BR112020008379A2

BR112020008379A2 - anticorpos anti-cd40 para uso no tratamento de síndrome de sjögren

Info

Publication number: BR112020008379A2
Application number: BR112020008379-8A
Authority: BR
Inventors: Pascal Espie; Peter Gergely; James RUSH
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-11-03
Also published as: JP2021501748A; WO2019087094A1; AU2022201425A1; AU2018361743A1; EP3704158A1; JP7357120B2; KR20200074993A; IL273848A; CA3076872A1; RU2020117365A; JP2022137233A; CN111263771A; TW201922783A; RU2020117365A3; CL2020001123A1; MX2020004411A; US20190153111A1

Abstract

Trata-se de métodos, regimes de tratamento, usos, kits e terapias para tratar síndrome de Sjögren empregando-se anticorpos anti-CD40.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTICORPOS ANTI-CD40 PARA USO NO TRATAMENTO DE SÍNDROME DE SJÖGREN”.

PEDIDOS ANTERIORES

[001] Este pedido reivindica prioridade para o pedido provisório nº U.S. 62/581212, depositado em 3 de novembro de 2017 e o pedido provisório nº U.S. 62/644939, depositado em 19 de março de 2018, cujo conteúdo é incluído em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

[002] A revelação refere-se a métodos, regimes de tratamento, usos, kits e terapias para tratar síndrome de Sjögren, como síndrome de Sjögren primária ou síndrome de Sjögren secundária, empregando- se os anticorpos anti-CD40, como CFZ533.

ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO

[003] A síndrome de Sjögren (SS), tal como síndrome de Sjögren primária (pSS) ou síndrome de Sjögren secundária (sSS), é uma doença autoimune crônica comum de etiologia desconhecida.

[004] Marcas da doença em pacientes com SS, tanto primária quanto secundária, incluem a presença de autoanticorpos anti-Ro e anti- La, assim como infiltrados de célula mononuclear em glândulas salivares e lacrimais (Bombardieri, et al. 2012). Em alguns casos, esses acúmulos de linfócitos T e B formam estruturas bem organizadas denominadas estruturas linfoides ectópicas (ELS) que portam similaridades morfológicas e funcionais a GCs (Voulgarelis et al. 2008). Um trabalho anterior relatou a evidência de ELS em glândulas salivares de pacientes SS, e de modelos pré-clínicos dessa doença, e evidência de maturação de afinidade contínua (Jacobi et al. 2002; Stott et al. 1998; Bombardieri et al. 2012), o que implica essas estruturas em patologia de doença (Bombardieri et al. 2017).

[005] O impacto dessa doença nas medidas de qualidade de vida

(QoL) é substancial e os estudos comparativos indicaram que QoL de pSS teve pontuação quantitativamente pior do que insuficiência cardíaca congestiva ou muitos cânceres (Segal et al 2009; Kuenstner et al 2002; Komaroff et al 1996). Além disso, a atividade de célula B aumentada em SS resulta em um risco aumentado para transformação maligna com desenvolvimento de linfoma que ocorre em 5% de pacientes SS. O tratamento para pacientes SS é limitado aos cuidados sintomáticos para os sinais e sintomas mucosais, e até então, nenhuma terapia sistêmica com base em evidência esteve disponível para pacientes SS.

[006] Glicocorticoides e fármacos antirreumáticos modificantes de doença típica (DMARDs) são na sua maioria ineficazes, e nenhuma intervenção farmacológica é eficaz contra a fadiga incapacitante severa. Apesar de uma falta de evidência convincente de eficácia e com base em evidência anedótica, assim como experiência de doenças autoimunes similares, como lúpus eritematoso sistêmico, antimaláricos (Tishler et al 2008), metotrexato (Winzer e Aringer 2010) ou azatioprina (Kaufman et al 1999) são usados algumas vezes, em particular para o tratamento de sintomas extraglandulares, como engajamento renal ou de junta.

[007] Embora pequenos testes com o agente de depleção de célula B rituximab tenham demonstrado um grau de eficácia terapêutica, nenhum teste controlado aleatorizado de larga escala apropriado mostrou eficácia clara em relação às manifestações de doença glandular ou extraglandular. Um agente modificante de doença que previne a destruição de glângula secretora e aborda manifestações de doença extraglandular introduziria um avanço inovador para o tratamento de SS, tal como pSS crônica.

[008] CFZ533 é um anticorpo monoclonal humano direcionado contra CD40 humano. O mesmo pertence à subclasse de isotipo de

IgG1 e compreende uma mutação silenciadora de Fc (N297A) que abole a ligação de FcγR e funções efetoras associadas, tais como ADCC e CDC. CFZ533 é revelado nos documentos nº US8828396 e US9221913, incorporados ao presente documento a título de referência.

SUMÁRIO DA REVELAÇÃO

[009] Foi constatado que anticorpos monoclonais anti-CD40 humanos com atividade de ADCC silenciada são adequados para o tratamento de síndrome de Sjögren. Particularmente, o anticorpo CFZ533 mostrou-se promissor em uma prova de estudo de conceito para oferecer uma nova modalidade de tratamento em pSS clinicamente ativo.

[010] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, um anticorpo anti-CD40 para uso no tratamento de síndrome de Sjögren é fornecido. Em uma modalidade, a síndrome de Sjögren é síndrome de Sjögren primária.

[011] O anticorpo pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em:

[012] a. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8;

[013] b. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;

[014] c. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 13;

[015] d. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 14; e

[016] e. um anticorpo anti-CD40 que compreende uma região de IgG1 de Fc silenciosa.

[017] O anticorpo pode compreender a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 10; ou a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

[018] Em uma modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo para uso de acordo com o primeiro aspecto e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[019] Em uma modalidade, a rota de administração do anticorpo de acordo com o primeiro aspecto é subcutânea ou intravenosa, ou uma combinação de subcutânea ou intravenosa.

[020] A dose pode ser cerca de 3 mg a cerca de 30 mg de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano. A dose pode ser dada semanalmente, a cada duas semanas ou a cada quatro semanas.

[021] Em uma modalidade, a dose é cerca de 10 mg de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano.

[022] Em uma modalidade, a dose é cerca de 150 mg a cerca de 600 mg de ingrediente ativo. A dose pode ser dada semanalmente, a cada duas semanas ou a cada quatro semanas.

[023] Em uma modalidade, a dose é cerca de 300 mg de ingrediente ativo.

[024] Em uma modalidade preferencial, a dose é 150 mg de ingrediente ativo. Em outra modalidade preferencial, a dose é 300 mg de ingrediente ativo. Em ainda outra modalidade preferencial, a dose é 600 mg de ingrediente ativo.

[025] Em uma modalidade, o anticorpo é administrado através de uma dosagem de carregamento e uma dosagem de manutenção.

[026] Em uma modalidade, a dosagem de carregamento é administrada por meio de injeções subcutâneas de uma primeira dose e a dosagem de manutenção é administrada por meio de injeções subcutâneas de uma segunda dose. A primeira dose pode ser a mesma que a segunda dose ou mais alta do que a segunda dose.

[027] Em uma modalidade, a primeira dose está entre cerca de 150 mg e cerca de 600 mg de ingrediente ativo, como cerca de 300 mg de ingrediente ativo e a segunda dose está entre cerca de 150 mg e cerca de 600 mg de ingrediente ativo, como cerca de 300 mg de ingrediente ativo.

[028] Em uma modalidade, a primeira dose é de 150 mg, 300 mg ou 600 mg de ingrediente ativo e a segunda dose é de 150 mg, 300 mg ou 600 mg de ingrediente ativo.

