JP2001158726A

JP2001158726A - メラニン生成抑制剤

Info

Publication number: JP2001158726A
Application number: JP34065799A
Authority: JP
Inventors: Yuko Yotsumoto; 元祐子四
Original assignee: Kirin Beverage Corp; Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Beverage Corp; Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1999-11-30
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2001-06-12

Abstract

(57)【要約】【課題】長期連用しても安全で、かつ美白効果に優れ
たメラニン生成抑制剤を提供する。【解決手段】紅茶ポリフェノールを有効成分として含
有することを特徴とするメラニン生成抑制剤。好ましく
は、紅茶ポリフェノールが、紅茶抽出物の水溶液から極
性有機溶媒を用いて抽出されたもの、紅茶抽出物の水溶
液からポリフェノール／カフェイン複合体の形で分離さ
れたもの、または紅茶抽出物の水溶液から合成吸着剤を
用いて分離されたものである。上記の紅茶ポリフェノー
ルをメラニン生成抑制剤として化粧料、飲食品または医
薬への配合に使用できる。【効果】上記の紅茶ポリフェノールは、安全でかつ強
いメラニン生成抑制作用を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、美白効果に優れ、
しみ、そばかすを予防あるいは治療することのできるメ
ラニン生成抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】しみ、そばかすなど皮膚の黒化は、皮膚
中に存在するチロシンが酸化されてメラニンに代謝され
ることでおこり、この生成を抑制すれば皮膚の美白効果
が達成できる。このことから、メラニン生成を抑制する
物質をスクリーニングすることで美白化粧品原料にしよ
うとする試みが古くから行なわれており、その結果アル
ブチンやコウジ酸などが実用化されている。また、その
後も各種天然物エキスなどがメラニン生成抑制効果を有
する物質として報告されている。しかし、これらはいず
れも効果が充分でないため、さらに新しいメラニン抑制
作用を有する物質が求められている。一方、近年茶類の
ヒトに及ぼす薬理作用に関して、様々な検討が行われて
いる。上記メラニン生成抑制効果に関しても若干の検討
が行なわれており、緑茶の高分子画分（日本食品科学工
学学会誌第43巻第5号（1996））、ウーロン茶抽出物（1
999年日本栄養食糧学会講演要旨集）あるいは茶の種子
抽出物（特開昭63-303910号公報）に効果があることが
知られているが、その効果の強さは実証されていない。
また、紅茶でも熱水抽出物や低級アルコール抽出物に関
して、チロシナーゼ阻害活性があることが知られている
（特公平4-63850号公報）が、酵素阻害が確認されてい
るだけで、インビボ効果に近い動物細胞での活性は確認
されていなかった。さらに、その活性がどの成分に由来
しているかに関する情報も開示されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来、茶の成分と薬理
作用効果については、緑茶中に多く含まれるカテキン類
には抗酸化作用、コレステロール上昇抑制作用を初めと
する多くの生理活性が知られているほか、多糖類には血
糖値上昇抑制作用が、テアニンには神経成長因子合成促
進作用などが知られている。そのほか、ウーロン茶ポリ
フェノールにも、虫歯予防効果などの薬理作用効果が知
られている。このような状況下において、紅茶抽出物中
の特定の成分とメラニン生成抑制効果に関する報告は全
く知られていない。本発明は、紅茶のチロシナーゼ阻害
活性に着目してその活性本体を明らかにし、ひいては長
期連用しても安全で、かつ美白効果に優れたメラニン生
成抑制剤およびその用途を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成すべく鋭意検討を進めた結果、紅茶抽出物中のポリ
フェノール画分が強いチロシナーゼ阻害活性およびメラ
ニン生成抑制効果を有することを見出し、この知見をも
とに本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明
は、紅茶ポリフェノールを有効成分として含有すること
を特徴とするメラニン生成抑制剤である。

