CN117136230A - 细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡及其制备方法。本发明的细胞衍生的囊泡是通过将细胞迁移到微孔中来制备的，其表现出表达与细胞自然分泌的外泌体不同的蛋白标记物的特征。与细胞分泌的天然状态的外泌体相比，本发明的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡具有显着优异的细胞内吸收能力，因此，可有效地用于将药物以及标记物等多种活性物质递送到靶细胞内部。

Description

细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡及其制备方法。本发明的细胞衍生的囊泡是通过将细胞迁移到微孔中来制备的，其表现出表达与细胞自然分泌的外泌体不同的蛋白标记物的特征。
背景技术
将靶蛋白直接引入细胞内的方法得到广泛研究。例如，可以制备作为穿过细胞膜的肽的蛋白质转导结构域(Protein Transduction Domain，PTD)和靶蛋白的重组蛋白，使得上述重组蛋白可穿过细胞膜进入细胞质内。HIV-1TAT(人类免疫缺陷病毒1型反式激活调节蛋白(human immunodeficiency virus type-1trans-activating regulatoryprotein))、HSV VP22、Antp、dfTAT以及Hph-1等为众所周知的蛋白质转导结构域。但是，利用上述细胞膜通过结构域(PTD)的方法在以重组蛋白形式生成和分离蛋白质转导结构域和结合靶蛋白的融合蛋白的过程中，由于蛋白质再折叠(refolding)没有正确进行，因而存在产生的蛋白质活性差、非特异性递送以及产量低的问题。
利用如金纳米颗粒(Gold NP，nano particle)、脂质体纳米颗粒(Liposome NP)、磁性纳米颗粒(Magnetic NP)以及聚合物纳米颗粒(Polymeric NP)等多种纳米颗粒并通过将靶蛋白结合到上述纳米颗粒的方法来将靶蛋白递送到细胞内的方法也被广泛使用。与纳米颗粒结合的靶蛋白可以通过胞吞作用(Endocytosis)穿过细胞膜并进入细胞质。但是，大多数纳米颗粒与靶蛋白的结合物在细胞内溶酶体中被降解，存在通过这种降解过程而丧失蛋白质活性的缺点，并且指出了因靶蛋白和纳米颗粒难以单独分离而导致纳米颗粒可能引起毒性的问题。
外泌体(exosome)是指以捕获蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)等的状态分泌到细胞外以实现细胞间信号传递的大小为50～200nm的膜结构小囊。外泌体不直接从质膜脱落，而是起源于称为多泡体(Multivesicular body，MVB)的特定细胞内隔室，并释放、分泌到细胞外。外泌体由多种免疫细胞，包括B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、树突状细胞、巨核细胞(megakaryocyte)以及巨噬细胞等，以及干细胞以及肿瘤细胞生成和分泌。外泌体包括细胞内的多种蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)等，这种物质还通过与细胞膜的融合或内吞作用(endocytosis)重新引入到其他细胞内来起到细胞之间的通讯器的作用。因此，在内部含有靶蛋白的外泌体有望用于体内的多种疾病的治疗，由此最近正在研究利用外泌体的细胞内递送方法。
对利用外泌体向细胞内递送的方法来说，虽然对有效地制备包含靶蛋白的外泌体的方法、通过将外泌体释放到细胞外来增加外泌体产量的方法进行了多种研究，但目前为止尚未广泛报道具有优异的细胞内吸收能力的新型外泌体。
发明内容
技术问题
为此，本发明人在研究可以更好地吸收到细胞内而将靶物质有效递送到细胞内的新型细胞衍生的囊泡的过程中，确认了与细胞自然分泌的外泌体相比，通过将细胞迁移到微孔中来制备的细胞衍生的囊泡表现出不同的膜表面蛋白标记物表达模式，并且表现出更加优异的细胞内吸收能力，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡及其制备方法。
技术方案
为实现上述目的，本发明提供细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡(Cell-derived vesicle，CDV)的制备方法，上述制备方法包括通过将包含细胞的试样迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡的步骤。
并且，本发明提供细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，其特征在于，与细胞分泌的外泌体相比，上述细胞衍生的囊泡增强选自由CD63以及LAMP1组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达。
并且，本发明提供细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，上述细胞衍生的囊泡通过包括如下步骤的方法来制备：通过将包含细胞的试样迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡。
并且，本发明提供用于递送活性成分的组合物，上述组合物包含上述细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡。
并且，本发明提供在体外(in vitro)或离体(ex vivo)将活性成分递送到对象内的方法，上述方法包括用包含活性成分的上述细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡处理对象(subject)的步骤。