[029] Em uma modalidade, a dosagem de carregamento compreende pelo menos duas injeções subcutâneas e a dosagem de manutenção consiste em injeções subcutâneas semanalmente (Q1W), quinzenalmente (Q2W) ou mensalmente (Q4W). Em uma modalidade, a dosagem de carregamento consiste em duas injeções subcutâneas. Em outra modalidade, a dosagem de carregamento consiste em três injeções subcutâneas.

[030] Em uma modalidade, as injeções subcutâneas da dosagem de carregamento possuem doses diferentes. Em outra modalidade, as injeções subcutâneas da dosagem de carregamento possuem a mesma dose.

[031] De acordo com um segundo aspecto, é fornecido um método para tratar síndrome de Sjögren em um indivíduo humano, que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo anti-CD40 ao dito indivíduo. Em uma modalidade preferencial, a síndrome de Sjögren é a síndrome de Sjögren primária.

[032] Em uma modalidade, o anticorpo é selecionado dentre o grupo que consiste em:

[033] a. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8;

[034] b. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;

[035] c. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 13;

[036] d. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 14; e

[037] e. um anticorpo anti-CD40 que compreende uma região de

IgG1 de Fc silenciosa.

[038] Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 10; ou a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

[039] Em uma modalidade, o anticorpo é administrado junto com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[040] Em uma modalidade, o anticorpo é administrado de modo subcutâneo ou intravenoso, ou uma combinação de subcutâneo ou intravenoso.

[041] Em uma modalidade, o anticorpo é administrado como uma dose de cerca de 3 mg a cerca de 30 mg de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano.

[042] Em uma modalidade, a dose é cerca de 10 mg de ingrediente ativo por quilograma do indivíduo humano.

[043] Em uma modalidade, o anticorpo é administrado como uma dose de cerca de 150 mg a cerca de 600 mg de ingrediente ativo, tal como 300 mg de ingrediente ativo.

[044] Em uma modalidade preferencial, a dose é de 150 mg de ingrediente ativo. Em outra modalidade preferencial, a dose é de 300 mg de ingrediente ativo. Em ainda outra modalidade preferencial, a dose é de 600 mg de ingrediente ativo.

[045] Em uma modalidade, o anticorpo é administrado com uma dosagem de carregamento e uma dosagem de manutenção.

[046] Em uma modalidade, a dosagem de carregamento é administrada por meio de injeções subcutâneas de uma primeira dose e a dosagem de manutenção é administrada por meio de injeções subcutâneas de uma segunda dose.

[047] A primeira dose pode ser a mesma que a segunda dose ou mais alta do que a segunda dose.

[048] Em uma modalidade, a primeira dose está entre cerca de 150 mg e cerca de 600 mg de ingrediente ativo, como cerca de 300 mg de ingrediente ativo e a segunda dose está entre cerca de 150 mg e cerca de 600 mg de ingrediente ativo, como cerca de 300 mg de ingrediente ativo.

[049] Em uma modalidade, a primeira dose é de 150 mg, 300 mg ou 600 mg de ingrediente ativo e a segunda dose é de 150 mg, 300 mg ou 600 mg de ingrediente ativo.

[050] Em uma modalidade, a dosagem de carregamento compreende pelo menos duas injeções subcutâneas e a dosagem de manutenção consiste em injeções subcutâneas semanalmente (Q1W), quinzenalmente (Q2W) ou mensalmente (Q4W).

[051] Em uma modalidade, a dosagem de carregamento consiste em duas injeções subcutâneas. Em outra modalidade, a dosagem de carregamento consiste em três injeções subcutâneas.

[052] Em uma modalidade, as injeções subcutâneas da dosagem de carregamento possuem doses diferentes. Em outra modalidade, as injeções subcutâneas da dosagem de carregamento possuem a mesma dose.

[053] De acordo com um terceiro aspecto, são fornecidos o uso de uma composição farmacêutica líquida que compreende um anticorpo anti-CD40, um tampão, um estabilizador e um solubilizante, meios para administrar de modo subcutâneo o anticorpo anti-CD40 a um paciente que tem síndrome de Sjögren e, um método para a fabricação de um medicamento para o tratamento de síndrome de Sjögren, em que o anticorpo anti-CD40:

[054] a. deve ser administrado de modo subcutâneo com uma primeira dosagem de carregamento; e

[055] b. após isso, com uma segunda dosagem de manutenção,

em que o dito anticorpo anti-CD40 é selecionado dentre o grupo que consiste em:

[056] i. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8;

[057] ii. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;

[058] iii. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 13;

[059] iv. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 e uma região Fc da SEQ ID NO: 14;

[060] v. um anticorpo anti-CD40 que compreende uma região de IgG1 de Fc silenciosa: e

[061] vi. um anticorpo anti-CD40 que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 10; ou a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

[062] Em uma modalidade preferencial, a síndrome de Sjögren é a síndrome de Sjögren primária.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[063] A Figura 1 é uma representação esquemática do projeto de estudo do primeiro e um segundo coorte da prova de estudo de conceito para CFZ533 em pacientes pSS (CCFZ533X2203).

[064] A Figura 2 é uma representação esquemática do projeto de estudo do terceiro coorte da prova de estudo de conceito para CFZ533 em pacientes pSS (CCFZ533X2203).

[065] A Figura 3 é um gráfico que mostra perfis de farmacocinética simulada preliminar antes da prova de estudo de conceito CCFZ533X2203 ter iniciado.

[066] A Figura 4 é um gráfico que mostra perfis de farmacocinética após a administração intravenosa (Coorte 2 de Estudo CCFZ533X2203; análise temporária).

[067] A Figura 5 é um gráfico que mostra escores clínicos (ESSDAI) após administração IV (Coorte 2; Estudo CCFZ533X2203).

[068] A Figura 6 é um gráfico que mostra níveis de biomarcador (CXCL13) após administração IV (Coorte 2; Estudo CCFZ533X2203).

[069] A Figura 7 é uma representação esquemática que mostra resultados de tratamento para pontos finais clínicos diferentes após administração IV (Coorte 2; Estudo CCFZ533X2203).

[070] A Figura 8 é um gráfico que mostra perfis farmacodinâmicos (CD40 solúvel total em plasma após administração IV; Coorte 2; Estudo CCFZ533X2203).

[071] A Figura 9 é um gráfico que mostra escores clínicos (ESSDAI) após administração subcutânea (Coorte 1; Estudo CCFZ533X2203).

[072] A Figura 10 é um gráfico que mostra perfis de farmacocinética após administração subcutânea (Coorte 1; Estudo CCFZ533X2203).

[073] A Figura 11 é um gráfico que mostra perfis farmacodinâmicos (CD40 solúvel total) após administração SC (Coorte 1; Estudo CCFZ533X2203).

[074] A Figura 12 é um gráfico que mostra escores clínicos (ESSPRI) após administração SC (Coorte 1; Estudo CCFZ533X2203).

[075] A Figura 13 é um gráfico que mostra escores clínicos (ESSPRI) após administração IV (Coorte 2; Estudo CCFZ533X2203).

[076] A Figura 14 é um gráfico que mostra níveis de biomarcador (CXCL13) após administração IV (Coorte 2; Estudo CCFZ533X2203).

[077] A Figura 15 é um gráfico que mostra escores clínicos (ESSDAI) após administração IV (Coorte 2; Estudo CCFZ533X2203).

