於實驗2-2、實驗3-2等進行之固結性試驗中判定為「無固結」(-)之被驗試樣，在本保存試驗中亦同樣地被判定為「無固結」(-)。此事實表示，於實驗2-2、實驗3-2等進行之固結性試驗，作為評估含有海藻糖二水合結晶之粉末在實際保存環境下之固結性的試驗，係妥當的。

又，如表5之「對水之溶解性」欄所示，於對水之溶解性試驗中，結晶化度100%、平均微晶直徑3,91之被驗試樣A被判定為溶解性「不良」，相對於此，結晶化度為96.0%以下、平均微晶直徑為3,58以下之被驗試樣1至9及被驗試樣1c至8c，均被判定為溶解性「良」。此結果表示，含有海藻糖二水合結晶之粉末中，結晶化度及平均微晶直徑若提高至被驗試樣A之等級，換言之，若提高至試藥級之含有海藻糖二水合結晶之粉末的等級，對水之溶解性變差之與固結性不同的問題會產生。

<實驗6：更適合於海藻糖之製造之CGTase所共通之部分胺基酸序列>

以特定更適合於海藻糖之製造的CGTase特徵為目的，將提高酵素反應液中之海藻糖含量的效果優良的前述來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase、亦即，分別來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株、類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli NBRC13638株、及類芽孢桿菌Paenibacillus amylolyticus NBRC15957株之CGTase胺基酸序列(序列表中之序列編號1、2及3)、與提高酵素反應液中之海藻糖含量之效果比來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase弱之分別來自前述嗜熱桿菌Tc-91株、與芽孢桿菌Bacillus macelans、厭氧性耐熱菌Thermoanaerobacter thermosulfurigenes之CGTase的胺基酸序列(序列表中之序列編號4、5及6)作比較。再者，胺基酸序列之比較所用之序列表中之序列編號1至3所示之胺基酸序列，均係使用申請人獨自將類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株、類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli NBRC13638株、及類芽孢桿菌Paenibacillus amylolyticus NBRC15957株各自的CGTase基因選殖而決定之鹼基序列所編碼的胺基酸序列。又，序列表中之序列編號4及5所示的胺基酸序列，係為申請人獨自決定，且與本案相同之申請人在日本特開昭61-135581號公報所揭示之來自嗜熱桿菌(舊分類中為 芽孢桿菌Bacillus stearothermophilus)Tc-91株、及來自芽孢桿菌Bacillus macelans之CGTase的胺基酸序列。附言之，序列表中序列編號5所示之胺基酸序列，雖不是實驗1中所用之來自芽孢桿菌Bacillus macelans之CGTase(商品名『Contizyme』、天野Enzyme股份有限公司販賣)，但為來自同樣芽孢桿菌Bacillus macelans之CGTase的胺基酸故代用之。又，來自厭氧性耐熱菌Thermoanaerobacter thermosulfurigenes之CGTase的胺基酸序列係使用在基因資料庫『GenBank』中登錄為accesion No.35484者。

上述胺基酸序列之比較中，提高酵素反應液中之海藻糖含量的效果優良的CGTase、亦即，於來自前述類芽孢桿菌屬微生物之CGTase中共通存在，且於提高酵素反應液中之海藻糖含量的效果並不如此高之CGTase、亦即分別來自Geobacillus stearothermophilus、芽孢桿菌Bacillus macelans、及厭氧性耐熱菌Thermoanaerobacter thermosulfurigenes之CGTase中不存在之部分胺基酸序列，可觀察到下述(a)至(d)之部分胺基酸序列。

(a)Gly-Ser-X₁-Ala-Ser-Asp；(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn；(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys；(d)Val-Asn-Ser-Asn-X₂-Tyr；(惟，X₁意指Ala或Ser，X₂意指Ala或Thr)。

由以上結果，本發明之製造方法之海藻糖的製造中， 更適合的CGTase、亦即，酵素反應液中之海藻糖含量可超過86.0%之CGTase，其特徵可為具有上述(a)至(d)之部分胺基酸序列。