【０００５】

【発明の実施の形態】[紅茶ポリフェノール]本発明によ
るメラニン生成抑制剤(もしくは組成物)は、紅茶ポリフ
ェノールを有効成分として含有することを特徴とするも
のであることは前記したところである。本発明でいう
「紅茶」とは、茶葉を完全発酵させたいわゆるブラック
ティー全般を指す。すなわち、アッサム種、セイロン
種、ダージリン種、キーマン種あるいはアールグレイ種
等のいずれであってもよく、また茶葉の等級も、リーフ
グレイド、ブロークングレイド等のいずれであっても使
用可能であることはいうまでもない。

【０００６】本発明における「紅茶ポリフェノール」と
は、カテキン類の重合体であるテアフラビン類やテアル
ビジン類といった紅茶に多く含まれるポリフェノール類
を指す。好ましくは、更に良好な効果を得るために紅茶
ポリフェノールは、ポリフェノール含量が固形分あたり
40重量％（タンニン量換算）以上のものである。ここで
いうタンニン量とは、酒石酸鉄を用いた「緑茶のタンニ
ン定量法」を用いて算出した値である。この定量法は、
ポリフェノール類が酒石酸鉄と反応して濃紺色の鉄塩を
生じることを利用した比色定量法である（茶業研究報告
第71号（1990）52頁）。紅茶中のテアフラビンやテアル
ビジンといったポリフェノールは茶葉の発酵工程でカテ
キン類が酸化、重合したもので、緑茶のカテキン類とは
異なっている。また、その化合物は様々な構造をとるこ
とが知られているが、そのほとんどは純品として単離さ
れておらず、正確な定量が困難であるのが現状である。
前述の緑茶タンニン定量法は緑茶カテキン量の近似値を
示すように設定されたものであり、本来複数のカテキン
酸化重合物を含む紅茶に適用するものではない。しか
し、その測定原理から考えて、紅茶中の総ポリフェノー
ル含量の一指標として利用することは可能であると判断
される。そこで、本明細書中では、紅茶ポリフェノール
中のポリフェノール含量をタンニン量換算で規定するこ
ととする。紅茶ポリフェノールは、紅茶抽出物を原料に
してこれを溶媒分画することで濃縮することが可能な
他、周知の各種クロマトグラフ処理によりさらに高濃度
に濃縮（粗精製もしくは精製）することが可能である。

【０００７】紅茶抽出物は、採取した紅茶葉をそのまま
あるいは砕片化して水（熱水や冷水など）やアルコール
（例えばメタノール、エタノール）などの有機溶媒、こ
れらの組合せあるいは超臨界炭酸ガスなど液体溶媒以外
のもの、好ましくは使用上の安全性の面から水、エタノ
ールまたは超臨界炭酸ガスによって抽出したものであ
る。例えば、紅茶葉を熱水等の溶剤に投入し、通常攪拌
しながら抽出した後、濾過処理または遠心分離処理によ
り固液分離して紅茶抽出液とする。抽出液量および時間
に関しては、特に限定はないが、例えば熱水（通常60〜
100℃程度）で抽出する際には茶葉1重量部に対して10〜
100重量部の水中で1分〜10分間くらい抽出するのが普通
である。この抽出液(通常、固形物含量0.1〜2重量％程
度：ポリフェノール含量として0.01〜0.5重量％（タン
ニン量換算）程度）を、水で抽出した場合にはそのまま
あるいは水またはその他の溶媒で抽出した場合には乾燥
（凍結乾燥など）して溶剤を除去して紅茶抽出物として
もよい。なお、上記抽出液の水あるいは溶剤を完全に除
去した紅茶抽出物中のポリフェノール含量は通常20〜35
重量％（タンニン量換算）程度になる。紅茶ポリフェノ
ールを分離するための試料としては紅茶抽出物の水溶
液、すなわち、水中抽出した場合には紅茶抽出（濃縮）
液をそのままか水で希釈した水溶液、あるいは抽出乾燥
物を適当量の水に溶かした水溶液を用いるのが好まし
い。