[078] A Figura 16 é um gráfico que mostra níveis de célula ICAM e B após administração IV (Coorte 2; Estudo CCFZ533X2203).

[079] A Figura 17 é uma representação esquemática que mostra resultados de tratamento para pontos finais clínicos diferentes (administração IV e SC; Estudo CCFZ533X2203).

[080] A Figura 18 é de gráficos que mostram a inibição de CFZ533 in vitro da ativação de via induzida por rCD154.

[081] A Figura 19 apresenta gráficos que mostram a atividade estimulante mínima CFZ533 in vitro.

[082] A Figura 20 apresenta gráficos que mostram que CFZ533 não media a depleção de célula in vitro.

[083] A Figura 21 apresenta imagens representativas de células RI-1 B individuais que mostram a internalização de receptores CD40 mediante ligação por recCD154 ou CFZ533.

[084] A Figura 22 apresenta gráficos que mostram as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas (engajamento de alvo; nenhuma depleção de célula B) de CFZ533 em primatas não humanos.

[085] A Figura 23A é um esquema de projeto experimental de um PK/PD e um estudo de vacinação em primatas não humanos. A Figura

23B apresenta gráficos que mostram IgG anti-KLH (resposta imune) e níveis CFZ533 de plasma (farmacocinética). A Figura 23C mostra resultados de uma análise histológica de centros germinativos.

[086] As Figuras 24A, 24B e 24C são representações gráficas de possíveis doses de carregamento semanais do dado do ingrediente ativo de modo subcutâneo seguidas por regime de manutenção quinzenal do ingrediente ativo (de modo subcutâneo).

[087] A Figura 25A, é uma representação gráfica de possíveis doses de carregamento semanais do dado ingrediente ativo aplicadas de modo subcutâneo seguidas por administração a cada 4 semanas do ingrediente ativo (de modo subcutâneo) e a Figura 25B é uma representação gráfica de possíveis doses de carregamento semanais do dado ingrediente ativo aplicadas de modo subcutâneo seguidas por administração a cada semana do ingrediente ativo (de modo subcutâneo).

[088] A Figura 26 mostra os resultados experimentais de assinatura CD40 em ELS em glândulas salivares e de redução de órgãos linfoides terciários em glândulas salivares de camundongos NOD após tratamento de 10 semanas com MR1.

[089] A Figura 27 mostra os resultados experimentais de Porcentagem aumentada de células positivas AQP -5 em glândulas salivares de camundongos NOD após tratamento de 10 semanas com anti-CD154.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO

[090] A via CD40-CD154 (CD154 é a CD40L) é considerada como uma função importante na patogênese de síndrome de Sjögren (SS).

[091] Desse modo, qualquer anticorpo monoclonal anti-CD40 com capacidade para bloquear a sinalização CD40-CD154, como um anticorpo anti-CD40 com atividade de ADCC silenciada, pode ser adequado para o tratamento de SS, como síndrome de Sjögren primária

(pSS).

[092] Sem se atrelar à teoria, os inventores identificaram que concentrações de plasma sustentadas de pelo menos cerca de 40 μg/ml do anticorpo CFZ533 durante o regime de manutenção foram necessárias para bloquear a via CD40-CD40L em tecidos alvo de pacientes SS, tais como pacientes pSS. Adicionalmente, devido ao fato de que CFZ533 é submetido à disposição mediada por alvo (que está relacionada à rotatividade e expressão de alvo), e pacientes SS se apresentam com alta expressão de CD40 no corpo, um regime de carregamento foi necessário no início de tratamento para saturar completamente os receptores de CD40 nesses pacientes em condições nas quais os níveis de CD40 foram intensificados, necessitando de doses mais altas ou um regime mais frequente no início de tratamento. Desse modo, com um regime de dosagem de carregamento que fornece no início do tratamento (2 a 3 semanas) a saturação rápida de receptores de CD40, seguido por um regime de dosagem de manutenção que fornece, ao longo de todo o período de tratamento, concentrações de plasma sustentadas de pelo menos 40 μg/ml ou pelo menos 100 μg/ml, em situações em que a expressão de CD40 em tecidos afetados seria intensificada (severidade da condição), são consideradas para um efeito terapêutico. A concentração de plasma máxima observada em estado estável foi entre cerca de 300 e 400 µg/ml (Coorte 3; Estudo CCFZ533X2203) e foi geralmente segura e bem tolerada, com nenhum sinal maqioe que sugira risco aumentado de infecção. Nenhum evento tromboembólico foi observado.

[093] A dosagem apropriada variará dependendo de, por exemplo, o antagonista de via CD40 particular, por exemplo, um anticorpo anti- CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1, também chamado de CFZ533 no presente documento, mAb2, ASKP1240) ou anticorpo anti-CD40L (por exemplo, BIIB063) ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a ser empregado, o indivíduo de tratamento, o modo de administração, a natureza e a severidade da afecção em tratamento, e a natureza dos tratamentos anteriores aos quais o paciente foi submetido. Finalmente, os fornecedores de assistência médica atendentes decidirão a quantidade do antagonista de via CD40 para tratar cada paciente individual. Em algumas modalidades, o fornecedor de assistência médica atendente pode administrar baixas doses do antagonista de via CD40 e observar a resposta do paciente. Em outras modalidades, a dose inicial (ou doses iniciais) de antagonista de via de CD40 administrada a um paciente é alta e, então, é titulada de modo descendente até sinais de relapso ocorrerem. Doses maiores do antagonista de via CD40 podem ser administradas até o efeito terapêutico otimizado ser obtido para o paciente, e a dosagem não é geralmente aumentada de modo adicional.

[094] Na prática de alguns dos métodos de tratamento ou usos da presente revelação, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de via CD40, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1, também chamado de CFZ533 no presente documento, mAb2, ASKP1240) ou anticorpo anti-CD40L ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é administrada a um paciente, por exemplo, um mamífero (por exemplo, um ser humano). Embora seja entendido que os métodos revelados fornecem tratamento para pacientes SS com o uso de um antagonista de via CD40 (por exemplo, mAb1/CFZ533, mAb2, ASKP1240), isso não exclui que, se o paciente tiver que ser finalmente tratado com um antagonista de via CD40, tal terapia de antagonista de via CD40 seja necessariamente uma monoterapia. Certamente, se um paciente é selecionado para tratamento com um antagonista de via CD40, então, o antagonista de via CD40 (por exemplo, mAb1/CFZ533, mAb2, ASKP1240) pode ser administrado de acordo com os métodos da revelação sozinho ou em combinação com outros agentes e terapias.

[095] Deve ser entendido que as mudanças de regime podem ser apropriadas para certos pacientes SS, como pacientes pSS, por exemplo, pacientes que exibem resposta inadequada ao tratamento com os antagonistas de via CD40, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1, também chamado CFZ533 no presente documento, mAb2, ASKP1240) ou anticorpo anti-CD40L ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a ser empregado. Desse modo, a administração (por exemplo, mAb1/CFZ533 ou mAb2) pode ser mais frequente do que a dosagem mensal, por exemplo, uma dosagem quinzenal (a cada duas semanas) ou uma dosagem semanal.

[096] Alguns pacientes podem se beneficiar de um regime de carregamento (por exemplo, administrações semanais por diversas semanas [por exemplo, 1 a 4 semanas, por exemplo, dosagem nas semanas 0, 1, 2, e/ou 3, tal como em 2 semanas, regime de dosagem de carregamento nas Semanas 0 e 1] seguido por um regime de manutenção que começa, por exemplo, na Semana 3 ou 4 em que CFZ533 pode ser administrado semanalmente, quinzenalmente ou a cada 4 semanas por diversas semanas.

