본 발명은 포유류의 유핵세포로부터 유래되고 상기 세포보다 작은 마이크로베시클을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 포유류 유핵세포는 단핵구(monocyte), 대식 세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cell), 및 줄기 세포(stem cell)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 포유류의 유핵세포는 줄기 세포에서 분화된 세포로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 ‘마이크로베시클’은 포유류의 유핵세포에서 인위적으로 제조된 베시클로서, 자연적으로 분비되는 ‘쉐딩 마이크로베시클’과 구별된다. 본 발명의 ‘마이크로베시클’은 유래한 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분 등을 가지고 있으며, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 쉐딩 마이크로베시클은 세포가 자연적으로 분비하는 베시클로서, 유래한 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분을 가지고 있는 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미한다.
본 발명의 마이크로베시클은 포유류의 유핵세포를 포함하는 현탁액을 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 및 화학 물질 처리로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용하여 제조할 수 있으나 이제 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클 의 막이 상기 포유류의 유핵세포의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포막 이외의 성분으로서 표적유도 물질(targeting molecule), 표적세포와의 세포막 융합에 필요한 물질(fusogen), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 폴리에틸렌글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 세포막 이외의 성분은 다양한 방법에 의해 추가될 수 있으며, 세포막의 화학적 변형 등을 포함한다.
예를 들어, 상기 마이크로베시클의 막 성분이 티올기(-SH) 또는 아민기(-NH2)를 이용한 화학적 방법으로 변형되거나, 상기 마이크로베시클에 폴리에틸렌글리콜을 화학적으로 결합시킴으로써 상기 마이크로베시클의 막 성분이 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클 제조시 상기 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클의 막 성분을 화학적으로 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 유핵세포로부터 유래되고, 상기 세포보다 그 크기가 작으며, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 마이크로베시클을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 포유류 유핵세포는 특이 세포 또는 조직 등으로 유도가 가능한 세포, 질병 치료용 또는 진단용 물질을 발현하는 세포 등을 포함한다.
또한 본 발명의 포유류 유핵세포는 형질전환된 세포를 포함한다. 구체적으로, 상기 형질전환된 세포는 치료, 진단, 표적유도 물질, 또는 표적세포와의 세포막 융합에 필요한 물질을 발현하도록 형질전환된 세포; 및 이들의 2개 이상의 조합으로 이루어진 형질전환된 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 포유류의 유핵세포는 물질 처리 또는 유전자 도입에 의해 형질전환된 것일 수 있으며, 2회 이상 형질전환된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 일 구현예에서, 상기 포유류의 유핵세포가, 하나 이상의 특정 단백질의 발현을 억제하도록 형질전환된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 일 구현예에서, 상기 포유류의 유핵세포가, 세포 접합 분자, 항체, 표적유도 단백질, 세포막융합 단백질 자체, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 유핵세포로부터 유래되고, 상기 세포보다 그 크기가 작으며, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 쉐딩 마이크로베시클을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 로딩되는 물질은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 치료용 및/또는 진단용 물질일 수 있으며, 상기 포유류 유핵세포 또는 형질전환된 유핵세포가 발현하고 있는 물질이 로딩될 수도 있으며 필요에 따라 상기 포유류 유핵세포에서 유래하지 않고 세포 외부에서 준비된 물질을 로딩할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질은 상기 유핵세포에서 유래된 것 및 세포외부에서 주입된 것 등을 포함한다. 또한 로딩되는 물질은 1개 일수도 있고 2개 이상일 수도 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클은 사이토카인, 성장인자, 항체, 표적유도 단백질, 세포막융합 단백질 자체, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 발현하는 세포 또는 발현하도록 형질전환된 세포에서 준비될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 물질들을 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클의 표면에 물리, 화학, 및/또는 생물학적 방법으로 로딩할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포에 존재하지 않는 치료 및/또는 진단을 위한 다양한 물질을 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 다음과 같이 여러 가지 방법으로 로딩할 수 있다:
첫째, 치료 또는 진단을 위한 다양한 물질을 이미 로딩한 세포로부터 마이크로베시클을 제조한다. 예를 들어, 치료 및 진단을 위한 다양한 물질을 배양액에 포함시켜서 세포를 배양하면 상기 물질이 로딩된 세포를 수득할 수 있으며, 또는, 전기 천공 방법으로 세포에 물질을 로딩할 수도 있다. 이러한 세포로부터 자연적으로 분비되는 쉐딩 마이크로베시클 또는 초음파 분해, 압출, 기계적 분해 등의 방법으로 제조한 마이크로베시클에는 상기 물질이 로딩되어 있다.
둘째, 마이크로베시클의 제조 과정에서 상기 물질을 마이크로베시클에 로딩한다. 예를 들어, 세포가 포함된 용액에 상기 물질을 첨가한 후 세포보다 크기가 작은 필터를 통과시키는 압출법으로 마이크로베시클을 제조하면 마이크로베시클에 상기 물질이 로딩된다.
셋째, 쉐딩 마이크로베시클 또는 마이크로베시클을 제조한 후에 상기 물질을 로딩할 수 있다. 예를 들어, 다양한 물질을 현탁액에 포함시켜서 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클과 배양하거나 또는 전기 천공 방법으로 이미 제조한 쉐딩 마이크로베시클 또는 마이크로베시클에 물질을 로딩할 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용될 수 있는 물질을 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 로딩하는 방법은 상기예들에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 치료용 및/또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제(angiogenesis inhibitor), 펩타이드(peptide), 단백질(protein), 독소(toxin), 핵산(nucleic acid), 비드(bead), 마이크로입자(microparticle) 및 나노 입자(nanoparticle)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 또는 자기 비드(magnetic bead)를 포함하는 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 형광을 방출하는 물질 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 형광을 방출하는 물질이 형광단백질 또는 양자점(quantum dot, Qdot)일 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 항암제일 수 있다.
본 발명의 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클은 특정 세포 또는 조직 등으로 유도가 가능한 베시클을 포함한다. 상기 특이 조직은 혈관, 암 또는 염증 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 '암'이란 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하고, 주변 조직으로 침윤할 수 있는 특징을 갖는 질병군을 말한다. 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암 등의 상피세포 등에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암 등의 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma), 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 조혈세포에서 유래하는 혈액암, 신경조직에 발생하는 종양 등으로 이루어진 군으로부터 본 발명이 치료하려는 표적이 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 '혈관질환'은 혈관내 혹은 혈관벽에 대사성, 감염성, 독성, 또는 면역성 원인에 의해 혈관내 혹은 혈관벽에 장애가 발생하는 질환군이다. 동맥경화증(혹은 죽상경화증), 협심증, 급성 심근경색, 뇌졸증, 혈관성치매, 그외 허혈성 혈관질환 등의 대사성 혈관질환, 패혈증, 전신성파종성혈관내혈액응고(disseminated intravascular coagulation), 혈전/색전증, 혈관염, 사구체신염, 급성호흡부전증후군, 폐기종 등의 감염성, 독성, 또는 면역성 혈관질환 등으로 이루어진 군으로부터 본 발명이 치료하려는 표적이 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 '염증'은 체액이 조직 세포 사이에 증가하여 나타나는 부종, 혈관확장에 따른 충혈, 발열물질과 혈관확장에 의한 발열, 아라키돈산 대사산물에 의한 통증 현상 등과 같은 증상 또는 징후로 나타나고, 시간에 따라 급성, 아급성, 만성 염증으로 분류할 수 있고, 병태생리에 따라 감염성, 알레르기성, 자가면역성, 독성, 대사성, 외상성 염증질환으로 분류할 수 있다. 비염, 부비동염, 중이염, 비인두염, 후두염, 기관지염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 폐섬유화증 등의 호흡기계 염증질환, 구강염, 식도염, 위염, 소화성궤양, 과민성장증후군, 염증성장질환, 담낭염, 담도염, 췌장염, 간염 등의 소화기계 염증질환, 아토피피부염, 건선 등의 피부 염증질환, 심내막염, 심근염, 심낭염, 혈관염, 동맥경화증, 패혈증 등의 심혈관계 염증질환, 갑상선염, 부갑상산염, 당뇨병, 등의 내분비계 염증질환, 사구체신염, 신병증, 간질성 신질환, 고환염, 난소염, 자궁내막염, 질염 등의 비뇨생식계 염증질환, 류마티스관절염, 척추관절병증, 골관절염, 통풍, 전신성홍반성루프스, 전신성경화증, 근병증, 쇼그렌증후군, 베체트병, 항인지질증후군 등의 근골격계 염증질환, 혈관성치매, 알츠하이머병, 퇴행성뇌질환, 우울증, 정신분열증 등의 뇌정신계 염증질환 등으로 이루어진 군으로부터 본 발명이 치료하려는 표적이 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 상기 약제학적 조성물은 상기 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자 또는 나노 입자 중 1종 이상의 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 흡입제로 제제화하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로서 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.1 ~ 1000 ㎎/일, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.
본 발명에서 '개체'란, 암, 혈관질환, 또는 염증질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 본 발명에 따른 마이크로베시클을 포함하는 질병 치료용 및/또는 진단용 물질 전달용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 질병 치료용 및/또는 진단용 물질을 조직 또는 세포 특이적으로 전달하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 본 발명에 따른 마이크로베시클을 포함하는, 질병 치료용 및/또는 진단용 물질 전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 유핵세포로부터 유래되고 상기 세포보다 작은 쉐딩 마이크로베시클을 포함하는, 치료용 또는 진단용 물질 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 포유류의 유핵세포 유래 쉐딩 마이크로베시클을 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 물질 전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 상기 포유류 유핵세포 유래 마이크로베시클의 제조 방법을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 제조 방법의 일 구현예는 하기 단계들을 포함한다: 포유류의 유핵세포를 포함하는 현탁액을 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 및 화학 물질 처리로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용하여 마이크로베시클을 제조하는 단계; 상기 현탁액으로부터 제조된 마이크로베시클을 분리하는 단계; 및 상기 분리된 마이크로베시클을 포함하는 현탁액에 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계.
상기 본 발명에 따른 제조 방법의 또 다른 구현예는 하기 단계들을 포함한다: 포유류의 유핵세포를 포함하는 현탁액에 질병 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양시켜 상기 포유류의 유핵세포에 상기 치료용 또는 진단용 물질을 로딩시키는 단계; 및 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 포유류의 유핵세포를 포함하는 현탁액을 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 및 화학 물질 처리로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용하여 마이크로베시클을 제조하는 단계.
상기 본 발명에 따른 제조 방법의 또 다른 구현예는 하기 단계들을 포함한다: 포유류의 유핵세포를 포함하는 현탁액에 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 상기 포유류의 유핵세포와 치료용 또는 진단용 물질을 포함하는 혼합 현탁액을 수득하는 단계; 및 상기 혼합 현탁액을 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 및 화학 물질 처리로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용하여 마이크로베시클을 제조하는 단계.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 상기 포유류 유핵세포 유래 쉐딩마이크로베시클의 제조 방법을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 제조 방법의 일 구현예는 하기 단계들을 포함한다: 포유류의 유핵세포를 포함하는 현탁액에서 쉐딩 마이크로베시클을 분리하는 단계; 및 상기 분리된 쉐딩 마이크로베시클을 포함하는 현탁액에 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계.
상기 본 발명에 따른 제조 방법의 또 다른 구현예는 하기 단계들을 포함한다: 포유류의 유핵세포를 포함하는 현탁액에 질병 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양시켜 상기 포유류의 유핵세포에 상기 치료용 또는 진단용 물질을 로딩시키는 단계; 및 상기 배양액으로부터 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 쉐딩 마이크로베시클을 분리하는 단계.
상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 로딩된 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클의 제조 방법은, 상기 처리에 의하여 제조된 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 포함하는 현탁액으로부터 상기 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 로딩된 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 분리 단계는 밀도 구배(density gradient), 초원심분리(ultracentrifugation), 여과(filtration), 투석(dialysis) 및 자유 유동 전기이동법(free-flow electrophoresis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 본 발명의 제조 방법은 상기 마이크로베시클의 막에 상기 원형질체의 세포막 이외의 성분을 추가로 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 추가되는 성분은 사이클로덱스트린 및 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.
또한 상기 본 발명의 제조 방법은 마이크로베시클의 막 성분을 화학적으로 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 화학적 변형 방법은 전술한 바와 같다.
또한 상기 본 발명의 제조 방법은 상기 포유류의 유핵세포의 세포막과 비교하여 토폴로지가 변형된 막을 갖는 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 유핵세포에서 유래하며 상기 세포보다 크기가 작으며, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 상기 본 발명의 마이크로베시클을 사용하는 것을 포함하는, 치료용 또는 진단용 물질을 특이 세포 또는 조직에 전달하는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명의 마이크로베시클을 사용하여 질병 치료용 또는 진단용 물질을 표적 세포 또는 조직으로 전달하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 일 구현예에서, 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질을 특이 세포 또는 조직에 전달할 수 있다.
예를 들어, 상기 마이크로베시클에 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 함께 로딩되어 있는 것을 사용하여 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 1가지 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 마이크로베시클, 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 마이크로베시클, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 마이크로베시클을 사용하여 상기 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있다. 예를 들어, 상기 2 개 이상의 마이크로베시클을 동시에 투여할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 1가지 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 마이크로베시클, 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 마이크로베시클, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 마이크로베시클을 순차적으로 투여하여 상기 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있다.
또한 본 발명은 질병 치료용 및/또는 진단용 물질이 로딩된 포유류 유핵세포 유래 쉐딩 마이크로베시클을 사용하는 것을 포함하는, 치료용 또는 진단용 물질을 특이 세포 또는 조직에 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 유핵세포에서 유래하며 상기 세포보다 크기가 작으며, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 상기 본 발명의 마이크로베시클을 사용하여 상기 치료용 또는 진단용 물질을 특이 세포 또는 조직에 전달하는 것을 포함하는, 질병의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 유핵세포에서 유래하며 상기 세포보다 크기가 작으며, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 쉐딩 마이크로베시클을 사용하여 상기 치료용 또는 진단용 물질을 특이 세포 또는 조직에 전달하는 것을 포함하는, 질병의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 유핵세포에서 유래하고, 상기 세포보다 크기가 작으며, 질병의 진단에 필요한 프라이머, 프로브, 안티센스 핵산 또는 항체가 로딩된 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 포함하는 질병 진단용 키트를 제공한다.
[마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 이용한 물질 전달]
본 발명에서는 특정 조직으로 유도되는 세포에서 유래한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 사용하거나 표적 단백질을 발현한 형질전환 세포에서 유래한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 사용할 수 있다. 이에 더해, 상기 세포와 형질전환 세포에 세포막융합 물질이 발현하도록 형질전환된 세포에서 유래한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 사용할 수 있다.