【０００８】紅茶ポリフェノールは、上記のような紅茶
抽出物の水溶液を極性有機溶媒を用いて抽出する方法、
紅茶抽出物の水溶液からポリフェノール／カフェイン複
合体の形で分離する方法、あるいは紅茶抽出物の水溶液
を合成吸着剤を用いて分離精製する方法等により濃縮
（粗精製、精製を包含する）することが可能であるが、
ポリフェノール／カフェイン複合体の形で分離する方法
を用いるのがより好ましい。これらの方法は、具体的に
は下記のようにして行うことができる。これらの方法に
より、ポリフェノール含量は固形分あたり40重量％（タ
ンニン量換算）以上に濃縮される。

【０００９】(1)紅茶抽出物の水溶液を極性有機溶媒を
用いて抽出する方法この方法は、紅茶抽出物の水溶液を極性有機溶媒で抽出
することを基本とするが、通常1分〜60分程攪拌して有
機溶媒相を得ることにより該相中に高回収率で紅茶ポリ
フェノールを抽出濃縮することができる。抽出用の極性
有機溶媒としては、選択性の点で好ましくは酢酸エチ
ル、メチルイソブチルケトン、もしくはジエチルエーテ
ル等があげられるが、酢酸エチルによって抽出するのが
最も好ましい。酢酸エチルで抽出した場合には、紅茶ポ
リフェノールのうちテアフラビン等の比較的低分子のポ
リフェノールが濃縮できる。この方法の場合、紅茶抽出
物の水溶液を、あらかじめクロロホルム等の非極性溶媒
（通常水溶液と同容量で3回程度）で洗浄することによ
り、抽出物中に比較的多く含まれるカフェインを除去し
ておく方が紅茶ポリフェノールを濃縮する意味では望ま
しい。

【００１０】(2)紅茶抽出物の水溶液からポリフェノー
ル/カフェイン複合体の形で分離する方法この方法は、紅茶ポリフェノールを紅茶抽出物の水溶液
からポリフェノール/カフェイン複合体の形で沈殿もし
くは混濁させて分離する方法である。紅茶の熱水抽出液
は、冷却するとクリーミングと呼ばれる混濁現象を起こ
す。これは、紅茶ポリフェノールがカフェインと水不溶
性の複合体を形成して起こる現象である。このクリーミ
ングは、例えば抽出を熱水で行う場合には、使用する抽
出水の性質（軟水、硬水など）によって生じ方が異なる
し、その他、抽出温度や使用する茶葉の種類や量などの
抽出条件の違いによっても生じ方が異なってくる。しか
し、ポリフェノールとカフェインで複合体を形成すれ
ば、その不溶物を遠心分離等の手段で分離してそのまま
利用（化粧品など）することができる。また、上記クロ
ロホルム等の非極性溶媒での洗浄等の方法により複合体
からカフェインを除くことも可能である。このような複
合体からカフェインを除去する方法を使用することは、
高濃度の紅茶ポリフェノールが得られる点で望ましい。
なお、この複合体は、紅茶飲料を製造している工場では
副産物として発生することもあるので、それをそのまま
あるいはカフェインを除去して利用することも可能であ
る。さらに、上記の条件の他、酸性下でカフェインを添
加することで強制的に混濁を起こさせる方法も可能であ
る。例えば、紅茶抽出物の水溶液を有機酸（例えばアス
コルビン酸、乳酸、クエン酸）、無機酸（例えば塩酸、
硝酸、硫酸）などでpH2〜4程度の酸性にした後に、0.2
重量％以上、好ましくは0.5重量％以上（抽出物水溶液
中）のカフェインを添加することにより水不溶性の複合
体を生じさせることができる。この複合体は、本発明の
目的にそのまま使用することも可能であるが、分離回収
後、加温した水（通常40℃以上）に再溶解させた後に、
クロロホルム等の非極性溶媒で洗浄する（通常同容量で
3回程度）などしてカフェインを除去しておくことがポ
リフェノールを濃縮するという意味からは望ましい。し
かし、最近カフェインが保湿剤（特開平8-291018号公
報）や痩身用皮膚剤（特開平11-246425号公報など）に
利用可能であるという報告もあることから、複合体のま
まで化粧品などに利用することも考えられよう。

