WO2005063981A1 - 抗cd40抗体の変異体 - Google Patents

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Nobuaki Takahashi
Toru Miura
Yoshinori Kitagawa
Aki Hirano
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-CD40 antibody that recognizes CD40, which is a cell membrane molecule involved in immunity. Further, the present invention also provides an antibody in which a mutation is introduced into a constant region of a human antibody in order to reduce ADCC activity and CDC activity while maintaining agonistic and enzymatic activity.
  • the present invention also relates to an antibody in which a partial structure of a subclass is substituted.
  • CD40 is an antigen present on the surface of the cell membrane with a molecular weight of 50 kDa.
  • B cells and dendritic cells are an antigen present on the surface of the cell membrane with a molecular weight of 50 kDa.
  • DC is expressed on certain cancer cells and thymic epithelial cells.
  • CD40 is a B cell
  • CD40 has been identified as an antigen expressed on the surface of human ⁇ -cells ( ⁇ . ⁇ . Clark et al., Pro Natl. Acad.
  • CD40 is a low-affinity NGF receptor or TNF receptor
  • CD40L human and mouse CD40
  • Dendritic cells have a strong antigen-presenting ability and a strong helper T (Th) cell activation ability. In addition, dendritic cells are thought to control the differentiation of naive Th cells into Tli 1 or Th2 cells.
  • DC1 obtained by culturing peripheral blood monocytes, myeloid dendritic cells, with GM-CSF and IL-4 and matured by CD40L have II-12 production ability in vitro.
  • lymphoid dendritic cells obtained by culturing plasmacytoid T cells in the lymphoid tissue T region and peripheral blood with IL-3 and CD40 ligands do not have the ability to produce IL-12. It has been shown to stimulate Th cells to induce IL-4 producing T cells and promote differentiation into ⁇ 1 ⁇ 2. Thl cells are involved in the activation of cell-mediated immunity, and ⁇ 1 ⁇ 2 cells are thought to be involved in the suppression of cell-mediated immunity as well as enhancing humoral immunity. Cytotoxicity activated by help of Thl cells ⁇ cells
  • CTL can remove pathogens that grow in the cytoplasm (such as many viruses, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, and Toxoplasma gondii) and tumor cells.
  • Anti-CD40 monoclonal antibody that recognize CD40 expressed on the membrane surface exhibit various biological activities against B cells.
  • Activation of B cells is known as an action of agonistic antibodies.
  • anti-CD40 antibodies induce cell adhesion (BarreU et al., J. Immunol. 146:
  • B cell clones can be established from human primary cultured B cells (Banclierau et al., Science 241: 70, 1991), apoptosis of central cells in the germinal center has been reported to be inhibited through CD40 regardless of the action of the antigen receptor (Liu et al., Nature 342: 929, 1989).
  • CD40 has been identified as an antigen expressed on the surface of human B cells. Therefore, many of the isolated antibodies are mainly indexed to induce proliferation and differentiation of human B cells and to induce cell death in cancer cells.
  • Anti-CMO antibodies have been shown to mature DCs (Z. H. Zhou et. Al.,
  • CD4T cells The role of CD4T cells is reported to be through activation of CD40-CD40L]) C, and CD4 helper in the activation of dendritic cells (DCs) by anti-CD40 monoclonal antibody (mAb). It has been shown that the role of T cells can be replaced (Shoenberger, SP, et. Al .: T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-
  • CD40L interactions Nature, 480, 1998.
  • administration of anti-CD40 antibody in mice protects not only tumor cells that express CD40 but also non-expressing tumor cells. It has been shown to be possible (French, RR, et. Al .: CD40 ant ibody evokes a cytotoxic T-cel response that erad icates lymphoma and bypasses T-cel l help. Nature Medicine, 5, 1999). '
  • agonistic anti-CD40 antibodies are considered to be used for the treatment of infectious diseases such as bacteria and viruses, and the treatment of cancer.
  • WO02 / 088186 describes an anti-CD40 antibody having excellent agonistic activity.
  • Representative examples of the antigenic antibody include the KM341-1-19 antibody and the 2105 antibody.
  • Hypridorma producing KM341-1-19 antibody KM341-1-19 is September 27, 2001, Hypridorma 2105 producing 2105 antibody, April 17, 2002, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology It is deposited internationally in accordance with the Budapest Treaty at the Patent Biological Depositary Center (1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 6th Central). Accession number is FERM BP-7759
  • CD40 plays an important role in the immune response, so inhibiting the binding of CD40 and its ligands can prevent immunosuppression during organ transplantation and treatment of autoimmune diseases.
  • Sawada-Hase et al. Reported that the proportion of cells that strongly express CD40 increased in monocytes in the peripheral blood of patients with Crohn's disease ⁇ .
  • the antibody that inhibits the binding of CD40 to its ligand is still not well understood.
  • Such an inhibitory antibody may be effective, for example, for analyzing the function of CD40 or treating a disease that requires activation of CD40. Also,
  • Inhibitory antibodies against CD40 ligand have also been shown to be effective as disease drugs involving the binding of CD40 to CD40 ligand.
  • CD40L is expressed in activated platelets (V. Henn et al., Nature 391: 591, 1998), so 'anti-CD40L antibody causes thrombus when used as a therapeutic agent It has been reported that danger exists (T. Kawai et. Al., Nat. Medi. 6: 114, 2000). From this point of view, it can be expected that an antibody against CD40 is superior to anti-CD40L antibody as an antibody therapeutic that inhibits the binding between CD40 and its ligand.
  • Anti-CD40 antibody suppresses the binding of CD40L to CD40, and the antibody itself
  • an antagonistic anti-CD40 antibody can be used for the treatment of autoimmune diseases and the suppression of rejection during transplantation of organs, bone marrow, and the like.
  • W002 / 088186 describes an anti-CD40 antibody having excellent antagonistic activity.
  • a representative example of the antagonistic antibody is 4D11 antibody. 4D11 antibody-producing high-pridoma 4D11 was established on September 27, 2001, at the Patent Biological Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1st, 1st, 1st, 1st, 1st, 6th, Tsukuba, Ibaraki). Has been deposited internationally. The accession number is FE thigh BP-7758.
  • Patent Document 1 W0G2 / 088186 Publication Disclosure of Invention
  • the object of the present invention is to produce a variant that is optimized as a pharmaceutical for the anti-CD40 antibody disclosed in W002 / 088186 and expected to have a therapeutic effect.
  • the present inventors have found that a novel agonistic antibody, which is considered to have a higher therapeutic effect on diseases, and a variant of an antagonistic antibody, compared to the conventionally known anti-CD40 antibody.
  • the present invention has been completed.
  • the basic way of thinking of the modification of the anti-CD40 antibody in the present invention will be described in detail below.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2003-431408, which is the basis of the priority of the present application. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1A-1 is a diagram showing a binding site to a peptide prepared based on the sequence of CD40 of the anti-CD40 agonist antibody.
  • Figure 1A-2 shows the binding site to the peptide produced based on the CD40 sequence of the anti-CD40 agonist antibody (continuation of Figure 1A-1).
  • FIG. 1B-1 is a diagram showing a binding site to a peptide prepared based on the sequence of CD40 of an anti-CD40 antagonist antibody.
  • FIG. 1B-2 shows the binding site to the peptide produced based on the CD40 sequence of anti-CD40 Antagonis antibody (continuation of Fig. IB-1).
  • FIG. 2A shows the binding of anti-CD40 antibody to mutant CD40.
  • FIG. 2B shows the binding of anti-CD40 antibody to mutant CD40.
  • FIG. 2C shows the binding of anti-CD40 antibody to mutant CD40.
  • FIG. 3A is a graph showing that the binding activity to Ramos cells is almost the same even when the P 3 31 S mutation is introduced into the KM341- ⁇ 19 antibody.
  • Figure 3B shows that CD3 into Ramos cells even when the P3 3 1 S mutation was introduced into the KM341-1-19 antibody.
  • FIG. 5 is a diagram showing that expression promoting activity is comparable.
  • FIG. 4A is a diagram showing that CDC activity using a rabbit s complement is suppressed when a mutation of P 3 3 1 S is introduced into the KM34 ⁇ 1-19 antibody.
  • Figure 4B shows that G2 / 4 has low complement activity when human complement is used.
  • FIG. 5A — 1 shows that binding of Ramos cells does not change when the 2105 antibody subclass is converted from IgG 2 to another subclass.
  • FIG. 5A-2 shows that the binding to Ramos cells does not change when the subclass of the KM341-1-19 antibody is converted from IgG 2 to another subclass.
  • FIG. 5B-1 is a graph showing that CD95 expression promoting activity on Ramos cells decreases when the subclass of 2105 antibody is converted from IgG2 to another subclass.
  • FIG. 5B-2 shows that when the subclass of the KM34-19 antibody is converted from IgG 2 to another subclass, the CD95 expression promoting activity on Ramos cells decreases.
  • FIG. 6A-1 shows that the ability of the KM34 ⁇ 1-19 antibody to bind to Ramos cells does not depend on the hinge structure.
  • FIG. 6A-2 shows that the binding ability of the 2105 antibody to Ramos cells is not dependent on the hinge structure.
  • FIG. 6B-1 shows that the upper hinge and the middle hinge are important for the CD95 expression promotion activity of Ramos cells by the KM341-1-19 antibody.
  • FIG. 6B-2 shows that the upper hinge and the middle hinge are important for the CD95 expression promotion activity of Ramos cells by the 2105 antibody.
  • FIG. 7A shows that the ability to bind to Ramos cells does not change when F72 is converted to an IgG2 subclass.
  • FIG. 7B is a graph showing that CD95 expression promoting activity increases when F72 is converted to IgG2 subclass.
  • FIG. 8A shows that when the 4D11 antibody subclass is converted from IgG1 to ⁇ ⁇ ( ⁇ 4), the binding to Ramos cells does not change.
  • FIG. 8B shows that when the subclass of 4D11 antibody is converted from IgG1 to IgG4, CD40Ligand inhibits CD95 expression in Ramos cells to the same extent.
  • FIG. 9 shows that ADCC activity was reduced when the 4D11 antibody subclass was changed from IgGl to IgG4 or IgG4PE.
  • FIG. 10 shows that CDC activity was reduced when the subclass of 4D11 antibody was changed from IgG1 to IgG4P.
  • Figure 11 shows changes in blood B cell count (B220 positive cells in peripheral blood lymphocytes) after 4D11G1, 4D11G4P, ⁇ 4Dl 1G4PE was administered to human CD40 transgenic mice. is there.
  • Fig. 28 shows the increase in CD23 expression (CD23 positive cells in spleen B cells) in spleen B cells after administration of anti-CD40 antibody to human CD40 transgenic mice.
  • FIG. 12B shows the increase in CD86 expression in spleen B cells (CD86 positive cells in spleen B cells) after administration of anti-CD40 antibody to human CD40 transgenic mice.
  • Fig. 12C shows the increase in CD95 expression of splenic B cells (CD95 positive cells in spleen cells) after administration of anti-CD40 antibody to human CD40 transgenic mice.
  • Fig. 13A is a graph showing antigen-specific antibody (IgGl) production inhibitory activity of 4D11 and 281-1-10 in human CD40 transgenic mice.
  • FIG. 13B is a graph showing antigen-specific antibody (IgM) production inhibitory activity by 4 Dll, 281-1-10 in human CD40 transgenic mice.
  • IgM antigen-specific antibody
  • FIG. 14A is a graph showing the number of B cells in the blood (B220 positive cells in peripheral blood lymphocytes) during the antigen-specific antibody production inhibitory activity test.
  • FIG. 14B is a graph showing the number of B cells in the spleen (B220 positive cells in spleen lymphocytes) during the antigen-specific antibody production inhibitory activity test.
  • Figure 15 shows blood levels when 30 mg / kg of 4D11G4P and 4D11G4PE were administered to a power quizal It is a figure which shows the change of B cell count (B220 positive cell in a peripheral blood lymph and a sphere).
  • FIG. 16 is a diagram showing blood IL-12 concentrations during the test of FIG.
  • FIG. 17 is a graph showing the monkey DTH inhibitory effect of 4D11G4PE (delayed type hypersensitivity in male basic monkeys).
  • FIG. 18 is a graph showing the force value of anti-tenustoxin IgG in the test whose results are shown in FIG.
  • Figure 19 shows the titer of anti-tetrostoxin IgM in the test whose results are shown in Figure 17.
  • FIG. 2OA shows the effect of 4D11G4PE and 5C8 (anti-CD40 ligand antibody) on platelet aggregation.
  • FIG. 20B shows the effect of 4D11G4PE and 5C8 (anti-CD40 ligand antibody) on platelet aggregation.
  • FIG. 21 is a graph showing changes in oligomer content after incubation of 4D11G4P, 4D11G4PE-4DllG2Ser, and 4D11G4 / 2/4 at pH 2.7 and 37 ° C.
  • Figure 22 shows the anti-CD40 antibody anti-CD40 inhibitory effect on skin graft rejection.
  • FIG. 23 shows changes in tumor volume after cell transplantation when 341G2Ser was administered to tumor-bearing mice transplanted with Ramos cells.
  • FIG. 24 shows changes in tumor volume after cell transplantation when 341G2Ser was administered to a tumor-bearing mouse transplanted with T24 cells.
  • FIG. 25 shows changes in tumor volume after cell transplantation when 341G2Ser was administered to a tumor-bearing mouse transplanted with Hs766T cells.
  • FIG. 26 shows changes in tumor volume after cell transplantation when 341G2Ser was administered to a tumor-bearing mouse transplanted with Capan-2 cells.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCC recognizes cells by binding to the constant region of the antibody via Fc Recep tor expressed on the surface of macrophages, dish cells, neutrophils, etc., and is induced by activation of the recognized cells
  • cytotoxic activity refers to cytotoxic activity.
  • CDC refers to the cytotoxic activity caused by the activated complement system when an antibody binds to an antigen. These activities are known to vary in their strength depending on the antibody subclass, and it can be attributed to the difference in the structure of the constant region of the antibody (Charles A: Janeway et. al. Immunobiol ogy, 1997, Current Biology Ltd / Garl and Publishing Inc.).
  • ADCC and CDC have no activity causing cell death of CD40-expressing cells due to the mechanism of immune activation. If the CD40-expressing cells are damaged by ADCC and CDC activity, it is possible that the immunosuppressed state will be opposite to the expected immune activation, and the disease may be exacerbated.
  • CDC and ADCC activities of patients are originally increased.When normal human serum or peripheral blood is used, the activity can be detected. Even if not, it is necessary to evaluate the safety more carefully using a stronger activity such as the rabbit complement. Therefore, mutants without ADCC and CDC activity and recombinants were prepared and their activities were examined.
  • ADCC and CDC activities are known to vary depending on the antibody subclass, ADCC and CDC activities may be reduced by subclass conversion.
  • IgG4 is known as a subclass with low ADCC and CDC activity, and IgG2 has CDC activity but low ADCC activity.
  • IgGl has been reported to have both high ADCC and CDC activity (Charles A.
  • Glu233-Ser239, Gly316-Lys338, Lys274-Arg301, Tyr407-Arg416, Asn297, Glu318, Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299, Ala327-Ile332 are involved in the binding of IgG and FcR.
  • the antibody of the present invention comprises one or more amino acid mutations that reduce the ADCC and / or CDC activity, preferably 1-20, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11! ⁇ 10 pieces, 1-9 pieces, 1-8 pieces, 1-7 pieces solid, 1-6 pieces, 1-5 pieces, 1-4 pieces, 1-3 pieces or 1 or 2 pieces.
  • the hinge region of IgG2 is important for the expression of potent agonist activity. Therefore, substitution of variable regions and constant regions other than the hinge region with arbitrary subclasses, and introduction of point mutations not only improve ADCC and CDC activity, but also improve antibody productivity, purification, and storage The stability in time and the improvement of moving body in blood can be expected.
  • the stability of the antibody during purification and storage is a very important point.
  • the antibodies developed so far have the most IgGl subclass, so in order to further improve the properties of the above-mentioned anti-CD40 agonist antibodies, it is also effective to use sequences derived from the IgGl subclass except for the variable region and the binge region. I will.
  • the present invention provides the following agonistic anti-CD40 antibody variants and the like.
  • a monoclonal antibody comprising the heavy chain according to any one of [1] to [7].
  • a monoclonal antibody comprising a heavy chain according to [9] and a light chain having a variable region of a light chain of a monoclonal antibody produced by Hypridoma KM34 ⁇ 1-19 (Accession No. FERM BP-7759).
  • [1 2] A monoclonal antibody comprising the heavy chain of [1 1] and the light chain of a monoclonal antibody having the variable region of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 40.
  • [1 7] The heavy chain according to any one of [1] to [7], which has a variable region of a heavy chain of a monoclonal antibody produced by Hypridoma 2105 (Accession No. FERM BP-8024).
  • a monoclonal antibody comprising a light chain having a variable region of a light chain of a monoclonal antibody produced by the heavy chain of [17] and Hyperidoma 2105 (Accession No. FERM BP-8024).
  • a monoclonal antibody comprising the heavy chain of [19] and the light chain of a monoclonal antibody having the variable region of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 44.
  • [2 2] A monoclonal antibody comprising a heavy chain of [2 1] and a light chain of a monoclonal antibody comprising a portion of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 138 excluding the signal sequence.
  • [3 1] A host comprising the expression vector according to [2 8].
  • [3 2] A host comprising the expression vector according to [29].
  • a method for producing a heavy chain of a monoclonal antibody comprising culturing a host of [33] in a culture solution and obtaining a heavy chain of a monoclonal antibody from the culture and / or the host.
  • a method for producing a monoclonal antibody comprising culturing the host according to [32] in a culture solution, and obtaining a monoclonal antibody from the culture and / or the host.
  • a host comprising the expression vector according to [38].
  • a method for producing a heavy chain of a monoclonal antibody comprising culturing the host of [40] in a culture solution and obtaining a heavy chain of a monoclonal antibody from the culture and / or the host.
  • a method for producing a monoclonal antibody comprising culturing the host of [42] in a culture solution and obtaining a monoclonal antibody from the culture and / or the host.
  • Binds to CD40 with agonist activity including a process to replace the upper and middle hinges of antibodies without human I.gG2 upper and middle hinges with human IgG2 upper and middle hinges A method for producing a heavy chain of a monoclonal antibody.
  • a method for producing a heavy chain of a monoclonal antibody having the variable region, human IgG2 upper hinge and middle hinge comprising the step of identifying a polypeptide of the variable region of the heavy chain of the monoclonal antibody that binds to CD40.
  • a method for producing a monoclonal antibody having a variable region, a human IgG2 upper hinge and a middle hinge comprising a step of identifying a polypeptide of a variable region of a heavy chain of a monoclonal antibody that binds to CD40.
  • a pharmaceutical composition comprising an antibody as an active ingredient.
  • [5 1] A malignant tumor, pathogen, comprising administering the pharmaceutical composition of [49] to a mammal A method of preventing or treating a body or autoimmune disease.
  • the present invention also provides an antibody obtained by modifying an agonist anti-CD40 antibody belonging to human IgG2 in which a constant region other than the hinge region is substituted with a sequence derived from another subclass.
  • Another preferred subclass is IgGl.
  • ADCC activity and CDC activity are reduced, which means that ADCC activity and CDC are reduced compared to anti-CD40 monoclonal antibody that is not the above-mentioned mutant.
  • hybridoma KM341- means that ADCC activity and CDC are reduced compared to the monoclonal antibody produced by 1-19 (Accession No. FERM BP-7759) or 2105 (Accession No. FE BP-8024).
  • ADCC activity and CDC activity can be measured by a known method, for example, by the method described in the examples of the present specification.
  • the heavy chain and light chain variable region sequences of the monoclonal antibody produced by Ivry Dorma KM341-1-19 (accession number FERM BP-7759) or 2105 (accession number FERM BP-8024) are as shown below.
  • the signal sequence begins with the 50th adenine (A).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 109th [adenine] ([A]) and the 110th cytosine (C), and the boundary between the variable region and the constant region is the 493th adenine (A) and 494 It is located between the second guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th serine (S) and the 21st glutamine (Q).
  • the boundary of the constant region is located between the 148th serine (S) and the 149th alanine (A).
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the KM341- ⁇ 19 antibody is from the 110th cytosine (C) to the 493rd adenine (A) in SEQ ID NO: 37.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the thigh 34 ⁇ 1-19 antibody is from the 21st glutamine (Q) to the 148th serine (S) in SEQ ID NO: 38.
  • the signal sequence in the light chain base sequence of the KM341- ⁇ 19 antibody begins with the 29th adenine (A).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 88th [denine] ([A]) and the 89th guanine (G), and the boundary between the variable region and the constant region is the 400th adenine (A).
  • 401st [cytosine] ([C]) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th dalysin (G) and the 21st glutamate (E).
  • the boundary of the constant region is located between the 124th lysine (K) and the 125th [arginine] ([R]).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of the KM341-1-19 antibody is from the 89th guanine (G) to the 400th adenine (A) in SEQ ID NO: 39.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of the KM34-19 antibody is from 21st glutamic acid (E) to 124th lysine (K) in SEQ ID NO: 40.
  • I0SA3HSMM SM3 ⁇ 43SInMdrf3MAMiiMnAjCIA3AisM 3IdSvASAga3HSvAaAM
  • the signal sequence starts with the 70th adenine (A).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 126th [thymine] ([T]) and the 127th guanine (G), and the boundary between the variable region and the constant region is the 495th adenine (A). It is located between the 496th guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 19th cysteine (C) and the 20th darumanic acid (E).
  • the boundary between the region and the constant region is located between the 142nd serine (S) and the 143rd alanine (A).
  • the base sequence of the heavy chain variable region of the 2105 antibody is from the 127th guanine (G) to the 495th adenine (A) in SEQ ID NO: 41.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the 2105 antibody is from the 20th glutamic acid (E) to the 142nd serine (S) in SEQ ID NO: 42.
  • the signal sequence in the 2105 antibody light chain base sequence begins with the 28th adenine (A).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is the 87th [ ([A]) and 88th guanine (G), the boundary between the variable region and the constant region is between 405th adenine (A) and 406th [cytosine] ([C]) (Uses gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th dalysin (G) and the 21st glutamate (E).
  • the boundary is located between the 126th lysine (K) and the 127th [arginine] ([R]).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of the 2105 antibody is from the 88th guanine (G) to the 405th adenine (A) in SEQ ID NO: 43.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of the 2105 antibody is from the 21st glutamic acid (E) to the 126th lysine (K) in SEQ ID NO: 44.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 60th [adenine] ([A]) and the 61st cytosine (C).
  • the boundary between the variable region and the stationary region is located between the 444th adenine (A) and the 445th guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th serine (S) and the 21st glutamine (Q), and the variable region and the constant region.
  • the boundary is located between the 148th serine (S) and the 149th alanine (A).
  • the base sequence of the heavy chain variable region of 341G2Ser is from the 61st cytosine (C) to the 444th adenine (A) in SEQ ID NO: 1 31.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of 341G2Ser is from the 21st glutamine (Q) to the 148th serine (S) in SEQ ID NO: 132.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 60th [adenine] ([A]) and the 61st guanine (G).
  • the boundary between the region and the constant region is located between the 372rd adenine (A) and the 373rd [cytosine] ([C]) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th dalysin (G) and the 21st darumabic acid (E).
  • the boundary between the region and the constant region is located between the 124th lysine (K) and the 125th [arginine] ([R]).
  • the base sequence of the light chain variable region of 341G2Ser is from the 61st guanine (G) to the 372nd adenine (A) in SEQ ID NO: 133.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of 341G2Ser is from the 21st glutamic acid (E) to the 124th lysine (K) in SEQ ID NO: 13.4.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 57th [thymine] ([T]) and the 58th guanine (G).
  • the boundary between the region and the stationary region is between the 426th adenine (A) and the 427th guanine (G) Located (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 19th cysteine (C) and the 20th 'glutamate (E).
  • the boundary of the region is located between the 142nd serine (S) and the 143rd alanine (A).
  • the base sequence of the heavy chain variable region of 2105G2Ser is from the 58th guanine (G) to the 426th adenine (A) in SEQ ID NO: 135.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of 2105G2Ser is from the 20th glutamic acid (E) to the 142nd serine (S) in SEQ ID NO: 136.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 60th [adenine] ([A]) and the 61st guanine (G).
  • the boundary between the region and the constant region is located between the 378th adenine (A) and the 379th [cytosine] ([C]) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th dalysin (G) and the 21st dalbuminic acid (E). And the constant region boundary is located between the 126th lysine (K) and the 127th [arginine] ([R]).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of 2105G2Ser is from the 61st guanine (G) to the 378th adenine (A) in SEQ ID NO: 1 37.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of 2105G2Ser is from the 21st glutamic acid (E) to the 126th lysine (K) in SEQ ID NO: 1 38.
  • 2105G2Ser light chain complete nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 3 7) CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
  • anti-CD40 antibody antagonistic antibodies as in the case of agonistic antibodies, the absence of ADCC activity and CDC activity is considered to be more preferable as a pharmaceutical because of its mechanism of action. Furthermore, in the case of an antagonistic antibody, even when ADCC activity cannot be detected, it is important to avoid the activity of inducing signal by cross-linking of the antibody via Fc receptor in vivo. In other words, it is necessary to confirm that immunity is not activated in vivo, and it is considered that an antibody having such activity is necessary as a pharmaceutical product. Anti-CD40 antibody is expected as a therapeutic agent for autoimmune diseases and organ transplant rejection, but if it is weak, it may induce agonist activity even if it is weak.
