WO2006093229A1 - ステビア甘味料 - Google Patents

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morita
sweetness
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Toyoshige Morita
Koji Morita
Koichiro Komai
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Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to stevia with a high content ratio of rebaudioside A to stepioside.
  • the present invention relates to a plant belonging to the cultivar Bertoni, a method for producing a sweetener extracted from the plant and Z or dried leaves thereof.
  • the present invention further relates to a method for producing high-purity rebaudioside A having a sweetening power.
  • Stevia is a perennial plant of Chrysanthemum that originates in Paraguay, South America, and its scientific name is Stevia Rebaudiana Bertoni. Stevia contains sweetening ingredients that are more than 300 times sweeter than sugar and is cultivated to extract these sweetening ingredients and use them as natural sweeteners.
  • Stevia's sweetening ingredients include stepioside (C H ⁇ ), rebaudioside A (C
  • Stevia varieties that have been cultivated contain stepioside (ST) as the main component, and rebaudioside A (RA) content is about 3 to 4 times lower than stepioside, and rebaudioside C content is slightly lower.
  • ST stepioside
  • RA rebaudioside A
  • C content is slightly lower.
  • ST stepioside
  • RA rebaudioside A
  • the inventors of the present invention repeatedly improved breeding by cross-selection from conventional varieties, and obtained stevia varieties having a high content ratio of rebaudioside A (RA) to stepioside (ST).
  • RA rebaudioside A
  • ST stepioside
  • the development of an excellent variety with a higher content ratio of rebaudioside A was desired.
  • the method of identifying Stevia plants becomes a problem.
  • identification by plant height, leaf shape, etc. can be considered, but stevia is self-incompatible and soon becomes hybrid and cannot be identified by plant height, leaf shape, etc. .
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-045848
  • Patent Document 2 JP-A-60-160823
  • Patent Document 3 JP-A-61-202667
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-9878
  • the present invention creates varieties with an excellent sweetness component content and sweetness component content ratio, and distinguishes them from other strains and other varieties of stevia plants by identifying genes by RAPD method in order to maintain their characteristics.
  • the present invention provides a sweetener with excellent sweetness and a method for producing the same.
  • the first of the present invention is a Stevia 'Rebaudiana' Bertoni variety that contains 4 parts by weight or more of Rebaudioside A to 1 part by weight of Stepioside. For this reason, as described later, the mating and selection were repeated to create a new plant belonging to the Stevia 'Rebaudiana' Bertoni variety that contains at least 4 parts by weight of Rebaudioside A per 1 part by weight of Stevioside.
  • a second aspect of the present invention is a method for producing a sweetener comprising 4 parts by weight or more of rebaudioside A per 1 part by weight of stepioside, and the plant or the dried leaf thereof is extracted with water or a water-containing solvent. It is characterized by doing.
  • a third aspect of the present invention is a method for producing a high-purity sweetener comprising 40 parts by weight or more of rebaudioside A per 1 part by weight of stepioside, wherein the sweetener obtained in the previous item is recrystallized.
  • This is a method for producing a sweetener comprising 40 parts by weight or more of rebaudioside A per 1 part by weight of stevioside, and containing 92% or more of those contents.
  • a sweetener with excellent sweetness and a method for producing the same are provided.
  • Fig. 1 is an electrophoretogram of DNA base sequences of Morita variety, SS and SN. A characteristic base sequence is observed in the arrowed part.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram of DNA sequences of Morita variety and SN. A characteristic base sequence is observed in the arrowed part. Explanation of symbols
  • the RAPD method used for identification of the present invention is one of DNA analysis methods.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a region of DNA sandwiched between identical or similar sequences is amplified, and the amplified DNA pattern is analyzed by electrophoresis.
  • Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) is a quaternary ammonium base with a long-chain alkyl group, and it forms nucleic acid insoluble complexes with polyanions such as nucleic acids. Can be used for isolation.
  • the genomic DNA that has been selectively precipitated is used as a template for the raw material plant.
  • a set of A06 (base IJ; ACTGGCCGAGGG) and A48 (base sequence; C CGCAGGGACCA) and rTaq (TAKARA) are used as primers.
  • A06 base IJ
  • A48 base sequence; C CGCAGGGACCA
  • rTaq rTaq
  • the plant body and / or its dried leaves are extracted with water or a water-containing organic solvent, and then the extract is concentrated as it is, or cation exchange is performed as necessary.
  • the ionic impurities are removed with a resin, an anion exchange resin, and activated carbon, a sweetening component is adsorbed on the adsorption resin, eluted with a hydrophilic solvent, and the eluate is concentrated and dried to obtain a sweetener.
  • Other conventional purification means such as decolorization can be applied to the sweetener production method, and conventional methods such as membrane separation, alcohol extraction, and crystallization can be appropriately applied to obtain high purity rebaudioside A. it can.
  • the crystallization method can be appropriately used by adding water as a crystallization solvent to an organic solvent such as ethanol and methanol.
  • Other natural and artificial sweeteners, diluents and the like can be added to the obtained sweetener.
  • breeding is carried out by cross-selection of varieties containing a relatively high content of rebaudioside A.
