WO2006001380A1

WO2006001380A1 - 物質の製造法

Info

Publication number: WO2006001380A1
Application number: PCT/JP2005/011637
Authority: WO
Inventors: Shin-Ichi Hashimoto; Kazuhiko Tabata
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2006-01-05
Also published as: EP1783203B1; ATE455845T1; EP1783203A4; US20080038786A1; CN101065477A; ES2337379T3; JPWO2006001380A1; EP1783203A1; US8211688B2; DE602005019063D1; CN101065477B; JP4898441B2

Abstract

　本発明によれば、グルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ(GlnE蛋白質)およびグルタミンシンテターゼ調節蛋白質PIIの活性が低下または喪失し、かつＬ－グルタミンまたはＬ－グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いたＬ－グルタミンまたはＬ－グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質の製造法が提供される。

Description

明細書

物質の製造法

技術分野

[0001] 本発明は、 L—グノレタミンまたは L_グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いた L—グノレタミンまたは該物質の製造法に関する。

背景技術

[0002] ェシエリヒア属に属する微生物などにおいて、 Lーグノレタミンは自身が蛋白質合成の基質であるとともに、プリンやピリミジンの核酸および L アルギニン、 L ヒスチジン、 L トリプトファンおよび L ァスパラギンなどのアミノ酸の生合成において、窒素の供給基質となっている。

一方、 L—グルタミンの生合成は遺伝子にコードされるグルタミンシンテターゼ（ GS)によって行われるが、 GS活性は非常に厳密かつ複雑な制御を受けることが知られている。すなわち GSはアデユリルイ匕されることで活性を負に調節されている。このアデ二リル化および脱アデ二リル化は g ^遺伝子にコードされるグルタミンシンテターゼァデニリルトランスフェラーゼ（以下、 GlnE蛋白質と称す）によって触媒され、どちらの方向を触媒するかはさらに £ 遺伝子にコードされるグノレタミンシンテターゼ調節蛋白質 PII (PII regulatory protein for glutamine synthetase₀以下、 GlnB蛋白質と称す）によって決定される。 GlnB蛋白質がゥリジリルイ匕されている場合は GlnE蛋白質による GSの脱アデ二リル化を促進し、逆に GlnB蛋白質がゥリジリル化されてレ、なレ、場合は GlnE蛋白質による GSのアデ二リル化を促進する。 GlnB蛋白質のゥリジリル、脱ゥリジリルイ匕は glnD遺伝子にコードされる蛋白質によって決定される。 L グルタミンは脱ゥリジリル化を促進するため、 GSはアデユリルイ匕されて活性が低下し、 L グルタミンの合成が低下する調節が働く。一方、 2—才キソグノレタル酸は GlnB蛋白質のゥリジリル化を促進するため、上記と逆のスキームにより L グルタミン合成が促進される（非特許文献 1および 2)。

[0003] 上記した複雑な調節機構を解除することにより L グルタミンを発酵生産する試みがなされている。特許文献 1には、 GSのアデ二リル化部位をアデ二リル化されないように改変し、かつ遺伝子の発現を強化することで L_グルタミンを生成、蓄積するェシエリヒア'コリが取得されたとの記載はある力その生産量は 1.3g/Lにすぎない。また、グルタミン生産菌としては、 glnE遺伝子が欠損したコリネダルタミクム'フラバム (特許文献 2)、 g! 遺伝子を改変しかつ l遺伝子の発現を強化したコリネダルタミクム'フラバム (特許文献 2)、 L—アルギニン生産菌としては、 areA遺伝子を導入したェシエリヒア'コリ (特許文献 3)など、 L—トリブトファン生産菌としては、トリブトファンォペロン、遺伝子および^遺伝子を導入したェシエリヒア 'コリ（特許文献 4)など、 L-ヒスチジン生産菌としては、ァミノキノリン耐性を付与したェシエリヒア 'コリ（特許文献 5)など、核酸生産菌としては、 5 ' イノシン酸を生産する ΜΐΔ、 deoD、 DurR、 ad d, gsk, edd, xapA. およびの各遺伝子が欠損し、脱感作型 lE遺伝子の発現を強化したェシエリヒア 'コリ (特許文献 6)など、 5 '—グァ二ル酸を生産する ΜΐΔ、 d eoD、。urR、 add, gsk、 edd、 xapA, ushAおよび aohの各遺伝子を欠損し、脱感作 ¾¾ur