  • an antibody that does not have any agonist activity is more preferable as it may cause an exacerbation of symptoms and may result in the opposite of the expected therapeutic effect.
  • IgG4 in order to further reduce the agonist activity even in vivo by a test using monkeys, it means that IgG4 has a point mutation L235E (substitution of L at position 235 to E. The same applies hereinafter.) It was shown that the introduction of is effective.
  • IgG4 is listed as an antibody subclass with low ADCC and CDC activity. When IgG4 is expressed as a recombinant protein in cells such as CHO, it has been reported that the formation of SS bonds between heavy chains is insufficient and a half-mer is secreted (Rob C.
  • the 38th L of the 4D11 antibody heavy chain variable region is Mutant substituted with (abbreviated as L38V.
  • P58K mutant, G6 mutant, I79M mutant, K81Y mutant, H87Y mutant, S98A mutant, K109R mutant, V120M mutant, T124A mutant, and N75S mutant of light chain or The combination of the aforementioned point mutations is considered possible.
  • the antibody of the present invention has one or more, preferably 1-15, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, amino acid mutations that reduce the ADCC and / or CDC activity. 1-9 pieces, 1-8 pieces, 1-7 pieces, 1-6 pieces, 1-5 pieces, 1-4 pieces, 1-3 pieces, 1 or 2 pieces.
  • the present invention provides the following antagonistic anti-CD40 antibody variants and the like.
  • amino acid substitution in the constant region is a substitution from leucine to glutamic acid at position 235 as indicated by the EU index by Kabat et al. [55], [57] and [58] Either heavy chain.
  • [6 2] A monoclonal antibody comprising the heavy chain according to any one of [5 3] to [6 1].
  • a heavy chain comprising [6 3] and a light chain having a variable region of the light chain of a monoclonal antibody produced by Hypridor 4D11 (Accession No. FERM BP-7758), Oral antibody.
  • a monoclonal antibody comprising the heavy chain of [65] and the light chain of a monoclonal antibody having the variable region of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 48.
  • [6 8] A monoclonal antibody comprising a heavy chain of [6 7] and a light chain of a monoclonal antibody comprising a portion of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 142 except the signal sequence,
  • [7 5] An expression vector having the polynucleotide of [7 1] and [7 2].
  • [7 7] A host comprising the expression vector according to [74].
  • [7 8] A host comprising the expression vector according to [7 5].
  • the host of [7 6] is cultured in a culture solution, and a monoclonal antibody heavy chain is produced comprising the step of obtaining the monoclonal antibody heavy chain from the culture and / or the host.
  • [8 0] A method for producing a monoclonal antibody, comprising culturing the host according to [78] in a culture solution, and obtaining a monoclonal antibody from the culture and / or the host.
  • a pharmaceutical composition comprising a null antibody as an active ingredient.
  • [8 3] A method for preventing or treating transplant rejection, autoimmune disease, allergy or blood coagulation factor I inhibition syndrome, comprising administering the pharmaceutical composition of [81] to a mammal. .
  • [84] [62], [64], [6 6], [84] for producing a pharmaceutical composition used for the prevention or treatment of transplant rejection, autoimmune disease, allergy or blood coagulation factor VIII inhibition syndrome group Use of the monoclonal antibody of any of [68] and [70].
  • CD40 having antigenic activity with reduced agonistic activity comprising the step of deleting or substituting one or more amino acids or adding .1 or more amino acids to the heavy chain constant region of a human antibody.
  • the present invention provides the following.
  • ADCC activity and CDC activity mean that ADCC activity and CDC are decreased as compared to the anti-CD40 monoclonal antibody that is not the above-mentioned mutant.
  • 'Hypridor 4D11 It means that ADCC activity and CDC are decreased compared to the monoclonal antibody produced by the accession number FERM BP-7758).
  • ADCC activity and CDC activity can be measured by a known method.
  • the ADCC activity and CDC activity may be measured by the method described in the examples of the present specification.
  • the heavy chain and light chain variable region sequences of the monoclonal antibody produced by Hyperidoma 4D11 (Accession No. FERM BP-7758) are shown below.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 93rd [cytosine] ([C]) and the 94th cytosine (C),
  • the boundary between the variable region and the constant region is located between the 456th adenine (A) and the 457th guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 26th serine (S) and the 27th glutamine (Q).
  • the boundary of the constant region is located between the 147th serine (S) and the 148th alanine (A).
  • the base sequence of the heavy chain variable region of the 4D11 antibody is from the 94th cytosine (C) to the 456th adenine (A) in SEQ ID NO: 45.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the 4D11 antibody is from 27th glutamine (Q) to 147th serine (S) in SEQ ID NO: 46.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 124th [thymine] ([T]) and the 125th guanine (G),
  • the boundary between the variable region and the constant region is located between the 442nd adenine (A) and the 443rd [cytosine] ([C]) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 22nd cysteine (C) and the 23rd alanine (A).
  • the boundary of is between the 128th lysine (K) and the 129th [arginine] ([R]) Located in.
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of the 4D11 antibody is from the 125th guanine (G) to the 442nd adenine (A) in SEQ ID NO: 47 ′.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of the 4D11 antibody is from the 23rd alanine (A) to the 128th lysine (K) in SEQ ID NO: 48.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 78th [cytosine] ([C]) and the 79th cytosine (C).
  • the constant region is located between the 441th adenine (A) and the 442nd guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)) c
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 26th serine (S) and the 27th glutamine (Q).
  • the boundary is located between the 147th serine (S) and the 148th alanine (A).
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the 4i) ll antibody is from the 79th cytosine (C) to the 441th adenine (A) in SEQ ID NO: 139.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the 4D11 antibody is from 27th glutamine (Q) to 147th serine (S) in SEQ ID NO: 140.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 66th [thymine] ([T]) and the 67th guanine (G).
  • the boundary between the region and the constant region is located between the 384th adenine (A) and the 385th [cytosine] ([C]) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 22nd cysteine (C) and the 23rd alanine (A), and between the variable region and the constant region.
  • the boundary is located between the 128th lysine (K) and the 129th [arginine].
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of 4D1 1G4PE is from the 67th guanine (G) to the 384th adenine (A) in SEQ ID NO: 14 1.
  • 4 D11G4PE light The amino acid sequence of the chain variable region is from the 23rd character to the 128th lysine (K) in SEQ ID NO: 142.
  • CD40 refers to Clark et al. (EA Clark et. Al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986) or Stamenkovic et al. (I. Stamenkovic et. Al., EMBO J. 8: 1403, 1989), in particular, B cells, DCs, macrophages, endothelial cells, epithelial cells, or antigenic poly- gens expressed on the surface of these tumor cells. It is a peptide.
  • Anti-CD40 antibody means any of monoclonal antibodies against cell-expressed CD40, full-length CD40, or partial-length CD40.
  • the term “antibody” refers to genes encoding the heavy chain variable region and the heavy chain constant region, and the light chain variable region and the light chain constant region constituting the immunoglobulin (collectively referred to as “antibody gene”). It is derived from. There are five different classes of human immunoglobulins consisting of IgG, IgA, IgM, IgD and IgE.
  • IgG can be further divided into four subclasses consisting of IgGl, IgG2, IgG3 and IgG4, and IgA can be further divided into two subclasses consisting of IgAl and IgA2.
  • IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4 are located at 14Q32.33 of the human chromosome.
  • the basic structure of immunoglobulin is composed of two homologous light chains (light chains) and two homologous heavy chains (heavy chains). Immunoglobulin class and subclass are determined by the heavy chain.
  • the antibody of the present invention includes antibodies having any immunoglopurin class / subclass and isotype.
  • “Functional fragment” of an antibody in the present invention means a part (partial fragment) of an antibody as defined above, which retains at least one action of an antibody on an antigen; specifically, F (ab ') 2 , Fab' Fab, Fv, disulfide-bonded FV, -single chain FV (scFV), and polymers thereof (DJ King., Applicat ions and Engineering of Monoclonal Ant ibodies. , 1998 T. 'L Internat ional Ltd).
  • IgG1 is J00228, Z17370 or Y14737
  • IgG2 is J00230, AJ250170, AF449616, AF449617, AF449618, Z49802 or Z4980
  • IgG3 is M12958, picture 13, X16110, X99549, AJ390236 , AJ390237, AJ390238 AJ39024K AJ390242, AJ390246, AJ390247, AJ390252, AJ390244, AJ390254, AJ390260, AJ390262, AJ390272, AJ390276 or AJ390279 and IgG4 include K01316, AJ001563, AJ001564, etc. Session number).
  • CH1, hinge, CH2, and CH3 represent a part of the antibody heavy chain constant region.
  • the EU index of Kabat et al. Kabat et al. (Kabat et. Al., Seauences of proteins of immunological interest, 1991 Fif) th ed it ion).
  • CH1 is EU index 118 to 215, hinge is EU index 216 to 230, CH2 is
  • EU Index 231 to 340 CH3 is defined as EU Index 341 to 446.
  • human antibody means an antibody that is an expression product of a human-derived antibody gene. Taste.
  • “Agonistic” is an action that promotes binding of the ligand to CD40 expressed on the surface of cells such as B cells, tumor cells or dendritic cells, or CD40 ligand gives to CD40-expressing cells.
  • the term “agonistic antibody” refers to an antibody having such an agonistic effect, in which one or more of the effects are exerted on cells expressing CD40.
  • One of the effects on CD40-expressing cells is, for example, enhanced expression of CD95.
  • Angogonistic refers to an action that inhibits the binding of the ligand to CD40 expressed on the surface of cells such as B cells, tumor cells or dendritic cells, or the CD40 ligand gives to CD40-expressing cells.
  • An effect that neutralizes one or more of the effects is meant, and an “anti-antigonistic antibody” means an antibody having such an effect.
  • CD40-expressing cells For example, suppression of B cell proliferation or antibody production.
  • the antibody or its heavy chain variable region or light chain variable region is specified by the amino acid sequence, but one or more, preferably 1 to 10, 1 to 9, 1 to 0, 1 to 7 1-6 pieces, 1-5 pieces! -4, 1-3, or 1 or 2 amino acids deleted, substituted, or added are also included in the scope of the present invention.
  • the gene encoding the antibody or its heavy chain variable region or light chain variable region is specified by the nucleotide sequence, but one or more, preferably 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8 , 1-7, 1-6, 1-5, 1-4,; Those in which ⁇ 3 or 1 or 2 bases are deleted, substituted, or added are also included in the scope of the present invention.
  • the anti-CD40 antibody can be obtained by incorporating the antibody gene into an expression vector, introducing the vector into an appropriate host cell, and collecting and purifying the cell or the cell culture supernatant.
  • the vector may be a phage or plasmid that can grow autonomously in the host cell or can integrate into the host cell chromosome.
  • plasmid DNA examples include plasmids derived from Escherichia coli, Bacillus subtilis or yeast, and phage DNA includes ⁇ Phage etc. are mentioned.
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the target gene.
  • Examples include bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CH0 cells, etc.) and insect cells.
  • Methods for introducing a gene into a host include any method (for example, a method using calcium ion, an electo-poration method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, a lipofuxion method, etc.).
  • Examples of the method for introducing a gene into an animal described later include a microinjection method, a method for introducing a gene into an ES cell using electroporation or lipofection, and a nuclear transfer method.
  • culture means any one of (a) culture supernatant, (W cultured cells or cultured cells or disrupted products thereof, and (c) secreted product of the transformant).
  • a medium suitable for the host to be used is used, and a stationary culture method, a culture method using a roller bottle, or the like is employed.
  • the antibody is collected by disrupting the cells or cells.
  • the target antibody is produced outside the cells or cells, use the culture medium as it is, or remove the cells or cells by centrifugation or the like. Thereafter, the target antibody can be isolated and purified from the culture by using general biochemical methods using various chromatographies used for protein isolation and purification alone or in appropriate combination. it can.
  • an animal host in which the gene of the target antibody has been incorporated into the endogenous gene such as Transgenic worm, Transgenic snake, Transgenic ridge or Transgenic buoy. It is also possible to obtain a large amount of monoclonal antibodies derived from the antibody gene from milk secreted from the transgenic animal (Wright, G., et al. (1991) Bio / Technology 9 , 830-834).
  • the hybridomas are grown, maintained and stored according to various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test and the culture method, etc.
  • Known nutrient media such as those used to produce monoclonal antibodies, or It can be carried out using any nutrient medium derived from a known basic medium. .
  • the variant of the agonistic antibody of the present invention retains the agonistic activity and the ADC CDC activity is less than that of the original antibody, so that the immunocompetent cells are not damaged. It is thought that the immune system can be activated. Therefore, it is expected to show the same level of immune activation as compared with the original antibody and the toxicity of CD40-expressing cells below the same level.
  • the mutant of the anti-antigenic CD40 antibody of the present invention retains the activity of suppressing the immune activation signal by CD40L, and has reduced ADCC and CDC activities compared to the antibody before modification.
  • a pharmaceutical composition containing a purified formulation of the antibody of the present invention preferably comprises a physiologically acceptable diluent or carrier in addition to the antibody and is a mixture with other drugs such as other antibodies or antibiotics. May be.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose solution, and buffered saline.
  • the antibody may be freeze-dried (freeze-dried) and reconstituted for use by adding the above buffered aqueous solution when necessary.
  • the routes of administration are oral routes and parenteral routes including intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injections or drug delivery.
  • the effective amount administered as a combination of an effective amount of the antibody of the present invention and an appropriate diluent and a pharmacologically usable carrier is 0. OOOlrag to 100 mg per kg body weight at a time, It is administered every 2 to 8 weeks.
  • the agonistic antibody is an immunostimulator (antiviral agent, anti-infective agent), and the pathogen is A
  • the pathogen is A
  • examples include hepatitis B virus, hepatitis B virus, HIV, influenza virus, herpes simplex virus, cytomegalovirus, EB virus, papilloma virus, chlamydia, mycoplasma, toxoplasma, malaria, trypanosome, tuberculosis, etc.
  • the Or malignant tumors containing cancer cells that express CD40 as target tumors such as knee cancer, bladder cancer, lymphoma (eg Hodgkin lymphoma), leukemia, malignant melanoma, knee cancer, lung cancer, ovary Cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, prostate cancer, head and neck cancer.
  • lymphoma eg Hodgkin lymphoma
  • leukemia malignant melanoma
  • knee cancer e.g Hodgkin lymphoma
  • lung cancer ovary Cancer
  • bladder cancer breast cancer, colon cancer, prostate cancer, head and neck cancer
  • rheumatism is illustrated as a target disease.
  • it can be used as an adjuvant with a vaccine such as a cancer-specific peptide.
  • anti-antigonistic antibodies as immunosuppressants at the time of organ transplantation (rejection at the time of transplantation of knee islands and kidneys, preventive or therapeutic agents for GVHD), or autoimmune diseases (for example, rheumatism, Psoriasis, ulcerative colitis, Crohn's disease, systemic 0 tomatoes death, multiple sclerosis, myasthenia, scleroderma, antiphospholipid antibody syndrome, autoimmune hepatitis, idiopathic thrombocytopenic purpura It is useful as a treatment for Behcet's disease, arteriosclerosis, nephritis, respiratory urgency syndrome), a treatment for allergies such as asthma, and a treatment for blood coagulation factor VI 11 inhibition syndrome. Also good.
  • autoimmune diseases for example, rheumatism, Psoriasis, ulcerative colitis, Crohn's disease, systemic 0 tomatoes death, multiple sclerosis, myasthenia, scleroderma, antiphospholipid antibody syndrome, autoimmune
  • the binding epitope for CD40 of the KM341-1-19 antibody and 2105 antibody having excellent agonist activity and the 4D11 antibody having excellent antagonist activity was determined (Example 2).
  • the present invention provides an agonistic or antagonistic anti-CD40 antibody having a variable region sequence different from that of the above antibody and recognizing the same epitope as any of the above antibodies.
  • Such antibodies can be obtained by the following procedure. '
  • KM341- ⁇ 19 is used for binding to CM0 from monoclonal antibodies obtained by immunizing CD40 with mice. Those that compete with the antibody are selected by conventional methods. Based on the method described in Example 2 for those selected, those having the same binding pattern to the peptide as KM34-19 antibody are selected.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to only the modes described in the examples. '
  • Antibody expressing cells were prepared by introducing a vector containing a variable region of an antibody into CH0 cells (ATCC) and selecting with G418. Mutant antigens were expressed by transiently introducing the vector into HEK cells (ATCC).
  • the anti-CD40 antibody was purified from the culture supernatant by the following method. Use a Hyper D Prote in A column (manufactured by NGK) or a Prote in G column (Amersham Pharmacia Biotech) for purification of mouse IgG1 from the culture supernatant containing anti-CD40 antibody, and use the adsorption buffer according to the attached instructions.
  • the solution was purified using PBS (-) as the elution buffer and 0.1M sodium citrate buffer ( ⁇ 3) as the elution buffer. Eluted fraction 1M Tr is - HC1 (. PH8 0) or was adjusted by addition of Na 2 HP0 4 solution near pH 7 2..
  • the prepared antibody solution was replaced with PBS (-) using a dialysis membrane (10000 cut, manufactured by Spectrum Laboratories) or SP Kara (Amersham Armasia Biotech), and a 0.22 ⁇ m membrane with a pore size of 0.222 ⁇ m. It was sterilized by filtration with Phil Yuichi MILLEX-GV (MILLIP0RE). The concentration of the purified antibody was calculated by measuring absorbance at 280 nm and lmg / ml as 1.450D.
  • MILLIP0RE Phil Yuichi MILLEX-GV
  • the 175 amino acids (SEQ ID NO: 1) in the extracellular region of CM0 are force-parged, and the 13-mer peptide is shifted by 2 amino acids, for a total of 82 peptides (SEQ ID NOs: 49 to 130)
  • the N-terminal was acetylated on a Cel lulose membrane from the C-terminus (JERINI: Germany). Subsequent reactions were performed using conventional Western analysis (Reineke, U. et al. (2001).
  • Lumi lmager TM Boe ringer-Mannheim was used for the analysis, and the color intensity of each spot was digitized (Fig. 1 A-1, A-2, B-1, B-2).
  • 4D11 antibody is 20-24th and 41st peptide
  • 2105 antibody is 12-23th
  • 64th, KM34 ⁇ 1-19 antibody is the 41st and 42nd peptide
  • KM643-4-11 is the 43rd peptide
  • F72 is the 75th peptide
  • 110 is the 64th peptide
  • F4-465 is the 34th peptide 35, 54, 55, 65, 66, 75th peptide
  • KM281- ⁇ 10 is 21, 24, 64; 75th peptide, 2B11
  • a mutation-introduced CD40-FC fusion protein was prepared and the binding ability was examined by ELISA. Since anti-CD40 antibodies do not exhibit cross-reactivity to mouse B cells, five types of CD40Fc fus ion protein partially converted to the mouse CD40 amino acid sequence were prepared, and antibody binding to this antigen was performed. Examined. A method for producing a mutant CD40-FC fusion protein is shown below. The mutation site was created by introducing the mouse CD40 sequence into the portion of the peptide sequence where the antibody binds strongly.
  • CD40fflut l the EFTE of the site corresponding to the 15th peptide is set to ALEK, for CD40mut2, the LDT of the site corresponding to the 21st peptide is set to SAQ, and for the CD40mut3, the TH corresponding to the 24th peptide is set to IR CD40mut4 converted the EEGW at the site corresponding to the 42nd peptide to KEGQ, and CD40mut5 converted the site corresponding to the 64th peptide from VSSA to QSSL. Mutant preparation was performed according to genetic engineering techniques (Figure 2A, B, C analysis results showed that 2105 antibody significantly reduced the ability to bind to CD40inuU. 2 B11 was found to decrease the ability to bind to CD40nmt 2.
  • Figure 2A, B, C analysis results showed that 2105 antibody significantly reduced the ability to bind to CD40inuU. 2 B11 was found to decrease the ability to bind to CD40nmt 2.
  • OxlO 6 cells / ml ⁇ Ramos cell suspension was seeded on a 96-well plate at 50 1 / well. Hydrioma culture supernatant or purified antibody was adjusted to 2 g / ml with medium, and 100 il / well was added to 96 well plates. 4 g 3 ⁇ 4il of soluble CD40 ligand (ALEXIS CORPORATION) and 4 g / ml of anti-FLAG antibody (M2, Sigma) were added to the medium, and 50 2 1 / well was added to a 96 well plate. After overnight culture, cells were collected and analyzed using FACS using R-PE-labeled anti-CD95 antibody (Pharmingen NJ). Example 6 Measurement of anti-CD40 antibody CDC activity
  • CDC Atsey uses a human serum-derived complement (SIGMA) or Usagi serum-derived complement (CEDARLANE LABORATORIES LIMITED, Ontario, Canada) at a final concentration of 5% for 2,000 Cr 51- labeled target cells. across capacitor 200 ⁇ L in 96 ⁇ El plates and incubated for 2 hours at 37 ° C, 5% C0 2 presence with each antibody concentration.
  • SIGMA human serum-derived complement
  • CEDARLANE LABORATORIES LIMITED Ontario, Canada
  • Antibody-mediated cytotoxic activity is based on cytotoxic activity against target cells in the presence of killer cells such as NK cells or neutrophils and antibodies (antibody-dependent cellular cytotoxic activity (Ant ibody- Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)), and in the presence of complement and antibodies, damage to target cells (complement-dependent cytotoxicity)
  • killer cells such as NK cells or neutrophils and antibodies
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxic activity
  • complement and antibodies damage to target cells
  • radioactive chromium (Cr 51 ) was taken into the cytoplasm in the target cells, and the amount of Cr 51 released into the culture medium due to cell death was measured with a dose.
  • suspended 106 an Kit Torinpa carcinoma cell line Raj i (ATCC CCL-86) bar to 15 L of Fetal Cal f Serum (FCS) as targets cells, 50 AL
  • ADCC Atssey uses 2000 million Cr 51- labeled target cells and 200,000 normal human peripheral blood mononuclear cells obtained by the method described in Example 6 in a round bottom 96-well plate (Falcon). in total volume 200 L, it was incubated for 4 hours at 37 ° C, 5% C0 2 presence with each antibody concentration.
  • thigh 34 ⁇ 19 hyperidoma was collected by centrifugation, TRIZOL (Gibco BRL) was added, and TotalRNA was extracted according to the instruction manual.
  • the variable region of the antibody cDNA was cloned using the SMART RACE cDNA amplification Kit from CL0NTECH according to the attached instructions.
  • L sl Strand cDNA was prepared using 5 g of total RNA as a cage.
  • the sequencer of Primer uses tnIgG3Nhe: atat GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC (SEQ ID NO: 2) G, tnIgG2Bani: atat gga t ccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC (SEQ ID NO: 3), and uses ZtaqPCR kit (Takara) 30 ° C for 30 seconds. PCR was performed at 72 ° C for 1 minute x 30 cycles to amplify the gene. After the reaction, the product was purified with a QIAGEN PCR purification kit, digested with Nhel and BamHI, and the incorporated sequence was confirmed in N5KG1. This vector was designated as N5KG2.
  • IgG3Nhe atatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG (SEQ ID NO: 4),
  • G2Ser2 GTTTTCTCGATGGAGGCTGGGAGGCC (SEQ ID NO: 5) at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds,
  • GGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAAC SEQ ID NO: 7
  • the reaction at 72 ° C for 30 seconds was performed 15 times. Purify the amplified DNA fragment with a PCR purification kit, and then purify the two fragments]) After mixing equal amounts of NA fragment, react 5 times at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, IgG3Nhe and IgG2Bam were added and reacted 15 times. Amplified
  • the DNA fragment was cleaved with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector.
  • IgG2 subclass Of the anti-CD40 antibodies described in W002 / 088186, two of the strongest agonistic activities (KM34 ⁇ 19 antibody, 2105 antibody) were IgG2 subclass. In order to investigate whether the IgG2 subclass is important for CD40 activation, a recombinant protein in which the antibody constant region was converted to IgGl, IgG3, or IgG4 was prepared, and the ability to bind to the antigen and CD95 expression promoting activity in Ramos cells. Were carried out according to Examples Example 4, 6.
  • N5KG1 was used for IgG2 and IgG3, and expression vectors N5KG2 and N5KG3 were used in which the constant regions of N5KG1 were replaced with IgG2 and IgG3, respectively.
  • IgG3 constant region cDNA cloning is IgG2 claw :! The method was partially modified and an IgG3-specific primer was used.
  • N5KG4PE IDEC
  • Antibody protein expression was performed according to Example 1. ⁇ CD40-expressing Ramos cells have binding activity from IgG2 to IgGl, 3,
  • CHK hinge region is IgG2, then IgG4), IgG4 / 2/4 (hinge region is IgG2, otherwise IgG4), IgG2 / 4/4 (CHl is IgG2, otherwise IgG4), IgG4 / 2 / 2 (CHI is IgG4, otherwise IgG2).
