CN101432295B - 来自乳蛋白质的肽的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以具有抗氧化效果和促进脂连蛋白产生效果的下述肽作为有效成分的抗氧化剂和含有该抗氧化剂的饮食品、脂连蛋白产生促进剂和含有该脂连蛋白产生促进剂的饮食品，所述肽由His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln、His-Pro-Ile-Lys或His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln所示的氨基酸序列构成。本发明还涉及以干酪中含有的成分为有效成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂，或配合有该干酪中含有的有效成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品。

Description

来自乳蛋白质的肽的应用
技术领域
本发明涉及来自乳蛋白质的具有抗氧化作用的肽，以该肽作为有效成分的抗氧化剂和含有该肽的抗氧化用饮食品或饲料。 
另外，本发明还涉及来自乳蛋白质的具有促进脂连蛋白产生作用的肽，以该肽作为有效成分的脂连蛋白产生促进剂和含有该肽的促进脂连蛋白产生用的饮食品或饲料。 
另外，本发明还涉及以干酪中含有的成分作为有效成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂，或配合有干酪中含有的成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品。 
背景技术
由不饱和脂肪酸氧化而产生的过氧化物和自由基不仅损害食品的风味和营养价值等，引起品质劣化，而且在生物体中由于其强的氧化力在损伤细胞内的蛋白质和基因DNA的同时，也攻击构成细胞膜的脂质，制造毒性强的过氧化氢等过氧化脂质，引起细胞损伤或组织损伤。已知这样的活性氧和自由基对生物体的有害的蓄积会促进老化、引起包括癌症、动脉硬化和心脏病等生活习惯病。特别是由于生活习惯病与饮食生活密切相关，通过改善饮食来预防疾病的重要性正受到人们关注。因此，从通过食品成分来防止或抑制氧化应激的观点出发，正在进行有关食品的抗氧化性和食品成分之间关系的研究和具有抗氧化性的成分的探索。 
关于具有抗氧化性的成分，已知有来自植物的维生素和多酚等。关于维生素已有很多报道，特别是已经确认维生素C、维生素E和β-胡萝卜素等具有抗氧化性。关于多酚，已知儿茶素类和类黄酮等具有强烈的抗氧化性。另外，据报道从蛋白质的蛋白酶水解产物中已分离 和鉴定了各种各样的抗氧化肽，从卵清蛋白的酶分解物中分离了3种抗氧化肽(例如参照非专利文献1)。另外也有报道从大豆蛋白质的β-伴大豆球蛋白(conglycinin)的蛋白酶水解物中分离和鉴定出了6种抗氧化肽(例如参照非专利文献2)。 
另一方面，有关乳蛋白质的酶分解物，已知具有类鸦片活性作用、促进钙吸收作用、细胞增殖作用、抗菌作用、抑制血管紧张素I转化酶作用等多种生理作用。已经公开了：通过水溶性蛋白质溶液对鱼油等含有二十碳五烯酸的油脂进行乳化，抑制鱼油味的方法(例如参照专利文献1)，通过乳的部分水解物对含有高度不饱和脂肪酸的油脂进行乳化，获得氧化稳定性高的含有高度不饱和脂肪酸的油脂的粉末的方法(例如参照专利文献2)。另外，还公开了将含有高度不饱和脂肪酸的油脂、干酪和水进行乳化，制备抗氧化乳化物，由此防止含有高度不饱和脂肪酸的油脂氧化，掩蔽来自含有高度不饱和脂肪酸的鱼油的鱼腥或保存中的异味的方法(例如参照专利文献3)。然而，上述的含有高度不饱和脂肪酸的油脂的乳化物都是通过向含有高度不饱和脂肪酸的油脂中加入水溶性蛋白质溶液、乳的部分水解物、或干酪，乳化混合物而制得的。上述方法主要是用来防止含有高度不饱和脂肪酸的油脂的本身的鱼腥或保存中的异臭。但是，不与含有高度不饱和脂肪酸的油脂混合、乳化，而是靠来自乳蛋白质的肽单独具有抗氧化性的报告还很少。本发明人等发现干酪的水溶性肽级分具有抗氧化作用，申请了专利(参照专利文献4)。另外，还发现具有特定氨基酸序列的肽具有抗氧化作用(参照专利文献5)。然而这些肽尤其在霉促熟型的干酪中含有得特别多。从世界上干酪的产量来看，与霉促熟型的干酪相比，只用乳酸菌促熟的干酪的生产和消费要多得多。只用乳酸菌促熟的干酪还大量用作加工干酪的原料。因此期待从只用乳酸菌促熟的干酪中分离出显示高抗氧化作用的肽成分。 
如上所述，虽然已知活性氧和自由基对生物体的有害的蓄积会引起所谓的生活习惯病，但重要的是要对高血压、高脂血症、糖尿病等生活习惯病的发病和进展的危险因子进行预防。目前，在日本，由于 心脏疾病和脑血管病导致的死亡有逐年增加的倾向，由心血管疾病和脑血管疾病导致的死亡占死因的约三分之一，对心血管疾病和脑血管疾病的对策已成为国民课题。在这些动脉硬化性疾病中，已知由于高血压、高脂血症、耐糖能力障碍等危险因子集中在一个人时发病的危险度显著上升，这一危险因子集中的状态被称之为代谢综合征，已被人们广泛认识到。 