E遺伝子および £ Δβ遺伝子の発現を強化したェシエリヒア 'コリ (特許文献 6)などが知られている力 GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下もしくは喪失した微生物であり、かつ L グルタミンまたは L グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物、および該微生物を用レ、たし -グノレタミンまたは該物質の製造法は知られてレ、なレ、。

非特霄午文！丄： E.coli and Salmonella, Second E ition(1996)

非特許文献 2 : FEMS Microb. Lett., 201, 91-98(2001)

特許文献 1：特開 2003-164297号

特許文献 2：特開 2002-300887号

特許文献 3：特開昭 57-5693号

特許文献 4：米国特許第 5,939,295号

特許文献 5：特開 2001-86998号

特許文献 6：特開 2002-355087号

発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0004] 本発明の目的は、 L—グルタミンまたは L—グノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いた L—グノレタミンまたは該物質の製造法を提供することにある課題を解決するための手段

[0005] 本発明は、以下の（1)〜（： 10)に関する。

(1) グルタミンシンテターゼアデ二リルトランスフェラーゼ（以下、 GlnE蛋白質と称す )およびグルタミンシンテターゼ調節蛋白質 ΡΠ (ΡΠ regulatory protein for glutamine s ynthetase₀以下、 GlnB蛋白質と称す）の活性が低下または喪失し、かつ L グノレタミンまたは L グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物。

(2) ェシエリヒア属に属する微生物が野生型の GlnE蛋白質をコードする遺伝子（以下、 gkiE遺伝子と称す）、および野生型の GlnB蛋白質をコードする遺伝子（以下、 gin β遺伝子と称す）の塩基配列中に塩基の欠失、置換または付加がある該遺伝子を有する微生物である、上記（1)の微生物。

(3) ェシエリヒア属に属する微生物がェシエリヒア'コリである、上記（1)または（2)の微生物。

(4) L_グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、上記（1)〜（3)のレ、ずれか 1つの微生物。

(5) アミノ酸が L アルギニン、 L トリプトファン、 L ヒスチジンおよび L グルタミン酸からなる群よりえらばれるアミノ酸である、上記（4)の微生物。

(6) 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チミジン、 5'—アデニル酸、 5'—イノシン酸、 5 '—グァニル酸、 5，ーシチジル酸、 5 ' キサンチル酸、 5'ーゥリジル酸および 5 '—チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、上記（4)の微生物。

(7) 上記（1)〜（3)のいずれか 1つの微生物を培地に培養し、該培地中に L ダルタミンまたは Lーグノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積させ、該培地から L グルタミンまたは該物質を採取することを特徴とする Lーグルタミンまたは該物質の製造法。

(8) L_グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、上記（7)の製造法。

(9) アミノ酸が L—アルギニン、 L—トリプトファン、 L—ヒスチジン、 L—グルタミン酸力もなる群よりえらばれるアミノ酸である、上記（8)の製造法。

(10) 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チミジン、 5 '—アデニル酸、 5 '—イノシン酸、 5'—グァニル酸、 5'—シチジル酸、 5' - キサンチル酸、 5'ーゥリジル酸および 5 '—チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、上記（8)の製造法。

発明の効果

[0006] 本発明により、 L_グルタミンまたは L—グノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いた L—グノレタミンまたは該物質を製造する方法が提供される。発明を実施するための最良の形態

[0007] 1. GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下または喪失したェシエリヒア属に属する微生物とその調製

GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下または喪失したェシエリヒア属に属する微生物は、既存のェシエリヒア属に属する微生物が有する glnE遺伝子または glnE 遺伝子欠損変異を Plff 質導入 [J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Col d Spring Harbor Lab.(1972)]によって 1種のェシエリヒア属に属する微生物に集積する方法、 UV照射などの変異処理後、 GlnE蛋白質または GlnB蛋白質の活性が低下または喪失した菌株を選択する方法、またはェシエリヒア属に属する微生物の染色体 D

NA上の遺伝子および glnn遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法などにより取得することができる。ここで、 glnE遣伝子および glnB遣伝子は、それぞれ GlnE蛋白質または GlnB蛋白質をコードする塩基配列にプロモーター配列などの該遺伝子の発現を調節する領域を含む塩基配列が付加した配列よりなる本発明において GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下したェシエリヒア属に属する微生物とは、上記変異を導入することにより、該変異導入前の株 (親株）に比ベ、 GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下している微生物であり、好ましくは 8 0%以下、好ましくは 50%以下、より好ましくは 30%以下、さらに好ましくは 20%、特に好ましくは 10%以下、最も好ましくは 5%以下に低下した微生物をいう。 GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性は、公知の方法により測定することができる。

[0008] 微生物の染色体 DNAの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したレ、宿主細胞内では自立複製できなレ、薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド DNAと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、好ましい相同組換えを利用した方法としてはラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法 [Proc. Natl. Acad. S ci. USA, 97, 6641-6645(2000)]をあげることができる。

[0009] 該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体 DNA上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜 1 日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体 DN A上において 2回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体 DNA 上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体 DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認すること力 Sできる。また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖 DNAを用いた方法をあげることができる

[0010] 具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖 D NAを細胞内に取り込ませ、染色体 DNAと導入した直鎖 DNAとの間で相同組換えが起こさせる方法である。本方法は、直鎖 DNAを取り込む能力を有するェシエリヒア属に属する微生物、好ましくはェシエリヒア'コリ、より好ましくはえファージ由来の組換えタンパク質群 (Red組換え系）を発現してレ、るシヱリヒア 'コリに用いることができる

[0011] λ Red組換え系を発現しているェシエリヒア'コリとしては、 Red組換え系遺伝子を有するプラスミド DNAである pKD46 [ェシエリヒア'コリジェネティックストックセンタ一（米国エール大学）より入手可能]を保有するェシエリヒア'コリ JM101株等をあげること力 Sできる。

相同組換えに用いられる DNAとしては、

(a)塩基の欠失、置換または付カ卩の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端の外側に存在する DNAと相同性を有する DNAを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖 DNA、

(b)塩基の欠失、置換または付カ卩の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端の外側に存在する DNAと相同性を有する DNAが連結した直鎖 DNA、

(c)薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子からなる DNAの両端に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端の外側に存在する DNAと相同性を有する DNAを有する直鎖 DNA、および

(d)上記（a)の直鎖 DNAにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体 DNA上の領域の両端の外側に存在する DNAと相同性を有する DNAの間に、さらに酵母由来の Flp rec ombinase [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5875 (1985)〕が認識する塩基配列を有する DNA、

をあげることができる。

[0012] 薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、レ、ずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にェシエリヒア 'コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフエ二コール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。

[0013] ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来の^遺伝子 [

Appl. Environ. Microbiol., 59, 1361-1366 (1993) ]、およびェシエリヒア属に属する微生物由来の遺伝子 [Genomics, 72, 99-104(2001)]等をあげることができる。

[0014] 上記の直鎖 DNAの両末端に存在する、置換または欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端の外側に存在する DNAと相同性を有する DNAは、直鎖 DN Aにおいて、染色体 DNA上の方向と同じ方向に配置され、その長さは 10bp〜100bp 程度が好ましぐ 20bp〜50bp程度がより好ましぐ 30〜40bp程度がさらに好ましい。酵母由来の Flp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号 9で表される塩基配列を有する DNA、および該 DNAにおいて 1個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来の Flp recombinaseが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有する DNAをあげることができる。

[0015] 上記の相同性を有する DNAとは、上記直鎖 DNAが、染色体 DNA上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有する DNAであり、具体的な相同性としては、 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 100%の相同性を有する DNAをあげることができる。