  • SF5-1, SF5-2 which contain rebaudioside A at a high concentration
  • TD-1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-9878
  • Select varieties resistant to Septoria and Alternaria analyze their sweetness components, contain 4 parts by weight or more of rebaudioside A against stepioside, and have a relatively high sweetness content. Selected strains with excellent properties. Furthermore, the sweetness component content, the sweetness component ratio, and the growth situation were repeatedly confirmed, and the gene was searched for Morita variety.
  • the applicant has already completed the international deposit for the Morita variety according to the present invention (Accession No. FERM BP-10353). Therefore, the plant body of the present invention can be easily obtained from the seeds of the Morita varieties related to the deposit. Stevia is self-incompatible, and the target plant is not always obtained from the seed, but the target product can be easily selected according to the DNA test described in the present application. If necessary, crosses with other high-quality stevia species (eg TD-1) and selection according to Example 1 described later makes it very easy to obtain plants containing rebaudioside A at high concentrations. can do. All of these plants are contained in plants obtained from the seeds of the varieties deposited internationally, namely the Morita variety. Be turned.
  • TD-1 high-quality stevia species
  • the TD-1 varieties were artificially crossed in a vinyl house in the Niimi Factory, and the seeds obtained were sown in a plastic house in the Niimi Factory in March 1999, and the germinated seedlings were transplanted to a nursery pot.
  • 300 seedlings with a seedling length of about 7 cm or more were fertilized with 20 kg each of nitrogen, phosphorus, and potash fertilizers per 10 ares in the factory field, and transplanted two weeks later.
  • 10 kg each of nitrogen, phosphorus and potash fertilizer components were added per 10 ares.
  • Rebaudioside A in mid-April 2003 for comparison with other varieties 40 common Stevia varieties (SN) each containing TD—l (TD), stevioside as the main sweetening ingredient, and rebaudioside A as the auxiliary sweetening ingredient, are also cut in the same way. Planted in the field.
  • Morita, TD, and SN varieties were cut at a height of 15 cm from the ground, and then the leaves were separated and used as analytical samples after drying.
  • Morita varieties had relatively low sweet spot content of lower leaf black spots, and dry leaf yields were superior to other varieties.
  • TD varieties have more black spots on the lower leaves due to Septoria bacteria than Morita varieties, and the leaves have already begun to turn yellow due to Septoria bacteria. As seen, one leaf from the ground was dead.
  • 200 cuttings were sprouted from Morita varieties, transplanted to the field in late April, and at the end of May, the end of June, the end of July, the end of August, the end of September, and the end of October after flowering After cutting and separating only the leaves, they were dried and the sweetness content was measured.
  • the sweetness component was measured by high performance liquid chromatography.
  • the Morita varieties had different sweetness component contents and sweetness component ratios depending on the growth period, and the sweetness component content increased as the growth period increased, while the stevioside content tended to decrease. At the end of October during the flowering period, the sweetness content decreased.
  • Discard the supernatant add 400 ⁇ l lMCsCl, and pipette to completely dissolve the precipitate.
  • Discard the supernatant add 400 / i 1 70% ethanol to the precipitate, centrifuge at 14000 rpm for 15 minutes, repeat this procedure, discard the supernatant, and dry the precipitate in a vacuum dryer.
  • Dissolve in ⁇ ultrapure water The solution was subjected to agarose gel electrophoresis to confirm that the DNA was isolated.
  • RNA To remove RNA, react with RNase solution 500 ⁇ 1 (composition: DNA isolation solution 100 ⁇ 1, RNase (5 g / ml) 5 ⁇ 1) at 37 ° C for 1 hour. Add an equal amount of PCI solution (composition: phenol / chloroform / isoamyl alcohol, 25: 24: 1, gently mixed, then centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes to separate the aqueous layer). After capping and gently mixing, the mixture was centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes.
  • aqueous layer (upper layer) to a new microtube, add an equal amount of CIA solution (composition: black mouth form / isoamyl alcohol, volume ratio 24: 1) stored at room temperature, and mix gently. Then, centrifuge at 15000 i "pm for 3 minutes, transfer the aqueous layer to a new microtube, perform CIA treatment again, 1/10 times the amount of 3M sodium acetate and 2.5 times the amount of 100% ethanol. And mix well, cool at -20 ° C for 20 min or longer, centrifuge at 15000 i "pm for 15 min, pellet the DNA, discard the supernatant, and add 70% ethanol that has been cooled to the pellet.
  • CIA solution composition: black mouth form / isoamyl alcohol, volume ratio 24: 1
  • the PCR composition (Table 4) was used for 35 minutes at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 120 seconds, and then at 72 ° C for 10 minutes. React. After the reaction, PCR amplification product was obtained by keeping at 4 ° C. When the DNA band of the PCR amplification product was confirmed by 1% agarose gel electrophoresis, as shown by Morita in Fig. 1, a characteristic DNA fragment was confirmed approximately 2000 bp below.
  • AO 6 and A4 8 primers are manufactured by BEX
  • FIG. 1 shows DNA bands obtained by treating SN varieties (S N) and SS varieties (SS) having stevioside as a main component and rebaudioside moth as a minor component in the same manner as described above.
  • Morita varieties have a characteristic base sequence approximately 2000 bp below, and can be easily distinguished from other varieties by detecting DNA by agarose gel electrophoresis.