并且，本发明提供将活性成分递送到对象内的方法，上述方法包括用包含活性成分的上述细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡处理对象(subject)的步骤。
发明的效果
与细胞分泌的天然状态的外泌体相比，本发明的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡具有显着优异的细胞内吸收能力，因此，可有效地用于将药物以及标记物等多种活性物质递送到靶细胞内部。
附图说明
图1为示出通过DiR荧光标记确认脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDV)以及脐带间充质干细胞分泌的外泌体在BT549中的随时间的吸收能力的结果的图。作为对照组，利用了将DiR添加到磷酸盐缓冲液(PBS)中的样品、未标记的细胞衍生的囊泡(CDVs)以及未标记的外泌体。
图2为示出通过共聚焦显微镜确认脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDVs)和脐带间充质干细胞分泌的外泌体的细胞内吸收的结果的图。
图3为示出通过蛋白质免疫印迹分析确认脐带间充质干细胞(UCMSC)、HEK293(贴壁)、HEK293(悬浮)、细胞衍生的囊泡(CDV)以及外泌体的膜表面蛋白标记物的结果的图。
图4为示出通过图像(Image J)程序定量脐带间充质干细胞(UCMSC)、HEK293(贴壁)、HEK293(悬浮)、细胞衍生的囊泡(CDV)以及外泌体的膜表面蛋白标记物的表达的图(平均±SD，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，未配对双尾T检验(unpaired two-tailed Ttest))。
图5为示出用蛋白酶K(Protease K)处理脐带间充质干细胞、HEK293(悬浮)细胞衍生的CDV以及外泌体，然后确认膜表面蛋白标记物的表达变化的结果的图(平均±SD，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，未配对双尾T检验(unpaired two-tailed T test))。
图6为示出用蛋白酶K(Protease K)处理脐带间充质干细胞、HEK293(悬浮)衍生的CDV以及外泌体，然后确认细胞吸收能力变化的结果的图(平均±SD，**p<0.01；***p<0.001，未配对双尾T检验(unpaired two-tailed T test))。
图7为示出用各膜表面蛋白特异性抗体对脐带间充质干细胞衍生的CDV以及外泌体进行浓度特异性阻断，并确认细胞内吸收能力变化的结果的图(平均±SD，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，未配对双尾T检验(unpaired two-tailed T test))。
图8为示出用各膜表面蛋白标记物特异性抗体对HEK293(悬浮)细胞衍生的CDV以及外泌体进行浓度特异性阻断，并确认细胞内吸收能力变化的结果的图(平均±SD，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，未配对双尾T检验(unpaired two-tailed T test))。
具体实施方式
本发明提供一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡(Cell-derivedvesicle，CDV)及其制备方法以及利用该细胞衍生的囊泡的细胞内活性物质递送方法。
在本发明中，上述“细胞衍生的囊泡(cell-derived vesicle)”可以为细胞内吸收能力增强的囊泡，可以通过将包含细胞的试样迁移到微孔中来制备。因此，本发明涉及一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡(Cell-derived vesicle，CDV)的制备方法，上述制备方法包括通过将包含细胞的试样迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡的步骤。
在本发明中，与起源细胞(originated cell)或由起源细胞自然分泌的外泌体(exosome)相比，上述“细胞衍生的囊泡”可具有增强的细胞内吸收能力。
上述“细胞自然分泌的外泌体”是指细胞在没有单独刺激或处理的情况下分泌的外泌体，可以是通过本领域已知的离心方法从细胞中分离出来的外泌体。在本发明中，如上所述的由细胞自然分泌的外泌体被称为“细胞分泌的外泌体”。
与如上所述的由细胞分泌的外泌体相比，通过将细胞迁移到微孔中来制备的本发明的细胞衍生的囊泡(CDV)增强选自由CD29、flotillin-1、CD63、LAMP1、钙连蛋白(Calnexin)以及GM130组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达；或降低选自由CD81以及CD9组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达，优选地，与细胞分泌的外泌体相比，细胞衍生的囊泡(CDV)可以增强选自由CD29、flotillin-1、CD63、LAMP1、钙连蛋白以及GM130组成的2种以上、3种以上、4种以上、5种以上或者CD29、flotillin-1、CD63、LAMP1、钙连蛋白以及GM130标记物的表达，并降低CD81以及CD9的表达。在本发明中，与外泌体相比的增强是指表达的显着增强，例如，最小2倍至最大59倍的增强。
