WO2007132852A1 - 難水溶性医薬 - Google Patents

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WO2007132852A1
WO2007132852A1 PCT/JP2007/059967 JP2007059967W WO2007132852A1 WO 2007132852 A1 WO2007132852 A1 WO 2007132852A1 JP 2007059967 W JP2007059967 W JP 2007059967W WO 2007132852 A1 WO2007132852 A1 WO 2007132852A1
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WO
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drug
microchannel
laser light
tumor
suspension
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Application number
PCT/JP2007/059967
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroyuki Kato
Isao Umeda
Kazuo Watanabe
Kazuya Hirata
Akio Ishiguro
Tetsu Go
Original Assignee
Ebara Corporation
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Publication date
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Priority to JP2007554780A priority patent/JP4204634B2/ja
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/146—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a poorly water-soluble ultrafine drug and a complex thereof with a polymer electrolyte. More specifically, the present invention relates to an ultrafine drug particle obtained by atomizing a particle by irradiating a laser beam, and an ultrafine particle-polyelectrolyte complex.
  • Japanese Patent Application No. 2006-135677 filed in this application [Kebasa claims priority and uses the contents here.
  • Some drugs that are sparingly soluble in solvents such as anticancer drugs, have poor bioavailability because they are poorly water-soluble and difficult to be absorbed by cells. Therefore, a solubilizing agent is often used for the purpose of improving the bioavailability by increasing the solubility of a poorly water-soluble drug and making it easily soluble in water for use as an injection.
  • a solubilizing agent is often used for the purpose of improving the bioavailability by increasing the solubility of a poorly water-soluble drug and making it easily soluble in water for use as an injection.
  • the toxicity of this solubilizing agent is a problem. Met.
  • the organic compound in the liquid to be treated is irradiated with laser light having a wavelength longer than the absorption band of the organic compound to form the organic compound into fine particles.
  • has been proposed see, for example, Patent Document 2.
  • a method for producing ultrafine particles by irradiating an organic Balta crystal dispersed in a poor solvent with an ultra-short pulse laser to induce dispersion by nonlinear absorption and pulverizing the organic Balta crystal. (For example, see Patent Document 3).
  • a coarse particle powder of an organic compound dispersed in a solvent in a transparent container is externally irradiated with a laser beam having a wavelength longer than the absorption band or an ultrashort pulse laser to pulverize the organic compound in the solvent. It is a method to do. Compared with the method that linearly absorbs light with an absorption band wavelength, these methods enable relatively mild organic compound fine particles and the possibility of decomposition of the organic compound is relatively low. It is stated that this is a suitable method for making fine particles of small amounts of sparingly soluble organic compounds, especially drugs.
  • the principle of pulverization by laser light irradiation is assumed to be thermal stress destruction caused by short-time heating by pulse heat input, but in order to make ultrafine particles without causing alteration of the drug,
  • the laser energy absorption characteristics and the setting of the laser irradiation time are important parameters.
  • laser beam irradiation is performed while the drug is dispersed and stirred in the solvent in the container, so it is difficult to control the conditions such as setting the laser beam irradiation time and uniformly irradiating the dispersed particles with the laser. It is.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-113159
  • Patent Document 2 JP-A-2004-267918
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-238342
  • An object of the present invention is to provide a buy that has a uniform particle size within a target range and no change in medicinal effect. It is to provide a poorly water-soluble particulate anti-drug having the highest availability and a complex of such a poorly water-soluble particulate drug and a polyelectrolyte.
  • a particulate poorly water-soluble drug with an average diameter of 50 to 200 nm.
  • the polyelectrolyte is protamine, gelatin A, collagen, albumin, casein, chitosan, poly (L) lysine, carboxymethylcellulose, alginate, heparin, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, gelatin B, carrageenan, dextran.
  • the complex according to 7 above which is selected from the group consisting of another synthetic polymer or a polymer force in which they are cross-linked with an appropriate linker.
  • the ultrafine drug of the present invention and the complex thereof with a polymer electrolyte can be prepared as a stable and contamination-free excellent colloidal dispersion, and can be used for various injections. Therefore, the microparticulate pharmaceutical of the present invention, and the complex of it and the polymer electrolyte are directly Can be injected into the tube.
  • the absorption rate is low due to poor water solubility, so that it is difficult to move in a small amount into the body, or the drug is altered by gastric juice or enzymes, etc., and the effect disappears.
  • the drug of the present invention is injected into a blood vessel and transported at a very high speed, and the drug reaches the target site from the administration site very quickly.
  • the ultraparticulate medicament of the present invention particularly an anticancer agent, and a complex of a polyelectrolyte are difficult to pass through normal vascular endothelial cells in which the tissue gap of vascular endothelial cells is relatively narrow, The tissue gap is relatively wide and easily passes through the vascular endothelial cells where the cancer cell strength is increased, and is absorbed by the cancer cells.
  • the microparticulate anti-pharmaceutical of the present invention and the complex of the polyelectrolyte hardly pass normal vascular endothelial cells during transport to the target site, and thus have less adverse effects on normal cells.
  • the anticancer drug is strong!
  • microparticulate medicament of the present invention in particular the anticancer agent and the complex of the polymer electrolyte, has a higher bioavailability that is more likely to be absorbed by cancer cells than conventional drugs. In addition, there is little influence by reducing individual differences such as drug absorption.
  • Fig. 1 is a diagram showing the entire batch micronization apparatus used for preparing the particulate poorly water-soluble drug and complex of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the entire continuous atomization apparatus used for preparing the particulate poorly water-soluble drug of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the pulse width and intensity of laser light emitted from the light source 10.
  • FIG. 4 is an enlarged perspective view showing an outline of the microchannel introduction part 50 and the microchannel 60.
  • FIG. 5A is a cross-sectional view showing a cross section of the micro-channel introduction part 50 and the micro-channel 60.
  • FIG. 5B is a cross-sectional view showing the velocity distribution of the organic matter flowing through the microchannel 60.
  • FIG. 5C is a cross-sectional view showing a cross section when a transition section 64 is provided between the microchannel introduction section 50 and the microchannel 60.
  • FIG. 6 shows one embodiment of a coating portion using a single microchannel.
  • FIG. 7 is a diagram showing one embodiment of a coating portion using multi-micro flow channels.
  • FIG. 8 is a diagram showing the whole of one embodiment of the fine particle coating apparatus and coating method of the present invention along the flow of the fine particle suspension and the polymer electrolyte solution.
  • FIG. 9 is a graph showing comparison of absorption spectra of ethanol solutions of ellipticine before and after irradiation with laser light.
  • FIG. 10 is a diagram showing a liquid chromatogram of an ethanol solution of ellipticine after irradiation with laser light.
  • FIG. 11 is a view showing an SEM image before ellipticine is microparticulated.
  • FIG. 12 is a diagram showing an SEM image after ellipticine is microparticulated.
  • FIG. 13 is a diagram showing a histogram of particle size distribution after ellipticine is microparticulated.
  • FIG. 14A shows the chromatogram (developing solvent: ethanol) and HPLC analysis result of SN-38 not irradiated with laser.
  • FIG. 14B shows the chromatogram (developing solvent: ethanol) and HPLC analysis result of the supernatant of SN-38 suspension after laser irradiation.
  • Fig.15 shows SEM image of SN-38 after laser irradiation and centrifugation (2, OOOrpm, 10 minutes), and particle size distribution histogram (number of samples: 200, average particle size: 46nm, CV value) : 22%).
  • FIG. 16 is a graph showing changes in the zeta potential of SN-38 nanoparticles accompanying the addition of a polymer electrolyte.
  • Fig. 17 shows anti-SN-38 nanoparticles, SN-38 nanoparticles-protamine sulfate, SN-38 nanoparticles-chondroitin sulfate and irinotecan hydrochloride (CPT-11) It is a graph which shows a tumor effect.
  • FIG. 18A shows the chromatogram (developing solvent: ethanol) and HPLC analysis results of 10-hydroxy-camptothecin not irradiated with laser.
  • FIG. 18B shows the chromatogram (developing solvent: ethanol) and HPLC analysis of the supernatant of the 10-hydroxy-camptothecin suspension after laser irradiation.
  • Fig. 19 shows SEM images of 10-Hydroxy-camptothecin after laser irradiation and centrifugation (2,000 rpm, 10 minutes), and particle size distribution histogram (sample number: 150, average particle size: 68 nm) , CV value: 25%).
  • FIG. 20 is a graph showing the antitumor effect of 10-hydroxycamptothecin nanoparticles and irinotecan hydrochloride (CPT-11) using human cancer transplanted in nude mice.
  • particles are formed into fine particles by irradiating a medicine with a laser beam.
  • the medicament used for microparticulation is an arbitrary size such as a crude powder after synthesis.
  • the diameter should be as fine as possible and pulverized to a narrow range, for example, 1 to: LOO / zm. A known method may be used for such a crushing method.
  • the medicine to be microparticulated in the present invention is a particulate drug that is sparingly soluble in water.
  • poorly water-soluble refers to the range of “solubility in water is extremely insoluble” and “almost insoluble” as defined by the Japanese Pharmacopoeia!
  • the particulate drug to be microparticulated in the present invention preferably has one or more multiple bonds in its structure. This is because when the laser beam is irradiated, a local temperature rise abruptly occurs at the light absorbing portion where the multiple coupling portion easily absorbs the laser beam. This is because the temperature rise of the light absorbing portion occurs instantaneously after laser light irradiation, and a sharp temperature difference occurs between the light absorbing portion and the light non-absorbing portion, resulting in crushing.
  • the multiple bond refers to a synergistic or non-conjugated double bond or triple bond.
  • the drug to be microparticulated is a drug defined in the Pharmaceutical Affairs Law, a drug candidate compound phased out in the human clinical trial stage, or a drug candidate in the development stage in the human clinical trial stage.
  • a compound examples include anticancer agents, antifungal agents, vitamin agents, analgesics, anti-inflammatory agents and the like.
  • the particulate poorly water-soluble pharmaceutical of the present invention is particularly preferably an anticancer agent. This is because the tissue gap existing in vascular endothelial cells extending from cancer cells is roughly 50 nm or more compared to the tissue gap existing in normal vascular endothelial cells. Therefore, if it is a poorly soluble particulate anticancer agent having an average diameter of 5 Onm or more and 200 nm or less, it can be used for various injections and is difficult to pass through normal vascular endothelial cells, but vascular endothelium cells that extend from cancer cells It is because it can pass easily.
  • the anticancer drug referred to in the present invention is a drug defined in the Pharmaceutical Affairs Law and has anticancer activity, a drug candidate compound having anticancer activity phased out in the human clinical trial stage, or human clinical This refers to a drug candidate compound having anticancer activity under development in the test.
  • anticancer agent used in the present invention examples include camptothecin and its derivatives, ellipticine and its derivatives, and podophyllotoxin and its derivatives. This These general structural formulas are shown below.
  • Camptothecin having a structure represented by the following structural formula and derivatives thereof:
  • Podophyllotoxin having a structure represented by the following structural formula and derivatives thereof:
  • camptothecin derivatives are: 4 (S) -Ethyl-4-hydroxy-1H pyrano [3,4,: 6,7] indolidino [1, 2—b] quinoline 1, 3, 14 (4H, 12H) — Dione (camptothecin), 7 ethyl-10 hydroxycamptothecin (SN—38), 9-aminocamptothecin, 9-trocamptothecin 5 (R) —ethyl-9,10 difluoro 1, 4, 5, 13—tetrahydro 5 Hydroxy-3H, 15H—Oxepino [3, 4,: 6, 7] Indolizino [1, 2-b] quinoline 1,3,15 dione (BN—80915) [Anti-cancer Drugs (2001), 12 (1) , 9-19], (9S) -9 ethyl 9 hydroxy 1-pentyl 1H, 12H pyrano [3 ", 4": 6,7,] Indolizino [1,2,: 6,5] pyri
  • ellipticine derivatives include ellipticine, 9-hydroxy-ellipticine, T
  • podophyllotoxin derivative having anticancer activity are podophyllotoxin, etoposide, teniposide, and the like, but are not limited thereto.
  • the water or alcohol solution used to disperse the particulate drug is such that the particulate drug to be microparticulated is poorly soluble, does not adversely affect the human body, and does not absorb the irradiated laser beam.
  • Specific examples of the alcohol used in the present invention include ethyl alcohol, glycol, glycerol and the like.
  • the alcohol solution is generally an aqueous solution containing less than 5% alcohol by weight.
  • the particulate poorly water-soluble drug of the present invention has an average diameter of 50 to 200 nm.
  • the average particle diameter is a value obtained by measuring the diameter of each particle with a scaled microscope and dividing by the total number of particles.
  • the poorly water-soluble particulate pharmaceutical is produced by suspending a particulate anticancer agent in water or an aqueous alcohol solution and irradiating the suspended pharmaceutical with laser light to form ultrafine particles.
  • Water or an aqueous alcohol solution is placed in a container 1 shown in FIG. 1, and a particulate medicine is mixed in this to produce a suspension 2.
  • the concentration of Suspension 2 varies depending on the type and size of the particulate drug to be mixed, but is usually 1 to: LOmgZml.
  • the container 1 may have any shape as long as the surface to which the laser beam is irradiated is flat, but the size may be determined according to the amount of processing that is preferably performed by a substantially rectangular parallelepiped.
  • the material of the container 1 is not necessarily transparent as long as it transmits laser light, and any material that can withstand laser light irradiation is generally used.
  • the particulate medicine having an average diameter of 50 to 200 nm which is hardly water-soluble in water or an alcohol aqueous solution of the present invention, is easily recondensed by its surface energy, it is converted into ultrafine particles.
  • Stable, contamination-free, excellent colloidal dispersion obtained by combining polyelectrolytes with opposite charges to those of electrostatic electrolytes and hydrophobic interactions to form complexes with polyelectrolytes It can be prepared as a liquid.
  • the term “complex” means that a polymer electrolyte is further coated on ultrafine particles, and is preferably in the form of particles having an average diameter of 50 to 250 nm! /.
  • the preparation of the complex is determined by the ultrafine particles that are the core material, and is determined by finely setting the conditions such as the reaction time, the concentration in the suspension, and the pH of the suspension according to the core material. It ’s impossible to define it unambiguously!
  • the polymer electrolyte complex thus obtained can be used for various injections and can be directly injected into blood vessels.
  • the absorption rate is low due to poor water solubility, so that only a small amount can move into the body, or the drug is altered by gastric juice or enzymes and the effect is lost.
  • the drug of the present invention is injected into a blood vessel and transported at a very high speed, so that the drug reaches the target site from the administration site very quickly.
  • Ultrafine particles micronized by laser light irradiation are easily recondensed due to the surface energy, so if the concentration of the ultrafine particles is high, recondensation is likely to occur, so it is mixed into suspension 2.
  • the concentration of drugs to be done cannot be increased Therefore, before irradiating with laser light, the polymer electrolyte having the opposite charge to the finely divided ultrafine particles is added to the suspension 2 in advance. Is preferred.
  • the micronized fine particles form a complex with the polymer electrolyte. Complexes do not have high surface energy like microparticles, so they are stably suspended in water or dilute alcohol without recondensing each other.
  • the concentration of the mixed drug can be increased and the throughput can be increased.
  • one or more polymer electrolytes added to the suspension 2 may be used.
  • the concentration of the polyelectrolyte added is usually 1 to 10%.
  • the polyelectrolyte used in the present invention is generally understood to be a polymer having an ion dissociable group which may be a component or substituent of a polymer chain.
  • the number of these ion dissociable groups in the polyelectrolyte is large enough that the dissociated form of the polymer is water soluble. That's it.
  • polyelectrolytes also include ionomers with sufficient charge to initiate force self-assembly where the concentration of ionic groups is not sufficient for water solubility.
  • the polyelectrolyte is subdivided into polyacids and polybases.
  • polyions are generated by dissociation of protons upon dissociation, and these may be inorganic polymers or organic polymers.
  • examples of polyacids are polyphosphoric acid, polyvinyl sulfonic acid, polyvinyl sulfonic acid, polybuluphosphonic acid and polyacrylic acid, and salts thereof are also included.
  • the polybase contains a group capable of incorporating a proton under salt formation, for example, by reaction with an acid.
  • Examples of the polybase having a dissociable group in a chain position or a side chain position are polyethyleneimine, polybulamine and polybulpyridine. Polybases form polycations by incorporating protons.
  • Examples of polymer electrolytes suitable for use in the present invention include biocompatible polymers, biodegradable polymers, biopolymers, and synthetic polymers.
  • Biocompatible polymers are macromolecules that are compatible with biological tissues' organ systems without causing toxicity, damage or rejection.