  • DNA extraction was performed by the CTAB method. About 0.5 g of the leaves of each of the Morita and SN varieties were frozen with liquid nitrogen in a mortar and crushed with a pestle. The ground sample should be 20 ml of 2% CTAB solution (lOOmM Tris-HCl pH8.0, 20 mM EDTA pH8.0, 2% CTAB, 1.4M NaCl, 1% PVP) in a 50 ml Falcon tube. Kunmaki mouth was incubated at 65 ° C for 30 minutes. After adding an equal volume of black mouth form / isoamyl alcohol (24: 1) and stirring for 10 minutes, the mixture was centrifuged at 3500 i "pm for 15 minutes, and the aqueous layer was transferred to another 50 ml Falcon tube.
  • CTAB solution lOOmM Tris-HCl pH8.0, 20 mM EDTA pH8.0, 2% CTAB, 1.4M NaCl, 1% PVP
  • the obtained DNA sample was used as a saddle type, and PCR reaction was performed with the following reaction solution composition.
  • PCR cyclore is 96 after reacting at 96 ° C for 30 seconds.
  • the reaction was carried out at C for 10 seconds, 42 ° C for 2 minutes, 72 ° C for 2 minutes, 35 cycles, and further at 72 ° C for 4 minutes.
  • the PCR product was fractionated by 1.8% agarose gel electrophoresis and photographed under UV irradiation after staining with EtBr.
  • a band specific to Morita variety was confirmed around 2000 bp.
  • Blend 'Blend Taq TM (TOYOBO) 0.5 / il (2.5U / ⁇ 1) Stevia DNA 1 ⁇ 1 (30ng / ⁇ 1)
  • Amberlite IR_120B Pass through a column packed with 20 ml of ion exchange resin (Duolite A_4) and 5 ml of granular activated carbon, and pass the passing solution through
  • Table 5 shows the analysis results of the extracted and purified product.
  • ST is Stepioside and RA is Rebaudioside A.
  • Example 2 Each 0.1% solution of Morita and SN pale yellow powder obtained in Example 2 was prepared, and bitterness, astringency, and sweetness were compared by 10 panelists familiar with the taste of stevia sweetener.
  • Morita cultivar was bitter and astringency improved over the other samples, and was superior in sweetness.
  • Example 2 Prepare 0.1% each of Morita and TD pale yellow powders obtained in Example 2 and stevia. Panelists familiar with the taste of sweeteners compared bitterness, astringency, and sweetness.
  • Morita cultivar was bitter and astringency improved over the other samples, and was superior in sweetness.
  • Example 2 After heating and dissolving 2 g of the extracted and purified product obtained in Example 2 (Morita variety) in 10 times the amount of 95% methanol, it was left to cool at 4 ° C for 6 days, and the resulting crystals were separated and cooled with cold methanol. After washing, it was dried under reduced pressure to obtain 1.2 g of white crystals. For comparison, the same treatment was performed from TD and SN to obtain 0.9 g and 0.6 g of white crystals, which were analyzed.
  • Table 8 shows the analysis results of the extracted and purified product.
