CN110093274B - 一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种用于增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置及其应用，包括：挤压装置、挤压板；所述挤压装置包括：支架、舵机、arduino开源开发板、连接线和吸盘；所述舵机的一端活动连接在支架上，使舵机能够相对于支架活动；所述arduino开源开发板与舵机连通，以控制舵机进行动作；所述舵机的另一端与连接线的一端连接，所述连接线的另一端与吸盘连接；所述挤压板的表面为氮化镓成分的多孔结构；所述挤压板的表面是需要挤压的细胞接触的面。采用本发明设计的增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，由于挤压板的表面是经过处理后形成的氮化镓成分的多孔结构，从而能够有效地提高细胞外囊泡的产量。

Description

一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置

背景技术

本发明中，背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

分泌细胞外囊泡是细胞的普遍功能。随着近些年细胞外囊泡研究的深入，其具有的包括进行细胞间通信在内的功能与具体机制逐渐被阐明。细胞外囊泡因其能够被其他细胞摄取并发挥调节功能的作用，展现出作为靶向药物潜力。然而细胞外囊泡进行实验室研究和药物化面都临着产量不足的问题。目前国际上权威杂志认可的细胞外囊泡的分离方式主要包括超速离心法、抗体-磁珠分离法等。因受到细胞产出囊泡数量底下的影响，这些方法的易用性和产量均差强人意。除了研究更加高效的分离方法外，增加细胞外囊泡产量的方法也是另一个解决目前问题的途径。然而目前并没有成熟的增加细胞外囊泡产量的技术方式。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置及其应用。通过研究，本发明使用表面微加工后的材料挤压细胞实现了提高细胞外囊泡产量。

本发明的第一目的，是提供一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置。

本发明的第二目的，是提供所述增加细胞产生的细胞外囊数量的泡挤压装置的应用。

为实现上述目的，本发明公开了下述技术方案：

首先，本发明公开一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，包括挤压装置和挤压板；所述挤压装置包括：支架、舵机、arduino开源开发板、连接线和吸盘；

所述舵机的一端活动连接在支架上，使舵机能够相对于支架进行左、右、上、下的运动；所述arduino开源开发板与舵机连通，以控制舵机进行动作；所述舵机的另一端与连接线的一端连接，所述连接线的另一端与吸盘连接，所述挤压板吸附在吸盘上后挤压板上、下表面与连接线垂直；所述挤压板的表面由中国专利201180007613.2的中提供的方法处理后形成的氮化镓成分的多孔结构；所述挤压板的表面作为需要挤压的细胞的接触面。

所述舵机是一种位置(角度)伺服的驱动器，用于那些需要角度不断变化并可以保持的控制系统，例如，在本发明中驱动挤压板等部件。当舵机转动并向上提拉挤压板至最高点时，挤压板的具有氮化镓成分的多孔结构的表面与细胞培养装置的培养细胞表面完全脱离接触；当舵机转动并向下放松挤压板至最低点时，挤压板能够在自身(和/或)配重块的重力作用以及所处液体的浮力作用下，使其具有氮化镓成分的多孔结构的表面与细胞培养装饰的细胞培养表面充分接触，对细胞进行挤压，从而提高培养装置中上层液体中的细胞外囊泡的含量。

所述细胞可以为动物或人类的各类可以进行贴壁生长的细胞，并于细胞培养装置中培养。所述培养装置中的上层液体根据具体细胞的不同可以为DMEM等液体培养基，也可以为PBS等各类能够维持细胞正常形态的等渗透溶液。

可选地，所述舵机的型号为Tower pro^TMSG90。

进一步地，所述挤压装置中的舵机能够在arduino开源开发板的控制和调节下，根据需要将挤压板的压力控制在10-1000Pa，将挤压频率控制在1-100次每分钟，将单次细胞与挤压板的接触时间控制在0.1-10s，所述连接线为手术缝合线。

所述吸盘能够在需要进行细胞外囊泡挤压时将挤压板吸附起来，挤压完毕后再将挤压板从吸盘上脱除下来；例如各种利用真空原理的吸盘等。

进一步地，所述增加细胞产生量的细胞外囊泡挤压装置还包括配重块；所述配重块为中间带有圆孔的聚乙烯片，其形状、规格与挤压板一致。使用时根据需求，将配重块置于挤压板上方，配重块中间的圆孔供连接线及吸盘通过。