【００１１】(3)紅茶抽出物の水溶液を合成吸着材を用
いて分離精製する方法合成吸着材剤としては、ゲル濾過充填剤（例えばトヨパ
ールHW-40）やイオン交換樹脂（例えばアンバーライトI
RC-76）等も利用可能であるが、大量に、また安価に紅
茶ポリフェノールを調製するためには、食品や医薬品の
精製等に使用されているメタアクリル酸エステル系、親
水性ビニルポリマー系もしくはスチレン−ジビニルベン
ゼン系などの合成吸着材を利用することが望ましい。こ
のうち、分離能が優れているメタアクリル酸エステル系
を使用することが最も望ましい。具体的には、ダイヤイ
オンHP1MGあるいはHP2MG（いずれも三菱化学社製）など
が好適例としてあげられる。この方法では、紅茶抽出物
の水溶液を上記のような合成吸着剤に供して、紅茶ポリ
フェノールを吸着させてからこれを回収することを基本
とするが、具体的には非吸着物をイオン交換水等で洗浄
した後、エタノール、アセトンなどの溶媒を用いて、段
階的に極性を変化させて目的物を回収する方法が一般的
である。紅茶ポリフェノールを食品原料として使用した
い場合にはエタノールを使用して回収することが望まし
い。

【００１２】上記の方法に限らず、周知の種々の合目的
的分離精製方法を用いて紅茶ポリフェノールの分離、濃
縮が可能であることはいうまでもない。その場合の分離
方法は、分離される成分をHPLCなどの分析手段を用いて
モニターしながらポリフェノールが濃縮されるように適
宜選択すればよい。

【００１３】上述のような種々の方法で得られた濃縮液
は、いずれも通常溶媒を除去して紅茶ポリフェノールと
する。

【００１４】[紅茶ポリフェノールの用途]メラニン生成
抑制剤としての上記紅茶ポリフェノールは、従来のメラ
ニン生成抑制剤と同様に化粧品原料として使用でき、さ
らに飲食品原料あるいは医薬の有効成分として使用する
ことができる。本発明は、上記紅茶ポリフェノールをメ
ラニン生成抑制剤として化粧料、飲食品または医薬に配
合することを特徴とする使用方法であり、他の側面で
は、上記紅茶ポリフェノールを有効成分として含んでな
る化粧料、飲食品または医薬用メラニン生成抑制剤でも
ある。

【００１５】化粧品材料への使用の場合、紅茶ポリフェ
ノールは化粧水、乳液、クリーム、ファンデーション、
ヘアートニック、シャンプー、リンスなど既存のいずれ
の化粧品にも配合可能である。紅茶ポリフェノールの配
合量は、ポリフェノールの含量（純度もしくは精製度）
やその効果（もしくは活性度）と照らし合わせて適宜決
めれば良いが、一般に全量に対して分離濃縮物の固形分
濃度として0.01〜50重量％（ポリフェノール濃度として
0.004〜40重量％（タンニン量換算））程度、好ましく
は0.1〜5重量％（ポリフェノール濃度として0.04〜４重
量％（タンニン量換算））程度配合する。また、各化粧
料に一般に用いられる他の成分もしくは配合剤、例えば
基剤や酸化防止剤、防腐剤等を通常通り配合することが
できる。なお、ポリフェノール／カフェイン複合体の形
で分離した紅茶ポリフェノールは、クリーム状もしくは
乳液状化粧料としてそのまま使用することもできる。