[097] Por exemplo, um regime apropriado para mAb1/CFZ533 ou mAb2 pode ser semanal por diversas semanas [por exemplo, 1 a 4 semanas, por exemplo, dosagem nas semanas 0, 1, 2, e 3] seguido por um regime de manutenção mensal.

[098] Em outro exemplo, um regime apropriado para mAb1/CFZ533 ou mAb2 é semanal por diversas semanas (por exemplo, 2 a 8 semanas, tal como 3 semanas, por exemplo, dosagem nas semanas 0, 1, 2) seguido por um regime de manutenção quinzenal.

[099] Também será entendido que a administração (por exemplo,

para mAb1/CFZ533 ou mAb2) pode ser menos frequente do que a dosagem mensal, por exemplo, uma dosagem a cada 6 semanas, a cada 8 semanas (a cada dois meses), trimestral (a cada três meses), etc.

[0100] Será entendido que a ampliação de dose pode ser apropriada para certos pacientes SS, por exemplo, pacientes pSS, com base na severidade da doença, por exemplo, pacientes que exibem resposta inadequada ao tratamento com os antagonistas de via CD40, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1, também chamado CFZ533 no presente documento, mAb2, ASKP1240) ou anticorpo anti-CD40L ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a ser empregado. Desse modo, as dosagens subcutâneas (s.c.) (doses de carregamento ou manutenção) podem ser maiores do que cerca de 150 mg a cerca de 900 mg s.c., por exemplo, cerca de 75 mg, cerca de 100 mg, cerca de 125 mg, cerca de 175 mg, cerca de 200 mg, cerca de 250 mg, cerca de 350 mg, cerca de 400 mg, cerca de 450 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, etc.; de modo similar, as dosagens intravenosas (i.v.) podem ser maiores do que cerca de 10 mg/kg, por exemplo, cerca de 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, etc. Também será entendido que a redução de dose também pode ser apropriada para certos pacientes SS, como pacientes pSS, por exemplo, pacientes que exibem eventos adversos ou uma resposta adversa ao tratamento com o antagonista de via CD40 (por exemplo, um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1, também chamado de dCFZ533 no presente documento, mAb2, ASKP1240) ou anticorpo anti-CD40L ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo). Desse modo, as dosagens do antagonista de via CD40 (por exemplo, um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1,

também chamado CFZ533 no presente documento, mAb2, ASKP1240) ou anticorpo anti-CD40L ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), podem ser menores do que cerca de 150 mg a cerca de 900 mg s.c., por exemplo, cerca de 25 mg, cerca de 50 mg, cerca de 75 mg, cerca de 100 mg, cerca de 125 mg, cerca de 175 mg, cerca de 200 mg, cerca de 250 mg, cerca de 350 mg, cerca de 400 mg, cerca de 450 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, etc.

[0101] Em algumas modalidades, o antagonista CD40, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1, também chamado CFZ533 no presente documento, mAb2, ASKP1240) ou anticorpo anti-CD40L ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser administrado ao paciente a uma dose inicial de 600 mg entregue s.c., e uma dose pode ser, então, ajustada a 150 mg ou 300 mg entregue s.c. se necessário, conforme determinado por um médico.

[0102] Em algumas modalidades, o antagonista CD40, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1, também chamado CFZ533 no presente documento, mAb2, ASKP1240) ou anticorpo anti-CD40L ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser administrado ao paciente a uma dose inicial de 10 mg/kg entregue i.v., e a dose pode ser, então, ajustada a 150 mg ou 300 mg entregue s.c. se necessário, conforme determinado por um médico.

[0103] Em uma modalidade específica, CFZ533 3 mg/kg é administrado s.c. no dia 1 (D1), dia 15 (D15), D29, D57, D85, D99, D113 e D141.

[0104] Em outra modalidade específica, CFZ533 10 mg/kg é administrado i.v. em D1, D15, D29, D57, D85, D99, D113 e D141.

[0105] Em ainda outra modalidade específica, uma dose de carregamento que compreende quatro doses unitárias de 600 mg de

CFZ533 administradas s.c. uma vez por semana (Q1W), isto é, 600 mg de CFZ533 s.c. nos dias D1, D8, D15 e D22, seguidos por uma dose de manutenção que compreende doses unitárias de 300 mg administradas s.c. São administrados uma vez por semana (Q1W), isto é, 300 mg de CFZ533 s.c. uma vez por semana nos dias D29 a D85.

[0106] Em uma modalidade específica adicional, uma dose de carregamento que compreende uma dose de 10 mg de CFZ533 por kg do indivíduo, administrada i.v. uma vez no dia 1, seguido por uma dose de manutenção que compreende doses unitárias de 300 mg administradas s.c. uma vez por semana (Q1W), isto é, 300 mg de CFZ533 s.c. uma vez por semana de D8 a D85.

[0107] CFZ533 pode ser administrado trimestralmente, mensalmente, semanalmente ou quinzenalmente, por exemplo, de modo subcutâneo, a uma dosagem de cerca de 75 mg a cerca de 600 mg ou cerca de 150 mg a cerca de 300 mg sendo administrados, por injeção subcutânea, a uma dose unitária de cerca de 75 mg, cerca de 150 mg, cerca de 300 mg, cerca de 450 mg ou cerca de 600 mg.

[0108] CFZ533 pode ser administrado por injeção subcutânea, semanalmente, com doses de carregamento de cerca de 150 mg a cerca de 600 mg, em que as doses de carregamento são administradas durante 1 a 4 semanas.

[0109] A dose de carregamento também pode ser uma administração i.v. de cerca de 10 mg/kg a cerca de 30 mg/kg. Adicionalmente, as doses de carregamento podem ser administradas de modo subcutâneo semanalmente ou quinzenalmente com doses de cerca de 150 mg, 300 mg e/ou 600 mg do ingrediente ativo.

[0110] O regime de carregamento ou dosagem de CFZ533 (como 150/300/600 mg, semanalmente ou quinzenalmente) é preferencialmente seguido por um regime de manutenção ou dosagem, administrado semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente (a cada quatro semanas). A dose de manutenção é preferencialmente de 300 mg s.c. semanalmente ou quinzenalmente, ou 600 mg quinzenalmente ou 600 mg a cada 4 semanas.

[0111] O anticorpo anti-CD40, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser CFZ533, um derivado funcional do mesmo ou um biossimilar do mesmo.

[0112] Conforme definido no presente documento, "dose unitária" se refere a uma dose s.c. que pode ser compreendida entre cerca de 75 mg a 900 mg, por exemplo, cerca de 150 mg a cerca de 600 mg, por exemplo, cerca de 150 mg a cerca de 600 mg, por exemplo, cerca de 300 mg a cerca de 600 mg, ou, por exemplo, cerca de 150 mg a cerca de 300 mg. Por exemplo, uma dose s.c. unitária é de cerca de 75 mg, cerca de 150 mg, cerca de 300 mg, cerca de 350 mg, cerca de 400 mg, cerca de 450 mg, cerca de 500 mg, cerca de 550 mg, cerca de 600 mg. Definições

[0113] Conforme usado no presente documento, CD40 se refere um agrupamento de diferenciação 40, também chamado membro 5 de superfamília de receptor de fator de necrose tumoral. O termo CD40 se refere um CD40 humano, por exemplo, conforme definido na SEQ ID NO: 19, a menos que descrito de outro modo.