  • a biodegradable polymer is a general term for polymers that are degraded in vivo or by the action of microorganisms, and is hydrolyzed into water, carbon dioxide, methane, and the like.
  • the biopolymer is a general term for polymer compounds synthesized in vivo.
  • biocompatible polymer examples include protamine, gelatin A, collagen, albumin, force zein, chitosan, poly (L) lysine, carboxymethylcellulose, alginate, heterophosphorus, hyaluronic acid, chondroitin sulfate. , Gelatin B, carrageenan, dextran sulfate or poly- (L) -daltamic acid.
  • biodegradable polymers are DNA, RNA, enzymes or antibodies.
  • synthetic polymer are polymetathallic acid, polydiaryldimethylammonium, or a polymer in which they are cross-linked with an appropriate linker. The polymer electrolyte is not limited to these.
  • the charge of the above-described polymer electrolyte is positively charged or negatively charged by changing the pH, so that the polymer electrolyte to be used varies depending on conditions.
  • the suspension 2 formed as described above is mixed with a stirrer 3, preferably a magnetic stirrer. Use and stir to disperse the drug and polyelectrolyte uniformly.
  • Laser light 5 having an absorption wavelength is irradiated from a laser light source 4 to a drug dispersed in water or dilute alcohol.
  • the laser light source 4 may be one that continuously emits laser light having a substantially constant intensity, or one that emits laser light intermittently, for example, one that emits pulsed laser light.
  • the laser light emitted from the laser light source 4 may be selected according to the absorption wavelength of the drug to be microparticulated.
  • ultraviolet laser light there are an excimer laser (193 nm, 248 nm, 308 nm, 351 nm), a nitrogen laser (337 nm), a YAG laser third harmonic and a fourth harmonic (355 nm, 266 nm), and the like.
  • visible light laser light there are YAG laser double wave (532 nm), Ar ion laser (488 nm or 514 nm), and other dye lasers.
  • the ultraviolet power may be used by oscillating light having an arbitrary wavelength in the infrared region.
  • the laser light emitted from the laser light source 4 is preferably a pulsed laser light.
  • FIG. 2 is a graph showing the pulse width and intensity of the laser light emitted from the light source 4.
  • the horizontal axis represents time
  • the vertical axis represents the excitation light intensity of the laser light emitted from the light source 4.
  • the laser beam emitted from the light source 4 is a pulsed laser beam. That is, the light source 4 alternately repeats a lighting state in which laser light is emitted and a light-off state in which laser light is not emitted, and emits laser light intermittently.
  • the intensity of the laser beam changes in a pulse shape.
  • one pulse of laser light is referred to as pulsed light. When pulsed laser light is used, one irradiation is performed with one pulsed light.
  • excitation light intensity P of the laser light emitted from the light source 4, 1 ⁇ : LOOOmjZcm 2 is preferable preferably instrument 30 ⁇ 300MiZcm 2 force.
  • the pulse period T between the pulsed light is preferably 0.1 to 1000 Hz.
  • the pulse period is the time from the rise of one pulsed light to the rise of the pulsed light adjacent to one pulsed light. Or the time from the falling point of the pulsed light to the falling point of the adjacent pulsed light.
  • each of the pulse width s of the pulsed light is intended preferably 10 _15 ⁇ 10_ 6 seconds.
  • the pulse width is the time from the rising point of one pulsed light to the falling point.
  • the irradiation time tL is a time during which a target drug can be irradiated with laser light.
  • the irradiation time tL is lengthened, as shown in FIG. 2, both the lighting state and the extinguishing state of the pulse laser beam can be included.
  • the light-off state laser light is not emitted, but when it is in the light-on state, laser light is emitted and a certain organic substance is irradiated with the laser light. In this way, even if the extinction state is included within a certain period of time, if the lighting state in which laser light can be irradiated to a certain target organic substance is included, the time is the irradiation time tL.
  • the drug when a certain target drug is flowing and enters the laser light irradiation area and then exits the laser light irradiation area, the drug is irradiated with the laser light.
  • the time in the irradiation region is long, the drug is irradiated with pulsed light multiple times.
  • the irradiation time tL described above can be a time during which a certain target drug is present in the laser light irradiation region.
  • the drug can be made into fine particles by irradiating the drug with laser light. The number of times the drug is irradiated with the pulsed light can be determined so that the size when the particles are formed becomes desired.
  • the number of times of irradiation with pulsed light can be changed by adjusting the above-described pulse period T, the flow rate of the drug, and the like. By doing so, the drug is irradiated with the pulse light at least once in the laser light irradiation region.
  • the irradiation region of the laser beam refers to a range in which the laser beam is irradiated when the laser beam is in a lighting state.
  • the irradiation time of the laser light is irradiated with the short-time pulse light of about nanoseconds a plurality of times.
  • the particle size when the drug is atomized can be controlled by changing the length of the above-mentioned Knoll width s.
  • the drug stirred is Repeatedly irradiated with laser light. For this reason, if the drug is irradiated with the laser beam many times, it may be too fine and particles with an average diameter smaller than 50 nm may be formed, or the drug may be altered. Total irradiation time is an important factor.
  • the total irradiation time of the laser light varies depending on factors such as the stirring speed, the size of the drug, the laser light source, the pulse width, and the light intensity, but is generally several seconds to several minutes.
  • the colloidal solution containing the complex thus obtained can be used as an injection having a target concentration by appropriately diluting or concentrating with a solvent.
  • the solid is separated by separating the solid through a colloidal solution through a filter, washing well, drying or evaporating in water or dilute alcohol. , Well washed and dried. In the latter case, it is preferable to use alcohol, liquid nitrogen or liquid helium as the solvent.
  • FIG. 3 shows a drug micronizing apparatus 100 used for continuously preparing the drug of the present invention.
  • the supply unit 20 includes a tank for containing a drug-containing suspension in which a drug is dispersed in water or dilute alcohol.
  • the supply unit 20 has a predetermined volume.
  • the volume may be set to a desired size for one treatment.
  • the supply unit 20 is preferably one that can be sealed so that the concentration of the injected drug-containing suspension does not change.
  • a pipe 30 is connected to the lower part of the supply unit 20 so that the supply unit 20 communicates with the pipe 30.
  • the drug-containing suspension injected into the supply unit 20 can be discharged to the pipe 30.
  • the pipe 30 is provided with a pump 40.
  • the pump 40 is described later. This is for supplying the drug-containing suspension to the microchannel 60.
  • the micro channel is a channel having a channel width on the order of microns formed by precision machining.
  • the pump 40 can be controlled so that the flow rate of the drug-containing suspension flowing through the microchannel 60 becomes a desired speed.
  • the flow rate in the microchannel 60 can be controlled to be constant.
  • the drug-containing suspension can be stopped or flown in the microchannel 60 at a desired timing. preferable.
  • the drug can be accurately irradiated with the laser light emitted from the light source 10.
  • a micro-channel introduction part 50 is connected to the pipe 30 so that the pipe 30 communicates with the micro-channel introduction part 50.
  • the pump 40 By driving the pump 40, the drug-containing suspension injected into the supply unit 20 can be supplied to the microchannel introduction unit 50 via the pipe 30.
  • the microchannel introduction part 50 has a substantially rectangular parallelepiped shape.
  • the microchannel introduction unit 50 temporarily stores the drug-containing suspension supplied from the supply unit 20 so as to uniformize the flow rate of the drug-containing suspension flowing through the microchannel 60 described later. belongs to .
  • the volume of the microchannel introduction part 50 may be determined appropriately according to the drug-containing suspension to be processed, the flow rate generated by the pump 40, and the like.
  • the shape of the microchannel introduction part 50 is a substantially rectangular parallelepiped.
  • the flow rate of the drug-containing suspension flowing through the microchannel 60 described later can be made to be uniform. If necessary, it may be formed with a curved surface such as a substantially cylindrical shape.
  • the shape of the microchannel introduction part 50 may be appropriately determined according to the flow rate of the drug-containing suspension flowing through the microchannel 60 and the type and size of the drug-containing suspension.
  • a micro flow channel 60 is connected to the micro flow channel introduction unit 50 so that the micro flow channel introduction unit 50 communicates with the micro flow channel 60.
  • the microchannel introduction part 50 has a discharge surface 52.
  • An opening 54 is formed in the discharge surface 52.
  • the microchannel 60 is connected to the opening 54. By rubbing in this way, the drug-containing suspension is transferred from the microchannel introduction section 50 to the microchannel 60 through the opening 54. Can be supplied.
  • the drug By irradiating laser light emitted from the light source 10 onto the drug-containing suspension flowing through the microchannel 60, the drug can be made into fine particles.
  • the microchannel 60 has an elongated rectangular parallelepiped shape, and a cross section along a plane perpendicular to the longitudinal direction of the microchannel 60 is substantially square.
  • the length ML of one side of the square (see Fig. 4) is preferably 1.1 to 200 times the maximum drug diameter, and preferably 3 to 60 times. In this way, the flow of the drug in the microchannel 60 can be made smooth, the microchannel 60 is prevented from being blocked by the drug, and the irradiation of the laser beam to the drug is accurately performed. It can be carried out.
  • the shape of the micro flow channel 60 is not limited to a rectangular parallelepiped, and the portion irradiated with the laser light emitted from the light source 10 (the portion located in the irradiation region LR described later) is flat. Good.
  • the shape of the cross section along the plane perpendicular to the longitudinal direction of the microchannel 60 is substantially square. However, it is sufficient that the drug can be accurately irradiated with laser light.
  • the cross-sectional shape may be a rectangle or the like.
  • the microchannel 60 is made of a material that can transmit the laser light emitted from the light source 10, preferably a transparent material such as quartz or glass.
  • the laser light LA emitted from the light source 10 is irradiated onto a part of the upper surface 62 of the microchannel 60.
  • the irradiation area LR of the laser beam LA (the hatched area in FIG. 4) is substantially circular, and its diameter dL force
  • the length 62 of the upper surface 62 in the short direction is longer than that of the laser. Light can be sufficiently applied to the microchannel 60.
  • the drug-containing suspension flows from the microchannel introduction unit 50 into the microchannel 60, and the organic substance flows in the microchannel 60.
  • the drug-containing suspension When focusing on a certain drug, it follows the flow of the drug-containing suspension in the microchannel 60 to reach the irradiation area LR of the laser beam LA, and after being present in the irradiation area LR for a while, the irradiation area Exit from LR.
  • the drug is irradiated with the pulsed light multiple times.
  • Drug microchannel 6 In the case of flowing within 0, as described above, the irradiation time tL can be the time existing in the target organic matter irradiation region LR.
  • the drug can be microparticulated by irradiating the drug with laser light.
  • the number of times the pulsed light is applied to the drug can be determined so that the size when the particles are formed becomes desired.
  • the number of times of irradiation with pulsed light can be changed by adjusting the above-described pulse period T, the flow rate of the drug, and the like. By doing so, in the laser light irradiation region LR, the drug is irradiated with the drug at least once.
  • Micro-channel introduction section 50 cross-sectional size SA (see Fig. 4) force 2 of cross-sectional size SB (see Fig. 4) along the plane perpendicular to the longitudinal direction of micro-channel 60 It is preferable to make it more than twice.
  • the flow velocity VL of the organic substance flowing through the microchannel 60 is a velocity distribution such that the vicinity of the wall surface of the microchannel 60 is the slowest and the center of the microchannel 60 is the fastest (hereinafter referred to as the velocity distribution). (Refer to FIG. 5B).
  • the drug flowing in the vicinity of the wall surface of the microchannel 60 has a slow flow rate, so the time that is present in the irradiation region LR becomes long, and the vicinity of the center of the microchannel 60 Since the flow rate of the drug flowing through is short, the time in the irradiation region LR is short. For this reason, when the laser light is irradiated, the number of times the pulsed light is applied to the organic matter flowing near the wall surface of the microchannel 60 increases, and the pulsed light is applied to the organic matter flowing near the center of the microchannel 60. The number of times of irradiation is reduced.
  • the time for which the organic material flowing near the wall surface of the microchannel 60 is irradiated with the laser light becomes longer, and the laser is applied to the organic material flowing near the center of the microchannel 60.
  • the time for light irradiation is shortened. For this reason, the degree of micronization differs depending on the place where the drug flows, and there is a possibility that the drug size after the micronization is uneven.
  • the drug-containing suspension is micro-flowed. It flows into the micro channel 60 from the channel introduction part 50.
  • the drug flow velocity VL (see FIG. 5A) in the microchannel 60 is preferably VL and KX dLZtL.
  • the flow velocity VL is the flow velocity of the drug in a state where there is no velocity distribution as described above, or in a state where the velocity distribution can be sufficiently ignored.
  • the drug can be irradiated with the laser beam without excess or deficiency, and can be microparticulated to a desired size. For example, when a drug is irradiated with pulsed light, the drug can be irradiated with the pulsed light an appropriate number of times.
  • dL is the diameter of the laser beam when the laser beam is irradiated (see FIG. 4)
  • tL is the irradiation time described above (see FIG. 2)
  • K is 1 to 0 A constant in the range of 1 and determined according to the type of drug. Note that K is not limited to the above-mentioned range.
  • the number of times of pulsed light applied to the drug is sufficient to atomize the drug. Thus, it is preferable to determine the value of K.
  • the size of the micronized drug is 50-200 nanometers.
  • FIG. 5A is a cross-sectional view showing a cross section of the microchannel introduction part 50 and the microchannel 60.
  • the laser light LA is irradiated at a location where the distance force from the discharge surface 52 of the micro flow path introduction section 50 to the center LC of the laser light LA irradiation area LR is 10 X Dm or less. Is preferred (see FIG. 5A).
  • Dm is a hydraulic diameter in the microchannel 60
  • Dm 4 X (the size SB of the cross section of the microchannel 60) Z (the entire circumference of the cross section of the microchannel 60).
  • the cross-sectional force of the microchannel 60 is a square with a length ML
  • the flow velocity distribution of the drug in the microchannel 60 described above tends to increase as the distance from the discharge surface 52 of the microchannel introduction section 50 increases, and by making the portion irradiated with the laser light LA in such a range, Before the flow velocity distribution of the drug flowing in the microchannel 60 increases, the drug can be irradiated with the laser beam LA, and the drug can be finely divided into fine particles. The thickness can be made uniform.
  • a transition part 64 may be formed between the microchannel 60 and the microchannel 60.
  • Transition part 64 is a micro-channel As the distance from the opening 54 formed in the introduction portion 50 increases, the cross section gradually decreases. By doing so, the transition section 64 functions as a run-up section, and the velocity distribution of the drug flowing into the microchannel 60 can be further reduced.
  • the shape of this transition part 64 should be determined appropriately according to the flow rate and viscosity of the drug-containing suspension.
  • a recovery unit 70 is connected to the microchannel 60 so as to communicate with the microchannel 60 force recovery unit 70.
  • the collection unit 70 is a tank that can store a suspension containing a drug irradiated with laser light in the microchannel 60.
  • the recovery unit 70 is preferably provided with a reaggregation prevention device 72.
  • the reaggregation preventing device 72 includes an ultrasonic vibrator and emits ultrasonic waves to the suspension contained in the collection unit 70. By transmitting this ultrasonic wave to the suspension, it is possible to prevent the microparticulated drug from reaggregating.
  • the intensity and wavelength of the ultrasonic wave emitted from the reaggregation prevention device 72 may be appropriately determined according to the size and type of the micronized drug.
  • the reaggregation preventing device 72 that emits ultrasonic waves is shown. However, other devices may be used as long as they can prevent reaggregation of the microparticulated drug.
  • a magnetic drive rotary impeller 74 may be provided in the tank of the collection unit 70.
  • the magnetically driven rotating impeller 74 can be rotated by applying the magnetic force to the outside force of the collecting unit 70, and the magnetically driven rotating impeller 74 is accommodated in the collecting unit 70 by rotating the magnetically driven rotating impeller 74.
  • the suspension can be stirred, and reaggregation of the microparticulated drug can be prevented.
  • the size and the number of rotations of the magnetically driven rotary impeller 74 may be determined as appropriate according to the size and type of the microparticulated drug.
  • the charge possessed by the ultrafine particles of the drug obtained as described above is measured.
  • Charge is measured with a zeta electrometer. Depending on the core material, it may be positive or negative.
  • the ultrafine particles are prevented from reaggregating by preparing a complex of one or more polymer electrolytes having a charge opposite to that of the ultrafine particles by electrostatic interaction and hydrophobic interaction.
  • FIG. 6 This polymer film coating portion is one of the main components of the fine particle coating apparatus used in the present invention.
  • coating is performed by combining the flow of the fine particle suspension of the drug and the flow of the polyelectrolyte solution.
  • both the fine particle suspension and the high molecular electrolyte solution are allowed to flow through the microflow channel.
