JPWO2007132852A1 - 難水溶性医薬 - Google Patents

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Abstract

平均直径５０〜２００ｎｍの粒子状の難水溶性医薬、及びこの粒子状の難水溶性医薬と高分子電解質との平均直径５０〜２５０ｎｍの粒子状コンプレックス。

Description

本発明は、難水溶性の極微粒子状医薬、それと高分子電解質とのコンプレックスに関する。更に詳しくは、本発明は、レーザビームを照射することによって粒子を微粒子化した医薬の極微粒子、および極微粒子−高分子電解質コンプレックスに関する。
本願は、２００６年５月１５日に日本に出願された、特願２００６−１３５６７７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
溶媒に難溶性の医薬、例えば抗癌剤等の一部の医薬品は、難水溶性のため細胞に吸収され難く、バイオアベイラビリテイー(Bioavailability)が低い。そのため、注射剤として用いるために、難水溶性医薬品の溶解度を高めて水に溶けやすくしてバイオアベイラビリテイーを向上させる目的で溶解補助剤を用いることが多いが、この溶解補助剤の毒性が問題であった。
溶解補助剤を用いないで、難水溶性医薬品の細胞取り込み効率を向上させるためには、医薬品が患部の細胞膜を通過し易いサイズまで極微粒子化すればよい。このサイズは、凡そ２００ｎｍ以下とされている。
有機物質について、微粒子化することによって、興味深い特性の向上・変化が期待されることから、有機化合物の微粒子化方法が提案されている。例えば、溶媒中に分散させた有機化合物にレーザ光を照射することによって有機化合物の微粒子を製造する方法が開示されている（例えば特許文献１を参照）。特許文献１に開示される方法は、有機化合物に、吸収帯波長の光を照射することにより、分子構造中の比較的に弱い化学結合部にて光線形吸収により熱応力破壊が生じて、微粒子を生成するものであり、同時に、一部、電子励起状態を経由して光化学反応が生じ、有機化合物の分解が起きるおそれがある。特に、有機化合物が、体内に投与する医薬品の場合に、その分解生成物が生体に悪影響を与えるおそれがあるため、このような事態は極力避けなければならない。
特許文献１に開示される方法を改良するために、被処理液中の有機化合物にその吸光帯より長い波長のレーザ光を被処理液に照射し、有機化合物を微粒子化する、微粒子の製造方法が提案された（例えば特許文献２を参照）。また、貧溶媒に分散させた有機バルク結晶に、超短パルスレーザを照射することにより非線形吸収によりアブレーションを誘起して有機バルク結晶を粉砕することによる、極微粒子の製造方法が提案された（例えば特許文献３を参照）。
これらの方法は、透明容器中に溶媒分散された有機化合物の粗粒子紛に外部から吸光帯より長い波長のレーザ光又は超短パルスレーザを照射して有機化合物を溶媒中で粉砕する方法である。これらの方法は、吸収帯波長の光を線形吸収させる方法に比べれば、比較的に温和な有機化合物の微粒子化が可能になり、有機化合物の分解が起きるおそれも比較的に少ないことから、少量の難溶性有機化合物、特に薬物の極微粒子化には、適した方法であると述べられている。
しかし、レーザ光照射による粉砕原理は、パルス入熱による短時間加熱に起因する熱応力破壊と想定されているが、薬物に変質を起こさずに極微粒子化するためには、薬物のレーザエネルギー吸収特性とレーザ照射時間の設定とが重要なパラメータとなる。バッチ方式は、薬物が容器内溶媒中に分散、攪拌されている状態でレーザビーム照射を行うため、レーザ光照射時間の設定や分散粒子にレーザを均一に照射する等の条件の制御が困難である。例えば、ある粒子は、レーザビーム照射を何回も受けたり、他の粒子は、レーザビーム照射を１回も受けなかったりして、粒度が目標とする均一な範囲に入りかつ変質のないバイオアベイラビリテイーの高い極微粒子薬物を工業レベルで生産するには至っていない。
特開２００１−１１３１５９号公報 特開２００４−２６７９１８号公報 特開２００５−２３８３４２号公報
本発明の目的は、粒度が目標とする均一な範囲に入りかつ薬効に変化のないバイオアベイラビリテイーの高い、難水溶性粒子状抗医薬、およびこのような難水溶性粒子状医薬と高分子電解質とのコンプレックスを提供することである。
本発明者等は、上述した課題を解決すべく鋭意検討したところ、レーザアブレーション式極微粒子製造技術を用い、レーザ光照射条件を微細に制御することにより前記課題を達成できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
かくして本発明によれば、以下の１〜１０の発明が提供される。
１．平均直径５０〜２００ｎｍの粒子状の難水溶性医薬。
２．構造中に多重結合を１個以上有する、前記１記載の難水溶性医薬。
３．医薬が抗癌剤である、前記１又は２記載の難水溶性医薬。
４．抗癌剤がカンプトテシン誘導体である、前記３記載の難水溶性医薬。
５．抗癌剤がエリプチシン誘導体である、前記３記載の難水溶性医薬。
６．抗癌剤がポドフィロトキシン誘導体である、前記３記載の難水溶性医薬。
７．前記１〜６のいずれか一記載の粒子状の難水溶性医薬と高分子電解質との平均直径５０〜２５０ｎｍの粒子状コンプレックス。
８．高分子電解質が、プロタミン、ゲラチンＡ、コラーゲン、アルブミン、カゼイン、キトサン、ポリ−（Ｌ）−リジン、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ヘパリン、ヒアルロニックアシッド、コンドロイチンサルフェート、ゲラチンＢ、カラギーナン、デキストランサルフェート、ポリ−（Ｌ）−グルタミックアシッドその他の生体適合性高分子、生分解性高分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素若しくは抗体その他の生体高分子、ポリメタクリリックアシッド、ポリジアリールジメチルアンモニウム又はその他の合成高分子又はそれらが適当なリンカーでクロスリンクされた高分子からなる群より選ばれた、前記７記載のコンプレックス。
本発明の極微粒子状医薬、それと高分子電解質とのコンプレックスは、安定な汚染フリーの優れたコロイド分散液として調製可能であり、各種注射剤に対応できる。そのため、本発明の極微粒子状医薬、それと高分子電解質とのコンプレックスは、直接血管内に注入させることができる。経口投与の場合には、難水溶性のため吸収率が低いことから体内に少量しか移動できなかったり、胃液や酵素等によって薬物が変質し、効果が消失してしまうのに比べて、本発明の薬物は、血管内に注入され、非常に速いスピードで輸送が行われ、投与部位から目的部位への薬物の到達が非常に速い。
本発明の極粒子状医薬、特に抗癌剤、それと高分子電解質とのコンプレックスは、血管内皮細胞の組織間隙が比較的に狭い正常の血管内皮細胞を通過し難いが、血管内皮細胞の組織間隙が比較的に広く、粗い癌細胞から伸びる血管内皮細胞を容易に通過して、癌細胞に吸収される。このように、本発明の極微粒子状抗医薬、それと高分子電解質とのコンプレックスは、目的部位への輸送の間に正常の血管内皮細胞を通過し難いため、正常細胞に及ぼす悪影響が少なく、また、薬物の投与量も少量ですむため、抗癌剤の強い副作用も少なくてすむ。
また、本発明の極微粒子状医薬、特に抗癌剤、それと高分子電解質とのコンプレックスは、癌細胞に吸収される確率が従来の薬物に比べて高く、バイオアベイラビリテイーの向上及び薬物の吸収等の個人差の低減による影響が少ない。
図１は、本発明の粒子状の難水溶性薬物及びコンプレックスを調製するために使用したバッチ式微粒子化装置の全体を示す図である。 図２は、本発明の粒子状の難水溶性薬物を調製するために使用した連続式微粒子化装置の全体を示す図である。 図３は、光源１０から発するレーザー光のパルス幅と強度とを示すグラフである。 図４は、マイクロ流路導入部５０とマイクロ流路６０との概略を示す拡大斜視図である。 図５Ａは、マイクロ流路導入部５０とマイクロ流路６０との断面を示す断面図である。 図５Ｂは、マイクロ流路６０を流れる有機物の速度分布を示す断面図である。 図５Ｃは、マイクロ流路導入部５０とマイクロ流路６０との間に遷移部６４を設けたときの断面を示す断面図である。 図６は、シングルマイクロ流路を用いたコーティング部の１つの実施形態を示す図である。 図７は、マルチマイクロフローチャンネルを用いたコーティング部の１つの実施形態を示す図である。 図８は、微粒子懸濁液及び高分子電解質液の流れに沿って、本発明の微粒子のコーティング装置及びコーティング方法の１つの実施形態の全体を示した線図である。 図９は、レーザ光を照射する前及び照射した後のエリプチシンのエタノール溶液の吸収スペクトルの比較を示す図である。 図１０は、レーザ光を照射した後のエリプチシンのエタノール溶液の液体クロマトグラムを示す図である。 図１１は、エリプチシンを微粒子化する前のＳＥＭの画像を示す図である。 図１２は、エリプチシンを微粒子化した後のＳＥＭの画像を示す図である。 図１３は、エリプチシンを微粒子化した後の粒径分布分ヒストグラムを示す図である。 図１４Ａは、レーザー未照射のＳＮ−３８のクロマトグラム（展開溶媒：エタノール）及びＨＰＬＣ分析結果である。 図１４Ｂは、レーザー照射後のＳＮ−３８懸濁液の上澄み液のクロマトグラム（展開溶媒：エタノール）及びＨＰＬＣ分析結果である。 図１５は、ＳＮ−３８のレーザー照射後及び遠心分離（２，０００ｒｐｍ，１０分）後のＳＥＭ像、並びに粒径分布ヒストグラム（サンプル数：２００，平均粒径：４６ｎｍ，ＣＶ値：２２％）である。 図１６は、高分子電解質の添加に伴うＳＮ−３８ナノ粒子のゼータ電位変化を示すグラフである。 図１７は、ヌードマウス移植ヒト癌を用いたＳＮ−３８ナノ粒子、ＳＮ−３８ナノ粒子−硫酸プロタミン、ＳＮ−３８ナノ粒子−コンドロイチン硫酸と塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）の抗腫瘍効果を示すグラフである。 図１８Ａは、レーザー未照射の10-Hydroxy-camptothecinのクロマトグラム（展開溶媒：エタノール）及びＨＰＬＣ分析結果である。 図１８Ｂは、レーザー照射後の10-Hydroxy-camptothecin懸濁液の上澄み液のクロマトグラム（展開溶媒：エタノール）及びＨＰＬＣ分析結果である。 図１９は、10-Hydroxy-camptothecinのレーザー照射後及び遠心分離（２，０００ｒｐｍ，１０分）後のＳＥＭ像、並びに粒径分布ヒストグラム（サンプル数：１５０，平均粒径：６８ｎｍ，ＣＶ値：２５％）である。 図２０は、ヌードマウス移植ヒト癌を用いた10-Hydroxycamptothecinナノ粒子と塩酸イリノテカン(ＣＰＴ−１１)の抗腫瘍効果を示すグラフである。