【００１６】飲食品原料への使用の場合、紅茶由来とい
う特徴を生かして、使用する溶媒等に留意すれば（例え
ば溶媒としてエタノールを用いるなど）、種々の食品、
飲料等に利用可能である。具体的には、炭酸飲料、果汁
飲料、ビタミン飲料、栄養飲料、茶飲料、ミネラル飲
料、アルコール飲料等の飲料等の原料として紅茶ポリフ
ェノールを単独もしくは他の通常の成分原料と混合して
利用できるほか、固形食品原料として使用して通常食
品、すなわちパン、ラーメンなどの主食類、ガム、チョ
コレート、キャンディーなどの菓子類、ヨーグルトなど
の乳製品、調味料、惣菜等様々なものにも利用可能であ
る。また、飲料飲用時に添加する易溶性の液剤または粉
末剤等の添加剤として利用することも可能である。これ
らの飲食品等への紅茶ポリフェノールの配合量は適宜決
定できるが、一般に全量に対してポリフェノール濃度と
して0.001〜0.5重量％（タンニン量換算）、好ましくは
0.01〜0.1重量％（タンニン量換算）程度である。

【００１７】メラニン生成抑制剤としての医薬用製剤へ
の用途の場合、紅茶ポリフェノールを単独でまたは他の
通常の製剤用添加物と混合して錠剤、顆粒剤、カプセル
剤、液剤等の所望の剤形に形成することができる。例え
ば紅茶ポリフェノールをデンプン、乳糖などの賦形剤等
と一緒に製剤化してタブレットの形態にしたり、分離濃
縮液をゼラチンでカプセル化するなど、通常の配合剤や
調製方法を用いて製剤化することが可能である。医薬用
製剤は、通常の製剤用添加剤（例えば賦形剤、保存剤、
安定剤等）を紅茶ポリフェノールが有効に作用する範囲
内で適宜配合することができる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をさらに具体
的に説明するが、これによって本発明が限定されるもの
ではない。

【００１９】［分析法］タンニン量の分析後記調製例において、試料中のポリフェノール含量は下
記の試験法に従って測定を行い、最終的にタンニン量換
算値として表記した（茶業研究報告第71号（1990）第52
頁に記載の方法に準拠）。試料溶液は、試料粉末100mg
を100mlに定容し、適宜希釈して使用する。また、酒石
酸鉄試薬は硫酸第一鉄（7水塩）100mgと酒石酸ナトリウ
ムカリウム500mgを水に溶かして100mlにして調製する。
試料溶液5mlと酒石酸鉄試薬5mlを25ml容メスフラスコに
とり、セーレンゼンのリン酸緩衝液（pH7.5）で定容し
て、発色させる。対照液（酒石酸鉄試薬を水に置き換え
たもの）に対して波長540nmの吸光度を測定する。没食
子酸エチル標準溶液に対し酒石酸鉄試薬による同様な処
理をおこなって、得られた吸光度の測定結果から作成し
た検量線を用いて、試料溶液中の没食子酸エチル相当量
を求める。さらにその1.5倍することで（−）-エピカテ
キンガレート濃度に換算してタンニン量とする。

【００２０】[調製例１]セイロン種紅茶葉の1種である
ディンブラ40ｇを85℃のイオン交換水2Lに投入し、撹拌
しながら6分間抽出した。その後、濾過処理および遠心
分離処理により固液分離をおこない、紅茶抽出液1.8Lを
得た。このうちの180mlを分取して、凍結乾燥をおこな
い、紅茶抽出物1.2ｇを得た。このポリフェノール含量
は31.2重量％（タンニン量換算）であった。さらにこの
紅茶抽出液２00mlを75℃まで加温した後、1/10N塩酸10m
lと10％カフェイン溶液20mlを加えてよく混和した。こ
れを5℃で1時間放置した後、遠心分離してカフェイン非
共沈画分およびカフェイン共沈画分を分取した。引き続
き、カフェイン共沈画分を再度水に溶解させてからクロ
ロホルムで洗浄してカフェインを除去した。このうち半
量は凍結乾燥して紅茶ポリフェノールとした（収量100m
g、ポリフェノール含量69.6重量％（タンニン量換
算））。残りの半量は酢酸エチルで抽出した。酢酸エチ
ルで抽出されるものは紅茶ポリフェノールの比較的低分
子のものが、酢酸エチルで抽出されないものは紅茶ポリ
フェノールの比較的高分子のものが濃縮されることが知
られている。これらの抽出物の溶媒を除去して、酢酸エ
チル抽出物44mgを得て、紅茶ポリフェノール（I）画分
とした。さらに抽出残さである水溶液を凍結乾燥するこ
とで紅茶ポリフェノール（II）画分44mgを得た。紅茶ポ
リフェノール（I）画分のポリフェノール含量は86.1重
量％（タンニン量換算）であり、紅茶ポリフェノール
（II）画分は、41.4重量％（タンニン量換算）であっ
た。