在代谢综合征的概念中，最要重视的是内脏脂肪的过剩蓄积。作为生物体最大分泌组织的脂肪组织产生各种内分泌因子，参与生物体中体内平衡的维持。然而伴随着内脏脂肪的过剩蓄积，会导致内分泌因子的分泌平衡遭到破坏，引起各种病理疾病。脂肪组织一直被认为只起着能量贮存的作用，但近年来，在考虑以生活习惯病为中心的代谢异常综合征的病理状态方面，脂肪组织的重要性已引起人们关注。即，脂肪组织分泌纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂、肿瘤坏死因子(TNF-α)、瘦素、脂连蛋白等内分泌因子，起着维持生物体内环境稳定的作用，已知其产生、分泌得过剩或过少的平衡破坏与糖和脂质代谢异常、高血压、动脉硬化的发病和进展密切相关。 
作为来自脂肪组织的内分泌因子之一的脂连蛋白(Adiponectin)是由244个氨基酸组成的30kDa的激素，除了具有抑制动脉硬化的作用等之外，据说还有促进肝脏和肌肉中的脂肪燃烧的效果。另外，还已知脂连蛋白具有促进血液中的葡萄糖和脂肪酸被吸收到细胞内的作用。如果脂肪在肌肉和肝脏等中蓄积，糖分的摄入变差，就会产生糖尿病。而且，通常人们认为脂连蛋白通过对暂时过剩的脂肪或糖分进行水解，保持体内的营养平衡，肥胖发展时，分泌脂连蛋白的脂肪细胞的作用变弱，以至于体内的营养平衡被破坏。 
已知脂肪组织特异分泌的脂连蛋白通常以高浓度存在于血中，但随着内脏脂肪蓄积，分泌减少。已知脂连蛋白具有抗糖尿病、抗动脉硬化、抗炎症、抗高血压等各种各样的生理功能，促进血中脂连蛋白浓度增加或抑制脂连蛋白浓度的减少在治疗代谢综合征方面正变得非常重要。
目前，作为对代谢综合征的各病理状态的对策也可以采用药物疗法，然而药物治疗需要处方而且会产生副作用。另外，即使对一种病理状态进行了治疗，其它病理状态也可能出现并严重病理状态发展，因此有必要调整存在于这些病理状态上游的来自于脂肪细胞的内分泌因子的分泌平衡。另外，在对由内脏脂肪蓄积引起的代谢综合征的治疗中，与药物疗法相比，运动疗法和食疗等生活方式的改变显得越发重要。因此，期望开发出日常即可摄取、长期摄取安全性也很高的、对由内脏脂肪蓄积引起的代谢综合征的治疗有效的饮食品。 
最近，除了通过合成药物进行治疗外，对于具有通过饮食生活尽可能抑制病情发展的功能的食品成分的研究也逐渐受到关注。 
关于脂连蛋白，已知脂连蛋白具有抑制肝纤维化和促进正常肝细胞增殖的效果和抗炎症效果(例如参照专利文献6)，作为来自饮食品的促进脂连蛋白产生的促进物，已公开了以发酵茶提取物作为有效成分的组合物(例如参照专利文献7)，由被称为余甘子的属于叶下珠属(Phyllanthus urinaria)的落叶亚乔木提取物构成的增强血中脂肪组织特异分泌蛋白的组合物(参照例如专利文献8)。 
另外，据报道尽管干酪是含有高脂肪的食品，但具有促进血中甘油三酯浓度降低的作用和改善胆固醇代谢的作用(参照专利文献9、专利文献10)。然而，作为干酪的功能，有关其促进血中脂连蛋白浓度增加的作用、或抑制血中脂连蛋白浓度减少的作用，还没有报道。 
专利文献1：特开昭60-102168号公报 
专利文献2：特开平2-305898号公报 
专利文献3：特开平7-274823号公报 
专利文献4：特开2004-352958号公报 
专利文献5：特愿2005-294358号公报 
专利文献6：特开2000-256208号公报 
专利文献7：特开2002-363094号公报 
专利文献8：特开2006-56836号公报 
专利文献9：特开2003-300890号公报
专利文献10：特开2003-144090号公报 
非专利文献1：柘植信昭等人，日本农艺化学会志，65号，p.1635，1991年 
非专利文献2：Chen，H.M.等人，J.Agric.Food Chem.，43号，p.574，1995年 
发明内容
发明要解决的课题 
本发明的课题在于提供对抑制由活性氧、自由基等产生的生物体的氧化损伤具有有效的抗氧化作用的肽，而活性氧和自由基不仅损害食品的风味和营养价值等、引起品质劣化，而且在生物体内对疾病和老化等有不良影响。另外，本发明的课题还在于提供通过在生物体内促进脂连蛋白产生，抑制动脉硬化、促进肝脏和肌肉中脂肪燃烧的肽。 
另外，本发明的课题还在于提供促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂，或促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品，通过摄取它们，有利于促进血中脂连蛋白浓度的增加，或抑制其减少中，而且它们以日常可摄取的干酪中含有的成分作为有效成分。 
用于解决课题的方法 
本发明人等为了解决上述课题不断进行深入研究，结果发现，由下述式(1)～(3)所示的任一个氨基酸序列构成的肽具有抗氧化效果，而且在低用量下就有效果，直至完成了本发明。 
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln            式(1) 
His-Pro-Ile-Lys                                式(2) 
His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln式(3) 
即，本发明涉及由上述式(1)～(3)中任一个所示的氨基酸序列构成的具有抗氧化作用的肽。 
另外，本发明还涉及来自乳蛋白质的由式(1)～(3)中任一个所示的氨基酸序列构成的具有抗氧化作用的肽。
另外，本发明还涉及由式(1)～(3)中任一个所示的1个以上的肽作为有效成分的抗氧化剂。 
另外，本发明还涉及含有式(1)～(3)中任一个所示的1个以上的肽的抗氧化用饮食品或饲料。 