以下，基於實施例進一步詳細說明本發明。但是，本發明並非受該等實施例限定。

[實施例1] <含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造>

將玉米澱粉以成為30%的方式懸濁於水中，於此懸濁液中添加碳酸鈣使成為終濃度0.1%，調整為pH6.0。於其中以相當於澱粉質量為0.2%添加耐熱性α-澱粉酶(商品名『Termamyl 60L』、Novozymes Japan股份有限公司販賣)，於98至100℃反應15分鐘，使澱粉糊化．液化。將所得之液化澱粉溶液於125℃高壓蒸煮15分鐘後，冷卻至51℃，於其中添加以實驗1-1之方法調製的含有α-醣苷基海藻糖生成酵素與海藻糖游離酵素之部分精製酵素液使成為相當於每1克澱粉而言分別為2單位及10單位，進一步地，添加相當於每1克澱粉而言為300單位之異澱粉酶(林原股份有限公司製)及2單位之以實驗1-2的方法調製之來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15959株的CGTase，進一步反應約70小時。接著，將此反應液於97℃加熱30分鐘使酵素失活後，調整為pH4.5，於其中添加相當於每1克澱粉而言為10單位之葡萄糖澱粉酶劑(商品名『Glucozyme#20000』、Nagase Chemtex股份有限公司販賣)，反應24小時後，得到海藻糖純度、亦即以無水物換算之海藻糖含量為87.4%之反應液。將如此方式所得之反應液加熱，使酵素失活，藉由一般方法以活性碳脫色過濾，將濾液以陽離子交換樹脂(H⁺型)及陰離子交換樹脂(OH^-型)去鹽，減壓濃縮，成為固體成分濃度約85%之濃縮液。將其採入助晶罐，以試藥級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『海藻糖999』、編碼號：TH224、海藻糖純度99.9%以上、林原股份有限公司販賣)作為種晶添加2%，設為55℃，一邊溫和地攪拌，花費24小時自然冷卻至15℃，使海藻糖二水合結晶晶析。以籃型離心分離機回收結晶，將結晶以相對於糖膏重量為約5%之精製水噴霧洗淨後，於50℃熟成、乾燥2小時，吹拂20℃之空氣10分鐘以冷卻，粉碎而以對澱粉產率約42%得到以無水物換算含有海藻糖99.4%、D-葡萄糖0.3%、4-O-α-葡萄糖基海藻糖0.06%、及6-O-α-葡萄糖基海藻糖0.09%之含有海藻糖二水合結晶之粉末。

依照本例之製造方法，能夠以約42%之高的對澱粉產率製造含有海藻糖二水合結晶之粉末。又，藉由本製造方法製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末之海藻糖二水合結晶的結晶化度為88.4%、平均微晶直徑為2,85、粉末整體之還原力為0.4%。附言之，上述結晶化度之測定係以荷曼斯法進行，使用於實驗4-2求得之解析值H₁₀₀及H₀來進行。測定本品之粒度分布後，粒徑53μm以上、未達425μm之粒子為含73.1%；粒徑53μm以上、未達300μm 之粒子為含68.6%；及，粒徑425μm以上之粒子為含8.2%。本品係與習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末同樣地可作為食品材料、化粧品材料、準醫藥品材料、及醫藥品材料等來使用。