  • ST is Stepioside and RA is Rebaudioside A.
  • the Morita varieties had better bitterness and astringency than the other samples, were superior in sweetness, and had an excellent recovery rate for high-purity products.
  • Example 3 Each 0.1% solution of white powder of TD obtained in Example 3 was prepared, and bitterness, astringency, and sweetness were compared by 10 panelists familiar with the taste quality of stevia sweetener.
  • the Morita varieties had better bitterness and astringency than the other samples, were superior in sweetness, and had an excellent recovery rate for high-purity products.

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Abstract

本発明により、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡを４重量部以上含むステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種の新たな植物体が提供され、該植物体またはその乾燥葉より良質な甘味料が容易に製造できる。

Description

明 細 書
ステビア甘味料
技術分野
[0001] 本発明は、ステピオサイドに対してレバウディォサイド Aの含有比率の高いステビア
-レバウディアナ.ベルトニーの品種に属する植物体、該植物体および Zまたはその 乾燥葉より抽出される甘味料の製造方法に関する。
本発明は、更に該甘味料力も高純度レバウディォサイド Aを製造する方法に関する 背景技術
[0002] ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア ·レ バウディアナ 'ベルトニー (Stevia Rebaudiana Bertoni)という。ステビアは砂糖の 30 0倍以上の甘味を持つ甘味成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料と して用いる為に栽培されている。
ステビアの甘味成分としては、ステピオサイド (C H 〇 ）、レバウディォサイド A(C
38 60 18 4
H Ο )、レバウディォサイド C、 D、 E、ズルコサイド A等が知られている。一般に栽
4 70 23
培されているステビア品種では上記甘味成分の内ステピオサイド (ST)が主成分でレ バウディォサイド A(RA)の含有量はステピオサイドの 10分の 3〜4程度、レバウディォ サイド Cの含量はそれよりやや少なレ、が、品種によってはレバウディォサイド Cを主成 分とするものなど種々である。
[0003] 渋み、辛み等の舌で知覚される味の中でも甘みの質は非常に微妙である。ステビ ォサイドは砂糖の 300倍の甘味度を有するので天然甘味料として食品工業界で用い られている。その甘味は比較的砂糖に似ているが、苦み等の不快味が後味に残ると レ、う欠点がある。それゆえステピオサイドを多量に含むことは甘味料として好ましいこ とではない。これに対して、レバウディォサイド Aは良質の甘味質とステピオサイドの 1 .3倍〜 1.5倍の甘味度を有する。
レバウディォサイド Aの生産コストの削減と安定した乾燥葉の収穫量を保ち、甘味 料原料として甘味質の優れたレバウディォサイド Aを高含有したステビア品種を開発 し、同時に、それらを継続維持し、それらを基に優れた甘味料を製造する必要がある
[0004] 本発明者らは従来品種から交配選抜を繰り返して品種改良を行い、ステピオサイド (ST)に対してレバウディォサイド A(RA)が高い含有比率を示すステビア品種を得、こ れらの植物から甘味成分を抽出しステピオサイドに対してレバウディォサイド Aの含 有比の高レ、優れた甘味料を製造してきた (後記特許文献 1 - 1から 1 _ 3参照)が、更 にレバウディォサイド Aの安定的により含有比の高い優れた品種の開発が望まれた。 一方、ステビア植物の品種改良におレ、てステビア植物を特定する方法が問題とな る。改良されたステビア植物の識別方法として、草丈、葉形等による識別が考えられ るが、ステビアは自家不和合性であり雑種になりやすぐ草丈、葉形等による識別の みでは不可能である。
[0005] また、ステビア特有の病原菌による耐病性による比較特定もあるが、ステビア特有 に発現する枯葉、黒斑点病はセプトリァ菌、アルタナリア菌に起因して発生するが、 それらの菌は土壌に生息する菌であり、これらの症状のみによる品種の特定は日本 のみならず世界的に発生することからこれら特性のみで品種を特定するには不十分 である。
甘味成分の含有量が高くステピオサイドに対してレバウディォサイド Aの含有比率 の高い改良品種においてはその含有比率による特定方法が考えられる力 生育期 間の気象条件、収穫時期等により甘味成分比率が変動するのは避けられないから、 この方法も現実性に乏しい。
[0006] 最近、プライマーミックスを用いる RAPD法によって、 DNA鑑定により識別を行う方 法 (後記特許文献 2参照)も開発されたが、本発明の植物体の鑑定に適用できるかど うかは明らかでない。
特許文献 1 :特開昭 59— 045848号公報
特許文献 2 :特開昭 60— 160823号公報
特許文献 3 :特開昭 61— 202667号公報
特許文献 4 :特開 2003— 9878号公報