另外，本发明人等还发现由上述式(1)所示的氨基酸序列构成的肽具有促进脂连蛋白产生的效果，而且低用量下即有效果，直至完成了本发明。 
即，本发明还涉及由上述式(1)所示的氨基酸序列构成的具有促进脂连蛋白产生作用的肽。 
另外，本发明还涉及来自乳蛋白质的由上述式(1)所示的氨基酸序列构成的具有促进脂连蛋白产生作用的肽。 
另外，本发明还涉及以式(1)所示的肽作为有效成分的脂连蛋白产生促进剂。 
另外，本发明还涉及含有由式(1)所示的肽的促进脂连蛋白产生用饮食品或饲料。 
在此基础上，本发明人等还从通过日常可摄取的食品素材是否能够预防和改善生物体的各种机能异常的观点出发，着眼于干酪中含有的成分，确认其生理功能，结果发现，某些成分具有促进血中脂连蛋白浓度增加，或抑制血中脂连蛋白减少的作用。 
然后发现，通过提供利用上述生理功能的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂、或促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品，可以促进血中脂连蛋白浓度的增加，或抑制血中脂连蛋白浓度的减少，直至完成了本发明。 
即，通过提供利用干酪中含有的促进血中脂连蛋白浓度增加作用、或抑制血中脂连蛋白浓度减少作用、以干酪中含有的成分作为有效成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂，或配合有干酪中含有的成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品，能够解决课题。本发明人等对干酪中含有的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的有效成分进行了深入的研究，结果最终 发现作为有效成分之一的干酪中含有的肽。 
发明效果 
本发明的由式(1)～(3)中任一个所示的氨基酸序列构成的具有氧化作用的肽，可有效抑制由活性氧、自由基等产生的生物体的氧化损伤，而活性氧和自由基不仅损害食品的风味和营养价值等、引起品质劣化，而且在生物体内对疾病和老化等有不良影响。以该肽为有效成分的抗氧化剂，以及含有该肽的抗氧化用饮食品或饲料也是有效的。 
而且，本发明的由式(1)所示的氨基酸序列构成的具有促进脂连蛋白产生的作用的肽对于促进脂连蛋白的产生是有效的，以该肽为有效成分的脂连蛋白产生促进剂，以及含有该肽的促进脂连蛋白产生用饮食品或饲料也是有效的。 
近而，本发明的以干酪中含有的成分作为有效成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂、促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品，由于通过摄取它们，可促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少，所以对于抑制内脏脂肪的过剩蓄积，治疗和预防血栓症、胰岛素抗性、糖代谢异常、高血压等代谢综合征是有效的。 
附图说明
图1表示以古乌达干酪为原料的水溶性肽级分的分离色谱(实施例1)。 
图2表示合成肽级分的分离色谱(实施例2)。 
图3表示合成肽级分的抗氧化活性评价(实施例2、试验例2)。 
图4表示胰蛋白酶消化后的肽级分的分离色谱(实施例3)。 
图5表示胰蛋白酶消化后的肽级分的抗氧化活性评价(实施例3、试验例3)。 
图6表示由肽浓度的差异而表现出的脂连蛋白产量(每单位DNA量)(实施例1、试验例4)。
图7表示由肽浓度的差异表现出的脂肪蓄积量(实施例1、试验例4)。 
符号说明 
图1中，箭头表示本发明的His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln氨基酸序列。 
图4中，1表示本发明的His-Pro-Ile-Lys氨基酸序列，2表示本发明的His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln氨基酸序列。 
图5中，肽消化物1表示本发明的His-Pro-Ile-Lys氨基酸序列，肽消化物2表示本发明的His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln氨基酸序列。 
具体实施方式
本发明可用的由His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln、His-Pro-Ile-Lys或His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln所示的氨基酸序列构成的肽，例如通过将干酪混悬于溶剂中后，经脱脂、离心分离，除去不溶性物质而得到。也可以进一步从得到的该级分中除去蛋白质。本发明中所谓将干酪混悬于溶剂是指，或向干酪中加溶剂进行均质化，或在溶剂中进行粉碎，从而制成容易获得水溶性肽级分的大小。作为溶剂，可以使用水、磷酸缓冲液等水性溶剂。然后也可以通过透析膜或离子交换树脂等进行脱盐，也可以再通过冷冻干燥或喷雾干燥等使其干燥而粉末化。 