[實施例2] <含有海藻糖二水合結晶之粉末的製造>

除了使用相當於每1克澱粉而言分別為3單位及15單位之α-醣苷基海藻糖生成酵素與海藻糖游離酵素，將反應時間設為40小時，使用以實驗1-2之方法得到之來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株之CGTase作為CGTase以外，係藉由與實施例1同樣之方法進行海藻糖生成反應及葡萄糖澱粉酶處理，藉以得到海藻糖純度、亦即以無水物換算之海藻糖含量為87.6%之反應液。加熱所得到之反應液，使酵素失活，藉由一般方法以活性碳脫色過濾，將濾液以陽離子交換樹脂(H⁺型)及陰離子交換樹脂(OH^-型)去鹽，減壓濃縮，成為固體成分濃度約85%之濃縮液。將其採入助晶罐，以試藥級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『海藻糖999』、編碼號：TH224、海藻糖純度99.9%以上、林原股份有限公司販賣)作為種晶添加1%，設為60℃，接著，將此含有海藻糖之溶液一邊溫和地攪拌，同時以由60℃至50℃花費12小時、由50℃至40℃花費6小時、進一步地由40℃至15℃花費6小時冷卻之擬控制冷卻法，合計24小時冷卻至 15℃，藉以使海藻糖之二水合結晶晶析。以籃型離心分離機回收結晶，將結晶以相對於糖膏重量為約5%之精製水噴霧洗淨後，於50℃熟成、乾燥2小時，吹拂20℃之空氣20分鐘以冷卻，粉碎而以對澱粉產率約45%得到以無水物換算含有海藻糖99.6%、D-葡萄糖0.07%、4-O-α-葡萄糖基海藻糖0.04%、及、6-O-α-葡萄糖基海藻糖0.06%之含有海藻糖二水合結晶之粉末。

本含有海藻糖二水合結晶之粉末的海藻糖二水合結晶之結晶化度為95.6%、平均微晶直徑為3,52、粉末整體之還原力為0.15%。附言之，上述結晶化度之測定係以荷曼斯法進行，使用於實驗4-2求得之解析值H₁₀₀及H₀來進行。測定本品之粒度分布後，粒徑53μm以上、未達425μm之粒子為含83.3%；粒徑53μm以上、未達300μm之粒子為含72.5%；及、粒徑425μm以上之粒子為含6.9%。使用本品，藉由與實驗2-2、實驗3-2等相同之方法進行固結性試驗後，判定為「無固結」(-)。又，藉由與實驗5相同方法來試驗對水之溶解性後，判定為溶解性「良」。

依照本例之製造方法，能夠以約45%之高的對澱粉產率製造含有海藻糖二水合結晶之粉末。又，藉由本製造方法製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，相較於作為食品材料等而市售之習知食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『TREHA』、林原股份有限公司販賣)，於海藻糖純度雖無很大的不同，但相較於習知之食品級含有海藻 糖二水合結晶之粉末為顯著地不易固結之粉末，且保存或操作容易。本品，就含有海藻糖之二水合結晶之粉末的方面，與習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末相同，保存或操作容易，故可更適合作為食品材料、化粧品材料、準醫藥品材料、及醫藥品材料等使用。

[實施例3] <含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造>

除了使用以實驗1-2之方法調製之來自類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli NBRC13638株的CGTase作為CGTase以外，與實施例1中同樣地進行海藻糖生成反應後，葡萄糖澱粉酶處理後之反應液中以無水物換算之海藻糖含量為87.2%。將如此方式得到之反應液加熱，使酵素失活，藉由一般方法以活性碳脫色過濾，將濾液以陽離子交換樹脂(H⁺型)及陰離子交換樹脂(OH^-型)去鹽，減壓濃縮，成為固體成分濃度約85%之濃縮液。將其採入助晶罐，以試藥級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『海藻糖999』、編碼號：TH224、海藻糖純度99.9%以上、林原股份有限公司販賣)作為種晶添加1%，設為60℃，一邊溫和攪拌，同時以由60℃至45℃花費15小時、由45℃至20℃花費9小時而冷卻之2階段擬控制冷卻法花費24小時冷卻，使海藻糖二水合結晶晶析。以籃型離心分離機回收結晶，將結晶以相對於糖膏重量為約5%之精製水噴霧洗淨後，於50℃熟成、乾燥2小時，吹拂20 ℃之空氣10分鐘以冷卻，粉碎而以對澱粉產率約44%得到以無水物換算含有海藻糖99.2%、D-葡萄糖0.4%、4-O-α-葡萄糖基海藻糖0.06%、及6-O-α-葡萄糖基海藻糖0.10%之含有海藻糖二水合結晶之粉末。