符号の説明
１ 容器
２ 懸濁液
３ 攪拌機
４ レーザ光源
５ レーザ光
１０ 光源
４０ ポンプ（流動手段）
５０、１５０ マイクロ流路導入部
６０、１６０、２６０、４６０、５６０ マイクロ流路
６４ 遷移部
１００ 微粒子化装置
１２０ 高分子皮膜コーティング部
１２２ａ 微粒子懸濁液用マイクロ流路
１２２ｂ 高分子電解質液用マイクロ流路
１２２ｃ 合流マイクロ流路
１２４ 高分子電解質液タンク
１４０ コンプレックス回収槽
本発明では、医薬にレーザビームを照射することによって粒子を微粒子化する。本発明において微粒子化するのに用いる医薬は、合成後の粗製粉末等任意のサイズ、形状の粉末固体でよいが、微粒子化するのに容易であり、微粒子化の効率が上がりかつ微粒子化したときの医薬のサイズを均一に調整し易いことから、あらかじめ平均直径をできるだけ微細なかつ狭い範囲、例えば１〜１００μｍの範囲に粉砕しておくのがよい。このような粗砕方法は、公知の方法を使用してよい。
本発明において微粒子化する医薬は、水に難水溶性の粒子状薬物である。本発明において言う難水溶性とは、その溶解性が日本薬局方に定義する、「水に対する溶解度が極めて溶けにくい」、「ほとんど溶けない」の範囲をいう。
また、本発明において微粒子化する粒子状薬物は、その構造中に多重結合を１個以上有するのが好ましい。これは、レーザ光が照射される場合に、多重結合部分がレーザ光を吸収し易く、光吸収部で急激に局所的な温度上昇が起こる。この光吸収部の温度上昇は、レーザ光照射後瞬間的に起こり、光吸収部と光非吸収部との間で急激な温度差が発生し破砕が起こるからである。本発明において言う多重結合とは、共役又は非共役の二重結合もしくは三重結合をいう。
更に、本発明において微粒子化する医薬とは、薬事法に定義する医薬品、人臨床試験段階でフェーズアウトした医薬候補化合物又は人臨床試験中で開発段階にある医薬候補化合物をいう。難水溶性薬物の例として、抗癌剤、抗真菌剤、ビタミン剤、鎮痛剤、抗炎症剤等を挙げることができる。
本発明の粒子状の難水溶性医薬は、抗癌剤であるのが特に好ましい。と言うのは、癌細胞から伸びる血管内皮細胞に存在する組織間隙は、正常の血管内皮細胞に存在する組織間隙に比べて、粗く５０ｎｍ以上であると考えられる。よって、平均直径が５０ｎｍ以上でありかつ２００ｎｍ以下の難溶性粒子状抗癌剤であれば、各種注射剤に対応できるとともに、正常の血管内皮細胞を通過し難いが、癌細胞から伸びる血管内皮細胞を容易に通過できるからである。
本発明において言う抗癌剤とは、薬事法に定義する医薬品であって抗癌活性を有するもの、人臨床試験段階でフェーズアウトした抗癌活性を有する医薬候補化合物又は人臨床試験中で開発段階にある抗癌活性を有する医薬候補化合物をいう。
本発明において用いる抗癌剤の例として、カンプトテシン及びその誘導体、エリプチシン及びその誘導体、ポドフィロトキシン及びその誘導体を挙げることができる。これらの一般的な構造式を下記に示す。
下記の構造式で表される構造を有するカンプトテシン、及びその誘導体：
下記の構造式で表される構造を有するエリプチシン、及びその誘導体：
下記の構造式で表される構造を有するポドフィロトキシン、及びその誘導体：
カンプトテシン誘導体の具体例は、４（Ｓ）−エチル−４−ヒドロキシー１Ｈ−ピラノ［３’、４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリンー３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン（カンプトテシン）、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン５（Ｒ）−エチル−９，１０−ジフルオロ−１，４，５，１３−テトラヒドロ−５−ヒドロキシー３Ｈ，１５Ｈ−オキセピノ［３’、４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１５−ジオン（ＢＮ−８０９１５）［Anti-cancer Drugs (2001), 12(1), 9-19］、（９Ｓ）−９−エチル−９−ヒドロキシ−１−ペンチル−１Ｈ，１２Ｈ−ピラノ［３”，４”：６’，７’］インドリジノ［１’，２’：６，５］ピリド［４，３，２−ｄｅ］キナゾリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオン
［Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principle and Practice, 第2版, Lippincott-Ravenmeans, p.463-484、(b)Biochim. Biophys. Acta (1998), 1400(1-3), 107-119］等であり、これらに限定しない。
エリプチシン誘導体の具体例は、エリプチシン、９−ヒドロキシーエリプチシン、Ｔ−２１５（TANABE SEIYAKU Co. Ltd．）等であり、これらに限定しない。
抗癌活性を有するポドフィロトキシン誘導体の具体例は、ポドフィロトキシン、エトポシド、テニポシド等であり、これらに限定しない。
粒子状薬物を分散させるのに用いる水、アルコール溶液は、微粒子化する粒子状薬物が難溶性であり、人体に悪影響を与えずかつ照射するレーザ光を吸収しないものである。本発明において用いるアルコールの具体例として、エチルアルコール、グリコール、グリセロール等を挙げることができる。アルコール溶液は、アルコールが５質量％以下の水溶液が一般的である。
本発明の粒子状の難水溶性医薬は、平均直径５０〜２００ｎｍを有する。粒子の平均直径は、個々の粒子の直径をスケール付き顕微鏡で測定し、全体の個数で割って求めた値である。
難水溶性の粒子状医薬は、水又はアルコール水溶液に粒子状抗癌剤を懸濁させ、懸濁させた医薬にレーザ光を照射して極微粒子化することによって製造する。水又はアルコール水溶液を、図１に示す容器１に入れ、これに粒子状医薬を混入して懸濁液２を生成する。懸濁液２の濃度は、混入する粒子状医薬の種類やサイズによって、異なるが、１〜１０ｍｇ／ｍｌが普通である。また、容器１は、レーザ光の照射を受ける面が平面であれば、任意の形状でよいが、略直方体が好ましく、処理する量に応じて大きさを決めてよい。容器１の材質は、レーザ光を透過するものであれば特に透明である必要は無く、かつレーザ光の照射に耐えるものであれば任意のものでよく、石英、ガラスが一般的である。
本発明の水又はアルコール水溶液に難水溶性の平均直径５０〜２００ｎｍの粒子状医薬は、その表面エネルギーによって再凝縮しやすいことから、極微粒子にそれが有する電荷と反対の電荷を有する高分子電解質を静電的相互作用、疎水的相互作用によって結合させて高分子電解質とのコンプレックスを形成させることによって得られる安定な汚染フリーの優れたコロイド分散液として調製可能である。
本発明において、コンプレックスとは、極微粒子に高分子電解質が一層被覆したものを言い、平均直径５０〜２５０ｎｍの粒子状であるのが好ましい。
コンプレックスの調製は、コア物質となる極微粒子によって決まり、コア物質に応じて反応時間、懸濁液中の濃度、懸濁液のｐＨ等の条件をその都度細かく設定することによって決まり、一義的に規定することはできない。
このようにして得られた高分子電解質とのコンプレックスは、各種注射剤に対応でき、直接血管内に注入させることができる。経口投与の場合には、難水溶性のため吸収率が低いことから体内に少量しか移動できなかったり、胃液や酵素等によって薬物が変質し、効果が消失してしまうのに比べて、本発明の薬物は、血管内に注入され、非常に速いスピードで輸送が行われ、投与部位から目的部位への薬物の到達は非常に速い。
レーザ光の照射によって微粒子化された極微粒子は、その表面エネルギーによって再凝縮しやすいことから、極微粒子の濃度が高いと、再凝縮しやすいため、懸濁液２に混入する薬物の濃度は、高くできない。そのため、レーザ光を照射して微粒子化する前に、微粒子化された極微粒子にそれが有する電荷と反対の電荷を有する高分子電解質を懸濁液２に、あらかじめ加えておくのが好ましい。これにより、微粒子化された極微粒子は、高分子電解質とコンプレックスを形成する。コンプレックスは、極微粒子のような高い表面エネルギーを持たないため、互いに再凝縮することなく、水又は希薄アルコール中に安定に懸濁される。すなわち、高分子電解質を懸濁液２に、あらかじめ加えておくことにより、混入する薬物の濃度を高くして、処理量の増大を図ることができる。このような目的で、懸濁液２に加える高分子電解質は、一種以上を用いてよい。加える高分子電解質の濃度は、１〜１０％が普通である。
本発明において用いる高分子電解質とは、一般にポリマー鎖の成分又は置換基であってもよいイオン解離性基を有するポリマーと理解される。通常、高分子電解質中のこれらイオン解離性基の数は、解離された形のポリマーが水溶性であるような大きさである。この点で、高分子電解質には、イオン基の濃度が水溶性には十分でないが、自己集合を開始するために十分な電荷を有するイオノマーも含まれると理解される。解離性基の種類に応じて、高分子電解質は、ポリ酸及びポリ塩基に細分される。ポリ酸からは、解離の際にプロトンの脱離化によりポリアニオンが生じ、これは無機ポリマーであっても有機ポリマーであってもよい。ポリ酸の例は、ポリリン酸、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルホスホン酸及びポリアクリル酸であり、これらの塩も含まれる。