另外，作为用于获得由式(1)～(3)所示的氨基酸序列构成的肽的干酪原料，以及作为用于获得本发明的以干酪中含有的成分作为有效成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂和促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品的干酪原料，可以使用巴马干酪、格鲁耶尔干酪、马利波干酪、古乌达干酪、切达干酪、爱芒特干酪、荷兰干酪、卡门伯特干酪、布里干酪、蒙斯特干酪、彭雷维克干酪、斯提耳顿干酪、牛奶半硬干酪、青纹干酪等天然干酪，以及以这些天然干酪作为原料进行加工的加工干酪等，为了获得由式(1)～(3)所示的氨基酸序列构成的肽，优选使用催熟度高的乳酸 菌促熟型天然干酪。另外，既可以使用这些干酪本身，也可以使用将干酪混悬于溶剂中后，进行脱脂、除去不溶性物质、除去蛋白质等操作而得到的级分。另外，也可以使用将这些级分利用透析膜或者凝胶渗透色谱、离子交换色谱等各种色谱进行了纯化的级分。这些级分也可以经浓缩或干燥后使用。 
另外，将干酪混悬于溶剂后，通过脱脂、除去不溶性物质和除去蛋白质而得到的含有由式(1)～(3)所示的氨基酸序列构成的肽的级分也可以通过使用C18柱的反相色谱进行进一步纯化。将含有该肽的级分在三氟乙酸(TFA)等酸性条件或蒸馏水等中性条件下通过C18柱时，具有抗氧化活性的级分主要被分成：没被柱子吸附的透过级分和吸附于柱上、用80％乙腈洗脱下来的级分。 
然后将含有该肽的级分用蒸馏水溶解后，使用YMC-Pack ODS-A柱(4.6mm×150mm；YMC公司)进行反相HPLC，对肽进行分级。色谱优选在溶剂(A液：50mM乙酸铵水溶液；B液：80％乙腈)、浓度梯度(12％B→60％B，60分钟)、流速0.8ml/分钟、检测波长215nm的条件下进行。 
本发明的由式(1)～(3)所示的氨基酸序列构成的肽和含有该肽的级分可以配合到饮食品中，用于防止饮食品的品质劣化。当配合到饮食品中时，将干酪在水中磨碎后，经脱脂、离心分离而除去不溶性物质，再通过除去蛋白质而得到的干酪的水溶性肽，可以直接进行配合。也可以配合通过透析膜或离子交换树脂等进行脱盐后的产物，以及再经冷冻干燥或喷雾干燥等进行了干燥而粉末化的产物。另外，也可以利用合成获得的肽。 
本发明的由式(1)～(3)所示的氨基酸序列构成的肽和含有该肽的级分经口服或非口服给予后，在生物体内可以通过消除活性氧和自由基等来防止疾病和老化等的进行。另外，本发明的由式(1)所示的氨基酸序列构成的具有促进脂连蛋白产生作用的肽和含有该肽的级分经口服或非口服给予后，在生物体内可以通过促进脂连蛋白产生，抑制动脉硬化，促进肝脏和肌肉中的脂肪燃烧。经口服或非口服给予 时，作为本发明的具有抗氧化作用或促进脂连蛋白产生作用的肽、或以干酪中含有的成分作为有效成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂的剂型，例如可举出片剂、胶囊、颗粒、粉末、丸剂、糖锭、舌下剂或液体制剂等口服制剂，或注射剂、栓剂等非口服制剂。 
本发明的由式(1)～(3)所示的氨基酸序列构成的具有抗氧化作用的肽，或本发明的由式(1)所示的氨基酸序列构成的具有促进脂连蛋白产生作用的肽的口服剂量可以考虑治疗或预防目的、症状、体重、年龄和性别等而适当决定，通常，如果成人每天给予由式(1)～(3)所示的氨基酸序列构成的具有抗氧化作用的肽，或本发明的由式(1)所示的氨基酸序列构成的具有促进脂连蛋白产生作用的肽10μg～500mg，即可以获得抑制由对疾病和老化等有不良影响的活性氧和自由基产生的生物体的氧化损伤的效果，或促进脂连蛋白产生的效果。则本发明在低用量下即有效果。 
另外，本发明的以干酪中含有的成分作为有效成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂和促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品的给予量可以在考虑治疗或预防目的、症状、体重、年龄和性别等后适当决定，成人每次摄取的有效成分相当于20～200g左右的干酪。 
通过口服摄取含有本发明的由式(1)～(3)所示的氨基酸序列构成的肽的饮食品或饲料，不仅在生物体内发挥抗氧化作用或促进脂连蛋白产生作用，而且也可防止配合到饮食品或饲料的饮食品或饲料本身的氧化引起的劣化。 
本发明的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂和促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品以干酪中含有的成分为有效成分。近而，本发明的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的制剂、促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品配合有干酪中含有的具有促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少作用的成分。
作为本发明的抗氧化用或促进脂连蛋白产生用的饮食品，以及作为以干酪中含有的成分为有效成分的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的饮食品，例如可举出干酪、黄油、乳饮料、清凉饮料、果汁、酸奶、果冻、面包、冰淇淋、面条、香肠、快餐点心、饼干、布丁、腊肠、婴幼儿用调制乳或断奶食品等。 