本含有海藻糖二水合結晶之粉末之海藻糖二水合結晶的結晶化度為92.6%、平均微晶直徑為3,13、粉末整體之還原力為0.5%。附言之，上述結晶化度之測定係以荷曼斯法進行，使用於實驗4-2求得之解析值H₁₀₀及H₀來進行。測定本品之粒度分布後，粒徑53μm以上、未達425μm之粒子為含75.2%；粒徑53μm以上、未達300μm之粒子為含69.3%、及、粒徑425μm以上之粒子為含7.8%。使用本品，藉由與實驗2-2、實驗3-2等相同之方法進行固結性試驗後，判定為「無固結」(-)。又，藉由與實驗5相同方法來試驗對水之溶解性後，判定為溶解性「良」。

依照本例之製造方法，能夠以約44%之高對澱粉產率來製造含有海藻糖二水合結晶之粉末。又，藉由本製造方法製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，相較於作為食品材料等而市售之習知食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『TREHA』、林原股份有限公司販賣)，於海藻糖純度雖無很大的不同，但相較於習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末為顯著地不易固結之粉末，且保存或操作容易。本品，就含有海藻糖之二水合結晶之粉末的方面，與習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末相同， 保存或操作容易，故可更適合作為食品材料、化粧品材料、準醫藥品材料、及醫藥品材料等使用。

[實施例4] <含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造>

除了使用樹薯澱粉作為原料澱粉，且使用以實驗1-2之方法得到之來自類芽孢桿菌Paenibacillus amylolyticus NBRC15957株之CGTase作為CGTase以外，係藉由與實施例1同樣之方法進行海藻糖生成反應及葡萄糖澱粉酶處理，藉以得到海藻糖純度、亦即以無水物換算之海藻糖含量為86.6%之反應液。將所得之反應液加熱使酵素失活，藉由一般方法活性碳脫色過濾，將濾液以陽離子交換樹脂(H⁺型)及陰離子交換樹脂(OH^-型)去鹽，減壓濃縮，成為固體成分濃度約86%之濃縮液。將其採入助晶罐，以試藥級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『海藻糖999』、編碼號：TH224、海藻糖純度99.9%以上、林原股份有限公司販賣)作為種晶添加1%，設為60℃，接著，將此含有海藻糖之溶液一邊溫和地攪拌，以由60℃至50℃花費8小時、由50℃至35℃花費8小時、由35℃至15℃花費8小時以冷卻之3階段擬控制冷卻法合計於24小時冷卻至15℃，藉以使海藻糖之二水合結晶晶析。以籃型離心分離機回收結晶，將結晶以相對於糖膏重量為約5%之精製水噴霧洗淨後，於50℃熟成、乾燥2小時，吹拂20℃之空氣20分鐘以冷卻，粉碎而以對澱粉產率約43% 得到以無水物換算含海藻糖99.4%、D-葡萄糖0.06%、4-O-α-葡萄糖基海藻糖0.04%、及、6-O-α-葡萄糖基海藻糖0.06%之含有海藻糖二水合結晶之粉末。

本含有海藻糖二水合結晶之粉末之海藻糖二水合結晶的結晶化度為93.3%、平均微晶直徑為3,28、粉末整體之還原力為0.13%。附言之，上述結晶化度之測定係以荷曼斯法進行，使用於實驗4-2求得之解析值H₁₀₀及H₀來進行。測定本品之粒度分布後，粒徑53μm以上、未達425μm之粒子為含80.7%、粒徑53μm以上、未達300μm之粒子為含74.4%、及、粒徑425μm以上之粒子為含7.1%。使用本品，藉由與實驗2-2、實驗3-2等相同之方法進行固結性試驗後，判定為「無固結」(-)。又，藉由與實驗5相同方法來試驗對水之溶解性後，判定為溶解性「良」。