  • a vector for expression of IgG2 / 4 antibody, N5KG2 / 4 was prepared using ZtaQ PCR kit (Takara).
  • N5KG2 is vertical type, and primer IgG3Bam: atat gga tc cTCATTTACC CGGAGACAGGGAGAGGC (sequence number 8), 24C i4: AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT (sequence number 9), 98 ° C 1 second, 72 ° C
  • the reaction at 30 ° C for 30 seconds was performed 15 times.
  • Primer 24Chi3 AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT (SEQ ID NO: 10)
  • linkH2 tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 1 1)
  • 98 ° C 1 second 60 ° C 30 seconds
  • 72 The reaction at 30 ° C for 30 seconds was performed 15 times.
  • the amplified DNA fragment was purified with a PCR purification kit, and the two purified DNA fragments were mixed in equal amounts, followed by 5 reactions at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds.
  • LinkH2 tgatcatacgtagatatcacggc
  • the vector for expression of IgG4 / 2/4 N5KG4 / 2/4 is a type of N5KG4, linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (arrangement (J number 1.3)), G2Hin3:
  • the vector for expression of IgG2 / 4/4 N5KG2 / 4/4 is N5KG2 in the form of a primer, with primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (sequence 'No. 17), G4CH1-2: GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG (SEQ ID No. 18)
  • the reaction at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds was performed 15 times.
  • the vector N5KG4 / 2/2 for expression of IgG4 / 2/2 is composed of N5KG4 as a saddle, primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (sequence number 2 1), G4CH1-2: GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG (sequence number 22) 98 ° C 1 second, 60 ° C. 30 seconds, 72 ° C. 30 seconds reaction was performed 15 times.
  • primer G4C- ⁇ CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC (sequence number 2 3), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (sequence number 24), 98 ° C 1 second, 60 ° C 30 seconds, 72 ° C 30 seconds
  • linkH2 was added and reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector.
  • hinge area is divided into three parts: upper hinge, middle hinge, and lower hinge. (Ole H Brekke et. Al. I ⁇ unology Today 1995, 16, 85-90), each of which was specifically substituted for IgG2 with a sequence of IgG4.
  • Upper hinge from Kabat EU code 216
  • Middle hinge from Kabat EU code 2'26
  • Lower hinge from Kabat EU code 216
  • the antibodies introduced with mutations were IgG2UH4, IgG2 thigh 4, IgG2LH4, and the expression vectors were N5KG2UH4, N5KG2-4, and N5KG2LH4. According to Kabat et. Al., Sequences of proteins of imitation ological inierest, 1991 Fifth edition, “hinge” is defined as EU index 216-230.
  • N5KG2UH4 uses N5KG2 as a vertical type, and a primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (distribution 'J number 25) ⁇ UH4-2: CACAACATTTggaCTCAACTcTCTTGTCCACC (sequence number 26 1 second) The reaction at C30 seconds and 72 ° C for 30 seconds was performed 15 times.
  • primer UH4-1 GGTGGACAAGAgAGTTGAGtccAAATGTTGTG (sequence number 2 7), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (sequence number 2 8), 98 ° C 1 second, 60 ° C 30 seconds, 72 ° C 30
  • the second reaction was performed 15 times. After purifying the amplified DNA fragment with a PCR purification kit and mixing two equal amounts of the purified DNA fragment, the reaction of 98 1 sec, 60 ° C for 30 sec, 72 ° C for 30 sec is performed 5 times, and the primers IinkH and linkH2 are In addition, it reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cleaved with Nliel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector.
  • N5KG2MH4 uses N5KG2 as a saddle type, and is linked to the primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (distribution [ ⁇ number 29]), UM4-2:
  • GGCACGGTGGGCAtgggggaccataTTTGCGCTC (SEQ ID NO: 30) at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds
  • GAGCGCAAAtatggtcccccaTGCCCACCGTGCC linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (sequence number 3 2), 98 ° C 1 second, 60 ° C 30 seconds,
  • the DNA fragment was cut with Nliel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector.
  • N5KG2LH4 uses N5KG2 as a saddle type and a primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (sequence number 3 3), UL4-2: GAAGACTGACGGTCCccccaggaactcTGGTGCTGGGCA (sequence number 34) at 98 ° C for 1 second, 60 ° C. C 30 seconds, 72 ° C 30 seconds reaction was carried out 15 times.
  • primer UL4-1 TGCCCAGCACCAgagttcctggggGGACCGTCAGTCTTC (SEQ ID NO: 3 5), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 3 6), 98 ° C 1 second, 60 30 seconds, 72 ° C 30 seconds I went 15 times.
  • the reaction is performed 5 times at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and the primers linkH and linkH2 And reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector.
  • the original subclass is IgGl.
  • a DNA fragment containing the heavy and light chains of the 4D11 antibody gene described in W002 / 088186 is digested with BglII and Nhel, purified, and then N5KG4PE, thigh 4P, and N5KG4 vectors (IDEC Pharmaceuticals) I changed the connection.
  • N5KG4PE, thigh 4P, and N5KG4 vectors I changed the connection.
  • S228P, L235E, and N5KG4P contain the S228P point mutation, respectively.
  • Expression and purification of the antibody protein was performed by the method described above.
  • the purified antibody was performed according to the method described above using the binding to Ramos cells as an index.
  • the ADCC activity and CDC activity of the anti-CD40 mutant antibody were performed by the method described above.
  • IgG11 and IgG4PE mutants each have significantly reduced ADCC activity compared to IgGl, the original subclass of D11 antibody. Was observed (Fig. 9).
  • mice In mice (Yasu i. Et al. Int. I awake imol. 2002 Vol l4: 319) with a homozygous genetic background for mouse endogenous CD40 disruption and a transgene of the human CD40 gene 4 D11 antibodies IgGl, IgG4P and IgG4PE were each administered intravenously at 100 g tail vein. 24 hours after administration, blood was collected from the orbital venous plexus, hemolyzed with 0.16 mol / L ammonium chloride, and then analyzed using FACS using FITC-labeled anti-B220 antibody.
  • Figure 11 shows the results. In the figure, the vertical axis shows the percentage of B cells in all lymphocytes.
  • the degree of attenuation of the B cell ratio was in the order of IgGl>IgG4P> IgG4PE.
  • the spleen was removed and crushed with a glass slide to prepare a cell suspension. After cell lysate was hemolyzed, analysis was performed using FACS using PE-labeled anti-B220 antibody and FITC-labeled anti-CD23, CD86 or CD95 antibody.
  • Figures 12A, B, shows the results. In the figure, the vertical axis shows the percentage of B cells expressing each surface marker in total lymphocytes. 4 D 11G1 is a mouse in which all markers are commercially available antibodies.
  • mice with a homozygous genetic background for endogenous mouse CM0 disruption and a human CD40 gene transgene Ya'su i. Et al. Int. Immunol. 2002 Vol 14 ': 319) 4-hydroxy- 3-nitropropyl acetate ⁇ chiken r-globul in conj ugates (NP-CGG: distributed by Professor Hitoshi Kikutani, Institute for Microbial Diseases, Osaka University)
  • Sensitization was performed by intraperitoneal injection (as NP-CGG amount) of the complex (Alum: aluminum hydroxide gel). 'Each antibody was administered in the tail vein in an amount of 50 or 100 immediately before antigen sensitization. As a negative control, 100 ⁇ g of anti-human albumin human IgG4PE antibody was administered. Seven and 14 days after sensitization, blood was collected from the orbital venous plexus, and the amounts of NP-specific IgGl and IgM antibodies in the serum were measured by ELISA. For ELISA, NP-conjugated urine serum albumin (NP-BSA: 2.5 g / ml) 50 / z l / well, 96-well microplate for ELISA
  • the vertical axis shows the serum collected after two injections of NP-CGG into C57BL / 6 mice, diluted 10,000 times for IgG1 and 100 times for IgM antibody. Each value is converted as a unit. 4 D11 antibody and 281 IgG4P or IgG4PE antibody inhibited NP-specific IgGl and IgM antibody production equally strongly.
  • the serum IL12 concentration was measured by the ELI SA method. Blood collected from the femoral vein was allowed to stand at room temperature for 20 to 60 minutes, and the serum obtained by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes at room temperature was measured using monkey IL12 ELISA kit (Biosource). The results are shown in Figure 16. IgG4PE antibody did not increase IL 12 production at any of the blood sampling points, but IgG4P antibody peaked on day 4 and IL12 production was observed.
  • Example 16 Effect of anti-CD40 antibody gonistic antibody in force-type quizal delayed hypersensitivity model
  • Tet anus toxoid (10Li / ml; Denka Seiken Co., Ltd.) was sensitized to 9 male male cynomolgus monkeys intradermally and intramuscularly to induce delayed hypersensitivity to TTx. 10 minutes before the start of sensitization, 0.1 and 10 mg / kg 4D11G4PE antibody were intravenously administered 3 times each to 3 animals (once every week), and the effect of 4D11G4PE on delayed-type hypersensitivity investigated. Under anesthesia with intramuscular administration of keminmin, sensitization is performed in the back skin (50
  • TT x was administered intradermally (10 L / se, 3 power points each: 0 to 10 Lf / mI).
  • the skin reaction at the administration site was observed at 24 and 48 hours after induction, and evaluated according to Draize's criteria for skin damage.
  • the results for the three TTx concentrations at three power stations were averaged. The results are shown in Figure 17.
  • the administration of the 4D11G4PE antibody clearly suppressed the delayed hypersensitivity reaction seen after 24 and 48 hours.
  • TT x-specific IgG and IgM antibody titers The effect on TT x-specific IgG and IgM antibody titers was examined.
  • the blood serum collected from the femoral vein over time was allowed to stand at room temperature for 20 to 60 minutes, and then the antibody titer in the serum obtained by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes at room temperature was measured using the ELISA method.
  • TTx 0.5 Li / ml
  • 100 1 / well 100 1 / well to each well of a 96-well microplate for ELISA (Maxi sorp, Nunc) and incubate at 4 ° C to adsorb TTx. It was.
  • each well is mixed with 0.05% Tween20-containing phosphate buffer. 'Washed 3 times with (PBS-T).
  • the anti-TTx antibody titer was the maximum dilution factor at which the absorbance was 0.1 or more, and was 0 when the absorbance did not reach 0.1 even at 100-fold dilution. The results are shown in Figs.
  • TTx-specific IgG and IgM antibody titers were suppressed to about 1/10.
  • the antibody titer was below detection sensitivity at any blood collection point.
  • Blood collected from normal rabbits is divided into 4 equal parts (6 ml each), and control human IgG4PE, Control mouse IgG2a, human anti-human CD40 IgG4PE (4Dll) and mouse anti-human CD154 IgG2a (5C8) were added and incubated at 37 ° C for 10 minutes.
  • a flat perfus ion chamber (Glycotech) and a collagen-coated petri dish were assembled according to the attached instructions, and blood treated with various antibodies was flowed to the sore chamber at a rate of shear stress of 1500 / s for 7 minutes.
  • the stability of the constant region modified antibody of 4D11 antibody was compared.
  • the culture supernatant obtained by transient expression of G4P, G4PE, G2Ser and G4 / 2/4 in HEK293 cells was charged onto a Protein A column (Amersham Biosciences). After elution with buffer (pH 2.7), the mixture was incubated at 37 ° C for 1 min and 10 min. Thereafter, the mixture was neutralized with 50 phosphate buffer ( ⁇ 7.0). The oligomer content of the obtained antibody solution was measured using a gel filtration column (Tosoh Corporation).
  • Example 1 9 Skin graft rejection inhibitory action by anti-CD40 antagonistic antibody Mouse has a homozygous gene background for endogenous CD40 disruption, and human
  • a graft obtained from the DBA / 2 mouse tail was implanted on the back of the chest of a C57BL / 6 background mouse carrying the CD40 gene transgene, and fixed with an adhesive bandage for 7 days.
  • 4D11G4PE 100 S or vehicle was administered via the tail vein at 0, 2, 4, 7, 9, 11, and 14 days after the day of skin transplantation.
  • all patients were injected intraperitoneally with anti-asharo GM1 antibody lOO ⁇ g 3 days before surgery and 1, 4 and 9 days after surgery. Gave.
  • Figure 22 shows the results.
  • a significant graft rejection delay was observed compared to the vehicle administration group.
  • CD40 expression in the Burkitt lymphoma cell line Ramos, bladder cancer cell line T24 (ATC HTB-4), knee cancer cell lines Hs 766T (ATCC, HTB-134) and Capan_2 (ATCC, HTB-80) is 341G2Ser This was confirmed by FACS analysis using.
  • Each cell line was digested with trypsin for T24, Hs766T and Capan-2, and the Ramos was recovered as it was, washed with PBS, and resuspended in a staining buffer containing 341G2Ser 1 ⁇ g / ml.
  • the staining buffer was prepared by adding 0.5 mM EDTA, 0.05% sodium azide, 5% non-immobilized urine serum to PBS. After 15 minutes incubation at 4 ° C, cells were washed twice with staining buffer and PE-conjugated goat anti-human IgG ( ⁇ )
  • Hs 766T, ⁇ 24, and Capan-2 harvest the cells on a uni-filter (Perkin Elma) using a harvester (Perkin Elma), attach a special seal on the back, and microcinch 20 (Perkin 20 / i L / wel was added, and the jS dose was measured with a scintillation counter (Top Count: Packard). Data were expressed as cell viability () by dividing the average of triplicate measurements obtained in three independent experiments by the value of the untreated control.
  • Example 2 Effect of anti-CD40 agonistic antibody on mouse tumor bearing model
  • mice Six-week-old female Balb / c nude mice (purchased from Clea Japan Co., Ltd.) were irradiated with 3 Gy radiation, and Ramos was transplanted 2 ⁇ 10 7 mice / mouse subcutaneously on the back. On the 16th day after transplantation, the size of the engrafted tumor was measured, and 5 tumor-bearing mice having a tumor size of 50-170 3 were grouped into 5 groups.
  • 341G2Ser 100 ig / mouse intravenously in a tumor-bearing mouse Body dissolved in PBS containing 200 1% 1% nude mouse serum
  • Human anti-human serum albumin (HAS) antibody was used as a negative control. '
  • a T24 cell mass that had been passaged three times under the back of nude mice was excised and transplanted subcutaneously into the back of 6-week-old female Balb / c nude mice (purchased from CLEA Japan, Inc.).
  • the tumor cell mass to be transplanted is about 3 squares.
  • Ten days after transplantation the size of the engrafted tumor was measured, and 5 tumor-bearing mice having a tumor size of 80-200 awakening 3 were divided into groups.
  • Tumor-bearing mice were intravenously administered with 341G2Ser 100 g / mouse (dissolved in PBS containing 200 1% 1% nude mouse serum) once on day 10, and tumor size was measured until day 29 did.
  • As a negative control an equal amount of human anti-DNP antibody was used.
  • mice 8 weeks old female Balb / c nude mice (purchased from Clea Japan Co., Ltd.) were transplanted subcutaneously in the back with Hs766T 7 ⁇ 10 6 mice / mouse. Sixteen days after transplantation, the size of the engrafted tumor was measured, and 5 tumor-bearing mice having a tumor size of 50-140 3 were grouped into 5 groups. A 341G2 SerOO g / mouse individual (dissolved in PBS containing 1% 1% nude mouse serum) was administered once on the 16th day into the vein of the tumor-bearing mouse, and the tumor size was increased until the 32nd day. It was measured. As a negative control, an equal amount of human anti-DNP antibody was used.
  • Capan-2 2 X 10 6 mice / mouse were transplanted subcutaneously in the back of 6-week-old female Balb / c nude mice (purchased from CLEA Japan, Inc.). After transplantation 13 days, the size of the tumors engrafted measurement, size of tumor poppy group content of tumor bearing mice from 30 to 130 ⁇ 3 as 5 mice per group. 341G2Ser 10 or 100 g / mouse individual (containing 1% nude mouse serum of 200 1? Dissolved in BS) was administered twice a week from day 13
  • hlgG human polyclonal antibody
  • Tumor growth inhibition rate was calculated by the following formula. 100- [((Average tumor volume on the last measurement day in the 341G2Ser administration group vs. average tumor volume on the antibody administration start day in the 341G2Ser administration group) / (Average tumor volume on the last measurement day in the negative control administration group vs. negative control) As a result, the tumor volume regression was observed in T24, Hs766T, and Capan-2 tumor-bearing mice, with TGIR exceeding 100%. On the other hand, Ramos tumor-bearing mice had a TGIR of 73.4%, and the increase in tumor volume was significantly suppressed (Table 2). Figures 23 to 26 show changes in tumor volume after cell transplantation when 341G2Ser was administered to tumor-bearing mice transplanted with Ramos cells, T24 cells, Hs766T cells and Capan-2 cells, respectively. Table 2
  • the inhibition rate is the value on the last day of measurement for each cell line.
  • the anti-CD40 antibody of the present invention in which a mutation is introduced into the constant region and the anti-CD40 antibody in which a part of the subclass is substituted with another subclass have the activity while maintaining the activity. ADCC activity ; and CDC activity is reduced. Therefore, when the antibody of the present invention is administered to a subject as a therapeutic antibody, the cytotoxic activity against CD40-expressing cells is weak and can be used safely.

Abstract

　治療効果が期待できる抗CD40抗体について、医薬品としての最適化の図られたADCC活性およびCDC活性が低減された変異体の提供。　少なくともヒンジ領域がヒトIgG2に由来するヒンジ領域であり、定常領域にADCCおよび／またはCDC活性の低減をもたらす１アミノ酸以上の変異および／または置換を含む、アゴニスティック抗CD40モノクローナル抗体の変異体および定常領域にADCCおよび／またはCDC活性の低減をもたらす１以上の変異もしくは置換を含むアンタゴニスティック抗CD40抗体の変異体。

Description

抗 CD40抗体の変異体
技術分野
本発明は免疫に関与する細胞膜分子である CD40を認識する抗 CD40抗体に関する。 さらに本発明はァゴニスティック、 アン夕ゴニスティック活性を保ちつつ、 ADCC 活性、 CDC活性を低減するために、 ヒト抗体定常領域に変異を導入した抗体、 も 明
しくはサブクラスの一部の構造を置換した抗体に関する。 背景技術 書
1. CD40
CD40は分子量 50kDaの細胞膜表面に存在する抗原であり、 B細胞、 樹状細胞
(DC) 、 ある種の癌細胞、 そして胸腺上皮細胞に発現している。 CD40は B細胞や
DCの増殖、 分化に重要な働きをしていることが知られている。 CD40は、 ヒ卜 β細 胞表面に発現する抗原として同定され (Ε. Α. Clark et. al. , Pro Natl. Acad.
Sci. USA 83: 4494, 1986, I. Stamenkovic et. al. , EMBO J. 8:1403, 1989)、 アミノ酸配列の相同性から、 CD40は、 低親和性 NGFレセプ夕一や TNFレセプ夕一、
CD27、 0X40、 CD30などが属している TNFレセプ夕一ファミリーの 1つのメンバ一と して考えられている。 ヒトおよびマウスの CD40に対するリガンド （CD40L) は、 近年遺伝子クローニングされ、 II型膜蛋白質であること、 及び活性化した t + T 細胞に発現していることが分かった。 CD40Lは、 強力な活性化シグナルをヒトぉ よびマウスの B細胞に導入することも分かっている。
また、'樹状細胞には B細胞よりも多くの CD40発現が確認されており、 重要な役 割を担っていることが明らかとなってきた。 CD40が CD40Lと結合すると、 抗原提 示細胞 （APC) の活性化、 すなわち CD80 (B7-1) や CD86 (B7-2) などの補助刺激 分子の発現、 あるいは IL- 12の産生が増強される （Caux, C.., et al..-Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J. Exp. Med. ,
180:1263, 1994) 、 (Shu, U. , et al.： Activated T cells induce interleukin- 12 production by monocyte via CD40-CD40 ligand interaction . Eur. J. Immunol., 25:1125, 1995) 。 樹状細胞は強い抗原提示能を有し、 強力なへ ルパー T (Th) 細胞活性化能を持っている。 また、 ナイーブ （naive) Th細胞の Tli 1又は Th2細胞への分化を樹状細胞が制御していると考えられている。 ミエロイ ド系樹状細胞である末梢血単球を GM- CSF及び IL- 4とともに培養して CD40Lにより 成熟させた樹状細胞 （DC1) は in vitroにおいて、 II- 12産生能を有し、 異系 naive Tli細胞を刺激活性化し、 IFNr産生 T細胞を誘導する （すなわち Thlへの分 化を促す） 。 この作用は抗 IL- 12抗体により阻害されることから、 IL- 12を介した 反応と考えられる。 一方リンパ組織 T領域や、 末梢血に存在する plasmacytoid T 細胞を IL-3、 CD40リガンドとともに培養したリンパ球系樹状細胞 （DC2) は、 IL - 12産生能は有さず、 そして異系 naive Th細胞を刺激活性化し、 IL- 4産生 T細胞を 誘導し、 Τ1ι2への分化を促進することが示されている。 Thl細胞は細胞性免疫の活 性化にかかわり'、 Τ1ι2細胞は液性免疫能を高めると同時に細胞性免疫能の抑制に 関与すると考えられている。 Thl細胞のヘルプで活性化された細胞傷害性 Τ細胞
(CTL) は、 細胞質内で増殖する病原体 （多くのウィルス、 リステリア菌、 結核 菌、 およびトキソプラズマ原虫など） や腫瘍細胞を除去することができる。
膜表面に発現した CD40を認識する抗 CD40モノクローナル抗体が、 B細胞に対し ていろいろな生物活性を示すことは示されてきた。 抗 CD40モノクローナル抗体は、
CD40と CD40Lとの相互作用に対してァゴニスティックなものと、 アン夕ゴニステ イツクなものとに大別される。
2. ァゴニスティック抗体
ァゴニスティック抗体の作用として、 B細胞の活性化が知られている。 たとえ ば、 抗 CD40抗体が細胞接着を誘導する （BarreU et al. , J. Immunol. 146:
1722, 1991; Gordon et al. , J. I誦漏 1. 140: 1425, 1988) 、 細胞の大きさを 増進する (Gordon et al., J. I匪 unol. 140: 1425, 1988; Yalle et al., Eur.
LI腿 imol. 19: 1463, 1989) 、 抗 IgM抗体、 抗 CD20抗体または pliorbol esterの みで活性化された B細胞の分裂を誘導する （Clark and Ledbetter, Pro Natl.
Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; Gordon et al., LEUCOCYTE TYPING III. A. J.