另外，本发明的由式(1)～(3)所示的氨基酸序列构成的具有抗氧化作用的肽，可以被制成只以各肽中的1种肽作为有效成分的抗氧化剂，或者只配合1种肽的抗氧化用饮食品或饲料，也可以被制成以各肽中的1种以上作为有效成分的抗氧化剂，或者配合了1种以上肽的抗氧化用饮食品或饲料。 
以下给出实施例和试验例，对本发明进行更详细地说明，但这些只是例举的例子，本发明并不受这些实施例和试验例的任何限定。 
实施例1 
(古乌达干酪的肽的制备) 
在40g古乌达干酪中加入160ml蒸馏水，用旋转搅拌机(日本精机制作所)进行15分钟磨碎后，再用Polytron均化器(Kinematica公司)进行30秒粉碎。除去粉碎时产生的乳脂，所得干酪浆通过离心分离(6000×g、20分钟、4℃)除去不溶物，将上清液用滤纸(No.113；Whatman公司)过滤。向所得滤液中加入乙醇，使乙醇终浓度达到70％，于4℃下静置过夜后，通过离心分离(9000×g、20分钟、4℃)除去不溶物，用蒸发器除去乙醇后，经冷冻干燥得到古乌达干酪的水溶性肽级分。 
将该水溶性肽级分用蒸馏水溶解后，使用YMC-Pack ODS-A柱(YMC公司；4.6mm×150mm)进行反相HPLC，分级出水溶性肽纯化级分。色谱优选在溶剂(A液：50mM乙酸铵水溶液；B液：80％乙腈)、浓度梯度(12％B→60％B，60分钟)、流速0.8ml/分钟、检测波长215nm的条件下进行。结果如图1所示。当用以下所示的试验例1的方法测定分级出的级分的抗氧化活性时，确认色谱的箭头的级分具有强的抗氧化活性。
对所得古乌达干酪的肽使用液相质谱仪(Nippon Thermo公司)推定分子量，使用肽序列分析仪(Applied Biosystems公司)对氨基酸序列进行解析，确认图1中箭头所指的是His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln序列。 
由此所得的肽可直接用作本发明的抗氧化剂或脂连蛋白产生促进剂。 
[试验例1] 
(肽的抗氧化活性测定) 
对实施例1中分级的肽，通过利用亚油酸的氧化物使β-胡萝卜素退色的作用的方法测定抗氧化活性。即，将0.5ml的β-胡萝卜素溶液(1mg/ml氯仿)、0.2ml亚油酸溶液(100mg/ml氯仿)、1.0ml吐温40溶液(200mg/ml氯仿)加入到300ml的三角烧瓶中，用氮气将氯仿完全除去后，加100ml的蒸馏水进行溶解。然后再添加9.0ml0.2M磷酸缓冲液(pH7.0)，制备亚油酸·β-胡萝卜素溶液。然后，向事先已分注了肽级分0.02ml的98孔微孔板加入上述的亚油酸·β-胡萝卜素溶液0.18ml，立刻测定490nm的吸光度(S0)。予以说明，在制备亚油酸·β-胡萝卜素溶液时，可适当增减β-胡萝卜素溶液的添加量以使S0达到1.2左右(1.1～1.3)。测定S0后，立刻将微孔板放入到50℃的恒温槽中，温育30分钟。温育结束后，立刻测定吸光度(S30)，算出30分钟内的490nm的吸光度的下降量ΔS＝S0-S30。作为空白使用70％乙醇代替样品，进行同样的操作。即，测定刚添加亚油酸·β-胡萝卜素溶液时的吸光度(B0)以及在50℃下保持30分钟后的吸光度(B30)，求出30分钟内的490nm的吸光度的下降量ΔB＝B0-B30。代入下数公式，抗氧化活性以抗氧化率(％)表示。 
[数1] 
抗氧化率(％)＝[ΔB-ΔS]/(ΔB)×100 
作为阳性对照，使用来自肌肉的抗氧化活性肽——肌肽(β-Ala-L-His；肽研究所)，配制成浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml 的样品。 
表1给出了纯化肽以及作为阳性对照的肌肽的抗氧化活性的测定结果。 
[表1]抗氧化活性(％) 
Figure G2007800154883D00131
由表1可以看出，添加肽后，显示出了浓度依赖性抗氧化活性。 
以上，通过本试验例的结果确认，由His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln所示的氨基酸序列构成的来自干酪的肽具有抗氧化活性(自由基清除剂活性)，对于由活性氧或过氧化脂质氧化所导致的细胞损伤的预防和改善是有用的。 
实施例2 
(肽的合成) 
对由上述式(1)所示的氨基酸序列构成的肽通过肽合成仪进行合成。利用肽合成仪431A(Applied Biosystems公司)，使用对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂，9-芴甲氧羰基(Fmoc)作为氨基末端的保护基，从C末端一侧开始通过依次延长肽链，以0.25mmol等级合成直链保护肽。由此得到结合了HMP树脂的保护肽。然后在酚、1，2-乙二硫醇、苯甲硫醚的存在下，通过三氟乙酸(TFA)将该肽从HMP树脂上切下，同时除去保护基。通过减压浓缩除去TFA后，用乙醚使粗肽结晶，将它溶解于5％乙酸中，进行冷冻干燥。 
将得到的粗肽使用YMC-Pack ODS-A柱(4.6mm×150mm；YMC公司)进行HPLC。色谱优选在溶剂(A液：50mM乙酸铵水溶液；B液：80％乙腈)、浓度梯度(12％B→60％B，60分钟)、流速0.8ml/分钟、检测波长215nm的条件下进行。得到的直链纯化肽的纯度经HPLC分析的结果为98％。结果如图2所示。 
由此所得的肽可直接用作本发明的抗氧化剂或脂连蛋白产生促进剂。
[试验例2] 
(合成肽的抗氧化活性测定) 