依照本例之製造方法，能夠以約43%之高對澱粉產率來製造含有海藻糖二水合結晶之粉末。又，藉由本製造方法製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，相較於作為食品材料等而市售之習知食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『TREHA』、林原股份有限公司販賣)，於海藻糖純度雖無很大的不同，但相較於習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末為顯著地不易固結之粉末，且保存或操作容易。本品，就含有海藻糖之二水合結晶之粉末的方面，與習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末相同，保存或操作容易，故可更適合作為食品材料、化粧品材 料、準醫藥品材料、及醫藥品材料等使用。

[實施例5] <重組型CGTase及突變體CGTase之調製與使用該等之含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造>

使用將來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株之CGTase基因以大腸菌作為宿主表現而得之重組型(野生型)CGTase、與於該CGTase基因藉由一般方法導入部位特異性突變以調製之胺基酸序列中胺基酸殘基之1殘基取代為其他胺基酸殘基之突變體CGTase 2種，來取代實施例2中使用之來自同株之CGTase，進行含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造。

<重組型CGTase之調製>

使用本發明者等人由類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株中選殖而保有之來自同株的CGTase基因(具有序列表中以序列編號7所示之鹼基序列)，不改變其編碼之胺基酸序列而突變導入或缺失限制酵素部位等後，將其重組於表現用質體載體「pRSET-A」(Invitrogen公司製)，製成包含編碼天然型(野生型)CGTase之基因的表現用重組DNA。所得之重組DNA「pRSET-iPI」之構造如圖6所示。使用該重組DNA「pRSET-iPI」藉由一般方法使大腸菌BL21(DE3)(Stratagene公司製)轉形，取得保持該重組 DNA之轉形體「BL21-RSET-iPI」。接著，將該轉形體使用含有安比西林Na鹽100μl/ml之T培養基(培養基每1L含有Bacto-胰腖12g、Bacto-酵母萃取物24g、甘油5ml、17mM磷酸一鉀、72mM磷酸二鉀)於37℃好氣培養24小時。將離心分離培養液而得之菌體以超音波破碎器(商品名『Ultra Sonic Homogenizer UH-600』、MST股份有限公司製)進行破碎處理，對藉由離心分離而得之破碎液上清液測定CGTase活性(澱粉分解活性)，換算為培養液每1ml後，得到約12.8單位/ml之酵素活性。將破碎液上清液遵照一般方法進行硫酸銨鹽析、透析藉以得到重組型CGTase之粗酵素液後，進行使用了DEAE-Toyopearl 650S凝膠(Tosoh股份有限公司製)之陰離子交換管柱層析及使用了丁基-Toyopearl 650M凝膠(Tosoh股份有限公司製)之疏水管柱層析來精製，成為重組型CGTase之部分精製品。

<突變體CGTase之調製>

於上述來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株之天然型(野生型)CGTase基因中藉由一般方法導入部位特異性突變，將所得之突變CGTase基因於大腸菌中表現，藉以調製2種1胺基酸取代突變體CGTase。再者，於該CGTase中導入胺基酸取代時，避免對來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株之CGTase的胺基酸序列即序列表中以序列 編號1所示胺基酸序列之由第133號的天門冬胺酸殘基至第138號的組胺酸殘基(Asp133~His138)、由第223號的甘胺酸殘基至第231號的組胺酸殘基(Gly223~His231)、由第255號的麩胺酸殘基至第258號的白胺酸殘基(Glu255~Leu258)、及由第321號的苯丙胺酸殘基至第326號的天門冬胺酸殘基(Phe321~Asp326)、亦即，相當為於分類為α-澱粉酶家族之酵素群中共通保存之4個保留區域的胺基酸序列；與由第259號的甘胺酸殘基至第264號的天門冬胺酸殘基(Gly269~Asp264)、由第331號的離胺酸殘基至第337號的天冬醯胺酸殘基(Lys331~Asn337)、由第375的離胺酸殘基至第381號的離胺酸殘基(Lys375~Lys381)、及由第567號的纈胺酸殘基至第572號的酪胺酸殘基(Val567~Tyr572)、亦即，來自類芽孢桿菌屬微生物之CGTase所特有的前述(a)至(d)之部分胺基酸序列進行胺基酸取代突變，而由該等以外的部位來選擇突變部位。