McMicheal ed. Oxford University Press. Oxford, p.426; Paulie et al. , J. I画 unol.142: 590, 1989) 、 IL4存在下で B細胞の分裂を誘導する（Val le et al. , Eur. J. Inraiimol. 19: 1463, 1989; Gordon et al. , Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987) 、 IL - 4刺激、 T細胞除去培養細胞の IgE (Jabara et al. , J. Exp. Med.172: 1861, 1990; Gascan et al. , J I腿 unol. 147:8, 1991 ) 、 IgG、 IgM
(Gascan et al., J. I匪 unol. 147: 8, 1991) の発現を誘導する、 IL- 4による B 細胞からの可溶性 CD23ZFceRIIの分泌と (Gordon and Guy, Immunol. Today 8:339, 1987; Cairns et al., Eur. J. Immunol. 18: 349, 1988) 細胞上の発現 増強 （Challa A, Allergy, 54: 576, 1999) をする、 IL- 6の生産を促進する
(Clark and Shu, J. I麗 unol. 145: 1400, 1990) ことが報告されている。 さら には、 CDW32 +接着細胞存在下で、 IL- 4及び抗 CD40抗体を添加することにより、 ヒト初代培養 B細胞から、 B細胞クローンを樹立することや （Banclierauet al., Science 241:70, 1991) 、 胚中心の中心細胞のアポトーシスが、 抗原レセプター の働きにかかわらず、 CD40を介して阻害されること （Liu et al. , Nature 342: 929, 1989) が報告されている。 以上のように CD40は、 ヒト B細胞表面に発現する 抗原として同定されたため、 単離された抗体の多ぐは、 主にヒト B細胞に対する 増殖分化誘導機能、 癌細胞における細胞死誘導活性を指標に評価されてきた (Katira, A. et. al. , LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Sc lossossman, et. al. eds. p.547. Oxford University Press. Oxford, W. C. Flansow et. al. , LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. p.555. Oxford University Press. Oxford, J. D. Pound et. al. , International Immunology, 11: 11， 1999, )。
抗 CMO抗体が DCを成熟させることが示された （Z. H. Zhou et. al. ,
Hybridoma, 18:471 1999) 。 さらに、 抗原特異的 CD8T細胞プライミングにおける
CD4T細胞の役割は、 CD40- CD40Lシグナリングを介した]) Cの活性化にあることが報 告され、 抗 CD40モノクローナル抗体（mAb)により、 樹状細胞 （DC) の活性化にお ける CD4ヘルパー T細胞の役割を代替できることが示された （Shoenberger, S. P., et. al.： T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-
CD40L interactions. Nature, 480, 1998) 。 また、 マウスにおいて抗 CD40抗体の 投与により CD40を発現する腫瘍細胞のみならず非発現腫瘍細胞からも生体を防御 可能であることが示された （French, R. R. , et. al.： CD40 ant ibody evokes a cytotoxic T - cel l response that erad icates lymphoma and bypasses T - cel l help. Nature Medicine, 5, 1999) 。 '
上述した機能に基づき、 ァゴニスティック抗 CD40抗体は、 細菌、 ウィルスなど の感染症の治療、 癌の治療等に使用しうるものと考えられている。 WO02/088186 には優れたァゴニスティック活性を有する抗 CD40抗体が記載されている。 当該ァ ゴニスティック抗体の代表例として KM341- 1-19抗体および 2105抗体が挙げられる。
KM341- 1-19抗体を産生するハイプリ ドーマ KM341- 1 - 19は 2001年 9月 27日、 2105抗 体を産生するハイプリ ドーマ 2105は 2002年 4月 17日に、 独立行政法人産業技術総 合研究所 特許生物寄託センター （茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6) にブタペス ト条約に基づき国際寄託されている。 受託番号は FERM BP-7759
(KM341-1-19) および FERM BP- 8024 (2105) である。
3. アン夕ゴニズティック抗体
—方、 上記のように、 CD40が免疫反応において重要な役割を担っていることか ら、 CD40とそのリガンドの結合を阻害することで、 臓器移植時の免疫抑制や自己 免疫疾患の治療薬が開発できると期待される。 Sawada- Haseらは、 クローン病患 者の末梢血中の単球では CD40を強く発現する細胞の割合が上昇していることを報 告してい^。 しかしながら、 CD40とそのリガンドの結合を阻害する抗体について は、 まだ良く分かっていない。 そのような阻害性抗体は、 たとえば、 CD40の機能 解析や、 CD40の活性化が必要な疾患の治療に有効である可能性がある。 また、
CD40リガンドに対する阻害抗体も、 CD40と CD40リガンドとの結合が関与する疾患 薬として有効である可能性が示されている。 しかしながら、 CD40Lは活性化した 血小板に発現するという報告 (V. Henn e t. al. , Nature 391 : 591, 1998) があ るため、 '抗 CD40L抗体を治療薬として使った場合、 血栓を引き起こす危険性が存 在することが報告されている （T. Kawai et. al. , Nat. Medi. 6 : 114, 2000) 。 このような観点から、 CD40とそのリガンドの結合を阻害する抗体治療薬としては、 抗 CD40L抗体よりも、 むしろ CD40に対する抗体の方が安全性に優れると期待でき る。 抗 CD40抗体としては CD40Lの CD40への結合を抑制し、 なおかつ、 抗体自身が
CD40を活性化しないことが必要とされる。 上述した機能に基づき、 アンタゴニスティック抗 CD40抗体は、 自己免疫疾患の 治療、 臓器、 骨髄等の移植に際しての拒絶反応の抑制に使用しうるものと考えら れている。 W002/088186には優れたアンタゴニスティック活性を有する抗 CD40抗 体が記載されている。 当該アンタゴニスティック抗体の代表例として 4 D11抗体 が挙げられる。 4D11抗体を産生するハイプリ ドーマ 4D11は 2001年 9月 27日に,.、 独 立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （茨城県つくば市東 1丁 目 1番地 1中央第 6) にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。 受託番号 は FE腿 BP- 7758である。
特許文献 1 W0G2/088186号公報 発明の開示
本件発明は、 W002/088186に開示された、 治療効果が期待できる抗 CD40抗体に ついて、 医薬品としての最適化の図られた変異体を作製することを目的とする。 本発明者らは、 鋭意研究の結果、 従来知られている抗 CD40抗体に比して、 より 疾患への治療効果が高いと考えられる新規なァゴニスティック抗体、 及びアン夕 ゴニスティック抗体の変異体を作製することに成功し、 本発明を完成した。 本件 発明における、 抗 CD40抗体の改変についての基本的な考えかたを下記に詳述する。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 431408号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 A— 1は、 抗 CD40ァゴニスト抗体の CD40を配列を基に作製したペプチドへ の結合部位を示した図である。
図 1 A— 2は、 抗 CD40ァゴニスト抗体の CD40を配列を基に作製したぺプチドへ の結合部位を示した図である （図 1 A- 1の続き） 。
図 1 B— 1は、 抗 CD40アンタゴニスト抗体の CD40を配列を基に作製したぺプチ ドへの結合部位を示した図である。
図 1 B— 2は、 抗 CD40アンタゴニス卜抗体の CD40を配列を基に作製したぺプチ ドへの結合部位を示した図である （図 I B- 1の続き） 。 図 2 Aは、 変異 CD40に対する抗 CD40抗体の結合性を示した図である。
図 2 Bは、 変異 CD40に対する抗 CD40抗体の結合性を示した図である。
図 2 Cは、 変異 CD40に対する抗 CD40抗体の結合性を示した図である。
図 3 Aは、 KM341-卜 19抗体に P 3 3 1 Sの変異を導入しても、 Ramos細胞への結 合活性が同程度あることを示した図である。
図 3 Bは、 KM341- 1- 19抗体に P 3 3 1 Sの変異を導入しても、 Ramos細胞への CD9
5発現促進活性が同程度あることを示す図である。
図 4 Aは、 KM34卜 1- 19抗体に P 3 3 1 Sの変異を導入すると、 ゥサギ補体を使つ た CDC活性が抑制されることを示す図である。
図 4 Bは、 ヒト補体を使った場合、 G2/4が低い補体活性があることを示す図で める。
図 5 A _ 1は、 2105抗体のサブクラスを I gG 2から他のサブクラスへ変換した 場合、 Ramos細^への結合は変化しないことを示す図である。
図 5 A— 2は、 KM341- 1- 19抗体のサブクラスを I gG 2から他のサブクラスへ変 換した場合、 Ramos細胞への結合は変化しないことを示す図である。
'図 5 B— 1は、 2105抗体のサブクラスを IgG 2から他のサブクラスへ変換した 場合、 Ramos細胞への CD9 5発現促進活性が低下することを示す図である。
図 5 B— 2は、 KM34卜卜 19抗体のサブクラスを I gG 2から他のサブクラスへ変 換した場合、 Ramos細胞への CD9 5発現促進活性が低下することを示す図である。 図 6 A— 1は、 KM34卜 1- 19抗体の Ramos細胞への結合能は、 ヒンジの構造に依 存されないことを示す図である。
図 6 A— 2は、 2105抗体の Ramos細胞への結合能は、 ヒンジの構造に依存され ないことを示す図である。
図 6 B— 1は、 KM341- 1- 19抗体の Ramos細胞への CD9 5発現促進活性は、 アツパ 一ヒンジ、 ミドルヒンジが重要であることを示す図である。
図 6 B— 2は、 2105抗体の Ramos細胞への CD9 5発現促進活性は、 アッパーヒン ジ、 ミドルヒンジが重要であることを示す図である。
図 7 Aは、 F72を I gG2サブクラスに変換すると、 Ramos細胞への結合能は変化し ないことを示す図である。 図 7 Bは、 F72を IgG2サブクラスに変換すると、 CD95発現促進活性は上昇する ことを示す図である。
図 8Aは、 4D11抗体のサブクラスを IgGlから Ιέ(ϊ4へ変換した場合、 Ramos細 胞への結合は変化しないことを示す図である。
図 8 Bは、 4 D11抗体のサブクラスを IgG 1から IgG4へ変換した場合、 CD40Ligandによる Ramos細胞における CD95の発現上昇を同程度阻害することを示 す図である。
図 9は、 4D11抗体のサブクラスを IgGlから IgG4、 IgG4PEに換えた場合、 ADCC 活性が低減したことを示す図である。
図 1 0は、 4D11抗体のサブクラスを IgGlから IgG4Pへ換えた場合、 CDC活性が 低減したことを示す図である。
図 1 1は、 4D11G1、 4D11G4P, ·4 Dl 1G4PEを human CD40トランスジエニックマ ウスに投与した'後の、 血中 B細胞数の変化 （末梢血リンパ球中の B220陽性細胞） を示す図である。
図1 2八は、 抗 CD40抗体を human CD40トランスジエニックマウスに投与した後 め、 脾臓 B細胞の CD23の発現上昇 （脾臓 B細胞中の CD23陽性細胞） を示す図である。 図 1 2 Bは、 抗 CD40抗体を human CD40トランスジエニックマウスに投与した後 の、 脾臓 B細胞の CD86の発現上昇 （脾臓 B細胞中の CD86陽性細胞） を示す図である。 図 1 2 Cは、 抗 CD40抗体を human CD40トランスジエニックマウスに投与した後 の、 脾臓 B細胞の CD95の発現上昇 （脾臓細胞中の CD95陽性細胞） を示す図である。 図 1 3Aは、 human CD40トランスジエニックマウスにおける 4D11、 281-1- 10による抗原特異的抗体 （IgGl) 産生抑制活性を示す図である。
図 1 3 Bは、 human CD40トランスジエニックマウスにおける 4 Dll、 281-1- 10による抗原特異的抗体 （IgM) 産生抑制活性を示す図である。
図 14Aは、 抗原特異的抗体産生抑制活性試験時の血中 B細胞数 （末梢血リン パ球中の B220陽性細胞） を示す図である。
図 14 Bは、 抗原特異的抗体産生抑制活性試験時の脾臓中 B細胞数 （脾臓リン パ球中の B220陽性細胞） を示す図である。
図 1 5は、 力二クイザルに 30mg/kgの 4D11G4P、 4D11G4PEを投与した場合の血中 B細胞数 （末梢血リンパ,球中の B220陽性細胞） の変化を示す図である。
図 16は、 図 15の試験時の血中 IL- 12濃度を示す図である。
図 1 7は、 4D11G4PEのサル DTH抑制効果 （雄力二クイサルにおける遅延型過敏 症） を示す図である。
図 1 8は、 図 17に結果を示す試験における抗テ夕ヌストキシン IgGの力値を示 す図である。
図 1 9は、 図 17に結果を示す試験における抗テ夕ヌストキシン IgMの力値をし めす。
図 2 O Aは、 4D11G4PEと 5C8 (抗 CD40Ligand抗体） の血小板凝集に対する影 響を示す図である。
図 2 0 Bは、 4D11G4PEと 5C8 (抗 CD40Ligand抗体） の血小板凝集に対する影 響を示す図である。
図 2 1は、 4D11G4P, 4D11G4PEゝ 4DllG2Ser、 4D11G4/2/4を pH2. 7、 37°Cで ィンキュベ一トした後の、 オリゴマー含有率の変化を示す図である。
図 2 2は、 抗 CD40アン夕ゴニスティック抗体による皮膚移植片拒絶抑制作用を 未す図である。
図 2 3は、 Ramos細胞を移植した担癌マウスに 341G2Serを投与した場合の細胞 移植後の腫瘍体積の変化を示す図である。
図 24は、 T24細胞を移植した担癌マウスに 341G2Serを投与した場合の細胞移 植後の腫瘍体積の変化を示す図である。
図 2 5は、 Hs 766T細胞を移植した担癌マウスに 341G2Serを投与した場合の細 胞移植後の腫瘍体積の変化を示す図である。
図 2 6は、 Capan- 2細胞を移植した担癌マウスに 341G2Serを投与した場合の細 胞移植後の腫瘍体積の変化を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
1. ァゴニスティック抗体の改変
抗体は本来外来の微生物、 ウィルスや癌に対する生体防御機能をつかさどる分 子であるため、 抗体が結合した細胞を殺傷し、 取り除く作用を兼ね備えている。 この殺傷機能は 2種類あり、 抗体依存性細胞性細胞傷害活性 （Ant ibody - Dependent Ce l lul ar Cytotoxic i ty0 以下、 . ADCCと略記） 、 及び補体依存性細胞 傷害活性 (Complement-Dependent Cytotoxic ! tyD 以下、 CDCと略記) といわれて いる。 ·
ADCCは、 Macrophage, 皿細胞、 好中球などの表面に発現している Fc Recep tor を介して、 抗体の定常領域と結合することにより細胞を認識し、 認識した細胞が 活性化することにより誘導される、 細胞障害活性のことを言う。 一方、 CDCは抗 体が抗原と結合することによって、 活性化された補体系によって引き起こされる 細胞障害活性のことを言う。 これらの活性は、 抗体のサブクラスによって、 その 活性の強弱が異なることが解っており、 それは、 抗体の定常領域の構造の違いに 起因することが、わ力 つてレ る （Charles A: Janeway e t. al. Immunobiol ogy, 1997, Current Biology Ltd/Garl and Publ i shing Inc. ) 。
抗 CD40ァゴニズティック抗体は、 免疫活性化という作用メカニズムから ADCC, CDCといった、 CD40発現細胞の細胞死を引き起こす活性を持たないものが、 治療 薬としてより好ましいと考えられる。 もしも、 ADCC、 CDC活性によって CD40発現 細胞が障害を受けてしまった場合、 期待する免疫活性化とは反対の免疫抑制状態 になる可能性が考えられ、 疾患の増悪をもたらす可能性が考えられる。 また、 感 染症の治療薬として使用する場合、 もともと患者の CDC、 ADCC活性が亢進してい る可能性が考えられ、 .正常のヒト血清や、 末梢血を用いた場合、 その活性が検出 できなかったとしても、 より強い活性を持つゥサギ補体などを用いて安全性に関 して、 より慎重に評価する必要がある。 そのため、 ADCC、 CDC活性を持たない変 異体や、 組換え体を作製しその活性を調べた。
ADCC, CDC活性は、 抗体のサブクラスによって活性が異なることが知られている ため、 ADCC、 CDC活性の低減はサブクラスの変換によって可能であると考えられ る。 たとえば、 一般的にヒト IgGサブクラスの中で、 IgG 4は ADCC、 CDC活性が低 いサブクラスとして知られており、 IgG 2は CDC活性はあるが、 ADCC活性は低く、
IgGlは ADCC、 CDC活性の両方とも高いことが報告されている （Charl es A.
Janeway e t. al. Immunobiology, 1997, Current B i ol ogy Ltd/Garl and
Publ i shing Inc. ) 。 この特徴を生かし、 特定のサブクラスを選択することによ り細胞障害活性の少ない抗体にすることができる。 また、 特定のサブクラスの抗 体と以下に示す点変異の組み合わせによって、 目的の活性をもつ抗体を作ること ができる。 また、 ADCC、 CDC活性を低減させる方法としては、 抗体定常領域に変 異を導入することによって可能であることが報告されている。 たとえば、 L235, D265, D270、 K322, P33K P329 (アルファベットはアミノ酸の一文字表記。 数字 は Kabatらによる EUインデックス （Kabat et. al. , Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition) を示す。 以下同様。 ） は、 ヒト IgGの補体活性化能に重要な役割を果たしていると考えられており、 この部位を 他のアミノ酸に置換することによって、 CDC活性を低減できる （Esohe E. Idusogie et. al. J. Immunol. 2000, 164:4178-4184, Yuanyu n Xu et. al. J. Biol. Chem. 1994, 269:3469-3474, Brekke, 0. H. et. al. Eur. J. I腿 unol. 1994, 24:2542, Morgan, A., et. al. , I匪 imology 1995, 86:319, Lund, J., et. al. , J. I腿 irnol., 1996, 157:4963, Tao, M. H. , et. al. , J. Exp. Med. 1993, 178:661) 。 具体的には、 D270、 K322、 P329、 P331を Aに置換することによ り可能である。 また、 P331を Sや Gに変換することによつても可能である。
'また、 Glu233-Ser239 , Gly316-Lys338 , Lys274-Arg301 , Tyr407-Arg416 , Asn297、 Glu318、 Leu234-Ser239 , Asp265-Glu269 , Asn297-Thr299 , Ala327- Ile332は IgGと FcRの結合に関与していると考えられており （Duncan, A. R. , Woof, J. M. , Partridge, L. J., Burton, D. R. , and Winter, G. (1988) Nature 332, 563 - 564、 Gessner, J. E. , Heiken, H. , Tamm, A.， and Schmidt, R. E. (1998) Ann. Hematol. 76, 231-248 , Gavin, A., Hulett, M. , and Hogarth, P. M. (1998) in The I画 noglobul in Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity (van de Winkel, J.G. J. , and Hogarth, P. M. , eds) , pp. 11-35, Kluwer Academic Publishers Group, Dordrecht, The Netherlands, Sautes, C. (1997) in Cell-mediated Effects of Immunoglobulins (Fridman, W. H. , and Sautes, C. , eds) , pp. 29-66, R. G. Landes Co., Austin, TX、 Da' ron, M. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 203- 234、 Canfield, S. M. , and Morrison, S. L. (1991) J. Exp. Med. 173, 1483- 1491、 Chappel, M. S. , Isenman, D. E. , Everett, M. , Xu, Y. - Y.， Dorrington, K. J., and Klein, M. H. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 88, 9036- 9040、 Woof, J. M. , Partridge, L. J. , ■ Jef feris, R.， and Burton, D. . (1986) Mol. Immunol. 23, 319-330、 Wines, B. D.； Powell, M. S.， Parren, P. W. H. I. , Barnes, N. , and Hogarth, P. M. (2000) J. Immunol. 164, 5313- 5318) 、 この領域に変異を導入することにより、 ADCC活性の低減が可能であると 考えられる。 具体的には L235を E、 G237を Aに置換することにより、 FcRとの結合 能を低減させることは可能である。
本発明の抗体は、 上記の ADCCおよび または CDC活性を低減させるアミノ酸の 変異を 1以上、 好ましくは 1〜20個、 1〜17個、 1〜16個、 1〜15個、 1〜14個、 1〜13個、 1〜12個、 1〜11個、 ：！〜 10個、 1〜9個、 1〜8個、 1〜7ί固、 1 ~6個、 1〜5個、 1〜4個、 1〜 3個または 1もしくは 2個有する。
一部の抗 CD40抗体に関しては、 強力なァゴニスト活性の発現に関して IgG2のヒ ンジ領域が重要であることが、 本発明において示された。 したがって、 可変領域 と、 ヒンジ領域以外の定常領域を任意のサブクラスに置換することや、 点変異を 導入することによって、 ADCC、 CDC活性の調整のみならず、 抗体の生産性の向上、 精製および保存時における安定性、 血中動体の向上が期待できる。
抗体医薬の生産においては、 抗体の精製および保存時の安定性は非常に重要な ボイントとなる。 いままで開発されている抗体は IgGlサブクラスが最も多いため、 上述の抗 CD40ァゴニスト抗体の物性をより向上させるためには、 可変領域とビン ジ領域以外は IgGlサブクラス由来の配列とすることも有効であろう。
本件発明は、 以下のァゴニスティック抗 CD40抗体変異体等を提供する。
[1] ヒト IgG2のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを有し、 定常領域に ADCCお よび/または CDCの増加または低減を生じせしめる 1以上のアミノ酸の欠失または 置換もしくは 1以上のアミノ酸が付加されだァゴニスト活性を有する CD40に結合 するモノクローナル抗体の重鎖。
[2] 定常領域がヒト IgGである、 [1]の重鎖。
[3] ヒト IgGがヒト IgGlである、 [2]の重鎖。
[4] ヒト IgGがヒト IgG2である、 [2]の重鎖。
[5] ヒト IgGがヒト IgG3である、 [2]の重鎖。 [6] ヒト IgGがヒト IgG4である、 [2]の重鎖。
[7] 定常領域のアミノ酸の置換が、 Kabatらによる EUインデックスにより示さ れる 331位のプロリンのセリンへの置換である、 [3]'〜 [5]のいずれかの重鎖。
[8] [ 1 ]〜 [ 7 ]のいずれかの重鎖を含むモノクローナル抗体。
[9] ハイプリドーマ KM34卜卜 19 (受託番号 FERM BP- 7759) が産生するモノクロ ーナル抗体の重鎖の可変領域を有する、 [1]〜 [7]のいずれかの重鎖。
[1 0] [9]の重鎖およびハイプリドーマ KM34卜 1- 19 (受託番号 FERM BP- 7759) が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、 からなるモノク 口一ナル抗体。
[1 1] 配列番号 3 8で表されるポリペプチドの可変領域を有する、 [1]〜[7] のいずれかの重鎖。 '
[1 2] [1 1]の重鎖および配列番号 40で表されるポリペプチドの可変領域を 有するモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモノクローナル抗体。
[1 3] 配列番号 132で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分か らなる [1]の重鎖。
[1 4] [1 3]の重鎖および配列番号 134で表されるポリペプチドからシグナル 配列を除いた部分からなるモノクロ一ナル抗体の軽鎖、 からなるモノク口一ナル 抗体。
[1 5] 配列番号 131で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む 宿主から産生される [1]の重鎖。
[1 6] 配列番号 131で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号 133で表される ポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される [8]のモノク ローナル抗体。
[1 7] ハイプリドーマ 2105 (受託番号 FERM BP- 8024) が産生するモノクローナ ル抗体の重鎖の可変領域を有する、 [1]〜 [7]のいずれかの重鎖。
[1 8] [1 7]の重鎖およびハイプリドーマ 2105 (受託番号 FERM BP- 8024) が産 生するモノク口一ナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖からなるモノクローナ ル抗体。
[1 9] 配列番号 42で表されるポリペプチドの可変領域を有する、 [1]〜[7] のいずれかの重鎖。
[20] [1 9]の重鎖および配列番号 44で表されるポリペプチドの可変領域を 有するモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモノク '口一ナル抗体。
[2 1] 配列番号 136で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分か らなる [1]の重鎖。
[2 2] [2 1]の重鎖および配列番号 138で表されるポリペプチドからシグナル 配列を除いた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモノクローナル 抗体。
[2 3] 配列番号 135で表されるポリヌクレオチドを有する発現べクタ一を含む 宿主から産生される [1]の重鎖。
[24] 配列番号 135で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号 137で表される ポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される〖8]のモノク 口一ナル抗体。 '
[2 5] 配列番号 131で表されるポリヌクレオチド。
[2 6] 配列番号 133で表されるポリヌクレオチド。
['2 7] [2 5]のホ。 リヌクレオチドを有する発現ベクター。
[2 8] [2 6]のポリヌクレオチドを有する発現べクタ一。
[2 9] [2 5]および [2 6]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
[3 0] [2 7]の発現ベクターを含む宿主。
[3 1] [2 8]の発現ベクターを含む宿主。
[3 2] [2 9]の発現ベクターを含む宿主。
[3 33 [3 0]の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または該宿主からモ ノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、 モノクローナル抗体の重鎖を製 造する方法。
[34] [3 2]の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または該宿主からモ ノク'ローナル抗体を取得する工程を含む、 モノクローナル抗体を製造する方法。
[3 5] 配列番号 135で表されるポリヌクレオチド。
[3 6] 配列番号 137で表されるポリヌクレオチド。
[3 7] [3 5]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。 [3 8] [3 6]のポリヌクレオチドを有する発現べクタ一。
[3 9] [3 5]および [36]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
[40] [3 7]の発現べクタ一を含む宿主。 '
[41] [38]の発現ベクターを含む宿主。
[42] [3 9]の発現ベクターを含む宿主。