혈액에 존재하는 인체 면역 체계의 단핵구, 단핵구에서 유래한 대식 세포 및 수지상 세포와 줄기 세포 등은 암 조직 및 염증 조직으로 유도된다는 것이 알려져 있다. 따라서, 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포와 줄기 세포 등의 세포막으로 이루어진 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클은 암 조직 및 염증 조직으로 유도된다. 특정 세포나 조직에 특이적으로 발현된 기질에 선택적으로 결합하는 단백질을 발현하도록 형질전환시킨 세포에서 유래한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클은 특정 세포나 조직으로 유도된다. 이에, 본 발명에서는, 이러한 세포로부터 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 제조하고, 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 치료 또는 진단을 위한 물질을 로딩하여 이 물질을 표적한 세포, 조직이나 혈액에 전달한다.
단핵구, 대식 세포, 수지상 세포와 줄기 세포 등이 특정조직으로 유도될 때 세포막에 존재하는 다양한 세포막 단백질(plasma membrane protein)들이 관여한다. 예를 들어, 단핵구 세포 표면에는 LFA-1(leukocyte function-associated antigen-1), Mac-1(macrophage-1 antigen) 등의 인테그린(integrin)을 포함한 다양한 세포 접합 분자(cell adhesion molecule)들이 존재한다. 이들 세포 접합 분자는 혈관 세포 표면에 존재하는 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1) 등의 세포 접합 분자와 결합할 수 있다. 단핵구는 LFA-1과 같은 세포 접합 분자를 이용해 혈관 세포 표면에 발현된 ICAM-1과 같은 세포막 단백질과 상호작용하여, 혈관 내피세포를 통과하여 염증 조직 및 암 조직으로 유도된다.
세포를 형질전환하여 암 또는 조직 특이적 세포막 단백질을 세포 표면에 발현시켜 혈관, 암조직과 염증조직을 포함한 다양한 조직으로 유도할 수 있다. 예를 들어, 유방암 조직의 세포 표면에는 ERBB2 세포막 단백질이 과다발현된다. T세포에 존재하는 T세포 수용체(T-cell receptor, TCR)의 형질전환을 통해 암세포 특이적 전달이 가능하다. TCR의 세포 외부 부분에 ERBB2 단백질을 인지할 수 있는 항체와 세포 내부 부분에 TCR의 세포내 신호 전달이 가능하도록 CD3 ζ(zeta) 단백질을 융합한 융합 단백질(fusion protein)을 발현시키도록 형질전환한 T세포는 유방암 조직으로 유도된다. 또한, 대장암, 췌장암, 폐암 등에서 과다발현되는 암배아항원(carcinoembryonic antigen, CEA)를 인지하는 항체와 CD3 ζ 단백질을 융합한 융합 단백질을 발현시키도록 형질전환한 T세포는 대장암, 췌장암, 폐암 조직으로 유도된다.
특정 조직이나 세포로 유도되는 세포 자체를 이용하여 특정 표적에 약물을 전달하는 목적에 이용하려면 전달하려는 물질 때문에 세포가 크게 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 독소루비신은 독성이 너무 강하기 때문에 전달을 담당할 세포가 죽는 문제가 있다.
세포 전체를 이용하지 않고 세포에서 유래한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 사용한다면 이 문제를 피할 수 있다. 세포에서 유래한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클은 세포막 단백질을 비롯한 세포막 성분들이 원래 세포와 유사하거나 사실상 동일하기 때문에 원래 세포가 표적하는 동일한 특정 조직이나 세포로 유도된다. 필요한 경우 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 제조하는 과정에서 핵산 분해 효소 등을 첨가하여 치료용 또는 진단용 물질 전달에 필요가 없는 핵산 등을 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클 내부에서 제거할 수 있다.
[마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클 및 그의 제조]
본 발명에서 ‘마이크로베시클’은 포유류의 유핵세포에서 인위적으로 제조된 베시클로서, 유래한 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분을 가지고 있으며, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 쉐딩 마이크로베시클은 세포가 자연적으로 분비하는 베시클로서, 유래한 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분을 가지고 있는 원래 세포보다 크기가 작은 것을 말한다.
세포로부터 제조되는 마이크로베시클은 기존의 리포좀처럼 다양한 크기로 쉽게 만들 수 있으며, 전달하고자 하는 다양한 치료용 또는 진단용 물질을 쉽게 로딩시킬 수 있어 한가지 또는 여러 가지 물질을 전달할 수 있으므로 단독 치료, 병합 치료, 진단 뿐만 아니라 진단과 치료의 두 가지 목적으로 사용하는 진단-치료(theragnosis, pharmacodiagnosis)에 이용할 수 있다. 이때 전달하고자 하는 다양한 물질은 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 내포(encapsulated)되어 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클의 이중막의 안쪽에 존재할 수도 있고, 세포막 단백질처럼 상기 물질의 전부 또는 일부가 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클의 이중막에 묻혀 있거나 끼워져(embedded) 있을 수도 있고, 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클 표면에 결합되어 있을 수도 있다.
또한 암 혈관을 통해 암 조직에 어떠한 물질이 전달될 때, 일반적으로 100 nm이상의 물질은 EPR(enhanced permeability and retention) 효과에 의해 암 조직에 오래 머무를 수 있다. 따라서 100 nm보다 큰 마이크로베시클에 로딩된 약물은 암 조직에 머무를 수 있는 시간이 길어서 약물의 효과를 극대화할 수 있어 진단 및 치료에 유용하다. 또한 폐 조직은 그 구조상 1 μm 이하 크기의 입자만이 흡입을 통해 폐포까지 전달될 수 있으므로, 1 μm 이하 크기의 마이크로베시클에 천식 등의 치료를 위한 염증억제제 등의 물질을 로딩하여 폐 조직에 효과적으로 약물을 전달할 수 있다. 이와 같이 마이크로베시클 크기는 진단용 또는 치료용 물질이 필요한 조직에 따라 다양한 크기로 제조될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 마이크로베시클의 크기는 10 nm 이상 10 μm 이하일 수 있다.
본 발명의 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 치료용 및/또는 진단용 물질을 로딩하여 ‘개체’에 투여하기 위해서 자가 유래 세포에서 제조한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 사용할 수 있다. 다른 개체에서 유래한 세포를 사용하면 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)의 차이로 인해 면역 반응을 유발할 수 있다. 하지만 자가 유래 세포로부터 제조한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클은 이러한 면역 반응을 유발하지 않는다. 자가 유래 세포를 사용하는 대신 MHC가 적합한 타가 유래 세포를 사용해서 면역 반응의 유발을 피할 수도 있다. 또한, 다른 개체에서 유래한 세포를 이용해 만든 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클도 면역 반응 문제가 없다면 사용 가능하다. 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클이 면역 반응을 일으키는 경우에도 면역 억제제와 같이 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 모든 세포로부터 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 제조할 수 있으며, 예를 들어, 특정 세포 또는 조직 등의 표적으로 유도되도록 형질전환 가능한 포유류의 유핵세포로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 세포(in vitro cell)로서 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포 및 간엽 줄기 세포를 포함한 시험관 내에서 배양 가능한 모든 세포일 수 있으며, 생체 내 세포(in vivo cell)로서는 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포, 골수 유래 간엽 줄기 세포, 지방 유래 간엽 줄기 세포 및 기타 줄기 세포, 암 조직 또는 염증 조직에서 채취한 세포 또는 조직에서 유래한 세포 등을 이용할 수 있다.
특정 조직으로 물질을 전달하기 위해 특정 조직으로 유도되는 세포 또는 형질전환한 세포에서 유래한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 사용할 수 있다. 예를 들어, 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포 및 줄기 세포 등에서 제조한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클은 암 조직 또는 염증 조직으로 유도된다. 특정 조직으로 유도가 되는 단백질을 과다발현하거나 비특이적(non-specific) 유도에 관여하는 단백질의 발현을 감소시킨 또는 이들을 조합한 형질전환한 세포에서 유래한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클은 암 조직 또는 염증 조직으로 효과적으로 유도된다.
세포의 형질전환은 세포에 자극을 주어 단백질 등 물질 발현을 증가 또는 변화시키는 방법과 유전자 도입을 통한 단백질 발현 증가 또는 발현 억제 시키는 방법으로서 당업계에서 통상 사용되는 방법들을 사용할 수 있다. 세포에 특정 자극을 주어 단백질 발현의 변화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 인간 배꼽 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에 TNF-a를 처리하면 세포막에 ICAM-1의 발현이 증가된다[J. Exp. Med. 177; 1277-1286 (1993)]. 단핵구에 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 처리하면 세포막 단백질인 LFA-1이 활성화(activation)된다[J. Exp. Med. 163; 1132-1149 (1986)]. 유전자 도입을 통한 세포의 형질전환을 통해 특정 단백질을 발현시키거나 혹은 억제시킬 수 있다. 특정 단백질의 발현을 증가시키는 방법은 플라스미드(plasmid) DNA, RNA또는 바이러스(virus)를 [PNAS. 90 (18); 8392-8396 (1993)] 이용할 수 있으며, 인산 칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation) [Current Protocols in Cell Biology 20.3.1-20.3.8 (2003)], 리포펙타민 유도(lipofectamine mediated) [PNAS. 84 (21); 7413-7417 (1987)], 전기 천공(electroporation) [Nucleic Acids Research. 15 (3) 1311-1326 (1987)], 미량주사법(microinjection) [Mol Cell Biol. 2(9); 1145-1154 (1982)], 초음파 유도(ultrasound mediated) [Human Gene Therapy. 7(11); 1339-1346 (1996)] 등의 방법뿐만 아니라 일반적으로 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다.
암세포, 암조직, 혈관 또는 염증조직 등에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 또는 항체를 세포 표면에 직접 발현하거나 융합 단백질로 발현시키고 이 세포로부터 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 제조할 수 있다. 또한, 치료용 및/또는 진단용 물질을 발현하는 세포 또는 발현하도록 형질전환된 세포로부터 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 제조할 수 있다. 또한, 상기의 조합 물질이 발현하거나 발현하도록 형질전환된 세포에서도 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 제조할 수도 있다. 특정 단백질의 발현을 억제시키기 위해서, miRNA, siRNA, 안티센스(antisense) RNA, LNA, PNA 등을 이용할 수 있다. 어떤 세포에서 유래한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클이 두 가지 표적으로 유도되는 경우 그 세포에서 한 가지 또는 여러 가지 특정 단백질의 발현을 억제시켜서 한 가지 표적으로의 유도를 감소시켜서 물질 전달의 특이성을 높일 수 있다. 또는, 2회 이상 형질전환한 세포를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 1차 형질전환한 세포를 2차 형질전환하여 사용할 수 있다.
단핵구, 대식 세포, 수지상 세포 및 줄기 세포 등의 세포가 자연적으로 분비하는 쉐딩 마이크로베시클을 분리하여 사용할 수 있다. 상기 치료용 또는 진단용 물질을 로딩한 세포에서 분비되는 쉐딩 마이크로베시클을 분리할 수도 있고, 쉐딩 마이크로베시클을 분리한 후에 쉐딩 마이크로베시클에 물질을 로딩할 수도 있다. 사이토칼라신 D(cytochalasin D), LPA(lysophosphatidic acid), 트롬빈(thrombin), ATP(adenosine triphosphate)와 KCl같은 물질을 처리하여 세포에서 자연적으로 분비되는 쉐딩 마이크로베시클의 분비를 촉진할 수 있다. 사이토칼라신 D를 처리할 경우, 세포 표면의 액틴(actin)의 구조를 변화시켜 세포막에서 쉐딩 마이크로베시클의 분비를 촉진한다. 세포를 배양하는 현탁액의 흐름 등으로 세포와 현탁액이 상대적으로 움직이게 하여 쉐딩 마이크로베시클의 형성을 더욱 촉진할 수도 있다. 하지만, 본 발명의 제조 방법이 이것들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 마이크로베시클은 다양한 기계적, 전기적, 화학적 방법으로도 제조될 수 있다. 삼투압을 이용한 세포 용해, 전기 천공(electroporation), 초음파 분해(sonication), 균질화(homogenization), 세제(detergent) 처리, 냉동-해동(freeze-thaw), 압출(extrusion), 기계적 분해, 화학 물질 처리 등의 방법을 사용할 수 있으나, 본 발명의 제조 방법이 이것들로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 세포가 들어있는 용액에 금속, 세라믹, 또는 충분히 딱딱한 플라스틱 공을 넣고 흔들어서 세포를 기계적인 방법으로 분해할 수도 있다. 압출하여 마이크로베시클을 제조하는 경우에는 구멍 크기가 큰 필터에서 작은 필터로 세포를 포함한 용액을 차례로 통과시켜 세포가 적당한 크기로 부숴지게 할 수 있다. 예를 들어, 구멍 크기가 10 μm → 5 μm → 1 μm의 순서로 작아지는 필터 3개를 차례로 사용하여 마이크로베시클을 제조할 수 있다.
[치료용 또는 진단용 물질]
본 발명에서는 세포 또는 형질전환된 포유류의 유핵세포가 발현하고 있는 물질을 사용하거나 필요에 따라 상기 포유류 유핵세포에서 유래하지 않고 세포 외부에서 준비된 물질을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 로딩할 수 있는 포유류 유핵세포 유래 상기 치료용 또는 진단용 물질로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 단백질 또는 펩타이드, 핵산, 지질 및 세포 대사산물 등 다양한 종류의 물질이 제한없이 사용될 수 있다.
상기 단백질 또는 펩타이드는 VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor) 등과 같은 성장 인자, IL-1, IFN-gamma, IL-10과 같은 사이토카인(cytokine) 류, 각종 항체 치료제, 수용체, 형광 단백질 및 다양한 펩타이드 또는 단백질을 제한없이 사용할 수 있다. 상기 단백질 또는 펩타이드는 세포 내에 발현 될 수도 있으며 세포막에 디스플레이(display)에 될 수도 있으며 전체 또는 활성을 보이는 부위가 단독 또는 융합 단백질 형태로 발현될 수도 있다. 특히, 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클 표면에 로딩된 단백질 또는 펩티드는 단독으로 존재하는 경우보다 국소 농도(local concentration)가 높아 단독으로 존재하는 경우보다 활성이 높음이 잘 알려져 있다. 이러한 단백질 또는 펩티드는 리간드로서 작용해 세포에 신호전달을 할 수 있거나 다양한 리간드의 기능을 저해하는 데 이용할 수 있으나, 상기예에 의해 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 로딩할 수 있는 핵산으로서 DNA, miRNA, siRNA, 안티센스 RNA, 센스(sense) RNA를 사용할 수 있으나 이것들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 핵산은 센스 효과, 안티센스 효과, RNA 간섭 및 단백질의 기능 저해 등의 목적으로 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포유류 유핵세포에서 유래하지 않는 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 포함시킬 수 있는 치료용 또는 진단용 물질로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자 및 나노 입자 등 다양한 종류의 물질이 제한없이 사용될 수 있다.
