WO2007125946A1 - ペプチド - Google Patents

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WO2007125946A1
WO2007125946A1 PCT/JP2007/058926 JP2007058926W WO2007125946A1 WO 2007125946 A1 WO2007125946 A1 WO 2007125946A1 JP 2007058926 W JP2007058926 W JP 2007058926W WO 2007125946 A1 WO2007125946 A1 WO 2007125946A1
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cheese
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adiponectin
gin
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Yukiko Kunieda
Satoshi Higurashi
Mutsumi Motouri
Hiroaki Matsuyama
Atsushi Serizawa
Hiroshi Kawakami
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Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide having an anti-oxidative action derived from milk protein, an antioxidant containing the peptide as an active ingredient, and an antioxidant food or drink or feed containing the peptide.
  • the present invention also relates to a peptide having an adiponectin production promoting action derived from milk protein, an adiponectin production promoter containing the peptide as an active ingredient, and an adiponectin production promoting food or drink or feed containing the peptide.
  • the present invention is an agent for promoting blood adiponectin concentration increase and Z or a decrease inhibitor containing an ingredient contained in cheese as an active ingredient, or for promoting blood adiponectin concentration increase and Z or a decrease containing a component contained in cheese. It relates to food and drink.
  • highly unsaturated fatty acid-containing fats and oils, cheese and water are emulsified to prepare antioxidant emulsions to prevent oxidation of highly unsaturated fatty acid-containing fats and oils, fish odor and preservation derived from highly unsaturated fatty acid-containing fish oils
  • a method for masking the off-flavor in the inside is disclosed (for example, see Patent Document 3).
  • these are all highly unsaturated fatty acid-containing oils and fats that are emulsified by adding a water-soluble protein solution, a milk partial hydrolyzate, or cheese to a highly unsaturated fatty acid-containing oil. This prevents the fishy odor of the highly unsaturated fatty acid-containing oil itself and the unusual odor during storage.
  • Adipose tissue the largest secretory tissue in the body, produces various endocrine factors and is involved in maintaining homeostasis in the body.
  • Adipose tissue has been a powerful force that has only been considered a role as an energy storage so far
  • adipose tissue secretes endocrine factors such as plasminogen activator monoinhibitor, tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), leptin, and adiponectin and contributes to the maintenance of homeostasis in the body.
  • endocrine factors such as plasminogen activator monoinhibitor, tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), leptin, and adiponectin.
  • Adiponectin one of the endocrine factors derived from adipose tissue, is a 30 kDa hormone consisting of 244 amino acids that promotes fat burning in the liver and muscles in addition to inhibiting arteriosclerosis. It is said to be effective. Adiponectin has also been shown to promote the uptake of glucose and fatty acids in the blood into cells. If fat accumulates in muscles or liver, sugar intake becomes worse, leading to diabetes. However, adiponectin is usually considered to maintain the nutritional balance in the body by breaking down excess fat and sugars temporarily. As it goes on, it is said that the function of fat cells that secrete adiponectin weakens and the nutritional balance in the body is lost.
  • Adiponectin which is specifically secreted by adipose tissue, is usually present in a high concentration in blood, but it is known that secretion decreases as visceral fat accumulates. Adiponectin is known to have various physiological functions such as anti-diabetic, anti-arteriosclerosis, anti-inflammatory, and anti-hypertension, and promotes an increase in the concentration of adiponectin in the blood. Suppressing the reduction becomes very important in treating metabolic syndrome.
  • adiponectin suppresses liver fibrosis and promotes normal hepatocyte proliferation and anti-inflammatory effects (see, for example, Patent Document 6), and as an adiponectin production promoter derived from food and drink,
  • a composition for enhancing secretory protein in blood adipose tissue eg, patent document 7 containing a fermented tea extract, and a secretory protein specific to blood adipose tissue comprising an extract of a sub-tree of deciduous leaves belonging to the genus Komikansou called Amler And Patent Document 8).
  • cheese is reported to have an effect of promoting a decrease in blood triglyceride concentration and an effect of improving cholesterol metabolism despite being a high-fat food.
  • Reference 9, patent reference 10 what is known as a function of cheese is to promote an increase in blood adiponectin concentration or to suppress a decrease in blood adiponectin concentration.
  • Patent Document 1 JP-A-60-102168
  • Patent Document 2 JP-A-2-305898
  • Patent Document 3 JP-A-7-274823
  • Patent Document 4 JP-A-2004-352958
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application No. 2005-294358
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-256208
  • Patent Document 7 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-363094
  • Patent Document 8 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-56836
  • Patent Document 9 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-300890
  • Patent Document 10 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-144090
  • Non-Patent Document 1 Nobuaki Tsuge et al., Japanese Journal of Agricultural Chemistry, 65, ⁇ .1635, 1991
  • Non-Patent Literature 2 Etch 'HM' et al., Journal 'Agricultural' and 'Food' Chemistry, 43, p.574, 1995 Disclosure of the invention
  • the present invention does not impair the flavor and nutritional value of foods, and in the living body not only cause deterioration of quality, but also prevents acidity and damage caused by active oxygen and free radicals that adversely affect diseases and aging. It is an object of the present invention to provide a peptide having an anti-acidic action that is effective for inhibition. Another object of the present invention is to provide a peptide that suppresses arteriosclerosis and promotes fat burning in the liver and muscles by promoting the production of adiponectin in the living body.
  • the present invention is useful for promoting the increase of blood adiponectin concentration or suppressing the decrease of the concentration of adiponectin in the blood by ingesting it, and in addition, an ingredient contained in cheese that can be taken daily is an active ingredient.
  • Providing blood adiponectin concentration increase and Z or decrease inhibitor, or blood adiponectin concentration increase and z or decrease inhibitor The task is to do.
  • the present invention relates to a peptide having an antioxidant action consisting of an amino acid sequence represented by any one of the above formulas (1) to (3).
  • the present invention also relates to a peptide having an anti-acidic action comprising an amino acid sequence represented by any one of formulas (1) to (3) derived from milk protein.
  • the present invention also relates to an antioxidant comprising one or more peptides represented by any one of formulas (1) to (3) as an active ingredient.
  • the present invention relates to a food or drink or feed for an acid koji that contains one or more peptides represented by any one of formulas (1) to (3).
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by the above formula (1) has an effect of promoting the production of adiponectin, and has an effect at a low dose. It came to complete.
  • the present invention relates to a peptide having an adiponectin production promoting action comprising the amino acid sequence represented by the above formula (1).
  • the present invention also relates to a peptide having an adiponectin production promoting action comprising the amino acid sequence represented by the formula (1) derived from milk protein.
  • the present invention also relates to an adiponectin production promoter comprising a peptide represented by formula (1) as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a food / beverage product or feed for promoting adiponectin production, which contains a peptide represented by formula (1).
  • the present inventors have determined that the species of living organisms by food materials that can be ingested on a daily basis. From the viewpoint of preventing or improving various functional abnormalities, we have focused on the ingredients contained in cheese and confirmed its physiological function, which has the effect of promoting an increase in blood adiponectin concentration, or The present inventors have found an effect of suppressing a decrease in blood adiponectin concentration. Then, by using these physiological functions to promote blood adiponectin concentration increase and Z or decrease inhibitor, or food and drink for promoting blood adiponectin concentration increase and Z or decrease suppression, the blood adiponectin concentration can be increased. The present inventors have found that it is possible to promote or suppress a decrease in blood adiponectin concentration, and the present invention has been completed.
  • a peptide having an anti-acidic action consisting of an amino acid sequence represented by any one of the formulas (1) to (3) of the present invention may cause deterioration in quality by impairing the flavor and nutritional value of food.
  • it is effective in suppressing the oxidative damage of the living body caused by active oxygen and free radicals that adversely affect diseases and aging, and as an antioxidant containing this peptide as an active ingredient. It is useful as a food / drink for anti-acid koji or feed containing this peptide.
  • a peptide having an adiponectin production promoting action consisting of the amino acid sequence represented by the formula (1) of the present invention is effective for promoting adiponectin production, and adiponectin production using this peptide as an active ingredient. It is useful as a promoter, and as a food or drink for promoting adiponectin production containing this peptide.
  • the concentration of adiponectin in blood containing the active ingredient as an ingredient contained in the cheese of the present invention Food / beverage products that promote the increase in blood pressure and z or decrease, or promote the increase in blood adiponectin concentration and suppress z or decrease, promote the increase in blood adiponectin concentration and suppress Z or decrease by ingesting them. It suppresses excessive accumulation of visceral fat and is effective in the treatment and prevention of metabolic syndrome such as thrombosis, insulin resistance, abnormal glucose metabolism, and hypertension.
  • FIG. 1 shows a separation chromatogram of a water-soluble peptide fraction made from gouda cheese (Example 1).
  • FIG. 2 shows a separation chromatogram of a synthetic peptide fraction (Example 2).
  • FIG. 3 shows the evaluation of antioxidant activity of synthetic peptide fractions (Example 2, Test Example 2).
  • FIG. 4 shows a separation chromatogram of peptide fractions after trypsin digestion (Example 3).
  • FIG. 5 shows the evaluation of antioxidative activity of peptide fractions after trypsin digestion (Example 3, Test Example 3).
  • FIG. 6 shows adiponectin production (per unit of DNA) depending on the peptide concentration (Example 1, Test Example 4).
  • FIG. 7 shows the amount of accumulated fat depending on the peptide concentration (Example 1, Test Example 4).
  • FIG. 1 The arrow indicates the amino acid sequence of His-Pro-lie-Lys-His-Gin-Gly-Leu-Pro-Gin of the present invention.
  • FIG. 4 In the figure, 1 shows the amino acid sequence of His-Pro-Ile-Lys of the present invention, and 2 in the figure shows the amino acid sequence of His-Gin-Gly-Leu-Pro-Gin of the present invention.
  • Peptide digest 1 shows the amino acid sequence of His-Pro-Ile-Lys of the present invention
  • peptide digest 2 shows the amino acid sequence of His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln of the present invention.
  • the peptide comprising the amino acid sequence represented by can be obtained, for example, by suspending cheese in a solvent and then removing the insoluble material by degreasing and centrifugation. You can also remove the resulting fractional protein. Yes.
  • suspending cheese in a solvent means that the solvent is added to the cheese and homogenized or crushed in the solvent so that the water-soluble peptide fraction is easily obtained.