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は甘味成分含量と甘味成分含有比の優れた品種を創造し、その特徴を維 持するために RAPD法で遺伝子を識別することにより他系統、他品種のステビア植 物と区別した上で、甘味質の優れた甘味料およびその製造方法を提供することであ る。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明の第 1は、ステピオサイド 1重量部に対してレバウディォサイド Aを 4重量部 以上含むステビア'レバウディアナ'ベルトニー品種である。このため、後述するように 交配と選別を繰り返してステビォサイド 1重量部に対してレバウディォサイド Aを少な くとも 4重量部以上含むステビア'レバウディアナ'ベルトニー品種に属する新たな植 物体を創造した。
本発明の第 2は、ステピオサイド 1重量部に対してレバウディォサイド Aを 4重量部 以上を含む甘味料の製造方法であり、前項の植物体またはその乾燥葉を水、または 含水溶媒で抽出することを特徴とする。
[0009] 本発明の第 3は、ステピオサイド 1重量部に対してレバウディォサイド Aを 40重量部 以上含む高純度甘味料の製造方法であって、前項で得られた甘味料を再結晶し、ス テビォサイド 1重量部に対してレバウディォサイド Aを 40重量部以上含み、それらの 含量が 92%以上を含む甘味料の製造方法である。
交配と選別による品種改良においては、選別された品種の特定方法が重要な意味 を持つ。本発明者らは、 RAPD法によって、 DNA鑑定による特定方法を検討した。 発明の効果
[0010] 本発明によれば、甘味質の優れた甘味料およびその製造方法が提供される。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]守田品種、 SSおよび SNの DNA塩基配列の電気泳動図である。矢印部分に 特徴的な塩基配列が認められる。
[図 2]守田品種、および SNの DNA塩基配列の電気泳動図である。矢印部分に特徴 的な塩基配列が認められる。 符号の説明
[0012] 図 1における記号 a〜hはそれぞれ下記の通りである。
a: Hind ΠΙマーカー
b、 e : SN品種
c、 f:守田品種
d、 g: SS品種
h : lkbp DNAラダーマーカー
図 2における記号は以下の通りである。
守：守田品種
SN : SN品種
M : DNAマーカー（lOObp ラダー）
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明の識別に用いられる RAPD法 (Random Amplified Polymorphic DNA method )は DNAの解析手法の 1つであり、複数のプライマーを用いて PCR (ポリメラーゼ連鎖 反応)を行うと、用いたプライマーと同一または類似の配列に挟まれた DNAの領域が 増幅され、その増幅された DNAのパターンを電気泳動で解析する方法である。また 、セチルトリメチルアンモニゥムブロミド (CTAB : Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) は長鎖アルキル基をもつ第 4級アンモニゥム塩基であり、核酸のようなポリア二オンと 不溶性の複合体を形成するために核酸の単離に利用することができる。
[0014] DNAの違いにより品種識別する手段は CTABにより植物体力 ゲノム DNAを単 離し、リボ核酸 (RNA)を除去し、プライマーミックスを用いて PCR法により得られた PC R増幅産物をァガロースゲル電気泳動法によって得られる DNAフィンガープリントの 違いにより区別する。本発明の植物体の場合、後述するように 2000bp下部に特徴 的な塩基配列を示すことが確認された。
実際には、原料の植物体について、選択的に沈殿させたゲノム DNAを雛型とし、 プライマーとして例えば A06(塩基配歹 IJ； ACTGGCCGAGGG)と A48(塩基配列； C CGCAGGGACCA)のセットおよび rTaq(TAKARA)を用いて 94度 (30秒)、 55度（ 30秒)、 72度 (120秒)で 35サイクル反応を行った後、 72度で 10分間反応させる。そ の後、 PCR増幅産物をァガロース電気泳動法によって確認し、特定の DNAバンドに より植物体が確認できる。
[0015] 甘味料の製造には、当該植物体および/またはその乾燥葉から水、または含水有 機溶媒にて抽出し、次いで抽出液をそのまま濃縮するか、または必要に応じて陽ィ オン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、活性炭でイオン性不純物を除去し、吸着樹脂に 甘味成分を吸着させ親水性溶媒で溶離して溶離液を濃縮、乾燥して甘味料が得ら れる。甘味料の製造方法はその他脱色等の慣用精製手段を適宣施すことが出来、 高純度レバウディォサイド Aを得る方法は膜分離、アルコール抽出、結晶化等の慣 用手段を適宜施すことができる。また、結晶化の方法は結晶溶媒としてエタノール、メ タノール等の有機溶媒に要すれば水を加えて、適宣使用することができる。得られた 甘味料は他の天然、人工甘味料、希釈剤等を加えることもできる。
レバウディ サイド Ά 比 白勺 農 で する。 禾重のき禾重 禾呈
[0016] 育種はレバウディォサイド Aを比較的高含有する品種のかけ合わせ選抜にて行い 、まず、レバウディォサイド Aを高濃度で含有する SF5— 1、 SF5— 2(特開平 10— 27 1928号記載)を人工的に交配し、得られた種子から TD-1 (特開 2003— 9878号記 載）を選択して、それらを更に人工的に交配し、得られた種子から、セプトリァ菌、ァ ルタナリア菌に抵抗性を有する品種を選抜し、その甘味成分を分析し、ステピオサイ ドに対してレバウディォサイド Aを 4重量部以上含み、甘味含有量が高ぐ比較的耐 病性に優れた株を選抜した。さらに、甘味成分含量、甘味成分比率、生育状況を繰 り返し確認し、守田品種として、その遺伝子を検索した。
[0017] さらに出願人は、今回、本発明に係る守田品種について、既に国際寄託を完了し た（受託番号 FERM BP— 10353)。従って、その寄託に係る守田品種の種子から 、容易に本発明の植物体を容易に入手することができる。ステビアは自家不和合性 であり、当該種子から常に目的の植物体が得られるとは限らないが、本願に記載され た DNA鑑定に従って目的物を容易に選別できる。また必要ならば、他の高品質ステ ビア種 (例えば TD— 1)と交配し、後記実施例 1に準じて選別を行えば、レバウディォ サイド Aを高濃度で含有する植物体を極めて容易に入手することができる。これら植 物体はすべて、国際寄託をした品種、即ち守田品種の種子から得られる植物体に含 まれる。