상기 항암제는 암의 성장과 전이를 억제시키기 위해 사용되는 모든 약제를 총칭하며, 대부분의 항암제는 암세포의 DNA의 복제, 전사, 번역 과정을 차단한다. 본 발명의 치료용 물질로 사용될 수 있는 항암제의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 항암제는 암세포의 종류, 항암제의 흡수 속도(치료기간과 항암제 투여 경로), 종양의 위치, 종양의 크기 등의 항암제 선택시 고려하는 일반적인 원칙하에 선택될 수 있다. 상기 본 발명에서 사용될 수 있는 항암제는 DNA 알킬제(DNA alkylating agent)인 메칠로에타민(mechloethamine), 클로람부실(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 시크로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin) 등이 사용될 수 있고, 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)인 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin) 및 C 블레오마이신(C Bleomycin) 등이 사용될 수 있으며, 식물 알카로이드(plant alkaloid)인 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 다노루비신(daunorubicin), 탁솔(taxol), 온코빈(oncovin), 프레드니손(prednisone), 시스플라틴(cisplatin), 허셉틴(herceptin), 리툽시맵(rituximab), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테산(topotecan) 및 이리도테산(iridotecan) 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방사성 물질들을 이용할 수도 있다. 그러나 본 발명에서 사용될 수 있는 항암제가 상기 예들에 의해 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 로딩될 수 있는 항염증제는 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 이부프로펜(ibuprofen), 클로베타졸 프로피오네이트(clobetasol propionate), 디팔오르손 디아세테이트(diflorasone diacetate), 할로베타솔 프로피오네이트(halobetasol propionate), 암시온니드(amcinonide), 플루시온니드(fluocinonide), 모메타손 푸로에이트(mometasone furoate), 데옥시메타손(desoximetasone), 디클로페낙(diclofenac) 및 피록시캄(piroxicam)등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 본 발명에서 사용될 수 있는 항염증제가 상기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
상기 혈관신생 저해제는 기존 혈관에서 새로운 혈관이 만들어지는 과정을 억제하기 위해 사용되는 모든 약제를 총칭하며, 대부분의 혈관신생 저해제는 암의 성장과 전이를 억제하고 염증 반응을 억제할 수 있다. 본 발명의 치료용 물질로 사용될 수 있는 혈관신생 저해제의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 치료용 또는 진단용 물질로서 단백질 또는 펩타이드를 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 후술하는 실시예에서 사용한 RNase A 뿐만 아니라, VEGF, EGF 등과 같은 성장 인자, IL-1, IFN-gamma, IL-10과 같은 사이토카인 류, 각종 항체 치료제, 다양한 펩타이드 또는 단백질, DNase 이 외에 암의 성장과 전이를 억제하고 염증반응을 억제할 수 있는 다양한 단백질 및 펩타이드를 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 치료용 또는 진단용 물질로서 독소를 포함시킬 수 있다. 독소는 다양한 생물체에서 유래된 것으로 체내에 흡수되었을 때 독성을 나타낼 수 있는 것을 총칭하며, 독소를 통해 세포 사멸을 유도할 수 있다. 본 발명의 치료용 물질로 사용될 수 있는 독소의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 형광단백질을 암호화(encode)하는 핵산 또는 다양한 형광물질을 로딩한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 진단에 이용할 수 있다. 특정 세포 또는 조직을 표적으로 하는 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 형광단백질을 암호화하고 있는 플라스미드 DNA를 로딩하여 생체에 주입하면 그 표적 세포 또는 조직의 존재를 형광단백질에서 방출되는 형광 신호로부터 알 수 있다. 또한, 특정 세포 또는 조직을 표적으로 하는 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 형광 방출 양자점을 포함한 다양한 형광물질을 포함시켜서 생체에 주입하면 그 표적 세포 또는 조직의 존재를 형광 신호로부터 알 수 있다. 특정한 표적 세포 또는 조직에서 발생하는 형광을 진단에 이용할 수 있다. 세포 사멸을 유도하는 형광 방출 양자점은 치료 목적으로도 이용할 수 있다.
마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 로딩할 수 있는 다른 치료용 또는 진단용 물질의 예로서 형광 물질 이외에 다른 마이크로입자 또는 나노입자를 사용할 수 있다. 산화철, 금, 탄소나노튜브 등의 마이크로입자 또는 나노입자를 사용할 수 있으나 이것들로 제한되는 것은 아니다. 자기 비드 등의 비드를 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 로딩하여 사용할 수도 있다. 산화철 등의 자성입자는 자기공명영상(MRI)을 얻는 조영제로 이용될 수 있다. 나노입자와 결합한 핵산, 나노입자와 결합한 단백질 등도 사용할 수 있으며 진단에 유용한 방사성 물질도 사용 가능하다.
본 발명에 따른 상기 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 사용하여 2가지 이상의 물질을 전달할 수 있다. 예를 들어, 2가지 이상의 물질을 동시에 로딩한 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 사용하여 2 가지 이상의 물질을 전달할 수 있다. 또는, 한 가지 또는 두 가지 이상의 물질이 로딩된 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 복수 개 사용하여 2 가지 이상의 물질을 전달할 수 있다. 예를 들어, 3 가지 물질을 전달하는 경우, 각 물질을 포함한 제 1, 제 2, 제 3 마이크로베시클을 제조하여 사용할 수 있다. 제 1, 제 2 물질을 포함한 제 4 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클과 제 3 물질을 포함한 제 5 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 준비하고 제 4, 제 5 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 사용하여 3 가지 물질을 전달할 수 있다. 제 1, 제 2, 제 3 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 동시에 투여할 수도 있고 순차적으로 투여할 수도 있다. 제 4, 제 5 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 동시에 투여할 수도 있고 순차적으로 투여할 수도 있다.
마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 다른 분자나 다른 세포 구성 성분으로부터 분리하기 위해 밀도 구배, 초원심분리, 여과, 투석 및 자유 유동 전기이동법 등의 방법을 사용할 수 있으나, 본 발명의 상기 선별 방법이 이것들로 제한되는 것은 아니다.
밀도 구배는 밀도가 다른 물질을 구분할 때 가장 많이 사용되는 방법으로서, 본 발명의 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클은 자유 분자(free molecule)등과 밀도가 구분되기 때문에 밀도 구배를 통해 분리할 수 있다. 이 방법의 구체적인 예로는 피콜(Ficoll), 글리세롤(Glycerol), 수크로즈(Sucrose), 옵티프렙(OptiPrep™) 등의 밀도 구배를 사용할 수 있으나 본 발명의 밀도 선별 방법이 이것들로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 치료 및 진단을 위한 분자가 로딩된 마이크로베시클과 로딩되지 않은 마이크로베시클의 밀도가 다른 성질을 이용하여 두 가지 마이크로베시클을 분리할 수 있다. 밀도 구배는 원심분리 또는 전기영동(electrophoresis) 등과 함께 사용할 수 있다. 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 선별하기 위해 겔 여과(gel filtration) 또는 한외여과(ultrafiltration)를 사용할 수도 있다. 크기가 작은 분자을 제거하기 위해 여과 대신 투석을 사용할 수 있다. 이 외에도 자유 유동 전기이동법을 사용할 수도 있다.
목적에 따라 크기가 일정한 범위에 있는 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 선별하여 사용할 수 있다. 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클의 크기를 선별하는 단계는 치료용 또는 진단용 물질을 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클에 로딩하는 단계보다 먼저 진행할 수도 있고, 동시에 진행할 수도 있고, 나중에 진행할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 세포막의 구성 성분의 일부가 개질된 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 제조하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, 따로 준비한 융합단백질과 세포의 혼합액으로부터 마이크로베시클을 제조하여 융합단백질이 표면에 노출된 마이크로베시클을 준비할 수 있다. 마이크로베시클 표면에 폴리에틸렌글리콜를 결합시켜 스텔스-마이크로베시클의 제조가 가능하다. 또한, 마이크로베시클에 사이클로덱스트린을 첨가할 경우 불특이적 타겟팅을 감소시킬 수 있다. 사이클로덱스트린은 수용성과 지용성을 동시에 가지고 있는 물질로서, 마이크로베시클에 표면에 붙어 지질간의 불특이적 결합을 저해할 수 있다. 화학적으로 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클을 개질하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, 세포막의 표면에 시스테인을 포함한 단백질의 부분이 노출된 세포로부터 마이크로베시클을 제조한 후에 시스테인의 티올기에 화학적인 방법으로 여러 가지 분자를 결합시켜 마이크로베시클을 개질할 수 있다. 또한, 세포막 단백질에 존재하는 아민기에 화학적인 방법으로 여러 분자를 결합시켜 개질할 수도 있다.
본 발명에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 로딩된 마이크로베시클 또는 쉐딩 마이크로베시클 및 그의 제조 방법은 특정 물질의 특정 세포 또는 조직 등으로의 전달을 위하여 in vitro 및/또는 in vivo에서 치료 및/또는 진단용, 또는 실험용으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소 또는 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 로딩된 포유류의 유핵세포 유래 마이크로베시클 및 그의 제조 방법은 in vitro 실험용으로 사용될 수 있으며, 또한, in vitro 실험을 통해 in vivo에서 치료 가능한 형태로 세포를 변형하는 용도로도 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 1에 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로베시클의 제조 과정과 진단 및 치료용 물질을 로딩한 마이크로베시클을 제조하는 과정을 도식적으로 나타내었다.
도 2의 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM) 이미지에서 실시예 1의 방법에 따라 단핵구로부터 압출법으로 제조한 마이크로베시클이 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 100 ~ 200 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있다.
동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 입도 분석기로 실시예 1의 압출법으로 마이크로베시클의 크기를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. 마이크로베시클의 크기는 200 ~ 300 nm이며, 평균 크기는 250 nm이다. 도 2 의 TEM 이미지에서 측정한 것과 대체로 일치한다.
실시예 1의 방법에 따라 단핵구로부터 압출법으로 제조한 마이크로베시클의 막이 원래 세포막과 같은 토폴로지(topology)를 유지하고 있음을 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 실시예 1 의 방법에 따라 단핵구로부터 압출법으로 제조한 마이크로베시클과 실시예 2의 방법에 따라 단핵구로부터 초음파 분해 방법으로 제조한 마이크로베시클을 트립신(trypsin)으로 처리하여 세포막 단백질 중 마이크로베시클의 외부에 노출된 영역을 소화(digestion)시켰다. 그 다음 고온으로 처리하여 트립신을 변성시킨 후 마이크로베시클을 용해(lysis)시켜서 막 내부와 외부의 단백질을 모두 용액에 노출시키고 세포막 단백질 중 LFA-1의 세포외 영역을 인지하는 항체와 세포 내부의 세포질에 존재하는 단백질인 베타-액틴(beta-actin)을 인지하는 항체로 처리한 결과를 도 4에 나타내었다. ‘+’로 표시한 것은 트립신을 처리한 결과를, ‘-‘로 표시한 것은 트립신으로 처리하지 않은 결과를 나타낸다. 압출법으로 제조한 후 트립신으로 처리한 마이크로베시클에서 LFA-1의 세포외 영역은 사라지지만 베타 액틴의 양은 줄어들지 않았다. 만약 세포막이 일부라도 안팎이 바뀌어 일부 LFA-1의 세포외 영역이 마이크로베시클 내부를 향한다면 이것은 트립신에 의해 소화되지 않기 때문에 항체반응을 유발해야 한다. 하지만, LFA-1 항체 반응이 나타나지 않았기 때문에 존재하던 LFA-1의 세포외 영역은 모두 마이크로베시클 외부를 향하고 있었음을 알 수 있다. 이로부터 압출법으로 제조한 마이크로베시클의 경우, LFA-1 이외의 다른 세포막 단백질도 마찬가지로 원래 세포막에서 세포 외부를 향하던 부분이 모두 마이크로베시클 외부를 향하고 있음을 추론할 수 있고 이것은 마이크로베시클 막이 원래 세포막과 동일한 토폴로지를 유지하고 있다는 것을 의미한다.
도 4를 보면 압출법으로 제조한 마이크로베시클과 달리 초음파 분해 방법으로 제조한 마이크로베시클의 경우는 트립신으로 소화한 후에 LFA-1 항체 반응 신호가 나타났다. 이로부터, 초음파 분해 방법으로 마이크로베시클을 제조하는 경우에는 세포막 단백질의 토폴로지가 바뀐 마이크로베시클도 일부 존재하는 것을 알 수 있다.
세포막의 토폴로지가 바뀌는 방법으로 마이크로베시클을 제조한 후에, 목적에 따라 원래 세포의 세포막과 토폴로지가 동일한 마이크로베시클만을 선택하여 사용할 수 있다. 세포막 단백질 중 세포질 도메인(cytoplasmic domain)을 인지하는 항체와 같은 물질을 사용해서 이 세포질 도메인이 외부에 노출된 마이크로베시클을 제거할 수 있다. 이렇게 하면 세포막의 안팎이 바뀐 마이크로베시클은 제거되고 남은 마이크로베시클의 외부에는 원래 세포의 세포막 외부에 노출된 세포막 단백질만이 존재한다.
도 43은 사이토칼라신 D처리 후, 세포에서 자연적으로 분비되는 쉐딩 마이크로베시클의 TEM 이미지이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 압출법에 의한 마이크로베시클의 제조
도1은 포유류 유핵세포 또는 형질전환된 포유류 유핵세포에서 마이크로베시클과 표적 유도물질, 치료용 물질, 진단용 물질 등 다양한 물질이 로딩된 마이크로베시클을 제조하는 방법을 도식으로 나타낸 것이다.
도 1에서 나타난 모식도에 따라 단핵구 또는 대식 세포에서 마이크로베시클을 제조하였다. 도 1에서 압출법과 밀도 구배의 방법을 사용하였다.
단핵구인 U937 세포(ATCC No.CRL-1593.2) 또는 대식 세포인 Raw264.7 세포(ATCC No.TIB-71)를 5 × 106 cells/ml의 농도로 PBS(phosphate buffered saline) 용액 3 ml에 현탁(resuspension)하였다. 상기 현탁 용액을 구멍 크기가 10 μm인 멤브레인 필터(membrane filter)에 3회 통과시킨 후, 구멍 크기가 5 μm인 멤브레인 필터에 3회 통과시키고, 이어서 구멍 크기가 1 μm인 멤브레인 필터를 3회 통과시켰다. 5 ml 용량의 초원심분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 각각 50% 옵티프렙 1 ml, 5% 옵티프렙 1 ml, 멤브레인 필터를 통과한 세포 현탁액 3 ml을 차례로 담았다. 이후 100,000 × g에서 2 시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하였다. 50% 옵티프렙과 5% 옵티프렙 사이의 층에서 마이크로베시클을 얻었다.
실시예 2. 초음파 분해법을 통한 마이크로베시클의 제조
도 1에서 나타난 모식도에 따라 단핵구 또는 대식 세포에서 마이크로베시클을 제조하였다. 도 1에서 초음파 분해와 밀도 구배의 방법을 사용하였다.