ポリ塩基は、プロトンを例えば酸との反応により造塩下に取り込むことのできる基を含有する。連鎖位ないしは側鎖位の解離性基を有するポリ塩基の例は、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン及びポリビニルピリジンである。ポリ塩基は、プロトンを取り込むことによりポリカチオンを形成する。
本発明において用いるのに適した高分子電解質の例として、生体適合性高分子、生分解性高分子、生体高分子、合成高分子を挙げることができる。生体適合性高分子とは、毒性や損傷を生じたり拒否反応を起こすことなく生体組織・器官系と適合する高分子を言う。生分解性高分子とは、生体内で、あるいは微生物の作用により分解される高分子の総称であり、加水分解により、水、二酸化炭素、メタンなどに分解される。生体高分子とは、生体内で合成される高分子化合物の総称である。
生体適合性高分子の具体例は、プロタミン、ゲラチンＡ、コラーゲン、アルブミン、カゼイン、キトサン、ポリ−（Ｌ）−リジン、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ヘパリン、ヒアルロニックアシッド、コンドロイチンサルフェート、ゲラチンＢ、カラギーナン、デキストランサルフェート若しくはポリ−（Ｌ）−グルタミックアシッドである。生分解性高分子の具体例は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素若しくは抗体である。合成高分子の具体例は、ポリメタクリリックアシッド、ポリジアリールジメチルアンモニウム又はそれらが適当なリンカーでクロスリンクされた高分子である。高分子電解質は、これらに限定するものではない。
上述した高分子電解質の電荷は、ｐＨを変えることで正に帯電したり、負に帯電したりするので、条件によって、使用する高分子電解質が変わる。
上記のようにして形成した懸濁液２を攪拌機３、好ましくはマグネチックスターラーを使用して攪拌して、薬物及び高分子電解質を均一に分散させる。
水又は希薄アルコール中に分散させた薬物に、レーザ光源４から吸収波長のレーザ光５を照射する。レーザ光源４は、実質的に一定の強度のレーザ光を連続的に発するものでも、間歇的にレーザ光を発するもの、例えばパルスレーザ光を発するものでもよい。
レーザ光源４から発するレーザ光は、微粒子化する薬物の吸収波長に合わせて選択すればよい。例えば、紫外レーザ光や、可視レーザ光や、近赤外レーザ光や赤外レーザ光がある。紫外光レーザ光を用いる場合には、エキシマーレーザ（１９３ｎｍ、２４８ｎｍ、３０８ｎｍ、３５１ｎｍ）や窒素レーザ（３３７ｎｍ）、ＹＡＧレーザの３倍波及び４倍波（３５５ｎｍ、２６６ｎｍ）等がある。また、可視光レーザ光を用いる場合には、ＹＡＧレーザの２倍波（５３２ｎｍ）、Ａｒイオンレーザ（４８８ｎｍ又は５１４ｎｍ）、その他色素レーザ等がある。さらに、近赤外レーザ光を用いる場合には、種々の半導体レーザ、チタンサファイヤレーザ、ＹＡＧレーザ、ガラスレーザ等がある。さらに、これらのレーザ光と光パラメトリック発振器を用いて、紫外から赤外領域の任意の波長の光を発振させて用いてもよい。
レーザ光源４から発せられるレーザ光は、パルスレーザ光であるものが好ましい。図２は、光源４から発せられるレーザ光のパルス幅と強度とを示すグラフである。図２に示したグラフは、横軸は、時間を示し、縦軸は、光源４から発せられるレーザ光の励起光強度を示す。図２に示すように、光源４から発せられるレーザ光は、パルス状のレーザ光である。すなわち、光源４は、レーザ光が発せられる点灯状態と、レーザ光が発せられない消灯状態とを交互に繰り返すもので、間歇的にレーザ光を発する。特に、レーザ光の強度がパルス状に変化するものが好ましい。以下では、１つのパルスのレーザ光をパルス光と称する。パルスレーザ光を用いたときには、１つのパルス光によって１回の照射が行われる。
光源４から発せられるレーザ光の励起光強度Ｐは、１〜１０００ｍＪ／ｃｍ２が好ましく、３０〜３００ｍＪ／ｃｍ２がより好ましい。また、パルス光とパルス光との間のパルス周期Ｔは、０．１〜１０００Ｈｚが好ましい。ここで、パルス周期とは、ある一のパルス光の立ち上がりの時点から、一のパルス光と隣り合うパルス光の立ち上がりの時点までの時間、又はパルス光の立ち下がりの時点から、隣り合うパルス光の立ち下がりの時点までの時間をいう。さらに、パルス光の各々のパルス幅ｓが、１０−１５〜１０−６秒であるものが好ましい。なお、パルス幅とは、ある一のパルス光の立ち上がりの時点から、立ち下がりの時点までの時間をいう。
パルスレーザ光を用いたときには、１つのパルス光によって薬物への１回の照射が行われる。本明細書では、ある対象となる薬物に対してレーザ光を照射することができる時間を照射時間ｔＬとする。照射時間ｔＬを長くした場合には、図２に示すように、パルスレーザ光の点灯状態と消灯状態との双方が含まれ得る。消灯状態では、レーザ光は発せられていないが、点灯状態となったときには、レーザ光が発せられて、ある対象となる有機物へレーザ光が照射される。このように、ある時間内に消灯状態が含まれていても、ある対象となる有機物に対してレーザ光を照射できる点灯状態が含まれていれば、その時間は、照射時間ｔＬとなる。
より具体的には、ある対象となる薬物が流動しており、レーザ光の照射領域に入り、その後、レーザ光の照射領域から出るようにした場合に、その薬物がレーザ光の照射領域に存在している時間が長いときには、その薬物にパルス光が複数回照射されることになる。このように、薬物を流動させる場合には、上述した照射時間ｔＬは、ある対象となる薬物が、レーザ光の照射領域に存在している時間とすることができる。上述したように、薬物にレーザ光を照射することで、薬物を微粒子化することができる。この微粒子化したときの大きさが所望するものとなるように、パルス光を薬物に照射する回数を定めることができる。パルス光を照射する回数は、上述したパルス周期Ｔや、薬物の流動速度等を調節することによって変更することができる。このようにすることで、レーザ光の照射領域では、少なくとも１回パルス光がその薬物に照射されることになる。なお、レーザ光の照射領域とは、レーザ光が点灯状態であるときに、レーザ光が照射される範囲をいう。
また、レーザ光の照射時間は、ナノ秒程度の短時間のパルス光を複数回照射することが好ましい。また、上述したパルス幅ｓの長さを変更することによって、薬物を微粒子化したときの粒径を制御することもできる。
本実施態様のように、バッチ式で撹拌槽を用いる場合には、撹拌している薬物は、何度もレーザ光の照射を受ける。そのため、薬物が何度もレーザ光の照射を受けることにより、微粒子化され過ぎて平均直径が５０ｎｍよりも小さい粒子が形成されたり、薬物が変質したりする恐れがあるため、レーザ光の総照射時間は重要な要因である。
レーザ光の総照射時間は、撹拌速度、薬物のサイズ、レーザ光源、パルス幅、光強度等の要因によって変わってくるが、数秒〜数分が一般的である。
レーザ光の照射を停止した後に、あらかじめ電解質を加えていない場合には、極微粒子間凝集を防止する目的で、直ちに電解質を加えてコンプレックスを形成して、極微粒子を水又は希薄アルコール中に安定に懸濁させる必要がある。
このようにして得られたコンプレックスを含有するコロイド溶液は、適宜溶媒で希釈するか又は濃縮することにより、目標とする濃度の注射剤として使用することができる。
また、コンプレックスを固体として得ることを所望する場合には、コロイド溶液をフィルターを通して固体を分離し、よく洗浄し、乾燥し或は水又は希薄アルコール中を蒸発させて固体を分離し、よく洗浄し、乾燥してもよい。後者の場合には、溶媒としてアルコール、液体窒素又は液体ヘリウムを用いるのが好ましい。
以上、本発明の薬物を、バッチ式で調製する場合について説明したが、連続して調製する場合について以下に説明することにする。
本発明の薬物を連続して調製する場合に使用する薬物の微粒子化装置１００を図３に示す。
図３に示すように、供給部２０は、水又は希薄アルコール中に薬物を分散させた薬物含有懸濁液を収容するための槽からなる。
供給部２０は、所定の容積を有する。容積は、１回の処理をする所望の大きさにすればよい。また、供給部２０は、注入された薬物含有懸濁液の濃度が変化しないように、密閉できるものが好ましい。
供給部２０の下部には、配管３０が接続されて、供給部２０が、配管３０と連通するようにされている。供給部２０に注入された薬物含有懸濁液を配管３０に排出することができる。
図３に示すように、配管３０には、ポンプ４０が設けられている。ポンプ４０は、後述するマイクロ流路６０へ薬物含有懸濁液を供給するためのものである。ここで、マイクロ流路とは、精密加工により形成されたミクロンオーダーの流路幅を有する流路である。ポンプ４０は、マイクロ流路６０を流れる薬物含有懸濁液の流速が所望する速度になるように制御できる。特に、マイクロ流路６０で薬物含有懸濁液を連続的に流す場合には、マイクロ流路６０における流速が一定になるように制御できるものが好ましい。また、マイクロ流路６０で薬物含有懸濁液を間歇的に流す場合には、所望のタイミングで、マイクロ流路６０において、薬物含有懸濁液を停止させたり流動させたり制御できるものが好ましい。マイクロ流路６０において、薬物含有懸濁液を停止させた場合には、光源１０から発せられたレーザ光を的確に薬物に照射することができる。
図３に示すように、配管３０には、マイクロ流路導入部５０が接続されて、配管３０が、マイクロ流路導入部５０と連通するようにされている。ポンプ４０を駆動することで、供給部２０に注入された薬物含有懸濁液を、配管３０を介して、マイクロ流路導入部５０に供給することができる。