上記塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST[Pro. Natl . Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLASTNや BLASTX とよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]。 BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えば Score = 100、 wordlength= 12とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公矢口で ¾>る (http://www.ncbi.nlm.nih.gov·)。

[0016] 上記直鎖 DNA断片は、 PCRにより作製すること力できる。また上記直鎖 DNAを含む DNAをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖 DNAを得ることちでさる。相同組換えを利用した微生物の染色体 DNAに塩基の欠失、置換または付加を導入する、より具体的な方法としては、以下の方法 1〜4をあげることができる。

方法 1：上記（a)または（d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNAが染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。

方法 2：上記方法 1により取得された形質転換株に、上記 (b)の直鎖 DNAを導入し、該方法により染色体 DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体 DNA上の領域を置換または欠失させる方法。

方法 3 :

[1]上記（c)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、

[2]染色体 DNA上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置する DNAと相同性を有する DNAを、染色体 DNA上における方向と同一の方向で連結した DN Aを合成し、上記 [1]で得られた形質転換株に導入する、

[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記 [2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体 D NA上力削除された株として選択する方法。

方法 4 :

[1]上記（d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、

[2]上記 [1]で得られた形質転換株に Flp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記 [1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。

上記方法で用いられる、直鎖 DNAを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へ DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムィオンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci" USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63-248394)、エレクト口ポレーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16. 6127 (1988)] 等をあげることができる。

[0018] 方法 2または方法 3 [2]で用いられる直鎖 DNAにおいて、該 DNAの中央部付近に、染色体 DNA上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖 DNAを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体 DNA上に揷入することができる。

上記方法 2〜4は、最終的に得られる形質転換株の染色体 DNA上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法である。よって、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体 DNA上の位置の異なる 2以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。

[0019] 上記方法により取得された GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下もしくは喪失した微生物力 Lーグノレタミンまたは L グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有することは、該微生物を培地に培養し、該培地中に生成、蓄積する L グルタミンまたは該物質を公知の方法、例えば HPLC を用いた分析またはバイオアツセィ等により容易に確認することができる。

[0020] 上記方法により調製できる GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が喪失し、かっし —グルタミンを生成、蓄積するェシエリヒア属に属する微生物としては、 glnE遣伝子および GlnB遺伝子が欠損しているェシエリヒア'コリ JGLBE1をあげることができる。

上記した GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下または喪失したェシエリヒア属に属する微生物は、 L—グノレタミンを生成、蓄積する能力を有するだけでなぐ L- グルタミン力供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力も有する。

[0021] L_グルタミンからから供給される窒素を利用して生合成される物質としてはァミノ酸および核酸などをあげることができ、アミノ酸としては、好ましくは L—アルギニン、 L —ヒスチジン、 L—トリプトファンおよび L—グノレタミン酸など、核酸としては、好ましくはアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チミジン、 5 ' _ァデュル酸、 5' イノシン酸、 5 '—グァニル酸、 5 'ーシチジル酸、 5 'ーキサンチル酸、 5 '—ゥリジル酸および 5 '—チミジル酸などをあげることができる。

[0022] GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下または喪失し、かつ L—グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物としては、ェシエリヒア'コリ JGLBE1をあげることができる他、上記方法で得られる微生物に、さらに、

(a)該物質の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法、

(b)該物質の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法、

(c)該物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加させる方法、

(d)該物質の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも 1つを弱化または遮断する方法、および

(e)野生型株に比べ、該物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、などの方法を単独または組み合わせて用いて取得される微生物をあげることができる。