[0114] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, +/- 10%. Quando usado na frente de uma gama numérica ou lista de números, o termo “cerca de” se aplica a cada número na série, por exemplo, a frase “cerca de 1-5” deve ser interpretada como “cerca de 1 a cerca de 5” ou, por exemplo, a frase “cerca de 1, 2, 3, 4” deve ser interpretada como “cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, etc.”.

[0115] A palavra “substancialmente” não exclui “completamente”, por exemplo, uma composição que está “substancialmente isenta” de Y pode estar completamente isenta de Y. Onde necessário, a palavra

“substancialmente” pode ser omitida da definição da divulgação.

[0116] O termo “compreendendo” engloba “incluindo” bem como “consistindo”, por exemplo, uma composição “compreendendo” X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[0117] AUC0-t designa a área sob a curva de concentração de plasma-tempo do tempo zero ao tempo ‘t', em que t é um ponto no tempo definido após a administração [massa x tempo / volume].

[0118] AUCtx-ty representa a área sob a curva de concentração de plasma-tempo do tempo ‘x' ao tempo ‘y', em que ‘tempo x' e ‘tempo y' são pontos no tempo definidos após a administração.

[0119] Cmax é a concentração de plasma máxima observada após a administração de fármaco [massa / volume].

[0120] Cmin é a concentração de plasma mínima observada que após a administração de fármaco.

[0121] Ctrough é a concentração de plasma observada que é logo antes do começo de, ou no fim de um intervalo de dosagem.

[0122] Tmax é o tempo para alcançar a concentração máxima após a administração do fármaco [tempo].

[0123] ss (subscrito) indica que o parâmetro é definido em estado estável.

[0124] O termo "anticorpo" ou "anticorpo anti-CD40" e semelhantes conforme usado no presente documento se refere a anticorpos inteiros que interagem com (por exemplo, por ligação, impedimento estérico, estabilização/desestabilização, distribuição especial) um CD40. Um “anticorpo” de ocorrência natural é uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável da cadeia pesada (abreviada no presente documento como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável da cadeia leve (abreviada no presente documento como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDRs), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FRs). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas, do terminal amino para o terminal carbóxi, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. O termo "anticorpo" inclui, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos camelídeos, ou anticorpos quiméricos. Os anticorpos podem ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse, preferencialmente IgG e com máxima preferência IgG1. Os anticorpos exemplificativos incluem CFZ533 (também designado no presente documento como mAb1) e mAb2, conforme apresentado na Tabela 1.

[0125] Ambas as cadeias leve e pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e “variável" são usados funcionalmente. Nesse sentido, será reconhecido que os domínios variáveis de ambas as porções de cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade de antígeno.

Consequentemente, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes, tais como secreção, mobilidade transplacentária, ligação a receptor Fc, ligação a complemento e similares. Por conversão, a numeração dos domínios de região constante aumenta à medida que se tornam mais distais do sítio de ligação ao antígeno ou terminal amino do anticorpo. O terminal N é uma região variável e o terminal C é uma região constante; os domínios CH3 e CL compreendem, na verdade, o terminal carbóxi da cadeia pesada e leve, respectivamente. Em particular, o termo "anticorpo" inclui especificamente um formato IgG- scFv.

[0126] O termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de antígeno"), conforme usado no presente documento, se refere a um comprimento completo ou um ou mais fragmentos de um anticorpo, como uma proteína, que retém a capacidade para se ligar especificamente a um antígeno ou epitopo (por exemplo, uma porção de CD40).

[0127] As "Regiões Determinantes de Complementariedade" ("CDRs") são sequências de aminoácidos com delimitações determinadas com o uso de qualquer um dentre vários esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5ª edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração "Kabat”), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927 a 948 (esquema de numeração "Chothia”) e numeração ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132 a 136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (esquema de numeração de "IMGT"). Sob IMGT, as regiões CDR de um anticorpo podem ser determinadas com o uso do programa IMGT/DomainGap Align.

[0128] O termo "epitopo", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer determinante com capacidade para ligação com alta afinidade a uma imunoglobulina. Um epitopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo que alveja especificamente esse antígeno, e quando o antígeno é uma proteína, esse inclui aminoácidos específicos que contatam diretamente o anticorpo. Mais frequentemente, os epitopos residem em proteínas, mas em alguns casos, podem residir em outros tipos de moléculas, tais como ácidos nucleicos. Os determinantes de epitopo podem incluir agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila e sulfonila, e podem ter características estruturais tridimensionais, e/ou características de carga específica. Adicionalmente, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser unidos, com o uso de métodos recombinantes, por um ligante sintético que possibilita que os mesmos sejam feitos como uma cadeia de proteína única, em que as regiões VL e VH se pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); consultar, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423 a 426; e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5.879 a 5.883).

[0129] A expressão "anticorpo isolado", conforme usado no presente documento, se refere ao anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos que têm especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que liga especificamente CD40 é substancialmente livre de anticorpos que ligam especificamente antígenos diferentes de CD40). Um anticorpo isolado que liga especificamente CD40 pode, entretanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos, como moléculas CD40 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode estar substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos. Os termos “anticorpo monoclonal” ou “composição de anticorpo monoclonal” como usados aqui se referem a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. O termo “anticorpo humano”, como usado aqui, se destina a incluir anticorpos tendo regiões variáveis nas quais ambas as regiões de arcabouço e CDR são derivadas de sequências de origem humana. Um “anticorpo humano” não necessita de ser produzido por um humano, tecido humano ou célula humana. Os anticorpos humanos da revelação podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro, por adição de N-nucleotídeo em junções in vivo durante a recombinação de genes de anticorpo, ou por mutação somática in vivo).

[0130] “Identidade” no que diz respeito a um polipeptídeo nativo e seu derivado funcional é definida aqui como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de um polipeptídeo nativo correspondente, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para se alcançar a percentagem máxima de identidade e não considerando qualquer substituição conservativa como parte da identidade de sequências. Nem extensões nem inserções N- ou C-terminais deverão ser interpretadas como reduzindo a identidade. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos. A percentagem de identidade pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão, por exemplo, a Ferramenta de Pesquisa por Alinhamento Local Básico (BLAST) descrito por Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403 410); o algoritmo de Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444 453); ou o algoritmo de Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 a 17). Um conjunto de parâmetros pode ser a matriz de pontuação Blosum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de extensão de lacuna de 4 e uma penalidade de lacuna de alteração de matriz de leitura de 5. A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou nucleotídeos pode ser também determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller ((1989) CABIOS, 4: 11-17) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de pesos PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4.

[0131] "Aminoácido (ou aminoácidos)" se refere(m) a todos os L-α- aminoácidos de ocorrência natural, por exemplo, e incluem D- aminoácidos. A frase “variante da sequência de aminoácidos” se refere a moléculas com algumas diferenças nas suas sequências de aminoácidos em comparação com as sequências de acordo com a presente divulgação. As variantes de sequência de aminoácidos de um anticorpo de acordo com a presente revelação, por exemplo, de uma sequência especificada, ainda têm a capacidade para se ligar ao CD40 humano. As variantes da sequência de aminoácidos incluem variantes substitucionais (aquelas que têm, pelo menos, um resíduo de aminoácido removido e um aminoácido diferente inserido em seu lugar na mesma posição em um polipeptídeo de acordo com a presente divulgação), variantes insercionais (aquelas com um ou mais aminoácidos inseridos imediatamente adjacentes a um aminoácido em uma posição particular em um polipeptídeo de acordo com a presente divulgação) e variantes delecionais (aquelas com um ou mais aminoácidos removidos em um polipeptídeo de acordo com a presente divulgação).