  • an aqueous solvent such as water or a phosphate buffer can be used. Thereafter, desalting may be performed using a dialysis membrane, ion exchange resin, or the like, or powder drying may be performed by lyophilization or spray drying.
  • cheese ingredients for promoting growth and Z or decrease inhibitor and blood adiponectin concentration promotion and Z or decrease suppression foods and beverages include Parmesan cheese, Gruy Enole cheese, Maribo cheese, Gouda cheese, Cheddar cheese, Emmentanore.
  • a fraction containing a peptide having an amino acid sequence ability represented by formulas (1) to (3) obtained by suspending cheese in a solvent and then degreasing, removing insoluble substances, and removing proteins is: Further purification by reverse phase chromatography using a C18 column is also possible.
  • acidic conditions such as trifluoroacetic acid (TFA) or neutral conditions such as distilled water
  • the fraction having antioxidant activity is not permeated to the column.
  • the fraction that is adsorbed on the column and eluted with 80% acetonitrile is
  • YMC-Pack ODS-A After dissolving the peptide-containing fraction with distilled water, YMC-Pack ODS-A Using a ram (4.6 mm X 150 mm; YMC), it is subjected to reverse phase HPLC to fractionate the peptides. Chromatography consists of a solvent (liquid A: 50 mM ammonium acetate aqueous solution; liquid B: 80% acetonitrile), concentration gradient (12% B ⁇ 60% B, 60 min), flow rate 0.8 ml / min, detection wavelength 215 nm. It is desirable to carry out under conditions.
  • the peptide comprising the amino acid sequence represented by the formulas (1) to (3) and the fraction containing the peptide of the present invention can be used in food and drink products to prevent deterioration in the quality of the food and drink products.
  • the peptide comprising the amino acid sequence represented by the formulas (1) to (3) and the fraction containing the peptide of the present invention can be used in food and drink products to prevent deterioration in the quality of the food and drink products.
  • When blended in food and drink after grinding the cheese in water, remove the insoluble material by degreasing and centrifuging, and then mix the cheese water-soluble peptide obtained by removing the protein as it is.
  • the peptide having the anti-acidic activity having amino acid sequence ability represented by the formulas (1) to (3) of the present invention and a fraction containing the peptide are administered orally or parenterally, It is possible to prevent the progression of diseases and aging by eliminating active oxygen, free radicals, and the like.
  • the peptide having the adiponectin production promoting action comprising the amino acid sequence represented by the formula (1) of the present invention and the fraction containing the peptide are administered orally or parenterally to promote adiponectin production in the living body. By doing so, arteriosclerosis can be suppressed and fat burning in the liver and muscles can be promoted.
  • the peptide of the present invention When administered orally or parenterally, the peptide of the present invention having an antioxidative action and adiponectin production promoting action, or an adiponectin concentration-increasing and Z or decrease inhibitor containing the ingredients contained in cheese as an active ingredient
  • dosage forms include tablets, capsules, fine granules, powders, pills, troches, sublingual or liquid preparations, or parenteral administration preparations such as injections and suppositories. can do.
  • the oral dose of a peptide having an action may be appropriately determined in consideration of the purpose of treatment and prevention, symptoms, body weight, age and sex, etc., but in general, formulas (1) to (3) per day for an adult )so
  • the present invention is effective at low doses.
  • the dosage of the adiponectin increase-promoting and Z- or decrease-inhibiting agent and the blood adiponectin increasing-promoting and Z- or decrease-inhibiting food or drink containing the components contained in the cheese of the present invention as the active ingredient is for therapeutic or preventive purposes.
  • the peptide having the amino acid sequence ability represented by the formulas (1) to (3) of the present invention has an anti-acidic action or adenobiological in vivo by ingesting foods and drinks or feeds containing them. It also prevents the deterioration of foods and drinks mixed with foods and feeds, or the feed itself, due to acidification only by exerting an effect of promoting iponectin production.
  • the blood adiponectin concentration increase promoting and Z or decrease inhibitor and the blood adiponectin concentration increasing promotion and Z or decrease suppressing food and drink according to the present invention have ingredients contained in cheese as active ingredients.
  • the blood adiponectin concentration increase promoting and Z or decrease inhibitor or the food for promoting blood adiponectin increasing concentration and Z or decrease suppression of the present invention is the blood adiponectin concentration increasing promotion and z or decrease suppressing contained in cheese. Ingredients having use are blended.
  • foods and drinks for promoting acid-acid koji or adiponectin production examples include butter, milk beverage, soft drink, juice, yogurt, jelly, bread, ice cream, rice cake, sausage, snack confectionery, cake, pudding, sausage, infant formula and baby food.
  • the peptide having an anti-oxidative action consisting of the amino acid sequences represented by the formulas (1) to (3) of the present invention has only one peptide as an active ingredient and an antioxidant, It is possible to add only one kind to make food and drink or feed for anti-acid candy, but one or more of each peptide is an active ingredient It can also be used as an antioxidant, or it can be blended with one or more to produce a food or drink for feed or feed.
  • This water-soluble peptide fraction was dissolved in distilled water and then subjected to reverse phase HPLC using a YMC-Pack ODS-A column (YMC; 4.6 mm X 150 mm) to fractionate into a water-soluble peptide purified fraction. . Chromatography is performed using solvent (A solution: 50 mM ammonium acetate aqueous solution; B solution: 80% acetonitrile), concentration gradient (12% B ⁇ 60% B, 60 min), flow rate 0.8 ml / min, detection wavelength 21 5 nm It went on condition of. The results are shown in Figure 1. When the antioxidant activity of the fractionated fraction was measured by the method of Test Example 1 shown below, strong antioxidant activity was confirmed in the fraction indicated by the arrow in the chromatogram.
  • the peptide thus obtained can be used as it is as the antioxidant or the adiponectin production promoter of the present invention.
  • Antioxidant activity of the peptide fractionated in Example 1 was measured by a method utilizing the action of an acid salt of linoleic acid to fade j8-carotene. That is, 0.5 ml of j8-carotene solution (lm g / ml black mouth form), 0.2 ml of linoleic acid solution (100 mg / ml black mouth form), 1.0 ml of Tween 40 solution (200 mg / ml black mouth form), 300 ml triangle The flask was placed in a flask and the chloroform was completely removed with nitrogen gas, and then 100 ml of distilled water was added and dissolved.
  • Anti-acid activity is substituted into the following formula and expressed as anti-acid ratio (%)
  • carnosin ⁇ -Ala-L-His; Peptide Institute
  • a muscle-derived antioxidative peptide was prepared at 0.01 ⁇ g / ml, 0.1 ⁇ g / ml, and 1 ⁇ g. The one prepared to / ml was used.
  • Table 1 shows the results of measuring the anti-acid activity of purified peptide and carnosine as a positive control.
  • the peptide derived from cheese with the amino acid sequence represented by His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln has anti-acid activity (radical strength). It was proved that it is useful for the prevention and improvement of oxidative cell damage caused by active oxygen and lipid peroxide.
  • the peptide having the amino acid sequence ability represented by the above formula (1) was synthesized with a peptide synthesizer.
  • Peptide synthesizer 431 A (Applied Biosystems) using parahydroxymethylphenoxymethylpolystyrene (HMP) resin and the 9 fluorenylmethyloxycarboxyl (Fmoc) group at the amino terminal
  • HMP parahydroxymethylphenoxymethylpolystyrene
  • Fmoc 9 fluorenylmethyloxycarboxyl
  • the obtained HMP-resin-binding protected peptide was simultaneously cleaved from the HMP-resin and removed the protecting group with trifluoroacetic acid (TFA). After removing TFA by vacuum concentration, the crude peptide was crystallized with ethyl ether, dissolved in 5% acetic acid, and lyophilized.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the obtained linear crude peptide was subjected to HPLC using a YMC-Pack ODS-A column (YMC; 4.6 mm ⁇ 150 mm). Chromatography consists of solvent (solution A: 50 mmol ammonium acetate aqueous solution; solution B: 80% acetonitrile), concentration gradient (12% B ⁇ 60% B, 60 min), flow rate 0.8 ml / min, detection wavelength 215. Performed under conditions. The purity of the obtained linear purified peptide was 98% as a result of analysis by HPLC. The result is shown in figure 2.
  • the peptide thus obtained can be used as it is as the antioxidant or the adiponectin production promoter of the present invention.
  • Antioxidant activity was measured for the peptide obtained in Example 2 in the same manner as in Test Example 1.
  • carnosine j8-Ala-L-His; Peptide Research Laboratories
  • catechin Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • muscle-derived anti-acidic active peptides were adjusted to 1 m, lO ⁇ m, 100 m. The prepared one was used.
  • the results of evaluating the anti-acid activity of the synthetic peptide are shown in Table 2 and FIG. As shown in Table 2 and FIG. 3, strong antioxidative activity was confirmed in the obtained synthetic peptide.
  • a tryptic digest of the peptide obtained in Example 2 was prepared.
  • the enzyme reaction solution (50 mM Tris-HC1, 20 mM CaCl, pH 8.0) was prepared so that the peptide obtained in Example 2 and trypsin (Sigma Aldrich Japan) were each lmg / ml.
  • This trypsin digest was dissolved in distilled water and then subjected to HPLC using a YMC-Pack ODS-A column (YMC; 4.6 mm ⁇ 150 mm). HPLC analysis was performed under the same conditions as the peptide before digestion with trypsin in Example 2. The results are shown in Fig. 4. As shown in the figure, it was divided into two peaks.
  • the thus obtained peptide having anti-oxidative activity can be used as it is as the antioxidant of the present invention.
  • Antioxidant activity was measured using the carotene bleaching method in the same manner as in Test Example 2 for the two peptides that were trypsin digests obtained in Example 3 and the trypsin digest before fractionation.
  • the peptide concentration was measured by dissolving each peptide in 500 ⁇ l of pure water and using Micro BCA Protein assay kit (Pierce).
  • carnosine / 3-Ala-L-His; Peptide Institute
  • catechin Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • FIG. 5 shows the results of evaluating the anti-acid activity of tryptic peptides. As shown in Figure 5, the resulting trypsin digestion peptide is strong! ⁇ Antioxidant activity was confirmed.
  • the peptide isolated from the cheese obtained in Example 1 was administered to primary cultured visceral fat cells.