단핵구 또는 대식 세포를 2 × 107 cells/ml의 농도로 PBS용액 3 ml에 현탁하였다. Cycle 0.5와 amplitute 50의 조건에서 초음파 발생기(UP400s, Heilscher)로 30회 초음파 분해를 한 후, 다시 물통 초음파 발생기(water bath sonicator)에서 30 분간 초음파 분해를 하였다. 5 ml 용량의 초원심분리 튜브에 각각 50% 옵티프렙 1 ml, 5% 옵티프렙 1 ml, 초음파 분해한 세포 현탁액 3 ml을 차례로 담았다. 이후 100,000 × g에서 2 시간 동안 초원심분리하였다. 50% 옵티프렙과 5% 옵티프렙 사이의 층에서 마이크로베시클을 얻었다.
실시예 3. 단핵구 유래 마이크로베시클의 특성 분석
실시예 1의 방법에 따라 단핵구에서 제조한 마이크로베시클을 글로방전 탄소 코팅 구리 그리드(glow-discharged carbon-coated copper grid)에서 3 분간 흡착 시켰다. 상기 그리드를 증류수로 세척한 후, 2% 우라닐아세테이트(uranylacetate)로 1 분 동안 염색(staining)하였다. JEM101(Jeol, Japan) 전자현미경으로 관찰한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 투과전자현미경 이미지에 나타난 바와 같이, 단핵구로부터 압출법으로 제조한 마이크로베시클이 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 100 ~ 200 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있다.
실시예 1의 방법에 따라 단핵구에서 제조한 마이크로베시클을 5 μg/ml의 농도로 PBS 1ml에 희석(dilution)하였다. 마이크로베시클이 들어있는 PBS 1 ml을 큐벳(cuvette)에 넣고 동적 광산란 입도 분석기로 분석하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 마이크로베시클의 크기는 200 ~ 300 nm이며, 평균 크기는 250 nm 로 확인되었다.
실시예 1의 방법에 따라 단핵구로부터 압출법으로 제조한 마이크로베시클과 실시예 2의 방법에 따라 단핵구로부터 초음파 분해 방법으로 제조한 마이크로베시클과 단핵구 세포를 각각 5 μg을 준비한 후, 트립신 0.5 μg을 37oC에서 20분간 처리하였다. 트립신을 처리한 것과 처리하지 않는 것에 각각 5 x 로딩 염색제(loading dye, 250 mM Tris-HCl, 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% glycerol)을 최종적으로 1 x가 되도록 넣고, 100oC에서 5분간 처리하였다. 8% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 준비하고, 샘플을 로딩하였다. 80V에서 2시간 전기영동 한 후, 400 mA에서 2시간 동안 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 트랜스퍼(transfer)하였다. Skim milk를 PBS에 3%가 되도록 녹인 후, 멤브레인을 이 용액에서 2시간 블로킹(blocking)하였다. LFA-1과 베타-액틴 항체를 4oC에서 12시간 처리하였다. PBS로 2번 세척한 후, 각각 페록시다아제(peroxidase)가 붙어있는 이차 항체를 실온에서 1 시간 처리하였다. PBS로 30분 세척한 후, ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Co.No.RPN2106) 기질(substrate)로 확인하여 도 4에 나타내었다. ‘+’로 표시한 것은 트립신을 처리한 결과를, ‘-‘로 표시한 것은 트립신을 처리하지 않은 결과를 나타낸다.
도 4에 나타난 바와 같이, 압출법으로 제조한 후 트립신으로 처리한 마이크로베시클과 세포에서는 세포막 단백질인 LFA-1의 세포외 영역은 사라지지만 베타 액틴의 양은 줄어들지 않는 것으로 확인되었다. 만약 세포막이 일부라도 안팎이 바뀌어 일부 LFA-1의 세포외 영역이 마이크로베시클 내부를 향한다면 이것은 트립신에 의해 분해되지 않기 때문에 항체반응을 유발해야 한다. 하지만, 트립신을 처리한 마이크로베시클과 세포에서는 LFA-1 항체 반응이 나타나지 않았기 때문에 존재하던 LFA-1의 세포외 영역은 마이크로베시클 외부를 향하고 있었음을 알 수 있다.
상기 결과로부터 압출법으로 제조한 마이크로베시클의 경우, LFA-1 이외의 다른 세포막 단백질도 마찬가지로 원래 세포막에서 세포 외부를 향하던 부분이 모두 마이크로베시클 외부를 향하고 있음을 추론할 수 있고 이것은 마이크로베시클 막이 세포의 세포막과 동일한 토폴로지를 유지하고 있다는 것을 의미한다.
또한 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 압출법으로 제조한 마이크로베시클과 달리 초음파 분해 방법으로 제조한 마이크로베시클의 경우는 트립신으로 분해한 후에 LFA-1 항체 반응 신호가 나타났다. 상기 결과로부터, 초음파 분해 방법으로 마이크로베시클을 제조하는 경우에는 세포막 단백질의 토폴로지가 바뀐 마이크로베시클도 일부 존재하는 것을 알 수 있다.
실시예 4. 사이클로덱스트린을 포함한 마이크로베시클의 제조
실시예 1의 방법에 따라 단핵구에서 제조한 마이크로베시클을 준비하였다. 1 μM의 농도로 사이클로덱스트린을 넣고, 실온에서 1 시간 보관하였다. 샘플을 5 μg/ml의 농도로 PBS 1 ml에 희석하였다. 마이크로베시클이 들어있는 PBS 1 ml을 큐벳에 넣고 동적 광산란 입도 분석기로 분석하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 사이클로덱스트린이 없는 마이크로베시클의 크기는 약 100 nm이며, 사이클로덱스트린이 포함된 마이크로베시클의 크기는 약 200 nm로 확인되었다. 상기 결과로부터, 사이클로덱스트린을 넣을 경우, 마이크로베시클의 막 주위에 사이클로덱스트린이 첨가되어 크기가 커졌음을 예측할 수 있다.
실시예 5. 폴리에틸렌글리콜을 포함한 마이크로베시클의 제조
실시예 1의 방법에 따라 단핵구에서 제조한 마이크로베시클을 준비하였다. 1 μM의 농도로 콜레스테롤-폴리에틸렌글리콜을 넣고, 실온에서 1 시간 보관하였다. 샘플을 5 μg/ml의 농도로 PBS 1 ml에 희석하였다. 마이크로베시클이 들어있는 PBS 1 ml을 큐벳에 넣고 동적 광산란 입도 분석기로 분석하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 폴리에틸렌글리콜이 없는 마이크로베시클의 크기는 약 100 nm이며, 폴리에틸렌글리콜이 포함된 마이크로베시클의 크기는 약 90 nm이었다. 상기 결과로부터, 폴리에틸렌글리콜을 넣을 경우, 마이크로베시클의 막 지질 사이로 폴리에틸렌글리콜이 첨가되어 크기가 작아졌음을 확인하였다.
실시예 6. 세포 유래 miRNA를 로딩한 마이크로베시클의 제조 및 miRNA 의 세포내 전달
마이크로 RNA(miRNA)의 일종인 miR125를 발현하고 있는 인간 아교모세포주(human glioblastoma) 세포인 A172 세포와 발현하지 않는 A172 세포를 준비하였다. 각 세포에서 실시예 1의 방법에 따라 마이크로베시클을 제조하였다. miR125를 발현하는 세포에서 유래한 마이크로베시클은 miR125를 로딩하고 있을 것이라 예상하였다.
miR125의 로딩을 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 진행하였다. miR125의 타겟 mRNA 중 하나가 EGF 수용체인 ERBB2로 알려져 있다[J.Biol.Chem.282; 1479-1486 (2007)]. 그래서 EGF 신호 전달의 저해 정도를 확인하였다.
인간 비소세포폐암주인 A549 세포를 6 웰 플레이트에 1 × 105 cells/well이 되도록 접종한 후, 12시간 동안 배양하였다. 12시간 후, 각각 miR125가 로딩된 마이크로베시클과 로딩되지 않은 마이크로베시클 10 μg/ml의 농도로 1시간 처리하고, 배양액을 바꾼 후 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 혈청(serum)이 없는 배지로 바꾸고, 12시간 배양하였다. 12시간 후, 각 세포에 EGF를 100 ng/ml의 농도로 10분간 처리하였다. 10분 후, A549 세포를 M-PER(Pierce) 용액에서 용해하여 세포 전체 단백질(whole cell lysate)를 얻었다.
얻은 세포 전제 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후, 각각 phospho-Erk(p-Erk)와 Erk 항체로 확인하였다. Western blotting 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, EGF를 처리할 경우, p-Erk발현이 증가되었다. 하지만, miR125가 로딩된 마이크로베시클을 처리하였을 경우 p-Erk가 관찰되지 않았다.
상기 결과로부터, miR125가 로딩된 마이크로베시클을 처리할 경우, 세포에서 miR125가 작용하여 EGF 수용체인 ERBB2의 발현이 감소되었고 그로인해 EGF 신호전달이 저해되었다고 유추할 수 있다.
상기 결과는, 세포 유래 물질을 마이크로베시클에 로딩할 수 있고, 로딩된 물질을 전달할 수 있음을 의미한다.
실시예 7. VEGF 수용체가 로딩된 세포 유래 마이크로베시클을 이용한 VEGF 결합
실시예 1의 방법에 따라 혈관 내피세포인 HUVEC에서 마이크로베시클을 제조하였다. 혈관 내피세포인 HUVEC은 VEGF 수용체를 표면에 발현하고 있으므로, HUVEC에서 유래한 마이크로베시클 또한 VEGF 수용체를 가질 것으로 예상하였다.
VEGF 수용체를 형질전환한 세포에서 마이크로베시클을 얻기위해, VEGF 수용체 cDNA가 들어있는 pCEP4 벡터를 생쥐 세포인 PT67 세포(ATCC No. CRL-12284)에 Lipofectamin을 사용하여 형질전환하였다. 세포는 250 μg/ml의 hygromycin B(Invitrogen No.10687010) 항생제 조건에서 배양하였다. 실시예 1의 방법에 따라 VEGF 수용체를 로딩한 세포에서 마이크로베시클을 제조하였다.
96 웰 플레이트를 준비하고, 웰 플레이트에 각각 0, 12.5, 25 ng이 되도록 각각의 마이크로베시클을 넣고, 4oC에서12시간 이상 보관하여 코팅하였다. 1% BSA/PBS를 100 μl를 넣어 1시간 동안 고정하였다. 1시간 후, 바이오틴이 붙어있는 VEGF를 100 ng/ml이 되도록 넣고 2시간 배양하였다. 1% BSA/PBS로 세척한 후, 스트렙타비딘-POD로 20 분간 배양하고 BM-POD 기질을 넣어 발색을 유도하였다.
도 8과 도 9는 발색 후에 RLU 값들을 표시한 것이다. 도 8은 혈관 내피세포 유래 마이크로베시클의 결과이고, 도 9는 VEGF 수용체가 형질전환되어 로딩된 세포 유래 마이크로베시클의 결과이다. RLU 값은 마이크로베시클에 붙은 VEGF의 상대적인 값을 나타낸다. 도 8에 나타난 바와 같이, 혈관 내피세포에서 유래한 마이크로베시클은 VEGF와 결합(binding)하여 높은 RLU 값을 나타냄을 확인하였다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이, VEGF 수용체를 형질전환하여 로딩한 세포 유래 마이크로베시클도 VEGF와 결합하여 높은 RLU 값을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해 VEGF 수용체는 마이크로베시클 표면에 로딩되어 수용액에 존재하는 VEGF와 결합할 수 있고 VEGF 수용체가 로딩된 마이크로베시클을 VEGF 기능 저해제로 사용할 수 있음을 시사하고 있다.
실시예 8. ICAM-1을 로딩한 세포 유래 마이크로베시클을 이용한 면역 세포 결합 저해
센스 ICAM-1 cDNA와 안티센스 ICAM-1 cDNA를 얻기 위해, 인간 전립선 암세포 주인 PC3 세포(ATCC No. CRL-1435)의 전체 RNA를 사용하였다. 센스 프라이머(primer)로 5’-GATCGGATCCTCAGCCTCGCTAT-GGCTCCCAGCA-3’와 안티센스 프라이머로 5’-GCTAGGATCCCGGGATA-GGTTCAGGGAGGCG-3’를 사용하여 역전사 PCR(reverse transcription PCR)을 통해 각각 ICAM-1 센스, 안티센스 cDNA를 얻었다. 1.6 kb의 크기를 가지는 ICAM-1 cDNA는 아가로즈(agarose) 겔 영동을 통해 분리하였다. 분리한 cDNA는 제한효소(restriction enzyme) BamHI으로 자르고, 플라스미드인 pCEP4(Invitrogen No.V04450) 또한 BamHI로 자른 후, 접합효소(ligase)를 처리하여 pCEP4와 ICAM-1 cDNA가 접합되도록 하였다. 각각 센스 ICAM-1과 안티센스 ICAM-1 cDNA가 들어있는 pCEP4 벡터를 인간 섬유아세포 종인 HT1080(ATCC No.CCL-121)에 FuGENE6 transfection reagent(Roche No.1 815 091)를 사용하여 형질전환하였다. 이들 세포는 250 μg/ml의 hygromycin B 항생제 조건에서 배양하였다.
센스 ICAM-1 cDNA로 형질전환하여 ICAM-1을 로딩한 HT1080 세포와 안티센스 ICAM-1을 형질전환하여 ICAM-1의 로딩을 감소시킨 HT1080에서 실시예 1의 방법에 따라 마이크로베시클을 제조하였다.
인간 혈관 내피세포인 HUVEC을 탯줄(umbilical cord)에서 얻었다[J. Clin. Invest.52; 2745-2756 (1973)]. 96 웰 플레이트에 0.1% 젤라틴(gelatin)을 코팅한 후 HUVEC을 1 × 104의 양만큼 접종한 후, 12 시간 동안 배양하였다. 10 ng/ml이 되도록 TNF(Tumor Necrosis Factor)-a(R&D systems, No.210TA)를 넣은 것과 넣지 않은 HUVEC을 16 시간 동안 배양하였다. HUVEC에 TNF-a를 처리하면 세포가 활성화(activation)되어 세포막에 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin과 같은 세포 접합 분자의 발현이 증가되어 단핵구 및 대식 세포에 존재하는 LFA-1, Mac-1과 같은 세포 접합 분자와 결합하여 단핵구 및 대식 세포와 혈관 내피 세포가 결합할 수 있도록 한다.
단핵구 세포인 U937 세포에 5 μM의 셀 트래커를 넣고 30 분간 녹색 형광으로 염색하여 녹색을 띠는 단핵구를 준비하였다. 96 웰 플레이트를 PBS로 세척한 후, 5 × 104개의 녹색 형광으로 염색된 단핵구와 함께 각각 0, 1, 5, 25 μg/ml이 되도록 ICAM-1을 로딩한 마이크로베시클 또는 ICAM-1을 제거한 마이크로베시클을 넣고 1 시간 동안 배양하였다. 1 시간 후, 배양액을 버리고, PBS로 세척하였다. 형광 현미경에서 혈관 내피세포인 HUVEC에 결합한 녹색 형광의 단핵구를 관찰하고 단핵구의 수를 측정하여 도 10에 나타내었다.