実施例
[0018] 以下に、育種過程およびその特性等を具体的に記載する。本発明は本育種過程、 栽培方法に限定されるものでない。
実施例 1
レバウディォサイド Aを比較的高濃度に含有する品種のかけ合わせで得られた種 子より、 1995年にレバウディォサイド Aを含有する SF—1、 SF5— 2品種 (特開平 10 — 271928号記載)を新見工場内ビニールハウス内で人工的にかけ合わせ、得られ た種子を 96年 3月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポット に移植し、 5月上旬に苗丈 8cm程度以上の苗 600本を工場内圃場に 10アール当た り窒素、燐、カリの肥料成分各 20kgを施肥し 2週間後に移植した。 7月上旬に追肥と して 10アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各 10kgを追肥した。
[0019] 9月上旬に調査し、その甘味成分を分析し、ステビォサイドに対してレバウディォサ イド Aを 3倍以上含む株 TD— 1品種（特開 2003— 9878号記載）を選抜した。
98年に TD-1品種を新見工場内ビニールノヽウス内で人工的にかけ合わせ、得られ た種子を 99年 3月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポット に移植し、 5月上旬に苗丈 7cm程度以上の苗 300本を工場内圃場に 10アール当た り窒素、燐、カリの肥料成分各 20kgを施肥し 2週間後に移植した。 7月上旬に追肥と して 10アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各 10kgを追肥した。
[0020] 9月上旬に調査し、その甘味成分を分析し、ステピオサイドに対してレバウディォサ イド Aを 4重量部以上含み株 TD— 1品種よりも耐病性に優れ、生育の良い株を選抜 した。 2000年 4月中旬にそれらより萌芽した芽を 100本挿し木した。 5月上旬に同様 に工場内圃場に植え付け 7月末に耐病性、生育を再度調査し、甘味成分比、含量が 優れている事を確認し、更に、 2001年から 3力年間をかけて耐病性、甘味成分比、 甘味成分含量、乾燥葉の収量が優れ、生育、成分に変化が無い事を確認し、守田 品種とした。
[0021] 守田品種、 TD— 1、および SNの比較試験 1
守田品種との他品種の比較のために、 2003年 4月中旬にレバウディォサイド Aを 主成分とする TD—l (TD)、ステビォサイドを主甘味成分とし、レバウディォサイド A を副甘味成分とする一般的なステビア品種 (SN)各 40本も同様に挿し木し、同様にェ 場内圃場に植え付けた。
上記の 5月上旬に圃場に移植した挿し木により増殖させた守田品種の苗 200本と、 TD品種、 SN苗各 40本のうち、 6月上旬に任意に選んだ各品種 10本中での発病の 有無を調査した後、守田、 TD、 SNの各品種を地上から 15cmで刈り取り後、葉部を 分離し、乾燥後分析試料とした。
分析結果は次のとおりであった。
[表 1]
Figure imgf000008_0001
守田品種、 TD、および SNの比較試験 2
7月中旬に追肥を行い、 9月上旬に各品種 1区画 20株を選択しセプトリァ菌、アル タナリア菌の発病状況を調査した後、各品種を地上部から刈り取った後、葉部を分離 し、乾燥後分析試料とした。
分析結果は次のとおりであった。
[表 2]
Figure imgf000008_0002
守田品種は下葉黒斑点の発病割合は比較的低ぐ甘味成分含量、乾燥葉収量も 他品種より優れていた。 TD品種は守田品種よりもセプトリァ菌により下葉黒斑点が多 ぐ既に葉がセプトリァ菌により黄色く変色し始めており、 SN品種はセプトリァ菌により 下葉の 3節までの部分でセプトリァ菌による黄変が見られ、地上より 1節の葉は枯れ 葉となっていた。 04年 3月に守田品種から萌芽した穂先を 200本挿し木し、 4月下旬に圃場に移植 し、 5月末、 6月末、 7月末、 8月末、 9月末、開花後の 10月末に地上部を刈り取り、葉 のみを分離した後、乾燥し、甘味成分含量を測定した。
甘味成分の測定は高速液体クロマトグラフィーにより行った。
[表 3]
Figure imgf000009_0001
[0026] 守田品種は生育期間により甘味成分含量、甘味成分比が異なり、生育期間が長く なるにつれて甘味成分含量が増え、一方、ステビォサイド含量が減少する傾向が見 られた。開花時期の 10月末には甘味成分含量の減少がみられる。
[0027] 遺伝子塩某配列の特定 (その 1)
甘味成分含量、甘味成分比、収量力 守田品種が最も優れていたことから、守田 品種を PCR法により識別した。
乾熱滅菌した乳鉢に守田品種の葉を約 0. 2グラム入れ、液体窒素を加えて乳棒で すりつぶし、マイクロチューブにスパテユラで約 0· 05gづっ入れた。 300 /i lの 2%C TAB溶液 (2%CTAB溶液 (50ml) :組成 100mM、 Tris -HCl (pH8. 0) 20mM、 E DTA(pH8. 0)、 2% CTAB、 1. 4M NaCl)を加え、転倒混和した後、 65°Cに熱 したヒートブロックにチューブを移し、 30分間カロ温した。等量（300 μ ΐ)のクロ口ホルム /イソァミルアルコール (24: 1)を加え、 5分間穏やかに攪拌する。 14000rpmで 15 分遠心分離した後、 2層に分かれた内容物の上層の水層を新しいチューブに移す。
[0028] 上記のクロ口ホルム/イソアルミアルコール以降の操作をもう一度繰り返し、水層を新 しいチューブに移す。 400 μ 1の 1%CTAB溶液 (1%CTAB溶液 (50ml) :組成 1M Tris -HCl 2.5ml, 0.5M EDTA 1.0ml, 1 % CTAB 0.5g)をカ卩え、 15分転 倒混和後、 1時間室温で静置し、 14000rpmで 15分間遠心分離を行う。
上清を捨てて、 400 μ 1の lMCsClを加え、ピペッティングをして沈殿を完全に溶か す。 900 /i lの 100%エタノールをカロえ、転倒混和後、 20°Cで 20分以上静置し、 1 4000rpmで 15分間遠心分離を行なう。上清を捨て、沈殿に 400 /i 1の 70%エタノー ルを加え 14000rpmで 15分間遠心分離を行レ、、この操作を繰り返した後に上清を 捨て、沈殿を真空乾燥機で乾燥し、 30 μ ΐの超純水に溶解する。溶液をァガロースゲ ル電気泳動し、 DNAが単離されてレ、ることを確認した。