  • FIG. 6 shows an embodiment of a polymer film coating unit using a single microflow channel in which a fine particle suspension and a polymer electrolyte solution each flow through a single microflow channel.
  • FIG. 7 shows an embodiment of a polymer film coating unit using a multi-micro flow channel provided with a plurality of polymer film coating units using a single multi-flow channel shown in FIG.
  • a discharge microchannel 76 is provided in the lower part of the rear surface with respect to the surface of the inlet from the microchannel 60 of the tank of the collection unit 70.
  • the micro flow path is effective for preventing re-aggregation of the ultrafine particles formed by the fine particle production apparatus in the ultrafine particle suspension.
  • the channel width of the microchannel is set to be slightly larger than the long diameter of the ultrafine particles flowing in the ultrafine particle suspension.
  • the microchannel through which the polymer electrolyte solution flows can also be set to the same dimensions as the microchannel through which the ultrafine particle suspension flows.
  • the polymer electrolyte solution flowing through the microchannel contains a polymer electrolyte having a charge opposite to that of the outermost layer of the ultrafine particles to which the polymer electrolyte is bonded or coated with the polymer electrolyte. That is, when the outermost layer of the ultrafine particles contained in the fine particle suspension has a negative charge, a cationic polymer electrolyte solution having a positive charge is passed through the microchannel.
  • the angle at which the micro flow path through which the microparticle suspension flows and the micro flow path through which the polymer electrolyte flows can be selected from an acute angle to an obtuse angle. wear.
  • the merging angle is preferably in the range of 0 to 180 degrees. A range of 0 to 5 degrees is preferred when using multi-microflow channels.
  • each polymer film coating portion a polymer electrolyte solution having a charge opposite to the charge of the outermost layer of the ultrafine particles is used for the ultrafine particle suspension.
  • a strong film can be easily formed simply by merging the two liquids with force.
  • FIG. 6 shows a force using an example using a single microchannel.
  • the compression can be prepared with high productivity.
  • the ultrafine particle coating apparatus used in the present invention mainly comprises a polymer film coating unit 120.
  • the polymer film coating unit 120 includes a microparticle suspension tank 70 (the recovery unit 70) containing a suspension of ultrafine particles before coating, a microchannel 122a for microparticle suspension, a polymer electrolyte solution Micro flow channel 122b, merged micro flow channel 122c formed by merging them, polymer electrolyte liquid tank 124 that stores the polymer electrolyte solution, and polymer film ultrafine particles that have been coated (
  • the complex collection tank 140 that collects the formed complex), pumps, pipes, and valves are also configured.
  • the polymer film coating portion 120 using the micro flow channel has a force shown in the form of a single micro flow channel.
  • a multi-microchannel having a microchannel can be used.
  • the ultrafine particle suspension is accommodated in the fine particle suspension tank 70.
  • the case where water is used as the solvent will be described.
  • the ultrafine particles are suspended in water, and the outer surface of the ultrafine particles ionizes in the water and has a positive or negative charge.
  • a cationic polymer electrolyte solution is used as the polymer electrolyte.
  • the ultrafine particle suspension before coating is transferred from the fine particle suspension tank 70 to the microfluidic suspension microchannel 122a in the polymer film coating unit 120.
  • the cationic polymer electrolyte solution stored in the polymer electrolyte solution tank 124 is sent from the polymer electrolyte solution tank 124 to the polymer electrolyte solution micro-channel 122b using the pump 126.
  • microparticle suspension microchannel 122a and the polymer electrolyte solution microchannel 122b join together to form a merged microchannel 122c.
  • the ultrafine particle suspension and the cationic polymer electrolyte solution are mixed, and the cationic polymer electrolyte comes into contact with the outer surface of the ultrafine particles to form a complex having a cationic film.
  • a complex can be formed by the same method as described above except that a polymer electrolyte solution is used as the polymer electrolyte solution. .
  • Nd 3T YAG laser (Continuum, Surelite) was used as the light source, and laser light was extracted with an OPO (Optical Parametric Oscillator: Continuum, SureliteOPO) system.
  • OPO Optical Parametric Oscillator: Continuum, SureliteOPO
  • the laser beam intensity was adjusted using a dimming plate and an attenutor.
  • the light irradiation area was estimated by irradiating the photosensitive paper in front of the quartz cell with laser light.
  • the sample used was ellipticine (Fluka,> 99%), which was roughly pulverized to about 1 ⁇ m.
  • deionized water was used as the solvent.
  • ultrasonic waves For the production of ultrafine particles, 75 ml of the sample suspension was irradiated with ultrasonic waves (SHARP, UT-205, high frequency: maximum 200 W). 3 ml of this sample suspension was weighed with stirring using a magnetic stirrer, transferred to a quartz cell (1 ⁇ 1 ⁇ 5 cm 3 ) with an optical path length of 1 cm, and irradiated with laser light while stirring using a magnetic stirrer.
  • the generated ultrafine particles were immediately coated with a pre-added polymer electrolyte, and stabilized for the purpose of preventing aggregation between particles (a) with a sample electrolyte added with a polymer electrolyte.
  • the two types were irradiated and compared with each other.
  • Ellipticin 4.1 X 10 " 3 M (1. Omgmr 1 ) was used as an anticancer agent and dispersed by irradiation with laser light. The resulting supernatant was evaluated by allowing it to stand for 1 hour after irradiation.
  • Ellipticin 4.1 X 10 " 3 M (1. Omgmr 1 ) was used and dispersed without irradiating laser light. The supernatant was used as a control.
  • the concentration of the supernatant was estimated by the absorbance force.
  • the concentration of the supernatant after irradiating and dispersing the laser beam in the presence of the polymer electrolyte was> 100 times higher than that in the absence of the polymer electrolyte.
  • Figure 9 shows the unirradiated and post-irradiated ethanol solutions.
  • Figure 9 shows the absorption spectrum (solid line) of the unirradiated ellipticine ethanol solution and the absorption spectrum (dotted line) of the ellipticine ethanol solution after laser irradiation (100 miZcm 2 for 10 seconds). From Fig. 9, there is almost no change between the unirradiated absorption spectrum (solid line) and the absorption spectrum after irradiation (dotted line). From this, it can be seen that the ellipticine micronized by laser light irradiation is almost decomposed.
  • Fig. 10 shows the liquid chromatogram of the ellipticine ethanol solution after laser irradiation. From FIG. 10, it can be seen that the ellipticine micronized by laser light irradiation is almost decomposed! /.
  • FIGS. 11 and 12 show the SEM image before the micronization of ellipticine and the SEM image after the micronization, respectively.
  • the average diameter of the particles before micronization is about 1 ⁇ m, which is the limit of mechanical micronization.
  • FIG. 13 shows a histogram of the particle size distribution after micronization.
  • Ellipticin (concentration 2 ⁇ g / ml) micronized by laser irradiation is diluted with the following cell culture medium to give 1 g / ml, 0.5 ⁇ g / ml, 0.25 ⁇ g / ml, 0.125 g
  • a test sample of / ml was prepared.
  • the target cells were MCF-7 (MEM (medium) and L-1210 (RPMI-1640 medium) tumor cells, and cytotoxicity was measured using Cell Counting Kit-8 and dehydrogenase activity as the indicator.
  • WST-8 The number of viable cells after culturing for 24 hours was measured by the 450 nm color development measurement of Patent 2757348).
  • Viability (%) (A -A) / (A -A) 100%
  • A represents the absorbance at a wavelength of 450 nm in the UV characteristics, and A represents the presence of the sample.
  • samples represents the absorbance when no sample is present and polyelectrolyte is present.
  • MCF-7 cell 0.21 ⁇ g / ml
  • the above supernatant liquid lm gZml is supplemented with a sufficient amount of protamine or chondroitin sulfate to reach a constant zeta potential on the nanoparticle surface.
  • lmgZml micronized SN-38 add lOmgZmL protamine sulfate (pH4) or lOmgZmL chondroitin sulfate (PH4) so that the weight ratio is 30wt%) constant zeta potential + 19.9mV, -47. 2mV (See Fig. 16).
  • the number of viable cells after cultivation for 72 hrs was measured by a method similar to the cytotoxicity test of ellipticine described in (3-4) of Example 1.
  • the 50% inhibitory activity was ⁇ in MCF-7 cells.
  • the laser-irradiated SN-38 DMSO solution and water suspension used as controls had 50% inhibitory activity of 500 nM and 2000 nM, respectively.
  • Test substance SN-38 nanoparticles SN 38 nanoparticles Protamine sulfate
  • Contrast agent irinotecan hydrochloride (CPT—11)
  • the tumor subcultured subcutaneously was removed, the capsule and necrotic area were removed from the tumor, washed with RPMI medium, and a cube as uniform as 2 to 3 mm square Tumor pieces were prepared.
  • This tumor fragment was transplanted using the trocar subcutaneously on the back of a 6-week-old mouse (transplant date: DayO).
  • the control group and the treatment group were set so that the average value of the estimated tumor volume and the standard error were as equal as possible with 5 mice per group, and administration was started.
  • the end of the experiment was 4 weeks after the start of administration, and the tumor diameter was measured twice a week, the body weight was measured at the time of administration, the state of tumor growth and the effects of drug administration were monitored, and other physical changes were observed. Animals were kept in small vinyl isolators throughout the experiment until the end of the experiment, except that they were transferred to a clean bench through the sleeve at the time of tumor implantation, administration and measurement.
  • SN 38 nanoparticle (lmgZml) and SN-38 nanoparticle chondroitin sulfate (lmg / ml) stock solution for 1 OmgZkg administration group
  • SN-38 nanoparticle protamine sulfate (lmgZml) in distilled water for injection 0.3mgZml It was diluted to be 3 mgZkg administration group. Furthermore, 27% NaCl solution was added at a volume ratio of 1:30 each immediately before administration.
  • CPT-11 was diluted by adding physiological saline to 3 mgZml.
  • Each of the SN-38 nanoparticle, SN-38 nanoparticle-protamine and SN-38 nanoparticle chondroitin sulfate administration groups was administered within 25 minutes after NaCl was added thereto.
  • 0.1 ml per 10g of mouse body weight was intravenously administered once a day for a total of 4 times (q4dx4) every 4th day.
  • the 3 mg Zml preparation was administered intravenously twice a day (60 mg Zkg administration group), 0.1 ml per 10 g of mouse body weight, 4 times in total (q4dx4) every 4 days. No drug was administered to the Control group.
  • the tumor growth inhibition rate (IR) was calculated from the average tumor weight of the control group (C) and treatment group (T) extracted on the day of the experiment using the following formula. “Effective” was judged when ⁇ 58%, and “Effective” when IR ⁇ 80%.
  • the effect of the drug on the host was examined based on changes in body weight and appearance of symptoms.
  • Nude mouse transplanted human gastric cancer H-23 (moderately differentiated adenocarcinoma)
  • the antiproliferative effect of NOPT, SN-38 nanoparticle-protamine sulfate and SN-38 nanoparticle chondroitin sulfate was compared with the antiproliferative effect of CPT-11.
  • Tumor volume IR increased as the number of administrations increased, and 2 days after the fourth administration (d21), the maximum tumor growth inhibition rate (max. IR) during the experiment period was 69.1%, which was effective. . After that, the tumor volume IR gradually decreased and the tumor wei ght IR at the end of the experiment (d35) was judged to be invalid at 22.4%. The t-test based on tumor weight showed no significant difference from the control group.
  • tumor volume IR was 57.7% in the treatment group. Only 3 days after the second dose (dl4), there was also a tendency to shrink the tumor (see raw data). As a result, tumor volume IR was 59.9%, and it was found to be the only effective treatment group as soon as the second dose. Three days after the third dose (dl8), it was 73.4%, which was even higher. Two days after the fourth dose (d21), max. IR was 74.7%, indicating that the tumor growth inhibitory effect was conspicuous. Nine days after the fourth dose (d28), tumor volume IR was still 61.1% and was still effective in the treatment group.
  • the tumor weight IR of d35 was determined to be invalid at 45.9%. However, in the t-test based on tumor weight, there was a statistically significant difference between the control group and p ⁇ 1%, and it was better than the CPT-11 6 OmgZkg group, with a statistically significant difference of 5%. It was.
  • tumor volume IR was 57.5%, slightly higher than the CPT-11 60 mg Zkg group.
  • IR was 62.1%, indicating that it was effective. Thereafter, tumor volume IR gradually decreased. Tumor weight IR at the end of the experiment (d35) was determined to be invalid at 38.9%. The t-test based on tumor weight showed a statistically significant difference between the control group and ⁇ ⁇ 1%. Furthermore, IR was superior to the CPT-11 60mgZkg group.
  • the SN-38 nanoparticle lOmgZkg administration group was clearly higher than the CPT-11 administration group and showed tumor growth inhibitory effect.
  • the tumor growth inhibitory effect is markedly reduced by cessation of administration
  • the tumor growth inhibition effect is reduced by cessation of administration, but the extent is Compared to the CPT-11 administration group, it was considerably smaller.
  • the SN-38 nanoparticle lOmgZkg administration group did not lose weight during the experiment and did not show any particularly serious side effects.
  • a suspension of 10-Hydroxy-camptothecin at a concentration of 0.5 mg Zml was prepared in the same manner as the preparation of SN-38 nanoparticles.
  • the number of viable cells after cultivation for 72 hrs was measured by a method similar to the cytotoxicity test of ellipticine described in (3-4) of Example 1.
  • the 50% inhibitory activity was ⁇ in MCF-7 cells.
  • the laser-irradiated 10-Hydroxy-camptothecin DMSO solution and water suspension used as reference had 50% inhibitory activity ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and 500 nM, respectively.
  • Test substance 10-Hydroxycamptothecin nanoparticles
  • tumors that have been subcultured subcutaneously are removed, and the capsule and necrotic area are removed from the tumors, washed with RPMI medium, and as uniform as 3 to 3 mm square cubes. Tumor pieces were prepared. This tumor fragment was transplanted into the back of a 5-week old mouse subcutaneously using trocar (transplant date: DayO).
  • the control group and the treatment group were set so that the mean value of the estimated tumor volume and the standard error were as equal as possible with 5 mice per group, and administration was started.
  • the end of the experiment was 4 weeks after the start of administration, and the tumor diameter was measured twice a week, the body weight was measured at the time of administration, the state of tumor growth and the effects of drug administration were monitored, and other physical changes were observed. Animals are cleaned through sleeves at the time of tumor implantation, administration and measurement All animals were kept in a small vinyl isolator until the end of the experiment, except for being transferred to the bench.
  • 10- Hydroxycamptothecin Nanoparticle Solution (0.25mgZml) 1. Add the same amount of 8% NaCl solution to make 0.125mgZml solution. Add physiological saline to CPT-11 to 3mgZml.
  • CPT-11 3 mgZml preparation was administered intravenously twice a day (60 mgZkg administration group), 0.1 ml per 10 g of mouse body weight, d7, dll, and dl4 for a total of 3 days.
  • physiological saline was intravenously administered three times in the same manner as CPT-11.
  • the tumor growth inhibition rate (IR) was calculated from the average tumor weight of the control group (C) and treatment group (T) extracted on the day of the experiment using the following formula. “Effective” was judged when ⁇ 58%, and “Effective” when IR ⁇ 80%.
  • the effect of the drug on the host was examined based on changes in body weight and appearance of symptoms.
  • tumor growth was conspicuously suppressed, and at the third administration (dl4), arousal or volume IR of 60.7% was demonstrated and became effective. Furthermore, 4 days after the third administration (dl8), max. IR was 69.0%.
  • Tumor volume t-test showed a statistically significant difference between the control group and p ⁇ 0.1%. After that, however, the tumor grew faster and became ineffective after 3 days (d21) at 50.7%. Thereafter, the growth rate increased further, and the torn or volume IR 18 days after the start of administration (d25) was lower than that in the CPT-11 30 mg Zkg administration group, where the surface of the tumor was ulcerated and the growth peaked.
  • the tumor volume IR at the end of the experiment (d35) was 14.1%. Tumor weight IR was 14.1% and was judged invalid.
  • the t-test based on tumor weight was also significantly different from the control group.
  • tumor shrinkage was observed after the start of administration, and tumor volume IR was 63.2% on the third administration day (dl l), and this was the only effective treatment group at this point. After that, regrowth gradually started, but the inhibitory effect was significantly higher than that of the control group, and the Tumor volume IR was higher. Three days after the end of the 6th administration (dl8), tumor volume IR was 85.4% (max. IR), which was markedly effective. The t-test by Tumor volume showed a statistically significant difference between the control group and p ⁇ 0.1%. After that, the tumor volume IR gradually decreased with the speed of regrowth. Still, 10 days after the end of 6 doses (d25), tumor volume IR 6 2. 3%, only effective in the treatment group.