[0023] 該物質がアミノ酸である場合、上記（a)については、例えば Agric. Biol. Chem., 43, 105— 111(1979)、 J. Bacteriol., 110, 761— 763(1972)および Appl. Microbiol. Biotechnol ·, 39, 318-323(1993)など、上記（b)については、例えば Agric. Biol. Chem., 43, 105- 111(1979)および J. Bacteriol., 110, 761- 763(1972)など、上記（c)については、例えば Appl. Microbiol. Biotechnol, 39, 318-323(1993)および Agric. Biol. Chem., 39, 37 1-377(1987)など、上記（d)については、例えば AppL Environ. MicribioL, 38, 181-19 0(1979)および Agric. Biol. Chem. , 42, 1773-1778(1978)など、上記（e)については、例えば Agric. Biol. Chem., 36, 1675— 1684(1972)、 Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1 977)、 Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)および Agric. Biol. Chem., 51, 2089- 2094(1987)などに記載されている。また、該物質が核酸である場合、上記（a)〜（e) の体的方法は、 Biotechnology second, completely revised eddition, ed. H. J. Re hm, . Reed, A. Puhler, and P. Stadler, vol. 6， products of primary metabolism" ed . M. Roehr, VCH verlagsgesellschaft mbH, Weinheim(1996)および特開 2002-35508 7号などに記載されている。 [0024] また、 L—グノレタミン力供給される窒素を利用して生合成される物質を生産する能力を有することがすでに知られているェシエリヒア属に属する微生物の GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性を上記した方法により低下または喪失させる方法によって得られる微生物も本発明の微生物としてあげることができる。

L_グルタミン力供給される窒素を利用して生合成される物質を生産する能力を有する公知のェシエリヒア属に属する微生物としては、 L—アルギニン生産菌であるェシエリヒア'コリ (特開昭 57-5693号)など、 L—トリプトファン生産菌であるェシエリヒア 'コリ（米国特許第 5,939,295号）、 L ヒスチジン生産菌であるェシエリヒア 'コリ（特開 2001-86998)、 L グルタミン酸生産菌であるェシエリヒア'コリ（特開平 5-244970)、 5 '—イノシン酸生産菌である、ェシエリヒア 'コリ (特開 2002-355087)、 5 '—グァニル酸生産菌であるェシエリヒア'コリ (特開 2002-355087)などをあげることができる。

2.本発明の製造法

上記 1の方法で調製することができるェシエリヒア属に属する微生物を培地に培養し、該培地中に L グルタミンまたは L グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積させ、該培地から Lーグノレタミンまたは該物質を採取することにより L グルタミンまたは該物質を製造することができる。

[0025] L グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質としては、上記 1の物質をあげることができる。

本発明の製造法で用レ、られる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど本発明の微生物の増殖、および L—グルタミンまたは L—グノレタミンからから供給される窒素を利用して生合成される物質の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のレ、ずれでもよレヽ。

[0026] 炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよぐグノレコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などをあげることができる。

窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニゥム等のアンモニゥム塩、ァミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。

[0027] 無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。

ビタミンとしては、ピオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質 (例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。

[0028] 培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は 20〜50°C、好ましくは 20〜42°C、より好ましくは 28〜38°Cである。培養 pHは 5〜9 、好ましくは 6〜7.5である。培養時間は、 5時間〜 5日間、好ましくは 16時間〜 3日間である。

培地中に蓄積した Lーグノレタミンまたは L—グルタミンからから供給される窒素を利用して生合成される物質は、通常の精製方法によって採取することができる。例えば L—グノレタミンは、培養後、遠心分離などで菌体ゃ固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別によって採取することができる。

[0029] 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例 1

[0030] glnE遣伝子、 sing遺伝子が欠損した微生物の作製

ェシエリヒア'コリの染色体 DNA上の特定遺伝子の欠損は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法 [Pro Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6641- 6645(2000)]に従つて行った。なお、以下に示すプラスミド pKD46、 pKD3および pCP20は、ェシエリヒア' コリジェネティックストックセンター（米国エール大学)から該プラスミドを保持するェシエリヒア'コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。