  • GPDH glycerol 3-phosphate dehydrogenase
  • the amount of DNA was quantified using a DNA quantification kit manufactured by Cell Garage.
  • Intracellular glycerol 3-phosphate dehydrogenase (GPDH) enzyme activity was measured using a cell garage GPDH activity measurement kit according to the Cell Garage protocol. The measurement results were standardized by the amount of DNA extracted from each well.
  • GPDH Intracellular glycerol 3-phosphate dehydrogenase
  • the adiponectin concentration was measured using an adiponectin ELISA kit manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. The measurement results were standardized by the amount of DNA extracted from each well force.
  • the amount of accumulated fat in the cells was determined by fat staining with Oil Red 0 and quantification of the accumulated fat by absorbance measurement using a fat staining kit manufactured by Cell Garage.
  • the Student's t-test showed that no significant difference was detected in the amount of cellular DNA between the group to which the peptide of the present invention was not added and the group to which the peptide was added.
  • GPDH activity per unit amount of DNA
  • GPDH activity normalized by the amount of cellular DNA in each well showed significantly higher activity in the 10 M or 50 M addition group of the peptide of the present invention than in the no peptide addition group. It was. No significant difference was detected between the peptide 100 M addition group and the non-addition group.
  • Figure 6 shows the difference in adiponectin production (per unit of DNA) due to the difference in the administered peptide concentration on the seventh day when the concentration of adiponectin in the culture supernatant was the highest.
  • the adiponectin concentration increase promotion and Z or decrease suppression action in the present invention
  • the active ingredient is not limited to these peptides, but may contain various other active ingredients.
  • the peptide-anchored promoter promotes the differentiation of preadipocytes into adipocytes, or promotes the fat synthesis activity in differentiated mature adipocytes.
  • the synthesized fat may be broken down by some other molecular mechanism.
  • Adiponectin is a good cytosite in which mature adipocyte force is also secreted, and this adiponectin production promoting effect was confirmed by the peptide-added kit of the present invention. From the above, it is recognized that the peptide of the present invention has an effect of promoting functional differentiation into adipocyte power adipocytes and increasing the production of adiponectin. It was suggested that there might be an inhibitory effect.
  • Adiponectin is said to have the effect of promoting fat burning in the liver and muscles, in addition to inhibiting arteriosclerosis.
  • the peptide of the present invention has the function of preventing adipose syndrome by producing adipocytes that are likely to produce adiponectin. You could think so.
  • the effect of the peptide of the present invention on adipocytes varies depending on the concentration, suggesting the possibility that an optimal concentration exists.
  • the effect of promoting the production of adiponectin was confirmed by the peptide-added kit of the present invention.
  • the peptide of the present invention which must have an effect of suppressing the amount of accumulated fat, has a metabolic syndrome preventing effect.
  • His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln is a trypsin degradation product of the peptide consisting of the amino acid sequence represented by His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln. It was confirmed that the peptide having the amino acid sequence ability represented by -Leu-Pro-Gln has the same effect of promoting adiponectin production.
  • the raw milk was sterilized by heating (75 ° C for 15 seconds), cooled to 30 ° C, and 0.01% salt calcium was added.
  • commercially available lactic acid bacteria starter for cheese production (Christian 'Hansen) 1.5% and polysaccharide-producing lactic acid bacteria L. helveticus SBT21 71 ( ⁇ -14381) 3 0 / ( ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , rennet
  • the milk was coagulated by adding 0.003%, and the curd thus obtained was cut and stirred until ⁇ 6.2 reached 6.2 to 6.1 to discharge whey to obtain curd grains.
  • the curd grains were molded, squeezed, further salted, and aged at 10 ° C to prepare gouda cheese type hard natural cheese.
  • This hard natural cheese (aged for 12 months) was minced. (GM-DX, manufactured by Nippon Carrier Co., Ltd.) Minced and freeze-dried, then refined with a coffee mill to obtain cheese powder.
  • Example 5 (Confirmation of blood adiponectin concentration increase promotion and z or decrease inhibitory action) Using the cheese powder obtained in Example 4, blood adiponectin concentration increase promotion and Z or decrease suppressive action was confirmed.
  • Animal experiments consisted of 8 animals per group, a group administered with a high fat diet containing cheese powder (a cheese diet group), a group administered with a control diet without administering a high fat diet formulated with cheese powder (a control diet group) )
  • the control feed contains the general ingredients, main minerals, vitamin E-tocopherol) in a high-fat feed containing cheese flour, Milk casein and butter oil were used as the lipid source.
  • both protein and lipid were covered with only cheese components.
  • a control diet was fed up to 4 weeks after breeding, and then divided into two groups, and a control diet or a high fat diet formulated with cheese powder was fed up to 8 weeks.