  • the tumor growth in the control group reached its peak after that, the tumor growth rate in the 10-Hydroxycamptothecin nanoparticle administration group became noticeably faster, and the tumor volume IR decreased rapidly.
  • the tumor volume IR at the end of the experiment (d35) was 23.1%.
  • Tumor weight IR was judged to be invalid at 19.4%.
  • the t-test based on tumor weight showed no significant difference from the control group.
  • tumor volume IR was found to be effective at 68.0%. 3 days after 6 doses (dl8), max. IR was 76.4%. Tumor volume t-test showed a statistically significant difference between the control group and p ⁇ 0.1%. Furthermore, after 3 days (d21), the effect was recognized at 68.0%. At the end of the period, because the number of animals with ulcers on the surface of the tumor increased, tumor growth also reached its peak, and the tumor volume IR was higher than that in the 5 mg Zkg group.
  • the tumor volume IR was 28.7% and the tumor weight IR was 25.5% at the end of the experiment (d3 5), the highest strength among the 1S treatment groups judged to be ineffective. However, the t-test based on tumor weight showed no statistically significant difference from the control group.
  • the ultraparticulate anticancer agent that is sparingly soluble in water or an aqueous alcohol solution of the present invention, and a complex of the same and a high molecular electrolyte can be used as an injection, improving bioavailability and reducing side effects. Is.
  • a polyelectrolyte that recognizes the surface of specific tissue cells such as adhesion factors is expected to be applied to specific tissue targeting therapy.
  • Anticancer agents can be released slowly over a long period of time, and it is also expected to suppress adverse side effects caused when a large amount of drugs enter the body at once.

Abstract

　平均直径５０～２００ｎｍの粒子状の難水溶性医薬、及びこの粒子状の難水溶性医薬と高分子電解質との平均直径５０～２５０ｎｍの粒子状コンプレックス。

Description

明 細 書
難水溶性医薬
技術分野
[0001] 本発明は、難水溶性の極微粒子状医薬、それと高分子電解質とのコンプレックスに 関する。更に詳しくは、本発明は、レーザビームを照射することによって粒子を微粒 子化した医薬の極微粒子、および極微粒子一高分子電解質コンプレックスに関する 本願 ίま、 2006年 5月 15曰〖こ曰本【こ出願された、特願 2006— 135677号【こ基づさ 優先権を主張し、その内容をここに援用する。
背景技術
[0002] 溶媒に難溶性の医薬、例えば抗癌剤等の一部の医薬品は、難水溶性のため細胞 に吸収され難ぐバイオアベイラビリティ一 (Bioavailability)が低い。そのため、注射剤 として用いるために、難水溶性医薬品の溶解度を高めて水に溶けやすくしてバイオ アベイラビリティ一を向上させる目的で溶解補助剤を用いることが多いが、この溶解 補助剤の毒性が問題であった。
[0003] 溶解補助剤を用いないで、難水溶性医薬品の細胞取り込み効率を向上させるため には、医薬品が患部の細胞膜を通過し易いサイズまで極微粒子化すればよい。この サイズは、凡そ 200nm以下とされている。
[0004] 有機物質について、微粒子化することによって、興味深い特性の向上'変化が期待 されることから、有機化合物の微粒子化方法が提案されている。例えば、溶媒中に分 散させた有機化合物にレーザ光を照射することによって有機化合物の微粒子を製造 する方法が開示されている (例えば特許文献 1を参照)。特許文献 1に開示される方 法は、有機化合物に、吸収帯波長の光を照射することにより、分子構造中の比較的 に弱い化学結合部にて光線形吸収により熱応力破壊が生じて、微粒子を生成するも のであり、同時に、一部、電子励起状態を経由して光化学反応が生じ、有機化合物 の分解が起きるおそれがある。特に、有機化合物が、体内に投与する医薬品の場合 に、その分解生成物が生体に悪影響を与えるおそれがあるため、このような事態は極 力避けなければならない。
[0005] 特許文献 1に開示される方法を改良するために、被処理液中の有機化合物にその 吸光帯より長い波長のレーザ光を被処理液に照射し、有機化合物を微粒子化する、 微粒子の製造方法が提案された (例えば特許文献 2を参照)。また、貧溶媒に分散さ せた有機バルタ結晶に、超短パルスレーザを照射することにより非線形吸収によりァ ブレーシヨンを誘起して有機バルタ結晶を粉砕することによる、極微粒子の製造方法 が提案された (例えば特許文献 3を参照)。
[0006] これらの方法は、透明容器中に溶媒分散された有機化合物の粗粒子紛に外部から 吸光帯より長い波長のレーザ光又は超短パルスレーザを照射して有機化合物を溶 媒中で粉砕する方法である。これらの方法は、吸収帯波長の光を線形吸収させる方 法に比べれば、比較的に温和な有機化合物の微粒子化が可能になり、有機化合物 の分解が起きるおそれも比較的に少ないことから、少量の難溶性有機化合物、特に 薬物の極微粒子化には、適した方法であると述べられている。
[0007] しかし、レーザ光照射による粉砕原理は、パルス入熱による短時間加熱に起因する 熱応力破壊と想定されているが、薬物に変質を起こさずに極微粒子化するためには 、薬物のレーザエネルギー吸収特性とレーザ照射時間の設定とが重要なパラメータ となる。ノツチ方式は、薬物が容器内溶媒中に分散、攪拌されている状態でレーザビ ーム照射を行うため、レーザ光照射時間の設定や分散粒子にレーザを均一に照射 する等の条件の制御が困難である。例えば、ある粒子は、レーザビーム照射を何回も 受けたり、他の粒子は、レーザビーム照射を 1回も受けな力 たりして、粒度が目標と する均一な範囲に入りかつ変質のないバイオアベイラビリティ一の高い極微粒子薬 物を工業レベルで生産するには至って ヽな 、。
特許文献 1：特開 2001— 113159号公報
特許文献 2 :特開 2004— 267918号公報
特許文献 3：特開 2005 - 238342号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の目的は、粒度が目標とする均一な範囲に入りかつ薬効に変化のないバイ ォアベイラビリティ一の高い、難水溶性粒子状抗医薬、およびこのような難水溶性粒 子状医薬と高分子電解質とのコンプレックスを提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者等は、上述した課題を解決すべく鋭意検討したところ、レーザアブレーシ ヨン式極微粒子製造技術を用い、レーザ光照射条件を微細に制御することにより前 記課題を達成できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至つ た。
[0010] 力べして本発明によれば、以下の 1〜： LOの発明が提供される。
1.平均直径 50〜200nmの粒子状の難水溶性医薬。
2.構造中に多重結合を 1個以上有する、前記 1記載の難水溶性医薬。
3.医薬が抗癌剤である、前記 1又は 2記載の難水溶性医薬。
4.抗癌剤がカンプトテシン誘導体である、前記 3記載の難水溶性医薬。
5.抗癌剤がエリプチシン誘導体である、前記 3記載の難水溶性医薬。
6.抗癌剤がポドフイロトキシン誘導体である、前記 3記載の難水溶性医薬。
7.前記 1〜6のいずれか一記載の粒子状の難水溶性医薬と高分子電解質との平均 直径 50〜250nmの粒子状コンプレックス。
8.高分子電解質が、プロタミン、ゲラチン A、コラーゲン、アルブミン、カゼイン、キト サン、ポリ一（L) リジン、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、へパリン、ヒア ルロニックアシッド、コンドロイチンサルフェート、ゲラチン B、カラギーナン、デキストラ ンサルフェート、ポリ一（L) グルタミックアシッドその他の生体適合性高分子、生分 解性高分子、 DNA、 RNA、酵素若しくは抗体その他の生体高分子、ポリメタタリリツ クアシッド、ポリジァリールジメチルアンモ -ゥム又はその他の合成高分子又はそれら が適当なリンカ一でクロスリンクされた高分子力 なる群より選ばれた、前記 7記載の コンプレックス。
発明の効果
[0011] 本発明の極微粒子状医薬、それと高分子電解質とのコンプレックスは、安定な汚染 フリーの優れたコロイド分散液として調製可能であり、各種注射剤に対応できる。その ため、本発明の極微粒子状医薬、それと高分子電解質とのコンプレックスは、直接血 管内に注入させることができる。経口投与の場合には、難水溶性のため吸収率が低 いことから体内に少量し力移動できな力つたり、胃液や酵素等によって薬物が変質し 、効果が消失してしまうのに比べて、本発明の薬物は、血管内に注入され、非常に速 いスピードで輸送が行われ、投与部位から目的部位への薬物の到達が非常に速い。
[0012] 本発明の極粒子状医薬、特に抗癌剤、それと高分子電解質とのコンプレックスは、 血管内皮細胞の組織間隙が比較的に狭い正常の血管内皮細胞を通過し難いが、血 管内皮細胞の組織間隙が比較的に広ぐ粗 、癌細胞力 伸びる血管内皮細胞を容 易に通過して、癌細胞に吸収される。このように、本発明の極微粒子状抗医薬、それ と高分子電解質とのコンプレックスは、目的部位への輸送の間に正常の血管内皮細 胞を通過し難いため、正常細胞に及ぼす悪影響が少なぐまた、薬物の投与量も少 量ですむため、抗癌剤の強!、副作用も少なくてすむ。
[0013] また、本発明の極微粒子状医薬、特に抗癌剤、それと高分子電解質とのコンプレツ タスは、癌細胞に吸収される確率が従来の薬物に比べて高ぐバイオアベイラビリテ ィ一の向上及び薬物の吸収等の個人差の低減による影響が少ない。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]図 1は、本発明の粒子状の難水溶性薬物及びコンプレックスを調製するために 使用したバッチ式微粒子化装置の全体を示す図である。
[図 2]図 2は、本発明の粒子状の難水溶性薬物を調製するために使用した連続式微 粒子化装置の全体を示す図である。
[図 3]図 3は、光源 10から発するレーザー光のパルス幅と強度とを示すグラフである。
[図 4]図 4は、マイクロ流路導入部 50とマイクロ流路 60との概略を示す拡大斜視図で ある。
[図 5A]図 5Aは、マイクロ流路導入部 50とマイクロ流路 60との断面を示す断面図であ る。
[図 5B]図 5Bは、マイクロ流路 60を流れる有機物の速度分布を示す断面図である。
[図 5C]図 5Cは、マイクロ流路導入部 50とマイクロ流路 60との間に遷移部 64を設け たときの断面を示す断面図である。
[図 6]図 6は、シングルマイクロ流路を用いたコーティング部の 1つの実施形態を示す 図である。
[図 7]図 7は、マルチマイクロフローチャンネルを用いたコーティング部の 1つの実施 形態を示す図である。
[図 8]図 8は、微粒子懸濁液及び高分子電解質液の流れに沿って、本発明の微粒子 のコーティング装置及びコーティング方法の 1つの実施形態の全体を示した線図で ある。
[図 9]図 9は、レーザ光を照射する前及び照射した後のエリプチシンのエタノール溶 液の吸収スペクトルの比較を示す図である。
[図 10]図 10は、レーザ光を照射した後のエリプチシンのエタノール溶液の液体クロマ トグラムを示す図である。
[図 11]図 11は、エリプチシンを微粒子化する前の SEMの画像を示す図である。
[図 12]図 12は、エリプチシンを微粒子化した後の SEMの画像を示す図である。
[図 13]図 13は、エリプチシンを微粒子化した後の粒径分布分ヒストグラムを示す図で ある。
[図 14A]図 14Aは、レーザー未照射の SN— 38のクロマトグラム（展開溶媒:エタノー ル)及び HPLC分析結果である。
[図 14B]図 14Bは、レーザー照射後の SN— 38懸濁液の上澄み液のクロマトグラム（ 展開溶媒：エタノール)及び HPLC分析結果である。
[図 15]図 15は、 SN— 38のレーザー照射後及び遠心分離（2, OOOrpm, 10分）後の SEM像、並びに粒径分布ヒストグラム（サンプル数： 200,平均粒径： 46nm, CV値： 22%)である。
[図 16]図 16は、高分子電解質の添カ卩に伴う SN— 38ナノ粒子のゼータ電位変化を 示すグラフである。
[図 17]図 17は、ヌードマウス移植ヒト癌を用いた SN— 38ナノ粒子、 SN— 38ナノ粒 子―硫酸プロタミン、 SN - 38ナノ粒子―コンドロイチン硫酸と塩酸イリノテカン（CPT - 11)の抗腫瘍効果を示すグラフである。
[図 18A]図 18Aは、レーザー未照射の 10- Hydroxy- camptothecinのクロマトグラム（展 開溶媒：エタノール)及び HPLC分析結果である。 [図 18B]図 18Bは、レーザー照射後の 10-Hydroxy-camptothecin懸濁液の上澄み液 のクロマトグラム (展開溶媒：エタノール)及び HPLC分析結果である。
[図 19]図 19は、 10-Hydroxy-camptothecinのレーザー照射後及び遠心分離（2, 000 rpm, 10分）後の SEM像、並びに粒径分布ヒストグラム（サンプル数： 150,平均粒 径： 68nm, CV値： 25%)である。
[図 20]図 20は、ヌードマウス移植ヒト癌を用いた 10- Hydroxycamptothecinナノ粒子と 塩酸イリノテカン (CPT— 11)の抗腫瘍効果を示すグラフである。
符号の説明
1 容器
2 懸濁液
3 攪拌機
4 レーザ光源
5 レーザ光
10 光源
40 ポンプ (流動手段）
50、 150 マイクロ流路導入部
60、 160、 260、 460、 560 マイクロ流路
64 遷移部
100 微粒子化装置
120 高分子皮膜コーティング部
122a 微粒子懸濁液用マイクロ流路
122b 高分子電解質液用マイクロ流路
122c 合流マイクロ流路
124 高分子電解質液タンク
140 コンプレックス回収楼
発明を実施するための最良の形態
本発明では、医薬にレーザビームを照射することによって粒子を微粒子化する。本 発明にお 、て微粒子化するのに用いる医薬は、合成後の粗製粉末等任意のサイズ 、形状の粉末固体でよいが、微粒子化するのに容易であり、微粒子化の効率が上が りかつ微粒子化したときの医薬のサイズを均一に調整し易いことから、あら力じめ平 均直径をできるだけ微細なかつ狭い範囲、例えば 1〜： LOO /z mの範囲に粉砕してお くのがよい。このような粗砕方法は、公知の方法を使用してよい。
[0017] 本発明において微粒子化する医薬は、水に難水溶性の粒子状薬物である。本発 明において言う難水溶性とは、その溶解性が日本薬局方に定義する、「水に対する 溶解度が極めて溶けにく 、」、「ほとんど溶けな 、」の範囲を!、う。