(1)遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片のクローニング

ェシエリヒア 'コリ K12株の gln£、 glnnの各遺伝子の塩基配列は既に明らかにされてレ、る [Science, 5331. 1453-1474(1997)] ₀報告されている塩基配列に基づいてパーセプティブ'バイオシステムズ社製 8905型 DNA合成機を用いて、 £遺伝子欠損用のプライマー DNAとして配列番号 1および 2で表される塩基配列からなる DNA、 glnE 遺伝子欠損用のプライマー DNAとして配列番号 3および 4で表される塩基配列からなる DNAを合成した。合成したプライマー DNAは、各々の欠失の標的遺伝子の上流と下流に位置する 36bpからなる塩基配列に基づき設計した。

[0031] 上記合成 DNAをそれぞれプライマーセットとして用レ、、 pKD3DNAを铸型として P CRを行った。 PCRはプラスミド DNA 10ng、プライマー各 0.5 μ mol/L、 EfiiDNAポリメラーゼ (ストラタジーン社製） 2.5units、 Pfu DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液 (ストラタジーン社製) 4 μ L、 deoxyNTP各 200 μ mol/Lを含む反応液 40 μ Lを用レ、、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間からなる工程を 30回繰り返すことにより行った。

[0032] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量の TE[10 mmol/L Tris_HCl(pH8.0)、 lmmol/L EDTA] 飽和フエノール/クロ口ホルム（lvol/lvol)溶液を添加し、混合した。

該混合液を遠心分離後、得られた上層に 2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、 -80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して DNAを沈殿させた後、該 DNAを 2

0 しの丁£に溶解した。上記操作により、 glnE遺伝子欠損用、および glnE遺伝子欠損用のクロラムフエ二コール耐性遺伝子断片をそれぞれ取得した。

(2)染色体 DNA上の £lnE遺伝子が欠損したェシエリヒア 'コリ JM101株の作製ェシエリヒア 'コリ JM 101株を pKD46で形質転換した後、 100mg/lのアンピシリンを含む LB寒天培地上で pKD46を保持するェシエリヒア'コリ JM101株（以下、ェシエリヒア' コリ JM101/pKD46と称す）を選択した。 10mmol/Lの L-ァラビノースと 50 μ g/mlのアンピシリン存在下で培養したェシエリヒア'コリ JM101/pKD46を、電気パルス法により gin E遺伝子欠損用クロラムフヱニコール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、 JM101株の染色体 DNA上の glnE遺伝子にクロラムフエ二コール耐性遺伝子が揷入され、 glnE 構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を 25mg/Lのクロラムフヱニコールを含む LB寒天培地上で選択した。

[0033] 取得したクロラムフエ二コール耐性株を、 25mg/Lのクロラムフエ二コールを含む LB 寒天培地にレプリカし、 42°Cで保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを 25mg/Lのクロラムフエ二コール含む LB寒天培地、および 100mg/Lのァンピシリンを含む LB寒天培地にレプリカし、クロラムフエ二コール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。次にこの pKD46脱落株を pCP20で形質転換し、 100mg/Lのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°Cでー晚培養した。 [0034] 生育してきたアンピシリン耐性株を薬剤無添カ卩の LB寒天培地にレプリカし、 42°Cで保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを薬剤無添加の LB 寒天培地、 25mg/Lのクロラムフエ二コール含む LB寒天培地、および 100mg/Lのアンピシリンを含む LB寒天培地にレプリカし、クロラムフエ二コール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。ここで得られた各株からそれぞれ染色体 DNA を常法 (生物工学実験書、日本生物工学会編 97〜98頁、培風館、 1992年)により調製した。 gkiE遺伝子の内部配列を元に設計した配列番号 5および 6で表される塩基配列からなるプライマー DNAを用いて、コロニー PCRを行った。

コロニー PCRは、 200 μ 1のピペットチップをコロニーに触れさせることで取得した量の菌体、プライマー各 0.5 μ mol/L、 E£iDNAポリメラーゼ 2.5units、 Pfo DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液 4 μ L、 deoxyNTP各 200 μ mol/Lを含む反応液 40 μ 1を用レ、、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間からなる工程を 30回繰り返すことにより行った。 P CRに供した株のうちで遺伝子増幅の見られなかった株は、 glnE遺伝子欠損株であることを確認し、ェシエリヒア'コリ JGLE1と命名した。