【００２１】[調製例２]調製例１で得た、紅茶抽出液18
0mlを同量のクロロホルムで3回洗浄してカフェインを除
去した後、180mlの酢酸エチルで3回抽出した。この酢酸
エチル抽出物の溶媒を除去して紅茶ポリフェノール画分
(III)とした。収量は208mgであり、ポリフェノール含量
は74.7重量％（タンニン量換算）であった。

【００２２】[調製例３]紅茶葉をダージリン種茶葉に変
えた他は、調製例１および２と全く同様にして紅茶抽出
物1.0ｇ(ポリフェノール含量33.4重量％（タンニン量換
算）)、紅茶ポリフェノール87mg（ポリフェノール含量8
8.3重量％（タンニン量換算））、紅茶ポリフェノール
（I）画分45mg（ポリフェノール含量94.2重量％（タン
ニン量換算））および紅茶ポリフェノール（II）画分34
mg(ポリフェノール含量53.4重量％（タンニン量換
算））を得た。

【００２３】[調製例４]紅茶葉ディンブラを用いて、茶
葉重量の30倍量のイオン交換水を使用して85℃で、攪拌
しながら7分間抽出した。濾過処理および遠心分離処理
を順次行い、紅茶抽出液を得た。この抽出液200mlにダ
イアイオンHP2MG200ml（メタノール、イオン交換水で順
次洗浄したもの）を加えて攪拌しながら１時間放置し
た。その後、HP2MGを2Lのイオン交換水で洗浄した後、3
0％エタノール水溶液600ml、80％エタノール水溶液600m
lで順次溶出した。溶媒を除去して、それぞれ約0.4ｇお
よび約0.3ｇが得られた。HPLCで分析したところ80％エ
タノール水溶液溶出画分に紅茶ポリフェノールが濃縮さ
れているのが確認された。このポリフェノール含量は8
5.2重量％（タンニン量換算）であった。

【００２４】[調製例５]調製例３と同様に得た紅茶抽出
液2Lを、5℃に冷却して1時間放置した後、生じた沈殿を
遠心分離で回収して、水洗後そのまま凍結乾燥すること
で紅茶ポリフェノール／カフェイン複合体1840mgを得
た。

【００２５】[評価例１]メラニン生成の際のキーとなる
酵素であるチロシナーゼの阻害効果を見ることでメラニ
ン生成抑制効果を評価した（参考；組織培養21（8）29
3、1995）。1.5mlマイクロチューブを用いて0.2Mリン酸
緩衝液（pH6.5）0.3mlと試料水溶液（紅茶ポリフェノー
ル（100ppm、500ppm）、紅茶ポリフェノール(I)画分お
よび（II）画分（各133ppm））の0.4mlを混和し、これ
に1.5mg／mlチロシナーゼ（マッシュルーム由来；和光
純薬社製）0.1mlを加えて37℃で20分間プレインキュベ
ートした。これに基質として1.5mM L-DOPA（和光純薬社
製）を0.7ml加え37℃で保持した。正確に20分間反応さ
せた後、遠心分離処理して上清の吸光度（470nm）を測
定した。基質の代わりに水を使用したものをブランクと
して各試料の酵素阻害率を測定した。また、ポジティブ
コントロールとしてアルブチン（133ppm）を測定した。 E0 ;試料無添加区のブランクの吸光度 E1；試料無添加区の吸光度 E2；試料添加区のブランクの吸光度 E3；試料添加区の吸光度評価結果を表1に示した。なお表中、ディンブラ紅茶ポ
リフェノールの試料は全て調製例１の方法で得られたも
のであり、ダージリン紅茶ポリフェノールの試料は全て
調製例３の方法で得られたものである。表１紅茶ポリフェノールのチロシナーゼ阻害活性試料名阻害率（％）ディンブラ紅茶ポリフェノール 100ppm 40.3 500ppm 64.5 紅茶ポリフェノール(I)画分 133ppm 48.5 紅茶ポリフェノール(II)画分 133ppm 39.3 ダージリン紅茶ポリフェノール 100ppm 39.5 500ppm 73.2 紅茶ポリフェノール(I)画分 133ppm 47.7 紅茶ポリフェノール(II)画分 133ppm 31.4 アルブチン（ポジティブコントロール）133ppm 26.0 紅茶ポリフェノールはいずれもポジティブコントロール
であるアルブチンよりもはるかに強いチロシナーゼ阻害
活性を示した。