对于实施例2得到的肽使用与试验例1同样的方法测定抗氧化活性。作为阳性对照，使用来自肌肉的抗氧化活性肽肌肽(β-Ala-L-His；肽研究所)和儿茶素(和光纯药工业公司)配制成1μm、10μm、100μm的样品。合成肽的抗氧化活性的评价结果如表2和图3所示。如表2和图3所示，确认得到的合成肽具有强的抗氧化活性。 
[表2] 
抗氧化活性(％) 
实施例3 
(胰蛋白酶消化物的制备) 
制备实施例2中得到的肽的胰蛋白酶消化物。 
将实施例2中得到的肽和胰蛋白酶(Sigma Aldrich Japan公司)分别溶解于酶反应液(50mM Tris-HCl，20mM CaCl2、pH8.0)，使浓度分别为1mg/ml。向500μl肽溶液中添加5μl胰蛋白酶溶液，在37℃下反应2小时后，再加入5μl胰蛋白酶溶液，在37℃下反应18小时，得到胰蛋白酶消化物。 
将该胰蛋白酶消化物用蒸馏水溶解后，使用YMC-Pack ODS-A柱(4.6mm×150mm；YMC公司)进行反相HPLC。HPLC分析在与实施例2的胰蛋白酶消化前的肽相同条件下进行。结果示于图4。如图所示，分成了两个峰。 
将相当于被胰蛋白酶分解的两个肽段(His-Pro-Ile-Lys，肽1)和(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln，肽2)的两个峰分别回收10次，使用离心蒸发器干燥，得到作为胰蛋白酶消化物的2种肽。用以下所示的试验例3的方法对得到的2种肽和分级前的胰蛋白酶消化物的抗氧 化活性进行测定，如图5所示，确认合成肽有强的抗氧化活性。 
上述得到的具有抗氧化作用的肽可直接用作本发明的抗氧化剂。 
[试验例3] 
(肽的抗氧化活性测定) 
对实施例3得到的作为胰蛋白酶消化物的2种肽以及分级前的胰蛋白酶消化物与试验例2同样地使用胡萝卜素退色法测定抗氧化活性。肽浓度通过将各个肽分别溶解于500μl的纯水中，使用Micro BCA蛋白分析试剂盒(Pierce公司)进行测定。作为阳性对照，与试验例2同样地使用肌肽(β-Ala-L-His；肽研究所)和儿茶素(和光纯药工业公司)。将各片段配制成1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的稀释系列，使用β-胡萝卜素退色法评价抗氧化活性。胰蛋白酶消化肽的抗氧化活性的评价结果示于图5。如图5所示，确认得到的胰蛋白酶消化肽具有强的抗氧化活性。 
[试验例4] 
(肽给予脂肪细胞的实验) 
对实施例1得到的由干酪分离出的肽，进行给予初代培养内脏脂肪细胞的实验。 
使用大鼠的初代培养内脏脂肪细胞(VAC01，Cell Garage公司)和内脏脂肪细胞分化诱导培养基(Cell Garage公司)进行实验。根据Cell Garage公司的方案对冷冻保存的细胞进行融解，将接种到24孔板的日定为第0日，然后于第2日、第5日、第7日添加溶解了合成肽的培养基(肽浓度：100μM、50μM、10μM、0μM)，培养8日。于第5日、第7日、第8日回收培养的上清液，测定脂连蛋白浓度。另外，在第8日回收细胞，测定细胞内的甘油3-磷酸脱氢酶(GPDH)酶活性和各孔的DNA量、细胞内蓄积的脂肪量。GPDH是在由葡萄糖合成甘油三酯时起作用的酶，表达成熟脂肪细胞。在本培养系中，在使脂肪前体细胞分化的同时给予本发明的肽，观察给予效果。 
DNA量使用Cell Garage公司的DNA定量试剂盒进行定量。 
细胞内的甘油3-磷酸脱氢酶(GPDH)的酶活性使用Cell Garage 公司的GPDH活性测定试剂盒，根据Cell Garage公司的方案进行测定。测定结果用从各孔中提取的DNA量标准化。 
脂连蛋白浓度的测定使用大冢制药公司的脂连蛋白ELISA试剂盒，测定培养上清液中的脂连蛋白浓度。测定结果用从各孔提取的DNA量标准化。 
细胞内蓄积脂肪的定量使用Cell Garage公司的脂肪染色试剂盒，用油红0进行脂肪染色，通过测定吸光度对蓄积脂肪量进行定量。 
(肽给予脂肪细胞的实验结果) 
对来自各孔的细胞的DNA进行定量，结果，在学生t检验中没有检测出未添加本发明肽的组和添加组的细胞DNA量有显著性差异。 
测定GPDH活性(每单位DNA量)的结果表明，在用各孔的细胞DNA量标准化的GPDH活性中，与未添加肽的组相比，在添加本发明肽10μM或50μM的添加组中发现显著的高活性。在100μM肽添加组与未添加组之间没有检测出显著性差异。 
从经数日培养的脂连蛋白浓度变化的测定结果可知，培养第7日时脂连蛋白产量为最大，而在第8日时便急剧减少。图6表示在培养上清液的脂连蛋白浓度最高的第7日给予肽浓度的不同所引起的脂连蛋白产量的不同(每单位DNA量)。 
与未添加肽进行培养的细胞相比，添加了肽培养的细胞产生的脂连蛋白显著增多。这种倾向特别是在添加的肽浓度为10μM或50μM的细胞中明显看到。该结果表明来自干酪的肽是产生促进脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的作用的成分之一。 
但是，本发明中的促进脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的作用的有效成分并不限定于这些肽，除此之外还包括各种各样的有效成分。 
图7给出了在培养第8日，经油红0进行脂肪染色和通过测定吸光度进行蓄积脂肪量的定量的结果。 