[0132] O termo "região Fc", conforme usado no presente documento, se refere a um polipeptídeo que compreende o CH3, CH2 e pelo menos uma porção da região de articulação de um domínio constante de um anticorpo. Opcionalmente, uma região Fc pode incluir um domínio CH4, presente em algumas classes de anticorpo. Uma região Fc pode compreender a região de articulação inteira de um domínio constante de um anticorpo. Em uma modalidade, a invenção compreende uma região Fc e uma região CH1 de um anticorpo. Em uma modalidade, a invenção compreende uma região Fc e uma região CH3 de um anticorpo. Em outra modalidade, a invenção compreende uma região Fc, uma região CH1 e uma região Ckappa/lâmbda do domínio constante de um anticorpo. Em uma modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende uma região constante, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada. Em uma modalidade, tal região constante é modificada em comparação a uma região constante do tipo selvagem. Isto é, os polipeptídeos da invenção revelados no presente documento podem compreender alterações ou modificações a um ou mais dos três domínios constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) e/ou ao domínio de região constante de cadeia leve (CL). As modificações exemplificativas incluem adições, deleções ou substituições de um ou mais aminoácidos em um ou mais domínios. Tais alterações podem ser incluídas para otimizar a função efetora, meia-vida, etc.

[0133] Conforme usado no presente documento, o termo "Afinidade" se refere à força de interação entre anticorpo e antígeno em sítios antigênicos únicos. Dentro de cada sítio antigênico, o "braço" de região variável do anticorpo interage através de forças não covalentes fracas com o antígeno em vários sítios; quanto mais interações, mais forte a afinidade. Conforme usado no presente documento, o termo "alta afinidade" para um anticorpo IgG ou fragmento do mesmo (por exemplo, um fragmento Fab) se refere a um anticorpo que tem um KD de 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, ou 10-10 M, ou 10-11 M ou menos, ou 10-12 M ou menos, ou 10-13 M ou menos para um antígeno alvo. Entretanto, a ligação de alta afinidade pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, a ligação de alta afinidade para um isotipo de IgM se refere a um anticorpo que tem um KD de 10-7 M ou menos, ou 10-8 M ou menos.

[0134] Conforme usado no presente documento, um anticorpo ou uma proteína que "se liga especificamente a polipeptídeo CD40" é destinado a se referir a um anticorpo ou proteína que se liga a polipeptídeo CD40 humano com um KD de 100 nM ou menos, 10 nM ou menos, 1 nM ou menos.

[0135] Um anticorpo que "reage de modo cruzado com um antígeno diferente de CD40" é destinado a se referir a um anticorpo que se liga a esse antígeno com um KD de 1 µM ou menos, 100 nM ou menos, 10 nM ou menos, 1 nM ou menos. Um anticorpo que "não reage de modo cruzado com um antígeno particular" é destinado a se referir a um anticorpo que se liga a esse antígeno, com um KD de 100 nM ou maior, ou um KD de 1 µM ou maior, ou um KD de 10 µM ou maior. Em certas modalidades, tais anticorpos que não reagem de modo cruzado com o antígeno exibem ligação essencialmente indetectável contra essas proteínas em ensaios de ligação padrão.

[0136] O termo "Kassoc" ou "Ka", conforme usado no presente documento, é destinado a se referir à taxa de associação de uma interação de anticorpo-antígeno particular, enquanto o termo "Kdis" ou "Kd," conforme usado no presente documento, é destinado a se referir à taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular.

[0137] O termo "KD", conforme usado no presente documento, é destinado a se referir à constante de dissociação, que é obtida da razão entre Kd e Ka (isto é Kd/Ka) e é expressada como uma concentração molar (M). Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinação da KD de um anticorpo é por uso de ressonância de plasmon de superfície ou uso de um sistema biossensor tal como um sistema Biacore®.

[0138] Conforme usado no presente documento, o termo ou atividade de "ADCC" ou "citotoxicidade celular dependente de anticorpo" se refere à atividade de depleção de célula. A atividade de ADCC pode ser medida pelo ensaio de ADCC, conforme bem conhecido por uma pessoa versada na técnica.

[0139] Conforme usado no presente documento, o termo anticorpo "silencioso" se refere a um anticorpo que exibe nenhuma ou baixa atividade de ADCC conforme medido em um ensaio de ADCC.

[0140] Em uma modalidade, o termo "nenhuma ou baixa atividade de ADCC" significa que o anticorpo silencioso exibe uma atividade de ADCC que está abaixo de 50% de lise de célula específica, por exemplo abaixo de 10% de lise de célula específica, conforme medido em um ensaio de ADCC padrão. Nenhuma atividade de ADCC significa que o anticorpo silencioso exibe uma atividade de ADCC (lise de célula específica) que está abaixo de 1%.

[0141] Funções efetoras silenciadas podem ser obtidas por mutação na região Fc dos anticorpos e foram descritas na técnica: LALA e N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. volume 20(6):685 a 691); e D265A (Baudino et al., 2008, J. lmmunol. 181:6.664 a 6.669; Strohl, W., supra). Exemplos de anticorpos Fc de IgG1 silenciosos compreendem o denominado mutante LALA compreendendo a mutação L234A e L235A na sequência de aminoácidos de Fc de IgG1. Outro exemplo de um anticorpo de IgG1 silencioso compreende a mutação D265A. Outro anticorpo IgG1 silencioso compreende a mutação N297A, que resulta em anticorpos aglicosilados/não glicosilados.

[0142] O termo "tratamento" ou "tratar " é definido no presente documento como a aplicação ou administração de um anticorpo anti- CD40 ou proteína de acordo com a invenção, por exemplo, anticorpo mAb1 ou mAb2, a um indivíduo, ou aplicação ou administração de uma composição farmacêutica que compreende o dito anticorpo anti-CD40 ou proteína da invenção, a um tecido isolado ou linhagem celular de um indivíduo, em que o indivíduo tem uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, um sintoma associado a uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, ou uma predisposição em relação ao desenvolvimento de uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, em que o propósito é aliviar, amenizar ou melhorar a doença autoimune e/ou doença inflamatória, quaisquer sintomas associados da doença autoimune e/ou doença inflamatória, ou a predisposição em relação ao desenvolvimento da doença autoimune e/ou doença inflamatória.

[0143] Por "tratamento", também pretende-se que a aplicação ou a administração de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CD40 ou proteína da invenção, por exemplo, anticorpo mAb1 ou mAb2, a um indivíduo, ou aplicação ou administração de uma composição farmacêutica que compreende o dito anticorpo anti-CD40 ou proteína da invenção, a um tecido isolado ou linhagem celular de um indivíduo, em que o indivíduo tem uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, um sintoma associado a uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, ou uma predisposição em relação ao desenvolvimento de uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, em que o propósito é aliviar, amenizar ou melhorar a doença autoimune e/ou doença inflamatória, quaisquer sintomas associados da doença autoimune e/ou doença inflamatória, ou a predisposição em relação ao desenvolvimento da doença autoimune e/ou doença inflamatória.

[0144] O termo "impede" ou "que impede" se refere ao tratamento profilático ou preventivo; se refere a atrasar o início de, ou impedir o início da doença, distúrbios e/ou sintomas associados ao mesmo.