在本发明中，上述“细胞衍生的囊泡(cell-derived vesicle，CDV)”为在细胞中人工制备的囊泡，具有双磷脂(phospholipid)膜的形式。本发明的特征可在于，与细胞分泌的外泌体相比，上述细胞衍生的囊泡增强尤其与细胞内吸收能力相关的CD63以及LAMP1膜表面蛋白标记物的表达，从而增强细胞内吸收能力。
为了制备本发明的细胞衍生的囊泡，虽然可以使用有核细胞或其转化细胞，但可以不受限制地使用所有能够制备囊泡的细胞，优选地，可以为干细胞、未分化细胞、免疫细胞、体细胞、诱导性多能干细胞或生殖细胞。并且，本发明的细胞可以为选自由脐带间充质干细胞、沃顿胶(Wharton's jelly)间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、扁桃体间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞胚胎肾细胞组成的组中的一种以上细胞，作为具体一实施例，在本发明中利用了人胚胎肾悬浮以及贴壁细胞(HEK293)、脐带间充质干细胞。
本发明的囊泡可通过使用选自由对包含细胞的悬浮液的挤出、超声波降解、细胞裂解、均质化、冷冻-解冻、电穿孔、化学物质处理、机械降解以及对细胞施加外部物理刺激的处理组成的组中的方法来制备，但并不局限于此。在本申请中，通过使用以如下方式挤出到微孔中的细胞挤出机来制备囊泡：向包含细胞的悬浮液试样施加压力，并从大孔径的过滤器到小孔径的过滤器依次进行迁移并挤出。
更具体地，在本发明中，“通过迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡的步骤”可以为通过向具有能够以1至10μm的孔径进行过滤的的膜(membrane)结构的过滤器施加压力来迁移试样的步骤，优选地，可以为从大孔径的过滤器到小孔径的过滤器依次进行迁移的步骤。
并且，本发明提供一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，其特征在于，与细胞分泌的外泌体相比，上述细胞衍生的囊泡增强选自由CD63以及LAMP1组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达。
在本发明中，确认了本发明细胞衍生的囊泡与现有的细胞分泌的外泌体相比具有显着增强的细胞吸收能力，并且确认了优异的细胞吸收能力起因于在细胞衍生的囊泡中表现出显着的表达差异的膜表面蛋白。尤其在本发明中，通过CD63以及LAMP1的表达增强以及对它们的特异性阻断来确认细胞吸收能力的变化，从而确认了上述膜表面蛋白标记物与细胞吸收能力的增强有关。因此，本发明提供一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，其特征在于，与细胞分泌的外泌体相比，上述细胞衍生的囊泡增强选自由CD63以及LAMP1组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达。
上述细胞衍生的囊泡的特征在于，与细胞分泌的外泌体相比，除了上述膜表面标记物之外，还可以增强选自由CD29、flotillin-1、钙连蛋白以及GM130组成的组中的一种、两种、三种或四种膜表面蛋白标记物的表达，或降低选自由CD81以及CD9组成的组中的一种以上或者两种的所有表达。
在本发明中，与细胞分泌的外泌体相比，上述细胞吸收能力增强的细胞衍生的囊泡可以不受限制地使用本发明所属技术领域的普通技术人员已知的可以制备选自由CD63以及LAMP1组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达增强的囊泡的方法来制备，但优选地，上述细胞衍生的囊泡的制备方法可以包括通过将包含细胞的试样迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡的步骤。
并且，本发明提供一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，上述细胞衍生的囊泡通过包括如下步骤的方法来制备：通过将包含细胞的试样迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡。
上述细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡的特征可在于，与细胞分泌的外泌体相比，增强选自由CD63以及LAMP1组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达，进一步地，本发明的特征可在于，与细胞分泌的外泌体相比，增强选自由CD29、flotillin-1、钙连蛋白以及GM130组成的组中的一种、两种、三种或四种膜表面蛋白标记物的表达；或降低选自由CD81以及CD9组成的组中的一种以上、两种的所有表达。
在本发明中，“通过迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡的步骤”可以为通过向具有能够以1至10μm的孔径进行过滤的膜(membrane)结构的过滤器施加压力来迁移试样的步骤，优选地，可以为从大孔径的过滤器到小孔径的过滤器依次进行迁移的步骤。
本发明还提供一种用于递送活性成分的组合物，上述组合物包含上述细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡。
利用上述用于递送活性成分的组合物，可以将活性成分更有效地递送到细胞、组织、器官或包括人类在内的哺乳动物。
并且，本发明提供一种在体外或离体将活性成分递送到对象内的方法，该方法包括用包含活性成分的本发明的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡处理对象(subject)的步骤。并且，本发明提供一种将活性成分递送到对象内的方法，上述方法包括用上述细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡处理对象(subject)的步骤。