도 10의 흰색 바는 ICAM-1의 센스 형질전환 세포에서 유래되고 ICAM-1을 로딩한 마이크로베시클을 처리한 실험군에서 녹색의 단핵구를 측정하여 나타낸 그래프이고 도 10의 검은색 바는 ICAM-1의 안티센스 형질전환 세포에서 유래되고 ICAM-1을 제거한 마이크로베시클을 처리한 실험군에서 녹색의 단핵구를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 10의 세로축은 TNF-α를 처리한 HUVEC 세포에 결합한 단핵구의 수를 100%라 하고, 이와 비교하여 백분율로 나타낸 것이다. TNF-α를 처리할 경우, HUVEC에서 다양한 세포 접합 분자가 발현되어 면역 세포인 단핵구의 결합을 촉진한다. TNF-α를 처리하지 않은 HUVEC에는 결합한 단핵구가 거의 없지만, TNF-α를 처리할 경우 결합한 단핵구가 증가함을 확인할 수 있다.
도 10에서 확인할 수 있듯이 ICAM-1을 로딩한 마이크로베시클의 농도가 높아짐에 따라 혈관 내피세포에 결합하는 단핵구가 감소함을 알 수 있다. 하지만, ICAM-1이 없는 마이크로베시클은 단핵구의 결합을 저해하지 못하였다.
상기 결과는, ICAM-1을 로딩한 마이크로베시클이 단핵구가 세포 접합 분자와의 상호 작용를 통해 혈관 내피세포에 결합을 저해함을 의미한다.
실시예 9. 항암 약물이 로딩된 마이크로베시클의 제조
도 1에서 나타난 모식도에 따라 단핵구 또는 대식 세포에서 마이크로베시클을 제조하였다. 도 1에서 압출법과 밀도 구배의 방법을 사용하였으며, 압출 단계에서 항암 약물을 투여하여 약물을 로딩하였다.
단핵구 또는 대식 세포를 5 × 106 cells/ml의 농도로 PBS 용액 3 ml에 현탁하였다. 상기 현탁 용액에 항암 약물인 독소루비신(Sigma, No.D1515)을 각각 0, 100, 200, 400 μg/ml의 농도로 첨가하고 잘 섞었다. 상기 용액을 구멍 크기가 10 μm인 멤브레인 필터에 3회 통과시킨 후, 구멍 크기가 5 μm인 멤브레인 필터에 3회 통과시키고, 이어서 구멍 크기가 1 μm인 멤브레인 필터에 3회 통과시켰다. 5 ml 용량의 초원심분리 튜브에 각각 50% 옵티프렙 1 ml, 5% 옵티프렙 1 ml, 멤브레인 필터를 통과한 세포 현탁액 3 ml을 차례로 담았다. 이후 100,000 × g에서 2 시간 동안 초원심분리하였다. 50% 옵티프렙과 5% 옵티프렙 사이의 층에서 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 얻었다.
PBS를 이용해 각각 0, 5, 10, 20, 40 μg/ml의 농도로 희석한 독소루비신 용액 300 μl 를 준비하였으며, 각각 다른 농도의 독소루비신을 사용해 압출법을 통해 제조된 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 100 μg/ml의 농도로 각각 300 μl 준비하였다. 96 웰 플레이트에 각 샘플을 100 μl씩 3개의 웰에 넣었다. Wallac 1420 VICTOR plate-reader(Perkin-Elmer Life Sciences) 기계에서 excitation 파장 488 nm, emission 파장 530 nm에서의 값을 얻었다. 독소루비신 용액의 값을 이용해 스탠다드 커브(standard curve)를 그린 후, 마이크로베시클에 들어간 독소루비신의 양을 정량하여 도 11에 나타내었다.
도 11은 단백질 양 1 μg의 마이크로베시클에 로딩된 독소루비신의 양을 나타내는 그래프이다. 100, 200, 400 μg/ml의 독소루비신을 사용할 경우, 각각 약 50 ng, 200 ng, 300 ng의 독소루비신이 마이크로베시클에 로딩됨을 확인하였다.
아래의 모든 실시예에서 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클은 400 μg /ml의 독소루비신을 사용해 제조하였다.
실시예 10. 항암 약물이 로딩된 마이크로베시클의 특성 분석
실시예 9의 방법에 따라 단핵구에서 제조한 마이크로베시클을 글로방전 탄소 코팅 구리 그리드에서 3 분간 흡착 시켰다. 상기 그리드를 증류수로 세척한 후, 2% 우라닐아세테이트로 1 분 동안 염색하였다. JEM101 전자현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12의 투과전자현미경 이미지에 나타난 바와 같이, 단핵구로부터 압출법으로 제조한 마이크로베시클이 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 100 ~ 200 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있다.
실시예 9의 방법에 따라 단핵구에서 제조한 마이크로베시클을 5 μg/ml의 농도로 PBS 1ml에 희석하였다. 마이크로베시클이 들어있는 PBS 1 ml을 큐벳에 넣고 동적 광산란 입도 분석기로 분석한 결과, 마이크로베시클의 크기는 100 ~ 300 nm이며, 평균 크기는 250 nm로 확인되었다. 상기 결과로부터, 항암 약물이 로딩되지 않은 마이크로베시클과 크기적으로 동일함을 알 수 있다.
실시예 1 및 9에서 수득된, 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클 및 로딩되지 않은 마이크로베시클을 각각 5 μM의 DiO(Invitrogen, No.V22886)와 30 분간 배양하였다. DiO는 지질에 붙을 수 있으며, 녹색 형광을 나타내는 물질이다. DiO로 표지한 마이크로베시클을 20 μg/ml이 되도록 한 후, 커버 글라스(cover glass)에 50 μl를 점적하였다. 4oC에서 12시간 보관하여, 마이크로베시클이 커버 글라스에 코팅되도록 하였다. 커버 글라스를 슬라이드 글라스(slide glass)에 붙인 후, 형광 현미경에서 관찰하였다. 마이크로베시클은 DiO의 녹색 형광으로 관찰하였으며, 독소루비신은 자체의 빨간색 형광으로 관찰하여 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13은 독소루비신이 로딩되지 않은 마이크로베시클 및 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클의 형광 이미지이다. 도 13에 나타난 바와 같이, 독소루비신이 로딩되지 않은 마이크로베시클은 DiO로 표지되어 녹색 형광을 나타내지만, 독소루비신의 빨간색 형광은 보이지 않음을 알 수 있다. 반면, 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클은 녹색 형광뿐만 아니라, 독소루비신의 빨간색 형광까지 나타남을 확인하였으며, 녹색 형광과 빨간색 형광이 같은 위치에 있음을 통해 독소루비신이 마이크로베시클에 로딩되었음을 확인하였다.
실시예 11. 산화철이 로딩된 마이크로베시클의 제조
도 1에서 나타난 모식도에 따라 단핵구 또는 대식 세포에서 마이크로베시클을 제조하였다. 도 1에서 압출법과 밀도 구배의 방법을 사용하였으며, 세포 수준에서 물질을 로딩하였다.
대식 세포를 세포 배양 플레이트에 80% 정도 차도록 키우고, 산화철 나노입자(iron oxide nanoparticle)을 50 μg/ml이 되도록 넣어 준 후, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 대식 세포를 스크래퍼(scrapper)로 떼어 내고, PBS에 현탁하였다. 실시예 1의 방법에 따라 압출법과 옵티프렙을 실시하여 산화철이 로딩된 마이크로베시클을 얻었다.
도 14는 산화철이 로딩된 마이크로베시클의 TEM 이미지이다. 도 14에서 마이크로베시클의 내부는 검은색으로 보이며, 이는 검은색의 산화철이 로딩된 결과이다. 도 14에 나타난 바와 같이, 마이크로베시클 내부에 전자 밀도가 높은 산화철이 로딩되어 있음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 마이크로베시클에 산화철을 로딩할 수 있음이 명백하다.
실시예 12. 단핵구 유래 마이크로베시클을 이용한 유전자의 전달
실시예9의 방법에서 독소루비신 용액을 첨가하는 단계를 생략하고, 전기천공 방법으로 녹색형광단백질 플라스미드(Green Fluorescence Protein, GFP, Clontech No.6085-1) 또는 빨간색형광단백질 플라스미드(Red Fluorescnce Protein, RFP, Clontech No.632465)를 주입한 단핵구를 사용하여 GFP 또는 RFP가 로딩된 마이크로베시클을 제조하여 사용하였다.
ICAM-1 센스 형질전환된 HT1080 세포를 24 웰 플레이트에 1 × 104 cells/well이 되도록 접종한 후, 12시간 동안 배양하였다. GFP또는 RFP가 로딩된 마이크로베시클을 20 μg/ml이 되도록 세포에 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후, PBS로 세척한 후, 배지 500 μl를 넣고, 48 시간 동안 배양한 후 세포를 공초점 현미경에서 관찰하여 도 15과 도15의 이미지를 얻었다. DIC(differential interference contrast) 이미지는 공초점 현미경 상에서 빛의 간섭 현상을 이용하여 관찰하였으며, 호스트 염료(Hoechst dye)는DAPI(4',6'-diamidino-2-phenylindole hydrochloride) 파장에서, GFP는 FITC(fluorescein isothiocyanate) 파장에서, RFP는 Rhodamine 파장에서 관찰하였다.
도 15는 GFP를 전달한 세포를 나타내며, 도 16은 RFP를 전달한 세포를 나타낸다. 도 15 및 도 16에 나타난 바와 같이, GFP의 녹색 형광과 RFP의 빨간색 형광이 세포의 세포질(cytosol)부분 에서 발현된 것이 확인되었다.
상기 결과는 마이크로베시클이 유전자를 효과적으로 세포에 전달한다는 것을 의미한다.
실시예 13. 단핵구 유래 마이크로베시클을 이용한 나노입자의 전달
단핵구를 5 × 107 cells/ml이 되도록 PBS에 넣고, 5 μM이 되도록 DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, Invitrogen, No.V22885) 염색제를 넣었다. 30분간 37oC에서 배양한 후, 500 × g에서 단핵구를 원심분리하고 Qdot 705를 전기 천공 방법으로 주입하였다. 독소루비신 용액을 첨가하는 단계를 생략한 실시예 9의 방법으로 이 단핵구로부터 마이크로베시클을 제조하여 사용하였다. 이와 동시에 상기 Qdot 705가 없는 마이크로베시클도 실시예 1의 방법에 따라 제조하였다.
24 웰 플레이트에 0.1% 젤라틴이 코팅된 커버 글라스를 넣고, ICAM-1 센스 형질전환된 HT1080 세포를 1 × 104 접종하고 12시간 동안 배양하였다. 상기Qdot 705 가 로딩된 마이크로베시클 또는 Qdot 705가 로딩되지 않은 마이크로베시클을 20 μg/ml이 되도록 세포에 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후, PBS로 세척하고 커버 글라스를 4% 파라포름알데하이드에 10분간 고정하였다. 커버 글라스를 슬라이드 글라스에 붙인 후, 공초점 현미경 상에서 세포를 관찰하여 도 17과 도 18의 이미지를 얻었다. Qdot 705 은 excitation 파장 600 nm, emission 파장 705 nm를 가지고 있어, Cy7 파장에서 형광을 관찰한 후, 파란색의 인위적인 색상(pseudo color)으로 표시하였으며, 마이크로베시클은 DiI로 표지되어 있어 Rhodamine 파장에서 빨간색 형광을 관찰하였다. DIC 이미지는 공초점 현미경 상에서 빛의 간섭 현상을 이용하여 관찰하였다.
도 17은 Qdot 705 가 로딩된 마이크로베시클을 처리한 것이며, 도 18은 Qdot 705 가 로딩되지 않은 마이크로베시클을 처리한 결과이다.
도 17에서 세포 내부에 존재하는 빨간색 형광은 마이크로베시클을 나타내며, 파란색은 Qdot 705를 나타낸다. 이를 통해 마이크로베시클과 이에 로딩된 Qdot 705 가 효과적으로 세포에 전달된 것을 알 수 있다. 도 17의 DIC 이미지에서 화살표로 표시한 부분은 세포가 사멸되어 용해되고 있는 것이며, 도 18의 Qdot 705 가 로딩되지 않은 마이크로베시클을 처리한 이미지와 비교하면 전달된 Qdot 705 에 의해 세포 사멸이 유도된 것을 알 수 있다.
실시예 14. 단핵구 유래 마이크로베시클을 이용한 단백질의 전달
실시예 9의 방법에서 독소루비신 용액을 첨가하는 단계를 생략하고, 전기천공 방법으로 RNA 분해효소 A(RNase A, Sigma, No.R4875)을 주입한 단핵구를 사용하여 RNase A가 로딩된 마이크로베시클을 제조하여 사용하였다.
24 웰 플레이트에 ICAM-1 센스 형질전환된 HT1080 세포를 1 × 104 cells/well로 접종하고 12시간 동안 배양하였다. 상기 RNase A가 로딩된 마이크로베시클을 0, 20, 50 μg/ml의 농도로 각각 처리한 후, 30분간 37oC에서 배양하였다. PBS로 세척한 후, 10% FBS/MEM 배지에 넣은 뒤, 24시간 배양하였다. 24시간 후, PBS로 세척한 후, 1 μM의 calcein AM 염색제(calcein AM dye, Invitrogen, No.C3099)와 2 μM의 에티디움 호모다이머-1 염색제(ethidium homodimer-1 dye, Invitrogen, No.E1169)를 넣은 후, 30분간 배양하였다. 세포 내부에 존재하는 esterase라는 효소에 의해 calcein AM은 녹색 형광을 나타내는 칼세인(calcein)으로 변환된다. 칼세인은 살아있는 세포의 세포막을 통과하지 못하므로 살아 있는 세포 내부에서 농축되어 녹색 형광 신호를 발생한다. 그러나 죽은 세포의 경우는 칼세인이 세포막을 쉽게 통과하므로 칼세인의 형광 신호로 세포를 관찰할 수 없다. 핵산과 결합하여 빨간색 형광을 나타내는 에티디움 호모다이머-1는 살아있는 세포의 세포막을 통과하지 못하지만 죽은 세포의 세포막은 쉽게 통과할 수 있다. 따라서 살아 있는 세포는 에티디움 호모다이머-1로 염색할 수 없지만 죽은 세포는 쉽게 염색하여 관찰할 수 있다. 형광 색이 다른 이 두 염색제를 써서 살아 있는 세포와 죽은 세포를 쉽게 구분할 수 있다. 상기 방법으로 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰한 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타난 바와 같이, RNase A가 로딩된 마이크로베시클이 높은 농도에서 세포사멸을 더 많이 유도하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 마이크로베시클을 통해 RNase A가 세포에 전달되었다는 것을 의미한다.