[0145] Como usado no presente documento, um sujeito está “em necessidade de” um tratamento se tal sujeito se beneficiar biologicamente, medicamente ou em qualidade de vida a partir de tal tratamento.

[0146] O termo “farmaceuticamente aceitável” significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da atividade biológica do(s)

ingrediente(s) ativo(s).

[0147] Conforme usado no presente documento, o termo "administração" ou "que administra" do composto de indivíduo significa fornecer um composto da invenção e pró-fármacos do mesmo a um indivíduo que necessita de tratamento. Administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concomitante) e consecutiva em qualquer ordem, e em qualquer rota de administração. Uma administração pode ser uma injeção única, ou múltiplas injeções entregues em combinação com entre si, dependendo do quanto de substância de fármaco precisa ser administrado para alcançar o efeito terapêutico.

[0148] Conforme usado no presente documento, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, mAb1, que é eficaz, mediante administração de dose única ou múltipla a um paciente (como um ser humano) para tratar, impedir, prevenir o início de, curar, atrasar, reduzir a severidade de, amenizar pelo menos um sintoma de um distúrbio ou distúrbio recorrente, ou prolongando a sobrevivência do paciente além do esperado na ausência de tal tratamento. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual (por exemplo, um anticorpo anti-CD40, por exemplo, mAb1) administrado sozinho, o termo se refere somente àquele ingrediente. Quando aplicado a uma combinação, o termo se refere a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultem no efeito terapêutico, quer administradas em combinação, em série ou simultaneamente.

[0149] A expressão "regime terapêutico" significa o regime usado para tratar uma doença, por exemplo, o protocolo de dosagem usado durante o tratamento de SS, como pSS. Um regime terapêutico pode incluir um regime de carregamento (ou dosagem de carregamento), seguido por um regime de manutenção (ou dosagem de manutenção).

[0150] A expressão "regime de carregamento" ou "período de carregamento" se refere a um regime de tratamento (ou uma porção de um regime de tratamento) que é usada para o tratamento inicial de uma doença. Em algumas modalidades, os métodos, usos, kits, processos e regimes revelados (por exemplo, métodos para tratar SS) empregam um regime de carregamento (ou dosagem de carregamento). Em alguns casos, o período de carregamento é o período até a máxima eficácia ser alcançada. O objetivo geral de um regime de carregamento é fornecer um alto nível de fármaco a um paciente durante o período inicial de um regime de tratamento. Um regime de carregamento pode incluir administrar uma dose maior do fármaco do que um médico empregaria durante o regime de manutenção, administrar um fármaco mais frequentemente do que um médico administraria durante um regime de manutenção, ou ambos. A escalação da dose pode ocorrer durante ou após o regime de carregamento.

[0151] A expressão "regime de manutenção" ou "período de manutenção" se refere a um regime de tratamento (ou a porção de um regime de tratamento) que é usado para a manutenção de um paciente durante o tratamento de uma doença, por exemplo, para manter o paciente em remissão por longos períodos de tempo (meses ou anos) após o regime ou período de carregamento. Em algumas modalidades, os métodos revelados, usos e regimes empregam um regime de manutenção. Um regime de manutenção pode empregar terapia contínua (por exemplo, administrar um fármaco em intervalos regulares, por exemplo, semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente (a cada 4 semanas), anualmente, etc.) ou terapia intermitente (por exemplo, tratamento interrompido, tratamento intermitente, tratamento em relapso ou tratamento mediante satisfação de um critério predeterminado particular [por exemplo, dor, manifestação de doença, etc.]). A escalação da dose pode ocorrer durante um regime de manutenção.

[0152] A expressão "meios para administrar” é usada para indicar qualquer implantação disponível para administrar sistemicamente um fármaco a um paciente, incluindo, mas sem limitação, uma seringa pré- carregada, um frasco e seringa, uma caneta de injeção, um autoinjetor, uma bolsa de gotejamento i.v., uma bomba, uma bomba de emplastro, etc. Com tais itens, um paciente pode se autoadministrar o fármaco (isto é, administrar o fármaco por si próprio) ou um médico pode administrar o fármaco. Exemplo 1. Anticorpos anti-CD40

[0153] Os mAbs anti-CD40 com atividade de ADCC silenciada foram revelados nas patentes nº US8828396 e US9221913, incorporadas a título de referência no presente documento em sua totalidade. É previsto que os mAbs anti-CD40 com atividade de ADCC silenciada tenham um perfil de segurança melhorado em relação a outros anticorpos anti-CD40, e em particular, podem ser mais adequados para indicações não oncológicas, como síndrome de Sjögren (SS) e, particularmente, síndrome de Sjögren primária (pSS).

[0154] De acordo com uma hipótese de não ligação dos inventores, os dois mAbs das patentes nº US8828396 e US9221913, designados como mAb1 e mAb2, são considerados compostos adequados para o tratamento de SS. O anticorpo mAb1, também chamado de CFZ533, é particularmente preferencial.

[0155] mAb1 inibe a ativação induzida por CD154 in vitro, a formação de anticorpo dependente de célula T e a formação de centro germinativo in vivo. Em pacientes com pSS, o bloqueio CD40 com mAb1 demonstrou oferecer uma nova modalidade de tratamento (Exemplo 7).

[0156] Para possibilitar que uma pessoa versada na técnica pratique a invenção, as sequências de aminoácidos e nucleotídeos de mAb1 e mAb2 são fornecidas na Tabela 1 abaixo.

[0157] Outro mAb anti-CD40 conhecido na técnica é ASKP1240 de

Astellas Pharma/Kyowa Hakko Kirin Co, conforme descrito, por exemplo, no documento nº US8568725B2, incorporado a título de referência ao presente documento.

[0158] Ainda outro mAb anti-CD40 conhecido na técnica é o BI655064 de Boehringer Ingelheim, conforme descrito por exemplo, no documento nº US8591900, incorporado a título de referência, ao presente documento.

[0159] Um mAb anti-CD40 adicional conhecido na técnica é FFP104 por Fast Forward Pharmaceuticals, conforme descrito, por exemplo, no documento nº US8669352, incorporado a título de referência ao presente documento.

[0160] Outra modalidade de tratamento pode ser o MEDI4920 da AstraZeneca, que é uma proteína de fusão Anti-CD40L-Tn3, ou o anticorpo anti-CD40L BIIB063 de Biogen.

[0161] Os anticorpos com o mesmo modo de ação que os anticorpos mencionados acima, chamados biossimilares, também são cobertos pela revelação, conforme será observado por uma pessoa versada na técnica. Tabela 1. Tabela de sequências SEQ ID Descrição de Sequências de aminoácido ou NO: sequência nucleotídeo detalhadas 1 HCDR1 de mAb 1 e SYGMH mAb2 (Kabat) 2 HCDR2 de mAb 1 e VISYEESNRYHADSVKG mAb2 (Kabat) 3 HCDR3 de mAb 1 e DGGIAAPGPDY mAb2 (Kabat) 4 LCDR1 de mAb 1 e RSSQSLLYSNGYNYLD mAb2 (Kabat)

SEQ ID Descrição de Sequências de aminoácido ou NO: sequência nucleotídeo detalhadas 5 LCDR2 de mAb 1 e LGSNRAS mAb2 (Kabat) 6 LCDR3 de mAb 1 e MQARQTPFT mAb2 (Kabat) 7 Cadeia pesada QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA variável de mAb1 e ASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGL mAb2 EWVAVISYEESNRYHADSVKGRF

TISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAV YYCARDGGIAAPGPDYWGQGTLV