在本发明中，被细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡处理的对象可以为细胞、组织、器官或包括人类在内的哺乳动物，当递送方法在体外或离体进行时可以为细胞、器官或组织。
由于包含上述用于递送活性成分的组合物或利用于上述方法的细胞衍生的囊泡比现有的细胞分泌的外泌体可以更有效地吸收到细胞内，因此可以更有效地递送活性成分。在此情况下，细胞衍生的囊泡可以在其内部或外部包含或负载所要递送的活性成分，或可以处于与活性成分结合的状态。
作为可通过本发明的细胞衍生的囊泡递送到细胞的活性成分，可以不受限制地包括可通过递送到细胞中来表达期望的效果的物质，但优选地，可以是选自由抗真菌剂、抗细菌剂、抗菌剂、抗氧化剂、清凉剂、舒缓剂(Soothing Agent)、伤口愈合剂、抗炎剂、抗衰老剂、抗皱剂、皮肤美白剂、抗癌剂、血管生成抑制剂(angiogenesis inhibitor)、肽(peptide)、蛋白质(protein)、毒素(toxin)、核酸(nucleic acid)、珠(bead)、微粒(microparticle)、纳米颗粒(nanoparticle)蛋白质以及化合物组成的组中的一种以上。
在此情况下，上述用于细胞内递送活性成分的组合物可以为药物组合物，并且可以包括在生物制剂中常用的载体、稀释剂、赋形剂或两种或多种组合。药学上可接受的载体不受特别的限制，只要其适合向体内递送组合物即可，例如，可以为化合物、盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇或这些成分中的一种以上的混合物。在此情况下，根据需要可以添加抗氧化剂、缓冲剂以及抑菌剂等其他常规添加剂。在配制上述组合物时，常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂以及表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。
本发明的组合物可以被配制成口服制剂或肠胃外制剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂以及锭剂等，这些固体制剂可以通过在一种以上组合物中混合至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、半乳糖以及明胶等来制备。并且还可以添加苯乙烯酸镁、滑石粉等多种润滑剂。另一方面，液体制剂可以包括悬浮剂、内溶液剂、乳剂或糖浆剂等，其中可包含赋形剂如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。
用于肠胃外给药的制剂可以包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮溶剂以及乳剂等注射剂。
作为非水性溶剂、悬浮溶剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射酯等。
本发明的组合物可根据所需的方法口服给药或肠胃外给药，肠胃外给药可以选自皮肤外用或腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉注射、肌肉内注射、胸内注射、鼻内(intranasal)给药、眼内(intr avitreal)注射、鞘内(intrathecal)注射或脑室内(intracerebroventricu lar)注射等多种注入方式，但不限于此。
本发明的组合物按药物有效量给药。这可能因疾病的种类、严重程度、药物的活性、对药物的敏感度、给药时间、给药途径和排泄率、治疗周期以及同时使用的药物等而异。本发明的组合物可单独给药或与其他治疗剂联合给药。当联合给药时，可以依次或同时给药。
考虑到本说明书的复杂性，省略了重复的内容，本说明书中未另外定义的术语具有本发明所属技术领域中常用的含义。
本发明的实施方式
实施例1.试样的制备
分别从脐带间充质干细胞(UCMSC)、人胚胎肾悬浮细胞(HEK 293 suspensioncell)以及贴壁细胞(HEK 293 adherent cell)获得细胞衍生的囊泡(Cell-derivedvesicle，CDV)和分离成细胞分泌状态的外泌体，并将它们作为试样来制备。
分别具体制备如下。
1.1脐带间充质干细胞(UCMSC)
脐带间充质干细胞(UCMSC)是在帕拉塞尔苏斯医科私立大学(ParacelsusMedical Private University，PMU)的良好生产规范(GMP，Good ManufacturingPractice)设施下生产的。将脐带间充质干细胞接种在包含DMEM低葡萄糖培养基(GibcoBRL，马萨诸塞州(MA)，美国(USA))的两层(Corning公司，纽约(NY)，美国)，在上述培养基中添加了4％的人血小板裂解物(human platelet lysate，hPL；Helios，AventaCell Biomedica公司，佐治亚州，美国)和1％的青霉素-链霉素(Gibco BRL，马萨诸塞州，美国)。细胞在37℃温度、5％的二氧化碳环境中培养，并且每天监测细胞生长。经两次的传代培养，然后以2.5×105细胞/mL(cells/mL)的浓度获得细胞并重悬于磷酸盐缓冲液(PBS，Gibco BRL，马萨诸塞州，美国)中。将细胞悬浮液用孔径为10μm、3μm以及0.4μm(Whatman Inc公司，新泽西州(NJ)，美国)的过滤器依次挤出来获得脐带间充质干细胞衍生的囊泡(Cell derived vesicle，以下简称CDV)。之后，通过利用过滤组件(MidiKros)截留分子量(MWCO)为750千道尔顿(kDa)中空纤维的过滤器，使用以通过孔径为0.45μm的过滤器(赛多利斯公司(Sartorious)，哥廷根大学(Gottingen)，德国(Germany))的方式形成的切向流过滤(TFF，tangential flow filtration，Repligen公司，加利福尼亚州(CA)，美国)装置进行纯化。利用qEV10(Izon公司，马萨诸塞州，美国)进行免疫印迹，通过尺寸排阻色谱法进一步纯化CDV。