  • Blood was collected at 4 weeks and 8 weeks, and the blood adiponectin concentration was measured using mouse Z rat adiponectin ELISA kit (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • blood triglyceride concentration and blood total cholesterol concentration at 8 weeks were measured.
  • Adiponectin concentration in blood (ix g / ml)
  • Each component was mixed with the composition shown in Table 6, filled into a container, and then heat-sterilized, and then the synthetic antioxidant peptide (His-Pro-Ile-Lys-His-Gln) obtained in Example 2 of the present invention was used. -Gly-Leu-Pro- The fruit juice beverage for anti-acid koji of the present invention containing Gin) was produced.
  • Antioxidant peptide His ⁇ Gln- Gly-Leu_Pro- Gin
  • Example 3 of the present invention His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln and An anti-acid soft drink of the present invention containing His-Pro-Ile-Lys was produced.
  • a dough having the composition shown in Table 9 was prepared, molded, and then baked to obtain the peptide obtained in Example 1 of the present invention (His-Pro-lie-Lvs-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gin). ) And the antioxidant biscuits of the present invention were produced.
  • a feed for breeding dogs according to the present invention containing (His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gin) was produced.
  • Antioxidant peptide obtained in Example 1 (His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 20% by weight, lactose (DMV) 46% by weight, crystalline cellulose (Wako Pure Chemicals) (Industry Co., Ltd.) 31% by weight and 3 parts by weight of water were sufficiently mixed, and then tableted with a tableting machine (Fuji Pharmaceutical Co., Ltd.) to produce the tablet for promoting adiponectin production of the present invention.
  • a tableting machine Fruji Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Example 2 of the present invention Each component was mixed with the composition shown in Table 11, filled into a container, and then heat-sterilized, and then the synthetic peptide (His-Proly-Lys-His-Gin-Gly) obtained in Example 2 of the present invention was used.
  • -A fruit juice drink for promoting adiponectin production according to the present invention containing Leu-Pro-Gin) was produced.

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Abstract

　抗酸化効果及びアディポネクチンの産生促進効果があるHis-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln、His-Pro-Ile-Lys　もしくは His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする抗酸化剤及びこの抗酸化剤を配合した飲食品、アディポネクチンの産生促進剤及びこの産生促進剤を配合した飲食品。さらには、チーズに含まれる成分を有効成分とする血中アディポネクチン濃度増加促進及び／又は減少抑制剤、あるいはチーズに含まれる有効成分を配合した血中アディポネクチン濃度増加促進及び／又は減少抑制用飲食品。

Description

明 細 書
ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は乳タンパク質に由来する抗酸ィ匕作用を有するペプチド、該ペプチドを有 効成分とする抗酸化剤および該ペプチドを配合した抗酸化用飲食品または飼料に 関する。
また、本発明は、乳タンパク質に由来するアディポネクチン産生促進作用を有する ペプチド、該ペプチドを有効成分とするアディポネクチン産生促進剤および該ぺプチ ドを配合したアディポネクチン産生促進用飲食品または飼料に関する。
さらに、本発明は、チーズに含まれる成分を有効成分とする血中アディポネクチン 濃度増加促進及び Z又は減少抑制剤、あるいはチーズに含まれる成分を配合した 血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制用飲食品に関する。
背景技術
[0002] 不飽和脂肪酸の酸化によって生じる過酸化物やフリーラジカルは、食品の風味や 栄養価等を損ない、品質の劣化を引き起こすだけではなぐ生体においては、その 強い酸ィ匕力により細胞内のタンパク質や遺伝子 DNAを傷つけるとともに、細胞膜を構 成する脂質を攻撃して、毒性の強いハイド口パーオキサイド等の過酸ィ匕脂質を作り、 細胞損傷や組織障害を惹き起こすと ヽわれて ヽる。こうした活性酸素やフリーラジカ ルによる生体への有害な作用の蓄積が、老化を促進したり、ガンや動脈硬化、心臓 病をはじめとする、いわゆる生活習慣病の原因の一つとして関係があることが明らか となってきた。特に生活習慣病は、食生活と密接な関係にあることから、食事内容の 改善による疾病予防の重要性が注目されている。そのため、食品成分による酸化スト レスの防止や抑制の観点から、食品の抗酸ィ匕性と食品成分との関係に関する研究 ゃ抗酸化性を持つ成分の探索が行われて ヽる。
[0003] 抗酸ィ匕性を持つ成分に関しては、植物由来のビタミンやポリフエノール等が以前か ら知られている。ビタミンに関しては多くの報告があり、特にビタミン C、ビタミン E及び カロテン等に抗酸ィ匕性が認められている。また、ポリフエノールについては、カテ キン類ゃフラボノイド類等が強い抗酸ィ匕性をもつことが明らかにされている。 さらに、 タンパク質のプロテアーゼ加水分解物力 も多種多様な抗酸ィ匕ペプチドが分離-同 定されており、卵白アルブミンの酵素分解物から 3種類の抗酸ィ匕ペプチドを分離した という報告がある (例えば、非特許文献 1参照。 ) oまた、大豆タンパク質の )8 -コンダリ シニンのプロテアーゼ加水分解物から、 6種類の抗酸化ペプチドを分離'同定したと いう報告もある (例えば、非特許文献 2参照。 )0
一方、乳タンパク質の酵素分解物についてはォピオイド活性作用、カルシウム吸収 促進作用、細胞増殖作用、抗菌作用、アンジォテンシン I変換酵素阻害作用等、多く の生理作用が明らかにされている。魚油等のエイコサペンタエン酸含有油脂を水溶 性タンパク質溶液により乳化して魚油臭を抑制する方法 (例えば、特許文献 1参照。 ) や、高度不飽和脂肪酸含有油脂を乳の部分加水分解物により乳化し、酸化安定性 の高い高度不飽和脂肪酸含有油脂の粉末を得る方法 (例えば、特許文献 2参照。 ) が開示されている。また、高度不飽和脂肪酸含有油脂、チーズ及び水を乳化させて 抗酸化乳化物を調製して、高度不飽和脂肪酸含有油脂の酸化を防止し、高度不飽 和脂肪酸含有魚油由来の魚臭や保存中の異臭をマスキングすると!、う方法 (例えば 、特許文献 3参照。）が開示されている。しかし、これらはいずれも高度不飽和脂肪酸 含有油脂に、水溶性タンパク質溶液、乳の部分加水分解物、またはチーズを加えて それぞれ乳化させた高度不飽和脂肪酸含有油脂の乳化物であって、主体となる高 度不飽和脂肪酸含有油脂自体の魚臭や保存中の異臭を防止するものである。しか しながら、高度不飽和脂肪酸含有油脂と混合し乳化させることなぐ乳タンパク質由
Figure imgf000003_0001
、う報告は数少な ヽ。本発明者らはチーズの 水溶性ペプチド画分が抗酸化作用を持つことを見出し、特許出願を行った (特許文 献 4参照。 )0また、特定のアミノ酸配列を有するペプチドが抗酸化作用を有すること も見出した (特許文献 5参照。；)。し力しながら、これらのペプチドは特にカビ熟成型の チーズに多く含まれるものである。世界的にチーズの生産量を見ると、乳酸菌のみで 熟成したチーズは、カビ熟成型のチーズよりもはるかに多く生産 *消費されている。乳 酸菌のみで熟成したチーズは、プロセスチーズの原料としても多く利用される。このこ とから、乳酸菌のみで熟成したチーズにおいて高い抗酸ィ匕作用を示すペプチド成分 の単離が望まれる。
[0005] 上述のように、活性酸素やフリーラジカルによる生体への有害な作用の蓄積力 い わゆる生活習慣病の原因の一つとして関係があることが明ら力となっている力 高血 圧、高脂血症、糖尿病などの生活習慣病発症'進展の危険因子を予防することが重 要である。現在、わが国で、心疾患ならびに脳血管疾患による死亡力 年々増加す る傾向にあり、心血管疾患と脳血管疾患による死亡が死因の約 3分の 1を占め、この 対策が国民的な課題となっている。これらの動脈硬化性疾患においては、高血圧、 高脂血症、耐糖能障害などのリスクファクターが一個人に集積することで発症の危険 度が著しく上昇することが知られており、このリスクファクターの集積した状態はメタボ リックシンドロームと呼ばれ、広く認識されるようになってきた。
[0006] メタボリックシンドロームの概念の中で、最重要視されて!/、るのが内臓脂肪の過剰な 蓄積である。生体最大の分泌組織である脂肪組織は、種々の内分泌因子を産生し、 生体における恒常性の維持に関わっている。し力しながら内臓脂肪の過剰な蓄積に 伴い、内分泌因子の分泌バランスが崩れ、種々の病態につながっていくと考えられる 。脂肪組織はこれまで、エネルギーの貯蔵庫としての役割しか考えられていな力つた 力 生活習慣病を中心とした代謝異常症候群の病態を考えるうえでの脂肪組織の重 要性が、近年、注目されるようになった。すなわち、脂肪組織は、プラスミノーゲンァク チベータ一インヒビター、腫瘍壊死因子（TNF— α )、レプチン、アディポネクチンな どの内分泌因子を分泌し、生体のホメォスタシスの維持に寄与している力 その産生 、分泌の過剰あるいは過少と言ったバランスの破綻が、糖'脂質代謝異常、高血圧、 動脈硬化の発症 ·進展に深く関わっていることが明らかになつてきた。