[0035] また、上記と同様の操作により、ェシエリヒア'コリ JM101/pKD46を glnE遺伝子欠損用クロラムフエ二コール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、 ginn遺伝子が欠損したェシエリヒア ·コリを取得し、ェシエリヒア ·コリ JGLB 1と命名した。

(3)染色体 DNA上の ginE遺伝子および glnS遺伝子が欠損したェシエリヒア'コリ JM1

01株の作製

上記（2)で得られたェシエリヒア'コリ JGLE1株を pKD46で形質転換した後、 100mg/ Lのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布し、 30°Cでー晚培養することにより pKD46 を保持するェシエリヒア'コリ JGLE1株（以下、ェシエリヒア'コリ JGLEl/pKD46と称す）を取得した。上記（2)と同様の操作により、ェシエリヒア'コリ JGLE1/DKD46を glnB遣伝子欠損用クロラムフエニコール耐性遺伝子断片を用いて電気ノ^レス法により形質転換し、染色体 DNA上の遺伝子が欠損するように組換えられた株を取得した。

£klS遺伝子の内部配列を元に設計した配列番号 7および 8で表される塩基配列からなるプライマー DNAを用いて、上記（2)の条件下でコロニー PCRを行った。該 PCR により遺伝子増幅が見られなかった株は、 glnE遺伝子欠損株であることを確認し、ェシエリヒア'コリ JGLBE1と命名した。

実施例 2

[0036] glnE遺伝子、遺伝子が欠損した微生物を用いた L グルタミンの発酵生産（1)

ェシエリヒア 'コリ JM101、実施例 1で得られたェシエリヒア 'コリ JGLB1、ェシエリヒア •コリ JGLE1およびェシエリヒア'コリ JGLBE1をそれぞれ 8mlの LB培地 [lOg/1バクトトリプトン (ディフコ社製）、 5g/lイーストエキス (ディフコ社製）、 5g/l塩ィ匕ナトリウム]が入つている試験管に接種し、 28°Cで 17時間培養した。該培養液をそれぞれ生産培地 [1 6g/Lリン酸水素二カリウム、 14g/Lリン酸二水素カリウム、 5g/L硫酸アンモニゥム、 1 g/Lクェン酸（無水）、 5g/Lカザミノ酸（ディフコ社製）、 10g/Lグルコース、 10mg/L ビタミン B、 25mg/L硫酸マグネシウム · 7水和物、 50mg/L硫酸鉄 · 7水和物、 pH7.2

1

に 10mol/Lの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミン B、硫酸マグネシウム · 7

1

水和物、硫酸鉄 · 7水和物は別個に蒸煮後添加した]が 8ml入っている試験管に 1 % 接種し、 30°Cで 24時間培養した後、該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。

[0037] 培養上清中の生成物を F_moc化法で誘導体化した後に HPLC法により分析した。 H PLC法による分析は、分離カラムに ODS- HG5 (野村化学社製）、溶離液として八液（酢酸 6ml/l、 20。/。(ν/ν)ァセトニトリル、トリェチルァミンにて ρΗ4·8に調整）および Β液 (酢酸 6ml/l、 70%(v/v)ァセトニトリル、トリェチルァミンにて ρΗ4·8に調整）を用い、分析開始後 5分までは Α液： B液 =8： 2、 5分〜 20分までは、 20分に達したときに A液： B液 = 1： 1になるようにリニアーグラジェントをかける条件で分析を行った。結果を表 1 に示す。

[0038] [表 1] L-グルタミン（mg/L) L-グルタミン酸（mg/L)

JM101 0 24

JGLB1 0 25

JGLE1 10 53

JGLBE1 620 29

[0039] 表 1に示すように、 £ΐπΕ遺伝子または glnS遺伝子の単独欠損株であるェシエリヒア- コリ JGLB1およびェシエリヒア'コリ JGLE1に比べ、 glnE遺伝子および glnB遺伝子力 ^ 欠損しているェシエリヒア'コリ JGLBE1は、培地中に著量の L グノレタミンを蓄積することがわかった。