由于要进行脂肪细胞的染色需要固定，所以不能对进行了脂肪定量的孔的细胞数(细胞DNA量)进行定量。然而，由于没有看到添加肽对细胞数的影响，所以可以由在同样条件下培养的细胞的DNA定量 结果推测，在各孔中几乎存在相同数量的细胞。在学生t检验中，未添加肽培养的细胞与添加肽培养的细胞的脂肪蓄积量没有显著性差异，但在添加100μM肽的细胞中，看到如图7所示那样脂肪蓄积量有略微减少的倾向。 
(肽给予脂肪细胞的实验总结) 
当向脂肪前体细胞中添加10～50μM本发明的肽进行培养时， 
(1)GPDH活性上升， 
(2)脂连蛋白产量也增加， 
(3)脂肪蓄积量没有变化。 
此时，认为添加肽可以促进由脂肪前体细胞向脂肪细胞的分化，或促进分化了的成熟脂肪细胞中的脂肪合成活性。然而，由于与未添加肽的细胞相比在脂肪蓄积量上没有差异，因此存在通过其它某种分子机制分解合成脂肪的可能性。脂连蛋白是由成熟脂肪细胞分泌的有益细胞因子，已确认通过添加本发明的肽有促进该脂连蛋白产生的效果。由以上实验可证实本发明的肽有促进脂肪前体细胞向脂肪细胞分化的功能，有使脂连蛋白的产量增加的作用，并且暗示存在具有抑制脂肪向细胞蓄积的效果的可能性。 
脂连蛋白被认为除了具有抑制动脉硬化等作用之外，还有促进肝脏和肌肉中的脂肪燃烧的效果。认为本发明的肽具有制造易产生脂连蛋白的脂肪细胞、预防代谢综合征的功能。 
当向脂肪前体细胞中添加100μM本发明的肽进行培养时， 
(1)GPDH活性没有变化， 
(2)脂连蛋白产量增加， 
(3)脂肪蓄积量没有变化(没有显著差异，但看到有减少倾向)。 
这些结果可知，本发明的肽对脂肪细胞的效果因浓度的不同而不同，这按时可能存在最佳浓度。但均可确认通过添加本发明的肽，有促进脂连蛋白产量的作用。另外，确认本发明的肽同样具有抑制脂肪蓄积量的效果。这暗示本发明肽存在具有预防代谢综合征的效果。 
另外确认，作为由该His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro- Gln所示的氨基酸序列构成的肽的胰蛋白酶分解物，由His-Pro-Ile-Lys或His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln所示的氨基酸序列构成的肽也同样具有促进脂连蛋白产生的作用。 
实施例4 
(细菌促熟型干酪的制备) 
将原料乳加热灭菌(75℃，15秒)后，冷却至30℃，添加0.01％氯化钙。再添加1.5％市售的干酪制造用乳酸菌发酵剂(ChristianHansen公司)以及3％产生多糖的乳酸菌即瑞士乳杆菌(L.helveticus)SBT2171(FERMP-14381)，再加0.003％粗制凝乳酶，使乳凝固。将由此得到的凝乳切割，搅拌直至pH达到6.2～6.1后排出乳清，得到凝乳粒。然后将凝乳粒装入模具中进行压制，再加盐，在10℃下使其熟化，制备古乌达干酪类型的硬质天然干酪。将该硬质天然干酪(熟化12个月)用绞肉机(GM-DX，Nippon Career Industry公司制造)绞碎，进行冷冻干燥。然后经咖啡研磨机微细化，得到干酪粉。 
[试验例5] 
(促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的作用的确认) 
使用实施例4得到的干酪粉，确认促进脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少的作用。动物实验1组8只，分为给予配有干酪粉的高脂肪饲料组(干酪饲料组)、不给予配有干酪粉的高脂肪饲料而给予对照饲料的组(对照饲料组)进行。对照饲料是以干酪的成分分析结果(参照表3)为基准，一般成分、主要矿物质、维生素E(α-生育酚)的含量与配有干酪粉的高脂肪饲料一致，作为蛋白质源使用乳酪蛋白，作为脂质源使用黄油。在配有干酪粉的高脂肪饲料中，蛋白质、脂质都只靠干酪成分供给。 
[表3]
Figure G2007800154883D00191
动物实验为首先给予对照饲料至第4周，然后分成2组，再给予4周(即，至第8周)对照饲料或配合有干酪粉的高脂肪饲料。在第4周、第8周进行采血，使用小鼠/大鼠脂连蛋白ELISA试剂盒(大冢制药公司制)测定血中脂连蛋白浓度。另外，在第8周测定血中甘油三酯浓度以及血中总胆固醇浓度。 
结果示于表4和表5。结果表明对照饲料组的血中脂连蛋白浓度经时减少，与此相比，干酪饲料组的血中脂连蛋白浓度经时增加。即，可见通过摄取干酪，血中脂连蛋白浓度增加或其减少被抑制。另外，干酪饲料组的血中甘油三酯浓度与对照饲料组相比，显著降低。另一方面，在血中总胆固醇浓度方面各组虽无显著差异，但在干酪饲料组血中总胆固醇浓度有下降的倾向。 
[表4]血中脂连蛋白浓度的变化 
Figure G2007800154883D00192
[表5]血中甘油三酯浓度和血中总胆固醇浓度 
  
      饲料组 甘油三酯浓度            (mg/dl)       总胆固醇浓度            (mg/dl)      
对照饲料组 111.75 80.38
干酪饲料组 75.63 68.63
实施例5 
(片剂的制造) 
将实施例1中得到的抗氧化肽(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)20重量％、乳糖(DMV公司)46重量％、结晶纤维素(和光纯药工业公司)31重量％、水3重量份充分混合后，通过压片机(富士药物机械公司制造)压片，制造本发明的抗氧化用片剂。 