マイクロ流路導入部５０は、略直方体の形状を有する。マイクロ流路導入部５０は、供給部２０から供給された薬物含有懸濁液を、一時的に貯留することによって、後述するマイクロ流路６０を流れる薬物含有懸濁液の流速を均一化するためのものである。このマイクロ流路導入部５０の容積は、処理する薬物含有懸濁液や、ポンプ４０によって生成される流速等に応じて適宜定めればよい。
なお、上述した例では、マイクロ流路導入部５０の形状を、略直方体としたが、後述するマイクロ流路６０を流れる薬物含有懸濁液の流速を均一に近づけることができるものであればよく、略円筒形状等の曲面で形成されたものでもよい。マイクロ流路導入部５０の形状は、マイクロ流路６０を流れる薬物含有懸濁液の流速や薬物含有懸濁液の種類や大きさによって適宜定めればよい。
図４に示すように、マイクロ流路導入部５０には、マイクロ流路６０が接続されて、マイクロ流路導入部５０が、マイクロ流路６０と連通するようにされている。図４に示すように、マイクロ流路導入部５０は、排出面５２を有する。この排出面５２には、開口５４が形成されている。この開口５４にマイクロ流路６０が接続されている。このようにすることで、開口５４を介して、マイクロ流路導入部５０からマイクロ流路６０へ薬物含有懸濁液を供給することができる。
光源１０から発せられたレーザ光を、マイクロ流路６０を流れる薬物含有懸濁液に照射することによって、薬物を微粒子化することができる。
マイクロ流路６０は、長尺な直方体の形状を有し、マイクロ流路６０の長手方向に対して垂直な面に沿った断面は略正方形である。この正方形の一辺の長さＭＬ（図４参照）を、薬物の最大直径の１．１倍〜２００倍とするのが好ましく、３倍〜６０倍とするのがより好ましい。このようにすることで、マイクロ流路６０における薬物の流れを円滑にすることができ、薬物によって、マイクロ流路６０が閉塞されることを防止して、薬物へのレーザ光の照射を的確に行うことができる。
なお、マイクロ流路６０の形状は、直方体には限られず、光源１０から発せられたレーザ光が照射される箇所（後述する照射領域ＬＲに位置する箇所）が平坦であればよい。
また、上述した例では、マイクロ流路６０の長手方向に対して垂直な面に沿った断面の形状を略正方形としたが、レーザ光を薬物に的確に照射することができればよく、断面の形状は矩形等の形状にしてもよい。
マイクロ流路６０は、光源１０から発せられたレーザ光を透過させることができるような材料、好ましくは透明な材料、例えば石英や、ガラスによって構成されている。
図４に示すように、光源１０から発せられたレーザ光ＬＡは、マイクロ流路６０の上面６２の一部に照射される。レーザ光ＬＡの照射領域ＬＲ（図４で斜線を付した領域）は、略円形であり、その直径ｄＬが、上面６２の短手方向の長さＭＬよりも長くなるようにすることで、レーザ光をマイクロ流路６０に十分に照射することができる。
上述したポンプ４０を駆動することによって、薬物含有懸濁液が、マイクロ流路導入部５０からマイクロ流路６０へ流入し、有機物はマイクロ流路６０内を流動する。ある所定の薬物に着目した場合に、マイクロ流路６０内の薬物含有懸濁液の流れに従って、レーザ光ＬＡの照射領域ＬＲに至り、しばらくの間、照射領域ＬＲに存在した後、照射領域ＬＲから出る。
パルスレーザ光を用いたときに、薬物が照射領域ＬＲに存在している時間が長い場合に、その薬物には、パルス光が複数回照射されることになる。薬物をマイクロ流路６０内で流動させる場合には、上述したように、照射時間ｔＬは、ある対象となる有機物が、照射領域ＬＲに存在している時間とすることができる。
上述したように、薬物にレーザ光を照射することで、薬物を微粒子化することができる。この微粒子化したときの大きさが所望するものとなるように、パルス光を薬物に照射する回数を定めることができる。パルス光を照射する回数は、上述したパルス周期Ｔや、薬物の流動速度等を調節することによって変更することができる。このようにすることで、レーザ光の照射領域ＬＲでは、少なくとも１回パルス光がその薬物に照射されることになる。
マイクロ流路導入部５０の断面の大きさＳＡ（図４参照）が、マイクロ流路６０の長手方向に対して垂直な面に沿った断面の大きさＳＢ（図４参照）の２倍以上とするのが好ましい。一般的に、マイクロ流路６０を流れる有機物の流速ＶＬは、マイクロ流路６０の壁面近傍が最も遅く、マイクロ流路６０の中心近傍が最も速くなるような速度の分布（以下、速度分布と称する。）が生ずる傾向がある（図５Ｂ参照）。このような速度分布が生じた場合には、マイクロ流路６０の壁面近傍を流れる薬物は、流速が遅いので、照射領域ＬＲに存在している時間が長くなり、マイクロ流路６０の中心近傍を流れる薬物は、流速が速いので、照射領域ＬＲに存在している時間が短くなる。このため、パルスレーザ光を照射したときには、マイクロ流路６０の壁面近傍を流れる有機物にパルス光が照射される回数は、多くなり、マイクロ流路６０の中心近傍を流れる有機物にパルス光が照射される回数は、少なくなる。また、連続的なレーザ光を照射する場合には、マイクロ流路６０の壁面近傍を流れる有機物にレーザ光が照射される時間は、長くなり、マイクロ流路６０の中心近傍を流れる有機物にレーザ光が照射される時間は、短くなる。このため、薬物が流れる場所によって、微粒子化の程度が異なり、微粒子化された後の薬物の大きさに不均一が生ずる可能性がある。このため、上述したように、マイクロ流路導入部５０の断面の大きさＳＡを、マイクロ流路６０の断面の大きさＳＢの２倍以上とすることによって、マイクロ流路６０へ流入させた薬物の流速分布を小さくして、微粒子化された後の薬物の大きさに不均一化が生ずることを防止することができる。
上述したように、ポンプ４０を駆動することによって、薬物含有懸濁液が、マイクロ流路導入部５０からマイクロ流路６０へ流入する。このマイクロ流路６０における薬物の流速ＶＬ（図５Ａ参照）は、ＶＬ＜Ｋ×ｄＬ／ｔＬとするのが好ましい。なお、ここで、流速ＶＬは、上述した速度分布がない状態、又は速度分布を十分に無視できる状態での薬物の流速である。この流速ＶＬを、この範囲にすることで、レーザ光を薬物に過不足なく照射することができ、所望する大きさに微粒子化することができる。例えば、パルス光を薬物に照射する場合には、適切な回数だけ、パルス光を薬物に照射することができる。
ここで、ｄＬは、レーザ光が照射されるときのレーザ光の直径であり（図４参照）、ｔＬは、上述した照射時間であり（図２参照）、Ｋは、１〜０．１の範囲の定数であり、薬物の種類に応じて定められる定数である。なお、Ｋは、上述した範囲に限定されるものではなく、薬物が、照射領域ＬＲを通過するときに、薬物に照射されるパルス光の回数が、薬物を微粒子化するのに十分なものとなるように、Ｋの値を定めるのが好ましい。このようにして、微粒子化された薬物の大きさは、５０〜２００ナノメートルである。
図５Ａは、マイクロ流路導入部５０とマイクロ流路６０との断面を示す断面図である。マイクロ流路６０において、レーザ光ＬＡを照射する箇所は、マイクロ流路導入部５０の排出面５２から、レーザ光ＬＡの照射領域ＬＲの中心ＬＣまでの距離が、１０×Ｄｍ以下となるようにするのが好ましい（図５Ａ参照）。ここで、Ｄｍは、マイクロ流路６０における水力直径であり、Ｄｍ＝４×（マイクロ流路６０の断面の大きさＳＢ）／（マイクロ流路６０の断面の全周）である。例えば、マイクロ流路６０の断面が、長さＭＬの正方形であるときには、Ｄｍ＝４×ＭＬ２／４ＭＬ＝ＭＬとなる。上述したマイクロ流路６０の薬物の流速分布は、マイクロ流路導入部５０の排出面５２から離れるに従って大きくなる傾向があり、レーザ光ＬＡを照射する箇所をこのような範囲にすることで、マイクロ流路６０内を流れる薬物の流速分布が大きくなる前に、レーザ光ＬＡを薬物に照射することができ、的確に薬物を微粒子化することができ、微粒子化された後の薬物の大きさを均一に近づけることができる。
上述した例では、マイクロ流路導入部５０に形成された開口５４に、直ちにマイクロ流路６０が接続されている場合を示したが、図５Ｃに示すように、マイクロ流路導入部５０とマイクロ流路６０との間に、遷移部６４を形成してもよい。遷移部６４は、マイクロ流路導入部５０に形成された開口５４から離れるに従って、断面が徐々に小さくなるように形成されている。このようにすることで、遷移部６４は助走区間として機能し、マイクロ流路６０に流れ込む薬物の速度分布をより小さくすることができる。この遷移部６４の形状は、薬物含有懸濁液の流速や粘性等に応じて適宜定めればよい。
図３に示すように、マイクロ流路６０には、回収部７０が接続されて、マイクロ流路６０が、回収部７０と連通するようにされている。回収部７０は、マイクロ流路６０でレーザ光が照射された薬物を含む懸濁液を収容できる槽からなる。
回収部７０に、再凝集防止装置７２を設けるのが好ましい。この再凝集防止装置７２は、超音波振動子を含み、回収部７０に収容された懸濁液に超音波を発する。この超音波が、懸濁液に伝播されることによって、微粒子化された薬物が、再凝集することを防止することができる。再凝集防止装置７２から発する超音波の強度や波長は、微粒子化された薬物の大きさや種類等に応じて適宜定めればよい。また、上述した例では、再凝集防止装置７２として超音波を発するものを示したが、微粒子化された薬物の再凝集を防止することができるものであれば他のものでもよい。
回収部７０の槽内には、磁気駆動回転羽根車７４を設けるようにしてもよい。この磁気駆動回転羽根車７４は、回収部７０の外側から磁場を印加することで回転させることができるもので、磁気駆動回転羽根車７４を回転させることによって、回収部７０に収容された懸濁液を攪拌することができ、微粒子化された薬物の再凝集を防止することができる。この磁気駆動回転羽根車７４の大きさや回転数は、微粒子化された薬物の大きさや種類等に応じて適宜定めればよい。
次に、上述した通りにして得られた薬物の極微粒子が有する電荷を測定する。電荷は、ゼータ電位計で測定する。コア物質に応じて正であったり、負であったりする。極微粒子に、それが有する電荷と反対の電荷を有する一種以上の高分子電解質を静電的相互作用、疎水的相互作用によってコンプレックスを調製して、極微粒子が再凝集するのを防ぐ。
このようなコンプレックスを調製する方法及びそれに用いる装置を下記に説明することにする。