基於上述方針，調製序列表中以序列編號1所示胺基酸序列中將第178號的甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之突變體CGTase(G178R)、與將第454號的酪胺酸殘基取代為組胺酸殘基之突變體CGTase(Y454H)2種。使用保持來自類芽孢桿菌Paenibacillus illinoisensis NBRC15379株之天然型(野生型)CGTase基因的重組DNA「pRSET-iPI」為模板，分別以具有序列表中序列編號8及9各所示之鹼基序列的合成寡核苷酸作為正意引子及反意引子，使用市售 之『QuiclkChange Site-Directed Mutagenesis Kit』(Stratagene公司製)以一般方法之PCR法、DpnI法於CGTase基因導入部位特異性突變藉以得到編碼突變體CGTase(G178R)之重組DNA「pRSET-iPI(G178R)」。又，分別以具有序列表中序列編號10及11各所示之鹼基序列的合成寡核苷酸作為正意引子及反意引子以外，以與上述同樣方式，得到編碼突變體CGTase(Y454H)之重組DNA「pRSET-iPI(Y454H)」。

分別使用保持突變體CGTase基因之重組DNA「pRSET-iPI(G178R)」及「pRSET-iPI(Y454H)」，藉由一般方法使大腸菌BL21(DE3)(Stratagene公司製)轉形，取得保持各自之重組DNA的轉形體「BL21-RSET-iPI(G178R)」及「BL21-RSET-iPI(Y454H)」。將該等轉形體以與上述「BL21-RSET-iPI」情況時同樣方式培養，使菌體破碎後，部分精製而得到各自之突變體CGTase之部分精製品。附言之，對各自的菌體破碎液上清液測定CGTase活性(澱粉分解活性)，換算為培養液每1ml的酵素活性後，於「BL21-RSET-iPI(G178R)」為約10.3單位/ml、於「BL21-RSET-iPI(Y454H)」為約13.7單位/ml。

<含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造>

除了使用上述得到之重組型(野生型)CGTase、作為突變體CGTase之G178R(具有序列表中序列編號12所示胺基酸序列之CGTase)、或Y454H(具有序列表中序列編號 13所示胺基酸序列之CGTase)以外，係藉由與實施例2同樣方法製造含有海藻糖二水合結晶之粉末。測定使用各自之CGTase而得之反應液中的海藻糖含量、所得之含有海藻糖二水合結晶之粉末中的糖組成、對澱粉產率、海藻糖二水合結晶之結晶化度、平均微晶直徑、粉末整體之還原力、粒度分布，而且對粉末進行與實驗2-2、實驗3-2等相同方法之固結性試驗及與實驗5相同方法之對水之溶解性試驗。結果整理如表6。

如表6所示，即使使用重組型CGTase或1胺基酸取代突變體CGTase的情況時，酵素反應液中之海藻糖含量亦為與天然型CGTase的情況同等之87.0%以上，依照同樣之製造方法，能夠以約44%~45%之高對澱粉產率來製造具有大致同等之海藻糖純度、結晶化度、粒度分布等之含有海藻糖二水合結晶之粉末。又，藉由本製造方法製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，與實施例1至4中使用天然型CGTase所製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末同樣地，相較於作為食品材料等而市售之習知食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『TREHA』、林原股份有限公司販賣)，於海藻糖純度雖無很大的不同，但相較於習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末為顯著地不易固結之粉末，且為保存或操作容易之粉末。

[實施例6]