[0029] RNAを除去する為に RNase溶液 500 μ 1(組成：上記 DNA単離溶液 100 μ 1、 RN ase(5g/ml) 5 μ 1)で 37°Cにて 1時間反応させ、反応液に PCI溶液 (組成：フエノー ル/クロ口ホルム/イソァミルアルコール、 25 : 24 : 1を穏やかに混合した後、 13000 rpmで 5分間遠心し、水層を分離した溶液)を等量加える。蓋をして穏やかに混合し た後、 13000rpmで 5分間遠心した。
[0030] 水層 (上層)を新しいマイクロチューブに移し、室温で保存していた CIA溶液 (組成： クロ口ホルム/イソァミルアルコール、容量比 24 : 1)を等量加え、穏やかに混合した 後、 15000i"pmで 3分間遠心し、水層を新しいマイクロチューブに移し、もう一度 CIA 処理を行い、得られた上清の 1/10倍量の 3M酢酸ナトリウムと 2.5倍量の 100%ェ タノールを加え、よく混ぜた後、—20°Cで 20分以上冷却し、 15000i"pmで 15分間遠 心し、 DNAをペレットにし、上清を捨て、ペレットに冷却しておいた 70%エタノールを lmlを加えた後、 15000rpmで 15分間遠心し、上清を捨て、もう一度冷却した 70% エタノールを lmlカ卩えた後、 15000rpmで 15分間遠心し、上清を捨て、減圧デシケ 一ターを用いて 5分間乾燥させた。
[0031] 得られたゲノム DNAをテンプレートとして PCR用組成物 (表 4)にて、 94°C30秒、 55 °C30秒、 72°C120秒 35サイクル反応を行った後、 72°Cで 10分間反応させる。反応 後、 4°Cに保ち PCR増幅産物を得た。 PCR増幅産物を 1 %ァガロースゲル電気泳動 で DNAバンドを確認すると、図 1の守田が示すように、およそ 2000bp下方に特徴的 な DNA断片が確認できた。
[0032] [表 4] P C R用組成物（2 0 μ 1 )
テンプレート DNA( IngZ 1 ) 5 μ 1
P r i m e r M I X ( 1 6 p m o \ / μ 1 ) 各〇 . 5 μ 1
A 0 6 * (配列番号 1 ： AC TGGC CGAGGG)
A4 8* (配列番号 2 ： C C GC AGGGAC C A)
d N T P (各 2. 5 mM) 1. 6 μ 1
1 0 xバファー 2 μ 1
蒸留水 7. 9 μ 1 rT a q (T AK AR A) 0. 5 μ 1
: AO 6および A4 8プライマーは BEX社製
Mg C 1 2 2 μ 1
[0033] 同様に、ステビォサイドを主成分としレバウディォサイド Αを副成分とする SN品種 (S N)および SS品種（SS)を上記と同様に処理した DNAバンドを図 1に示す。
守田品種はおよそ 2000bp下部に特徴的な塩基配列を有し、 DNAをァガロースゲ ル電気泳動で検出することによって、他の品種と容易に区別することが出来る。
[0034] ィ云 ffi歹 Ιίの (その 2)
上記と異なるプライマーを使用して、守田品種および SN品種の比較を行った。
<DNA抽出 >
DNA抽出は CTAB法により行った。守田品種、 SN品種それぞれの葉、約 0.5gを 乳鉢中で液体窒素により凍結し、乳棒にて粉砕した。粉砕したサンプルは 50mlファ ルコンチューブ中で 20mlの 2%CTAB溶液（lOOmM Tris-HCl pH8.0、 20m M EDTA pH8.0、 2% CTAB, 1.4M NaCl、 1% PVP)と？昆禾口し、 65°Cで 30 分インキュベートした。等量のクロ口ホルム/イソァミルアルコール（24:1)を加え、 10分 間撹拌した後、 3500i"pmで 15分遠心分離し、水層を別の 50mlファルコンチューブ に移した。
[0035] さらに等量の 100%イソプロパノールを加え、 3500rpmで 15分遠心分離し、沈殿を ホックで集め 1.5mlマイクロチューブに移した。沈殿を 75%エタノールでリンスした 後、乾燥させ 600 μ 1の ΤΕバファーで溶解した。 RNase溶液（lmg/ml)を 1 μ 1加え 、 37°Cで 1時間インキュベートしたのち、等量の TE飽和フエノールを加え混和してか ら 15000i"pmで 30分間遠心分離した。水層を別のマイクロチューブに移し 1/10量 の 3M酢酸ナトリウムと等量のイソプロパノールを加え、混禾口し 1500(kpmで 30分間 遠心分離した。得られた沈殿を 75%エタノールで 2回リンスしたのち乾燥させ 50 β 1 の TEバファーに溶解し DNAサンプルとした。
[0036] <PCR分析 >
得られた DNAサンプルを铸型として以下の反応液組成にて PCR反応を行った。 P CRサイクノレは 96°Cで 30秒反応させた後、 96。C10秒、 42°C2分、 72°C2分 35サイク ノレ、さらに 72°Cで 4分反応させた。反応後、 PCR産物は 1.8%ァガロースゲル電気 泳動により分画し、 EtBr染色後 UV照射下にて撮影した。その結果、プライマー UB C— 66において約 2000bp付近に守田品種に特異的なバンドが確認できた。またプ ライマー UBC— 72では約 600bp付近に、 UBC— 106では約 700bp付近に SN品 種に特異的なバンドが確認された。この結果から守田品種と SN品種は遺伝的に異 なる系統であり、 RAPD分析により容易にその差異が検出できることが明らかとなつ た。
[0037] 反応液組成（50 μΐ中）
10 X PCR バファー 5μ1
dNTP (2. OmM) 5μ1
RAPD プライマー * (10 mer) 5μ1(5/ιΜ)
ブレンド 'タック（Blend Taq) (商標）（TOYOBO) 0.5/il(2.5U/ μ 1) ステビア DNA 1 μ 1 (30ng/ β 1)
滅菌水 33.5/il
*プライマーとしては下記の UBC— 66、 UBC— 72または UBC— 106を用いた。
UBC-66: GAGGGCGTGA
UBC-72: GAGCACGGGA
UBC-106: CGTCTGCCCG
[0038] 実施例 2 甘味料の製造