进一步地，所述增加细胞产生量的细胞外囊泡挤压装置还包括底座，所述支架固定在底座上。

可选地，所述arduino开源开发板与舵机之间通过导线连通。

可选地，所述支架为带有可动关节的金属等材料制成的支架。

arduino开源开发板(单片机)是一种便携灵活、易于使用的开源电子原型平台，其能够实现对Tower pro^TMSG90舵机按照设定好的频率的控制，例如180°的旋转等。所述arduino开源开发板可以通过市售产品获得或者根据需要的频率等参数向厂家进行定制。

其次，本发明公开所述增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置在生物、医药等领域中的应用。

与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：采用本发明设计的增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，由于挤压板的表面是经过处理后形成的氮化镓成分的多孔结构，从而能够有效地提高细胞外囊泡的产量。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置的结构示意图。

图2为本发明实施例3增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置的结构示意图。

图3为本发明实施例4增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置的结构示意图。

图4为本发明实施例4增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置的结构示意图。

图5为本发明实施例5中挤压处理组粒子直径/数量分布图。

图6为本发明对比例中挤压处理组粒子直径/数量分布图。

附图中标记分别代表：1-支架、2-舵机、3-arduino开源开发板、4-连接线、5-吸盘、6-挤压板、7-配重块、8-底座、9-导线、10-细胞培养装置。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所述，目前国际上权威杂志认可的细胞外囊泡的分离方式主要包括超速离心法、抗体-磁珠分离法等。因受到细胞产出囊泡数量低下的影响，这些方法的易用性和产量均差强人意。除了研究更加高效的分离方法外，增加细胞外囊泡产量的方法也是另一个解决目前问题的途径。然而目前并没有成熟的增加细胞外囊泡产量的技术方式。因此，本发明提出一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，现结合附图及具体实施方式对本发明进一步进行说明。

下列实施例中，所述arduino开源开发板的型号为arduino uno r3，其为市售产品，或者也可以采用其他类型的arduino开源开发板。所述舵机的型号为Tower pro^TMSG90。

实施例1

一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，参考图1，包括挤压装置和挤压板；所述挤压装置包括：支架1、舵机2、arduino开源开发板3、连接线4和吸盘5；

所述舵机2的一端活动连接在支架1上，使舵机2能够相对于支架1进行左、右、上、下的运动；所述arduino开源开发板3与舵机2连通，以控制舵机2进行动作；所述舵机2的另一端与连接线4的一端连接，所述连接线4的另一端与吸盘5连接，所述挤压板6吸附在吸盘上后挤压板上、下表面与连接线4垂直；所述挤压板6的表面是由中国专利文献201180007613.2中提供的方法处理后形成的氮化镓成分的多孔结构；所述挤压板6的表面是需要挤压的细胞接触的面。

所述挤压装置中的舵机2能够在arduino开源开发板3的控制和调节下，根据需要将挤压板的压力控制在10-1000Pa，将挤压频率控制在1-100次每分钟，将单次细胞与挤压板的接触时间控制在0.1-10s。

实施例2

一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，同实施例1，区别在于：所述氮化镓成分的多孔结构的制备方法为：使用201180007613.2专利中的装置和实验方法：使用草酸作为电解质，其浓度为0.03M。n型掺杂GaN(10¹⁸cm^-3)和铂丝构成阳极和阴极，其分别连接到电源以形成电路，电压控制在30v，蚀刻速率为200nm/min，蚀刻时间为5min。蚀刻完毕后使用去离子水，甲醇和戊烷依次洗涤后干燥待用。

实施例3

增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，同实施例1，区别在于：还包括配重块7(参考图2)；所述配重块7为中间带有圆孔的聚乙烯片，其形状、规格与挤压板一致。使用时将配重块7置于挤压板上方，配重块7中间的圆孔供连接线4及吸盘5通过。

实施例4

增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，同实施例1，区别在于：所述增加细胞产生量的细胞外囊泡挤压装置还包括底座8(参考图3)，所述支架1固定在底座8上，且所述支架1为带有可动关节的金属等材料制成的支架。所述arduino开源开发板3与舵机2之间通过导线9连通(参考图3)。

实施例5

实施例4所述的增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置(以下简称为：所述挤压装置)的基本使用原理：