除了於海藻糖二水合結晶之晶析步驟中，應用使用了通用之晶析系統用程式恆溫循環裝置，使經溫度控制之熱介質流入助晶罐之護套，使溫度由60℃至20℃，以近似於前述式[2]之20階段冷卻過程花費24小時冷卻之控制冷卻法，藉以使海藻糖二水合結晶晶析以外，係藉由與實施例2同樣方法製造含有海藻糖二水合結晶之粉末，以對澱粉產率約46%得到以無水物換算含有海藻糖99.7%、D-葡萄糖0.05%、4-O-α-葡萄糖基海藻糖0.03%、及6-O-α-葡萄糖基海藻糖0.05%之含有海藻糖二水合結晶之粉末。

本含有海藻糖二水合結晶之粉末之海藻糖二水合結晶的結晶化度為96.8%、平均微晶直徑為3,68、粉末整體之還原力為0.13%。附言之，上述結晶化度之測定係以荷曼斯法進行，使用於實驗4-2求得之解析值H₁₀₀及H₀來進行。測定本品之粒度分布後，粒徑53μm以上、未達425μm之粒子為含84.5%；粒徑53μm以上、未達300μm之粒子為含76.2%；及粒徑425μm以上之粒子為含6.4%。使用本品，藉由與實驗2-2、實驗3-2等相同之方法進行固結性試驗後，判定為「無固結」(-)。又，藉由與實驗5相同方法來試驗對水之溶解性後，判定為溶解性「良」。

依照本例之製造方法，能夠以約46%之高對澱粉產率來製造含有海藻糖二水合結晶之粉末。又，藉由本製造方法製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，相較於作為食品材料等而市售之習知食品級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『TREHA』、林原股份有限公司販賣)，於海藻糖純度雖無很大的不同，但相較於習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末為顯著地不易固結之粉末，且保存或操作容易。本品，就含有海藻糖之二水合結晶之粉末的方面，與習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末相同，保存或操作容易，故可更適合作為食品材料、化粧品材料、準醫藥品材料、及醫藥品材料等使用。

[比較例] <含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造>

除了使用來自嗜熱桿菌Tc-91株之CGTase酵素劑(林原股份有限公司製)作為CGTase以外，係與實施例1中同樣的方式進行海藻糖生成反應及葡萄糖澱粉酶處理後，葡萄糖澱粉酶處理後之反應液中以無水物換算的海藻糖含量為85.2%。將此反應液藉由一般方法以活性碳脫色過濾、將濾液以陽離子交換樹脂(H⁺型)及陰離子交換樹脂(OH^-型)去鹽，減壓濃縮，成為固體成分濃度約84%之濃縮液。將其採入助晶罐，以試藥級之含有海藻糖二水合結晶之粉末(商品名『海藻糖999』、編碼號：TH224、海藻糖純度99.9%以上、林原股份有限公司販賣)作為種晶添加1%，設為55℃。接著，將此含有海藻糖之溶液一邊溫和地攪拌，同時由55℃至15℃花費20小時自然冷卻，藉以使海藻糖之二水合結晶晶析。以籃型離心分離機回收結晶，將結晶以相對於糖膏重量為約5%之精製水噴霧洗淨後，於50℃熟成、乾燥2小時，吹拂20℃之空氣20分鐘以冷卻，粉碎而得到以無水物換算含有海藻糖98.5%、D-葡萄糖0.8%、4-O-α-葡萄糖基海藻糖0.07%、及6-O-α-葡萄糖基海藻糖0.1%之含有海藻糖二水合結晶之粉末，然其對澱粉產率為約38%。

本含有海藻糖二水合結晶之粉末之海藻糖二水合結晶的結晶化度為88.3%、平均微晶直徑為2,58、粉末整體之還原力為1.0%。附言之，上述結晶化度之測定係以荷曼斯法進行，使用於實驗4-2求得之解析值H₁₀₀及H₀來 進行。測定本品之粒度分布後，粒徑53μm以上、未達425μm之粒子為含74.4%；粒徑53μm以上、未達300μm之粒子為含69.4%；及粒徑425μm以上之粒子為含12.6%。使用本品，以與實驗2-2、實驗3-2等相同之方法進行固結性試驗後，判定為「稍有固結」(±)。又，藉由與實驗5相同方法來試驗對水之溶解性後，判定為溶解性「良」。