[43] [40]の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または該宿主からモ ノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、 モノクローナル抗体の重鎖を製 造する方法。
[44] [42]の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または該宿主からモ ノクローナル抗体を取得する工程を含む、 モノクローナル抗体を製造する方法。
[45] ヒト I.gG2のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを有していない抗体のァ ッパーヒンジおよびミドルヒンジを、 ヒト IgG2のアッパーヒンジおよびミドルヒ ンジに置換する土程を含む、 ァゴニスト活性を有する CD40に結合するモノクロ一 ナル抗体の重鎖の製造方法。
[46] CD40に結合するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域のポリペプチドを 特定する工程を含む、 該可変領域とヒト IgG2のアッパーヒンジおよびミドルヒン ジを有するモノクローナル抗体の重鎖の製造方法。
[47] ヒト IgG2のアツパ一ヒンジおよびミドルヒンジを有していない抗体のァ ッパ一ヒンジおよびミドルヒンジを、 ヒト IgG2のアッパーヒンジおよびミドルヒ ンジに置換する工程を含む、 ァゴニスト活性を有する CM0に結合するモノクロ一 ナル抗体の製造方法。
[48] CD40に結合するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域のポリペプチドを 特定する工程を含む、 該可変領域とヒト IgG2のアッパーヒンジおよびミドルヒン ジを有するモノク口一ナル抗体の製造方法。
[49] · [.8]、 [1 0]、 [12]、 [14]、 [1 6]、 [1 8]、 [20]、 [22]およ び [24]のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含む医薬組成物。
[50] 悪性腫瘍、 病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる、 [49]の医薬組成物。
[5 1] [49]の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、 悪性腫瘍、 病原 体または自己免疫疾患を予防または治療する方法。
[52] 悪性腫瘍、 病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる医 薬組成物を製造するための、 [8]、 [10]、 [12]； [14]、 [16]、 [18]、 [20]、 〖22]および [24]のいずれかのモノクローナル抗体の使用。
[89] 配列番号 131で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードす る部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
[9 0] '配列番号 133で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードす る部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
[91] 配列番号 135で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードす る部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
[92] 配列番号 137で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードす る部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
また、 本件発日)!は、 ヒト IgG2に属するァゴニスト抗 CD40抗体に改変を加えた抗 体であって、 アッパーヒンジおよびミドルヒンジ領域以外の定常領域が他のサブ クラス由来の配列に置換された変異体を提供する。 好ましい他のサブクラスは IgGlである。 また、 本件発明は、 ヒト IgG2に属するァゴニスト抗 CD40抗体に改変 を加えた抗体であって、 ヒンジ領域以外の定常領域が他のサブクラス由来の配列 に置換された変異体を提供する。 好ましい他のサブクラスは IgGlである。
ここで、 ADCC活性および CDC活性が低下しているとは、 上記変異体でない、 抗 CD40モノクローナル抗体に比べて、 ADCC活性および CDCが低下していることをい い、 例えば、 ハイブリド一マ KM341- 1- 19 (受託番号 FERM BP- 7759) もしくは 2105 (受託番号 FE應 BP- 8024) が産生するモノクローナル抗体に比べて ADCC活性およ び CDCが低下していることをいう。 ADCC活性および CDC活性は公知の方法により測 定するこ'とができ、 例えば本明細書の実施例に記載の方法で測定すればよい。 八 イブリ ドーマ KM341- 1- 19 (受託番号 FERM BP-7759) もしくは 2105 (受託番号 FERM BP - 8024) が産生するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下 に示すとおりである。
KM34卜卜 19抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする]) NA並びに重鎖及び軽 鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。 KM341- 1- 19抗体 の重鎖塩基配列 （配列番号 3 7 ) における、 シグナル配列は 50番目のアデニン （A) から始まる。 シグナル配列と可変領域の境界は 109番目の [アデニン] ( [A] )と 110番目のシトシン（C)の間に位置し、 可変領域と定常領域の 境界は 493番目のアデニン（A)と 494番目のグァニン（G)の間に位置する （遺伝子配 列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) を使用） 。
KM341-卜 19抗体 の重鎖アミノ酸列 （配列番号 3 8 ) における、 シグナル配列 と可変領域の境界は 20番目のセリン (S)と 21番目のグルタミン（Q)の間に位置し、 可変領域と定常領域の境界は 1 48番目のセリン（S)と 149番目のァラニン（A)の間 に位置する。
以上より、 KM341 -卜 19抗体 の重鎖可変領域の塩基配列は、.配列番号 3 7にお ける 110番目のシトシン（C)から 493番目のアデニン（A)までである。 また、 腿 34卜 1 - 19抗体 の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 3 8における 21番目のグ ルタミン（Q)から' 148番目のセリン（S)までである。
KM341-卜 19抗体の軽鎖塩基配列 （配列番号 3 9 ) における、 シグナル配列は、 29番目のアデニン （A) から始まる。 シグナル配列と可変領域の境界は 88番目の [ デニン] ( [A] )と 89番目のグァニン（G)の間に位置し、 可変領域と定常領域の境 界は 4 00番目のアデニン（A)と 401番目の [シトシン] ( [C] )の間に位置する （遺伝 子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) を使用） 。
KM34卜卜 19抗体の軽鎖アミノ酸列 （配列番号 4 0 ) における、 シグナル配列と 可変領域の境界は 20番目のダリシン（G)と 21番目のグルタミン酸（E)の間に位置し、 可変領域と定常領域の境界は 124番目のリジン（K)と 125番目の [アルギニン] ( [R] ) の間に位置する。
以上より、 KM341- 1-19抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 3 9におけ る 89番目のグァニン（G)から 400番目のアデニン（A)までである。 また、 KM34卜卜 19抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 4 0における 21番目のグル夕 ミン酸（E)から 124番目のリジン（K)までである。
KM34卜卜 19抗体 重鎖塩基配列 （配列番号 3 7 ) ：
Figure imgf000018_0001
Ed3d¾3A33)eIDIddETASiyIv3iu¾aivMNSiHaAMSI3CvcC Od 3ENSSdAiA
M3)I0SA3HSMM:SM¾3SInMdrf3MAMiiMnAjCIA3AisM 3IdSvASAga3HSvAaAM
aMDs)LsislgMS3MHAIsdfsAnsAMaIaa<VsdnnAs ¾c3¾,
¾0lls¾3HP¾silHMVIAS3sANldisMSMAn¾5sn KM34卜卜 19抗体 軽鎖塩基配列 （配列番号 3 9 )
Figure imgf000019_0001
TAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG
KM341 - 1 - 19抗体 軽鎖アミノ酸配列 （配列番号 4 0 )
NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRT
2105抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする DNA並びに重鎖及び軽鎖のアミ ノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
2105抗体 の重鎖塩基配列 （配列番号 4 1 ) における、 シグナル配列は 70番目 めアデニン （A) から始まる。 シグナル配列と可変領域の境界は 126番目の [チミ ン] ( [T] )と 127番目のグァニン（G)の間に位置し、 可変領域と定常領域の境界は 495番目のアデニン（A)と 496番目のグァニン（G)の間に位置する （遺伝子配列予測 ソフトウェア （Signal P ver. 2) を使用） 。
2105抗体の重鎖アミノ酸列 （配列番号 4 2 ) における、 シグナル配列と可変領 域の境界は 19番目のシスティン（C)ど 20番目のダル夕ミン酸（E)の間に位置し、 可 変領域と定常領域の境界は 142番目のセリン（S)と 143番目のァラニン（A)の間に位 置する。
以上より、 2105抗体 の重鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 4 1における 127番目のグァニン（G)から 495番目のアデニン（A)までである。 また、 2105抗体の 重鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 4 2における 20番目のグルタミン酸 (E)から 142番目のセリン（S)までである。
2105抗体の軽鎖塩基配列 （配列番号 4 3 ) における、 シグナル配列は、 28番目 のアデニン （A) から始まる。 シグナル配列と可変領域の境界は 87番目の [アデ二 ン] ([A])と 88番目のグァニン（G)の間に位置し、 可変領域と定常領域の境界は 405 番目のアデニン（A)と 406番目の [シトシン] ([C])の間に位置する （遺伝子配列予 測ソフトウェア （Signal P ver.2) を使用） 。 '
2105抗体の軽鎖アミノ酸列 （配列番号 44) における、 シグナル配列と可変領 域の境界は 20番目のダリシン（G)と 21番目のグルタミン酸（E)の間に位置し、 可変 領域と定常領域の境界は 126番目のリジン（K)と 127番目の [アルギニン] ([R])の間 に位置する。
以上より、 2105抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 43における 88番 目のグァニン（G)から 405番目のアデニン（A)までである。 また、 2105抗体の軽鎖 可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 44における 21番目のグルタミン酸（E)か ら 126番目のリジン（K)までである。
2105抗体 重鎖'塩基配列 （配列番号： 4 1)
Figure imgf000020_0001
AAGG
2105抗体 重鎖アミノ酸配列 （配列番号： 42)
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLYQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWV QAPGKGLEWVSGISW NSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGY YYGMDVWGQGTTVTVSSAS TK
2105抗体 軽鎖塩基配列 （配列番号： 43) AGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTG
2105抗体 軽鎖アミノ酸配列 （配列番号： 4 4 )
N ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTV
341G2Serの重鎖塩基配列 （配列番号 1 3 1 ) における、 シグナル配列と可変領 域の境界は 60番目の [アデニン] ( [A] )と 61番目のシトシン （C) の間に位置し、 可 変領域と定常領'域の境界は 444番目のアデニン（A)と 445番目のグァニン （G)の間 に位置する （遺伝子配列予測ソフトゥヱァ （Signal P ver. 2) を使用） 。
341G2Serの重鎖アミノ酸列 （配列番号 1 3 2 ) における、 シグナル配列と可変 領域の境界は 20番目のセリン（S)と 21番目のグルタミン（Q)の間に位置し、 可変領 域と定常領域の境界は 148番目のセリン（S)と 149番目のァラニン（A)の間に位置す る。
以上より、 341G2Serの重鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 1 3 1における 61 番目のシトシン （C) から 444番目のアデニン（A)までである。 また、 341G2Serの 重鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 1 3 2における 21番目のグルタミン (Q)から 148番目のセリン（S)までである。
341G2Ser重鎖全塩基配列 （配列番号 : 1 3 1 )
GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
341G2Sser重鎖全アミノ酸配列 （配列番号： 1 3 2 )
TYYRSKWYRDYVGSVKSRI IINPDTS丽 QFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTV
VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIE KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF LYSKLTVDKS WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
341G2Serの軽鎖塩基配列 （配列番号 1 3 3 ) における、 シグナル配列と可変領 域の境界は 60番目の [アデニン] ( [A] )と 61番目のグァニン（G)の間に位置し、 可変 領域と定常領域の境界は 372番目のアデニン（A)と 373番目の [シトシン] ( [C] )の間 に位置する （遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) を使用） 。 341G2Serの軽鎖アミノ酸列 （配列番号 1 3 4 ) における、 シグナル配列と可変 領域の境界は 20番目のダリシン（G)と 21番目.のダル夕ミン酸（E)の間に位置し、 可 変領域と定常領域の境界は 124番目のリジン（K)と 125番.目の [アルギニン] ( [R] )の 間に位置する。 以上より、 341G2Serの軽鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 1 3 3における 61番目のグァニン（G)から 372番目のアデニン（A)までである。 また、 341G2Serの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 1 3 4における 21番目のグ ル夕ミン酸（E)から 124番目のリジン（K)までである。 -
341G2Ser軽鎖全塩基配列 （配列番号 : 1 3 3 )
Figure imgf000023_0001
GGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
341G2Ser軽鎖全アミノ酸配列 （配列番号： 1 3 4 )
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKYDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLL丽 FY EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
2105G2Serの重鎖塩基配列 （配列番号 1 3 5 ) における、 シグナル配列と可変 領域の境界は 57番目の [チミン] ( [T] )と 58番目のグァニン （G) の間に位置し、 可 変領域と定常領域の境界は 426番目のアデニン（A)と 427番目のグァニン（G)の間に 位置する （遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver.2) を使用） 。
2105G2Serの重鎖アミノ酸列 （配列番号 1 3 6 ) における、 シグナル配列と可 変領域の境界は 19番目のシスティン（C)と 20番目の 'グルタミン酸 (E)の間に位置 し、 可変領域と定常領域の境界は 142番目のセリン（S)と 143番目のァラニン（A)の 間に位置する。
以上より、 2105G2Serの重鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 1 3 5における 58番目のグァニン （G) から 426番目のアデニン（A)までである。 また、 2105G2Ser の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 1 3 6にお る 20番目のグルタミン 酸（E)から 142番目のセリン（S)までである。
2105G2Ser重鎖全塩基配列 （配列番号： 1 3 5)
TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
2105G2Ser重鎖全アミノ酸配列 （配列番号： 1 3 6 )
MELGLS IFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWYRQAPGKGLEWVSGISW NSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTYTVSSAS
Figure imgf000025_0001
HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKT KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE題 YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2105G2Serの軽鎖塩基配列 （配列番号 1 3 7 ) における、 シグナル配列と可変 領域の境界は 60番目の [アデニン] ( [A] )と 61番目のグァニン（G)の間に位置し、 可 変領域と定常領域の境界は 378番目のアデニン（A)と 379番目の [シトシン] ( [C] )の 間に位置する （遺伝子配列予測ソフトウェア （S ignal P ver. 2) を使用） 。
2105G2Serの軽鎖アミノ酸列 （配列番号 1 3 8 ) における、 シグナル配列と可 変領域の境界は 20番目のダリシン（G)と 21番目のダル夕ミン酸（E)の間に位置し、 可変領域と定常領域の境界は 126番目のリジン（K)と 127番目の [アルギニン] ( [R] ) の間に位置する。 以上より、 2105G2Serの軽鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 1 3 7における 61番目のグァニン（G)から 378番目のアデニン（A)までである。 ま た、 2105G2Serの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 1 3 8における 21番 目のグルタミン酸（E)から 126番目のリジン（K)までである。
2105G2Ser軽鎖全塩基配列 （配列番号 : 1 3 7 ) CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
2105G2Ser軽鎖全アミノ酸配列 （配列番号： 1 3 8 )
Figure imgf000026_0001
KSGTASVVCLLNNFYP EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC
2 . アンタゴニスティック抗体の改変
抗 CD40アン夕ゴニスティック抗体に関しても、 ァゴニスティック抗体と同様に、 の作用メカニズムから ADCC活性、 CDC活性がないことが医薬品としてより好ま しいと考えられる。 さらに、 アン夕ゴニスティック抗体の場合、 ADCC活性が検出 できない場合においても、 in vivoでの Fc receptorを介した抗体の架橋によって、 シグナルを誘導する活性を回避することが重要となる。 言い換えれば、 in vivo において免疫を活性化しないことを確認することが必要となり、 そのような活性 をもつ抗体が医薬品としては、 必要であると考えられる。 抗 CD40アン夕ゴニスト 抗体は、 自己免疫疾患や臓器移植拒絶などの治療薬として期待されているが、 も しも、 抗体投与後に何らかの働きで、 微弱でもァゴニスト活性を誘導してしまう ことがあ 'つた場合、 症状の増悪をもたらし、 期待した治療効果の反対の結果とな る可能性が考えられるため、 ァゴニスト活性が全くない抗体が医薬品としてはよ り好ましい。 本発明においては、 サルを用いた試験により、 in vivoにおいても ァゴニスト活性をより低減させるためには、 IgG4に点変異 L235E (235番目の Lを E に置換することを意味する。 以下同様。 ） を導入することが有効であることを示 した。 また、 ADCC、 CDC活性が低い抗体サブクラスとして、 IgG4が挙げられるが、 IgG4は組換え蛋白質として CHOなどの細胞で発現させる場合、 重鎖間の SS結合の 形成が不十分で、 半量体が分泌されることが報告されている （Rob C. Aalberse et. al.， Immuno logy, 105, 9-19, 2002) 。 このため、 抗体定常領域に変異を導 入することにより、 SS結合の形成を促進できることが報告されており、 この変異 の有用性に関しても評価した。 具体的には、 228番目の Sを Pに置換する変異を導 入した （S. Ang l et. al. , Molecul ar Immunology, vol 30, no l, 105-108, 1993) 。
ァゴニスト抗体と同様にアン夕ゴニスト抗体においても、 抗体の精製保存時の 安定性は非常に重要なポイントとなる。 いくつかの方法により、 アン夕ゴニスト 活性を保持しつつ、 より物性的に優れた抗体を作製することが可能であると考え られる。 現在までに市販されている抗体医薬品は、 IgGlサブクラスに属するもの がほとんどを占め、 製剤上の問題点は特に報告されていない。 このことから、 抗 体の定常領域が igGlであることが物性的には有利である可能性が考えられる。 し かし、 抗 CD40アンタゴニスト抗体の場合は、 ADC (；、 CDC活性が低減されたものが 望ましい。 このため、 IgG lの定常領域にいくつかの点変異を導入したものが望 まれる。 方法としては、 上述した変異を導入することにより可能となる。 例えば、 P331G点変異を導入することにより、 ADCC、 CDC活性を低減させた、 IgGl定常領域 を作ることが可能であると考えられる。 また、 IgG4に点変異 L235Eを導入するこ とにより、 in vivoにおいて、 微弱なァゴニスト活性が消失し、 薬効的には優れ た活性を示すが、 物性面では低 p Hにおける安定性が低下するという減少が見ら れている。 このため、 L235を E以外の別のアミノ酸に置換することにより、 物性 面での機能向上が期待できる。 また、 4 D11抗体については、 その可変領域の構 造が非常に類似している 2 B 1 1抗体がある。 2 B11抗体は、 アン夕ゴニスト活性 は、 4 D11抗体に劣るが、 低 p Hにおける安定性は 4 D11抗体に勝る。 このことを 利用し、 可変領域の 2 B 11由来のアミノ酸の一部を 4 D11抗体に導入することによ つて、 安定性を向上させることは可能であると考えられる。 具体的には、 重鎖の L38V、 P58L G62W、 I79M、 K81Y、 Η87Υ、 S98A、 K109 V函、 Π24Αおよび、 軽 鎖の N75Sの点変異とその組み合わせによって、 可能であると考えられる。 具体的 には、 4 D11抗体重鎖可変領域の 38番目 Lを Vに置換した変異体 （L38Vと略記。 以 下同様） 、 P58K変異体、 G6 変異体、 I79M変異体、 K81Y変異体、 H87Y変異体、 S98A変異体、 K109R変異体、 V120M変異体、 T124A変異体、 および、 軽鎖の N75S変 異体、 または前述の点変異の組み合わせによって、 可能であると考えられる。 本発明の抗体は、 上記の ADCCおよび/または CDC活性を低減させるアミノ酸の 変異を 1以上、 好ましくは 1〜15個、 1〜13個、 1〜12個、 1〜11個、 1〜10個、 1〜9個、 1〜8個、 1〜7個、 1〜6.個、 1〜5個、 1〜4個、 1〜3個また は 1もしくは 2個有する。
本件発明は、 以下のアンタゴニスティック抗 CD40抗体変異体等を提供する。
[5 3] 定常領域に ADCCおよび/または CDCの増加または低減を生じせしめる 1以 上のアミノ酸の欠失または置換もしくは 1以上のアミノ酸が付加されたアン夕ゴ ニスト活性を有する CD40に結合するモノクローナル抗体の重鎖。
[54] , 定常領域がヒト IgGである、 [5 3]の重鎖。
[5 5] ヒト Ig0がヒト IgGlである、 [54]の重鎖。
[5 6] ヒト IgGがヒト IgG2である、 [54]の重鎖。
[5 7] ヒト IgGがヒト IgG3である、 [54]の重鎖。
[5 8] ヒト IgGがヒト IgG4である、 [54]の重鎖。
[5 9] 定常領域のアミノ酸の置換が、 Kabatらによる EUインデックスにより示 される 235位のロイシンからグルタミン酸への置換である、 [5 5]、 [5 7]およ び [5 8]のいずれかの重鎖。
[6 0] 定常領域に、 重鎖どうしの S S結合形成を促進させる 1以上のアミノ酸 の欠失または置換もしくは 1以上のアミノ酸が付加されている、 [5 3]〜[5 8] のいずれかの重鎖。
[6 1] 定常領域のアミノ酸の置換が、 Kabatらによる EUインデックスにより示 される 228位のセリンからプロリンへの置換である、 [6 0]の抗体の重鎖。
[6 2] [5 3]〜 [6 1]のいずれかの重鎖を含むモノクローナル抗体。
[6 3] ハイプリ ドーマ 4D1 1 (受託番号 FERM BP-7758) が産生するモノクロ ーナル抗体の重鎖の可変領域を有する、 [5 3]〜 [6 1]のいずれかの重鎖。
[64] [6 3]の重鎖およびハイプリ ドーマ 4D1 1 (受託番号 FERM BP-7758) が産生するモノクロ一ナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、 からなるモノク 口一ナル抗体。
[6 5] 配列番号 46で表されるポリペプチドの可変領域を有する、 [5 3]〜 [6 1]のいずれかの重鎖。 '
[6 6] [6 5]の重鎖および配列番号 48で表されるポリペプチドの可変領域を 有するモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモノクローナル抗体。
[6 7] 配列番号 140で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分か らなる [53]の重鎖。
[6 8] [6 7]の重鎖および配列番号 142で表されるポリペプチドからシグナル 配列を除いた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモノクローナル キ几体
[6 9] 配列番号 139で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む 宿主から産生される [5 3]の重鎖。
[7 0] 配列番 ^139で表される リヌクレオチドおよび配列番号 141で表される ポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される [6 2]のモノ クローナル抗体。
[7 1] 配列番号 139で表されるポリヌクレオチド。
[7 2] 配列番号 141で表されるポリヌクレオチド。
[7 3] [7 1]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
[74〗 [7 2]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
[7 5] [7 1]および [7 2]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
[7 6] [7 3]の発現ベクターを含む宿主。
[7 7] [74]の発現べクタ一を含む宿主。
[7 8] [7 5]の発現ベクターを含む宿主。
[7 9] · [7 6]の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または該宿主からモ ノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、 モノクローナル抗体の重鎖を製 造する方法。
[8 0] [7 8]の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または該宿主からモ ノク口一ナル抗体を取得する工程を含む、 モノクローナル抗体を製造する方法。
[8 1] [6 2]、 [64]、 [6 6]、 [ 6 8 ]および [ 7 0 ]のいずれかのモノクロ一 ナル抗体を有効成分として含む医薬組成物。
[8' 2] 移植拒絶、 自己免疫疾患、 アレルギーまたは血液凝固第 I因子阻害症候 群の予防または治療に用いられる、 [8 1]の医薬組成物。
[8 3] [8 1]の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、 移植拒絶、 自己 免疫疾患、 アレルギーまたは血液凝固第 I因子阻害症候群を予防または治療する 方法。 .