为了获得脐带间充质干细胞衍生的外泌体，首先使用上述细胞培养相同的方法和培养基组成来培养脐带间充质干细胞。经两次的传代培养后，当细胞的汇合度(confluency)约为80％时，用过滤4％的外泌体的人血小板裂解物(hPL)和添加1％的青霉素-链霉素的DMEM低葡萄糖培养基来代替。将培养24小时后获得的培养基依次以300xg离心10分钟、以2000xg离心10分钟以及以10000xg离心30分钟，去除细胞碎片和死细胞，然后以120000xg超速离心2小时(Beckman Coulter公司，加利福尼亚州，美国)。去除上清液并重悬于磷酸盐缓冲液中，然后通过再次以120000xg超速离心2小时来获得外泌体。将纯化的脐带间充质干细胞衍生的细胞分泌的外泌体用于后续实验。
1.2人胚胎肾悬浮细胞(HEK 293suspension cell)和贴壁细胞(HEK 293adherentcell)
将人胚胎肾悬浮细胞(HEK 293suspension cell，以下简称HEK 293(悬浮))接种到装有FreeStyle F17培养基且添加4mM Glutamax(Gibco BRL，美国)和0.2％普朗尼克F68(Pluronic F68，Gibco BRL，美国)的250mL烧瓶中。在37℃、8％的二氧化碳环境中以120rpm培养细胞，并进行了两次的传代培养。收集细胞后以5×105细胞/mL(cells/mL)的浓度重悬于磷酸盐缓冲液中。利用与从脐带间充质干细胞获得细胞衍生的囊泡(CDVs)的方法相同的方法从HEK293(悬浮)细胞提取CDV，从而获得HEK293(悬浮)-细胞衍生的囊泡(CDVs)，并使用TFF装置纯化并去除杂质。为了进行蛋白质免疫印迹实验，利用qEV10(Izon公司，马萨诸塞州，美国)尺寸排阻色谱法进一步分离和纯化细胞衍生的囊泡(CDVs)。
为了获得HEK293(悬浮)衍生的外泌体，首先使用与上述相同的细胞培养方法和培养基组成培养HEK293(悬浮)。经两次的传代培养后获得培养基并以10000xg超速离心30分钟，取上清液并以与纯化HEK293(悬浮)-CDV时相同的方法进行纯化。
将人胚胎肾贴壁细胞(HEK 293adherent cell，以下简称HEK 293(贴壁))接种到添加10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的T175烧瓶(Thermo Scientific公司，马萨诸塞州，美国)中的MEM-alpha培养基(Gibco，BRL，马萨诸塞州，美国)中。在37℃、5％的二氧化碳条件下培养细胞，进行两次的传代后收集细胞，以5×105细胞/mL(cells/mL)的浓度重悬于磷酸盐缓冲液中。之后，通过与上述HEK293(悬浮)细胞相同的方法从人胚胎肾贴壁细胞生成HEK293(贴壁)-CDV和HEK293(贴壁)-外泌体。
从每个细胞分离出的CDV以及外泌体用于后续实验。
实施例2.CDV和细胞分泌的外泌体的细胞内吸收能力的比较
进行实验以确认通过上述实施例1获得的脐带间充质干细胞衍生的CDVs和外泌体吸收于细胞内的吸收能力是否存在差异。利用三阴性乳腺癌细胞系(BT549)作为靶细胞。将实施例1中制备的1×1011个细胞衍生的囊泡(CDVs)和细胞分泌的外泌体颗粒(particles)分别用5μM DiR(Thermo Scientific公司，马萨诸塞州，美国)进行处理，然后在37℃温度下培养30分钟并标记膜。根据制造商的指示，通过尺寸排阻色谱法(size exclUSionchromatography，PD-10，GE，伊利诺伊州(IL)，美国)去除未用于标记的DiR。作为对照组的DiR对照组，在磷酸盐缓冲液中用5μM DiR处理，然后进行与上述细胞衍生的囊泡(CDVs)以及外泌体的标记方法相同的过程。CDV以及外泌体的对照组分别以相同的方法来制备，除了用磷酸盐缓冲液代替DiR。
将三阴性乳腺癌细胞系以4×104细胞/m(cells/ml)的细胞密度铺展在24孔板(用于流式细胞仪)或玻璃盖玻片(用于显微镜分析)后培养17小时或更长时间，使得细胞贴壁。培养的三阴性乳腺癌细胞系用DiR标记的细胞衍生的囊泡(CDVs)(DiR-CDV)、外泌体(DiR-外泌体)以及对照组以1×105颗粒/细胞(particles/cell)进行处理，并在37℃温度下分别培养1小时、3小时、6小时、18小时、24小时以及48小时。在使用流式细胞仪测定对照组(DiR对照组，细胞衍生的囊泡(CDVs)，外泌体)、DiR-CDV以及DiR-外泌体的细胞内吸收率随时间的荧光强度后定量并以图表示出。在图1中示出了细胞衍生的囊泡(CDVs)与外泌体的细胞内吸收率的比较结果。
如图1所示，在作为对照组的未标记的脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDVs(CDV))、脐带间充质干细胞-外泌体(外泌体)以及DiR对照组(DiR)中，确认了与时间无关地均未检测到荧光值，而DiR-细胞衍生的囊泡(CDVs)和DiR-外泌体的荧光强度随时间增强。这表明DiR-细胞衍生的囊泡(CDVs)和DiR-外泌体随时间均被有效地吸收到BT549的细胞内，在所有观察时间中，细胞衍生的囊泡(CDVs)表现出比外泌体约大2倍的细胞内吸收。