[0018] また、本発明において微粒子化する粒子状薬物は、その構造中に多重結合を 1個 以上有するのが好ましい。これは、レーザ光が照射される場合に、多重結合部分がレ 一ザ光を吸収し易ぐ光吸収部で急激に局所的な温度上昇が起こる。この光吸収部 の温度上昇は、レーザ光照射後瞬間的に起こり、光吸収部と光非吸収部との間で急 激な温度差が発生し破砕が起こるからである。本発明において言う多重結合とは、共 役又は非共役の二重結合もしくは三重結合を 、う。
[0019] 更に、本発明において微粒子化する医薬とは、薬事法に定義する医薬品、人臨床 試験段階でフェーズアウトした医薬候補ィヒ合物又は人臨床試験中で開発段階にあ る医薬候補ィ匕合物をいう。難水溶性薬物の例として、抗癌剤、抗真菌剤、ビタミン剤 、鎮痛剤、抗炎症剤等を挙げることができる。
[0020] 本発明の粒子状の難水溶性医薬は、抗癌剤であるのが特に好ましい。と言うのは、 癌細胞から伸びる血管内皮細胞に存在する組織間隙は、正常の血管内皮細胞に存 在する組織間隙に比べて、粗く 50nm以上であると考えられる。よって、平均直径が 5 Onm以上でありかつ 200nm以下の難溶性粒子状抗癌剤であれば、各種注射剤に 対応できるとともに、正常の血管内皮細胞を通過し難いが、癌細胞から伸びる血管内 皮細胞を容易に通過できるからである。
[0021] 本発明において言う抗癌剤とは、薬事法に定義する医薬品であって抗癌活性を有 するもの、人臨床試験段階でフェーズアウトした抗癌活性を有する医薬候補ィ匕合物 又は人臨床試験中で開発段階にある抗癌活性を有する医薬候補化合物をいう。
[0022] 本発明にお 、て用いる抗癌剤の例として、カンプトテシン及びその誘導体、エリプ チシン及びその誘導体、ポドフイロトキシン及びその誘導体を挙げることができる。こ れらの一般的な構造式を下記に示す。
[0023] 下記の構造式で表される構造を有するカンプトテシン、及びその誘導体：
[0024] [化 1]
Figure imgf000010_0001
[0025] 下記の構造式で表される構造を有するエリプチシン、及びその誘導体：
[0026] [化 2]
Figure imgf000010_0002
[0027] 下記の構造式で表される構造を有するポドフイロトキシン、及びその誘導体：
[0028] [化 3]
Figure imgf000010_0003
[0029] カンプトテシン誘導体の具体例は、 4 (S)—ェチルー 4ーヒドロキシー 1H ピラノ [3 ，、4，：6, 7]インドリジノ [1, 2— b]キノリン一 3, 14 (4H, 12H)—ジオン（カンプトテ シン）、 7 ェチルー 10 ヒドロキシカンプトテシン（SN— 38)、 9ーァミノカンプトテシ ン、 9 -トロカンプトテシン 5 (R)—ェチル—9, 10 ジフルォロ 1, 4, 5, 13—テ トラヒドロー 5 ヒドロキシー 3H, 15H—ォキセピノ [3，、 4，：6, 7]インドリジノ [1, 2— b]キノリン一 3, 15 ジオン（BN— 80915) [Anti-cancer Drugs (2001), 12(1), 9—19 ]、（9S)— 9 ェチル 9 ヒドロキシ一 1—ペンチルー 1H, 12H ピラノ [3", 4" : 6，， 7，]インドリジノ [1，， 2，：6, 5]ピリド [4, 3, 2— de]キナゾリン— 10, 13 (9H, 15
H) ジ才ン
[し ancer Cnemotherapy and Biotherapy: Principle and Practice,弟 2版, Lippincott-
Ravenmeans, p.463— 484、 (b)Biochim. Biophys. Acta (1998), 1400(1—3), 107— 119]等 であり、これらに限定しない。
[0030] エリプチシン誘導体の具体例は、エリプチシン、 9ーヒドロキシーエリプチシン、 T
215 (TANABE SEIYAKU Co. Ltd.；)等であり、これらに限定しない。
[0031] 抗癌活性を有するポドフイロトキシン誘導体の具体例は、ポドフイロトキシン、エトポ シド、テニポシド等であり、これらに限定しない。
[0032] 粒子状薬物を分散させるのに用いる水、アルコール溶液は、微粒子化する粒子状 薬物が難溶性であり、人体に悪影響を与えずかつ照射するレーザ光を吸収しないも のである。本発明において用いるアルコールの具体例として、エチルアルコール、グ リコール、グリセロール等を挙げることができる。アルコール溶液は、アルコールが 5質 量％以下の水溶液が一般的である。
[0033] 本発明の粒子状の難水溶性医薬は、平均直径 50〜200nmを有する。粒子の平 均直径は、個々の粒子の直径をスケール付き顕微鏡で測定し、全体の個数で割って 求めた値である。
[0034] 難水溶性の粒子状医薬は、水又はアルコール水溶液に粒子状抗癌剤を懸濁させ 、懸濁させた医薬にレーザ光を照射して極微粒子化することによって製造する。水又 はアルコール水溶液を、図 1に示す容器 1に入れ、これに粒子状医薬を混入して懸 濁液 2を生成する。懸濁液 2の濃度は、混入する粒子状医薬の種類やサイズによつ て、異なるが、 1〜： LOmgZmlが普通である。また、容器 1は、レーザ光の照射を受け る面が平面であれば、任意の形状でよいが、略直方体が好ましぐ処理する量に応じ て大きさを決めてよい。容器 1の材質は、レーザ光を透過するものであれば特に透明 である必要は無ぐかつレーザ光の照射に耐えるものであれば任意のものでよぐ石 英、ガラスが一般的である。
[0035] 本発明の水又はアルコール水溶液に難水溶性の平均直径 50〜200nmの粒子状 医薬は、その表面エネルギーによって再凝縮しやすいことから、極微粒子にそれが 有する電荷と反対の電荷を有する高分子電解質を静電的相互作用、疎水的相互作 用によって結合させて高分子電解質とのコンプレックスを形成させることによって得ら れる安定な汚染フリーの優れたコロイド分散液として調製可能である。
[0036] 本発明にお 、て、コンプレックスとは、極微粒子に高分子電解質が一層被覆したも のを言 、、平均直径 50〜250nmの粒子状であるのが好まし!/、。
[0037] コンプレックスの調製は、コア物質となる極微粒子によって決まり、コア物質に応じ て反応時間、懸濁液中の濃度、懸濁液の pH等の条件をその都度細かく設定するこ とによって決まり、一義的に規定することはできな!、。
[0038] このようにして得られた高分子電解質とのコンプレックスは、各種注射剤に対応でき 、直接血管内に注入させることができる。経口投与の場合には、難水溶性のため吸 収率が低いことから体内に少量しか移動できな力つたり、胃液や酵素等によって薬物 が変質し、効果が消失してしまうのに比べて、本発明の薬物は、血管内に注入され、 非常に速いスピードで輸送が行われ、投与部位から目的部位への薬物の到達は非 常に速い。
[0039] レーザ光の照射によって微粒子化された極微粒子は、その表面エネルギーによつ て再凝縮しやすいことから、極微粒子の濃度が高いと、再凝縮しやすいため、懸濁液 2に混入する薬物の濃度は、高くできない。そのため、レーザ光を照射して微粒子化 する前に、微粒子化された極微粒子にそれが有する電荷と反対の電荷を有する高分 子電解質を懸濁液 2に、あら力じめ加えておくのが好ましい。これにより、微粒子化さ れた極微粒子は、高分子電解質とコンプレックスを形成する。コンプレックスは、極微 粒子のような高い表面エネルギーを持たないため、互いに再凝縮することなぐ水又 は希薄アルコール中に安定に懸濁される。すなわち、高分子電解質を懸濁液 2に、 あらかじめ加えておくことにより、混入する薬物の濃度を高くして、処理量の増大を図 ることができる。このような目的で、懸濁液 2に加える高分子電解質は、一種以上を用 いてよい。加える高分子電解質の濃度は、 1〜10%が普通である。
[0040] 本発明にお 、て用いる高分子電解質とは、一般にポリマー鎖の成分又は置換基で あってもよいイオン解離性基を有するポリマーと理解される。通常、高分子電解質中 のこれらイオン解離性基の数は、解離された形のポリマーが水溶性であるような大き さである。この点で、高分子電解質には、イオン基の濃度が水溶性には十分でない 力 自己集合を開始するために十分な電荷を有するィオノマーも含まれると理解され る。解離性基の種類に応じて、高分子電解質は、ポリ酸及びポリ塩基に細分される。 ポリ酸からは、解離の際にプロトンの脱離ィ匕によりポリア-オンが生じ、これは無機ポ リマーであっても有機ポリマーであってもよい。ポリ酸の例は、ポリリン酸、ポリビ-ノレ 硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビュルホスホン酸及びポリアクリル酸であり、これら の塩も含まれる。
[0041] ポリ塩基は、プロトンを例えば酸との反応により造塩下に取り込むことのできる基を 含有する。連鎖位ないしは側鎖位の解離性基を有するポリ塩基の例は、ポリエチレン ィミン、ポリビュルァミン及びポリビュルピリジンである。ポリ塩基は、プロトンを取り込 むことによりポリカチオンを形成する。
[0042] 本発明にお 、て用いるのに適した高分子電解質の例として、生体適合性高分子、 生分解性高分子、生体高分子、合成高分子を挙げることができる。生体適合性高分 子とは、毒性や損傷を生じたり拒否反応を起こすことなく生体組織'器官系と適合す る高分子を言う。生分解性高分子とは、生体内で、あるいは微生物の作用により分解 される高分子の総称であり、加水分解により、水、二酸化炭素、メタンなどに分解され る。生体高分子とは、生体内で合成される高分子化合物の総称である。
[0043] 生体適合性高分子の具体例は、プロタミン、ゲラチン A、コラーゲン、アルブミン、力 ゼイン、キトサン、ポリ一（L) リジン、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、へ ノ《リン、ヒアルロニックアシッド、コンドロイチンサルフェート、ゲラチン B、カラギーナン 、デキストランサルフェート若しくはポリ—（L)—ダルタミックアシッドである。生分解性 高分子の具体例は、 DNA、 RNA、酵素若しくは抗体である。合成高分子の具体例 は、ポリメタタリリックアシッド、ポリジァリールジメチルアンモ -ゥム又はそれらが適当 なリンカ一でクロスリンクされた高分子である。高分子電解質は、これらに限定するも のではない。
[0044] 上述した高分子電解質の電荷は、 pHを変えることで正に帯電したり、負に帯電した りするので、条件によって、使用する高分子電解質が変わる。
[0045] 上記のようにして形成した懸濁液 2を攪拌機 3、好ましくはマグネチックスターラーを 使用して攪拌して、薬物及び高分子電解質を均一に分散させる。
[0046] 水又は希薄アルコール中に分散させた薬物に、レーザ光源 4から吸収波長のレー ザ光 5を照射する。レーザ光源 4は、実質的に一定の強度のレーザ光を連続的に発 するものでも、間歇的にレーザ光を発するもの、例えばパルスレーザ光を発するもの でもよい。
[0047] レーザ光源 4から発するレーザ光は、微粒子化する薬物の吸収波長に合わせて選 択すればよい。例えば、紫外レーザ光や、可視レーザ光や、近赤外レーザ光や赤外 レーザ光がある。紫外光レーザ光を用いる場合には、エキシマーレーザ（193nm、 2 48nm、 308nm、 351nm)や窒素レーザ（337nm)、 YAGレーザの 3倍波及び 4倍 波（355nm、 266nm)等がある。また、可視光レーザ光を用いる場合には、 YAGレ 一ザの 2倍波（532nm)、 Arイオンレーザ（488nm又は 514nm)、その他色素レー ザ等がある。さらに、近赤外レーザ光を用いる場合には、種々の半導体レーザ、チタ ンサフアイャレーザ、 YAGレーザ、ガラスレーザ等がある。さらに、これらのレーザ光 と光パラメトリック発振器を用いて、紫外力も赤外領域の任意の波長の光を発振させ て用いてもよい。
[0048] レーザ光源 4から発せられるレーザ光は、パルスレーザ光であるものが好ましい。図 2は、光源 4から発せられるレーザ光のパルス幅と強度とを示すグラフである。図 2に 示したグラフは、横軸は、時間を示し、縦軸は、光源 4から発せられるレーザ光の励 起光強度を示す。図 2に示すように、光源 4から発せられるレーザ光は、パルス状のレ 一ザ光である。すなわち、光源 4は、レーザ光が発せられる点灯状態と、レーザ光が 発せられない消灯状態とを交互に繰り返すもので、間歇的にレーザ光を発する。特 に、レーザ光の強度がパルス状に変化するものが好ましい。以下では、 1つのパルス のレーザ光をパルス光と称する。パルスレーザ光を用いたときには、 1つのパルス光 によって 1回の照射が行われる。
[0049] 光源 4から発せられるレーザ光の励起光強度 Pは、 1〜： LOOOmjZcm2が好ましぐ 30〜300miZcm2力より好ましい。また、パルス光とパルス光との間のパルス周期 T は、 0. l〜1000Hzが好ましい。ここで、パルス周期とは、ある一のパルス光の立ち 上がりの時点から、一のノ ルス光と隣り合うパルス光の立ち上がりの時点までの時間 、又はパルス光の立ち下がりの時点から、隣り合うパルス光の立ち下がりの時点まで の時間をいう。さらに、パルス光の各々のパルス幅 sが、 10_15〜10_6秒であるものが 好ましい。なお、パルス幅とは、ある一のパルス光の立ち上がりの時点から、立ち下が りの時点までの時間を 、う。
[0050] パルスレーザ光を用いたときには、 1つのパルス光によって薬物への 1回の照射が 行われる。本明細書では、ある対象となる薬物に対してレーザ光を照射することがで きる時間を照射時間 tLとする。照射時間 tLを長くした場合には、図 2に示すように、 パルスレーザ光の点灯状態と消灯状態との双方が含まれ得る。消灯状態では、レー ザ光は発せられていないが、点灯状態となったときには、レーザ光が発せられて、あ る対象となる有機物へレーザ光が照射される。このように、ある時間内に消灯状態が 含まれていても、ある対象となる有機物に対してレーザ光を照射できる点灯状態が含 まれていれば、その時間は、照射時間 tLとなる。
[0051] より具体的には、ある対象となる薬物が流動しており、レーザ光の照射領域に入り、 その後、レーザ光の照射領域から出るようにした場合に、その薬物がレーザ光の照 射領域に存在している時間が長いときには、その薬物にパルス光が複数回照射され ることになる。このように、薬物を流動させる場合には、上述した照射時間 tLは、ある 対象となる薬物が、レーザ光の照射領域に存在している時間とすることができる。上 述したように、薬物にレーザ光を照射することで、薬物を微粒子化することができる。 この微粒子化したときの大きさが所望するものとなるように、パルス光を薬物に照射す る回数を定めることができる。パルス光を照射する回数は、上述したパルス周期 Tや、 薬物の流動速度等を調節することによって変更することができる。このようにすること で、レーザ光の照射領域では、少なくとも 1回パルス光がその薬物に照射されること になる。なお、レーザ光の照射領域とは、レーザ光が点灯状態であるときに、レーザ 光が照射される範囲をいう。
[0052] また、レーザ光の照射時間は、ナノ秒程度の短時間のパルス光を複数回照射する ことが好ましい。また、上述したノ ルス幅 sの長さを変更することによって、薬物を微粒 子化したときの粒径を制御することもできる。
[0053] 本実施態様のように、ノ ツチ式で撹拌槽を用いる場合には、撹拌して 、る薬物は、 何度もレーザ光の照射を受ける。そのため、薬物が何度もレーザ光の照射を受けるこ とにより、微粒子化され過ぎて平均直径が 50nmよりも小さい粒子が形成されたり、薬 物が変質したりする恐れがあるため、レーザ光の総照射時間は重要な要因である。
[0054] レーザ光の総照射時間は、撹拌速度、薬物のサイズ、レーザ光源、パルス幅、光強 度等の要因によって変わってくるが、数秒〜数分が一般的である。
[0055] レーザ光の照射を停止した後に、あら力じめ電解質を加えていない場合には、極微 粒子間凝集を防止する目的で、直ちに電解質を加えてコンプレックスを形成して、極 微粒子を水又は希薄アルコール中に安定に懸濁させる必要がある。
[0056] このようにして得られたコンプレックスを含有するコロイド溶液は、適宜溶媒で希釈 するか又は濃縮することにより、目標とする濃度の注射剤として使用することができる
[0057] また、コンプレックスを固体として得ることを所望する場合には、コロイド溶液をフィル ターを通して固体を分離し、よく洗浄し、乾燥し或は水又は希薄アルコール中を蒸発 させて固体を分離し、よく洗浄し、乾燥してもよい。後者の場合には、溶媒としてアル コール、液体窒素又は液体ヘリウムを用いるのが好ましい。
[0058] 以上、本発明の薬物を、ノ ツチ式で調製する場合について説明した力 連続して 調製する場合について以下に説明することにする。
本発明の薬物を連続して調製する場合に使用する薬物の微粒子化装置 100を図 3に示す。