实施例6 
(果汁饮料的制造) 
按照表6所示组成混合各成分，填充到容器后，进行加热灭菌，制造含有本发明实施例2所得的合成抗氧化肽(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)的本发明的抗氧化用果汁饮料。 
[表6] 
Figure G2007800154883D00201
实施例7 
(清凉饮料水的制造) 
按照表7所示组成混合各成分，填充到容器后，进行加热灭菌，制造含有本发明实施例3所得的胰蛋白酶消化肽(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)的本发明的抗氧化用清凉饮料水。
[表7] 
Figure G2007800154883D00211
实施例8 
(清凉饮料水的制造) 
按照表8所示组成混合各成分，填充到容器后，进行加热灭菌，制造含有本发明实施例3所得的胰蛋白酶消化肽(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln和His-Pro-Ile-Lys)的本发明的抗氧化用清凉饮料水。 
[表8] 
Figure G2007800154883D00212
实施例9 
制作表9所示组成的生面团，成形后，进行烘烤，制造含有本发明实施例1所得的肽(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)的本发明的抗氧化用饼干。
[表9] 
Figure G2007800154883D00221
实施例10 
按照表10所示组成混合各成分，制造含有本发明实施例1所得的抗氧化肽(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)的本发明的狗饲养用饲料。 
[表10] 
Figure G2007800154883D00222
实施例11
(片剂的制造) 
将实施例1中得到的抗氧化肽(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)20重量％、乳糖(DMV公司)46重量％、结晶纤维素(和光纯药工业公司)31重量％、水3重量份充分混合后，通过压片机(富士药物机械公司制造)压片，制造本发明的促进脂连蛋白产生用片剂。 
实施例12 
(果汁饮料的制造) 
按照表11所示组成混合各成分，填充到容器后，进行加热灭菌，制造含有本发明实施例2所得的合成肽(His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)的本发明的促进脂连蛋白产生用果汁饮料。 
[表11] 
Figure G2007800154883D00231
实施例13 
(干酪羊羹的制造) 
将200ml牛奶和2.5g琼脂粉充分混合后加热，将琼脂溶解后，加入砂糖50g，煮化，使其微沸。进而以配合干酪中含有的有效成分为目的，将150g古乌达干酪撕成1口大小后加入到混合物中，去热后，倒入模具中，于冰箱中凝固，得到促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的干酪羊羹。 
实施例14 
(粉末羊羹的制造)
为了配合干酪中含有的有效成分，将古乌达干酪10kg用绞肉机搅细，与熔融盐(磷酸钠1.2％，多磷酸钠1％)、乳化剂(糖酯0.6％)一起投入到加有90℃热水5kg的溶解桶中，调到pH6.2后，通过搅拌、吹入蒸汽，制备乳化液。将该乳化液进行均质后，用过滤器过滤，进行喷雾干燥，得到促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的粉末干酪。 
实施例15 
(棒状营养健康食品的制造) 
将实施例14得到的促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的粉末干酪100g、维生素C40g、细粒糖100g、玉米淀粉和乳糖的等量混合物60g混合后装袋，制造100袋促进血中脂连蛋白浓度增加和/或抑制其减少用的棒状营养健康食品。
Figure IAB00000000000171471600011

Claims (3)

1.由下述式(1)所示的氨基酸序列构成的肽、由下述式(2)所示的氨基酸序列构成的肽和/或由下述式(3)所示的氨基酸序列构成的肽在制备抗氧化剂中的用途，
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln    式(1)
His-Pro-Ile-Lys     式(2)
His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln    式(3)。
2.由下述式(1)所示的氨基酸序列构成的肽在制备脂连蛋白产生促进剂中的用途，
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln   式(1)。
3.由下述式(1)所示的氨基酸序列构成的肽在制备血中脂连蛋白浓度增加促进剂和/或减少抑制剂中的用途，
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln  式(1)。
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