【００２６】[評価例２]B16メラノーマ細胞を用いた評
価をおこなった。この細胞はC57BL／6J系マウスに自然
発生した悪性黒色腫から分離されたものでメラニン産生
能を有している。この株のメラニン産生量の減少度合い
によって、メラニン生成抑制効果を評価するものであ
る。試験に用いたＢ16細胞は理研細胞バンクより入手し
たB16melanoma4A5 (RCB0557) 株およびその株から、本
発明者がぺニシリンカップ法（バイオ実験イラストレイ
テッドすくすく育て細胞培養（秀潤社）参照）を用い
てクローニングをおこなって選抜することでさらにメラ
ニン産生能を向上させたKBC／B16-2株を使用した。培養
は市販ダルベッコ変法培地（ニッスイ）に10％ウシ胎児
血清（ライフテックオリエンタル）を添加した培地を用
いて、37℃、5％CO_２、95％空気からなるCO₂インキュベ
ーター内でおこなった。2×10⁴cells／mlの細胞懸濁液3
mlを、6wellマイクロプレートにまき、24時間前培養し
た後、培地を新鮮培地に交換し、供試試料を添加した。
48時間後、培地交換および試料添加をおこない、さらに
24時間培養した。細胞は、トリプシン処理により回収
し、メラニン量と細胞数を計測した。すなわち，培地を
吸引除去し，トリプシン溶液（0.25%トリプシン，2.65m
M EDTA4Na，0.425%NaCｌ）0.3mlを加えて細胞を剥離さ
せた。続いて50μg/mlトリプシンインヒビター液0.4ml
でトリプシンを不活性化させ，これにPBS 3mlを加えて
細胞を縣濁し，遠沈管に回収した。PBSでマイクロプレ
ートを共洗いして遠沈管内の細胞縣濁液は正確に5gとし
た。細胞縣濁液0.2mlを適宜希釈し，トリパンブルーで
染色後，血球計（EKDS血球計算盤）を用いて生細胞数を
計測した。残りの細胞縣濁液は1000rpm10分の遠心分離
処理を行い細胞を沈澱させた。細胞ペレットはPBSで洗
浄後，細胞融解剤ソルバブル（パッカード社）1mlを加
えて，1晩凍結後，細胞を融解して475nmの吸光度を測定
した。あらかじめ市販のメラニン（シグマ社）によって
作成した検量線からメラニン量を算出した。メラニン生成抑制率の算出は，次式により行った。メラニン生成抑制率（%）=｛（Vs−Vt）／Vs｝×100 Vs：試料無添加時の細胞10⁴あたりのメラニン生成量 Vt：試料添加時の細胞10⁴あたりのメラニン生成量紅茶抽出物と、紅茶ポリフェノールの評価結果を表2お
よび3に示した。なお表中、紅茶ポリフェノールおよび
紅茶抽出物は調製例１の方法で得られたものであり、紅
茶ポリフェノール(III)は調製例２で得られたものであ
る。表2 紅茶ポリフェノールのメラニン生成抑制効果＜B16melanoma4A5株＞試料名（供試量）抑制率（％；n=10の平均）ディンブラ紅茶抽出物（50μg／ml）（参考） 15.7 紅茶ポリフェノール画分（50μg／ml） 20.4