(1)将预先培养的人胶质瘤U172细胞系细胞转入直径为100mm，高度为10mm的培养装置10(培养皿，参考图4)中培养，使转入的细胞数量约为2.5×10⁶个，然后加入含有10％血清的DMEM培养基5ml，于细胞培养箱中培养24h；

(2)将所述挤压装置中的吸盘5、挤压板6、配重块7浸泡于95％的乙醇溶液中30min消毒后安装好备用；

(3)按照需要设置好挤压装置中参数，使得舵机2能够以每分钟10次的频率顺时针/逆时针旋转，两个旋转方向之间的时间间隔为2s；

(4)将连接好的所述挤压装置整体移入超净台，使用紫外线照射1h消毒并等待连接线4、吸盘5、挤压板6、配重块7上的酒精自然挥发，待超净台消毒完成后，将培养24h后的培养皿取出，置于超净台中，打开培养皿盖，使培养皿的中心对准挤压板6的中心；

(5)接通舵机2的电源，控制挤压板6开始挤压细胞，持续30min后关闭电源；然后盖好培养皿盖后继续放回培养箱中而培养12h。吸取培养皿中的上清部分，进行下一步的细胞外囊泡的分离等其他工作；

(6)拆卸挤压装置，将挤压板6使用超声波清洗机清洗10min，放置于洁净的培养皿中等待下次使用。

对实施例4利用表面具有氮化镓成分的多孔结构的挤压板6进行挤压处理的细胞上清液进行收集，使用qEV法对收集的上清液进行分离收集，并分别送检。使用qNano仪器对两组细胞上清中囊泡数量进行检测。qNano仪器主要基于可调电阻脉冲原理(TunableResistive Pulse Sensing,TRPS)来表征粒子(50nm-10um)的一些特征；纳米粒子通过柔性热塑性聚氨酯四臂纳米孔是，对原电场电流产生一个瞬间变化，这个变化可以被捕捉到，并与第三方已知颗粒校准，来分析纳米粒子的大小、浓度和表面电荷。

对比例

作为对比，对利用普通挤压板(材质与前述挤压板相同，但表面未进行氮化镓成分的多孔结构的制备)挤压处理的细胞上清液进行收集，其他结构同实施例4，加压完成后采用与实施例4相同的测试方法进行检测。

测试结果：

实施例4和对比例的测试结果分别如图5、6所示，图中结果表示的是被检测样品中不同直径区间的颗粒数量。其中，从图6可以看出：对比例的粒子直径区间大致分布于50-250nm区间中。通过检测方报告，图6样品的总体粒子数量50-250nm约为约为1.00e+09个。同样的，从图5可以看出：实施例4的粒子直径区间也大致分布于50-250nm区间中，通过检测方报告，图5样品的总体粒子数量50-250nm约为约为1.55e+09个。

可以看出，对比图5与图6的结果，经过约30min的处理就能够使囊泡总量增加50％，效果显著。这是因为：通过氮化镓多微孔结构(通过处理以形成10-200nm的孔)对细胞表面进行挤压，使得细胞的细胞膜(脂质双分子层，具有一定的流动性)发生形变，产生微小凸起，进而产生囊泡，而产生的囊泡释放至培养上清中，便于细胞外囊泡提取和进一步使用。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，其特征在于，包括：挤压装置和挤压板；所述挤压装置包括：支架、舵机、arduino开源开发板、连接线和吸盘；

所述舵机的一端活动连接在支架上，使舵机能够相对于支架活动；所述arduino开源开发板与舵机连通，以控制舵机进行动作；所述舵机的另一端与连接线的一端连接，所述连接线的另一端与吸盘连接；所述挤压板的表面为氮化镓成分的多孔结构；所述挤压板的表面是需要挤压的细胞接触的面。

2.如权利要求1所述的增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，其特征在于，还包括配重块，所述配重块安装在挤压板上。

3.如权利要求2所述的增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，其特征在于，所述配重块为中间带有圆孔的聚乙烯片，其形状、规格与挤压板一致。

4.如权利要求1-3任一项所述的增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，其特征在于，还包括底座，所述支架固定在底座上。

5.如权利要求1-3任一项所述的增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，其特征在于，所述arduino开源开发板与舵机之间通过导线连通。

6.如权利要求1-3任一项所述的增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置，其特征在于，所述支架为带有可动关节的金属材料制成的支架。

7.如权利要求1-6任一项所述的增加细胞产生的细胞外囊泡数量的挤压装置在生物、医药领域中的应用。

Images