9月末に得られた守田品種の乾燥葉 20gを 20倍量の水で甘味が感じられなくなる まで数回抽出し、抽出液を陽イオン交換樹脂 (アンバーライト IR_ 120B)20mlを充填 したカラムおよび陰イオン交換樹脂 (デュオライト A_4)20ml、粒状活性炭 5mlを充填 したカラムに通液し、通過液を吸着樹脂 (ダイヤイオン HP— 20) 100mlを充填した力 ラムに通して甘味成分を吸着させ、十分水洗後エタノール 300mlで溶離する。溶離 液を減圧下に濃縮し、乾燥して淡黄白色の粉末を得た。比較のために TD、 SNから も同様の処理をして甘味成分を得、これを分析した。
分析方法 高速液体クロマトグラフィー法
使用カラム Hibar Licrosorb NH 5 μ 4mm (直径) X 250mm
2
流速 1.5mlZ分
展開溶媒 ァセトニトリル:水 =82 : 18
測定波長 210nm
[0039] 表 5に抽出精製物の分析結果を示す。表中の STはステピオサイド、 RAはレバゥデ ィォサイド Aである。
[表 5]
Figure imgf000013_0001
[0040] 官能試験 1
実施例 2で得られた守田、 SNの淡黄色の粉末の各 0.1 %溶液を調製し、ステビア 甘味料の味質に精通したパネラー 10人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
[表 6]
Figure imgf000013_0002
各試料において守田品種は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質に おいて優れていた。
官能試験 2
実施例 2で得られた守田、 TDの淡黄色の粉末の各 0.1 %溶液を調製し、ステビア 甘味料の味質に精通したパネラー 10人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
[表 7]
Figure imgf000014_0001
各試料において守田品種は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質に おいて優れていた。
[0042] 実施例 3 高純度レバウディォサイド A甘味料の製造
実施例 2で得られた抽出精製物（守田品種） 2gを 10倍量の 95%メタノールに加熱 溶解した後に、 4°Cに 6日間冷却放置し、得られた結晶を分離し、冷メタノールで洗浄 後、減圧乾燥し、白色の結晶 1. 2gを得た。比較のために TD、 SNからも同様の処理 をしてそれぞれ白色の結晶 0. 9gおよび 0. 6gを得、これを分析した。
分析方法 高速液体クロマトグラフィー法
使用カラム Hibar licrosorb NH 5 μ 4mm (直径） X 250mm
2
流速 1.5ml/分
展開溶媒 ァセトニトリル:水 = 82 : 18
測定波長 210nm
[0043] 表 8に抽出精製物の分析結果を示す。表中の STはステピオサイド、 RAはレバゥデ ィォサイド Aである。
[表 8]
Figure imgf000014_0002
[0044] 官能試験 3 実施例 3で得られた SN白色の粉末の各 0.1 %溶液を調製し、ステビア甘味料の味 質に精通したパネラー 10人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
[表 9]
Figure imgf000015_0001
各試料において守田品種は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質に おいて優れており、高純度製品の回収率も優れていた。
官能試験 4
実施例 3で得られた TDの白色の粉末の各 0.1 %溶液を調製し、ステビア甘味料の 味質に精通したパネラー 10人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
[表 10]
Figure imgf000015_0002
各試料において守田品種は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質に おいて優れており、高純度製品の回収率も優れていた。
実施例 4 高純度レバウディォサイド A甘味料の製造
実施例 2で得られた抽出精製物（守田品種）の 2gを 5倍量の 75%メタノールに加熱 溶解した後に、 4°Cに 7日間冷却放置し、得られた結晶を分離し、冷メタノールで洗浄 後、減圧乾燥し、白色の結晶 0. 9gを得て、分析した。 11]
Figure imgf000016_0001
1/1
紙面 t る写し (as β子データが ®本となります）
[この用紙は、国際出 «の一部を榕成 、国際出《の用紙の枚数に »入しない]
Figure imgf000017_0001
受理官庁記入檷
-4 この用紙は国際出 «とともに受理した
(はい/いいえ）
-4-1 権限のある職貝 国際事務局記入檷
-5 この用紙が国際事務局に受理された日
-5-1 権阻のある《1^
差^え ^ m

Claims

請求の範囲
[1] ステピオサイド 1重量部に対してレバウディォサイド Aを少なくとも 4重量部以上含む ステビア'レバウディアナ ·ベルトニー品種であって、 RAPD法による DNA解析にお V、て 2000bp下部に特徴的な塩基配列を示す植物体。
[2] 国際寄託（受託番号 FERM BP— 10353)の種子より得られる、請求項 1の植物 体。
[3] 請求項 1に記載の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出すること を特徴とする甘味料の製造方法。
[4] 請求項 2に記載の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出すること を特徴とする甘味料の製造方法。
[5] 請求項 3に記載の方法により得られる甘味料から、ステピオサイド 1重量部に対して レバウディォサイド Aを少なくとも 40重量部以上含み、かつ純度 92°/。以上の高純度 レバウディォサイド Aを得る方法。
[6] 請求項 4に記載の方法により得られる甘味料から、ステピオサイド 1重量部に対して レパウディォサイド Aを少なくとも 40重量部以上含み、かつ純度 92%以上の高純度 レバウディォサイド Aを得る方法。
差替え用弒 m e)
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