[84] 移植拒絶、 自己免疫疾患、 アレルギーまたは血液凝固第珊因子阻害症候 群の予防または治療に用いられる医薬組成物を製造するための、 [62]、 [64]、 [6 6]、 [68]および [70]のいずれかのモノクローナル抗体の使用。
[8 5] ヒト抗体の重鎖定常領域に 1以上のアミノ酸の欠失または置換もしくは .1以上のアミノ酸を付加する工程を含む、 ァゴニスティック活性が低減されたァ ン夕ゴニスト活性を有する CD40に結合するモノクローナル抗体の重鎖の製造方法。
[8 6] 定常領域がヒト IgGである、 [8 5]の方法。
[8 7] ヒト IgGがヒト IgG4である、 [86]の方法。
[8 8] 定常領域のアミノ酸の置換が、 Kabatらによる EUインデックスにより示 される 235位のロイシンからグルタミン酸への置換である、 [8 5]〜 [87]のい ずれかの方法。
[9 3] 配列番号 139で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードす る部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
[94] 配列番号 141で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードす る部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
その他、 本発明は以下のものを提供する。
ハイプリ ドーマ 4D11 (受託番号 FERM BP- 7758) の産生するモノクローナル抗体 の重鎖可変領域の 38番目 Lの Vへの置換、 58番目 Pの Rへの置換、 62番目 Gの Wへの置 換、 79番目 Iの Mへの置換、 81番目 Kの Yへの置換、 87番目 Hの Yへの置換、 98番目 S の Aへの置換、 109番目 Kの Rへの置換、 120番目 Vの Mへの置換、 124番目 Tの Aへの置 換からなる群から選択される少なくとも一つの置換を含む上記のアン夕ゴニステ ィック抗 CD40抗体の変異体、 ならびに 4D1I抗体軽鎖可変領域の 75番目 Nを Sに置 換した上記上記ののアン夕ゴニスティック抗 CD40抗体の変異体。 ここで、 ADCC活性および CDC活性が低下しているとは、 上記変異体でない、 抗 CD40モノクローナル抗体に比べて、 ADCC活性および CDCが低下していることをい い、 例えば、'ハイプリ ドーマ 4D11 (受託番号 FERM BP-7758) の産生するモノクロ —ナル抗体に比べて ADCC活性および CDCが低下していることをいう。 ADCC活性お よび CDC活性は公知の方法により測定することができ、 例えば本明細書の実施例 に記載の方法で測定すればよい。 ハイプリドーマ 4D11 (受託番号 FERM BP-7758) の産生するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下に示すとお りである。
4 D11抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする DNA並びに重鎖及び軽鎖のアミ ノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
4 D11抗体の重鎖塩基配列 （配列番号 4 5 ) における、 シグナル配列と可変領 域の境界は 93番目の [シトシン] ( [C] )と 94番目のシトシン （C) の間に位置し、 可 変領域と定常領域の境界は 456番目のアデニン（A)と 457番目のグァニン（G)の間に 位置する （遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) を使用） 。
4 D11抗体の重鎖アミノ酸列 （配列番号 4 6 ) における、 シグナル配列と可変 頜域の境界は 26番目のセリン（S)と 27番目のグルタミン（Q)の間に位置し、 可変領 域と定常領域の境界は 147番目のセリン（S)と 148番目のァラニン（A)の間に位置す る。
以上より、 4 D11抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 4 5における 94 番目のシトシン（C)から 456番目のアデニン（A)までである。 また、 4 D11抗体の重 鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 4 6における 27番目のグルタミン（Q)か ら 147番目のセリン（S)までである。
4 D11抗体の軽鎖塩基配列 （配列番号 4 7 ) における、 シグナル配列と可変領 域の境界は 124番目の [チミン] ( [T] )と 125番目のグァニン（G)の間に位置し、 可変 領域と定常領域の境界は 442番目のアデニン（A)と 443番目の [シトシン] ( [C] )の間 に位置する （遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) を使用） 。
4 D11抗体の軽鎖アミノ酸列 （配列番号 4 8 ) における、 シグナル配列と可変 領域の境界は 22番目のシスティン（C)と 23番目のァラニン（A)の間に位置し、 可変 領域と定常領域の境界は 128番目のリジン（K)と 129番目の [アルギニン] ( [R] )の間 に位置する。
以上より、 4D11抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 47における 125 番目のグァニン（G)から 442番目のアデニン（A)までで'ある。 また、 4D11抗体の軽 鎖可変領域のァミノ酸配列は、 配列番号 48における 23番目のァラニン（A)から 128番目のリジン（K)までである。
4D11抗体 重鎖塩基配列 （配列番号： 45)
Figure imgf000032_0001
GGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
4D11抗体 重鎖アミノ酸配列 （配列番号： 46)
MDLMCKKMKHL FFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKG
VSSAS
4D11抗体 軽鎖塩基配列 （配列番号： 47)
Figure imgf000032_0002
GGAAATCAAACGTACG 4D11抗体 軽鎖アミノ酸配列 （配列番号： 48)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITi
ASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRT
4D11抗体 G4PEの重鎖塩基配列 （配列番号 139) における、 シグナル配列と 可変領域の境界は 78番目の [シトシン] ([C])と 79番目のシトシン （C) の間に位置 し、 可変領域と定常領域の境界は 441番目のアデニン（A)と 442番目のグァニン (G)の間に位置する （遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver.2) を使用） c
4D11抗体の重鎖アミノ酸列 （配列番号 140) における、 シグナル配列と可 変領域の境界は 26番目のセリン（S)と 27番目のグルタミン（Q)の間に位置し、 可変 領域と定常領域の境界は 147番目のセリン（S)と 148番目のァラニン（A)の間に位置 する。 · - 以上より、 4i)ll抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 139における 79番目のシトシン（C)から 441番目のアデニン（A)までである。 また、 4D11抗体の 重鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 140における 27番目のグルタミン (Q)から 147番目のセリン（S)までである。
4D11G4PE重鎖全塩基配列 （配列番号： 139)
GAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
4 D11G4PE重鎖全アミノ酸配列 （配列番号： 1 4 0 )
MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAP WVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGG IRQPPGKG LEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVT
TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE丽 YKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
4D11G4PEの軽鎖塩基配列 （配列番号 1 4 1 ) における、 シグナル配列と可変領 域の境界は 66番目の [チミン] ( [T] )と 67番目のグァニン（G)の間に位置し、 可変領 域と定常領域の境界は 384番目のアデニン（A)と 385番目の [シトシン] ( [C] )の間に 位置する （遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) を使用） 。
4D11G4PEの軽鎖アミノ酸列 （配列番号 1 4 2 ) における、 シグナル配列と可変 領域の境界は 22番目のシスティン（C)と 23番目のァラニン（A)の間に位置し、 可変 領域と定常領域の境界は 128番目のリジン（K)と 129番目の [アルギニン] の間 に位置する。
以上より、 4D1 1G4PEの軽鎖可変領域の塩基配列は、 配列番号 1 4 1における 67 番目のグァニン（G)から 384番目のアデニン（A)までである。 また、 4 D11G4PEの軽 鎖可変領域のアミノ酸配列は、 配列番号 142における 23番目のァラ ら 128番目のリジン（K)までである。
4D11G4PE軽鎖全塩基配列 （配列番号： 1 1 )
Figure imgf000035_0001
GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
4D11G4PE軽鎖全アミノ酸配列 (配列番号： 142)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGA CAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYD
QLKSGTASVVCLL丽 FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
3. 定義
本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
本発明でいう 「CD40」 とは、 クラークら （E. A. Clark et. al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986) 又はスタメンコビックら （I. Stamenkovic et. al. , EMBO J. 8:1403, 1989)により示されているアミノ酸配列を有するポリぺプ チドを意味し、 特に B細胞、 DC、 マクロファージ、 内皮細胞、 上皮細胞、 あるい はそれらの腫瘍細胞表面に発現する抗原ポリペプチドである。
「抗 CD40抗体」 とは、 細胞発現 CD40、 全長 CD40又は部分長 CD40に対するモノク Dーナル抗体のいずれをも意味する。 さらに、 本発明で 「抗体」 とは、 ィムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及 び重鎖定常領域並びに軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域をコードする遺伝子 ( 「抗体遺伝子」 と総称する） に由来するものである。 ヒトのィムノグロブリン には、 IgG、 IgA、 IgM、 IgDおよび IgEからなる 5つの異なったクラスが存在する。 IgGはさらに IgGl、 IgG2、 IgG3および IgG4からなる 4.つのサブクラス、 また IgAは さらに IgAlおよび IgA2からなる 2つのサブクラスに分類することが出来る。 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4はヒト染色体の 14Q32. 33に位置する。 ィムノグロブリンの基本構 造は、 2本の相同な L鎖 （軽鎖） と、 2本の相同な H鎖 （重鎖） から成り立つてい る。 免疫グロブリンのクラスとサブクラスは H鎖によって決定される。 本発明の 抗体には、 いずれのィムノグロプリンクラス ·サブクラス及びアイソタイプを有 する抗体をも包含する。 本発明における抗体の 「機能的断片」 とは、 前記で定義 した抗体の一部分 （部分断片） であって、 抗体の抗原への作用を 1つ以上保持す るものを意味し； 具体的には F (ab' ) 2、 Fab' Fab, Fv、 ジスルフイ ド結合 FV、 ― 本鎖 FV (scFV) 、 およびこれら の重合体等が挙げられる （ D. J. King. , Appl icat ions and Engineering of Monoclonal Ant ibodies. , 1998 T.' L Internat ional Ltd) 。
これまでに知られている IgGlとしては J00228、 Z17370または Y14737などが、 IgG2としては J00230、 AJ250170, AF449616, AF449617, AF449618, Z49802または Z49801などが、 IgG3としては M12958、 画 13、 X16110, X99549, AJ390236, AJ390237, AJ390238 AJ39024K AJ390242, AJ390246, AJ390247, AJ390252, AJ390244、 AJ390254、 AJ390260, AJ390262, AJ390272, AJ390276または AJ390279 などが、 IgG4としては K01316、 AJ001563, AJ001564などが挙げられる （以上の記 号は遺伝子のァクセッション番号である） 。
本発明における、 CH1、 ヒンジ、 CH2、 CH3とは、 抗体重鎖定常領域の一部分を 示しており、 Kabatらの EUイ ンデックス （Kabat et. al. , Seauences of prote ins of immunological interest, 1991 Fi f th ed i t ion) に基づレ てレ る。
CH1は、 EUインデックス 118から 215、 ヒンジは EUインデックス 216から 230、 CH2は
EUィンデックス 231から 340、 CH3は EUィンデックス 341から 446と定義される。
本発明で 「ヒト抗体」 とは、 ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意 味する。
「ァゴ二スティック」 とは、 B細胞、 腫瘍細胞又は樹状細胞などの細胞表面上 に発現する CD40に、 そのリガンドが結合することを促進する作用、 あるいは、 CD40リガンドが CD40発現細胞に与える影響の 1つ以上を、 CD40を発現する細胞に 与える作用を意味し、 「ァゴ二スティック抗体」 とは、 そのようなァゴニスティ ック作用を有する抗体を意味する。 CD40発現細胞に与える影響の 1つとして、 例 えば CD95の発現促進が挙げられる。
「アン夕ゴニスティック」 とは、 B細胞、 腫瘍細胞又は樹状細胞などの細胞表 面上に発現する CD40にそのリガンドが結合することを阻害する作用、 あるいは、 CD40リガンドが CD40発現細胞に与える影響の 1つ以上を中和する作用を意味し、 「アン夕ゴニスティック抗体」 とはそのような作用を有する抗体を意味する。
CD40発現細胞に与える影響の 1つとして、 例えば B細胞増殖抑制あるいは抗体産生 抑制が挙げられ ¾。.
本出願において、 アミノ酸配列によって抗体またはその重鎖可変領域若しくは 軽鎖可変領域を明示しているが、 1以上、 好ましくは 1〜10個、 1〜9個、 1〜 0個、 1〜7個、 1〜6個、 1〜5個、 ：！〜 4個、 1〜 3個または 1もしくは 2 個のアミノ酸が欠失した、 あるいは置換された、 若しくは付加されたものも本発 明の範疇に含まれる。
本出願において、 塩基配列によって抗体またはその重鎖可変領域若しくは軽鎖 可変領域をコードする遺伝子をを明示しているが、 1以上、 好ましくは 1〜10個、 1〜9個、 1〜8個、 1〜7個、 1〜6個、 1〜5個、 1〜4個、 ；！〜 3個また は 1もしくは 2個の塩基が欠失した、 あるいは置換された、 若しくは付加された ものも本発明の範疇に含まれる。
本発明においては、 抗 CD40抗体は、 抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み、 ベ クタ一を適当な宿主細胞に導入し、 細胞もしくは細胞の培養上清から回収、 精製 することにより得ることができる。
ベクタ一には、 宿主細胞で自律的に増殖し得るか、 宿主細胞の染色体に組み込 まれ得るファージ又はプラスミドが使用される。 プラスミド DNAとしては、 大腸 菌、 枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、 ファージ DNAとしては λ ファージ等が挙げられる。
形質転換に使用する宿主としては、 目的の遺伝子を発現できるものであれば特 に限定されるものではない。 例えば、 細菌 （大腸菌'、 枯草菌等） 、 酵母、 動物細 胞 （COS細胞、 CH0細胞等） 、 昆虫細胞が挙げられる。
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、 任意の方法 （例えばカルシウムィォ ンを用いる方法、 エレクト口ポレーシヨン法、 スフエロプラスト法、 酢酸リチウ ム法、 リン酸カルシウム法、 リポフエクシヨン法等） が挙げられる。 また、 後述 の動物に遺伝子を導入する方法としては、 マイクロインジェクション法、 ES細胞 にエレクトロポレーションゃリポフエクション法を使用して遺伝子を導入する方 法、 核移植法などが挙げられる。
本発明において、 「培養物」 とは、 （a) 培養上清、 （W 培養細胞若しくは培 養菌体又はその破砕物、 （c) 形質転換体の分泌物のいずれをも意味するもので ある。 形質転換本を培養するには、 使用する宿主に適した培地を用い、 静置培養 法、 ローラーボトルによる培養法などが採用される。
培養後、 目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、 菌体又は 細胞を破砕することにより抗体を採取する。 また、 目的抗体が菌体外又は細胞外 に生産される場合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等により菌体又 は細胞を除去する。 その後、 タンパク質の単離精製に用いられる各種クロマトグ ラフィーを用いた一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いるこ とにより、 前記培養物中から目的の抗体を単離精製することができる。
さらに、 トランスジエニック動物作製技術を用いて、 目.的抗体の遺伝子が内在 性遺伝子に組み込まれた動物宿主、 例えばトランスジエニックゥシ、 トランスジ エニックャギ、 トランスジエニックヒッジ又はトランスジエニックブ夕を作製し、 そのトランスジエニック動物から分泌されるミルク中からその抗体遺伝子に由来 するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である （Wright, G.， et al. ( 1991) Bio/Technology 9, 830- 834) 。 ハイプリ ドーマをインビトロで培 養する場合には、 培養する細胞種の特性、 試験研究の目的及び培養方法等の種々 条件に合わせて、 ハイプリ ドーマを増殖、 維持及び保存させ、 培養上清中にモノ クロ一ナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地、 あるいは既 知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能 である。 .
4 . 抗体の性質 '
(1)ァゴニスティック抗体の場合
本発明のァゴニスティック抗体の変異体は、 ァゴニスティック活性を保持しつ つ、 ADC CDC活性がオリジナルの抗体に比べ、 同程度以下になっているため、 免疫担当細胞を傷害することなく、 免疫系を活性化することができると考えられ る。 そのため、 オリジナル抗体に比べ同程度以上の免疫活性化作用と、 同程度以 下の CD40発現細胞への障害による毒性を示すことが期待される。
(2)アン夕ゴニスティック抗体の場合
本発明のアン夕ゴニスティック抗 CD40抗体の変異体は、 CD40Lによる免疫活性 化シグナルを抑制する活性を保持しつつ、 改変前の抗体に比べ、 ADCC、 CDC活性 が低減している。' また、 in vivo においても、 Fcレセプターを介すると考えられ るシグナル誘導活性の低下が期待される。
5 . 医薬組成物
'また、 本発明の抗体の精製された製剤を含有する医薬組成物もまた、 本発明の 範囲内に含まれる。 このような医薬組成物は、 好ましくは、 抗体に加えて、 生理 学的に許容され得る希釈剤またはキヤリアを含んでおり、 他の抗体または抗生物 質のような他の薬剤との混合物であってもよい。 適切なキャリアには、 生理的食 塩水、 リン酸緩衝生理食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、 および緩衝 生理食塩水が含まれるが、 これらに限定されるものではない。 或いは、 抗体は凍 結乾燥 （フリーズドライ） し、 必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添 加することに理再構成して使用してもよい。 投与経路は、 経口ルート、 並びに静 脈内、 筋肉内、 皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的ルートである。
この場合、 本発明の抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得るキ ャリアとの組合せとして投与される有効量は、 1回につき体重 lkgあたり 0. OOOlrag 〜100mgであり、 2日から 8週間間隔で投与される。
本発明の抗体を含む医薬組成物を使用する場合は、 ァゴニスティック抗体につ いては、 免疫賦活化剤 （抗ウィルス剤、 抗感染症剤） であり、 病原体としては A, B, C, D,または E型肝炎ウィルス、 HIV、 インフルエンザウイルス、 単純へルぺス ウィルス、 サイトメガロウィルス、 EBウィルス、 パピローマウィルス、 クラミジ ァ、 マイコプラズマ、 トキソプラズマ、 マラリア、 トリパノゾーマ、 結核などが 例示される。 または抗腫瘍剤であり、 対象腫瘍としては CD40を発現した癌細胞を 含む悪性腫瘍、 例えば膝臓癌、 膀胱癌、 リンパ腫 （例えばホジキンリンパ腫） 、 白血病、 悪性黒色腫、 膝臓癌、 肺癌、 卵巣癌、 膀胱癌、 乳癌、 大腸癌、 前立腺癌、 頭頸部癌が挙げられる。 または自己免疫疾患治療剤であり、 対象疾患としてはリ ゥマチが例示される。 または、 これらの疾患が複数併発してもよい。 あるいは、 ガン特異的ペプチドなどのワクチンとアジュバントとして併用することもできる。 また、 アン夕ゴニスティック抗体については、 臓器移植時における免疫抑制剤 (膝島移植や腎臓などの移植時における拒絶反応、 GVHDの予防又は治療剤） とし て、 あるいは自己免疫疾患 （例えば、 リュウマチ、 乾癬、 潰瘍性大腸炎、 クロー ン病、 全身性ェ 0トマト一デス、 多発性硬化症、 筋無力症、 強皮症、 抗りん脂質 抗体症候群、 自己免疫性肝炎、 特発性血小板減少性紫斑病、 ベーチェット病、 動 脈硬化、 腎炎、 呼吸切迫症候群） の治療剤、 喘息などアレルギーの治療剤、.血液 凝固第 VI 11因子阻害症候群の治療剤として有用であり、 これらの疾患が複数併発 してもよい。
6 . ェピト一プ
優れたァゴニスト活性を有する KM341- 1-19抗体および 2105抗体、 優れたアン夕 ゴニスト活性を有する 4 D11抗体の CD40に対する結合ェピトープが決定された (実施例 2 ) 。 本件発明は、 上記抗体とは異なる可変領域配列を有し、 かつ上記 抗体のいずれかと同じェピトープを認識するァゴニスティックもしくはアン夕ゴ ニスティック抗 CD40抗体を提供する。 このような抗体は下記の要領によって取得 できる。 '
例えば KM341-卜 19抗体と同じェピトープを認識するァゴニスティック抗 CD40抗 体を取得する場合、 CD40をマウス等に免疫して得られたモノクローナル抗体の中 から、 CM0への結合に際して KM341-卜 19抗体と競合するものを常法により選抜す る。 選抜されたものについて実施例 2に記載された方法に基づき、 ペプチドに対 する結合パターンが KM34卜卜 19抗体と同じものを選抜する。 以下、 実施例を以つて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明がその実施例 に記載される形態のみに限定されるものではない。 '
実施例 1 抗体、 抗原蛋白質の発現精製
抗体発現細胞は、 抗体の可変領域を含むベグ夕ープラスミ ドを、 CH0細胞 (ATCC) に遺伝子導入し、 G418により選択することにより安定発現株を作製した。 また、 変異型抗原の発現は、 ベクターを一過性に HEK細胞 （ATCC) に導入する ことによって実施した。
上記培養上清からの抗 CD40抗体の精製は以下の方法で行った。 抗 CD40抗体を含 む培養上清を Hyper D Prote in A カラム （日本ガイシ製） あるいはマウス IgGlの 精製には Prote in Gカラム （アマシャムフアルマシアバイオテク） を用い、 付属 の説明書に従い吸着緩衝液として PBS (-）、 溶出緩衝液として 0. 1Mクェン酸ナトリ ゥム緩衝液 （ρΉ3 ) を用いてァフィ二ティー精製した。 溶出画分は 1M Tr is - HC1 (pH8. 0)あるいは Na2HP04溶液を添加して pH7. 2付近に調整した。 調製された抗 体溶液は、 透析膜 （10000カット、 Spect rum Laboratories社製） あるいは SPカラ 厶 （アマシャムフアルマシアバイオテク） を用いて PBS (-)に置換し、 孔径 0. 22 ^ mのメンブランフィル夕一 MILLEX-GV (MILLIP0RE 製） でろ過滅菌した。 精製抗体 の濃度は 280nmの吸光度を測定し、 lmg/mlを 1. 450Dとして算出した。 実施例 2 ェピトープの決定 '
CM0の細胞外領域の 175アミノ酸 （配列番号 1.) を力パーする、 13- merぺプチ ドを 2アミノ酸ずつ、 ずらして合計 82種のペプチド （配列番号 49から 130) を
Cel lulose膜上に C末端からスポット状に合成し、 N末をァセチル化した （JERINI 社： ドイツ） 。 以降の反応は常法のウエスタン解析 （Reineke, U.ほか. （2001) .
"Ep i tope mapp ing wi th synthe t ic pept ides prepared by SPOT synthes i s. "
Ant ibody Engineer ing (Springer Lab Manual) Eds.： Kontermann/Dube l, 433-
459.など参照） を元に実施した。 解析は Lumi lmager™ (Boe ringer-Mannheim 社） を使用し、 各スポットの発色強度を数値化した （図 1 A- 1、 A- 2、 B- 1、 B-2) 。
その結果、 4 D11抗体は 20- 24番目と 41番目のペプチド、 2105抗体は 12- 23番目 と 64番目、 KM34卜 1- 19抗体は 41， 42番目のペプチド、 KM643- 4- 11は 43番目のぺプ チド、 F72は 75番目、 110は 64番目のペプチドを、 F4- 465は、 34、 35、 54、 55、 65、 66、 75番目のペプチドを、 KM281-卜 10は 21、 24、 64； 75番目のペプチドを、 2B11
(新規抗体） は 21、 24、 64番目のペプチドを、 F76 (新規抗体） は 21、 35、 51、 52番目のペプチドを強く認識することがわかった。
抗 CD40抗体の結合部位を確定するため、 変異を導入した CD40- FC fusion prote inを作製し結合能を ELISAにより調べた。 抗 CD40抗体はマウスの B細胞に対 して交差性を示さないため、 マウス CD40のアミノ酸配列に部分的に変換した 5種 類の CD40Fc fus ion proteinを作製し、 この抗原に対する、 抗体の結合を調べた。 変異型 CD40- FC融合蛋白質の作製方法は以下に示す。 変異部位は、 抗体が強く結 合するぺプチドの配列の部分に、 マウス CD40の配列を導入することにより作製し た。 CD40fflut lは、 1 5番ペプチドに相当する部位の EFTEを ALEKに、 CD40mut2は、 21番ペプチドに相当する部位の LDTを SAQへ、 CD40mut3は、 24番ペプチドに相当す る場所の THを IRへ、 CD40mu t4は、 42番目ペプチドに相当する部位の EEGWを KEGQへ、 CD40mut5は、 64番目ペプチドに相当する部位を VSSAから QSSLへ変換した。 変異体 め作製は、 遺伝子工学的手法に従って実施した（図 2A、 B、 C 解析の結果 2105抗 体は、 CD40inuUへの結合能を著しく低下させていることがわかった。 また、 4 D11抗体、 2 B11は、 CD40nmt2への結合能を低下させていることがわかった。 実施例 3 抗 CD40ァゴニスティック抗体の Ramos細胞に対する結合活性
2xl06/mlの濃度で Ramos細胞株を 0. l%NaN3、 2%FCS含有 PBSの染色バッファー
(SB) に浮遊させた。 細胞浮遊液 （100 ^ 1 ゥエル） を 96- wel l 丸底プレート
(べクトンディッキンソン社製） に分注した。 各々のハイブリド一マの培養上清
(50 1) を加え、 氷温下 30分間インキュベートした。 陰性コントロールとして ヒト血清アルブミンに対するヒ卜 IgGl抗体を用い、 ハイプリ ドーマ培養培地で 2 g/mlの濃度に調製し、 50 l添加後氷温下 15分間インキュベートした。 SBで洗 浄した後、 250倍希釈した R-PE蛍光標識抗ヒト抗体（Soutliern Biotechnology社 製） を加え、 氷温下 15分間インキュベートした。 SBで 2回洗浄した後、 300
〜500 1の FACS緩衝液に懸濁し、 FACS (FACSort, FACScan、 べクトンディツキン ソン社製） で各細胞の蛍光強度を測定した。 実施例 4 抗 CD40ァゴニスティック抗体の Ramos細胞に対するァゴニスティック 活性評価
5. OxlO5個/ mlの Ramos細胞懸濁液を 96ゥエルプレートに 100 μ ΐ/we l lで播種した。 ハイプリ ドーマ培養上清又は精製抗体を 20 g/mlに培地で希釈し、 96ゥエルプレ —トに
Figure imgf000043_0001
の濃度で添加した。 一晩培養後、 細胞を集め R- PE標識抗 CD95 ' 抗体 （Pharmingen NJ) を用い、 FACSCanあるいは FACSsort (べクトンデッキンソ ン） を使って解析した。 実施例 5 Ramos細胞における抗 CD40アン夕ゴニスティック抗体による CD95発現 抑制
1. OxlO6個/ ml ©Ramos細胞懸濁液を 96ゥエルプレートに 50 1/we l lで播種した。 ハイプリ ドーマ培養上清又は精製抗体を 2 g/mlに培地で調整し、 96ゥエルプレ —トに 100 i l/we l l添加した。 可溶性 CD40リガンド (ALEXIS CORPORATION) を 4 g ¾ilと抗 FLAG抗体 （M2、 シグマ） 4 g/mlとを培地に添加し、 96ゥエルプレート に 50 2 1/we l l添加した。 一晩培養後、 細胞を集め R- PE標識抗 CD95抗体 (Pharmingen NJ) を用い、 FACSを使って解析した。 実施例 6 抗 CD40抗体 CDC活性の測定
CDCアツセィは、 Cr51ラベルしたターゲット細胞 2000個に対して、 最終濃度 5 % のヒト血清由来補体 （SIGMA社製） もしくはゥサギ血清由来補体 （CEDARLANE LABORATORIES LIMITED, オンタリオ、 カナダ） を、 丸底 96ゥエルプレート中で 全体容量 200 ^ Lで、 各抗体濃度とともに 37°C、 5%C02存在下で 2時間培養した。