薬物の微粒子懸濁液と高分子電解質液を用いて、微粒子の外表面に高分子電解質の皮膜を形成する高分子皮膜コーティング部の１つの実施形態を、図６及び図７を用いて説明する。この高分子皮膜コーティング部は、本発明において用いる微粒子コーティング装置の主要構成機器の１つである。
本実施形態では、薬物の微粒子懸濁液の流れと高分子電解質液の流れとを合流させることによってコーティングを行なう。また、本実施形態では、微粒子懸濁液と高分子電解質液とが、共にマイクロフローチャンネルの中を流れるようになっている。図６には、微粒子懸濁液と高分子電解質液とが、各々１本のマイクロフローチャンネルの中を流れて合流するシングルマイクロフローチャンネルを用いた高分子皮膜コーティング部の実施形態を示し、図７には、図６に示すシングルマルチフローチャンネルを用いた高分子皮膜コーティング部が複数備えられたマルチマイクロフローチャンネルを用いた高分子皮膜コーティング部の実施形態を示す。
まず、図６に示すシングルマイクロフローチャンネルを用いた高分子皮膜コーティング部の実施形態の説明を行なう。図３における回収部７０の槽のマイクロ流路６０からの流入口の面に対して背面の下部に排出マイクロ流路７６を設ける。ここで、このマイクロ流路は、微粒子製造装置によって微粒子化された極微粒子が、極微粒子懸濁液の中で再凝集することを防ぐために有効である。特に、マイクロ流路の流路幅を、極微粒子懸濁液の中で流動する極微粒子長径よりもわずかに大きい程度にすることが好ましい。ただし、粒径のばらつきや、マイクロ流路の加工精度等を考慮すると、流動する極微粒子長径の１．１〜５００倍の範囲、好ましくは５０〜５００倍の範囲で定めることが望ましい。
次に、高分子電解質液が流れるマイクロ流路も、上述の極微粒子懸濁液が流れるマイクロ流路と同様の寸法に設定することができる。マイクロ流路を流れる高分子電解質液は、高分子電解質を結合させる又は高分子電解質でコーティングする極微粒子の最外層の電荷と反対の電荷を有する高分子電解質を含んでいる。つまり、微粒子懸濁液に含まれる極微粒子の最外層が負の電荷を有する場合には、正の電荷を有するカチオン性高分子電解質液をマイクロ流路に流す。同様に、極微粒子懸濁液に含まれる極微粒子の最外層が正の電荷を有する場合には、負の電荷を有するアニオン性高分子電解質液をマイクロ流路に流す。
また、極微粒子懸濁液が流れるマイクロ流路と、高分子電解質が流れるマイクロ流路とが合流する角度については、鋭角から鈍角まで幅広い角度を選択することができる。合流する角度は、０〜１８０度の範囲が好ましい。マルチマイクロフローチャンネルを用いる場合は０〜５度の範囲がより好ましい。
上述のように、各高分子皮膜コーティング部では、極微粒子懸濁液に対して、極微粒子の最外層の電荷と反対の電荷を有する高分子電解質液を用いるので、互いに引き付け合う静電気力によって、２つの液を合流させるだけで、強い皮膜を容易に形成することができる。
図６には、シングルマイクロ流路を用いた例を示したが、マルチマイクロ流路を用い、それぞれで上記と同様に高分子皮膜コーティングを実施することにより、コンプレックスを高い生産性で調製することができる。
次に、回収部７０中の極微粒子懸濁液から、コンプレックスを一連の様式で調製するコーティング装置及びコーティング方法の全体を、図８に示した線図を用いて説明することにする。
本発明において用いる極微粒子のコーティング装置は、主に、高分子皮膜コーティング部１２０からなる。高分子皮膜コーティング部１２０は、コーティングする前の極微粒子の懸濁液を収容した微粒子懸濁槽７０（前記回収部７０）と、極微粒子懸濁液用マイクロ流路１２２ａと、高分子電解質液用マイクロ流路１２２ｂと、それらが合流して形成される合流マイクロ流路１２２ｃと、高分子電解質液を貯蔵した高分子電解質液タンク１２４と、コーティング処理が終了した高分子皮膜極微粒子（形成されたコンプレックス）を回収するコンプレックス回収槽１４０と、ポンプ、配管、バルブ類から構成される。
なお、図を簡略化するため、マイクロ流路を用いた高分子皮膜コーティング部１２０は、シングルマイクロ流路の形で示されているが、実際には、微粒子の生産量に応じた本数のマイクロ流路を有するマルチマイクロ流路を用いることができる。
ここで、極微粒子懸濁液の流れに沿って説明すると、微粒子懸濁槽７０に極微粒子懸濁液が収容されている。溶媒として水を用いた場合について説明すると、極微粒子が水に懸濁されており、極微粒子の外表面は水の中でイオン化して正又は負の電荷を有している。簡単にするために、極微粒子の外表面が負の電荷を有している場合について説明する。なお、この場合、高分子電解質としてはカチオン性高分子電解質液を用いる。
この状態において、ポンプ１１４を用いて、コーティング前の極微粒子懸濁液を、微粒子懸濁槽７０から高分子皮膜コーティング部１２０内の極微粒子懸濁液用マイクロ流路１２２ａへ送る。同様に、ポンプ１２６を用いて、高分子電解質液タンク１２４に貯蔵されたカチオン性高分子電解質液を、高分子電解質液タンク１２４から高分子電解質液用マイクロ流路１２２ｂへ送る。
そして、極微粒子懸濁液用マイクロ流路１２２ａと高分子電解質液用マイクロ流路１２２ｂとが合流して、合流マイクロ流路１２２ｃを形成する。合流マイクロ流路１２２ｃにおいて、極微粒子懸濁液とカチオン性高分子電解質液とが混合し、極微粒子の外表面にカチオン性高分子電解質が接触してカチオン皮膜を有するコンプレックスが形成される。
そして、極微粒子懸濁液とカチオン性高分子電解質液との混合液であるカチオン性混合液が、形成されたコンプレックスを含んだ状態でコンプレックス回収槽１４０に回収される。
なお、極微粒子の外表面が正の電荷を有している場合も、高分子電解質液としてアニオン性高分子電解質液を用いる以外は上記と同様の方法でコンプレックスを形成することができる。
以下において、本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。
＜実施例１＞
（１）レーザ照射条件：
光源は、Ｎｄ３＋：ＹＡＧレーザ（Continuum, Surelite）を用い、ＯＰＯ（Optical Parametric Oscillator : Continuum, SureliteOPO）システムでレーザ光をとりだした。レーザ光強度の調節は減光板とattenutorを用いて行った。光照射面積は石英セルの前面の感光紙にレーザ光を照射して見積もった。
レーザ：繰り返し周波数：10 Hz
パルス幅：７ｎｓ
励起波長：３５５ｎｍ
照射面積：０．２８ｃｍ２
エリプチシンの微粒子化：レーザ光強度：１００ｍＪ／ｃｍ２
総照射時間：１０秒
（２）エリプチシンサンプル：
試料は、エリプチシン（Ｆｌｕｋａ，＞９９％）を用い、これをおよそ１μｍ程度に粗粉砕して用いた。溶媒は、脱イオン水を用いた。
極微粒子作製には、試料懸濁液７５ｍｌに超音波（ＳＨＡＲＰ,ＵＴ-２０５,高周波数：最大２００Ｗ）を照射したものを使用した。この試料懸濁液からマグネチックスターラーを用いて攪拌しながら３ｍｌ量り取り、光路長１ｃｍの石英セル（１ｘ１ｘ５ｃｍ３）に移し、マグネチックスターラーを用いて攪拌しながらレーザ光を照射した。
生成した極微粒子は、あらかじめ添加した高分子電解質により、直ちにコーティングされ、安定化されて粒子間凝集を阻止する目的で（ａ）高分子電解質を添加したサンプルと
（ｂ）高分子電解質非添加のサンプル
の二種で照射し両者を比較検討した。
（ａ）エリプチシン＋高分子電解質＋水分散液
高分子電解質：プロタミン（濃度：１ｘ１０−２ｇ／ｍｌ）
抗癌剤としてエリプチシン４．１×１０−３Ｍ（１．０ｍｇｍｌ−１）を用い、レーザ光を照射して分散させた。照射後一時間放置して、生成した上澄みを評価した。
エリプチシン４．１×１０−３Ｍ（１．０ｍｇｍｌ−１）を用い、レーザ光を照射しないで分散させた。その上澄み部分をコントーロールとした。
上澄み液の濃度は、吸光度から見積もった。
（ｂ）エリプチシン＋水分散液
エリプチシン１．５×１０−４Ｍ（３．６ｘ１０−２ｇｌ−１）を用い、レーザ光を照射して分散させた。照射後の上澄みを評価した。
エリプチシン１．５×１０−４Ｍ（３．６ｘ１０−２ｇｌ−１）を用い、レーザ光を照射しないで分散させた。その上澄み部分をコントーロールとした。
上澄み液の濃度は、吸光度から見積もった。
その結果、高分子電解質存在下レーザ光を照射して分散させた後の上澄み濃度は高分子電解質非存在下でのものと比較して＞１００倍濃い値を示した。
高分子電解質存在下でレーザ光を照射して分散させた後の上澄み濃度：＞１．８ｘ１０−５ｇ／ｍｌ。
（３）極微粒子の評価
（３−１）生成した極微粒子の純度評価は、次の手順で行った。
照射後の懸濁液から上澄みを抜き取り、真空ポンプで溶媒を留去した後に、残渣にエタノールを加えて紫外、可視吸収スペクトル（SHIMADZU, UV-3100. HITACHI, F-4500）及び液体クロマトグラフィー（SHIMADZU,SPD-10）を測定した。
吸収スペクトルの比較 −未照射及び照射後のエタノール溶液−を図９に示す。図９では、未照射のエリプチシンエタノール溶液の吸収スペクトル（実線）及びレーザー照射（１００ｍＪ／ｃｍ２、１０秒間）後のエリプチシンエタノール溶液の吸収スペクトル（点線）が示されている。図９から、未照射の吸収スペクトル（実線）と照射後の吸収スペクトル（点線）とを比べて変化がほとんど認められない。これより、レーザ光照射により微粒子化されたエリプチシンは、ほとんど分解されていないことが分かる。
レーザ光を照射した後のエリプチシンのエタノール溶液の液体クロマトグラムを図１０に示す。図１０からも、レーザ光照射により微粒子化されたエリプチシンが、ほとんど分解していないことが分かる。
（３−２）エリプチシンを微粒子化する前のＳＥＭの画像と、微粒子化した後のＳＥＭの画像とをそれぞれ図１１及び１２に示す。微粒子化する前の粒子の平均直径は、１μｍ程度であり、これが機械的な微粒子化の限界である。
FEI, Strata DB235-51で観察。別添写真参照
（３−３）微粒子化した後の粒径分布分ヒストグラムを図１３に示す。