[0007] 脂肪組織に由来する内分泌因子の一つであるアディポネクチン (Adiponectin)は、 244個のアミノ酸よりなる、 30kDaのホルモンで、動脈硬化抑制作用などのほかに、 肝臓や筋肉における脂肪燃焼を促進する効果があると言われている。また、アディポ ネクチンには血液中のブドウ糖と脂肪酸が細胞内に取り込まれるのを促進する働きを 持っていることが明らかにされている。筋肉や肝臓などに脂肪がたまると、糖分の取り 込みが悪くなり糖尿病につながる。しかし、通常、アディポネクチンは、一時的に過剰 となった脂肪や糖分を分解することで、体内の栄養バランスを保つとみられ、肥満が 進むと、アディポネクチンを分泌する脂肪細胞の働きが弱くなり、体内の栄養バランス が崩れてしまうと言われている。
脂肪組織が特異的に分泌するアディポネクチンは通常血中に高濃度で存在するが 、内臓脂肪が蓄積するにつれて分泌が減少していくことが知られている。アディポネ クチンは、抗糖尿病、抗動脈硬化、抗炎症、抗高血圧など様々な生理機能を持つこ とが知られており、血中において、アディポネクチン濃度の増加を促進すること、もしく はアディポネクチン濃度の減少を抑制することは、メタボリックシンドロームを治療する 上で非常に重要になってくる。
[0008] 従来、メタボリックシンドロームの個々の病態への対策として薬物療法も行われてい る力 処方が必要なことや副作用を伴うことなどが問題となっている。さらに、一つの 病態に対する治療を行っても、その他の病態がきっかけとなって重篤な病態へと発 展することが分っており、これらの状態の上流に存在する脂肪細胞由来の内分泌因 子の分泌バランスを整えることが必要となってくる。また、内臓脂肪の蓄積に起因する メタボリックシンドロームの治療には、薬物療法よりも運動療法や食事療法など日々 の生活を見直すことが重要とされている。そこで、日常的に摂取でき、長期にわたつ て摂取しても安全性の高 、、内臓脂肪の蓄積に起因するメタボリックシンドロームの 治療に有効な飲食品が望まれて ヽる。
最近では、合成医薬品による治療よりは、食生活を通じて病状の進展を出来るだけ 抑制するような機能を持った食品成分に対する研究も注目されるようになってきてい る。
[0009] アディポネクチンに関しては、アディポネクチンによる肝線維化抑制や正常肝細胞 増殖促進効果ゃ抗炎症効果 (例えば、特許文献 6参照。）が知られており、飲食品由 来のアディポネクチン産生促進物としては発酵茶抽出物を有効成分とする糸且成物（ 例えば、特許文献 7参照。）、アムラーというコミカンソゥ属に属する落葉の亜高木抽 出物からなる血中脂肪組織特異分泌蛋白増強組成物 (例えば、特許文献 8参照。 ) が開示されている。
一方、チーズは高脂肪含有食品であるのにも関わらず、血中トリグリセリド濃度の低 下促進作用やコレステロール代謝の改善作用を有することが報告されている（特許 文献 9、特許文献 10)。し力しながら、チーズの機能として、血中アディポネクチン濃 度の増加を促進する作用、あるいは血中アディポネクチン濃度の減少を抑制する作 用につ 、ては、何等知られて 、な 、。
特許文献 1 :特開昭 60- 102168号公報
特許文献 2 :特開平 2- 305898号公報
特許文献 3 :特開平 7- 274823号公報
特許文献 4 :特開 2004- 352958号
特許文献 5 :特願 2005 - 294358号
特許文献 6：特開 2000- 256208号公報
特許文献 7：特開 2002- 363094号公報
特許文献 8：特開 2006 - 56836号公報
特許文献 9：特開 2003 - 300890号公報
特許文献 10：特開 2003 - 144090号公報
非特許文献 1 :柘植信昭ら、日本農芸化学会誌、 65号、 ρ.1635、 1991年
非特許文献 2 :エッチ'ェム 'チェンら（Chen, H.M. et al.) ,ジャーナル'ァグリカルチュ ラル'アンド 'フード'ケミストリー（J. Agric. Food Chem.) , 43号， p.574, 1995年 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明は、食品の風味や栄養価等を損ない、品質の劣化を引き起こすだけではな ぐ生体においては疾病や老化等に悪影響を及ぼす活性酸素やフリーラジカル等に よる生体の酸ィ匕的障害を抑制するのに有効な抗酸ィ匕作用を有するペプチドを提供 することを課題とする。また、本発明は、生体においてアディポネクチンの産生を促進 させることにより、動脈硬化を抑制し、肝臓や筋肉における脂肪の燃焼を促進するべ プチドを提供することを課題とする。
また、本発明は、これを摂取することで血中アディポネクチン濃度の増加促進、ある いは減少抑制に有用であり、しかも、 日常的な摂取が可能であるチーズに含まれる 成分を有効成分とする血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制剤、 あるいは血中アディポネクチン濃度増加促進及び z又は減少抑制用飲食品を提供 することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、次の式（1)〜（3) で表されるいずれかのアミノ酸配列力 なるペプチドに抗酸ィ匕効果があり、し力も低 用量で効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
His- Pro- lie- Lys- His- Gin- Gly- Leu- Pro- Gin 式（ 1 )
His- Pro- lie- Lys 式（2)
His- Gin- Gly- Leu- Pro- Gin 式（3)
すなわち、本発明は、上記の式（1)〜（3)のいずれかで表されるアミノ酸配列から なる抗酸化作用を持つペプチドに関する。
また、本発明は、乳タンパク質に由来する式（1)〜（3)のいずれかで表されるァミノ 酸配列からなる抗酸ィ匕作用を持つペプチドに関する。
また、本発明は、式（1)〜（3)のいずれかで表される 1以上のペプチドを有効成分と する抗酸化剤に関する。
また、本発明は、式（1)〜（3)のいずれかで表される 1以上のペプチドを配合した抗 酸ィ匕用飲食品または飼料に関する。
さらに、本発明者らは、上記の式（1)で表されるアミノ酸配列からなるペプチドはァ ディポネクチンの産生を促進する効果があり、し力も低用量で効果を有することを見 出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、上記の式（1)で表されるアミノ酸配列からなるアディポネクチ ン産生促進作用を持つペプチドに関する。
また、本発明は、乳タンパク質に由来する式（1)で表されるアミノ酸配列からなるァ ディポネクチン産生促進作用を持つペプチドに関する。
また、本発明は、式（1)で表されるペプチドを有効成分とするアディポネクチン産生 促進剤に関する。
また、本発明は、式（1)で表されるペプチドを配合したアディポネクチン産生促進用 飲食品または飼料に関する。
[0012] 加えるに、本発明者らは、日常的に摂取が可能である食品素材によって生体の種 々の機能異常を予防や改善できな!、かと!、う観点で、チーズに含まれる成分に着目 し、その生理機能を確認してきたところ、血中アディポネクチン濃度の増加を促進す る作用、あるいは血中アディポネクチン濃度の減少を抑制する作用を見出した。 そして、これらの生理機能を利用した血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又 は減少抑制剤、あるいは血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制 用飲食品を供することにより、血中アディポネクチン濃度の増加を促進すること、ある いは血中アディポネクチン濃度の減少を抑制することができることを見出し、本発明 を完成するに至った。
つまり、チーズに含まれる成分の血中アディポネクチン濃度の増加を促進する作用 、あるいは血中アディポネクチン濃度の減少を抑制する作用を利用し、チーズに含ま れる成分を有効成分とする血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑 制剤、あるいはチーズに含まれる成分を配合した血中アディポネクチン濃度増加促 進及び Z又は減少抑制用飲食品を提供することにより課題を解決することができた。 また、チーズに含まれる血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制の 有効成分について鋭意研究を重ねた結果、有効成分の一つとして、チーズに含まれ るペプチドを見出すに至った。
発明の効果
本発明の式（1)〜（3)のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる抗酸ィ匕作用を持 つペプチドは、食品の風味や栄養価等を損ない品質の劣化を惹き起こすだけではな ぐ生体においては疾病や老化等に悪影響を及ぼす活性酸素やフリーラジカル等に よる生体の酸ィヒ的障害を抑制するのに有効であり、このペプチドを有効成分とする抗 酸化剤として、また、このペプチドを配合した抗酸ィ匕用飲食品または飼料として有用 である。
また、本発明の式（1)で表されるアミノ酸配列からなるアディポネクチン産生促進作 用を持つペプチドは、アディポネクチンの産生を促進するのに有効であり、このぺプ チドを有効成分とするアディポネクチン産生促進剤として、また、このペプチドを配合 したアディポネクチン産生促進用飲食品または飼料として有用である。
さらに、本発明のチーズに含まれる成分を有効成分とする血中アディポネクチン濃 度増加促進及び z又は減少抑制剤や血中アディポネクチン濃度増加促進及び z又 は減少抑制用飲食品は、これらを摂取することにより血中アディポネクチン濃度の増 加を促進及び Z又は減少を抑制するため、内臓脂肪の過剰な蓄積を抑制し、血栓 症、インスリン抵抗性、糖代謝異常、高血圧などのメタボリックシンドロームの治療及 び予防に有効である。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]ゴーダチーズを原料とする水溶性ペプチド画分の分離クロマトグラムを示す (実 施例 1)。
[図 2]合成ペプチド画分の分離クロマトグラムを示す (実施例 2)。
[図 3]合成ペプチド画分の抗酸化活性評価を示す (実施例 2、試験例 2)。
[図 4]トリプシン消化後のペプチド画分の分離クロマトグラムを示す (実施例 3)。
[図 5]トリプシン消化後のペプチド画分の抗酸ィ匕活性評価を示す (実施例 3、試験例 3
) o
[図 6]ペプチド濃度の違いによるアディポネクチン産生量（単位 DNA量あたり)を示す（ 実施例 1、試験例 4)。
[図 7]ペプチド濃度の違いによる蓄積脂肪量を示す (実施例 1、試験例 4)。
符号の説明
[0015] [図 1] 矢印は本発明の His- Pro- lie- Lys- His- Gin- Gly- Leu- Pro- Ginなるアミノ酸配 列を示す。
[図 4] 図中 1は本発明の His-Pro-Ile-Lysなるアミノ酸配列を、図中 2は本発明の His -Gin- Gly- Leu- Pro- Ginなるアミノ酸配列を示す。
[図 5] ペプチド消化物 1は本発明の His-Pro-Ile-Lysなるアミノ酸配列を、ペプチド消 化物 2は本発明の His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnなるアミノ酸配列を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明に用いることのできる His- Pro- lie- Lys- His- Gin- Gly- Leu- Pro- Gln、 His- Pro -Ile-Lys,あるいは His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnで表されるアミノ酸配列からなるぺプチ ドは、例えばチーズを溶媒に懸濁した後、脱脂、遠心分離によって不溶性物質の除 去を行って得ることができる。さらにその得られた画分力 タンパク質を除去してもよ い。本発明においてチーズを溶媒に懸濁するということは、チーズに溶媒をカ卩えて均 質化したり、または溶媒中で破砕したりして、水溶性ペプチド画分を得やすい大きさ にすることをいう。溶媒としては、水、リン酸緩衝液等の水性溶媒を用いることができる 。その後、透析膜やイオン交換榭脂等によって脱塩を行ってもよいし、さらに、凍結乾 燥や噴霧乾燥等によって乾燥させることにより粉末ィ匕してもよい。