実施例 3

slnE遺伝子および glnE遺伝子が欠損した微生物を用いた L グルタミンの発酵生産 (2)

実施例 1で得られたェシエリヒア 'コリ JGLBE1を 50mlの LB培地が入っている 300ml 容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 17時間培養した。

[0040] 該培養液を 950mlのジャー培養用生産培地 [7g/Lリン酸二水素カリウム、 5g/L塩化アンモニゥム、 lg/Lクェン酸 (無水）、 5g/L酵母エキス (極東製薬工業社製）、 10m g/L硫酸マンガン · 7水和物、 20g/Lグルコース、 10mg/Lビタミン B、 2g/L硫酸マグ

1

ネシゥム · 7水和物、 0.2g/L硫酸鉄 · 7水和物、 ρΗ7.2に 10mol/Lの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミン B、硫酸マグネシウム · 7水和物、硫酸鉄 · 7水和物は別個

1

に蒸煮後添加した]が入っている 2Lのジャーフアーメンターに 1 %接種した。培養中の培地 pHは 18%水酸化アンモニゥムで pH7.0に保持し、培養温度 30°C、撹拌速度 90 0卬 m、滅菌フィルターで除菌した圧縮空気を l.Owmで通気しながら培養した。最初に添カ卩したグノレコースがなくなった後（24時間後）、滅菌した 60%グノレコース溶液を 1 時間あたり 10〜 13mlの速度で供給した。

50時間培養した後の培養液を実施例 2と同様の方法で分析した結果、培養液中には 8.0g/Lの L グノレタミンが蓄積していた。

産業上の利用可能性

[0041] 本発明により、 L グルタミンまたは Lーグノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を効率よく製造することができる。

配列表フリ' —テキスト

[0042] 配列番号 1 - -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 2 - -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 3 - -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 4 - -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 5 - -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 6 - -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 7 - -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 8 - -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 9 - -人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲

[1] グルタミンシンテターゼアデ二リルトランスフェラーゼ（以下、 GlnE蛋白質と称す）およびグノレタミンシンテターゼ調節蛋白質 ΡΠ (ΡΠ regulatory protein for glutamine synthe tase₀以下、 GlnB蛋白質と称す）の活性が低下または喪失し、かつ L グノレタミンまたは L グルタミン力供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物。

[2] ェシエリヒア属に属する微生物が野生型の GlnE蛋白質をコードする遺伝子、および野生型の GlnB蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失、置換または付加がある該遺伝子を有する微生物である、請求項 1記載の微生物。

[3] ェシエリヒア属に属する微生物がェシエリヒア'コリである、請求項 1または 2記載の微生物。

[4] L—グノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の微生物。

[5] アミノ酸が L—アルギニン、 L—トリプトファン、 L—ヒスチジンおよび L—グルタミン酸力もなる群より選ばれるアミノ酸である、請求項 4記載の微生物。

[6] 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チミジン、

5 '—アデニル酸、 5 '—イノシン酸、 5，—グァニル酸、 5 '—シチジル酸、 5，—キサンチル酸、 5 '—ゥリジル酸および 5 '—チミジル酸からなる群より選ばれる核酸である、請求項 4記載の微生物。

[7] 請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載の微生物を培地に培養し、該培地中に L—ダルタミンまたは Lーグノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積させ、該培地から L グルタミンまたは該物質を採取することを特徴とする Lーグルタミンまたは該物質の製造法。

[8] Lーグノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、請求項 7記載の製造法。

[9] アミノ酸が L アルギニン、 L トリプトファン、 L ヒスチジンおよび L グルタミン酸力もなる群より選ばれるアミノ酸である、請求項 8記載の製造法。

[10] 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チミジン、 5'—アデニル酸、 5'—イノシン酸、 5，—グァニル酸、 5'—シチジル酸、 5，—キサンチル酸、 5'—ゥリジル酸および 5'—チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、請求項 8記載の製造法。