図１３から、本発明のコンプレックスは、そのほとんどが７０〜１３０ｎｍの粒度分布の中に入り、粒径が均一であることが分かり、平均直径は１００ｎｍであった。平均直径は、個々の粒子の直径をスケール付き顕微鏡で測定し、全体の個数で割って求めた。
FEI, Strata DB235-51で観察。MALVERNゼータサイザーNano-ZSで測定。
本例では、被膜の厚さは、３〜４ｎｍであり、全体の粒径に及ぼす影響は、無視できる。
（３−４）細胞毒性試験
レーザ照射して微粒子化したエリプチシン（濃度２μｇ／ｍｌ）を下記細胞培養液で希釈して１μｇ／ｍｌ，０．５μｇ／ｍｌ，０．２５μｇ／ｍｌ，０．１２５μｇ／ｍｌの被検サンプルを調製した。対象細胞はＭＣＦ−７（ＭＥＭ−（培地）及びＬ−１２１０（ＲＰＭＩ−１６４０培地）腫瘍細胞とし、細胞毒性はCell Counting Kit-8を用い、脱水素酵素活性を指標とするＷＳＴ−８（特許２７５７３４８）の４５０ｎｍ発色測定で２４ｈｒｓ培養後の生細胞数を測定した。
バイアビリテイー(%)＝（Ａｓａｍｐｌｅｓ−Ａｂｌａｎｋ）/（Ａｎｏ−ｓａｍｐｌｅｓ−Ａｂｌａｎｋ）100%
（式中、Ａは、ＵＶ特性の波長４５０ｎｍにおける吸光度を表し、Ａｓａｍｐｌｅｓは、試料が存在している場合の吸光度を表し、Ａｎｏ−ｓａｍｐｌｅｓは、試料が存在せず、高分子電解質が存在する場合の吸光度を表し、Ａｂｌａｎｋは、培地のみが存在する場合の吸光度を表す。）
細胞に対する５０％阻害活性はそれぞれ
ＭＣＦ−７ ｃｅｌｌ：０．２１μｇ／ｍｌ
Ｌ−１２１０ ｃｅｌｌ：０．０９μｇ／ｍｌ
であった。
なお、対照はエリプチシンが水に溶けないので評価不能である。文献で知られている値はジムソー等の有機溶媒を使用しているため直接比較はできない。
この結果より、本発明の極粒子状抗癌剤、及びそれと高分子電解質とのコンプレックスは、腫瘍細胞に対して阻害活性を示し、薬効を有することが立証された。
＜実施例２＞
ＳＮ−３８ナノ粒子の調製
０．０１ＮＨＣｌを１００倍希釈して、ｐＨ＝４．０の塩酸水溶液を調製した。この溶液２０ｍｌ中に６０ｍｇのＳＮ−３８を混入し２時間以上超音波処理した。この懸濁液をマグネチックスターラーで良く攪拌しながら、懸濁液２．０ｍｌを量り取り、光路長１ｃｍの石英セルに入れた。これにｐＨ＝４．０の塩酸水溶液１ｍｌを加えＳＮ−３８の濃度２ｍｇ／ｍｌの懸濁液とした。マグネチックスターラーで良く攪拌しながら、レーザー（４２０ｎｍ励起，８０ｍＪ／ｃｍ２，１００分間）を照射した。レーザー照射後、１日室温で静置し、その上澄み液を取り、吸収スペクトル、ＨＰＬＣ、粒度分布及びＳＥＭ測定を行った。その結果、上記レーザー照射条件下ではＳＮ−３８の化学分解は起こらず、ナノ化が進んだ(図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１５参照)。生成したナノ粒子の収率は５０％以上で濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。
ＳＮ−３８ナノ粒子−硫酸プロタミンとＳＮ−３８ナノ粒子−コンドロイチン硫酸の調製
ＳＮ−３８ナノ粒子を安定化する目的（自己凝集を防ぐ目的）で、上記上澄み液１ｍｇ／ｍｌに、ナノ粒子表面のゼータ電位が一定値に達するに十分量のプロタミン又はコンドロイチンサルフェートを添加し（１ｍｇ／ｍｌ微粒子化ＳＮ−３８に対し、重量比で３０ｗｔ％となるように１０ｍｇ／ｍＬ硫酸プロタミン（ｐＨ４）または１０ｍｇ／ｍＬコンドロイチン硫酸（ｐＨ４）を加え）それぞれ一定のゼータ電位＋１９．９ｍＶ，−４７．２ｍＶに調製した(図１６参照)。
ＳＮ−３８ナノ粒子の細胞毒性試験
実施例１の（３−４）に記載のエリプチシンの細胞毒性試験と類似の方法で７２ｈｒｓ培養後の生細胞数を測定した。５０％阻害活性は ＭＣＦ−７ ｃｅｌｌで１００ｎＭであった。対照として用いたレーザ未照射ＳＮ−３８のＤＭＳＯ溶液と水懸濁液はそれぞれ５０％阻害活性が５００ｎＭ，２０００ｎＭであった。
この結果より、対照と比較してナノ化試料のより高い細胞内移行性が示された。
ヌードマウス移植ヒト癌を用いたＳＮ−３８ナノ粒子、ＳＮ−３８ナノ粒子−硫酸プロタミン、ＳＮ−３８ナノ粒子−コンドロイチン硫酸と塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）の抗腫瘍効果の対比検討
試験施設
名称： 株式会社 実験癌化学療法研究所
住所： 大阪府箕面市白島3-13-1
材料および方法
１．被験物質：ＳＮ−３８ナノ粒子
ＳＮ−３８ナノ粒子−硫酸プロタミン
ＳＮ−３８ナノ粒子-コンドロイチン硫酸
保存条件：気密容器に入れ遮光、室温（２３℃）で保存した。
対比薬：塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）
２．使用ヒト癌株
胃癌Ｈ−２３，中分化型腺癌 ３２３代目
３．実験動物
ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕヌードマウス（雄性、日本クレア株式会社）
４．移植方法
ヌードマウスを頚椎脱臼により屠殺後、皮下で継代している腫瘍を摘出して腫瘍から被膜と壊死部を除き、ＲＰＭＩメディウムにて洗浄し、２〜３ｍｍ角の出来るだけ均等な立方状の腫瘍片を作製した。この腫瘍片を生後満６週齢のマウス背部皮下にｔｒｏｃａｒを用い移植した（移植日：Ｄａｙ０）。
５．実験方法
ノギスを用いて腫瘍の最大径（Ｌ）と直交する横径（Ｗ）及び厚み（Ｄ）を０．５ｍｍ単位まで計測し、Ｖ＝１／２ｘＬｘＷｘＤの式で求めた推定腫瘍体積が約７０ｍｍ３前後に達した時（移植後７日）、１群５匹で、推定腫瘍体積の平均値、標準誤差とも出来る限り均等となるよう対照群と治療群を設定し、投与を開始した。
実験終了は投与開始日から４週間後とし、腫瘍径を週２回、体重を投与時に計測し、腫瘍増殖の状態と薬剤の投与による影響をモニターするとともに、その他の身体的変化を観察した。動物は腫瘍移植時、投与時及び計測時にスリーブを通じてクリーンベンチに移した以外は、実験終了時まで終始小型ビニールアイソレータ内で飼育した。
６．投与量及び投与スケジュール
（１）Control (薬剤無処置)
(２)ＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ （ｉ．ｖ．）ｑ４ｄ×４ 計４回
（３）ＳＮ−３８ナノ粒子 １０ｍｇ／ｋｇ （ｉ．ｖ．）ｑ４ｄ×４ 計４回
(４)ＳＮ−３８ナノ粒子-プロタミン ３ｍｇ／ｋｇ （ｉ．ｖ．）ｑ４ｄ×４ 計４回
(５)ＳＮ−３８ナノ粒子-コンドロイチン硫酸 １０ｍｇ／ｋｇ （ｉ．ｖ．） ｑ４ｄ×４ 計４回
７．調製液の作製方法
ＳＮ−３８ナノ粒子（１ｍｇ／ｍｌ）およびＳＮ−３８ナノ粒子−コンドロイチン硫酸（１ｍｇ／ｍｌ）原液（１０ｍｇ／ｋｇ投与群用）、ＳＮ−３８ナノ粒子−硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）を注射用蒸留水で０．３ｍｇ／ｍｌ（３ｍｇ／ｋｇ投与群用)となるよう希釈した。さらに投与直前に２７％ＮａＣｌ液を容積比１：３０ずつ加えた。ＣＰＴ−１１は３ｍｇ／ｍｌとなるよう生理食塩水を加え希釈した。
８．調製液の投与方法
ＳＮ−３８ナノ粒、ＳＮ−３８ナノ粒子-プロタミンおよびＳＮ−３８ナノ粒子−コンドロイチン硫酸 投与群には、各々調製液をＮａＣｌを加えた後、２５分以内に投与した。マウス体重１０ｇあたり０．１ｍｌずつを１日に１回、４日目毎に計４回（ｑ４ｄｘ４）静脈内投与した。
ＣＰＴ−１１投与群は、３ｍｇ／ｍｌ調製液を１日２回（６０ｍｇ／ｋｇ投与群)、マウス体重１０ｇ当たり０．１ｍｌずつ、４日目毎に計４回（ｑ４ｄｘ４）静脈内投与した。Control群には薬剤投与を行わなかった。
９．効果判定法
実験終了日に摘出した対照群（Ｃ）と治療群（Ｔ）の平均腫瘍重量から腫瘍増殖抑制率（ＩＲ）を次式により求め、ＩＲが５８％に達しない時は「無効」、ＩＲ≧５８％の時に「有効」、ＩＲ≧８０％の時に「著効」と判定した。
ＩＲ＝（１−Ｔ／Ｃ）ｘ１００（％）
各群間の腫瘍重量による統計学的有意差はStudent’s t検定（両側）で求めた。
さらに、実験期間中の対照群（Ｃ）と治療群（Ｔ）の平均推定腫瘍体積を経時的に計測し、同様にtumor volume IRを求めて実験期間中の最大増殖抑制率（max. IR）を求めた。さらに、実験終了時の平均推定腫瘍体積が投与開始時のそれよりも小さい時、縮小効果ありと判定する。
なお、薬剤の宿主への影響は、体重の変化と症状の出現により検討した。
結果
ヌードマウス移植ヒト胃癌Ｈ−２３（中分化型腺癌）の３２３代目を用いてＳＮ−３８ナノ粒子、ＳＮ−３８ナノ粒子-硫酸プロタミンおよびＳＮ−３８ナノ粒子−コンドロイチン硫酸の腫瘍増殖抑制効果をＣＰＴ−１１の腫瘍増殖抑制効果と対比検討した。
１．腫瘍増殖抑制効果
１）ＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群
投与回数が増すにつれ、tumor volume IRは高くなり、４回目投与の２日後（ｄ２１）に、実験期間中の最大腫瘍増殖抑制率（max. IR） ６９．１％を示し、有効が認められた。しかし、その後は徐々にtumor volume IRは低下し、実験終了日（ｄ３５）のtumor weight IRは２２．４％で無効と判定された。腫瘍重量によるt-testでもcontrol群と推計学的有意差は認められなかった。
２）ＳＮ−３８ナノ粒子 １０ｍｇ／ｋｇ投与群
初回投与の４日後（ｄ１１）に、治療群の中で最大のtumor volume IR ５７．７％を示した。２回目投与の３日後（ｄ１４）には唯一、腫瘍の縮小傾向も認められた(生データ参照)。その結果、tumor volume IR ５９．９％を示し、２回目投与後早くも、治療群の中で唯一有効が認められた。３回目投与の３日後（ｄ１８）には７３．４％を示し、一段と高くなった。４回目投与の２日後（ｄ２１）にはｍａｘ． ＩＲ ７４．７％を示し、腫瘍増殖抑制効果が目立った。４回目の投与から９日後（ｄ２８）にはまだtumor volume IRは６１．１％を示し、治療群の中で唯一まだ有効が認められていたが、その後は徐々に低下し、実験終了日（ｄ３５）のtumor weight IRは４５．９％で無効と判定された。しかし、腫瘍重量によるt-testではcontrol群とｐ＜１％で推計学的有意差があり、ＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群よりもｐ＜５％の推計学的有意差をもって勝っていた。