[0059] 図 3に示すように、供給部 20は、水又は希薄アルコール中に薬物を分散させた薬 物含有懸濁液を収容するための槽からなる。
供給部 20は、所定の容積を有する。容積は、 1回の処理をする所望の大きさにす ればよい。また、供給部 20は、注入された薬物含有懸濁液の濃度が変化しないよう に、密閉できるものが好ましい。
供給部 20の下部には、配管 30が接続されて、供給部 20が、配管 30と連通するよう にされている。供給部 20に注入された薬物含有懸濁液を配管 30に排出することが できる。
[0060] 図 3に示すように、配管 30には、ポンプ 40が設けられている。ポンプ 40は、後述す るマイクロ流路 60へ薬物含有懸濁液を供給するためのものである。ここで、マイクロ 流路とは、精密加工により形成されたミクロンオーダーの流路幅を有する流路である 。ポンプ 40は、マイクロ流路 60を流れる薬物含有懸濁液の流速が所望する速度にな るように制御できる。特に、マイクロ流路 60で薬物含有懸濁液を連続的に流す場合 には、マイクロ流路 60における流速が一定になるように制御できるものが好ましい。ま た、マイクロ流路 60で薬物含有懸濁液を間歇的に流す場合には、所望のタイミング で、マイクロ流路 60において、薬物含有懸濁液を停止させたり流動させたり制御でき るものが好ましい。マイクロ流路 60において、薬物含有懸濁液を停止させた場合に は、光源 10から発せられたレーザ光を的確に薬物に照射することができる。
[0061] 図 3に示すように、配管 30には、マイクロ流路導入部 50が接続されて、配管 30が、 マイクロ流路導入部 50と連通するようにされている。ポンプ 40を駆動することで、供 給部 20に注入された薬物含有懸濁液を、配管 30を介して、マイクロ流路導入部 50 に供給することができる。
[0062] マイクロ流路導入部 50は、略直方体の形状を有する。マイクロ流路導入部 50は、 供給部 20から供給された薬物含有懸濁液を、一時的に貯留することによって、後述 するマイクロ流路 60を流れる薬物含有懸濁液の流速を均一化するためのものである 。このマイクロ流路導入部 50の容積は、処理する薬物含有懸濁液や、ポンプ 40によ つて生成される流速等に応じて適宜定めればょ 、。
[0063] なお、上述した例では、マイクロ流路導入部 50の形状を、略直方体としたが、後述 するマイクロ流路 60を流れる薬物含有懸濁液の流速を均一に近づけることができる ものであればよぐ略円筒形状等の曲面で形成されたものでもよい。マイクロ流路導 入部 50の形状は、マイクロ流路 60を流れる薬物含有懸濁液の流速や薬物含有懸濁 液の種類や大きさによって適宜定めればよい。
[0064] 図 4に示すように、マイクロ流路導入部 50には、マイクロ流路 60が接続されて、マイ クロ流路導入部 50が、マイクロ流路 60と連通するようにされている。図 4に示すように 、マイクロ流路導入部 50は、排出面 52を有する。この排出面 52には、開口 54が形 成されている。この開口 54にマイクロ流路 60が接続されている。このよう〖こすることで 、開口 54を介して、マイクロ流路導入部 50からマイクロ流路 60へ薬物含有懸濁液を 供給することができる。
[0065] 光源 10から発せられたレーザ光を、マイクロ流路 60を流れる薬物含有懸濁液に照 射することによって、薬物を微粒子化することができる。
[0066] マイクロ流路 60は、長尺な直方体の形状を有し、マイクロ流路 60の長手方向に対 して垂直な面に沿った断面は略正方形である。この正方形の一辺の長さ ML (図 4参 照）を、薬物の最大直径の 1. 1倍〜 200倍とするのが好ましぐ 3倍〜 60倍とするの 力 り好ましい。このようにすることで、マイクロ流路 60における薬物の流れを円滑に することができ、薬物によって、マイクロ流路 60が閉塞されることを防止して、薬物へ のレーザ光の照射を的確に行うことができる。
[0067] なお、マイクロ流路 60の形状は、直方体には限られず、光源 10から発せられたレ 一ザ光が照射される箇所 (後述する照射領域 LRに位置する箇所)が平坦であればよ い。
[0068] また、上述した例では、マイクロ流路 60の長手方向に対して垂直な面に沿った断 面の形状を略正方形としたが、レーザ光を薬物に的確に照射することができればよく 、断面の形状は矩形等の形状にしてもよい。
[0069] マイクロ流路 60は、光源 10から発せられたレーザ光を透過させることができるような 材料、好ましくは透明な材料、例えば石英や、ガラスによって構成されている。
[0070] 図 4に示すように、光源 10から発せられたレーザ光 LAは、マイクロ流路 60の上面 6 2の一部に照射される。レーザ光 LAの照射領域 LR (図 4で斜線を付した領域）は、 略円形であり、その直径 dL力 上面 62の短手方向の長さ MLよりも長くなるようにす ることで、レーザ光をマイクロ流路 60に十分に照射することができる。
[0071] 上述したポンプ 40を駆動することによって、薬物含有懸濁液が、マイクロ流路導入 部 50からマイクロ流路 60へ流入し、有機物はマイクロ流路 60内を流動する。ある所 定の薬物に着目した場合に、マイクロ流路 60内の薬物含有懸濁液の流れに従って、 レーザ光 LAの照射領域 LRに至り、しばらくの間、照射領域 LRに存在した後、照射 領域 LRから出る。
[0072] パルスレーザ光を用いたときに、薬物が照射領域 LRに存在している時間が長い場 合に、その薬物には、パルス光が複数回照射されることになる。薬物をマイクロ流路 6 0内で流動させる場合には、上述したように、照射時間 tLは、ある対象となる有機物 力 照射領域 LRに存在している時間とすることができる。
[0073] 上述したように、薬物にレーザ光を照射することで、薬物を微粒子化することができ る。この微粒子化したときの大きさが所望するものとなるように、パルス光を薬物に照 射する回数を定めることができる。パルス光を照射する回数は、上述したパルス周期 Tや、薬物の流動速度等を調節することによって変更することができる。このようにす ることで、レーザ光の照射領域 LRでは、少なくとも 1回ノ ルス光がその薬物に照射さ れること〖こなる。
[0074] マイクロ流路導入部 50の断面の大きさ SA (図 4参照）力 マイクロ流路 60の長手方 向に対して垂直な面に沿った断面の大きさ SB (図 4参照）の 2倍以上とするのが好ま しい。一般的に、マイクロ流路 60を流れる有機物の流速 VLは、マイクロ流路 60の壁 面近傍が最も遅ぐマイクロ流路 60の中心近傍が最も速くなるような速度の分布（以 下、速度分布と称する。）が生ずる傾向がある（図 5B参照)。このような速度分布が生 じた場合には、マイクロ流路 60の壁面近傍を流れる薬物は、流速が遅いので、照射 領域 LRに存在している時間が長くなり、マイクロ流路 60の中心近傍を流れる薬物は 、流速が速いので、照射領域 LRに存在している時間が短くなる。このため、ノ レスレ 一ザ光を照射したときには、マイクロ流路 60の壁面近傍を流れる有機物にパルス光 が照射される回数は、多くなり、マイクロ流路 60の中心近傍を流れる有機物にパルス 光が照射される回数は、少なくなる。また、連続的なレーザ光を照射する場合には、 マイクロ流路 60の壁面近傍を流れる有機物にレーザ光が照射される時間は、長くな り、マイクロ流路 60の中心近傍を流れる有機物にレーザ光が照射される時間は、短く なる。このため、薬物が流れる場所によって、微粒子化の程度が異なり、微粒子化さ れた後の薬物の大きさに不均一が生ずる可能性がある。このため、上述したように、 マイクロ流路導入部 50の断面の大きさ SAを、マイクロ流路 60の断面の大きさ SBの 2 倍以上とすることによって、マイクロ流路 60へ流入させた薬物の流速分布を小さくし て、微粒子化された後の薬物の大きさに不均一化が生ずることを防止することができ る。
[0075] 上述したように、ポンプ 40を駆動することによって、薬物含有懸濁液が、マイクロ流 路導入部 50からマイクロ流路 60へ流入する。このマイクロ流路 60における薬物の流 速 VL (図 5A参照）は、 VLく KX dLZtLとするのが好ましい。なお、ここで、流速 VL は、上述した速度分布がない状態、又は速度分布を十分に無視できる状態での薬 物の流速である。この流速 VLを、この範囲にすることで、レーザ光を薬物に過不足な く照射することができ、所望する大きさに微粒子化することができる。例えば、パルス 光を薬物に照射する場合には、適切な回数だけ、パルス光を薬物に照射することが できる。
[0076] ここで、 dLは、レーザ光が照射されるときのレーザ光の直径であり（図 4参照）、 tLは 、上述した照射時間であり（図 2参照）、 Kは、 1〜0. 1の範囲の定数であり、薬物の 種類に応じて定められる定数である。なお、 Kは、上述した範囲に限定されるもので はなぐ薬物が、照射領域 LRを通過するときに、薬物に照射されるパルス光の回数 力 薬物を微粒子化するのに十分なものとなるように、 Kの値を定めるのが好ましい。 このようにして、微粒子化された薬物の大きさは、 50〜200ナノメートルである。
[0077] 図 5Aは、マイクロ流路導入部 50とマイクロ流路 60との断面を示す断面図である。
マイクロ流路 60において、レーザ光 LAを照射する箇所は、マイクロ流路導入部 50の 排出面 52から、レーザ光 LAの照射領域 LRの中心 LCまでの距離力 10 X Dm以下 となるようにするのが好ましい（図 5A参照）。ここで、 Dmは、マイクロ流路 60における 水力直径であり、 Dm=4 X (マイクロ流路 60の断面の大きさ SB) Z (マイクロ流路 60 の断面の全周）である。例えば、マイクロ流路 60の断面力 長さ MLの正方形である ときには、 Dm = 4 X ML2/4ML = MLとなる。上述したマイクロ流路 60の薬物の流 速分布は、マイクロ流路導入部 50の排出面 52から離れるに従って大きくなる傾向が あり、レーザ光 LAを照射する箇所をこのような範囲にすることで、マイクロ流路 60内 を流れる薬物の流速分布が大きくなる前に、レーザ光 LAを薬物に照射することがで き、的確に薬物を微粒子化することができ、微粒子化された後の薬物の大きさを均一 に近づけることができる。
[0078] 上述した例では、マイクロ流路導入部 50に形成された開口 54に、直ちにマイクロ流 路 60が接続されている場合を示した力 図 5Cに示すように、マイクロ流路導入部 50 とマイクロ流路 60との間に、遷移部 64を形成してもよい。遷移部 64は、マイクロ流路 導入部 50に形成された開口 54から離れるに従って、断面が徐々に小さくなるように 形成されている。このようにすることで、遷移部 64は助走区間として機能し、マイクロ 流路 60に流れ込む薬物の速度分布をより小さくすることができる。この遷移部 64の 形状は、薬物含有懸濁液の流速や粘性等に応じて適宜定めればょ 、。
[0079] 図 3に示すように、マイクロ流路 60には、回収部 70が接続されて、マイクロ流路 60 力 回収部 70と連通するようにされている。回収部 70は、マイクロ流路 60でレーザ光 が照射された薬物を含む懸濁液を収容できる槽カ なる。
[0080] 回収部 70に、再凝集防止装置 72を設けるのが好ましい。この再凝集防止装置 72 は、超音波振動子を含み、回収部 70に収容された懸濁液に超音波を発する。この超 音波が、懸濁液に伝播されることによって、微粒子化された薬物が、再凝集すること を防止することができる。再凝集防止装置 72から発する超音波の強度や波長は、微 粒子化された薬物の大きさや種類等に応じて適宜定めればよい。また、上述した例 では、再凝集防止装置 72として超音波を発するものを示したが、微粒子化された薬 物の再凝集を防止することができるものであれば他のものでもよい。
[0081] 回収部 70の槽内には、磁気駆動回転羽根車 74を設けるようにしてもよい。この磁 気駆動回転羽根車 74は、回収部 70の外側力も磁場を印加することで回転させること ができるもので、磁気駆動回転羽根車 74を回転させることによって、回収部 70に収 容された懸濁液を攪拌することができ、微粒子化された薬物の再凝集を防止すること ができる。この磁気駆動回転羽根車 74の大きさや回転数は、微粒子化された薬物の 大きさや種類等に応じて適宜定めればよい。
[0082] 次に、上述した通りにして得られた薬物の極微粒子が有する電荷を測定する。電荷 は、ゼータ電位計で測定する。コア物質に応じて正であったり、負であったりする。極 微粒子に、それが有する電荷と反対の電荷を有する一種以上の高分子電解質を静 電的相互作用、疎水的相互作用によってコンプレックスを調製して、極微粒子が再 凝集するのを防ぐ。
[0083] このようなコンプレックスを調製する方法及びそれに用いる装置を下記に説明する ことにする。
[0084] 薬物の微粒子懸濁液と高分子電解質液を用いて、微粒子の外表面に高分子電解 質の皮膜を形成する高分子皮膜コーティング部の 1つの実施形態を、図 6及び図 7を 用いて説明する。この高分子皮膜コーティング部は、本発明において用いる微粒子 コーティング装置の主要構成機器の 1つである。
[0085] 本実施形態では、薬物の微粒子懸濁液の流れと高分子電解質液の流れとを合流 させることによってコーティングを行なう。また、本実施形態では、微粒子懸濁液と高 分子電解質液とが、共にマイクロフローチャンネルの中を流れるようになつている。図 6には、微粒子懸濁液と高分子電解質液とが、各々 1本のマイクロフローチャンネル の中を流れて合流するシングルマイクロフローチャンネルを用いた高分子皮膜コーテ イング部の実施形態を示し、図 7には、図 6に示すシングルマルチフローチャンネルを 用いた高分子皮膜コーティング部が複数備えられたマルチマイクロフローチャンネル を用いた高分子皮膜コーティング部の実施形態を示す。
[0086] まず、図 6に示すシングルマイクロフローチャンネルを用いた高分子皮膜コーティン グ部の実施形態の説明を行なう。図 3における回収部 70の槽のマイクロ流路 60から の流入口の面に対して背面の下部に排出マイクロ流路 76を設ける。ここで、このマイ クロ流路は、微粒子製造装置によって微粒子化された極微粒子が、極微粒子懸濁液 の中で再凝集することを防ぐために有効である。特に、マイクロ流路の流路幅を、極 微粒子懸濁液の中で流動する極微粒子長径よりもわずかに大きい程度にすることが 好ましい。ただし、粒径のばらつきや、マイクロ流路の加工精度等を考慮すると、流動 する極微粒子長径の 1. 1〜500倍の範囲、好ましくは 50〜500倍の範囲で定めるこ とが望ましい。
[0087] 次に、高分子電解質液が流れるマイクロ流路も、上述の極微粒子懸濁液が流れる マイクロ流路と同様の寸法に設定することができる。マイクロ流路を流れる高分子電 解質液は、高分子電解質を結合させる又は高分子電解質でコーティングする極微粒 子の最外層の電荷と反対の電荷を有する高分子電解質を含んでいる。つまり、微粒 子懸濁液に含まれる極微粒子の最外層が負の電荷を有する場合には、正の電荷を 有するカチオン性高分子電解質液をマイクロ流路に流す。同様に、極微粒子懸濁液 に含まれる極微粒子の最外層が正の電荷を有する場合には、負の電荷を有するァ ユオン性高分子電解質液をマイクロ流路に流す。 [0088] また、極微粒子懸濁液が流れるマイクロ流路と、高分子電解質が流れるマイクロ流 路とが合流する角度につ 、ては、鋭角から鈍角まで幅広!、角度を選択することがで きる。合流する角度は、 0〜180度の範囲が好ましい。マルチマイクロフローチャンネ ルを用いる場合は 0〜5度の範囲がより好ま U、。
[0089] 上述のように、各高分子皮膜コーティング部では、極微粒子懸濁液に対して、極微 粒子の最外層の電荷と反対の電荷を有する高分子電解質液を用いるので、互いに 引き付け合う静電気力によって、 2つの液を合流させるだけで、強い皮膜を容易に形 成することができる。
[0090] 図 6には、シングルマイクロ流路を用いた例を示した力 マルチマイクロ流路を用い
、それぞれで上記と同様に高分子皮膜コーティングを実施することにより、コンプレツ タスを高 、生産性で調製することができる。
[0091] 次に、回収部 70中の極微粒子懸濁液から、コンプレックスを一連の様式で調製す るコーティング装置及びコーティング方法の全体を、図 8に示した線図を用いて説明 すること〖こする。
[0092] 本発明において用いる極微粒子のコーティング装置は、主に、高分子皮膜コーティ ング部 120からなる。高分子皮膜コーティング部 120は、コーティングする前の極微 粒子の懸濁液を収容した微粒子懸濁槽 70 (前記回収部 70)と、極微粒子懸濁液用 マイクロ流路 122aと、高分子電解質液用マイクロ流路 122bと、それらが合流して形 成される合流マイクロ流路 122cと、高分子電解質液を貯蔵した高分子電解質液タン ク 124と、コーティング処理が終了した高分子皮膜極微粒子 (形成されたコンプレック ス）を回収するコンプレックス回収槽 140と、ポンプ、配管、バルブ類力も構成される。