[0017] また、式（1)〜（3)で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを得るためのチーズ原 料、また、本発明のチーズに含まれる成分を有効成分とする血中アディポネクチン濃 度増加促進及び Z又は減少抑制剤や血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又 は減少抑制用飲食品を得るためのチーズ原料としては、パルメザンチーズ、グリュイ エーノレチーズ、マリボーチーズ、ゴーダチーズ、チェダーチーズ、エメンターノレチー ズ、エダムチーズ、力マンべ一ノレチーズ、ブリーチーズ、マンステーノレチーズ、ポン' レヴェックチーズ、スチノレトンチーズ、ダナブルーチーズ、ブノレーチーズ等のナチユラ ルチーズ、及びこれらのナチュラルチーズを原料としたプロセスチーズ等を用いること ができる力 式（1)〜（3)で表されるアミノ酸配列力 なるペプチドを得るためには、 熟成度の進んだ乳酸菌熟成型ナチュラルチーズを用いることが望まし、。これらのチ ーズ自体を使用することもできるし、チーズを溶媒に懸濁した後、脱脂、不溶性物質 除去、タンパク質除去等を行った画分を使用することもできる。また、これらの画分を 透析膜やゲル濾過、イオン交換等の各種クロマトグラフィーにより精製した画分を使 用することもできる。なお、これらの画分については、濃縮や乾燥を行って使用するこ とちでさる。
[0018] さらに、チーズを溶媒に懸濁した後、脱脂、不溶性物質の除去及びタンパク質の除 去によって得られる式（1)〜（3)で表されるアミノ酸配列力 なるペプチドを含む画分 は、 C18カラムを用いた逆相クロマトグラフィーによりさらに精製することも可能である 。本ペプチドを含む画分をトリフルォロ酢酸 (TFA)等の酸性条件下あるいは蒸留水 等の中性条件下で C18カラムに通した時に、抗酸化活性を有する画分は、カラムに 吸着されない透過画分と、カラムに吸着されて 80%ァセトニトリルで溶出されてくる画 分に主として分かれる。
さらに、このペプチドを含む画分を蒸留水で溶解した後、 YMC- Pack ODS-A力 ラム（4.6mm X 150mm； YMC社）を用 、て逆相 HPLCに供してペプチドを分画する。 クロマトグラフィーは、溶媒 (A液： 50mM酢酸アンモ-ゥム水溶液； B液： 80%ァセトニ トリル）、濃度勾配（12%B→60%B,60min)、流速 0.8ml/min、検出波長 215nmの条件 で行うことが望ましい。
[0019] 本発明の式（1)〜（3)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び該ペプチドを 含む画分は、飲食品に配合して飲食品の品質劣化防止に使用することができる。飲 食品に配合する場合は、チーズを水中で摩砕した後、脱脂、遠心分離によって不溶 性物質の除去を行って、さらにタンパク質を除去することにより得たチーズの水溶性 ペプチドをそのまま配合することができるし、透析膜やイオン交換榭脂等によって脱 塩を行ったもの、さらに、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって乾燥を行い粉末ィ匕したもの も配合することができる。また、合成して得られたペプチドについても利用可能である
[0020] 本発明の式（1)〜（3)で表されるアミノ酸配列力 なる抗酸ィ匕作用を持つペプチド 及び該ペプチドを含む画分は、経口あるいは非経口的に投与して、生体において活 性酸素やフリーラジカル等を消去することにより疾病や老化等の進行を防止すること ができる。また、本発明の式（1)で表されるアミノ酸配列からなるアディポネクチン産 生促進作用を持つペプチド及び該ペプチドを含む画分は、経口あるいは非経口的 に投与して、生体においてアディポネクチン産生を促進することにより動脈硬化を抑 制し、肝臓や筋肉における脂肪の燃焼を促進することができる。経口あるいは非経口 的に投与する場合、本発明の抗酸化作用やアディポネクチン産生促進作用を持つ ペプチド、あるいは、チーズに含まれる成分を有効成分とする血中アディポネクチン 濃度増加促進及び Z又は減少抑制剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、 散剤、丸剤、トローチ、舌下剤または液剤等の経口投与用の製剤、あるいは、注射剤 、座剤等の非経口投与用の製剤を例示することができる。
[0021] 本発明の式（1)〜（3)で表されるアミノ酸配列力 なる抗酸ィ匕作用を持つペプチド 、あるいは本発明の式（1)で表されるアミノ酸配列力 なるアディポネクチン産生促進 作用を持つペプチドの経口による投与量は、治療や予防の目的、症状、体重、年齢 や性別等を考慮して適宜決定すればよいが、通常、成人 1日あたり、式（1)〜（3)で 表されるアミノ酸配列力もなる抗酸ィ匕作用を持つペプチド、あるいは本発明の式（1) で表されるアミノ酸配列力 なるアディポネクチン産生促進作用を持つペプチドとして
10 g〜500mg投与すれば、疾病や老化等に悪影響を及ぼす活性酸素やフリーラジ カル等による生体の酸ィ匕的障害を抑制する、あるいは、アディポネクチン産生を促進 する効果が得られる。このように本発明は低用量で効果がある。
また、本発明のチーズに含まれる成分を有効成分とする血中アディポネクチン増加 促進及び Z又は減少抑制剤や血中アディポネクチン増加促進及び Z又は減少抑制 用飲食品の投与量は、治療や予防の目的、症状、体重、年齢や性別等を考慮して 適宜決定すればよいが、成人の場合、 1食当たり 20〜200g程度のチーズに相当す る有効成分を摂取するようにする。
[0022] 本発明の式（1)〜（3)で表されるアミノ酸配列力 なるペプチドは、それらを配合し た飲食品または飼料を経口摂取することによって生体内で抗酸ィ匕作用あるいはアデ ィポネクチン産生促進作用を発揮するだけでなぐ飲食品または飼料に配合した飲 食品または飼料自体の酸ィ匕による劣化をも防ぐ。
また、本発明の血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制剤や血中 アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制用飲食品は、チーズに含まれ る成分を有効成分とする。さらに、本発明の血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制剤や血中アディポネクチン増加濃度促進及び Z又は減少抑制用飲 食品は、チーズに含まれる血中アディポネクチン濃度増加促進及び z又は減少抑 制作用を有する成分を配合する。
本発明の抗酸ィ匕用あるいはアディポネクチン産生促進用飲食品として、また、チー ズに含まれる成分を有効成分とする血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は 減少抑制用飲食品としては、、チーズ、バター、乳飲料、清涼飲料、ジュース、ョーグ ルト、ゼリー、パン、アイスクリーム、麵、ソーセージ、スナック菓子、ケーキ、プリン、ソ 一セージ、育児用調製乳や離乳食等を挙げることができる。
[0023] さらに、本発明の式（1)〜（3)で表されるアミノ酸配列からなる抗酸ィ匕作用を持つぺ プチドは、各ペプチド 1種だけを有効成分として抗酸化剤としたり、 1種だけを配合し て抗酸ィ匕用飲食品または飼料とすることもできるが、各ペプチド 1種以上を有効成分 として抗酸化剤としたり、 1種以上を配合して抗酸ィ匕用飲食品または飼料とすることも できる。
[0024] 以下に実施例及び試験例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは単に 例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例 1
[0025] (ゴーダチーズのペプチドの調製）
ゴーダチーズ 40gに蒸留水 160mlをカ卩え、ワーリンダブレンダー（日本精機製作所） で 15分間摩砕した後、ポリトロンホモジナイザー（キネマチ力社)で 30秒間さらに破砕 した。破砕時に生じた乳脂肪を取り除き、得られたチーズスラリー力も遠心分離 (6,00 0 X g、 20min、 4°C)で不溶物を除き、上清をろ紙 (No.113 ;ワットマン社）によりろ過した 。 得られたろ過液にエタノールを 70%濃度になるようにカ卩え、 4°Cでー晚静置した後 、遠心分離（9,000 X g、 20min、 4°C)により不溶物を除去し、エバポレーターでェタノ 一ルを除 、た後、凍結乾燥してゴーダチーズの水溶性ペプチド画分を得た。
この水溶性ペプチド画分を蒸留水で溶解した後、 YMC-Pack ODS-Aカラム (Y MC社; 4.6mm X 150mm)を用いて逆相 HPLCに供し、水溶性ペプチド精製画分に 分画した。クロマトグラフィーは、溶媒 (A液: 50mM酢酸アンモ-ゥム水溶液; B液: 80 %ァセトニトリル）、濃度勾配（12%B→60%B,60 min)、流速 0.8ml/min、検出波長 21 5nmの条件で行った。結果を図 1に示す。分画した画分の抗酸化活性を以下に示す 試験例 1の方法で測定したところ、クロマトグラムの矢印の画分に強い抗酸ィ匕活性が 確認された。
得られたゴーダチーズのペプチドにつ!/、て、液体クロマトグラフ質量分析計 (サーモ エレクトロン社)を用いて分子量を推定し、ペプチドシークェンサ一（アプライド 'バイ オシステムズ社)でアミノ酸配列を解析したところ、図 1の矢印で示される 6番が His-Pr o-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnなる配列であることが確認された。
このようにして得られたペプチドは、そのまま本発明の抗酸化剤あるいはアディポネ クチン産生促進剤として利用可能である。
[0026] [試験例 1]
(ペプチドの抗酸ィヒ活性測定） 実施例 1で分画したペプチドについて、リノール酸の酸ィ匕物が j8 -カロテンを退色さ せる作用を利用する方法で抗酸化活性を測定した。すなわち、 j8 -カロテン溶液（lm g/mlクロ口ホルム） 0.5ml、リノール酸溶液（100mg/mlクロ口ホルム） 0.2ml、ツイーン 40 溶液（200mg/mlクロ口ホルム） 1.0mlを 300 mlの三角フラスコに入れ、窒素ガスでクロ 口ホルムを完全に除去した後、 100mlの蒸留水をカ卩えて溶解した。さらに、 0.2Mリン酸 緩衝液 (PH7.0) 9.0 mlを添加して、リノール酸 · j8 -カロテン溶液を調製した。次に、あ らかじめペプチド画分 0.02 mlを分注した 98穴マイクロウェルプレートに、上記のリノ一 ル酸 · j8 -カロテン溶液 0.18 mlを加え、直ちに 490 nmの吸光度（S )を測定した。なお
0
、リノール酸 · j8 -カロテン溶液の調製に際しては、 Sが 1.2程度 (1.1〜1.3)になるように
0
-カロテン溶液の添加量を適宜増減した。 S測定後、直ちにマイクロウェルプレート
0
を 50°Cの恒温槽に入れ、 30分間インキュベートした。インキュベート終了後、直ちに 吸光度 (S )を測定し、 30分間における 490 nmの吸光度の低下量、 A S = S— S を算
30 0 30 出した。ブランクには試料の代わりに 70%エタノールを用い、同様の操作を行なった 。すなわち、リノール酸 · j8 -カロテン溶液を加えた直後の吸光度 (B )、及び 50°C
0 、 30 分間保持した後の吸光度 (B )を測定し、 30分間における 490 nmの吸光度の低下量
30
、 Δ Β = Β— B を求めた。抗酸ィ匕活性は次の式に代入し、抗酸ィ匕率（％)として表し
0 30
た。
[0027] [数 1] 抗酸化率 （％) = [ ΔΒ- A S] / ( ΔΒ) Χ ΙΟΟ
[0028] なお、ポジティブコントロールとして、筋肉由来抗酸ィ匕活性ペプチドであるカルノシ ン（ β - Ala- L- His；ペプチド研究所）を 0.01 μ g/ml、 0.1 μ g/ml、 1 μ g/mlに調製したも のを用いた。
[0029] 精製ペプチド及びポジティブコントロールとしてのカルノシンの抗酸ィ匕活性を測定し た結果を表 1に示す。
[0030] [表 1] 抗酸化活性 （％)
サンプル濃度 （yg/ml) 0. 01 0. 1 1 カルノシン （Ala-His) 32. 9 57. 8 78. 3
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 13. 0 41. 0 64. 6
[0031] 表 1に見られるように、ペプチドを添加すると、濃度依存的な抗酸化活性を示した。
以上、本試験例の結果により His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnで表され るアミノ酸配列力 なるチーズ由来のペプチドには抗酸ィ匕活性 (ラジカルス力べンジ ヤー活性)が認められ、活性酸素や過酸化脂質による酸化的細胞障害の予防'改善 に有用であることがわ力つた。