３）ＳＮ−３８ナノ粒子−硫酸プロタミン ３ｍｇ／ｋｇ投与群
３回投与の３日後（ｄ１８）にはtumor volume IR ５７．５％を示し、ＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群より僅かに高い腫瘍増殖抑制効果が認められた。
４回目投与の２日後（ｄ２１）にはmax. IR ６２．１％を示し、有効が認められた。その後は徐々にtumor volume IRは低下した。実験終了日（ｄ３５）のtumor weight IRは３８．９％で無効と判定されたが、腫瘍重量によるt-testではcontrol群とｐ＜１％で推計学的有意差があった。さらにＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群よりＩＲは勝っていた。
４）ＳＮ−３８ナノ粒子−コンドロイチン硫酸 １０ｍｇ／ｋｇ投与群
３回目投与の３日後（ｄ１８）にはtumor volume IR ６５．３％で有効を示し、ＳＮ−３８ １０ｍｇ／ｋｇ投与群に次いで高い腫瘍増殖抑制効果が認められた。しかし、４回目投与の２日後（ｄ２１）にmax. IR ６５．４％を示した後は、ＩＲが急速に低下した。実験終了日（ｄ３５）のtumor weight IRは２８．５％で無効と判定されたが、腫瘍重量によるt-testではcontrol群とｐ＜５％で推計学的有意差があった。
結論
ＳＮ−３８ナノ粒子１０ｍｇ／ｋｇ投与群はＣＰＴ−１１投与群より明らかに高い腫瘍増殖抑制効果を示した。また、ＣＰＴ−１１投与群は投与休止により腫瘍増殖抑制効果が目立って低下するのに対し、ＳＮ−３８ナノ粒子１０ｍｇ／ｋｇ投与群は、投与休止により腫瘍増殖抑制効果は低下するものの、その程度はＣＰＴ−１１投与群に比べてかなり小さかった。ＳＮ−３８ナノ粒子１０ｍｇ／ｋｇ投与群では実験期間中に体重減少もなく、特に重篤な副作用も見られなかった。
ＳＮ−３８ナノ粒子−硫酸プロタミン ３ｍｇ／ｋｇ投与群、ＳＮ−３８ナノ粒子−コンドロイチン硫酸 １０ｍｇ／ｋｇ投与群はいずれもＣＰＴ−１１投与群と同様な腫瘍増殖抑制効果を示した。特に３回目投与の３日後（ｄ１８）までとｄ３２〜ｄ３５（実験終了日）においてＣＰＴ−１１投与群に優っていた（図１７参照）。
＜実施例３＞
10-Hydroxy-camptothecinナノ粒子の調製
ＳＮ−３８ナノ粒子の調製と同様の手順で10-Hydroxy-camptothecinの濃度０．５ｍｇ／ｍｌの懸濁液とした。
マグネチックスターラーで良く攪拌しながら、レーザー（４３０ｎｍ励起，４０ｍＪ／ｃｍ２，６０分間）を照射した。レーザー照射後、遠心分離し、その上澄み液を取り、吸収スペクトル、ＨＰＬＣ、粒度分布及びＳＥＭ測定を行った（図１８Ａ、図１８Ｂ及び図１９参照）。その結果、生成したナノ化粒子の収率は５０％以上で濃度は０．２５ｍｇ／ｍｌであった。
10-Hydroxy-camptothecinナノ粒子の細胞毒性試験
実施例１の（３−４）に記載のエリプチシンの細胞毒性試験と類似の方法で７２ｈｒｓ培養後の生細胞数を測定した。５０％阻害活性は MCF-7 cellで１００ｎＭであった。対照として用いたレーザ未照射10-Hydroxy-camptothecinのＤＭＳＯ溶液と水懸濁液はそれぞれ５０％阻害活性が１００ｎＭ，５００ｎＭであった。
この結果より、対照と比較してナノ化試料のより高い細胞内移行性が示された。
ヌードマウス移植ヒト癌を用いた10-Hydroxycamptothecinナノ粒子と塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）の抗腫瘍効果
試験施設
名称： 株式会社 実験癌化学療法研究所
住所： 大阪府箕面市白島3-13-1
材料および方法
１．被験物質：10-Hydroxycamptothecinナノ粒子
対比薬：塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）
２．使用ヒト癌株
胃癌H-23, 中分化型腺癌
３．実験動物
ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕヌードマウス（雄性、日本クレア株式会社）
４．移植方法
ヌードマウスを頚椎脱臼により屠殺後、皮下で継代している腫瘍を摘出して腫瘍から被膜と壊死部を除き、RPMIメディウムにて洗浄し、２〜３ｍｍ角の出来るだけ均等な立方状の腫瘍片を作製した。この腫瘍片を生後満５週齢のマウス背部皮下にｔｒｏｃａｒを用い移植した（移植日：Ｄａｙ０）。
５．実験方法
ノギスを用いて腫瘍の最大径（Ｌ）と直交する横径（Ｗ）及び厚み（Ｄ）を０．５ｍｍ単位まで計測し、Ｖ＝１／２ｘＬｘＷｘＤの式で求めた推定腫瘍体積が約１００ｍｍ３前後に達した時（移植後７日）、１群５匹で、推定腫瘍体積の平均値、標準誤差とも出来る限り均等となるよう対照群と治療群を設定し、投与を開始した。
実験終了は投与開始日から４週間後とし、腫瘍径を週２回、体重を投与時に計測し、腫瘍増殖の状態と薬剤の投与による影響をモニターするとともに、その他の身体的変化を観察した。動物は腫瘍移植時、投与時及び計測時にスリーブを通じてクリーンベンチに移した以外は、実験終了時まで終始小型ビニールアイソレータ内で飼育した。
６．投与量及び投与スケジュール
（１）Control 生理食塩水０．１ｍｌ／マウス体重１０ｇ（ｉ．ｖ．）
ｄ７，ｄ１１，ｄ１４ 計３回
（２）ＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．） ｄ７，ｄ１１，ｄ１４ 計３回
（３）10-Hydroxycamptothecinナノ粒子
５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．） ｄ７，ｄ８，ｄ１１，ｄ１２，ｄ１４，ｄ１５ 計6回
（４）10-Hydroxycamptothecinナノ粒子
２．５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．） ｄ７，ｄ８，ｄ１１，ｄ１２，ｄ１４，ｄ１５ 計6回
７．調製液の作製方法
10-Hydroxycamptothecinナノ粒子溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ）に１．８％ＮａＣｌ液を同量加え、０．１２５ｍｇ／ｍｌ調製液とする。ＣＰＴ−１１は３ｍｇ／ｍｌとなるよう生理食塩水を加える。
８．調製液の投与方法
10-Hydroxycamptothecinナノ粒子投与群には、０．１２５ｍｇ／ｍｌ調製液を調製後２５分以内に投与した。５ｍｇ／ｋｇ投与群にはマウス体重１０ｇあたり０．２ｍｌずつを１日２回、２．５ｍｇ／ｋｇ投与群にはマウス体重１０ｇあたり０．２ｍｌずつを１日に１回、ｄ７，ｄ８，ｄ１１，ｄ１２，ｄ１４，ｄ１５の計6日静脈内投与した。
ＣＰＴ−１１投与群は、３ｍｇ／ｍｌ調製液を１日２回（６０ｍｇ／ｋｇ投与群）、マウス体重１０ｇ当たり０．１ｍｌずつ、ｄ７，ｄ１１，ｄ１４の計３日静脈内投与した。Control群には生理食塩水をＣＰＴ−１１と同様に計3回静脈内投与した。
９．効果判定法
実験終了日に摘出した対照群（Ｃ）と治療群（Ｔ）の平均腫瘍重量から腫瘍増殖抑制率（ＩＲ）を次式により求め、ＩＲが５８％に達しない時は「無効」、ＩＲ≧５８％の時に「有効」、ＩＲ≧８０％の時に「著効」と判定した。
ＩＲ＝（１−Ｔ／Ｃ）ｘ１００（％）
各群間の腫瘍重量による統計学的有意差はStudent’s t検定(両側)で求めた。
さらに、実験期間中の対照群（Ｃ）と治療群（Ｔ）の平均推定腫瘍体積を経時的に計測し、同様にtumor volume IRを求めて実験期間中の最大増殖抑制率（max. IR）を求めた。さらに、実験終了時の平均推定腫瘍体積が投与開始時のそれよりも小さい時、縮小効果ありと判定する。
なお、薬剤の宿主への影響は、体重の変化と症状の出現により検討した。
結果
ヌードマウス移植ヒト胃癌Ｈ−２３（中分化型腺癌）の３１７代目を用いて10-Hydroxycamptothecinナノ粒子の腫瘍増殖抑制効果をＣＰＴ−１１の腫瘍増殖抑制効果と対比検討した。
１．腫瘍増殖抑制効果
１）ＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群
投与開始後、腫瘍の増殖抑制が目立ち、３回目投与時（ｄ１４）にtumor volume IR ６０．７％を示し、有効となった。さらに、３回目投与の４日後（ｄ１８）にmax. IR ６９．０％を示した。Tumor volumeによるt-testではcontrol群とｐ＜０．１％で推計学的有意差があった。しかし、それ以後は腫瘍の増殖が速くなり、３日後（ｄ２１）には５０．７％と無効になった。その後は益々、増殖速度を速め、投与開始から１８日後（ｄ２５）のtumor volume IRは、腫瘍の表面が潰瘍化し、増殖が頭打ちになったＣＰＴ−１１ ３０ｍｇ／ｋｇ投与群よりも低下した。実験終了日（ｄ３５）のtumor volume IRは１４．１％であった。Tumor weight IRは１４．１％で無効と判定された。腫瘍重量によるt-testでもcontrol群と推計学的有意差がなかった。
2）10-Hydroxycamptothecinナノ粒子５ｍｇ／ｋｇ投与群