실시예 15. 대식 세포 유래 마이크로베시클을 이용한 항염증 약물 전달 및 염증 반응의 억제
대식 세포를 5 × 106 cells/ml의 농도로 PBS 용액에 현탁하고, 독소루비신 용액 대신 항염증 약물인 덱사메타손(Sigma, No.D2915) 400 μg/ml 용액을 사용하여 실시예 9의 방법에 따라 덱사메타손이 로딩된 마이크로베시클을 얻었다.
염증억제 효과를 보기 위해 면역 반응을 유발한 대식 세포를 덱사메타손이 로딩된 마이크로베시클로 처리하고 대식세포가 분비하는 염증 관련 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 양을 각각 ELISA 방법으로 측정하였다.
대식 세포에 LPS(lipopolysaccharide)를 10 ng/ml로 6시간 동안 처리하여 염증 반응을 유도하였다. 대조군에서는 LPS 만을 처리하고 실험군에서는 LPS처리와 동시에 마이크로베시클을 10 μg/ml이 되도록 처리하였다. 6시간 후, 세포의 조건 배지를 얻고, 500 × g에서 5분간 원심분리하였다. TNF-α와 IL-6 항체가 코팅된 96 웰 플레이트를 준비하고, 웰 플레이트에 1% BSA/PBS를 100 μl를 넣어 1시간 동안 고정(blocking) 하였다. 얻은 조건 배지를 각각 1/10 희석, 1/2 희석 하여 넣어주고 실온에서 2시간 배양한 후, 각각 바이오틴(biotin)이 붙어있는 TNF-a, IL-6에 대한 포획 항체(capturing antibody)로 2시간 배양하였다. 1% BSA/PBS로 세척한 후, 스트렙타비딘-POD(streptavdin-POD)로 20 분간 배양하고 BM-POD 기질을 넣어 발색을 유도하였다.
도 20은 발색 후에 RLU(relative light units) 값들을 표시한 것이다. RLU 값은 TNF-α와 IL-6사이토카인의 상대적인 양을 나타낸다. 검은색 바 그래프는 TNF-α의 값을 나타내며, 흰색 바는 IL-6의 값을 나타낸다. 그래프에서 '-'는 LPS를 처리하지 않은 것이며, ‘+’는 LPS를 10 ng/ml의 농도로 처리하여 염증 반응을 유도한 것이다.
도 20에 나타난 바와 같이, LPS를 처리하지 않을 경우에는 염증 반응이 없어, TNF-α와 IL-6의 분비가 거의 없으나, LPS를 처리할 경우에는 염증 반응이 나타나, TNF-α 와 IL-6의 분비가 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, LPS와 덱사메타손이 로딩된 마이크로베시클을 동시에 처리한 경우에는 사이토카인의 분비를 나타내는 RLU 값이 현저히 낮게 나타났다. 상기 결과로부터, 덱사메타손이 로딩된 마이크로베시클은 LPS에 의한 염증성 사이토카인의 증가를 효과적으로 억제하였음을 알 수 있다.
실시예 16. 단핵구 유래 마이크로베시클을 이용한 in vitro 약물 전달 및 세포 특이적 전달
24 웰 플레이트에 0.1% 젤라틴이 코팅된 커버 글라스를 넣고 커버 글라스 위에 HUVEC을 1 × 104의 양만큼 접종한 후, 24 웰 플레이트에서 12 시간 동안 배양하였다. 10 ng/ml이 되도록 TNF-a를 넣은 것과 넣지 않은 HUVEC을 16 시간 동안 배양하였다. 앞서 설명한 바와 같이, HUVEC에 TNF-a를 처리하면 세포가 활성화되어 세포막에 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin과 같은 세포 접합 분자의 발현이 증가되어 단핵구 및 대식 세포에 존재하는 LFA-1, Mac-1과 같은 세포 접합 분자와 결합하여 단핵구 및 대식 세포와 혈관 내피 세포가 결합할 수 있도록 한다.
PBS로 세척한 후, 배지 500 μl를 넣고, 5 μg/ml의 농도로 실시예 9의 방법에 따라 단핵구로부터 제조한 마이크로베시클로서 항암물질인 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 첨가하여 처리한 후, 1 시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 혈청이 없는 배지 500 μl를 넣고 셀트래커(CellTracker, Invitrogen, No.C2925) 용액을 5 μM이 되도록 넣은 후, 30분간 배양하였다.
PBS로 세척한 후, 혈청이 있는 배지를 500 μl 넣고 다시 30분간 배양하였다. 커버 글라스를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 500 μl에 넣고 실온에서 10분간 고정한 후, 공초점 현미경(confocal microscope) 상에서 관찰하여 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타난 바와 같이, TNF-a를 처리한 HUVEC에서 독소루비신의 빨간색 형광 신호가, 세포를 염색한 녹색 형광 신호와 같은 위치에 존재하고 있음을 확인하였다. 상기 결과로부터, 상기 마이크로베시클에 로딩된 항암물질인 독소루비신이 상기 HUVEC 세포의 핵에 전달되었음을 알 수 있다. 이와 달리, TNF-a를 처리하지 않은 HUVEC에서는 독소루비신이 관찰되지 않았다.
현미경으로는 소수의 세포만을 관찰할 수 있기 때문에 FACS(fluorescence activated cell sorting) 방법으로 다수의 세포에 포함된 독소루비신의 양을 측정하였다.
실시예 9의 방법에 따라 단핵구로부터 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 제조하였다. 또한 실시예 1의 방법에 따라 단핵구로부터 독소루비신이 로딩되지 않은 마이크로베시클을 제조하였다.
인간 혈관 세포인 HUVEC을 0.1% 젤라틴이 코팅된 24 웰 플레이트에 1 × 104이 되도록 접종한 후, 12 시간 동안 배양하였다. 10 ng/ml가 되도록 TNF-α를 넣고 16 시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 배지 500 μl를 넣고, 5 μg/ml의 농도로 위에서 준비한 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클과 독소루비신이 로딩되지 않은 마이크로베시클을 각각 처리한 후, 1 시간 동안 배양하였다. PBS 용액으로 세척한 후, 1×TE(trypsin-EDTA) 버퍼를 100 μl 넣고 37oC에서 5 분 배양하여 세포를 떼었다. PBS를 200 μl 첨가한 후, FACS방법으로 분석하여 그 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에서 가로축의 ‘red’는 독소루비신의 형광 신호 세기(fluorescent intensity)를 나타내는 상대적인 값이며, 세로축의 ‘counts’는 세포의 수를 나타낸다. 또한 보라색 그래프는 독소루비신이 로딩되지 않은 마이크로베시클을 세포에 처리하여 배양한 후 세포에서 발생하는 빨간색 형광 신호 세기에 따른 세포 수를 표시한 것이며, 파란색 그래프는 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 세포에 처리한 후 세포에서 발생하는 빨간색 형광 신호 세기에 따른 세포 수를 표시한 것이다.
도 22에 나타난 바와 같이, 독소루비신이 로딩되지 않은 마이크로베시클만을 처리한 것의 빨간색 형광신호 값은 1.1 × 101정도이며, 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 처리한 것은 빨간색 형광신호 값이 1.2 × 102정도이다. 상기 결과로부터, 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 처리할 경우, 세포에서 독소루비신의 형광값이 마이크로베시클만을 처리하였을 때 보다 10 배 이상 증가하였음을 알 수 있으며, 결론적으로 마이크로베시클이 로딩된 독소루비신이 세포로 전달되었음이 명백하다.
24 웰 플레이트에 0.1% 젤라틴을 코팅하고 인간 혈관 세포인 HUVEC을 3 × 104이 되도록 접종한 후, 96 웰 플레이트에서 12 시간 동안 배양하였다. 10 ng/ml가 되도록 TNF-α를 넣은 그룹과 넣지 않은 그룹을 준비하고 16 시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 배지 100 μl를 넣고, 각각 0, 1, 2, 5 μg/ml농도로 실시예 6의 방법에 따라 단핵구로부터 제조한 독소루비신-마이크로베시클을 처리한 후, 20분 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 배지 500 μl를 넣고 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, PBS로 세척한 후, 1 μM의 칼세인 AM 염색제를 넣어 살아있는 세포를 염색하였다. 형광 현미경을 이용하여 사진을 찍고, 살아있는 세포의 개수를 측정하였다.
도 23은 이 사진에서 염색된 세포의 개수를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 23에서 세로축의 ‘cell count’는 살아있는 세포의 개수를 보여준다.
도 23에 나타난 바와 같이, TNF-a를 처리한 HUVEC은 마이크로베시클 농도의존적으로 세포 사멸이 일어났으며, TNF-a를 처리하지 않은 세포는 세포 사멸이 거의 유도되지 않음을 알 수 있다.
상기 결과로부터, 마이크로베시클에 로딩된 독소루비신에 의해 세포 사멸이 유도되었으며, 이러한 사멸 효과는 TNF-a를 처리한 세포, 즉 활성화된 세포에서 더 높게 나타났음을 확인하였다.
24 웰 플레이트에 0.1% 젤라틴을 코팅하고 인간 혈관 세포인 HUVEC을 3 × 104이 되도록 접종한 후, 96 웰 플레이트에서 12 시간 동안 배양하였다. 10 ng/ml가 되도록 TNF-α를 넣은 그룹과 넣지 않은 그룹을 준비하고 16 시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 배지 100 μl를 넣고, 각각 0, 1, 2, 5 μg/ml농도로 실시예 9의 방법에서 독소루비신 대신 각각 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 카보플라틴(carboplatin)을 사용하여 단핵구로부터 제조한 마이크로베시클을 처리한 후, 20분 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 배지 500 μl를 넣고 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, PBS로 세척한 후, 1 μM의 칼세인 AM 염색제를 넣어 살아있는 세포를 염색하였다. 형광 현미경을 이용하여 사진을 찍고, 살아있는 세포의 개수를 측정하였다.
도 24는 사진에서 염색된 세포의 개수를 측정한 결과를 나타낸 것으로, 세로축의 ‘cell count’는 살아있는 세포의 개수를 보여준다.
도 24에 나타난 바와 같이, 다양한 약물을 로딩한 단핵구 유래 마이크로베시클 또한, TNF-a를 처리한 HUVEC에서 마이크로베시클 농도의존적으로 세포 사멸이 일어났으며, TNF-a를 처리하지 않은 세포는 세포 사멸이 거의 유도되지 않음을 알 수 있다.
세포 접합 분자가 단핵구 유래 마이크로베시클의 활성에 중요함을 확인하기 위해 세포 접합 분자 중 ICAM-1을 과발현하고 있는 ICAM-1 센스 형질전환된 HT1080 세포와 ICAM-1을 발현하지 않는 ICAM-1 안티센스 형질전환된 HT1080 세포를 준비하였다.
실시예 9의 방법에 따라 단핵구로부터 제조한 마이크로베시클을 0.1, 0.5, 1 μg/ml의 농도로 각각 처리한 후, 30분간 37oC에서 배양하였다. PBS로 세척한 후, 배지를 넣고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, PBS로 세척한 후, 1 μM의 칼세인 AM 염색제를 넣어 살아있는 세포를 염색하였다. 형광 현미경을 이용하여 사진을 찍고, 살아있는 세포의 개수를 측정하였다.
도 25는 사진에서 염색된 세포의 개수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 25에 나타난 바와 같이, ICAM-1이 발현하지 않은 HT1080 에 비해, ICAM-1이 많이 발현되어 있는 HT1080 세포에서 세포사멸이 훨씬 더 많이 유도됨을 알 수 있다. 상기 결과는, 단핵구에서 유래한 마이크로베시클 표면에는 단핵구 세포와 마찬가지로 LFA-1 단백질이 노출되어 있고 LFA-1은 ICAM-1과 특이적으로 결합할 수 있기 때문에 단핵구 유래 마이크로베시클이 이러한 특이 결합을 통해 ICAM-1이 과발현된 HT1080 세포에 더 많이 전달되었음을 의미한다.
결론적으로, 단핵구에서 유래되고 항암 약물이 로딩된 마이크로베시클에 존재하는 LFA-1 등의 세포 접합 분자는 ICAM-1 등과 같은 세포 접합 분자를 표면에 발현하고 있는 세포와 특이적으로 결합할 수 있고, 로딩된 항암 약물을 세포에 전달하여 세포 사멸을 일으킬 수 있음이 명백하다.
실시예 17. 단핵구 유래 마이크로베시클을 이용한 분열 세포 독성 유도
35 mm 지름의 세포 배양 플레이트에 0.1% 젤라틴을 코팅하고 인간 혈관 세포인 HUVEC을 1 × 105이 되도록 접종한 후, 12 시간 동안 배양하여 세포가 가득 차도록(confluent) 하였다. 세포가 가득찬 후, 200 p tip을 이용해 스크래치(scratch)를 주고, 10 ng/ml가 되도록 TNF-α를 넣고 16 시간 동안 배양하여 세포가 자랄 수 있도록 하였다.
PBS로 세척한 후, 배지 1 ml를 넣고, 5 μg/ml농도로 실시예 9의 방법에 따라 단핵구로부터 제조한 마이크로베시클을 처리한 후, 20분 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 배지 1 ml를 넣고 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, PBS로 세척한 후, 1 μM의 칼세인 AM 염색제를 넣어 살아있는 세포를 염색하였다. 형광 현미경을 이용하여 사진을 찍고 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에서 녹색은 살아있는 세포를 나타내며, 빨간색 선은 스크래치가 생긴 부분을 나타낸다. HUVEC은 confluent하게 되면 contact inhibition에 의해 더 이상 세포가 분열하지 않는다. 하지만 스크래치를 주어 공간이 생기면 빈 공간으로 세포가 분열 및 이동을 하게 된다.
도 26에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 그룹에서는 스크래치가 생긴 부위로 세포가 분열 및 이동을 하여 녹색으로 채워지고 있음을 확인하였다. 하지만 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 처리할 경우, 스크래치가 생긴 부위에 세포가 없음을 확인하였다. 또한, 스크래치가 없고 confluent한 부위에서는 마이크로베시클을 처리하더라도 아무런 영향이 없었다. 상기 결과로부터, 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클은 분열하는 세포에만 특이적으로 작용함을 알 수 있다.
실시예 18. 대식세포 유래 독소루비신 로딩 마이크로베시클을 이용한 in vivo 암 사멸 유도
생쥐 대장암 26 세포주(mouse colon 26 cell line) 1 × 106 세포[Cancer Res. 57; 1625-1629 (1997)]를 생쥐의 피부 밑에 주사하고 5일간 키웠다.
실시예 1의 방법에 따라 압출법으로 대식 세포로부터 독소루비신이 로딩되지 않은 마이크로베시클을 제조하였다. 실시예 9의 방법에 따라 압출법으로 독소루비신 400 μg/ml 용액에 현탁된 대식 세포로부터 3 μg의 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클(독소루비신-마이크로베시클)을 제조하였다.