実施例 2
[0032] (ペプチドの合成） 上記の式（1)で表されるアミノ酸配列力 なるペプチドについて、 ペプチドシンセサイザ一にて合成を行った。ペプチドシンセサイザー 431 A (アプライ ド 'バイオシステムズ社）により、パラヒドロキシメチルフエノキシメチルポリスチレン（H MP)榭脂を用い、 9 フルォレニルメチルォキシカルボ-ル（Fmoc)基をァミノ末端 の保護基として C末端側力 ペプチド鎖を順次延長することにより 0.25mmolスケール で直鎖保護ペプチドを合成した。得られた HMP榭脂結合保護ペプチドをフエノール 1, 2—エタンジチオール、チオア-ノール存在下、トリフルォロ酢酸 (TFA)により ペプチドの HMP榭脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃縮によ り TFAを除去した後、ェチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、これを 5%酢酸に 溶解し凍結乾燥を行った。
得られた直鎖粗ペプチドを、 YMC- Pack ODS- Aカラム（YMC社; 4.6mm X 150m m)を用いた HPLCに供した。クロマトグラフィーは、溶媒 (A液： 50 mmol酢酸アンモ ニゥム水溶液； B液： 80%ァセトニトリル）、濃度勾配（12%B→60%B,60 min)、流速 0. 8ml/min、検出波長 215 の条件で行った。得られた直鎖精製ペプチドの純度は、 H PLCによる分析の結果 98%であった。結果を図 2に示す。
このようにして得られたペプチドは、そのまま本発明の抗酸化剤あるいはアディポネ クチン産生促進剤として利用可能である。
[0033] [試験例 2] (合成ペプチドの抗酸化活性測定）
実施例 2で得られたペプチドについて試験例 1と同様の方法で抗酸ィ匕活性を測定 した。ポジティブコントロールとして、筋肉由来抗酸ィ匕活性ペプチドであるカルノシン ( j8 - Ala- L- His ;ペプチド研究所)及びカテキン（和光純薬工業社）を 1 m、 lO ^ m, 1 00 m、に調製したものを用いた。合成ペプチドの抗酸ィ匕活性を評価した結果を表 2 及び図 3に示す。表 2及び図 3に示されるように、得られた合成ペプチドに強い抗酸 化活性が確認された。
[0034] [表 2] 抗酸化活性 （％)
サンプル濃度 （iim) 1 10 100 カテキン 52. 65 84. 45 97. 17 カルノシン 7. 07 21. 2 48. 41 合成べプチド 32. 86 61. 13 63. 6 実施例 3
[0035] (トリプシン消化物の調製）
実施例 2で得られたペプチドのトリプシン消化物を調製した。
実施例 2で得られたペプチドおよびトリプシン (シグマアルドリッチジャパン社)を、そ れぞれ lmg/mlになるように酵素反応溶液（50 mM Tris- HC1、 20mM CaCl、 pH8.0)
2 に溶解した。ペプチド溶液 500 1に、トリプシン溶液を 5 1添加して、 37°Cで 2時間反 応させた後、さらにトリプシン溶液 5 1を加えて、 37°Cで 18時間反応させてトリプシン 消化物を得た。
このトリプシン消化物を蒸留水で溶解した後、 YMC- Pack ODS-Aカラム（YMC 社; 4.6mm X 150mm)を用いて HPLCに供した。 HPLC分析は実施例 2のトリプシン 消化前のペプチドと同じ条件で行った。結果を図 4に示す。図に示されるように 2つの ピークに分かれた。
トリプシンで分解された 2つのフラグメント (His-Pro-Ile-Lys、ペプチド 1)及び（His-G ln-Gly-Leu-Pro-Gln,ペプチド 2)に相当する 2つのピークを、それぞれ 10回分回収し 、遠心エバポレーターを用いて乾燥して、トリプシン消化物である 2種のペプチドを得 た。得られた 2種のペプチド及び分画前のトリプシン消化物の抗酸ィ匕活性を以下に 示す試験例 3の方法で測定したところ、図 5に示されるように、合成ペプチドに強い抗 酸化活性が確認された。
このようにして得られた抗酸ィ匕作用を持つペプチドは、そのまま本発明の抗酸化剤 として利用可能である。
[0036] [試験例 3]
(ペプチドの抗酸ィヒ活性測定）
実施例 3で得られたトリプシン消化物である 2種のペプチド及び分画前のトリプシン 消化物について試験例 2と同様にカロテン退色法を用いて抗酸ィ匕活性を測定した。 ペプチド濃度はそれぞれのペプチドを 500 μ 1の純水に溶解して、 Micro BCA Protein assay kit (ピアース社)を用いて測定した。ポジティブコントロールとして、試験例 2と同 様に、カルノシン（ /3 - Ala- L- His；ペプチド研究所)及びカテキン (和光純薬工業社） を用いた。各フラグメントについて lng/ml、 10ng/mU 100ng/mlの希釈系列を調製し、 βカロテン退色法を用いて抗酸ィ匕活性を評価した。トリプシン消化ペプチドの抗酸ィ匕 活性を評価した結果を図 5に示す。図 5に示されるように、得られたトリプシン消化べ プチドに強！ヽ抗酸化活性が確認された。
[0037] [試験例 4]
(ペプチドの脂肪細胞投与実験）
実施例 1で得られたチーズから分離されたペプチドについて、初代培養内臓脂肪 細胞への投与実験を行った。
ラットの初代培養内臓脂肪細胞 (VAC01、セルガレージ社)及び内臓脂肪細胞分ィ匕 誘導培地 (セルガレージ社)を用いて実験を行った。セルガレージ社のプロトコルに従 つて凍結保存した細胞を融解し、 24穴プレートに播種した日を 0日目とし、 2日目、 5日 目、 7日目に合成ペプチドを溶解した培地 (ペプチド濃度: 100 Μ、 50 Μ、 10 Μ、 0 μ Μ)を加え、 8日間培養した。 5日目、 7日目、 8日目に培養上清を回収し、アディポネ クチン濃度を測定した。また、 8日目に細胞を回収し、細胞内のグリセロール 3-リン酸 脱水素酵素 (GPDH)酵素活性及び各ゥエルの DNA量、細胞内蓄積脂肪量を測定し た。 GPDHはグルコースからトリグリセリドを合成する際に働く酵素で、成熟脂肪細胞 が発現する。今回の培養系では、脂肪前駆細胞を分化させると同時に本発明のぺプ チドを投与してその影響を見た。
DNA量は、セルガレージ社の DNA定量キットを用い、定量を行った。
細胞内のグリセロール 3-リン酸脱水素酵素（GPDH)酵素活性は、セルガレージ社 の GPDH活性測定キットを用い、セルガレージ社プロトコルに従って測定を行った。測 定結果は各ゥエルカゝら抽出した DNA量で標準化した。
アディポネクチン濃度の測定は、大塚製薬社のアディポネクチン ELISAキットを用い 、培養上清中のアディポネクチン濃度を測定した。測定結果は各ゥエル力 抽出した DNA量で標準化した。
細胞内蓄積脂肪の定量は、セルガレージ社の脂肪染色キットを用い、オイルレッド 0による脂肪染色および吸光度測定による蓄積脂肪定量を行った。
(ペプチドの脂肪細胞投与実験結果）
各ゥエルの細胞由来 DNAを定量した結果、 Student's t-testでは、本発明ペプチド 無添加群と添加群の細胞 DNA量に有意差は検出されな力つた。
GPDH活性 (単位 DNA量あたり)を測定した結果、各ゥエルの細胞 DNA量で標準化 した GPDH活性において、ペプチド無添加群よりも本発明ペプチド 10 Mまたは 50 M添加群で有意に高い活性が見られた。ペプチド 100 M添加群と、無添加群との有 意な差は検出されなかった。
培養日数によるアディポネクチン濃度変化の測定結果では、培養 7日目でアディポ ネクチン産生量は最大になるが、 8日目では急激に減少することがわ力つた。培養上 清中のアディポネクチン濃度が最も高力つた 7日目で、投与したペプチド濃度の違い によるアディポネクチン産生量の違 、(単位 DNA量あたり)を図 6に示す。
ペプチド無添加で培養した細胞よりもペプチドを添カ卩した細胞のほうが、アディポネ クチンを有意に多く産生していた。この傾向は、特にペプチド濃度 10 Mもしくは 50 Mで添加したものにおいて顕著に見られた。この結果は、このチーズ由来のぺプ チドがアディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制作用をもたらす成分の一 つであることを示す。
しかし、本発明におけるアディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制作用 の有効成分はこれらのペプチドに限定されるものではなぐこの他にもさまざまな有効 成分が含まれて 、ると考えられる。
培養 8日目に、オイルレッド 0による脂肪染色および吸光度測定による蓄積脂肪量 の定量を行った結果を図 7に示す。
脂肪細胞の染色には固定が必要であるため、脂肪定量を行つたゥエルの細胞数（ 細胞 DNA量)を定量することはできない。しかし、同じ条件で培養した細胞の DNA定 量結果から、ペプチド添カ卩による細胞数への影響が見られな力つたことから、各ゥェ ルにはほぼ同数の細胞が存在すると推測される。 Studenfst-testでは、ペプチド無 添加で培養したものと、ペプチドを加えて培養したものの脂肪蓄積量に有意な差は 見られな力つた力 ペプチドを 100 M添カ卩した細胞では、図 7に示されるように脂肪 蓄積量がやや減少する傾向が見られた。
(ペプチドの脂肪細胞投与実験まとめ）
脂肪前駆細胞に本発明のペプチドを 10〜50 μ Μ添加して培養すると、
(1) GPDH活性が上がり、
(2)アディポネクチン産生量も増加するが、
(3)脂肪蓄積量には変化がな力つた。
この場合、ペプチド添カ卩によって脂肪前駆細胞力 脂肪細胞への分ィ匕が促進され て ヽるか、もしくは分化した熟成脂肪細胞における脂肪合成活性が促進されて ヽると 考えられる。し力しながら、ペプチド無添加の細胞と脂肪蓄積量には差がな力つたこ とから、何らかの別の分子メカニズムにより、合成された脂肪は分解されている可能性 がある。アディポネクチンは、成熟脂肪細胞力も分泌される善玉サイト力インであり、 本発明のペプチド添カ卩によってこのアディポネクチン産生促進効果が確認された。 以上のことから、本発明のペプチドには、脂肪前駆細胞力 脂肪細胞への機能的分 化を促し、アディポネクチンの産生量を増加させる作用があることが認められ、また、 細胞への脂肪蓄積は抑制する効果がある可能性が示唆された。
アディポネクチンには動脈硬化抑制作用などのほかに、肝臓や筋肉における脂肪 燃焼を促進する効果があると言われている。本発明のペプチドには、アディポネクチ ンを産生しやすい脂肪細胞をつくり、メタボリックシンドロームを予防する働きがあるこ とが考えられる。
一方、脂肪前駆細胞に本発明のペプチドを 100 M添加して培養すると、
(1) GPDH活性には変化がなぐ
(2)アディポネクチン産生量は増加し、
(3)脂肪蓄積量には変化がない (有意な差はないが、減少傾向が見られるようである
) o
これらの結果から、脂肪細胞に対する本発明のペプチドの効果には濃度によって 違いがあり、至適濃度が存在する可能性が示唆された。いずれにしても、本発明の ペプチド添カ卩により、アディポネクチン産生量を促進する作用が確認された。また、脂 肪蓄積量抑制効果があることには違いなぐ本発明ペプチドにメタボリックシンドロー ム予防効果がある可能性が示された。
なお、この His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnで表されるアミノ酸配列から なるペプチドのトリプシン分解物である His-Pro-Ile-Lys及び His-Gln-Gly-Leu-Pro- Glnで表されるアミノ酸配列力 なるペプチドにつ 、ても、同様のアディポネクチン産 生を促進する作用が確認された。
実施例 4
[0040] (細菌熟成タイプのチーズの調製）
原料乳を加熱殺菌（75°C、 15秒間）した後、 30°Cまで冷却し、 0.01%塩ィ匕カルシゥ ムを添加した。さらに、市販のチーズ製造用乳酸菌スターター（クリスチャン 'ハンセン 社） 1.5%及び多糖産生乳酸菌のラクトバチルス ·ヘルべチカス（L. helveticus) SBT21 71 (ΡΕΚΜΡ-14381) 30/(^ ¾υ、さらにレンネット 0.003%を添カ卩して、乳を凝固させ た。このようにして得られた凝乳をカッティングし、 ρΗが 6.2〜6.1となるまで撹拌してホ エーを排出して、カード粒を得た。そして、このカード粒を型詰めして圧搾し、さらに 加塩して、 10°Cで熟成させ、ゴーダチーズタイプの硬質ナチュラルチーズを調製した 。この硬質ナチュラルチーズ（12ヶ月熟成）をミンチ器 (GM-DX、 日本キャリア社製）に よりミンチし、凍結乾燥を行った。その後、コーヒーミルにより微細化し、チーズ粉を得 た。