并且，为了直接观察以及比较细胞衍生的囊泡(CDVs)和外泌体的细胞内吸收，利用共聚焦显微镜并通过免疫荧光染色图像确认了细胞衍生的囊泡(CDVs)以及外泌体的随时间的细胞内吸收率。对用DiR标记的脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDVs)(DiR-细胞衍生的囊泡(CDV))(红色)或用DiR标记的脐带间充质干细胞-外泌体(DiR-Exo)(红色)处理3小时、6小时以及24小时的BT549细胞，用Alexa Fluor-488β-微管蛋白(tubulin)(细胞质；绿色)和赫斯特(Hoechst)(细胞核；蓝色)染色，在每个反应时间后，使用共聚焦显微镜观察BT549细胞，结果如图2所示。
如图2所示，与细胞分泌的外泌体相比，细胞衍生的囊泡(CDV)表现出更强的细胞吸收，这与之前确认的FACS结果一致。如上所述的细胞衍生的囊泡(CDV)的高细胞内吸收能力的结果表明细胞衍生的囊泡(CDV)比细胞分泌的外泌体更适合作为细胞内药物递送系统。
实施例3.CDV和细胞分泌的外泌体的表面蛋白分析
通过实施例2确认了CDV与细胞分泌的外泌体相比具有优异的细胞内吸收能力，并且进行实验以确认这种细胞吸收能力的差异是否起因于膜表面蛋白差异。首先，进行了蛋白质免疫印迹分析以确认存在于各个CDV和细胞分泌的外泌体的表面蛋白。
将脐带间充质干细胞、HEK293(贴壁)以及HEK293(悬浮)细胞和从上述细胞生成的各个细胞衍生的囊泡(CDVs)以及外泌体中包含的外泌体标记物(CD9、CD29、CD63以及CD81)以及细胞器标记物(Flotilin-1、LAMP1、钙连蛋白、GM130、Lamin B1、柠檬酸合酶(Citratesynthase))通过BoltTM 4～12％ Bis-Tris PlUS凝胶(PlUS gel，Invitrogen公司，马萨诸塞州，美国)分离，并将蛋白质转移到PVDF膜(Life Technologies公司，马萨诸塞州，美国)。使得该膜与作为第一抗体的抗CD63(anti-CD63，Life Technologies公司，马萨诸塞州，美国)、抗CD81(anti-CD81，Abcam公司，马萨诸塞州，美国)、抗CD9(anti-CD9，LifeTechnologies公司，马萨诸塞州，美国)、抗LAMP1(anti-LAMP1)、抗calnexin(anti-calnexin，Abcam公司，马萨诸塞州，美国)、抗CD29(anti-CD29，Abcam公司，美国)、抗GM130(anti-GM130，Abcam公司，马萨诸塞州，美国)、抗柠檬酸合酶(anti-citrate-synthase，Abcam公司，马萨诸塞州，美国)、anti-flotillin-1(Cell signaling公司，马萨诸塞州，美国)、抗核纤层蛋白B1(anti-lamin B1，Abcam公司，马萨诸塞州，美国)以1：2500的稀释比例反应17小时或更长时间。下一步，用1×TBST(Biosensang，首尔，韩国)冲洗膜，以1：2500的稀释比例添加第二抗体并反应1小时。用1×TBST再次冲洗后使用Amersham ECL Prime蛋白质印迹检测试剂(Amersham ECL Prime western blotting detection reagent，GE公司，伊利诺伊州，美国)通过Gel-Doc(Biorad公司，加利福尼亚州，美国)系统确认各个蛋白质。通过使用图像程序(Image J program)对从细胞中获得的蛋白条带的强度进行定量，然后显示测定值。图3以及图4示出了通过蛋白质免疫印迹分析结果以及图像程序来定量的结果。
如图3和图4所示，CD63以及flotillin-1比外泌体在细胞衍生的囊泡(CDVs)中的表达至少高3倍，钙连蛋白、LAMP1以及GM130等细胞器标记物比外泌体在细胞衍生的囊泡(CDVs)中的表达至少高6倍，而CD9以及CD81比外泌体在细胞衍生的囊泡(CDVs)中的表达至少低7倍以上。并且，Lamin B1以及柠檬酸合酶(Citrate synthase)与其他蛋白标记物相比在CDV以及外泌体中的表达较低。
在标记物中，与HEK293(贴壁)-外泌体相比，CD29在HEK293(贴壁)-细胞衍生的囊泡(CDV)中的表达约高7倍，与脐带间充质干细胞-外泌体相比，CD9在脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDV)中的表达约低100倍。
通过如上所述结果，确认了本发明的CDV与通过离心分离方法分离的细胞分泌的外泌体相比表现出显着不同的标记物表达模式的特性，并且表现出与起源细胞不同的标记物表达模式。
实施例4.根据膜表面蛋白酶处理的细胞内吸收率的比较
通过实施例2和实施例3，确认了与细胞分泌的外泌体相比，细胞衍生的囊泡(CDVs)表现出较高的细胞内吸收率，并且在膜表面蛋白标记物的表达中表现出显着差异。本发明所要确认这种膜表面蛋白标记物的显着表达差异是否与细胞内吸收率的差异相关。具体地，用蛋白酶(Proteinase K)处理脐带间充质干细胞、HEK293(悬浮)细胞衍生的CDV以及细胞分泌的外泌体，并降解CDV以及外泌体的表面蛋白标记物。之后，比较了经过蛋白酶(Proteinase K)处理和未经过蛋白酶(Proteinase K)处理的CDV以及外泌体的细胞内吸收率的变化。
首先，进行实验以确认CDV或外泌体表面蛋白标记物是否根据蛋白酶的处理而良好地降解。更具体地，通过实施例1的方法从脐带间充质干细胞以及HEK293(悬浮)细胞生成CDV以及外泌体。之后，通过二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)测定法来测定细胞衍生的囊泡(CDVs)和外泌体的蛋白质浓度。然后，用浓度为2μg蛋白酶/μg(proteinase K，Thermo Scientific公司)的蛋白质处理细胞衍生的囊泡(CDVs)和外泌体，然后每15分钟进行一次涡旋(vortexing)，并在37℃温度下培养1个小时。之后，将这些样品在90℃温度下加热5分钟来抑制蛋白酶的活性。利用5μm醛珠(aldehyde bead，Thermo Scientific公司，马萨诸塞州，美国)流式细胞仪(FACS，日本索尼公司(Sony Japan))来分析膜蛋白质的降解程度。在脐带间充质干细胞、HEK293(悬浮)细胞衍生的CDV以及外泌体中确认作为表面标记蛋白的CD63、CD81、CD9、CD29以及LAMP1的表达变化，并且在图5示出了其结果。