投与開始後、腫瘍の縮小が見られ、３回目投与日（ｄ１１）にはtumor volume IRは６３．２％で、この時点で治療群中唯一、有効が認められた。その後は徐々に再増殖を始めたが、control群の増殖に比べると顕著に抑制効果が認められ、Tumor volume IRは高くなった。６回投与終了の３日後（ｄ１８）にはtumor volume IR ８５．４％（max. IR）で著効と認められた。Tumor volumeによるt-testではcontrol群とｐ＜０．１％で推計学的有意差が認められた。しかし、その後は再増殖の速度を速めてtumor volume IRは徐々に低下した。それでも６回投与終了の１０日後（ｄ２５）にはtumor volume IR ６２．３％を示し、治療群で唯一有効が認められた。しかし、それ以後control群の腫瘍増殖が頭打ちになったため、10-Hydroxycamptothecinナノ粒子投与群の腫瘍増殖速度は目立って速くなり、tumor volume IRは急激に低下した。実験終了日（ｄ３５）のtumor volume IRは２３．１％であった。Tumor weight IRは１９．４％で無効と判定された。腫瘍重量によるt-testでもcontrol群と推計学的有意差は認められなかった。
３）10-Hydroxycamptothecinナノ粒子２．５ｍｇ／ｋｇ投与群
投与開始後、腫瘍の増殖は緩やかで、著しい増殖抑制効果が見られた。４回投与の２日後（ｄ１４）にはtumor volume IRは６８．０％で有効と認められた。６回投与の３日後（ｄ１８）にはmax. IR ７６．４％を示した。Tumor volumeによるt-testではcontrol群とｐ＜０．１％で推計学的有意差が認められた。さらに３日後（ｄ２１）にも６８．０％で有効が認められた。終盤は腫瘍の表面が潰瘍化する動物も増えたためか、腫瘍の増殖も頭打ちとなり、５ｍｇ／ｋｇ投与群よりもtumor volume IRは高くなった。実験終了日（ｄ３５）のtumor volume IRは２８．７％、tumor weight IRは２５．５％で、無効と判定されたが、治療群の中では最も高かった。しかし、腫瘍重量によるt-testではcontrol群と推計学的有意差は認められなかった。
２．副作用
各治療群の最大体重減少率（max. wt. loss）はＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇが０．４％で軽微、10-Hydroxycamptothecinナノ粒子２．５ｍｇ／ｋｇ投与群では、実験開始日からの体重の減少は見られなかった。
10-Hydroxycamptothecinナノ粒子５ｍｇ／ｋｇ投与群では６回投与終了日（ｄ１５）の３日後（ｄ１８）にmax. wt. loss ９．１％の中等度の体重減少が見られ、１群５匹中１匹（No.5）では軟便が認められた。しかし、その３日後（ｄ２１）には体重が回復し、以後は実験終了日まで増加し続けた。他の特に目立った副作用は見られなかった。Control群では、群の平均では実験開始日からの体重減少はなかったが、終盤は増大した腫瘍の重量を含んでいるにも拘らず、体重は低下の傾向があった。特に１群５匹中の１匹（No.2）の体重減少が著しく、全実験動物３０匹中、唯一、実験終了日の体重が投与開始日の体重を下回った。Control群およびＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群の全身状態も良好ではなかった。
３．10-Hydroxycamptothecinナノ粒子とCPT−11の対比
ＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群と10-Hydroxycamptothecinナノ粒子５ｍｇ／ｋｇ投与群を比較すると、いずれも投与終了後３あるいは２日後（ｄ１８）にmax. IRを示し、ＣＰＴ−１１投与群は６９．０％（有効）、レーザー微粒子化１０−ハイドロオキシカンプトテシンは８５．４％（著効）であった。推定腫瘍体積によるt-testでｐ＜５％で推計学的有意差をもって10-Hydroxycamptothecinナノ粒子が勝っていた。実験終了日（ｄ３５）の腫瘍重量における推計学的有意差はなかったが、ＩＲはＣＰＴ−１１が８．９％、10-Hydroxycamptothecinナノ粒子が１９．４％で、10-Hydroxycamptothecinナノ粒子のＩＲが上回った。
10-Hydroxycamptothecinナノ粒子２．５ｍｇ／ｋｇ投与群でさえ、ｄ１８に示したmax. IRは７６．４％で著効に近く、実験終了日（ｄ３５）の腫瘍重量によるＩＲは２５．５％で、ＣＰＴ−１１ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群のＩＲを上回った。
結論
今回のヌードマウス移植ヒト胃癌Ｈ−２３を用いた抗腫瘍効果の検討では、10-Hydroxycamptothecinナノ粒子投与群の腫瘍増殖抑制効果がＣＰＴ−１１投与群のそれを上回った（図２０参照）。
本発明の水又はアルコール水溶液に難溶性の極粒子状抗癌剤、及びそれと高分子電解質とのコンプレックスは、注射剤として使用可能であり、バイオアベイラビリティーの向上を図り、副作用を低減するものである。
接着因子その他の特定組織細胞表面を認識する高分子電解質で特定組織ターゲテイング療法への応用も期待される。
抗癌剤を長時間にわたってゆっくりと外部へ放出でき、一度に多量の薬物が体内に入る場合に引き起こされる悪い副作用を抑制することも期待される。
また、粒径サイズを２００ｎｍ〜５０ｎｍに調製することで、ＥＰＲ効果（Enhancement Permeability and Retention Effect）を持たせてより癌細胞に選択的に取り込ませ安全かつ効果的な癌治療が期待される。
かくして本発明によれば、以下の１〜９の発明が提供される。
１．平均直径５０〜２００ｎｍで構造中に多重結合を１個以上有する粒子状の抗癌剤と、高分子電解質との、平均直径５０〜２５０ｎｍの粒子状コンプレックス。
２．抗癌剤がカンプトテシン誘導体である、請求項１記載の粒子状コンプレックス。
３．抗癌剤がエリプチシン誘導体である、請求項１記載の粒子状コンプレックス。
４．抗癌剤がポドフィロトキシン誘導体である、請求項１記載の粒子状コンプレックス。
５．高分子電解質が、プロタミン、ゲラチンＡ、コラーゲン、アルブミン、カゼイン、キトサン、ポリ−（Ｌ）−リジン、カルボキシメシルセルロース、アルギネート、ヘパリン、ヒアルロニックアシッド、コンドロイチンサルフェート、ゲラチンＢ、カラギーナン、デキストランサルフェート、ポリ−（Ｌ）−グルタミックアシッドその他の生体適合性高分子、生分解性高分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素若しくは抗体その他の生体高分子、ポリメタクリリックアシッド、ポリジアリールジメチルアンモニウム又はその他の合成高分子又はそれらが適当なリンカーでクロスリンクされた高分子からなる群より選ばれた、請求項１記載の粒子状コンプレックス。
６．構造中に多重結合を１個以上有し、レーザ光を照射することにより平均直径５０〜２００ｎｍに微細化した粒子状の抗癌剤。
７．抗癌剤がカンプトテシン誘導体である、請求項６記載の粒子状の抗癌剤。
８．抗癌剤がエリプチシン誘導体である、請求項６記載の粒子状の抗癌剤。
９．抗癌剤がポドフィロトキシン誘導体である、請求項６記載の粒子状の抗癌剤。
かくして本発明によれば、以下の１〜６の発明が提供される。
１．構造中に多重結合を１個以上有し、吸光帯の範囲内で吸収曲線の長波長側の付け根付近における低吸収部位の波長のレーザ光を照射することにより平均直径５０〜２００ｎｍに微細化した粒子状の難水溶性抗癌剤。
２．抗癌剤がカンプトテシン誘導体である、前記１記載の粒子状の難水溶性抗癌剤。
３．抗癌剤がエリプチシン誘導体である、前記１記載の粒子状の難水溶性抗癌剤。
４．抗癌剤がポドフィロトキシン誘導体である、前記１記載の粒子状の難水溶性抗癌剤。
５．前記１〜４のいずれか一に記載の粒子状の難水溶性抗癌剤に、高分子電解質を一層被覆した、平均直径５０〜２５０ｎｍの粒子状コンプレックス。
６．高分子電解質が、プロタミン、ゲラチンＡ、コラーゲン、アルブミン、カゼイン、キトサン、ポリ−（Ｌ）−リジン、カルボキシメシルセルロース、アルギネート、ヘパリン、ヒアルロニックアシッド、コンドロイチンサルフェート、ゲラチンＢ、カラギーナン、デキストランサルフェート、ポリ−（Ｌ）−グルタミックアシッド、ポリメタクリリックアシッド、ポリジアリールジメチルアンモニウムからなる群より選ばれた、前記５記載の粒子状コンプレックス。

Claims (8)

  1. 平均直径５０〜２００ｎｍの粒子状の難水溶性医薬。
  2. 構造中に多重結合を１個以上有する、請求項１記載の難水溶性医薬。
  3. 医薬が抗癌剤である、請求項１又は２記載の難水溶性医薬。
  4. 抗癌剤がカンプトテシン誘導体である、請求項３記載の難水溶性医薬。
  5. 抗癌剤がエリプチシン誘導体である、請求項３記載の難水溶性医薬。
  6. 抗癌剤がポドフィロトキシン誘導体である、請求項３記載の難水溶性医薬。
  7. 請求項１〜６のいずれか一記載の粒子状の難水溶性医薬と高分子電解質との平均直径５０〜２５０ｎｍの粒子状コンプレックス。
  8. 高分子電解質が、プロタミン、ゲラチンＡ、コラーゲン、アルブミン、カゼイン、キトサン、ポリ−（Ｌ）−リジン、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ヘパリン、ヒアルロニックアシッド、コンドロイチンサルフェート、ゲラチンＢ、カラギーナン、デキストランサルフェート、ポリ−（Ｌ）−グルタミックアシッドその他の生体適合性高分子、生分解性高分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素若しくは抗体その他の生体高分子、ポリメタクリリックアシッド、ポリジアリールジメチルアンモニウム又はその他の合成高分子又はそれらが適当なリンカーでクロスリンクされた高分子からなる群より選ばれた、請求項７記載のコンプレックス。
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