[0093] なお、図を簡略化するため、マイクロ流路を用いた高分子皮膜コーティング部 120 は、シングルマイクロ流路の形で示されている力 実際には、微粒子の生産量に応じ た本数のマイクロ流路を有するマルチマイクロ流路を用いることができる。
[0094] ここで、極微粒子懸濁液の流れに沿って説明すると、微粒子懸濁槽 70に極微粒子 懸濁液が収容されている。溶媒として水を用いた場合について説明すると、極微粒 子が水に懸濁されており、極微粒子の外表面は水の中でイオンィヒして正又は負の電 荷を有している。簡単にするために、極微粒子の外表面が負の電荷を有している場 合について説明する。なお、この場合、高分子電解質としてはカチオン性高分子電 解質液を用いる。
[0095] この状態において、ポンプ 114を用いて、コーティング前の極微粒子懸濁液を、微 粒子懸濁槽 70から高分子皮膜コ一ティング部 120内の極微粒子懸濁液用マイクロ 流路 122aへ送る。同様に、ポンプ 126を用いて、高分子電解質液タンク 124に貯蔵 されたカチオン性高分子電解質液を、高分子電解質液タンク 124から高分子電解質 液用マイクロ流路 122bへ送る。
[0096] そして、極微粒子懸濁液用マイクロ流路 122aと高分子電解質液用マイクロ流路 12 2bとが合流して、合流マイクロ流路 122cを形成する。合流マイクロ流路 122cにおい て、極微粒子懸濁液とカチオン性高分子電解質液とが混合し、極微粒子の外表面に カチオン性高分子電解質が接触してカチオン皮膜を有するコンプレックスが形成さ れる。
[0097] そして、極微粒子懸濁液とカチオン性高分子電解質液との混合液であるカチオン 性混合液力 形成されたコンプレックスを含んだ状態でコンプレックス回収槽 140〖こ 回収される。
なお、極微粒子の外表面が正の電荷を有している場合も、高分子電解質液として ァ-オン性高分子電解質液を用いる以外は上記と同様の方法でコンプレックスを形 成することができる。
以下において、本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。
実施例
[0098] <実施例 1 >
(1)レーザ照射条件：
光源は、 Nd3T :YAGレーザ（Continuum, Surelite)を用い、 OPO (Optical Parametr ic Oscillator： Continuum, SureliteOPO)システムでレーザ光をとりだした。レーザ光 強度の調節は減光板と attenutorを用いて行った。光照射面積は石英セルの前面の 感光紙にレーザ光を照射して見積もった。
レーザ:繰り返し周波数： 10 Hz
ノ レス幅：7ns 励起波長： 355nm
照射面積: 0. 28cm2
エリプチシンの微粒子化：レーザ光強度： lOOmjZcm2
総照射時間： 10秒
[0099] (2)エリプチシンサンプノレ：
試料は、エリプチシン (Fluka, > 99%)を用い、これをおよそ 1 μ m程度に粗粉砕 して用いた。溶媒は、脱イオン水を用いた。
極微粒子作製には、試料懸濁液 75mlに超音波（SHARP,UT-205,高周波数:最 大 200W)を照射したものを使用した。この試料懸濁液カゝらマグネチックスターラーを 用いて攪拌しながら 3ml量り取り、光路長 lcmの石英セル（1x1x5cm3)に移し、マグ ネチックスターラーを用いて攪拌しながらレーザ光を照射した。
[0100] 生成した極微粒子は、あら力じめ添加した高分子電解質により、直ちにコーティン グされ、安定化されて粒子間凝集を阻止する目的で (a)高分子電解質を添加したサ ンプノレと
(b)高分子電解質非添加のサンプル
の二種で照射し両者を比較検討した。
(a)エリプチシン +高分子電解質 +水分散液
高分子電解質:プロタミン (濃度： lxlO_2gZml)
抗癌剤としてエリプチシン 4. 1 X 10"3M (1. Omgmr1)を用い、レーザ光を照射し て分散させた。照射後一時間放置して、生成した上澄みを評価した。
エリプチシン 4. 1 X 10"3M (1. Omgmr1)を用い、レーザ光を照射しないで分散さ せた。その上澄み部分をコント一ロールとした。
上澄み液の濃度は、吸光度力 見積もった。
(b)エリプチシン +水分散液
エリプチシン 1. 5 X 10"4M (3. 6xl0_2gl_ 1)を用い、レーザ光を照射して分散さ せた。照射後の上澄みを評価した。
エリプチシン 1. 5 X 10"4M (3. 6xl0_2gl_ 1)を用い、レーザ光を照射しないで分 散させた。その上澄み部分をコント一ロールとした。 上澄み液の濃度は、吸光度力 見積もった。
[0101] その結果、高分子電解質存在下レーザ光を照射して分散させた後の上澄み濃度 は高分子電解質非存在下でのものと比較して〉 100倍濃い値を示した。
高分子電解質存在下でレーザ光を照射して分散させた後の上澄み濃度： > 1. 8x
Figure imgf000026_0001
[0102] (3)極微粒子の評価
(3- 1)生成した極微粒子の純度評価は、次の手順で行った。
照射後の懸濁液から上澄みを抜き取り、真空ポンプで溶媒を留去した後に、残渣 にエタノールをカ卩えて紫外、可視吸収スペクトル（SHIMADZU, UV-3100. HITACHI, F-4500)及び液体クロマトグラフィー（SHIMADZU,SPD-10)を測定した。
吸収スペクトルの比較 一未照射及び照射後のエタノール溶液 を図 9に示す。図 9では、未照射のエリプチシンエタノール溶液の吸収スペクトル（実線)及びレーザー 照射（100miZcm2、 10秒間）後のエリプチシンエタノール溶液の吸収スペクトル（点 線）が示されている。図 9から、未照射の吸収スペクトル (実線）と照射後の吸収スぺク トル (点線）とを比べて変化がほとんど認められない。これより、レーザ光照射により微 粒子化されたエリプチシンは、ほとんど分解されて 、な 、ことが分かる。
レーザ光を照射した後のエリプチシンのエタノール溶液の液体クロマトグラムを図 1 0に示す。図 10からも、レーザ光照射により微粒子化されたエリプチシンが、ほとんど 分解して!/、な 、ことが分かる。
[0103] (3— 2)エリプチシンを微粒子化する前の SEMの画像と、微粒子化した後の SEMの 画像とをそれぞれ図 11及び 12に示す。微粒子化する前の粒子の平均直径は、 1 μ m程度であり、これが機械的な微粒子化の限界である。
FEI, Strata DB235-51で観察。別添写真参照
[0104] (3— 3)微粒子化した後の粒径分布分ヒストグラムを図 13に示す。
図 13から、本発明のコンプレックスは、そのほとんどが 70〜130nmの粒度分布の 中に入り、粒径が均一であることが分かり、平均直径は lOOnmであった。平均直径 は、個々の粒子の直径をスケール付き顕微鏡で測定し、全体の個数で割って求めた FEI, Strata DB235- 51で観察。 MALVERNゼータサイザ一 Nano- ZSで測定。 本例では、被膜の厚さは、 3〜4nmであり、全体の粒径に及ぼす影響は、無視でき る。
[0105] (3— 4)細胞毒性試験
レーザ照射して微粒子化したエリプチシン (濃度 2 μ g/ml)を下記細胞培養液で 希釈して 1 g/ml, 0. 5 μ g/ml, 0. 25 μ g/ml, 0. 125 g/mlの被検サンプ ルを調製した。対象細胞は MCF— 7 (MEM (培地）及び L— 1210 (RPMI— 164 0培地)腫瘍細胞とし、細胞毒性は Cell Counting Kit-8を用い、脱水素酵素活性を指 標とする WST— 8 (特許 2757348)の 450nm発色測定で 24hrs培養後の生細胞数 を測定した。
バイアビリティー (%)= (A -A ) / (A -A ) 100%
samples blank no— samples blank
(式中、 Aは、 UV特性の波長 450nmにおける吸光度を表し、 A は、試料が存
samples
在して ヽる場合の吸光度を表し、 A
no— samplesは、試料が存在せず、高分子電解質が 存在する場合の吸光度を表し、 A
blankは、培地のみが存在する場合の吸光度を表す o )
細胞に対する 50%阻害活性はそれぞれ
MCF- 7 cell: 0. 21 ^ g/ml
L 1210 cell: 0. 09 μ g/ml
であった。
なお、対照はエリプチシンが水に溶けないので評価不能である。文献で知られてい る値はジムソ一等の有機溶媒を使用して 、るため直接比較はできな!、。
[0106] この結果より、本発明の極粒子状抗癌剤、及びそれと高分子電解質とのコンプレツ タスは、腫瘍細胞に対して阻害活性を示し、薬効を有することが立証された。
[0107] <実施例 2>
SN— 38ナノ粒子の調製
0. 01NHC1を 100倍希釈して、 pH=4. 0の塩酸水溶液を調製した。この溶液 20 ml中に 60mgの SN— 38を混入し 2時間以上超音波処理した。この懸濁液をマグネ チックスターラーで良く攪拌しながら、懸濁液 2. Omlを量り取り、光路長 lcmの石英 セルに入れた。これに pH=4. 0の塩酸水溶液 lmlをカ卩ぇ SN— 38の濃度 2mgZml の懸濁液とした。マグネチックスターラーで良く攪拌しながら、レーザー（420nm励起 , 80mj/cm2, 100分間）を照射した。レーザー照射後、 1日室温で静置し、その上 澄み液を取り、吸収スペクトル、 HPLC、粒度分布及び SEM測定を行った。その結 果、上記レーザー照射条件下では SN— 38の化学分解は起こらず、ナノ化が進んだ (図 14A、図 14B及び図 15参照)。生成したナノ粒子の収率は 50%以上で濃度は 1 mgZ mlであつ 7こ。
[0108] SN 38ナノ粒子 硫酸プロタミンと SN— 38ナノ粒子 コンドロイチン硫酸の調製
SN - 38ナノ粒子を安定化する目的（自己凝集を防ぐ目的)で、上記上澄み液 lm gZmlに、ナノ粒子表面のゼータ電位が一定値に達するに十分量のプロタミン又は コンドロイチンサルフェートを添カ卩し（ lmgZml微粒子化 SN— 38に対し、重量比で 30wt%となるように lOmgZmL硫酸プロタミン（pH4)または lOmgZmLコンドロイ チン硫酸 (PH4)を加え）それぞれ一定のゼータ電位 + 19. 9mV, —47. 2mVに調 製した (図 16参照)。
[0109] SN— 38ナノ粒子の細朐毒件試験
実施例 1の（3— 4)に記載のエリプチシンの細胞毒性試験と類似の方法で 72hrs培 養後の生細胞数を測定した。 50%阻害活性は MCF— 7 cellで ΙΟΟηΜであった 。対照として用いたレーザ未照射 SN— 38の DMSO溶液と水懸濁液はそれぞれ 50 %阻害活性が 500nM, 2000nMであった。
この結果より、対照と比較してナノ化試料のより高い細胞内移行性が示された。
[0110] ヌードマウス移植ヒト癌を用 、た SN— 38ナノ粒子、 SN 38ナノ粒子 硫酸プロタミ ン、 SN— 38ナノ粒子—コンドロイチン硫酸と塩酸イリノテカン (CPT— 11)の抗腫瘍 効 の針比枪討
碰
名称： 株式会社実験癌化学療法研究所
住所： 大阪府箕面巿白島 3-13-1
[0111] 材料および方法
1.被験物質： SN— 38ナノ粒子 SN 38ナノ粒子 硫酸プロタミン
SN— 38ナノ粒子-コンドロイチン硫酸
保存条件：気密容器に入れ遮光、室温（23°C)で保存した。
対比薬:塩酸イリノテカン (CPT— 11)
[0112] 2.使用ヒト癌株
胃癌 H— 23,中分化型腺癌 323代目
[0113] 3.実験動物
BALBZcAJcl— nuヌードマウス（雄性、日本クレア株式会社）
[0114] 4.移植方法
ヌードマウスを頸椎脱臼により屠殺後、皮下で継代している腫瘍を摘出して腫瘍か ら被膜と壊死部を除き、 RPMIメディウムにて洗浄し、 2〜3mm角の出来るだけ均等 な立方状の腫瘍片を作製した。この腫瘍片を生後満 6週齢のマウス背部皮下に troc arを用 、移植した (移植日： DayO)。
[0115] 5.実験方法
ノギスを用いて腫瘍の最大径 (L)と直交する横径 (W)及び厚み (D)を 0. 5mm単 位まで計測し、 V= 1Z2XLXWXDの式で求めた推定腫瘍体積が約 70mm3前後に 達した時 (移植後 7日）、 1群 5匹で、推定腫瘍体積の平均値、標準誤差とも出来る限 り均等となるよう対照群と治療群を設定し、投与を開始した。
実験終了は投与開始日力 4週間後とし、腫瘍径を週 2回、体重を投与時に計測し 、腫瘍増殖の状態と薬剤の投与による影響をモニターするとともに、その他の身体的 変化を観察した。動物は腫瘍移植時、投与時及び計測時にスリーブを通じてクリーン ベンチに移した以外は、実験終了時まで終始小型ビニールアイソレータ内で飼育し た。
[0116] 6.投与量及び投与スケジュール
(1) Control (薬剤無処置）
(2) CPT— 11 60mg/kg (i. v. ) q4dX 4 計 4回
(3) SN— 38ナノ粒子 10mg/kg (i. v. ) q4d X 4 計 4回
(4) SN— 38ナノ粒子-プロタミン 3mg/kg (i. v. ) q4d X 4 計 4回 (5)SN 38ナノ粒子-コンドロイチン硫酸 lOmgZkg (i. v. ) q4d X 4 計 4回
[0117] 7.調製液の作製方法
SN 38ナノ粒子（ lmgZml)および SN— 38ナノ粒子 コンドロイチン硫酸（ lmg /ml)原液（ 1 OmgZkg投与群用；)、 SN— 38ナノ粒子 硫酸プロタミン（ lmgZml) を注射用蒸留水で 0. 3mgZml (3mgZkg投与群用)となるよう希釈した。さらに投与 直前に 27%NaCl液を容積比 1： 30ずつ加えた。 CPT— 11は 3mgZmlとなるよう生 理食塩水を加え希釈した。
[0118] 8.調製液の投与方法
SN - 38ナノ粒、 SN - 38ナノ粒子-プロタミンおよび SN - 38ナノ粒子 コンドロイ チン硫酸 投与群には、各々調製液を NaClを加えた後、 25分以内に投与した。マウ ス体重 10gあたり 0. 1mlずつを 1日に 1回、 4日目毎に計 4回（q4dx4)静脈内投与し た。
CPT— 11投与群は、 3mgZml調製液を 1日 2回（60mgZkg投与群)、マウス体重 10g当たり 0. 1mlずつ、 4日目毎に計 4回（q4dx4)静脈内投与した。 Control群には 薬剤投与を行わなかった。
[0119] 9.効果判定法
実験終了日に摘出した対照群 (C)と治療群 (T)の平均腫瘍重量から腫瘍増殖抑 制率 (IR)を次式により求め、 IRが 58%に達しない時は「無効」、 IR≥58%の時に「 有効」、 IR≥ 80%の時に「著効」と判定した。
IR= (1 -T/C) xl00 (%)
各群間の腫瘍重量による統計学的有意差は Student ' s t検定（両側）で求めた。 さらに、実験期間中の対照群 (C)と治療群 (T)の平均推定腫瘍体積を経時的に計 測し、同様に tumor volume IRを求めて実験期間中の最大増殖抑制率 (max. IR)を求 めた。さらに、実験終了時の平均推定腫瘍体積が投与開始時のそれよりも小さい時、 縮小効果ありと判定する。
なお、薬剤の宿主への影響は、体重の変化と症状の出現により検討した。
[0120] 腿
ヌードマウス移植ヒト胃癌 H— 23 (中分化型腺癌）の 323代目を用いて SN— 38ナ ノ粒子、 SN— 38ナノ粒子-硫酸プロタミンおよび SN— 38ナノ粒子 コンドロイチン 硫酸の腫瘍増殖抑制効果を CPT— 11の腫瘍増殖抑制効果と対比検討した。
[0121] 1.腫瘍増殖抑制効果
D CPT- l l 60mgZkg投与群
投与回数が増すにつれ、 tumor volume IRは高くなり、 4回目投与の 2日後（d21)に 、実験期間中の最大腫瘍増殖抑制率 (max. IR) 69. 1 %を示し、有効が認められた 。し力し、その後は徐々に tumor volume IRは低下し、実験終了日（d35)の tumor wei ght IRは 22. 4%で無効と判定された。腫瘍重量による t-testでも control群と推計学 的有意差は認められな力つた。
[0122] 2) SN 38ナノ粒子 lOmgZkg投与群
初回投与の 4日後（dl l)に、治療群の中で最大の tumor volume IR 57. 7%を示 した。 2回目投与の 3日後（dl4)には唯一、腫瘍の縮小傾向も認められた (生データ 参照)。その結果、 tumor volume IR 59. 9%を示し、 2回目投与後早くも、治療群の 中で唯一有効が認められた。 3回目投与の 3日後（dl8)には 73. 4%を示し、一段と 高くなつた。 4回目投与の 2日後（d21)には max. IR 74. 7%を示し、腫瘍増殖抑 制効果が目立った。 4回目の投与から 9日後（d28)にはまだ tumor volume IRは 61. 1 %を示し、治療群の中で唯一まだ有効が認められていたが、その後は徐々に低下 し、実験終了日（d35)の tumor weight IRは 45. 9%で無効と判定された。し力し、腫 瘍重量による t-testでは control群と p < 1 %で推計学的有意差があり、 CPT— 11 6 OmgZkg投与群よりも pく 5%の推計学的有意差をもって勝っていた。