如图5所示，确认了蛋白酶处理后CD81、CD9、CD29以及LAMP1的蛋白标记物的表达量大大降低。相反，在CD63的情况下，确认了通过蛋白酶处理的降解无效。众所周知，这可能是因为CD63的蛋白酶识别位点过度糖基化或CD63具有“由内而外”的拓扑结构而不受蛋白酶的影响。
由于除CD63外的其他蛋白标记物随着蛋白酶处理而在CDV以及外泌体表面中的表达量均降低，因此比较细胞内吸收效率以查看细胞内吸收率是否根据这种降低而改变。以与实施例2相同的方式对用蛋白酶处理的CDV以及外泌体进行荧光标记，在作为人三阴性乳腺癌细胞系的BT549中确认了细胞内吸收率。
如图6所示，在用作为蛋白酶的蛋白酶K(proteinase K)处理的所有实验组中，确认了细胞内吸收率显着降低。尤其，根据蛋白酶处理，CDV表现出与细胞分泌的外泌体相似或更低的吸收率，导致吸收率降低约50％以上。与脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDVs)相比，HEK-细胞衍生的囊泡(CDV)表现出更大的吸收率降低。相反，在表面蛋白降解后在外泌体(UCMSC-Exo；HEK-Exo)中观察到相对较小的吸收率降低。这种结果表明，CDV的细胞吸收与细胞衍生无关而是与CDV的膜表面蛋白标记物有关。
实施例5.根据膜表面蛋白阻断的细胞内吸收率的比较
利用基于已知外泌体表面蛋白标记物筛选的标记物的抗体阻断细胞衍生的囊泡(CDVs)以及外泌体的表面蛋白，然后比较细胞内吸收率。在外泌体的表面蛋白标记物中，首先主要对现有研究中已知的标记物进行实验，在细胞器标记物中，使用了作为溶酶体蛋白质的LAMP1。利用脐带间充质干细胞、HEK293(悬浮)细胞衍生CDV以及外泌体作为试样。
对于每个样品，根据上述实施例2的方法，将从用DiR标记物的脐带间充质干细胞以及HEK293(悬浮)细胞制备的2×109个细胞衍生的囊泡(CDVs)和外泌体(以下简称DiR-CDV；DiR-外泌体)颗粒(particles)分别与1：100；1：1000；1：10000浓度的抗体(针对CD63、CD29、CD81、CD9、CD29以及LAMP1的抗体，BD Biosciences，马萨诸塞州，美国)一同在4℃、黑暗条件下反应30分钟。之后，用各个浓度的抗体处理的各个DiR-CDV和DiR-外泌体立即用于测定细胞内吸收率的实验。将作为人三阴性乳腺癌细胞系的2×104个BT549细胞(cells)涂敷于48孔板后培养17个小时或更长时间，使得细胞贴壁。区分由各抗体阻断的DiR-细胞衍生的囊泡(CDVs)以及DiR-外泌体，并以1×105颗粒/细胞(particles/cell)处理各个三阴性乳腺癌细胞，在37℃温度下培养24小时。使用流式细胞仪测定对照组(未用抗体处理的DiR-细胞衍生的囊泡(CDVs)、未用抗体处理的DiR-外泌体)、抗体处理的DiR-细胞衍生的囊泡(CDV)以及抗体处理的DiR-外泌体的荧光强度后定量并以图表示出细胞内吸收率。由于细胞衍生的囊泡(CDVs)和外泌体的细胞内吸收程度不同，为了进行比较分析，将各对照组(未用抗体处理的DiR-细胞衍生的囊泡(CDVs)、未用抗体处理的DiR-外泌体)的值定量为100％后相对比较DiR的表达。图7示出通过脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDV)以及脐带间充质干细胞-外泌体的表面蛋白标记物阻断来确认细胞内吸收率的结果，图8示出通过HEK293(悬浮)-细胞衍生的囊泡(CDV)以及HEK293(悬浮)-外泌体表面蛋白标记物阻断来确认细胞内吸收率的结果。
如图7所示，在CD63和LAMP1的情况下，随着抗体浓度逐渐增强，脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDVs)的细胞内吸收程度逐渐降低。特别是在CD63的情况下，当CD63被抗CD63(anti-CD63)抗体阻断时，脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDVs)的细胞内吸收效率最显着降低了50％以上。相反，在CD81、CD9以及CD29的情况下，根据各个抗体浓度的脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDVs)的细胞内吸收率未表现出较大变化。并且，在脐带间充质干细胞-外泌体的情况下，当特定表面蛋白标记物(CD63、CD9、CD29)被各个抗体阻断时，细胞内吸收率以浓度依赖性方式降低约20～30％，但其降低率并不大于用脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDVs)阻断CD63抗体时的降低率。
如图8所示，确认了根据CD63抗体阻断的HEK293(悬浮)-细胞衍生的囊泡(CDVs)的细胞内吸收率以抗体浓度依赖性方式降低，当用高浓度抗体处理时，确认了细胞内吸收降低约40％。并且，与脐带间充质干细胞不同，可以观察到HEK293(悬浮)-细胞衍生的囊泡(CDVs)和HEK293(悬浮)-外泌体的细胞内吸收通过CD81的阻断以抗体浓度依赖性方式被抑制。并且，根据LAMP1抗体的阻断的HEK293(悬浮)-细胞衍生的囊泡(CDV)的细胞内吸收与脐带间充质干细胞-细胞衍生的囊泡(UCMSC-CDVs)同样地以浓度依赖性方式降低。