[0041] [試験例 5] (血中アディポネクチン濃度増加促進及び z又は減少抑制作用の確認） 実施例 4で得たチーズ粉を使用して、血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z 又は減少抑制作用を確認した。動物実験は 1群 8匹とし、チーズ粉を配合した高脂肪 飼料を投与した群 (チーズ食群)、チーズ粉を配合した高脂肪飼料を投与せずコント ロール飼料を投与した群 (コントロール食群）として行った。コントロール飼料はチー ズの成分分析の結果 (表 3参照）を元に、一般成分、主要ミネラル、ビタミン E —ト コフエロール)の含有量を、チーズ粉を配合した高脂肪飼料にそろえ、タンパク質源と してミルクカゼイン、脂質源としてバターオイルを用いた。チーズ粉を配合した高脂肪 飼料では、タンパク質、脂質とも、チーズ成分のみでまかなった。
[0042] [表 3]
—チーズの成分
タンパク質 44. 8 (g/100g)
脂肪 43. 4
灰分 6. 3
ナトリウム 1050 (mg/100g)
カリウム 130
カルシウム 1190
マグネシウム 41
リン 850
鉄 0. 22
α—トコフエ口ール 0. 9 (mg/100g)
[0043] 動物実験は、飼育後 4週目まではコントロール飼料を与え、その後 2群に分けて 8週 目までコントロール飼料もしくはチーズ粉を配合した高脂肪飼料を与えた。 4週目、 8 週目に採血を行い、マウス Zラットアディポネクチン ELISAキット（大塚製薬社製)を用 いて血中アディポネクチン濃度を測定した。また、 8週目における血中トリグリセリド濃 度及び血中総コレステロール濃度を測定した。
[0044] 結果を表 4及び表 5に示す。これによるとコントロール食群の血中アディポネクチン 濃度は時間の経過によって減少しているのに対し、チーズ食群ではむしろ増加する ことが明ら力となった。つまり、チーズを摂取することにより、血中アディポネクチン濃 度が増加若しくは低下抑制されることが分った。また、血中トリグリセリド濃度はコント ロール食群に比べ、チーズ食群では有意に低下していた。一方、血中総コレステロ ール濃度においても有意差こそ見られな力つたが、チーズ食群で低下する傾向があ ることが分った。
[0045] [表 4] 血中アディポネクチン濃度の変化
血中アディポネクチン濃度 （ix g /ml)
食群 変化率 （％)
4週間 8週間
コント口一ル食群 11. 19 10. 40 93. 72
チーズ食群 10. 41 13. 14 129. 67
[0046] [表 5] 血中トリグリセリ ド濃度及ぴ血中総コレステロール濃度
トリグリセリ ド濃度 総コレステロ
食群 一ノレ濃度
(mg/dl) (mg/dl)
コントロール食群 111. 75 80. 38 チーズ食群 75. 63 68. 63 実施例 5
[0047] (錠剤の製造）
実施例 1で得られた抗酸化ペプチド（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln
) 20重量％、乳糖 (DMV社) 46重量％、結晶セルロース (和光純薬工業社) 31重量％
、水 3重量部を十分混合した後、打錠機 (富士薬品機械社製)により打錠し、本発明 の抗酸化用錠剤を製造した。
実施例 6
[0048] (果汁飲料の製造）
表 6に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の 実施例 2で得られた合成抗酸化ペプチド（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro- Gin)を配合した本発明の抗酸ィ匕用果汁飲料を製造した。
[0049] [表 6] 混合異性化糖 15. 4 (重量％) 果汁 10. 0
クェン酸 0. 5
抗酸化ぺプチド
(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gl n) 0. 1
香料 0. 2
水 73. 8 実施例 7
[0050] (清涼飲料水の製造）
表 7に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の 実施例 3で得られたトリプシン消化ペプチド (His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)を配合した 本発明の抗酸化用清涼飲料水を製造した。
[0051] [表 7] マノレチトーノレ 7. 5 (重量％) 50%乳酸溶液 0. 12
抗酸化ぺプチド（His~Gln- Gly-Leu_Pro- Gin) 0. 1
香料 0. 2
水 92. 08 実施例 8
[0052] (清涼飲料水の製造）
表 8に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の 実施例 3で得られたトリプシン消化ペプチド (His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln及び His-Pro -Ile-Lys)を配合した本発明の抗酸ィ匕用清涼飲料水を製造した。
[0053] [表 8] マノレチト一ノレ
50%乳酸溶液 0. 12
抗酸ィヒペプチド (His- -Pro-Ile-Lys) 0. 05
抗酸化ペプチド (His- -Gln-Gl y-Leu-Pro-Gl n) 0. 05
香料 0. 2
水 92. 08 実施例 9
表 9に示す組成のドウを作成し、成形した後、焙焼して本発明の実施例 1で得られ たペプチド（His- Pro- lie- Lvs-His-Gln-Gly- Leu- Pro-Gin )を配合した本発明の抗酸 化用ビスケットを製造した。
[表 9] 小麦粉 51. 0 (重量％) 砂糖 20. 0
食塩 0. 5
マーガリン 12. 5
卵 12. 5
水 2. 5
ミネラル混合物 0. 8
抗酸化ペプチド (実施例 1 ) 0. 2 実施例 10
[0056] 表 10に示す組成で各成分を混合し、本発明の実施例 1で得られた抗酸化ペプチド
(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu- Pro-Gin )を配合した本発明のィヌ飼育用飼料 を製造した。
[0057] [表 10] 大豆粕 12. 0 (重量％) 脱脂粉乳 14. 9
大豆油 4. 0
コーン油 2. 0
パ―ム油 28. 0
とうもろこし澱粉 15. 0
小麦粉 8. 0
ふすま 2. 0
ビタミン混合物 9. 0
ミネラル混合物 2. 0
セノレ口一ス 3. 0
抗酸化ペプチド (実施例 1 ) 0. 1 実施例 11
[0058] (錠剤の製造）
実施例 1で得られた抗酸化ペプチド（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 20重量％、乳糖 (DMV社) 46重量％、結晶セルロース（和光純薬工業社) 31重量％ 、水 3重量部を十分混合した後、打錠機 (富士薬品機械社)により打錠し、本発明の アディポネクチン産生促進用錠剤を製造した。
実施例 12
[0059] (果汁飲料の製造）
表 11に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明 の実施例 2で得られた合成ペプチド（His- Pro- lie- Lys- His- Gin- Gly- Leu- Pro- Gin) を配合した本発明のアディポネクチン産生促進用果汁飲料を製造した。
[0060] [表 11] 混合異性化糖 15. 4 (重量％) 果汁 10. 0
クェン酸 0. 5
ペプチド
(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gl n) 0. 1
香料 0. 2
水 73. 8 実施例 13
[0061] (チーズ羊羹の製造）
牛乳 200mlと粉寒天 2.5gをよく混ぜ加熱し、寒天を溶解後、砂糖 50gを加えて煮溶 かし、軽く沸騰させた。さら〖こ、チーズに含まれる有効成分を配合する目的でゴーダ チーズ 150gを 1ロ大にちぎってカ卩え、粗熱を取り、型に流し冷蔵庫で固め、血中アデ ィポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制用チーズ羊羹を得た。
実施例 14
[0062] (粉末チーズの製造）
チーズに含まれる有効成分を配合する目的でゴーダチーズ 10kgをミートチョッパー で細断し、溶融塩 (リン酸 Naを 1.2%、ポリリン酸 Naを 1%)、乳化剤（シュガーエステ ルを 0.6%)と共に 90°Cの熱水 5kgが入っている溶解タンク中に投入して pH6.2に調 整した後、撹拌、蒸気吹き込みにより乳化液を調製した。この乳化液を均質してフィ ルターでろ過し、噴霧乾燥を行い、血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は 減少抑制用粉末チーズを得た。
実施例 15
[0063] (スティック状栄養健康食品の製造）
実施例 15で得られた血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制用 粉末チーズ 100gと、ビタミン C40g、グラニュー糖 100g、コーンスターチと乳糖の等量 混合物 60gを混合し袋に詰め、血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少 抑制用のスティック状栄養健康食品を 100袋製造した。

Claims

請求の範囲
[I] 次の式（1)で表されるアミノ酸配列力 なる抗酸ィ匕作用を持つペプチド。
His- Pro- lie- Lys- His- Gin- Gly- Leu- Pro- Gin 式（ 1 )
[2] 次の式（2)で表されるアミノ酸配列力 なる抗酸ィ匕作用を持つペプチド。
His- Pro- lie- Lys 式（2)
[3] 次の式（3)で表されるアミノ酸配列力 なる抗酸ィ匕作用を持つペプチド。
His- Gin- Gly- Leu- Pro- Gin 式（3)
[4] 乳タンパク質に由来する請求項 1〜3のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なる抗酸 化作用を持つペプチド。
[5] 請求項 1〜4のいずれかに記載の 1以上のペプチドを有効成分とする抗酸化剤。
[6] 請求項 1〜4のいずれかに記載の 1以上のペプチドを配合した抗酸ィ匕用飲食品また は飼料。
[7] 次の式（1)で表されるアミノ酸配列力 なるアディポネクチン産生促進作用を持つぺ プチド。
His- Pro- lie- Lys- His- Gin- Gly- Leu- Pro- Gin 式（ 1 )
[8] 乳タンパク質に由来する請求項 7に記載のアミノ酸配列力もなるアディポネクチン産 生促進作用を持つペプチド。
[9] 請求項 7または 8に記載のペプチドを有効成分とするアディポネクチン産生促進剤。
[10] 請求項 7または 8に記載のペプチドを配合したアディポネクチン産生促進用飲食品ま たは飼料。
[I I] チーズに含まれる成分を有効成分とする血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制剤。
[12] チーズ自体を使用した請求項 11記載の血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減少抑制剤。
[13] チーズに含まれる成分が次の式（1)で表されるアミノ酸配列力 なるチーズ由来の ペプチドである請求項 11記載の血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減 少抑制剤。
His- Pro- lie- Lys- His- Gin- Glv- Leu- Pro- Gin 式 (1)
[14] チーズに含まれる成分を配合した血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は 減少抑制用飲食品。
[15] チーズ自体を配合した請求項 14記載の血中アディポネクチン濃度増加促進及び
Z又は減少抑制用飲食品。
[16] チーズに含まれる成分が次の式（1)で表されるアミノ酸配列力 なるチーズ由来の ペプチドである請求項 14記載の血中アディポネクチン濃度増加促進及び Z又は減 少抑制用飲食品。
His- Pro- lie- Lys- His- Gin- Glv- Leu- Pro- Gin 式 (1)
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