5일 후, PBS, 10 μg의 마이크로베시클을 포함한 PBS용액(마이크로베시클), 0.6 μg의 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클 2 μg 포함한 PBS 용액(독소루비신-마이크로베시클 (2)), 3 μg의 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클 10 μg 포함한 PBS 용액(독소루비신- 마이크로베시클 (10)) 100 μl 을 각 실험군 별로 10마리씩의 생쥐에 하루에 한 번씩 꼬리 정맥에 주사하고, 이틀에 한 번씩 암 조직의 크기를 측정하였다. 암 조직의 부피는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 v=ls2/2의 식으로 계산하였다.
상기 대장암세포를 피하 접종한 이후 암 조직의 크기를 측정한 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타난 바와 같이, 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클을 매일 10 μg씩 주사한 경우가 암 조직의 성장이 가장 느렸다. 하지만 독소루비신이 없는 마이크로베시클은 암 조직의 성장에 아무런 영향이 없었다.
상기 결과는 마이크로베시클에 의해 항암 약물이 독소루비신이 암 조직으로 전달되어 독소루비신에 의해 항암 효과가 나타났음을 의미한다.
실시예 19. 대식세포 유래 독소루비신 로딩 마이크로베시클을 이용한 in vivo 암 사멸 메커니즘
실시예 18에서 실험한 생쥐에서 떼어낸 암 조직 중에서, PBS, 독소루비신을 로딩한 마이크로베시클을 처리한 암 조직을 4% 파라포름알데하이드에 담궈 24시간 동안 고정하였다. 고정한 암 조직을 70% 에탄올(ethanol)에 한 시간씩 1 번, 95% 에탈올에 1 시간씩 4번, 100% 에탄올에 1 시간씩 3번, 100% 자일렌(xylen)에 1시간씩 3번 담궈서 탈수 반응(dehydration)을 시켰다. 이 후, 파라핀(paraffin)에 넣고 고정을 하였다. 파라핀 고정된 암 조직을 4 μm 두께로 자르고, 슬라이드 글라스에 붙였다. 붙인 조직을 60oC에서 한 시간 보관하여 파라핀을 녹였다. 녹인 조직을 100% 자일렌에 1 분씩 3번, 100% 에탄올에 1 분씩 4번, 95% 에탄올에 1 분씩 3번, 마지막으로 흐르는 물에 5분 동안 보관하여 수화 반응(hydration)을 하였다.
수화 반응이 끝난 조직을 면역 조직 화학법(immunohistochemistry)를 수행하였다. 면역 조직 화학법을 위해, 조직을 10 mM 나트륨 사이트레이트(sodium citrate, Sigma, No.S4641) 버퍼에 넣고, 5분씩 3 번 전자레인지를 이용해 항원 재표지(antigen retrieval)을 수행하였다. 조직을 흐르는 물에 넣고 식힌 후, 5% 홀스 세럼(horse serum)과 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS(tris buffered saline)을 넣고 2 시간 동안 블로킹하였다. 5% 홀스 세럼과 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS에 혈관 마커인 CD31을 인지하는 항체(SantaCruz, No.SC1506)를 1:200의 비율로 넣고, 4oC 에서 12시간 보관하였다. 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS로 3번 세척한 후, 녹색 형광을 띠는 알렉사 488(Alexa 488)이 붙어있는 이차 항체를 실온에서 1 시간 처리하였다. 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS 로 3 번 세척한 후, 호스트 염색제를 5 μM이 되도록 넣고 다시 10분간 염색하였다. TBS 로 5 번 세척한 후, 커버 글라스를 슬라이드 글라스에 붙이고, 공초점 현미경 상에서 관찰하고 사진에서 녹색으로 염색된 부분의 영역을 측정하였다.
도 28은 사진에서 혈관 부위를 정량화한 그래프이다. 도 28에서 세로 축은 사진에서 녹색 부분(CD31 positive area)의 영역을 나타내며 녹색 영역은 혈관을 나타낸다. 총 10 장의 사진에서 혈관을 정량하였으며, 도 28에 나타난 바와 같이, 마이크로베시클 농도 의존적으로 혈관이 감소함을 확인하였다.
혈관 파괴에 의한 암세포의 분열 감소를 확인하기 위해 수화 반응이 끝난 조직을 면역 조직 화학법을 수행하였다. 면역 조직 화학법을 위해, 조직을 10 mM 나트륨 사이트레이트 버퍼에 넣고, 5분씩 3 번 전자레인지를 이용해 항원 재표지를 수행하였다. 조직을 흐르는 물에 넣고 식힌 후, 5% 홀스 세럼과 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS를 넣고 2 시간 동안 블로킹하였다. 5% 홀스 세럼과 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS에 세포 분열 마커인 인산-히스톤-3(phosphor-histone 3, PH-3)을 인지하는 항체(Upstate, No.06-570)를 1:200의 비율로 넣고, 4oC 에서 12시간 보관하였다. 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS로 3번 세척한 후, 녹색 형광을 띠는 알렉사 488이 붙어있는 이차 항체를 실온에서 1 시간 처리하였다. 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS 로 3 번 세척한 후, 호스트 염색제를 5 μM이 되도록 넣고 다시 10분간 염색하였다. TBS 로 5 번 세척한 후, 커버 글라스를 슬라이드 글라스에 붙이고, 공초점 현미경 상에서 관찰하였다.
도 29는 사진에서 분열하는 세포를 측정한 그래프이다. 도 29에서 세로 축은 사진에서 녹색을 띠는 분열하는 세포(PH3 positive cell)의 갯수를 나타낸다. 총 10 장의 사진에서 세포를 세었으며, 도 29에 나타난 바와 같이, 마이크로베시클 농도 의존적으로 분열하는 세포가 감소함을 확인하였다.
상기 결과를 종합해 볼 때, 독소루비신 로딩 마이크로베시클은 암 조직의 혈관 세포의 파괴를 유도하고, 그로 인해 암세포의 분열이 감소된 것이 명백하다.
실시예 20. 대식세포 유래 독소루비신 로딩 마이크로베시클을 이용한 in vivo 암 조직 혈관으로의 독소루비신 전달 확인
상기 실시예 18에서 사용한 생쥐 대장암 26 세포주 1 × 106 세포를 생쥐의 피부 밑에 주사하고 5일간 키웠다.
실시예 9의 방법에 따라 압출법으로 독소루비신 400 μg/ml 용액에 현탁된 대식 세포로부터 3 μg의 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클(독소루비신-마이크로베시클)을 제조하였다.
10일 후, PBS, 100 μg의 압출법 마이크로베시클을 포함한 PBS용액(독소루비신-마이크로베시클), 30 μg의 독소루비신이 포함한 PBS 용액 100 μl 을 각 1마리의 생쥐 꼬리 정맥에 주사하였다.
6 시간 후, 생쥐로부터 암 조직, 비장(spleen), 심장(heart)을 떼어내고, 4% 파라포름알데하이드에 담궈 24시간 동안 고정하였다. 고정한 조직을 70% 에탄올에 한 시간씩 1 번, 95% 에탈올에 1 시간씩 4번, 100% 에탄올에 1 시간씩 3번, 100% 자일렌에 1시간씩 3번 담궈서 탈수 반응을 시켰다. 이 후, 파라핀에 넣고 고정을 하였다. 파라핀 고정된 조직을 4 μm 두께로 자르고, 슬라이드 글라스에 붙였다. 붙인 조직을 60oC에서 한 시간 보관하여 파라핀을 녹였다. 녹인 조직을 100% 자일렌에 1 분씩 3번, 100% 에탄올에 1 분씩 4번, 95% 에탄올에 1 분씩 3번, 마지막으로 흐르는 물에 5분 동안 보관하여 수화 반응을 하였다.
각 조직으로 전달된 독소루비신을 확인하기 위해 수화 반응이 끝난 조직을 면역 조직 화학법을 수행하였다. 면역 조직 화학법을 위해, 조직을 10 mM 나트륨 사이트레이트 버퍼에 넣고, 5분씩 3 번 전자레인지를 이용해 항원 재표지를 수행하였다. 조직을 흐르는 물에 넣고 식힌 후, 5% 홀스 세럼과 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS를 넣고 2 시간 동안 블로킹하였다. 5% 홀스 세럼과 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS에 혈관 마커인 CD31을 인지하는 항체(SantaCruz, No.SC1506)를 1:200의 비율로 넣고, 4oC 에서 12시간 보관하였다. 0.02% Triton X-100을 넣은 TBS로 3번 세척한 후, 녹색 형광을 띠는 알렉사 488이 붙어있는 이차 항체를 실온에서 1 시간 처리하였다. TBS 로 5 번 세척한 후, 커버 글라스를 슬라이드 글라스에 붙이고, 공초점 현미경 상에서 관찰하였다.
도 30은 암 조직에서 관찰한 사진이고, 도 31은 비장과 심장에서 관찰한 사진이다. 도 30과 도31에서 녹색은 혈관을 나타내며, 빨간색은 독소루비신을 나타낸다.
도 30에 나타난 바와 같이, 독소루비신이 마이크로베시클에 로딩되어 있을 때만 암 혈관으로 전달되고, 독소루비신 자체로는 암 혈관으로 전달되지 않음을 알 수 있다.
상기 결과로부터, 대식 세포 마이크로베시클에 로딩된 독소루비신은 암 조직의 혈관 세포로 전달됨이 명백하다.
도 31에 나타난 바와 같이, 독소루비신 자체를 처리할 경우, 생쥐의 심장으로 많은 양의 독소루비신이 전달되지만, 마이크로베시클에 로딩될 경우 심장으로 전달되는 독소루비신이 감소함을 확인하였다.
상기 결과는 독소루비신에 의해 나타나는 심장 독성이 마이크로베시클을 통해 해결될 수 있음을 의미한다.
실시예 21. 대식세포 유래 독소루비신 로딩 마이크로베시클을 이용한 in vivo 암 사멸 유도
및 독소루비신과의 비교
상기 실시예 18에서 사용한 생쥐 대장암 26 세포주 1 × 106 세포를 생쥐의 피부 밑에 주사하고 5일간 키웠다.
실시예 9의 방법에 따라 압출법으로 독소루비신 400 μg/ml 용액에 현탁된 대식 세포로부터 3 μg의 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클(독소루비신-마이크로베시클)을 제조하였다.
5일 후, PBS, 3 μg의 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클 10 μg 포함한 PBS 용액(독소루비신-마이크로베시클), 각 3 μg, 15 μg, 60 μg의 독소루비신을 포함한 PBS 용액 100 μl 을 각 실험군 별로 5마리씩의 생쥐에 하루에 한 번씩 꼬리 정맥에 주사하고, 이틀에 한 번씩 암 조직의 크기를 측정하였다. 암 조직의 부피는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 v=ls2/2의 식으로 계산하였다.
상기 대장암세포를 피하 접종한 이후 암 조직의 크기를 측정한 결과를 도 32에 나타내었다. 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클을 매일 10 μg씩 주사한 경우가 암 조직의 성장이 가장 느렸다. 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클과 비슷한 효과를 보이는 독소루비신은 60 μg이었다. 이 양은 마이크로베시클에 로딩된 독소루비신보다 20배 높은 농도이다.
도 33은 각 조건당 5 마리의 생쥐의 몸무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 33에 나타난 바와 같이, 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 매일 10 μg씩 주사한 생쥐의 몸무게는 PBS 대조군과 비교하여 의미있는 변화가 없었다. 하지만, 60 μg의 독소루비신을 주사한 생쥐의 몸무게는 의미있게 감소하였다.
케타민:럼푼:PBS를 1:3:6의 비율로 섞은 마취제 150 ㎕를 생쥐의 복강에 투여하여 마취한 후, 심장에서 혈액을 채취하여, 응고 방지용 튜브에 넣었다. 혈액 10 ㎕와 1% HCl 90 ㎕을 섞은 후, 실온에서 7분간 보관하였다. 혈구 계산기에 10 ㎕넣고, 하얗게 반짝이는 세포의 개수를 세었다.
도 34는 이 방법으로 혈액에 존재하는 백혈구 숫자를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 34에 나타난 바와 같이, 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 매일 10 μg씩 주사한 생쥐의 백혈구 수가 줄어들지 않았으나, 60 μg의 독소루비신을 주사한 생쥐의 백혈구는 대조군보다 50%이상 감소하였다.
상기 결과는 마이크로베시클을 통해 독소루비신의 부작용을 줄일 수 있음을 의미한다.
실시예 22. 대식세포 유래 독소루비신 로딩 마이크로베시클을 이용한 in vivo 암 사멸 유도 및 막 단백질의 중요성 확인
상기 실시예 18에서 사용한 생쥐 대장암 26 세포주 1 × 106 세포를 생쥐의 피부 밑에 주사하고 5일간 키웠다.
실시예 9의 방법에 따라 압출법으로 독소루비신 400 μg/ml 용액에 현탁된 대식 세포로부터 3 μg의 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클(독소루비신-압출법 마이크로베시클)을 제조하였다. 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클에 트립신을 처리하여 막 단백질을 제거한 마이크로베시클(독소루비신-압출법 마이크로베시클 (T))을 준비하고, 또한 독소루비신이 로딩된 초음파 분해 마이크로베시클(독소루비신-초음파 분해 마이크로베시클)을 준비하였다.
5일 후, PBS, 3 μg의 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클 10 μg 포함한 PBS 용액, 트립신을 처리한 후 얻은 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클 10 μg을 포함한 PBS 용액, 3.6 μg의 독소루비신이 로딩된 초음파 분해 마이크로베시클 10 μg포함한 PBS 용액 100 μl 을 각 실험군 별로 5마리씩의 생쥐에 하루에 한 번씩 꼬리 정맥에 주사하고, 이틀에 한 번씩 암 조직의 크기를 측정하였다. 암 조직의 부피는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 v=ls2/2의 식으로 계산하였다.
상기 대장암세포를 피하 접종한 이후 암 조직의 크기를 측정한 결과를 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타난 바와 같이, 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클을 매일 10 μg씩 주사한 경우가 암 조직의 성장이 가장 느렸다. 하지만 막 단백질이 제거된 트립신 처리 마이크로베시클과 막 단백질의 topology가 바뀐 초음파 분해 마이크로베시클은 암 조직의 성장에 큰 영향이 없었다.
상기 결과는 마이크로베시클이 작용함에 있어서 막 단백질과 막 단백질의 topology가 중요함을 의미한다.
실시예 23. 대식세포 유래 항암 약물 로딩 마이크로베시클을 이용한 in vivo 암 사멸 유도
실시예 9의 방법에서 독소루비신 용액 대신 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 카보플라틴, EGCG(Epigallocatechin gallate) 용액을 사용하여 대식 세포로부터 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 카보플라틴, EGCG가 로딩된 마이크로베시클을 제조하여 사용하였다.