【００２７】表3 紅茶ポリフェノールのメラニン生成抑制効果＜KBC／B16‐2株＞試料名（供試量）抑制率（％；n=10の平均）ディンブラ紅茶抽出物（50μg／ml）（参考） 10.8 紅茶抽出物（75μg／ml）（参考） 17.5 紅茶ポリフェノール(III)画分（50μg／ml） 21.7 紅茶ポリフェノール(III)画分（75μg／ml） 25.9 いずれの細胞においても紅茶ポリフェノールを濃縮した
画分でメラニン生成抑制効果が確認できた。また、ポリ
フェノールを濃縮した画分の活性は、紅茶抽出物そのま
まよりも有意に強かった。

【００２８】[使用例] 1)乳液の製造例次の処方により、通常の方法で乳液を製造した。重量％ (1)紅茶ポリフェノール／カフェイン複合体（調製例５と同様に調製したもの） 10 (2) 1,3‐ブチレングリコール 5 (3) スクワラン 3 (4) ワセリン 1 (5) ステアリルアルコール 0.3 (6) ソルビタンモノステアリート 1.5 (7) ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート 3 (8) 水溶性コラーゲン 1 (9) 防腐剤適量 (10) 精製水残余

【００２９】2)ビスケット（スコーン）の製造例次の配合を通常通り、混合して生地を製造し、175℃15
分程度焼いてスコーンを製造した。重量 (1) 紅茶ポリフェノール（調製例4と同様に調製した凍結乾燥物） 3g (2) 薄力粉 450g (3) 無塩マーガリン 200g (4) 卵白 60g (5) 粉糖 60g (6) はちみつ 40g (7) 牛乳 160g (8) ベーキングパウダー 10g (9) 食塩 4g

【００３０】３）錠剤（タブレット）の製造例次の組成物を通常の方法で打錠して錠剤を製造した。重量％ (1) 紅茶ポリフェノール（調製例4と同様に調製した凍結乾燥物） 40 (2) 乳糖 30 (3) とうもろこしデンプン 25 (4) ヒドロキシプロピルセルロース 4 (5) ステアリン酸マグネシウム 1

【００３１】

【発明の効果】上述してきたように、本発明により、紅
茶由来で安全かつ効果に優れた新しいメラニン生成抑制
組成物を提供できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/78 Ａ６１Ｋ 35/78 ＣＡ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 17/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ // Ａ２１Ｄ 13/08 Ａ２１Ｄ 13/08 Ｆターム(参考） 4B018 LB01 MD08 MD59 ME14 MF01 4B032 DB21 DK05 DK29 DL20 4C083 AA111 AA112 AC012 AC022 AC072 AC122 AC442 AC841 AC852 AD432 CC01 CC05 DD31 EE16 4C086 AA01 AA02 BA08 GA17 MA02 MA10 MA35 MA52 NA14 ZA89 ZC20 4C088 AB45 AC05 BA08 BA19 CA03 CA13 MA02 MA35 NA14 ZA89 ZC20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】紅茶ポリフェノールを有効成分として含有
することを特徴とする、メラニン生成抑制剤。
【請求項２】紅茶ポリフェノールが、ポリフェノール含
量40重量％（タンニン量換算）以上である、請求項１記
載のメラニン生成抑制剤。
【請求項３】紅茶ポリフェノールが、紅茶抽出物の水溶
液を極性有機溶媒を用いて抽出することにより得られた
ポリフェノールである、請求項１または２記載のメラニ
ン生成抑制剤。
【請求項４】紅茶ポリフェノールが、紅茶抽出物の水溶
液からポリフェノール／カフェイン複合体の形で分離さ
れたポリフェノールである、請求項１または２記載のメ
ラニン生成抑制剤。
【請求項５】ポリフェノールが、紅茶抽出物の水溶液を
合成吸着剤を用いて分離することにより得られたポリフ
ェノールである、請求項１または２記載のメラニン生成
抑制剤。