[產業上之可利用性]

如以上所述，依照本發明之含有海藻糖二水合結晶之粉末之製造方法，以澱粉為原料，以高的對澱粉產率來製造與習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末同樣地高純度、且不易固結之含有海藻糖二水合結晶之粉末。特別是海藻糖二水合結晶之晶析步驟中應用控制冷卻法或擬控制冷卻法時，能夠以更高的對澱粉產率來製造更高純度之含有海藻糖二水合結晶之粉末。如此之本發明之製造方法，能夠以雖豐富地存在但仍有仍為受限制資源之澱粉為原料，更有效率地以工業規模製造含有海藻糖二水合結晶之粉末，其產業上之有用性出色。又，藉由應用控制冷卻法或擬控制冷卻法之本發明之製造方法來製造之含有海藻糖二水合結晶之粉末，相較於習知之食品級含有海藻糖二水合結晶之粉末為顯著地不易固結之粉末，具有可作為操作更容易之粉末狀食品材料、化粧品材料、準醫藥品材料、或醫藥品材料，使用於各種用途之優越的產業上可利 用性。發揮如此顯著作用效果之本發明在產業上之有用性極大。

<110> Havashibara Co.,Ltd.

<120> Process for producing a particulate composition comprising crystalline alpha,alpha-trehalose di-hydrate

<130> 124302

<160> 13

<210> 1

<211> 682

<212> PRT

<213> Paenibacillus illinoisensis

<400> 1

<210> 2

<211> 683

<212> PRT

<213> Paenibacillus pabuli

<400> 2

<210> 3

<211> 682

<212> PRT

<213> Paenibacillus amylolyticus

<400> 3

<210> 4

<211> 680

<212> PRT

<213> Geobacillus stearothermophilus

<400> 4

<210> 5

<211> 686

<212> PRT

<213> Bacillus macerans

<400> 5

<210> 6

<211> 681

<212> PRT

<213> Thermoanaerobacter thermosulfurigenes

<400> 6

<210> 7

<211> 2154

<212> DNA

<213> Paenibacillus illinoisensis

<400> 7

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sense primer for PCR

<400> 8

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antisense primer for PCR

<400> 9

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sense primer for PCR

<400> 10

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antisense primer for PCR

<400> 11

<210> 12

<211> 682

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mutated CGTase(G178R)

<400> 12

<210> 13

<211> 682

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mutated CGTase(Y454H)

<400> 13

Claims (5)

1. 一種含有 α, α-海藻糖二水合結晶之粉末，其具有如下述之(1)~(4)之特徵：(1)以無水物換算含有 α, α-海藻糖99.0質量%以上；(2)含有4-O- α-葡萄糖基海藻糖及6-O- α-葡萄糖基海藻糖；(3)基於粉末X射線繞射輪廓而算出之 α, α-海藻糖二水合結晶的結晶化度為90.0%以上、96.8%以下；及(4)粉末整體具有還原力。
2. 如請求項1之含有 α, α-海藻糖二水合結晶之粉末，其中，前述4-O- α-葡萄糖基海藻糖之含量，為0.03質量%以上，且前述6-O- α-葡萄糖基海藻糖之含量，為0.05質量%以上。
3. 如請求項2之含有 α, α-海藻糖二水合結晶之粉末，其中，前述4-O- α-葡萄糖基海藻糖之含量，為0.06質量%以下，且前述6-O- α-葡萄糖基海藻糖之含量，為0.10質量%以下。
4. 如請求項1~3中任一項之含有 α, α-海藻糖二水合結晶之粉末，其中進一步地，前述含有 α, α-海藻糖二水合結晶之粉末，含有粉末整體的80質量%以上之粒徑53μm以上、未達425μm之粒子，含有粉末整體的60質量%以上之粒徑53μm以上、未達300μm之粒子。
5. 如請求項1~4中任一項之含有 α, α-海藻糖二水合結晶之粉末，其中，粉末整體之還原力為0.5質量%以下。