通过如上所述结果，确认了与细胞分泌的外泌体相比，表现出高细胞吸收能力的CDV的特征以与外泌体区分的膜表面蛋白标记物表达为基础。CDV或细胞分泌的外泌体的细胞内吸收机制根据细胞的种类而异，CDV和细胞分泌的外泌体被认为分别具有不同的标记物来参与细胞吸收。相反，确认了CD63和LAMP1对CDV的细胞内吸收能力造成影响，而与细胞种类无关。
以上，对本发明内容的特定部分进行了详细阐述，对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言显而易见的是，这些具体阐述仅为优选实施例，而并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附发明要求保护范围以及其等同技术方案限定。

Claims (15)

1.一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡的制备方法，其特征在于，包括通过将包含细胞的试样迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡的步骤。
2.根据权利要求1所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡的制备方法，其特征在于，与细胞分泌的外泌体相比，上述细胞衍生的囊泡增强选自由CD29、flotillin-1、CD63、LAMP1、钙连蛋白以及GM130组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达，或降低选自由CD81以及CD9组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达。
3.根据权利要求1所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡的制备方法，其特征在于，向上述微孔的迁移从大孔径到小孔径依次进行。
4.根据权利要求1所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡的制备方法，其特征在于，向上述微孔的迁移是通过压力进行的。
5.根据权利要求1所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡的制备方法，其特征在于，上述细胞衍生的囊泡为有核细胞衍生的囊泡。
6.根据权利要求1所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡的制备方法，其特征在于，上述细胞衍生的囊泡为干细胞、未分化细胞、免疫细胞、体细胞、诱导性多能干细胞或生殖细胞衍生的囊泡。
7.根据权利要求1所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡的制备方法，其特征在于，上述细胞衍生的囊泡为选自由脐带间充质干细胞、沃顿胶间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、扁桃体间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞以及胚胎肾细胞组成的组中的一种以上细胞衍生的囊泡。
8.一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，其特征在于，与细胞分泌的外泌体相比，增强选自由CD63以及LAMP1组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达。
9.根据权利要求8所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，其特征在于，与细胞分泌的外泌体相比，增强选自由CD29、flotillin-1、钙连蛋白以及GM130组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达。
10.根据权利要求8所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，其特征在于，与细胞分泌的外泌体相比，降低选自由CD81以及CD9组成的组中的一种以上膜表面蛋白标记物的表达。
11.根据权利要求8所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，其特征在于，上述细胞衍生的囊泡通过包括如下步骤的方法来制备：通过将包含细胞的试样迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡。
12.一种细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡，其特征在于，上述细胞衍生的囊泡通过包括如下步骤的方法来制备：通过将包含细胞的试样迁移到微孔中来制备细胞衍生的囊泡。
13.一种用于递送活性成分的组合物，其特征在于，上述组合物包含根据权利要求8至12中任一项所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡。
14.一种在体外或离体将活性成分递送到对象内的方法，其特征在于，包括用包含活性成分的根据权利要求8至12中任一项所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡处理对象的步骤。
15.一种将活性成分递送到对象内的方法，其特征在于，包括用包含活性成分的根据权利要求8至12中任一项所述的细胞内吸收能力增强的细胞衍生的囊泡处理对象的步骤。
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