培養後、 プレートを遠心して細胞を沈めた後、 上清 を粉末シンチレ一夕 一含有の 96穴プレート （Lumapl ateTM- 96：パッカード社製） に移し、 55°C、 1. 5 時間で乾燥した。 乾燥を確認後、 専用カバー （TopSeal™-A : 96- wel l
Microplates：パッカード社製） でプレートをカバーし、 シンチレ一シヨンカウ ン夕ー （トップカウント ：パッカード社製） でァ線量を測定した。 実施例 7 抗 CD4G抗体の ADCC活性測定
抗体を介した細胞傷害性活性は、 NK細胞或いは好'中球などのキラー活性を有す る細胞と抗体の存在下でターゲット細胞への傷害活性 （抗体依存性細胞性細胞傷 害活性 （Ant ibody- Dependent Ce l lu l ar Cytotoxic i ty) 、 以下、 ADCC) 、 及び補 体と抗体の存在下で夕一ゲッ ト細胞への傷害活性 （補体依存性細胞傷害活性
(Compl ement- Dependent Cytotoxic i ty) 以下、 CDC) の測定を実施した。 コント ロールとして hlgGを用いた。
方法は簡単には、 ターゲット細胞に放射性クロム （Cr51) を細胞質内に取り込 ませ、 細胞死により培養液中に遊離される Cr51量をァ線量で測定した。
具体的には、 ターゲッ ト細胞としてバ一キッ トリンパ腫細胞株 Raj i (ATCC CCL-86 ) を 106個を 15 Lの Fetal Cal f Serum (FCS) に懸濁し、 50 A L
(37MB Q/mL) の' Cr51ラベルされたクロム酸ナトリウム （パーキエルマ一社製：以 下 Cr5iと書く） を添加し、 1時間 37°Cで培養した。 次に、 培地を I ODIL添加し、 遠 心して培地を捨てることを 3回繰り返すことで、 細胞内に取り込まれていない Cr5iを除いた。
ADCCアツセィは、 Cr51ラベルしたターゲット細胞 2000個に対して、 実施例 6記 載の方法で取得した健常人末梢血単核球 200000個を、 丸底 96ゥエルプレート (Falcon社製） 中で全体容量 200 Lで、 各抗体濃度とともに 37°C、 5% C02存在下 で 4時間培養した。
培養後、 プレートを遠心して細胞を沈めた後、 上清 50 Ai Lを粉末シンチレ一夕 一含有の 96穴プレート （Lumaplate™- 96：パッカード社製） に移し、 55で、 1. 5 時間で乾燥した。 乾燥を確認後、 専用カバー （TopSeal™- A: 96- we l l Micropl ates：パッカード社製） でプレートをカバーし、 シンチレ一シヨンカウ ンター （トップカウント ：パッカード社製） で 線量を測定した。 実施例 8 抗 CD40ァゴニスティック抗体 P331S変異体の作製と活性評価
抗 CD40ァゴニスティック抗体 KM341- 1-19および 2105の遺伝子クローニングに関 しては WO02/099186に記載されている。 IgG2定常領域の 331番目 Proを Serに変換す ることによって CDC活性が低減するという報告がある。 KM34卜卜 19抗体、 2105抗 体に関しても CDC活性を低減するために、 P331S変異を IgG2定常領域に導入した。 抗体発現べクタ一 N5KG卜 Val Lark (IDEC Pharmace'ut icals：以下 N5KG1と略記） の、 ヒト IgGl定常領域をヒト IgG2に置き換えたもの （N5KG2) を作製し、 IgG2の 331番目 Proを Serに変換した変異を作製した。 IgG2定常領域の cDNAクローニング は、 腿 34卜卜 19ハイプリドーマを遠心によって集め， TRIZOL (Gibco BRL) を添 加し、 取扱説明書にしたがって、 TotalRNAを抽出した。 抗体 cDNAの可変領域のク ローニングは、 CL0NTECH社の SMART RACE cDNA amplification Kit を用い、 添付 の説明書にしたがって行った。 5 gの total RNAを錶型として、 lslStrand cDNA を 作 製 し た 。 Primer の 配 列 は 、 tnIgG3Nhe ： a t a t GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC (配列番号 2 ) G、 tnIgG2Bani ： a t a t gga t ccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC (配列番号 3 ) を使い、 ZtaqPCR kit (Takara)を用'いて 98°C 1秒、 55°C30秒、 72°C 1分 x 30 cycleで PCRを行い、 遺伝子を増幅した。 反応後、 QIAGEN PCR purification kitで精製し、 Nhel, BamHIで digestionし、 N5KG1に組み込み配列の確認をおこなった。 このベクター を N5KG2とした。
N5KG2Ser(331番目を Serに換えたもの）は、 N5KG2を鐯型として、 プライマー
IgG3Nhe ： atatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG (配列番号 4 ) 、
G2Ser2： GTTTTCTCGATGGAGGCTGGGAGGCC (配列番号 5 ) で 98°C 1秒、 60°C30秒、
72°C30秒の反応を 15回行った。 同時に、 N5KG2を錶型として、 プライマー
IgG2Bam： atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC (配列番号 6 ) G2Serl ：
GGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAAC (配列番号 7 ) を用いて、 98°C 1秒、 60°C30秒、
72°C30秒の反応を 15回行った。 増幅した DNA断片を PCR purification kit で精製 し、 2つの精製]) NA断片を等量混合したのち、 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反 応を 5回行い、 プライマー IgG3Nhe、 IgG2Bamを加えて、 15回反応した。 増幅した
DNA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた
(N5KG2Ser) 。 BglII、 Nhelで消化した抗体可変領域の配列を含む断片を
N5KG2serベクターに組み込んだ。
.上述の方法で発現精製した抗体を用いて、 Ramos細胞に対する結合能 （図 3A) 、 ァゴニスティック活性 (図 3 B) の評価を実施した。 P331Sの変異の導入によって、 活性の変動は見られなかった。 実施例 9 抗 CD40ァゴニスティック抗体 3 3 1 ser変異体の CDC活性の測定
上述の方法により CDC活性を測定した。 ゥサギ血清由来補体を使用し、 Ramos細 胞を標的細胞として使用した。 その結果、 KM34卜 19抗体は 1 i g/mlの抗体濃度 では IgG2に比べ IgG2serが顕著に CDC活性が減少していることがわかった (図 4 A)。 一方ヒト補体を使用した場合は、 変化は見られなかった （図 4 B) 。 実施例 1 0 ァゴニスト抗 CD40抗体定常領域変換体の作製と活性'測定
W002/088186に記載の抗 CD40抗体のうち、 最も強いァゴニスティック活性を示 すもの 2つ （KM34卜卜 19抗体、 2105抗体） は、 IgG2サブクラスであった。 IgG2サ ブクラスが CD40め活性化に重要であるかどうか調べるため、 IgGl、 IgG3、 IgG4に 抗体定常領域を変換した組換え蛋白質を作製し、 抗原への結合能と、 Ramos細胞 における CD95発現促進活性は、 実施例実施例 4、 6に従って実施した。 IgGl型の 発現に関しては、 N5KG1を IgG2、 IgG3の発現に関しては、 N5KG1の定常領域を、 そ れぞれ IgG2、 IgG3に置きかえた発現ベクター、 N5KG2、 N5KG3を用いた。 IgG3定常 領域の cDNAクロ一ニングは IgG2のクロー：！ング方法を一部改変し、 IgG3特異的プ ライマ一を使用する ことで実施した。 IgG4の発現には N5KG4PE ( IDEC
Pharmaceu t i cal s) を用い 7こ。
抗体蛋白質の発現は、 実施例 1にしたがって実施した。 ヒ卜 CD40を発現してい る Ramos細胞への結合活性は、 KM341 -卜 19抗体、 2105抗体とも IgG2から IgGl、 3、
4へ変換したことによる影響は見られなかったが （図 5 A-1、 図 5 A- 2) 、 Ramos細 胞における CD95の発現促進活性は、 1/10以上低下していることがわかった （図 5
B-l、 図 5 B- 2) 。 このことは、 2105抗体、 KM34卜 1-19抗体の強いァゴニスティッ ク活性は、 抗体の結合領域を決定する可変領域の構造以外に、 抗体の定常領域の 構造も重要であることが示.された。 そこで、 IgG2の定常領域内のどの領域がァゴ ニスティック活性に重要であるかどうか調べるために、 IgG2と IgG4の構造を混ぜ た domain swap mutantを作製し、 活性を測定した。 以下に述べる通り、 domain swap mutantの作製においては、 ヒンジ領域の置換を行うが、 この場合の "ヒン ジ領域" は Ole H Brekke et. al. Immunology Today 1995, 16, 85- 90に記載の、 アッパーヒンジ （Kabat EU code 216から） 、 ミドルヒンジ （Kabat EU code 226 から） およびロウアーヒンジ （Kabat EU code 231から） を併せたものである。 domain swap mutantは KM34卜卜 19抗体、 2105抗体のそれぞれに対して、 IgG2/4
(CHK ヒンジ領域は IgG2、 それ以降は IgG4) 、 IgG4/2/4 (ヒンジ領域は、 IgG2、 それ以外は IgG4) 、 IgG2/4/4(CHlは IgG2、 それ以外は IgG4)、 IgG4/2/2 (CHIは IgG4、 それ以外は IgG2)の 4種類ずつ作製した。
IgG2/4抗体発現のためのベクタ一 N5KG2/4は、 ZtaQ PCR ki t (Takara)を用いて 作 製 し た 。 N5KG2 を 錶 型 と し て 、 プ ラ イ マ ー IgG3Bam ： a t a t gga t c cTCATTTACC CGGAGACAGGGAGAGGC ( 配 列 番 号 8 ) 、 24C i4 ： AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT (配列番号 9 ) で 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30 秒の反応を 15回行った。 同時に、 N5KG4 (IDEC Pharmaceuticals) を鐯型として、 プライマ一 24Chi3 ： AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT (配列番号 1 0 ) 、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 1 1 ) を用いて、 98°C 1秒、 60°C 30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。 増幅した DNA断片を PCR purification kit で精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合した.のち、 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30 秒の反応を 5回行い、 プライマ一 IgG3Bam、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc
(配列番号 12 )_を加えて、 15回反応した。 増幅した DNA断片を Nhel、 BamHIで切 断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。
IgG4/2/4発現のためのベクター N5KG4/2/4は、 N5KG4を鎳型として、 linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag ( 配 歹 (J 番 号 1. 3 ) 、 G2Hin3:
TTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGG (配列番号 1 4 ) 、 と linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc ( 配 列 番 号 1 5 ) 、 G2Hin4 ：
ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCG (配列番号 1 6 ) を用いてそれぞれ、
98 1秒、 60°C30秒、 72°C3Q秒の反応を 15回行った。 増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 これを鎢型 として 98t: i秒、 60で 30秒、 72で30秒の反応を 5回行い、 linkH、 linkH2プライマ 一を加えて、 15回反応した。 増幅した DNA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベ クタ一の IgGl定常領域と置き換えた。
IgG2/4/4発現のためのベクタ一 N5KG2/4/4は、 N5KG2を錶型として、 プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag ( 配 列 '番 号 1 7 ) 、 G4CH1- 2： GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG (配列番号 1 8 ) で 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。 同時に、 N5KG4を錶型として、 プライマ一 G4CH1 - 1 ： CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC ( 配 列 番 号 1 9 ) 、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 2 0 ) を用いて、 98°C 1秒、 60°C30秒、 72 30秒の反応を 15回行った。 増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製 し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反 応を 5回行い、 プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。 増幅した DNA 断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1 ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。
IgG4/2/2発現のためのベクター N5KG4/2/2は、 N5KG4を鎳型として、 プライマ 一 linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag ( 配 列 番 号 2 1 ) 、 G4CH1- 2： GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG (配列番号 22) で 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。 同時に、 N5KG2を錡型として、 プライマー G4C - ί ： CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC ( 配 列 番 号 2 3 ) 、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 24) を用いて、 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。 増幅した蘭 A断片を PCR purification kitで精製 し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の 反応を 5回行い、 プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。 増幅した DNA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクタ一の IgGl定常領域と置き換えた。
KM341- 1- 19抗体、 2105抗体に関してそれぞれ 4種の domain swap mutantの結合 活性を調べた結果では、 オリジナルの IgG2との違いは認められなかったが （図 6 A - 1、 図 6A-2) 、 ァゴニスティック活性に関しては、 KM34卜卜 19抗体、 2105抗体 の両者とも IgG2/4/4のみが活性が著しく低下していた （図 6B-1、 図 6 B-2) 。 こ の結果からは、 IgG2のヒンジ領域がァゴニスティック活性に重要であることが解 つた。
さらにヒンジ領域のなかで、 どの配列が重要であるか調べた。 ヒンジ領域はァ ッパーヒンジ、 ミ ドルヒンジ、 ロウアーヒンジの 3つの部位に分けられるが (Ole H Brekke et. al. I匪 unology Today 1995, 16, 85-90) 、 そのうちそれ ぞれ、 IgG2に特異的は配列を IgG4のものに置換した。 アッパーヒンジ （Kabat EU code 216から） 、 ミドルヒンジ （Kabat EU code 2'26から） 、 ロウアーヒンジ
(Kabat EU code 231から) に変異を導入した抗体を IgG2UH4、 IgG2腿 4、 IgG2LH4 とし、 それぞれの発現ベクターは、 N5KG2UH4、 N5KG2丽 4、 N5KG2LH4とした。 なお、 Kabat et. al. , Sequences of proteins of im醒 ological inierest, 1991 Fifth editionに基づけば、 "ヒンジ" は EUインデックス 216から 230と定義され ている。
N5KG2UH4 は 、 N5KG2 を 錶 型 と し て 、 プ ラ イ マ ー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag ( 配 歹' J 番 号 2 5 ) ゝ UH4-2 ： CACAACATTTggaCTCAACTcTCTTGTCCACC (配列番号 2 6 ) で 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。 同時に、 N5KG2を錶型として、 プライマー UH4 - 1 : GGTGGACAAGAgAGTTGAGtccAAATGTTGTG ( 配 列 番 号 2 7 ) 、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 2 8 ) を用いて、 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。 増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製 し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の 反応を 5回行い、 プライマ一 IinkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。 増幅した DNA断片を Nliel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。
N5KG2MH4 は 、 N5KG2 を 铸 型 と し て 、 プ ラ イ マ ー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag ( 配 歹 [ί 番 号 2 9 ) 、 UM4-2 ：
GGCACGGTGGGCAtgggggaccataTTTGCGCTC (配列番号 30 ) で 98°C 1秒、 60°C30秒、
72°C30秒の反応を 15回行った。 同時に、 N5KG2を鎢型として、 プライマー UM4-1 :
GAGCGCAAAtatggtcccccaTGCCCACCGTGCC ( 配 列 番 号 3 1 ) 、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 3 2 ) を用いて、 98°C 1秒、 60°C30秒、
72 30秒の反応を 15回行った。 増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製 し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C 1秒、 60°C30秒、 72で 30秒の 反応を 5回行い、 プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。 増幅した
DNA断片を Nliel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。
N5KG2LH4 は 、 N5KG2 を 錶 型 と し て 、 プ ラ イ マ 一 linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag ( 配 列 番 号 3 3 ) 、 UL4-2 ： GAAGACTGACGGTCCccccaggaactcTGGTGCTGGGCA (配列番号 34) で 98°C 1秒、 60。C 30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。 同時に、 N5KG2を錶型として、 プライマー UL4-1 ： TGCCCAGCACCAgagttcctggggGGACCGTCAGTCTTC (配列番号 3 5 ) 、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 3 6 ) を用いて、 98°C 1秒、 60 30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。 増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製 し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C 1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の 反応を 5回行い、 プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。 増幅した DNA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1 ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。
KM341- 1- 19抗体、 2105抗体に関して、 それぞれ 3種類の domain swap mutantの 抗原にたいする結合活性を調べたが、 同等であった （図 6A- 1、 図 6A- 2) 。 一方 Ramos細胞に対するァゴニスティック活性に関しては IgG2UH4、 IgG2MH4で著しく 低下していた （図 6B- 1、 図 6B-2) 。 以上のことから、 抗 CD40抗体 KM341-卜 19、 2105の IgG2サブクラス依存のァゴニスティック活性は、 ヒンジ領域のうち、 アツ パーヒンジ、 ミドルヒンジの構造が重要であることがわかった。
IgG2サブクラスがァゴニスティック活性に重要であることが判明したため、 IgG2以外のサブクラスの抗体を IgG2サブクラスに変換してァゴニスティック活 性が増強するかど'うか調べた。 数個のクローンについて調べたうち、 F76は、 IgGlから IgG2にサブクラスを変換することによって、 ァゴニスティック活性を増 強することが出来た （図 7A、 B) 。 実施例 1 1 抗 CD40アンタゴニスト抗体変異体の作製
もともとのサブクラスは IgGlである、 W002/088186に記載の 4D11抗体遺伝子の 重鎖、 軽鎖を含む DNA断片を、 BglII、 Nhelで消化、 精製した後、 N5KG4PE、 腿 4P、 N5KG4ベクター (IDEC Pharmaceuticals) につなぎ換えた。 N5KG4PEは
IgG4定常領域に、 S228P及び L235E、 N5KG4Pは S228Pの点変異をそれぞれ含む。 抗 体蛋白質の発現、 精製は上述の方法によって実施した。 精製抗体は Ramos細胞へ の結合を指標に、 上述の方法に従って実施した。 IgGl、 IgG4、 IgG4P、 IgG4PEの
Ramos細胞への結合活性の変化は見られなかった （図 8A) 。 また上述の方法によ つてアン夕ゴニスティック活性の比較を行ったが、 IgGlと IgG4各種変異体との間 には、 アン夕ゴニスティック活性に関しては、 差は見出されなかった （図 8 B) 。 実施例 1 2 抗 CD40アンタゴニスト抗体変異体の ADCC活性、 CDC活性評価
抗 CD40変異抗体の ADCC活性、 CDC活性は、 上述の方法によって実施した。
ヒト丽 Cをエフェクター細胞として、 CD40発現 Daudi細胞を標的として使用した 場合、 4 D11抗体のもとのサブクラスである IgGlと比較して、 IgG4、 IgG4PEの 2 つの変異体はそれぞれ ADCC活性の著しい低下が観察された （図 9 ) 。
CDC活性に関しては、 IgGlと IgG4Pの活性の比較を、 Daudi細胞を標的として測 定した。 IgGlに比べて、 IgG4Pは CDC活性が顕著に低下していることがわかった (図 10) 。 実施例 1 3 抗 CD40アン夕ゴニスティック抗体の B細胞に及ぼす影響
マウス内因性 CD40破壊についてホモ接合体の遺伝子背景を有し、 かつ、 ヒト CD40遺伝子のトランスジーンを有しているマウス（Yasu i. e t al. Int. I醒 imol. 2002 Vol l4 ： 319)に 4 D11抗体の IgGl、 IgG4Pおよび IgG4PEをそれぞれ 100 g尾 静脈内投与した。 投与 24時間後に眼窩静脈叢より採血し、 0. 16mol/Lの塩化アン モニゥムにて溶血後、 FITC標識抗 B220抗体を用い、 FACSを用いて解析した。 図 1 1 に結果を示す。 図中縦軸は全リンパ球中の B細胞の割合を示す。 B細胞割合の減弱 の程度は IgGl〉IgG4P> IgG4PEの順に大きかった。 また、 投与 24時間後に脾臓を 摘出し、 スライドガラスですりつぶすことにより細胞浮遊液を調製した。 細胞浮 遊液を溶血後、 PE標識抗 B220抗体と FITC標識抗 CD23、 CD86または CD95抗体を用い、 FACSを用いて解析した。 図 12A、 B、 (：に結果を示す。 図中縦軸は全リンパ球中の 各表面マーカーを発現している B細胞の割合を示す。 4 D 11G1はいずれのマーカー も市販抗体であるマウス抗ヒト CD40ァゴニスティック抗体 5C3 (ファーミンジェ ン） と同等の発現上昇がみられた。 IgG4PEは IgGlおよび IgG4Pに比して各活性化 表面マーカーの発現上昇の程度は低かった。 実施例 1 4 抗 CD40アン夕ゴニス'チイック抗体による抗原特異的抗体産生抑制作 用および B細胞数の変化
マウス内因性 CM0破壊についてホモ接合体の遺伝子背景を有し、 かつ、 ヒト CD40遺伝子のトランスジーンを有しているマウス（Ya'su i. e t al. Int. Immunol. 2002 Vol 14 '： 319) に 4- hydroxy- 3- ni t roplienyl ace ty卜 chiken r -globul in conj ugates (NP-CGG ：大阪大学微生物病研究所 菊谷 仁教授より分与）とァラム
(Alum :水酸化アルミニウムゲル） の複合体を (NP- CGG量として） 腹腔内 注射することにより感作した。'各抗体は抗原感作直前に 50または 100 の量を尾 静脈内投与した。 陰性対照として抗ヒトアルブミンヒト IgG4PE抗体 100 ^ gを投与 した。 感作 7および 14日後、 眼窩静脈叢より採血し、 血清中の NP特異的 IgGlおよ び IgM抗体量を ELISA法により測定した。 ELISA法は NPを結合したゥシ血清アルブ ミン （NP - BSA： 2. 5 g/ml ) 50 /z l/ゥエルを、 ELISA用 96穴マイクロプレート
(Maxisorp, Nunc社製） の各ゥエルに加え、 4°Cでインキュベートし、 NP- BSAを 吸着させた。 次いで、 上清を捨て、 各ゥエルにブロッキキング試薬 （スーパーブ ロック、 P ierce社製） を加え室温でインキュベートしブロッキングした後、 各ゥ エルを 0. l%Tween20含有リン酸緩衝液 （PBS- T) で 3回洗浄した。 次いで、 各ゥェ ルに 10 %プロックエース含有 PBS-Tで希釈した各血清 （50 ^ 1/ゥエル） を加え、 37°Cで 2時間ィンキュベ一トし反応させた。 マイクロプレートを PBS- Tで 3回洗 浄後、 アル力リフォスファターゼで標識されたャギ抗マウス IgGl抗体または IgM 抗体 （コスモバイオ、 1070- 04または 1020- 04) を 10 %ブロックエース含有 PBS - T で 1， 000倍に希釈した溶液 ゥエル） を、 各ゥエルに加え、 37でで 2時間 インキュベートした。 次いで、 マイクロプレートを PBS-Tで 3回洗浄後、 発色基 質液 （50 1/ゥエル、 S igmal04、 phosphatase subs t rate) を各ゥエルに加え、 波長 405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。 その結果を図 1 3 A、 Bに示す。 図中縦軸は NP- CGGを C57BL/6マウスに 2回注射した後採血してプ ールした血清について、 IgGlの場合は 10, 000倍希釈したものを、 IgM抗体の場合 は 100倍したものをそれぞれ 1ュニットとして換算した値を示す。 4 D11抗体およ び 281の IgG4Pまたは IgG4PE抗体は NP特異的な IgGlおよび IgM抗体産生を同等に強 く抑制した。
抗体産生抑制作用の検討に用いたマウスの末梢血中および脾臓中の B細胞数の 変化を実施例 1と同様の方法で測定した。 その結果を図 1 4 A、 Bに示す。 4 D11 および 281の IgG4P抗体は IgG4PE抗体に比して末梢血中 B細胞割合の減少がより顕 著であった。 また、 抗原感作 14日後に摘出した脾臓中 B細胞の割合についても IgG4PE抗体 100 i gの投与では変化がみられなかったのに対し、 IgG4Pの投与では 減少または減少傾向がみられた。 実施例 1 5 抗 CD40アン夕ゴニスティック抗体の力二クイザルにおける作用
4 D 11抗体の I gG4Pまたは I gG4PEの 30mg/l(gをカクニイザルの前腕橈側皮静脈内 に投与し、 一定時間後に大腿静脈より採血した。 末梢血リンパ球サブセット解析 は各細胞浮遊液を FITC標識抗 CD3抗体、 PE標識抗 CD20抗体および APC標識抗 CD45抗 体を用い、 FACSを用いて陽性細胞比率の計測を行い、 CD45陽性細胞における比率 を算出した。 その結果を図 1 5に示す。 図中縦軸は抗体投与前の CD20陽性細胞比 率に対する各時間での CD20陽性細胞比率の割合を示す。 IgG4P抗体投与個体では 抗体投与 1〜 7日後の間に CD20陽性細胞は約 40 %減少したが、 IgG4PE抗体投与個 体では 4日後に約 20%減少するのみであった。
'血清中の IL12濃度は ELI SA法にて測定した。 大腿静脈より採取した血液を室温 で 20〜60分間静置後、 室温で 3000rpm、 15分間遠心分離して得られた血清を monkey IL12 ELISA ki t (Biosource社）を用いて測定した。 その結果を図 1 6に示 す。 IgG4PE抗体はいずれの採血ボイントにおいても IL 12の産生増加は認められな かったが、 IgG4P抗体は 4日目をピークに IL12産生がみられた。 実施例 1 6 抗 CD40アン夕ゴニスティック抗体の力二クイザル遅延型過敏症モデ ルにおける作用
テ夕ヌス毒素 （Tet anus toxoid： TTx) ( 10Li/ml；デンカ生研株式会社） を雄 力二クイザル 9匹に皮内及び筋肉内に感作し、 TTxに対する遅延型過敏症を誘発 させるとともに、 感作開始の.10分前に 0. 1及び 10mg/kg 4D11G4PE抗体の静脈内投 与を各 3匹に 3回 （1週間毎に 1回） 実施し、 4D11G4PEの遅延型過敏症に対する 作用を検討した。 ケ夕ミンの筋肉内投与による麻酔下で、 感作は背部皮内 （50