상기 실시예 18에서 사용한 생쥐 대장암 26 세포주 1 × 106 세포를 생쥐의 피부 밑에 주사하고 5일간 키웠다. 5일 후, 5-플루오로우라실 로딩된 마이크로베시클 15 μg 포함한 PBS 용액, 각각 젬시타빈, 카보플라틴, EGCG가 로딩된 마이크로베시클 10 μg 포함한 PBS 용액 100 μl 를 하루에 한 번씩 생쥐 꼬리 정맥에 주사하고, 이틀에 한 번씩 암 조직의 크기를 측정하였다. 암 조직의 부피는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 v=ls2/2의 식으로 계산하였다.
상기 대장암세포를 피하 접종한 이후 암 조직의 크기를 측정한 결과를 도 36에 나타내었다. 도 36에 나타난 바와 같이, 각 약물이 로딩된 마이크로베시클을 매일 주사한 경우가 암 조직의 성장이 느린 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터, 마이크로베시클에 다양한 약물을 로딩할 수 있고, 각 약물의 항암 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 24. 대식세포 유래 항암 약물 로딩 마이크로베시클을 이용한 in vivo 이종이식(xenograft) 폐암 사멸 유도
인간 폐암세포주인 A549 세포 2 × 106 개를 matrigel과 섞어 NUDE 마우스의 피부 밑에 주사하고 25일간 키웠다.
실시예 9의 방법에 따라 독소루비신 대신 젬시타빈과 카보플라틴을 사용하여 대식 세포로부터 젬시타빈과 카보플라틴이 동시에 로딩된 마이크로베시클을 제조하였다.
25일 후, PBS, 약물이 로딩된 압출법 마이크로베시클 5 μg 포함한 PBS 용액, 약물이 로딩된 압출법 마이크로베시클 20 μg 포함한 PBS 용액 100 μl 을 각 실험군 별로 5마리씩의 생쥐에 이틀에 한 번씩 꼬리 정맥에 주사하고, 이틀에 한 번씩 암 조직의 크기를 측정하였다. 암 조직의 부피는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 v=ls2/2의 식으로 계산하였다.
상기 폐암세포를 피하 접종한 이후 암 조직의 크기를 측정한 결과를 도 37에 나타내었다. 도 37에 나타난 바와 같이 약물이 로딩된 압출법 마이크로베시클을 매일 20 μg씩 주사한 경우가 암 조직의 성장이 가장 느린 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터, 항암 약물 로딩 마이크로베시클을 이용하여 인간 암세포 주 이종 이식 암 조직에 대해서도 항암 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 25. 대식세포 유래 독소루비신 로딩 마이크로베시클을 이용한 in vivo 암 전이 억제
생쥐 흑색종 세포주인 B16BL6 세포 2 × 105 세포를 BNX 마우스에 꼬리 정맥으로 주사하고 3일간 키웠다.
실시예 9의 방법에 따라 압출법으로 독소루비신 400 μg/ml 용액에 현탁된 대식 세포로부터 3 μg의 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 제조하였다.
3일 후, PBS, 0.6 μg의 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클 2 μg 포함한 PBS 용액(독소루비신-마이크로베시클 (2)), 3 μg의 독소루비신이 로딩된 압출법 마이크로베시클 10 μg 포함한 PBS 용액(독소루비신-마이크로베시클 (10)) 100 μl 을 각 실험군 별로 5마리씩의 생쥐에 하루에 한 번씩 꼬리 정맥에 주사하였다.
도 38은 각 조건당 5 마리의 생쥐에서 폐로 전이된 흑색종의 갯수를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 38에 나타난 바와 같이 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 매일 10 μg씩 주사한 생쥐에서 폐로 전이된 흑색종이 가장 작은 것으로 확인되었다. 본 실험은 두 번 수행하였다.
생쥐 10 마리를 이용하여 흑색종을 투여하고 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 넣어 생쥐의 생존율을 확인하였다.
도 39는 생쥐의 생존율을 나타내는 그래프이다. 도 39에 나타난 바와 같이 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클 10 μg을 투여할 경우 생쥐의 생존율이 PBS 대조군에 비해 증가함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 독소루비신 로딩 마이크로베시클을 투여할 경우, 전이암의 성장을 저해할 수 있음이 명백하다.
실시예 26. 골수 조직 유래 마이크로베시클의 제조 및 약물 전달
생쥐의 골수(bone marrow)를 얻기 위해, 생쥐에서 뒷다리의 뼈를 꺼낸 후, 뼈에 붙은 근육 덩어리를 제고하고, 순수하게 뼈만 분리하였다. 1 ml 주사기를 이용해 뼈 속에 들어있는 골수 조직 세포를 꺼냈다. 500 × g에서 원심분리하여 골수 조직 세포를 얻었다. 적혈구를 제거하기 위해, RBC lysis 버퍼(0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH7. 2)에 세포를 넣고, 실온에서 10분간 보관하였다. 500 × g 에서 원심분리한 후, PBS에 세포를 현탁하였다. 상기 현탁액에서 실시예 1의 방법으로 마이크로베시클을 제조하였다.
골수에서 얻은 마이크로베시클이 골수로 타겟팅됨을 보이기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 마이크로베시클을 5 μM의 DiI와 30 분간 배양하였다. DiI는 빨간 형광을 나타내는 염색 물질이다. DiI 표지된 마이크로베시클을 생쥐 꼬리 정맥에 주사하였다. 6시간 후, 생쥐에서 골수 세포를 채취하였다. 채취한 골수 세포에서 적혈구를 제거하고, 남은 세포를 FACS로 분석하였다.
도 40은 FACS 분석 결과를 나타낸다. 마이크로베시클을 주사하지 않은 생쥐를 대조군으로 하였다. 도 40에 나타난 바와 같이, 마이크로베시클을 주사하지 않을 경우, DiI 신호가 2 X 101 이상인 세포는 1.01%이지만, 마이크로베시클을 주사한 생쥐는 2.47%로 약 2.5배 증가함을 확인하였다.
상기 결과는 골수에서 유래한 마이크로베시클은 골수로 타겟팅됨을 의미한다.
골수 유래 마이크로베시클을 이용해 독소루비신을 골수로 전달할 수 있음을 보이기 위해, 골수 유래 세포를 이용해 실시예9의 방법으로 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 제조하였다.
생쥐에 각각, PBS, 80 μg의 마이크로베시클, 24 μg의 독소루비신, 24 μg의 독소루비신의 독소루비신이 로딩된 80 μg의 독소루비신-마이크로베시클을 포함하는 PBS 용액 100 μl 를 생쥐 꼬리 정맥에 주사하였다. 6 시간 후, 각 생쥐에서 골수 세포를 얻고, 골수에 있는 독소루비신의 양을 계산하였다. 독소루비신의 양은 형광을 이용해 실시예 10의 방법으로 측정하였으며, 각 생쥐에서 얻은 골수의 단백질을 측정하여, 노말라이즈(normalize) 하였다.
도 41은 각 그룹당 3 마리의 생쥐에서 얻은 골수에서 1 μg의 단백질 양 대비 존재하는 독소루비신의 양을 나타낸다. 도 41에 나타난 바와 같이. PBS 대조군에서는 1 μg의 단백질 양에 약 20 μg의 독소루비신이 있는 것으로 측정되었으며, 이와 달리 독소루비신-마이크로베시클을 투여한 생쥐의 골수에서는 약 28 μg의 독소루비신이 측정되었다.
상기 결과는 골수 유래 마이크로베시클을 이용해 골수로 독소루비신을 전달할 수 있음을 의미한다. 독소루비신-마이크로베시클에 로딩된 동일양의 독소루비신은 골수로 전달되는 양이 마이크로베시클에 비해 현저히 적었다.
실시예 27. 형질전환 세포를 이용한 세포 특이적 전달
ICAM-1 안티센스 형질전환된 HT1080 세포와 ICAM-1 센스 형질전환된 HT1080 세포에서 독소루비신이 로딩된 마이크로베시클을 실시예 9의 방법에 따라 제조하였다. ICAM-1 안티센스 형질전환된 HT1080 세포 유래 마이크로베시클은 ICAM-1이 로딩되지 않지만, ICAM-1 센스 형질전환된 HT1080 세포 유래 마이크로베시클은 ICAM-1을 로딩하고 있다.
단핵구인 U937 세포를 24 웰 플레이트에 1 × 105 cell을 500 μl의 배지에 접종 한 후, HT2와 HT3세포에서 얻은 마이크로베시클을 0, 0.2, 0.5, 1 μg/ml의 농도로 각각 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 세포 용액 50 μl를 96 웰 플레이트에 넣고, 트립판 블루(trypan blue) 용액 50 μl를 넣었다. 살아있는 세포에서는 트립판 블루가 다시 세포 밖으로 분비되기 때문에, 살아 있는 세포는 트립판 블루로 염색되지 않는다. 혼합된 용액 10 μl를 혈구 계산기(hemocytometer)에 넣고, 광학 현미경에서 트립판 블루가 없는 세포의 개수를 세었다.
도 42는 각 실험군의 세포 수를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 42에 나타난 바와 같이, ICAM-1 센스 형질전환된 HT1080 세포 유래 마이크로베시클과 ICAM-1 안티센스 형질전환된 HT1080 세포 유래 마이크로베시클을 비교하였을 때, 단핵구의 LFA-1과 결합할 수 있는 ICAM-1이 발현된 ICAM-1 센스 형질전환 HT1080 세포 유래 마이크로베시클이 단핵구인 U937 세포의 세포 사멸을 훨씬 더 많이 유도함을 알 수 있다.
상기 결과로부터, 형질전환을 통해 타겟팅 물질을 로딩한 세포 유래 마이크로베시클을 이용하여 세포 특이적 전달이 가능함이 명백하다.
실시예 28. 단핵구 유래 쉐딩 마이크로베시클의 분리 정제 및 약물 로딩
단핵구 세포를 1 × 106 cells/ml의 농도로 10 ml을 준비하고, 10 μM의 사이토칼리신 D (Sigma, No.C8273)를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 24시간 동안 배양했다. 조건 배지(conditioned medium)을 500 × g 에서 10분간 원심분리하고, 얻어진 상층 배양액을 800 × g에서 10분간 두 번 원심분리를 하였다. 이 과정에서 얻은 상층 배양액을 100,000 × g에서 2시간 동안 초원심분리하였다. 침전물을 PBS로 현탁해서 마이크로베시클을 얻었다.
도 43은 사이토칼라신 D를 처리한 세포에서 얻은 쉐딩 마이크로베시클의 투과전자현미경 사진이다.
도 43에 나타난 바와 같이, 얻어진 쉐딩 마이크로베시클은 약 50 ~ 100 nm의 크기를 가짐을 확인할 수 있다.
사이토칼라신 D를 처리하지 않고 얻은 쉐딩 마이크로베시클과 처리한 후 얻은 쉐딩 마이크로베시클에 각각 400 μg/ml의 농도로 독소루비신을 넣은 후, 4°C에서 12 시간 배양하였다. 12 시간 후, 배양액을 100,000 × g에서 2시간 동안 초원심분리하였다. 침전물을 PBS로 현탁해서 독소루비신이 로딩된 쉐딩 마이크로베시클을 얻었다.
실시예 29. 나노입자가 로딩된 쉐딩 마이크로베시클의 분리 및 정제
인간 자궁 경부암세포주인 HeLa세포(ATCC No. CCL-2)를 1 × 107 cells이 되도록 150 mm 플레이트에 접종하였으며 플레이트 내에서 암세포가 80%가 차도록 준비하였다. 카르복실기(-COOH)가 접합된 Qdot 705(Invitrogen, No. Q21361MP)을 5 nM의 농도로 혈청이 없는 배지 20 ml에 섞은 다음 암세포와 함께 24시간 동안 배양하였다. 상기 Qdot을 처리하기 전에 PBS를 이용하여 기존에 키우고 있던 배지를 잘 씻어준 뒤에 Qdot을 포함하는 배지를 처리하였다. 24시간 후, 조건 배지를 거둔 뒤에, 세포 찌꺼기(cell debris)를 제거하기 위해 800 × g에서 10분간 원심분리하고 연속적으로 3000 × g에서 10분간 원심분리를 수행하였다. 세포 찌꺼기가 제거된 세포 상층액 20 ml을 10 kDa 이상의 크기만을 모아주는 원심분리 필터 장비를 이용하여 3000 × g에서 3 ml이 될 때까지 원심분리를 하였다. 5 ml 용량의 초원심분리 튜브에 아래에서부터 각각 50% 옵티프렙 1 ml, 5% 옵티프렙 1 ml, 그리고 농축된 3 ml의 조건 배지를 차례로 담았다. 이후 100,000 × g에서 2시간 동안 초원심분리하였다. 50% 옵티프렙과 5% 옵티프렙 사이의 층에서 Qdot이 로딩된 쉐딩 마이크로베시클을 얻었다.
도 44는 Qdot이 로딩된 쉐딩 마이크로베시클의 TEM 이미지이다. Qdot은 전자 밀도가 높기 때문에 TEM 이미지 상에서 검은색의 점으로 보인다. 도 44에 나타난 바와 같이, Qdot은 대부분 마이크로베시클과 동일한 위치에 위치하고 있음을 확인할 수 있으며, 이를 통해 쉐딩 마이크로베시클에 양자점과 같은 나노입자를 로딩할 수 있음을 확인하였다.
실시예 30. 단핵구 유래 독소루비신 로딩 쉐딩 마이크로베시클을 이용한 약물의 세포 특이적 전달
24 웰 플레이트에 0.1% 젤라틴이 코팅된 커버 글라스를 넣고 커버 글라스 위에 인간 혈관 세포인 HUVEC 세포를 3 × 104의 양만큼 접종한 후, 24 웰 플레이트에서 12 시간 동안 배양하였다. 10 ng/ml이 되도록 TNF-α를 넣고 16 시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 배지 500 μl를 넣고, 5 μg/ml의 농도로 실시예 27의 방법에 따라 분리한 단핵구 유래 독소루비신이 로딩된 쉐딩 마이크로베시클을 처리한 후, 20 분간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 혈청이 없는 배지 500 μl를 넣고 셀트래커 용액을 5 μM이 되도록 넣은 후, 30분간 배양하였다. PBS로 세척한 후, 혈청이 있는 배지를 500 μl 넣고 다시 30분간 배양하였다. 커버 글라스를 4% 파라포름알데하이드 500 μl에 넣고 실온에서 10분간 보관하였다. 커버 글라스를 슬라이드 글라스에 붙인 후, 형광 현미경 상에서 관찰하였다.
도 45는 살아있는 세포를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 45에 나타난 바와 같이 독소루비신이 로딩된, 사이토칼라신 D를 처리하지 않고 얻은 쉐딩 마이크로베시클과 사이토칼라신 D를 처리한 후 얻은 쉐딩 마이크로베시클 모두 세포 사멸을 유도하였음을 알 수 있다.
상기 결과로부터, TNF-a를 처리한 HUVEC 세포에서 세포 사멸 효과가 더 높기 때문에 독소루비신이 로딩된 쉐딩 마이크로베시클이 정상 세포보다 암세포의 사멸을 선택적으로 더 많이 유도할 것을 예상할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.