[0123] 3) SN— 38ナノ粒子—硫酸プロタミン 3mgZkg投与群
3回投与の 3曰後（dl 8)には tumor volume IR 57. 5%を示し、 CPT— 11 60mg Zkg投与群より僅かに高い腫瘍増殖抑制効果が認められた。
4回目投与の 2日後（d21)には max. IR 62. 1 %を示し、有効が認められた。その 後は徐々に tumor volume IRは低下した。実験終了日（d35)の tumor weight IRは 38 . 9%で無効と判定された力 腫瘍重量による t-testでは control群と ρ < 1 %で推計学 的有意差があった。さらに CPT— 11 60mgZkg投与群より IRは勝っていた。
[0124] 4) SN 38ナノ粒子 コンドロイチン硫酸 lOmgZkg投与群 3回目投与の 3曰後（dl8)に ίま tumor volume IR 65. 30/0で有効を示し、 SN— 38 lOmgZkg投与群に次いで高い腫瘍増殖抑制効果が認められた。しかし、 4回目 投与の 2日後（d21)に max. IR 65. 4%を示した後は、 IRが急速に低下した。実験 終了日（d35)の tumor weight IRは 28. 5%で無効と判定された力 腫瘍重量による t -testでは control群と p< 5%で推計学的有意差があった。
[0125] H
SN— 38ナノ粒子 lOmgZkg投与群は CPT— 11投与群より明らかに高 、腫瘍増 殖抑制効果を示した。また、 CPT— 11投与群は投与休止により腫瘍増殖抑制効果 が目立って低下するのに対し、 SN— 38ナノ粒子 lOmgZkg投与群は、投与休止に より腫瘍増殖抑制効果は低下するものの、その程度は CPT— 11投与群に比べてか なり小さ力つた。 SN— 38ナノ粒子 lOmgZkg投与群では実験期間中に体重減少も なぐ特に重篤な副作用も見られな力つた。
SN— 38ナノ粒子—硫酸プロタミン 3mgZkg投与群、 SN— 38ナノ粒子—コンド ロイチン硫酸 lOmgZkg投与群はいずれも CPT— 11投与群と同様な腫瘍増殖抑 制効果を示した。特に 3回目投与の 3日後（dl8)までと d32〜d35 (実験終了日）に ぉ 、て CPT— 11投与群に優って!/、た（図 17参照）。
[0126] <実施例 3 >
10- Hvdroxy- camDtothecinナノ粒子の調製
SN— 38ナノ粒子の調製と同様の手順で 10-Hydroxy-camptothecinの濃度 0. 5mg Zmlの懸濁液とした。
マグネチックスターラーで良く攪拌しながら、レーザー（430nm励起， 40mjZcm2 , 60分間）を照射した。レーザー照射後、遠心分離し、その上澄み液を取り、吸収ス ベクトル、 HPLC、粒度分布及び SEM測定を行った（図 18A、図 18B及び図 19参 照)。その結果、生成したナノ化粒子の収率は 50%以上で濃度は 0. 25mgZmlで めつに。
[0127] 10-Hvdroxy-camDtothecinナノ粒子の細朐毒性試験
実施例 1の（3— 4)に記載のエリプチシンの細胞毒性試験と類似の方法で 72hrs培 養後の生細胞数を測定した。 50%阻害活性は MCF-7 cellで ΙΟΟηΜであった。対 照として用いたレーザ未照射 10-Hydroxy-camptothecinの DMSO溶液と水懸濁液 はそれぞれ 50%阻害活性が ΙΟΟηΜ, 500nMであった。
この結果より、対照と比較してナノ化試料のより高い細胞内移行性が示された。
[0128] ヌードマウス移植ヒト癌を用いた 10- Hvdroxycamptothecinナノ粒子と塩酸イリノテカン
(CPT— 11)の杭 11重瘍効
碰
名称： 株式会社実験癌化学療法研究所
住所： 大阪府箕面巿白島 3-13-1
[0129] 材料および方法
1.被験物質： 10- Hydroxycamptothecinナノ粒子
対比薬：塩酸イリノテカン (CPT— 11)
[0130] 2.使用ヒト癌株
胃癌 H-23,中分化型腺癌
[0131] 3.実験動物
BALBZcAJcl— nuヌードマウス（雄性、 日本クレア株式会社）
[0132] 4.移植方法
ヌードマウスを頸椎脱臼により屠殺後、皮下で継代している腫瘍を摘出して腫瘍か ら被膜と壊死部を除き、 RPMIメディウムにて洗浄し、 2〜3mm角の出来るだけ均等な 立方状の腫瘍片を作製した。この腫瘍片を生後満 5週齢のマウス背部皮下に trocar を用 ヽ移植した (移植日： DayO)。
[0133] 5.実験方法
ノギスを用いて腫瘍の最大径 (L)と直交する横径 (W)及び厚み (D)を 0. 5mm単 位まで計測し、 V= 1Z2XLXWXDの式で求めた推定腫瘍体積が約 100mm3前後 に達した時 (移植後 7日）、 1群 5匹で、推定腫瘍体積の平均値、標準誤差とも出来る 限り均等となるよう対照群と治療群を設定し、投与を開始した。
実験終了は投与開始日力 4週間後とし、腫瘍径を週 2回、体重を投与時に計測し 、腫瘍増殖の状態と薬剤の投与による影響をモニターするとともに、その他の身体的 変化を観察した。動物は腫瘍移植時、投与時及び計測時にスリーブを通じてクリーン ベンチに移した以外は、実験終了時まで終始小型ビニールアイソレータ内で飼育し た。
[0134] 6.投与量及び投与スケジュール
(1) Control 生理食塩水 0. lmlZマウス体重 10g(i. v. )
d7, dll, dl4 計 3回
(2) CPT— 11 60mg/kg(i. v. ) d7, dll, dl4 計 3回
3) 10- Hydroxycamptothecinナノ 子
5mg/kg(i. v. ) d7, d8, dll, dl2, dl4, dl5 計 6回
(4) 10- Hydroxycamptothecinナノ 子
2. 5mg/kg(i. v. ) d7, d8, dll, dl2, dl4, dl5 計 6回
[0135] 7.調製液の作製方法
10- Hydroxycamptothecinナノ粒子溶液（0.25mgZml)〖こ 1. 8%NaCl液を同量 加え、 0.125mgZml調製液とする。 CPT— 11は 3mgZmlとなるよう生理食塩水を 加える。
[0136] 8.調製液の投与方法
10- Hydroxycamptothecinナノ粒子投与群には、 0.125mgZml調製液を調製後 2 5分以内に投与した。 5mgZkg投与群にはマウス体重 10gあたり 0. 2mlずつを 1日 2回、 2. 5mg/kg投与群【こ ίまマウス体重 10gあたり 0.2mlずつを 1曰【こ 1回、 d7, d 8, dll, dl2, dl4, dl 5の計 6日静脈内投与した。
CPT— 11投与群は、 3mgZml調製液を 1日 2回（60mgZkg投与群）、マウス体 重 10g当たり 0.1mlずつ、 d7, dll, dl4の計 3日静脈内投与した。 Control群には 生理食塩水を CPT— 11と同様に計 3回静脈内投与した。
[0137] 9.効果判定法
実験終了日に摘出した対照群 (C)と治療群 (T)の平均腫瘍重量から腫瘍増殖抑 制率 (IR)を次式により求め、 IRが 58%に達しない時は「無効」、 IR≥58%の時に「 有効」、 IR≥ 80%の時に「著効」と判定した。
IR= (1-T/C)xl00(%)
各群間の腫瘍重量による統計学的有意差は Student ' s t検定 (両側)で求めた。 さらに、実験期間中の対照群 (C)と治療群 (T)の平均推定腫瘍体積を経時的に計 測し、同様に tumor volume IRを求めて実験期間中の最大増殖抑制率 (max. IR)を求 めた。さらに、実験終了時の平均推定腫瘍体積が投与開始時のそれよりも小さい時、 縮小効果ありと判定する。
なお、薬剤の宿主への影響は、体重の変化と症状の出現により検討した。
[0138]
ヌードマウス移植ヒト胃癌 H— 23 (中分化型腺癌）の 317代目を用いて 10- Hydroxy camptothecinナノ粒子の腫瘍増殖抑制効果を CPT— 11の腫瘍増殖抑制効果と対 比検討した。
[0139] 1.腫瘍増殖抑制効果
D CPT- l l 60mgZkg投与群
投与開始後、腫瘍の増殖抑制が目立ち、 3回目投与時 (dl4)に t醒 or volume IR 60. 7%を示し、有効となった。さらに、 3回目投与の 4曰後（dl8)に max. IR 69. 0 %を示した。 Tumor volumeによる t- testでは control群と p< 0. 1%で推計学的有意 差があった。しかし、それ以後は腫瘍の増殖が速くなり、 3日後（d21)には 50. 7%と 無効になった。その後は益々、増殖速度を速め、投与開始から 18日後（d25)の torn or volume IRは、腫瘍の表面が潰瘍化し、増殖が頭打ちになった CPT— 11 30mg Zkg投与群よりも低下した。実験終了日（d35)の tumor volume IRは 14. 1%であつ た。 Tumor weight IRは 14. 1%で無効と判定された。腫瘍重量による t- testでも contr ol群と推計学的有意差がな力つた。
[0140] 2) 10- Hydroxycamptothecinナノ粒子 5mgZkg投与群
投与開始後、腫瘍の縮小が見られ、 3回目投与日（dl l)には tumor volume IRは 6 3. 2%で、この時点で治療群中唯一、有効が認められた。その後は徐々に再増殖を 始めたが、 control群の増殖に比べると顕著に抑制効果が認められ、 Tumor volume I Rは高くなつた。 6回投与終了の 3日後（dl8)には tumor volume IR 85. 4% (max. I R)で著効と認められた。 Tumor volumeによる t- testでは control群と p< 0. 1%で推計 学的有意差が認められた。し力し、その後は再増殖の速度を速めて tumor volume IR は徐々に低下した。それでも 6回投与終了の 10日後（d25)には tumor volume IR 6 2. 3%を示し、治療群で唯一有効が認められた。しかし、それ以後 control群の腫瘍 増殖が頭打ちになったため、 10-Hydroxycamptothecinナノ粒子投与群の腫瘍増殖 速度は目立って速くなり、 tumor volume IRは急激に低下した。実験終了日（d35)の t umor volume IRは 23. 1%であった。 Tumor weight IRは 19. 4%で無効と判定された 。腫瘍重量による t-testでも control群と推計学的有意差は認められな力つた。
[0141] 3) 10- Hydroxycamptothecinナノ粒子 2. 5mgZkg投与群
投与開始後、腫瘍の増殖は緩やかで、著しい増殖抑制効果が見られた。 4回投与 の 2日後（dl4)には tumor volume IRは 68. 0%で有効と認められた。 6回投与の 3日 後（dl8)には max. IR 76. 4%を示した。 Tumor volumeによる t- testでは control群と p< 0. 1%で推計学的有意差が認められた。さらに 3日後（d21)にも 68. 0%で有効 が認められた。終盤は腫瘍の表面が潰瘍ィ匕する動物も増えたためか、腫瘍の増殖も 頭打ちとなり、 5mgZkg投与群よりも tumor volume IRは高くなつた。実験終了日（d3 5)の tumor volume IRは 28. 7%、 tumor weight IRは 25. 5%で、無効と判定された 1S 治療群の中では最も高力つた。しかし、腫瘍重量による t-testでは control群と推 計学的有意差は認められな力 た。
[0142] 2.副作用
各治療群の最大体重減少率 (max. wt. loss)は CPT— 11 60mgZkgが 0. 4%で 軽微、 10- Hydroxycamptothecinナノ粒子 2. 5mgZkg投与群では、実験開始日から の体重の減少は見られなかった。
10- Hydroxycamptothecinナノ粒子 5mgZkg投与群では 6回投与終了日（dl5)の 3 日後（dl8)に max. wt. loss 9. 1%の中等度の体重減少が見られ、 1群 5匹中 1匹（ No.5)では軟便が認められた。しかし、その 3日後（d21)には体重が回復し、以後は 実験終了日まで増加し続けた。他の特に目立った副作用は見られな力つた。 Control 群では、群の平均では実験開始日からの体重減少はな力つたが、終盤は増大した腫 瘍の重量を含んでいるにも拘らず、体重は低下の傾向があった。特に 1群 5匹中の 1 匹 (No.2)の体重減少が著しぐ全実験動物 30匹中、唯一、実験終了日の体重が投 与開始日の体重を下回った。 Control群および CPT— 11 60mgZkg投与群の全 身状態も良好ではなかった。 [0143] 3. 10- Hydroxycamptothecinナノ粒子と CPT— l lの対比
CPT— 11 60mgZkg投与群と 10- Hydroxycamptothecinナノ粒子 5mgZkg投与 群を比較すると、いずれも投与終了後 3あるいは 2日後（dl8)に max. IRを示し、 CPT —11投与群は 69. 0% (有効）、レーザー微粒子化 10—ハイド口ォキシカンプトテシ ンは 85. 4% (著効)であった。推定腫瘍体積による t- testで p< 5%で推計学的有意 差をもって 10- Hydroxycamptothecinナノ粒子が勝っていた。実験終了日（d35)の腫 瘍重量における推計学的有意差はなかったが、 IRは CPT— 11が 8. 9%、 10-Hydro xycamptothecinナノ粒子が 19. 4%で、 10- Hydroxycamptothecinナノ粒子の IRが上 回った。
10- Hydroxycamptothecinナノ粒子 2. 5mgZkg投与群でさえ、 dl8に示した max. I Rは 76. 4%で著効に近ぐ実験終了日（d35)の腫瘍重量による IRは 25. 5%で、 C PT- 11 60mgZkg投与群の IRを上回った。
[0144] H
今回のヌードマウス移植ヒト胃癌 H— 23を用いた抗腫瘍効果の検討では、 10- Hydr ◦xycamptothecinナノ粒子投与群の腫瘍増殖抑制効果力 SCPT— 11投与群のそれを 上回った（図 20参照)。
産業上の利用可能性
[0145] 本発明の水又はアルコール水溶液に難溶性の極粒子状抗癌剤、及びそれと高分 子電解質とのコンプレックスは、注射剤として使用可能であり、バイオアベイラビリティ 一の向上を図り、副作用を低減するものである。
接着因子その他の特定組織細胞表面を認識する高分子電解質で特定組織ターゲ ティング療法への応用も期待される。
抗癌剤を長時間にわたってゆっくりと外部へ放出でき、一度に多量の薬物が体内 に入る場合に引き起こされる悪 ヽ副作用を抑制することも期待される。
また、粒径サイズを 200nm〜50nmに調製することで、 EPR効果（Enhancement Pe rmeability and Retention Effect)を持たせてより癌細胞に選択的に取り込ませ安全か つ効果的な癌治療が期待される。

Claims

請求の範囲
[1] 平均直径 50〜200nmの粒子状の難水溶性医薬。
[2] 構造中に多重結合を 1個以上有する、請求項 1記載の難水溶性医薬。
[3] 医薬が抗癌剤である、請求項 1又は 2記載の難水溶性医薬。
[4] 抗癌剤がカンプトテシン誘導体である、請求項 3記載の難水溶性医薬。
[5] 抗癌剤がエリプチシン誘導体である、請求項 3記載の難水溶性医薬。
[6] 抗癌剤がポドフイロトキシン誘導体である、請求項 3記載の難水溶性医薬。
[7] 請求項 1〜6のいずれか一記載の粒子状の難水溶性医薬と高分子電解質との平 均直径 50〜250nmの粒子状コンプレックス。
[8] 高分子電解質が、プロタミン、ゲラチン A、コラーゲン、アルブミン、カゼイン、キトサ ン、ポリ一（L) リジン、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、へパリン、ヒアル 口-ックアシッド、コンドロイチンサルフェート、ゲラチン B、カラギーナン、デキストラン サルフェート、ポリ一（L)一グルタミックアシッドその他の生体適合性高分子、生分解 性高分子、 DNA、 RNA、酵素若しくは抗体その他の生体高分子、ポリメタタリリック アシッド、ポリジァリールジメチルアンモ -ゥム又はその他の合成高分子又はそれら が適当なリンカ一でクロスリンクされた高分子力 なる群より選ばれた、請求項 7記載 のコンプレックス。
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