L/s i te X l2部位) 及び大腿部筋肉内 (0. 6mL/body) に、 惹起は感作の 21日後に胸 部皮内 （10 L/s e、 3力所ずつ ： 0〜10Lf/mI) に TT xを投与した。 惹起後 24及 び 48時間に投与部位の皮膚反応を観察し、 Drai zeの皮膚障害判定基準に従い評価 した。 なお、 TTx各濃度 3力所における結果は、 それぞれを平均したものを用い た。 その結果を図 1 7に示す。 4D11G4PE抗体の投与により、 24及び 48時間後にみ られる遅延型過敏症反応は明らかに抑制された。
TT x特異的 IgGおよび IgM抗体価に及ぼす影響を検討した。 経時的に大腿静脈よ り採取した血液を室温で 20〜60分間静置後、 室温で 3000rpm、 15分間遠心分離し て得られた血清中の抗体価を ELISA法を用いて測定した。 ELISA法は TTx (0. 5Li/ml ) 100 1/ゥエルを、 ELISA用 96穴マイクロプレート （Maxi sorp, Nunc 社製） の各ゥエルに加え、 4 °Cでー晚インキュベートし、 TTxを吸着させた。 次 いで、 上清を捨て、 各ゥエルにブロッキング試薬 （0. 5%BSA含有リン酸緩衝液） を加え室温でィンキュベートしプロッキングした後、 各ゥエルを 0. 05%Tween20含 有リン酸緩衝液'（PBS-T) で 3回洗浄した。 次いで、 各ゥエルに 0. 5%BSA含有 PBS- Tで希釈した各血清 （100~819200倍希釈、 希釈倍率 = 2 ； 100 £ 1/ゥエル） を加え、 室温で 2時間ィンキュペートし反応させた。 マイクロプレートを PBS- Tで 3回洗浄 、 ペルォキシダ一ゼで標識されたャギ抗サル IgG抗体または IgM抗体 （Nord ic Immunology) を 0. 5 %BSA含有 PBS - Tで 3, 000倍に希釈した溶液 ( 100 ^ g/ゥエル) を、 各ゥエルに加え、 室温で 1時間インキュベートした。 次いで、 マイクロプレ ートを PBS- Tで 3回洗浄後、 発色基質液 （100 l/ゥエル、 0-フエ二レンジァミン 塩酸塩 +過酸化水素水） を各ゥエルに加え、 波長 492nmでの吸光度をマイクロプ レートリ一ダ一で測定した。 抗 TTx抗体価は吸光度が 0. 1以上となる最大希釈倍率 とし、 100倍希釈においても吸光度が 0. 1に達しない場合は 0とした。 その結果を 図 1 8及び 1 9に示す。 4D11G4PE lmg/kgの投与により、 TTx特異的 IgGおよび IgM 抗体価は約 1/10に抑制された。 また、 10mg/kgの投与ではいずれの採血ポイント でも抗体価は検出感度以下であった。 実施例 1 7 抗 CD40アン夕ゴニスティック抗体の血小板血栓形成に与える影響 正常ヒ卜より採取した血液を 4等分し （各 6ml ) 、 それぞれ 100 g/mlの濃度と なるようにコントロールヒト IgG4PE, コントロールマウス IgG2a, ヒト抗ヒト CD40 IgG4PE (4Dl l)、 マウス抗ヒト CD154 IgG2a (5C8)を加え 37°Cで 10分間インキ ュペートした。 Flat perfus ion chamber (Glycotech社）およびコラーゲンコート ペトリデッシュを付属の説明書に従い組み立て、 そめチヤンバーに各種抗体で処 理した血液を 1500/sのずり応力が加わる速度で 7分間流した。 その後 4 ¾パラホル ムアルデヒドリン酸緩衝液を同じく 1500/sのずり応力が加わる速度で 10分間流し、 ぺトリデッシュ上に形成された血小板凝集塊を固定し、 さらに血小板特異的 PE標 識抗 CD41a抗体で染色したうえ蛍光顕微鏡で観察した。 その結果を図 2 0 A、 Bに 示す。 ヒト抗ヒト CD40 IgG4PE (4Dl l)で処理した血液は、 コントロール抗体で処 理した血液と同様に、 コラーゲンコートぺトリディッシュ上に血小板凝集塊を形 成したが、 マウス抗ヒト CD154 IgG2aで処理した血液は血小板凝集塊を形成しな かった。 実施例 1 8 抗 0D40アンタゴニスティック抗体の安定性の評価
4D11抗体の定常領域改変抗体の安定性を比較検討した。 方法としては G4P、 G4PE、 G2Serおよび G4/2/4を HEK293細胞で一過性発現することにより得られた培 ¾上清を Protein Aカラム （アマシャムバイオサイエンス社） にチャージし 0. 1M クェン酸バッファー （pH2. 7) により溶出した後 37°Cで 1分間および 10分間インキ ュべ一トした。 その後 50 リン酸バッファー （ρΗ7· 0) により中和した。 得られ た抗体溶液のオリゴマー含有率をゲルろ過カラム （東ソ一社） を用いて測定した。 その結果インキュベート '時間に応じてオリゴマ一含有率が増加し、 G4/2/OG4PE >G2Ser〉G4Pの順にオリゴマーが生成しやすいことが判明.した （図 2 1 ) 。 実施例 1 9 抗 CD40アンタゴニスティック抗体による皮膚移植片拒絶抑制作用 マウス内因性 CD40破壊についてホモ接合体の遺伝子背景を有し、 かつ、 ヒト
CD40遺伝子のトランスジーンを有している C57BL/6背景マウス側胸背部に DBA/2マ ウス尾部より採取した移植片を植え込み絆創膏で 7日間固定した。 被験物質
4D11G4PE 100 Sまたは vehicleは皮膚移植当日から 0、 2、 4、 7、 9、 11、 14日後 にそれぞれ尾静脈内投与した。 NK細胞による移植片拒絶を抑えるため、 手術の 3 日前及び術後 1、 4、 9日後にそれぞれ抗ァシァロ GM1抗体 lOO ^ gを全頭に腹腔内投 与した。 図 2 2に結果を示す。 4D11G4PE投与群において、 vehicle投与群と比較 して有意な移植片拒絶遅延が観察された。 実施例 2 0 ヒト腫瘍細胞株における CD40の発現解析
バーキットリンフォーマ細胞株 Ramos、 膀胱癌細胞株 T24 (ATC HTB- 4)、 膝臓 癌細胞株 Hs 766T (ATCC, HTB- 134)および Capan_2 (ATCC、 HTB- 80)における CD40の 発現は、 341G2Serを用いた FACS解析により確認した。
各細胞株を T24、 Hs 766T、 Capan- 2についてはトリプシン消化後、 Ramosについ てはそのまま回収し、 PBSで洗浄後、 341G2Ser 1 ^ g/mlを含む染色用緩衝液に再 懸濁した。 染色用バッファ一は、 PBSに 0. 5mM EDTA、 0. 05%アジ化ナトリウム、 5 %非動化済みゥシ血清を添加して作成した。 4 °Cで 15分間ィンキュベーション 後、 細胞を染色用バッファ一で 2回洗浄し、 PE結合ャギ抗ヒ ト IgG ( τ )
(Southern Biotechnology Associates, Inc) を染色用バッファ一で 1 : 250に希 釈した溶液に再懸濁した。 4 °Cで 15分間インキュベーション後、 細胞を染色用バ ッファーで 2回洗浄し、 FACSCal ibur (BDバイオサイエンス社製） で分析した。 陰性コントロールには、 等量のヒト抗 2, 4ジニトロフエノール（DNP)抗体を用いた。 データ解析ソフトは Cel lduest (BDバイオサイエンス社製） で行い、 平均蛍光強 度を算出した。
その結果、 Ramos、 T24、 Hs 766T、 Capan- 2では、 341G2Serで染色した場合の平 均蛍光強度が陰性コントロールと比較して明らかに高く、 CD40の発現が確認され た。 実施例 2 1 ヒト腫瘍細胞株に対する抗 CD40ァゴニスティック抗体の効果
Ramosは 2. 5 X 103個、 T24は 2. 5 X 102個、 Hs 766Tおよび Capan- 2は 5 X 103個を培 地に懸濁し、 平底 96ゥエルプレート （FALCON社製） 中で全体容量 100 Lで、
341G2Ser 1 ng/ml〜 lOOOng/ml.の濃度とともに 37°C、 5 %C02存在下で、 Ramosおよ び 766Tは 66時間、 Capan- 2は 90時間、 T24は 114時間培養した。 10 L
(3. 7MBa/mL) の3 Hラベルされたチミジン （アマシャムバイオサイエンス社製） を添加し、 37 ° (：、 5 %C02存在下で 6時間培養した。 Ramosは、 96Micro cel l harves ter (SKATRON社製）を用いて、 Printed Fi l termat A (パーキンエルマ一社 製） に細胞を回収し、 サンプルバッグ （パーキンエルマ一社製） でカバーし、 ベ 一夕プレートシンチ （パーキンエルマ一社製） 12mLを添加し、 液体シンチレーシ ヨンカウンタ一 （フアルマシア 1205ベー夕プレート ： フアルマシア社製） で 3線 量を測定した。 Hs 766T、 Τ24および Capan- 2は、 ハーべスター （パーキンエルマ 一社製） を用いてュニフィルター （パーキンエルマ一社製） に細胞を回収し、 裏 に専用のシールを貼り、 マイクロシンチ 20 (パーキンエルマ一社製） を 20 /i L/wel l添加し、 シンチレーシヨンカウンター （トップカウント ：パッカード社 製） で jS線量を測定した。 データは、 3つの独立した実験で得られた 3重反復測 定値の平均を、 非処理対照の値で除して細胞生存率（ )として表した。
その結果、 全ての細胞株で 341G2Serの濃度依存的に細胞生存率が低下した （表 1 ) 。 341G2Ser 100ng/ml添加時の細胞生存率は、 Ramosにおいては 58%、 T24にお いては 22%、 Hs, 766Tにおいては 15 、 Capan- 2においては 77%であり、 341G2Serが Ramos, T24、 Hs 766Tおよび Capan - 2の細胞増殖を抑制する活性をもつことが明ら かとなつた。 表 1
細胞の
生存率
Figure imgf000057_0001
実施例 2 2 マウス担癌モデルに対する抗 CD40ァゴニスティック抗体の効果
( 1 ) Ramos細胞
6週齢の雌性 Balb/cヌードマウス （日本クレア （株） 社より購入） に、 3Gyの放 射線を照射し、 背部皮下に Ramosを 2 X 107個/マウス個体で移植した。 移植 16日後 に、 生着した腫瘍の大きさを測定し、 腫瘍の大きさが 50〜170丽 3の担癌マウスを 5匹 1群として群分けした。 担癌マウスの静脈内に、 341G2Ser 100 i g/マウス個 体 （200 1の 1 %ヌードマウス血清を含む PBSに溶解したもの） を 16日目に 1回投 与し、 47日目まで腫瘍大きさを測定した。 陰性コントロールとしてヒト抗ヒト血 清アルブミン （HAS) 抗体を使用した。 '
( 2 ) T24細胞
ヌードマウス背部皮下にて継代を 3回繰り返した T24細胞塊を摘出し、 6週齢 の雌性 Balb/cヌードマウス （日本クレア （株） 社より購入） の背部皮下に移植し た。 移植する腫瘍細胞塊は 3醒四方程度が適当である。 移植 10日後に、 生着した 腫瘍の大きさを測定し、 腫瘍の大きさが 80〜200醒 3の担癌マウスを 5匹 1群とし て群分けした。 担癌マウスの静脈内に、 341G2Ser 100 g/マウス個体 （200 1の 1%ヌードマウス血清を含む PBSに溶解したもの） を 10日目に 1回投与し、 29日目 まで腫瘍大きさを測定した。 陰性コントロールとして、 等量のヒト抗 DNP抗体を 使用した。
( 3 ) Hs 766T細胞
8週齢の雌性 Balb/cヌードマウス (日本クレア (株） 社より購入） の背部皮下 に、 Hs 766T 7 X 106個/マウス個体で移植した。 移植 16日後に、 生着した腫瘍の 大きさを測定し、 腫瘍の大きさが 50〜 140匪3の担癌マウスを 5匹 1群として群分 けした。 担癌マウスの静脈内に、 341G2Ser lOO g/マウス個体 （200 1の 1%ヌー ドマウス血清を含む PBSに溶解したもの） を 16日目に 1回投与し、 32日目まで腫 瘍大きさを測定した。 陰性コントロールとして、 等量のヒト抗 DNP抗体を使用し た。
( 4 ) Capan- 2細胞
6週齢の雌性 Balb/cヌードマウス （.日本クレア （株） 社より購入） の背部皮下 に、 Capan- 2 2 X 106個/マウス個体で移植した。 移植 13日後に、 生着した腫瘍の 大きさを測定し、 腫瘍の大きさが 30〜130顧3の担癌マウスを 5匹 1群として群分 けした。 担癌マウスの静脈内に、 341G2Ser 10または 100 g/マウス個体 （200 1 の 1%ヌードマウス血清を含む？ BSに溶解したもの） を 13日目から週 2回投与し、
34日目まで腫瘍大きさを測定した。 陰性コントロールとして、 ヒトポリクローナ ル抗体（hlgG) (シグマ社製） を使用した。
腫瘍増殖抑制率 （TGIR) は以下の式で計算した。 100- [ ( (341G2Ser投与群の最終測定日の平均腫瘍体積 一 341G2Ser投与群の 抗体投与開始日の平均腫瘍体積） / (陰性コント ϋール投与群の最終測定日の 平均腫瘍体積 一 陰性コントロール投与群の抗体投与開始日の平均腫瘍体 積） ) X 100] その結果、 T24、 Hs766Tおよび Capan- 2担癌マウスでは TGIRが 100%を超え、 腫 瘍体積の退縮が観察された。 一方、 Ramos担癌マウスでも TGIR 73. 4%であり、 腫 瘍体積の増大が大幅に抑制された （表 2 ) 。 図 2 3から 2 6にそれぞれ、 Ramos 細胞、 T24細胞、 Hs 766T細胞および Capan- 2細胞を移植した担癌マウスに 341G2Serを投与した場合の細胞移植後の腫瘍体積の変化を示す。 表 2
腫瘍増殖
抑制率
Figure imgf000059_0001
抑制率は、 各細胞株とも測定最終日における値を示す。
産業上の利用可能性
実施例に示すように、 定常領域に変異を導入した本発明の抗 CD40抗体およびサ プクラスの一部の構造を他のサブクラスのものに置換した抗 CD40抗体は、 その活 性を保持しつつ、 ADCC活性および ;CDC活性が低減されている。 従って、 本発明の 抗体を洽療用抗体として被験体に投与した場合、 CD40発現細胞に対する細胞障害 活性が弱く、 安全に用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキスト 配列番号 2から 3 6 ：合成 DNA 配列番号 4 9から 1 3 0 ：合成べプチド

Claims

請求の範囲
1 . ヒト IgG2のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを有し、 定常領域に ADCC および/または CDCの増加または低減を生じせしめる 1以上のアミノ酸の欠失また は置換もしくは 1以上のアミノ酸が付加されたァゴニスト活性を有する CD40に結 合するモノクローナル抗体の重鎖。
2 . 定常領域がヒ卜 IgGである、 請求項 1に記載の重鎖。
3 . ヒト IgGがヒト IgGlである、 請求項 2に記載の重鎖。
4 . ヒト IgGがヒト IgG2である、 請求項 2に記載の重鎖。
5 . ヒ卜 IgGがヒト IgG3である、 請求項 2に記載の重鎖。
6 . ヒト IgGがヒト IgG4である、 請求項 2に記載の重鎖。
7 . 定常領域のアミノ酸の置換が、 Kabatらによる EUィンデックスにより示 される 331位のプロリンのセリンへの置換である、 請求項 3〜 5のいずれか 1項 に記載の重鎖。
8 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の重鎖を含むモノクローナル抗体。 ' 9 . ハイプリドーマ KM341-卜 19 (受託番号 FERM BP- 7759) が産生するモノク ローナル抗体の重鎖の可変領域を有する、 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の 重鎖。
1 0 . 請求項 9に記載の重鎖およびハイプリ ドーマ KM34卜卜 19 (受託番号 FERM BP- 7759) が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、 からなるモノクローナル抗体。
1 1 . 配列番号 3 8で表されるポリペプチドの可変領域を有する、 請求項 1 ~ 7のいずれか 1項に記載の重鎖。
1 2 . · 請求項 1 1に記載の重鎖および配列番号 4 0で表されるポリペプチド の可変領域を有するモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモノクローナル抗体。
1 3 . 配列番号 132で表きれるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分 からなる請求項 1に記載の重鎖。
1 4 . 請求項 1 3に記載の重鎖および配列番号 134で表されるポリペプチド からシグナル配列を除いた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモ ノクロ一ナル抗体。 ， —
1 5 . 配列番号 13 1で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含 む宿主から産生される請求項 1に記載の重鎖。 '
1 6 . 配列番号 131で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号 133で表され るポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される請求項 8に 記載のモノクローナル抗体。
1 7 . ハイプリドーマ 2105 (受託番号 FERM BP- 8024) が産生するモノクロ一 ナル抗体の重鎖の可変領域を有する、 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の重鎖。
1 8 . 請求項 1 7に記載の重鎖およびハイプリ ドーマ 2105 (受託番号 FERM BP- 8024) が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、 から なるモノクローナル抗体。
1 9 . 配列番号 4 2で表されるポリペプチドの可変領域を有する、 請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の重鎖。
2 0 . 請求項 1 9に記載の重鎖および配列番号 4 4で表されるポリペプチド の可変領域を有するモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモノクローナル抗体。 ' 2 1 . 配列番号 136で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分 からなる請求項 1に記載の重鎖。
2 2 . 請求項 2 1に記載の重鎖および配列番号 138で表されるポリペプチド からシグナル配列を除いた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモ ノクローナル抗体。
2 3 . ·配列番号 135で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含 む宿主から産生される請求項 1に記載の重鎖。
2 4 . 配列番号 135で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号 137で表され るポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される請求項 8に 記載のモノクローナル抗体。
2 5 . 配列番号 131で表されるポリヌクレオチド。
2 6 . 配列番号 133で表されるポリヌクレオチド。
2 7 . 請求項 2 5に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
2 8 . 請求項 2 6に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
2 9 . 請求項 2 5および 2 6に記載のポリヌクレオチドを有する発現べクタ
3 0 . 請求項 2 7に記載の発現べクタ一を含む宿主。
3 1 . 請求項 2 8に記載の発現ベクターを含む宿主。
3 2 . 請求項 2 9に記載の発現べクタ一を含む宿主。
3 3 , 請求項 3 0に記載の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または 該宿主からモノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、 モノクローナル抗 体の重鎖を製造する方法。
3 4 . 請求項 3 2に記載の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または 該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、 モノクローナル抗体を製 造する方法。
3 5 . 配列番号 135で表されるポリヌクレオチド。
3 6 . 配列 Ϊ 号 137で表されるポリヌクレオチド。
3 7 . 請求項 3 5に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
3 8 . 請求項 3 6に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
' 3 9 . 請求項 3 5および 3 6に記載のポリヌクレオチドを有する発現べクタ
4 0 . 請求項 3 7に記載の発現べクタ一を含む宿主。
4 1 . 請求項 3 8に記載の発現べクタ一を含む宿主。
4 2 . 請求項 3 9に記載の発現べクタ一を含む宿主。
4 3 . 請求項 4 0に記載の宿主を培養液中で培養し、 .該培養物及び/または 該宿主からモノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、 モノクローナル抗 体の重鎖を製造する方法。
4 4 . ' 請求項 4 2に記載の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または 該宿主からモノクロ一ナル抗体を取得する工程を含む、 モノクローナル抗体を製 造する方法。
4 5 . ヒト IgG2のアツパ一ヒンジおよびミドルヒンジを有していない抗体の アッパーヒンジおよびミドルヒンジを、 ヒト IgG2のアッパーヒンジおよびミドル ヒンジに置換する工程を含む、 ァゴニスト活性を有する CD40に結合するモノクロ —ナル抗体の重鎖の製造方法。
4 6 . CD40に結合するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域のポリペプチド を特定する工程を含む、 該可変領域とヒト IgG2のァ、シパーヒンジおよびミドルヒ ンジを有するモノクローナル抗体の重鎖の製造方法。
4 7 . ヒ卜 IgG2のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを有していない抗体の アッパーヒンジおよびミドルヒンジを、 ヒト IgG2のアツパ一ヒンジおよびミドル ヒンジに置換する工程を含む、 ァゴニスト活性を有する CD40に結合するモノクロ ーナル抗体の製造方法。
4 8 . CD40に結合するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域のポリペプチド を特定する工程を含む、 該可変領域とヒト IgG2のアツパ一ヒンジおよびミドルヒ ンジを有するモノクローナル抗体の製造方法。
4 9 . 請求項 8、
1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0、 2 2および 2 4の いずれか 1項に i2載のモノクローナル抗体を有効成分として含む医薬組成物。
5 0 . 悪性腫瘍、 病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる、 請求項 4 9に記載の医薬組成物。
' 5 1 . 請求項 4 9に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、 悪 性腫瘍、 病原体または自己免疫疾患を予防または治療する方法。
5 2 . 悪性腫瘍、 病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる 医薬組成物を製造するための、 請求項 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0、 2 2および 2 4のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体の使用。
5 3 . 定常領域に ADCCおよび/または CDCの増加または低減を生じせしめる 1 以上のアミノ酸の欠失または置換もしくは 1以上のアミノ酸が付加されたアン夕 ゴニスト活性を有する CD40に結合するモノクローナル抗体の重鎖。
5 4 . 定常領域がヒト IgGである、 請求項 5 3に記載の重鎖。
5 5 . ヒト IgGがヒト IgGlである、 請求項 5 4に記載の重鎖。
5 6 . ヒト IgGがヒト IgG2 ある、 請求項 5 4に記載の重鎖。
5 7 . ヒ卜 IgGがヒ MgG3である、 請求項 5 4に記載の重鎖。
5 8 . ヒト IgGがヒト IgG4である、 請求項 5 4に記載の重鎖。
5 9 . 定常領域のアミノ酸の置換が、 Kabatら ：よる EUインデッ:クスにより 示される 235位のロイシンからグルタミン酸への置換である、 請求項 5 5、 5 7 および 5 8のいずれか 1項に記載の重鎖。
6 0 . 定常領域に、 .重鎖どうしの S S結合形成'を促進させる 1以上のァミノ 酸の欠失または置換もしくは 1以上のアミノ酸が付加されている、 請求項 5 3〜 5 9のいずれか 1項に記載の重鎖。
6 1 . 定常領域のアミノ酸の置換が、 Kabatらによる EUインデックスにより 示される 228位のセリンからプロリンへの置換である、 請求項 6 0記載の抗体の 重鎖。
6 2 . 請求項 5 3〜6 1のいずれか 1項に記載の重鎖を含むモノクローナル キ几体
6 3 . ハイプリ ドーマ 4 D 1 1 (受託番号 FERM BP-7758) が産生するモノク 口一ナル抗体の重鎖の可変領域を有する、 請求項 5 3〜6 1のいずれか 1項に記 載の重鎖。
6 4 . 請求項 6 3に記載の重鎖およびハイプリ ドーマ 4 D 1 1 (受託番号 FE應 BP- 7758) が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、 からなるモノク口一ナル抗体。
6 5 . 配列番号 4 6で表されるポリペプチドの可変領域を有する、 請求項 5 3〜6 1のいずれか 1項に記載の重鎖。
6 6 . 請求項 6 5に記載の重鎖および配列番号 4 8で表されるポリペプチド の可変領域を有するモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモノクローナル抗体。
6 7 . 配列番号 140で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分 からなる請求項 5 3に記載の重鎖。 +
6 8 . 請求項 6 7に記載の重鎖および配列番号 142で表されるポリペプチド からシグナル配列を除いた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、 からなるモ ノクローナル抗体。
6 9 . 配列番号 139で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含 む宿主から産生される請求項 5 3に記載の重鎖。
7 0 . 配列番号 139で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号 141で表され るポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される請求項 6 2 に記載のモノクローナル抗体。
7 1 . 配列番号 139で表されるポリヌクレオチド。
7 2 . 配列番号 141で表されるポリヌクレオチド。
7 3 . 請求項 7 1に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
7 4 . 請求項 7 2に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
7 5 . 請求項 7 1および 7 2に記載のポリヌクレオチドを有する発現べクタ
7 6 . 請求項 7 3に記載の発現べクタ一を含む宿主。
7 7 . 請求項 7 4に記載の発現ベクターを含む宿主。
7 8 . 請求項 7 5に記載の発現べクタ一を含む宿主。
7 9 . 請求項 7 6に記載の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または 該宿主からモノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、 モノクローナル抗 体の重鎖を製造する方法。
8 0 . 請求項 7 8に記載の宿主を培養液中で培養し、 該培養物及び/または 該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、 モノクローナル抗体を製 する方法。
8 1 . 請求項 6 2、 6 4、 6 6、 6 8および 7 0のいずれか 1項に記載のモ ノクロ一ナル抗体を有効成分として含む医薬組成物。
8 2 . 移植拒絶、 自己免疫疾患、 アレルギーまたは血液凝固第！!因子阻害症 候群の予防または治療に用いられる、 請求項 8 1に記載の医薬組成物。
8 3 . 請求項 8 1に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、 移 植拒絶、 自己免疫疾患、 アレルギーまたは血液凝固第珊因子阻害症候群を予防ま たは治療する方法。
8 4 . ' 移植拒絶、 自己免疫疾患、 アレルギーまたは血液凝固第 I因子阻害症 候群の予防または治療に用いられる医薬組成物を製造するための、 請求項 6 2、 6 4、 6 6、 6 8および 7 0 いずれか 1項に記載のモノクローナル抗体の使用。
8 5 . ヒト抗体の重鎖定常領域に 1以上のアミノ酸の欠失または置換もしく は 1以上のアミノ酸を付加する工程を含む、 ァゴニスティック活性が低減された アン夕ゴニスト活性を有する CD40に結合するモノクローナル抗体の重鎖の製造方 法。
8 6 . 定常領域がヒト IgGである、 請求項 8 5に記載の方法。
8 7 . ヒト I gGがヒト IgG4である、 請求項 8 6 記載の方法。
8 8 . 定常領域のアミノ酸の置換が、 Kabatらによる EUインデックスにより 示される 235位のロイシンからグルタミン酸への置換である、 請求項 8 5〜 8 7 のいずれか 1項に記載の方法。
8 9 . 配列番号 131で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコード する部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
9 0 . 配列番号 133で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコード する部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
9 1 . 配列番号 135で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコード する部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
9 2 . 配列'番号 137で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコード する部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
9 3 . 配列番号 139で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコード する部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
9 4 . 配列番号 141で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコード する部分を除いた、 ポリヌクレオチド。
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