TVSS 8 Cadeia leve variável DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRS de mAb1 e mAb2 SQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQS

PQVLISLGSNRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQ

ARQTPFTFGPGTKVDIR 9 Cadeia pesada de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA comprimento ASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGL completo de mAb1 EWVAVISYEESNRYHADSVKGRF

TISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAV YYCARDGGIAAPGPDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR

SEQ ID Descrição de Sequências de aminoácido ou NO: sequência nucleotídeo detalhadas

VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

SLSPGK 10 Cadeia leve de DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRS comprimento SQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQS completo de mAb1 PQVLISLGSNRASGVPDRFSGSG

SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQ ARQTPFTFGPGTKVDIRRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK

SFNRGEC 11 Cadeia pesada de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA comprimento ASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGL completo de mAb2 EWVAVISYEESNRYHADSVKGRF

TISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAV YYCARDGGIAAPGPDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

SLSPGK 12 Cadeia leve de DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRS comprimento SQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQS completo de mAb2 PQVLISLGSNRASGVPDRFSGSG

SFNRGEC 13 Região Fc de mAb1 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS

RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS

LSLSPGK 14 Região Fc de mAb2 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS

RTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS

LSLSPGK 15 DNA que codifica CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTG cadeia pesada de GCGGCGGAGTGGTGCAGCCTG comprimento GCCGGTCCCTGAGACTGTCTTG completo de mAb1 CGCCGCCTCCGGCTTCACCTTC

TCCAGCTACGGCATGCACTGGG TGCGACAGGCCCCTGGCAAGGG ACTGGAATGGGTGGCCGTGATC TCCTACGAGGAATCCAACAGATA CCACGCTGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACAATCTCCCGGGACA ACTCCAAGATCACCCTGTACCTG CAGATGAACTCCCTGCGGACCG AGGACACCGCCGTGTACTACTG CGCCAGGGACGGAGGAATCGCC GCTCCTGGACCTGATTATTGGG GCCAGGGCACCCTGGTGACAGT GTCCTCCGCTAGCACCAAGGGC

CCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCC CCTCCAGCAAGTCCACCTCTGG CGGCACCGCCGCTCTGGGCTGC CTGGTGAAAGACTACTTCCCCGA GCCCGTGACCGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCCGGCG TGCACACCTTTCCAGCCGTGCTG CAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCT GTCCTCCGTGGTGACCGTGCCC TCTAGCTCTCTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCTCCAACACCAAGGTGG ACAAGCGGGTGGAACCCAAGTC CTGCGACAAGACCCACACCTGT CCCCCCTGCCCTGCCCCTGAAC TGCTGGGCGGACCTTCCGTGTT CCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAG GACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGT GGTGGACGTGTCCCACGAGGAC CCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTA CGTGGACGGCGTGGAAGTGCAC AACGCCAAGACCAAGCCCAGAG AGGAACAGTACGCCTCCACCTA CCGGGTGGTGTCTGTGCTGACC GTGCTGCACCAGGACTGGCTGA ACGGCAAAGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAGGCCCTGCCT

GCCCCCATCGAAAAGACCATCTC CAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGC GAGCCACAGGTGTACACACTGC CCCCCAGCCGGGAAGAGATGAC CAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGTCTGGTCAAAGGCTTCTACCC CTCCGATATCGCCGTGGAGTGG GAGTCCAACGGACAGCCCGAGA ACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACTCCGACGGCTCAT TCTTCCTGTACTCCAAGCTGACC GTGGACAAGTCCCGGTGGCAGC AGGGCAACGTGTTCTCCTGCTC CGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGTCCCT

GTCCCTGAGCCCCGGCAAG 16 DNA que codifica GACATCGTGATGACCCAGTCCC cadeia leve de CCCTGTCCCTGACCGTGACACC comprimento TGGCGAGCCTGCCTCTATCTCCT completo de mAb1 GCAGATCCTCCCAGTCCCTGCT

GTACTCCAACGGCTACAACTACC TGGACTGGTATCTGCAGAAGCC CGGCCAGTCCCCACAGGTGCTG ATCTCCCTGGGCTCCAACAGAG CCTCTGGCGTGCCCGACCGGTT CTCCGGCTCTGGCTCTGGCACC GACTTCACACTGAAGATCTCACG GGTGGAAGCCGAGGACGTGGG

CGTGTACTACTGCATGCAGGCC CGGCAGACCCCCTTCACCTTCG GCCCTGGCACCAAGGTGGACAT CCGGCGTACGGTGGCCGCTCCC AGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAG CGACGAGCAGCTGAAGAGCGGC ACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGC TGAACAACTTCTACCCCCGGGA GGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGAGCGGCA ACAGCCAGGAGAGCGTCACCGA GCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGA CCCTGAGCAAGGCCGACTACGA GAAGCATAAGGTGTACGCCTGC GAGGTGACCCACCAGGGCCTGT CCAGCCCCGTGACCAAGAGCTT

CAACAGGGGCGAGTGC 17 DNA que codifica CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTG cadeia pesada de GCGGCGGAGTGGTGCAGCCTG comprimento GCCGGTCCCTGAGACTGTCTTG completo de mAb2 CGCCGCCTCCGGCTTCACCTTC

TCCAGCTACGGCATGCACTGGG TGCGACAGGCCCCTGGCAAGGG ACTGGAATGGGTGGCCGTGATC TCCTACGAGGAATCCAACAGATA CCACGCTGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACAATCTCCCGGGACA

ACTCCAAGATCACCCTGTACCTG CAGATGAACTCCCTGCGGACCG AGGACACCGCCGTGTACTACTG CGCCAGGGACGGAGGAATCGCC GCTCCTGGACCTGATTATTGGG GCCAGGGCACCCTGGTGACAGT GTCCTCCGCTAGCACCAAGGGC CCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCC CCTCCAGCAAGTCCACCTCTGG CGGCACCGCCGCTCTGGGCTGC CTGGTGAAAGACTACTTCCCCGA GCCCGTGACCGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCCGGCG TGCACACCTTTCCAGCCGTGCTG CAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCT GTCCTCCGTGGTGACCGTGCCC TCTAGCTCTCTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCTCCAACACCAAGGTGG ACAAGCGGGTGGAACCCAAGTC CTGCGACAAGACCCACACCTGT CCCCCCTGCCCTGCCCCTGAAC TGCTGGGCGGACCTTCCGTGTT CCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAG GACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGT GGTGGCCGTGTCCCACGAGGAC CCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTA

CGTGGACGGCGTGGAAGTGCAC AACGCCAAGACCAAGCCCAGAG AGGAACAGTACAACTCCACCTAC CGGGTGGTGTCTGTGCTGACCG TGCTGCACCAGGACTGGCTGAA CGGCAAAGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAGGCCCTGCCTG CCCCCATCGAAAAGACCATCTCC AAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCG AGCCACAGGTGTACACACTGCC CCCCAGCCGGGAAGAGATGACC AAGAACCAGGTGTCCCTGACCT GTCTGGTCAAAGGCTTCTACCCC TCCGATATCGCCGTGGAGTGGG AGTCCAACGGACAGCCCGAGAA CAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACTCCGACGGCTCAT TCTTCCTGTACTCCAAGCTGACC GTGGACAAGTCCCGGTGGCAGC AGGGCAACGTGTTCTCCTGCTC CGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGTCCCT

GTCCCTGAGCCCCGGCAAG 18 DNA que codifica GACATCGTGATGACCCAGTCCC cadeia leve de CCCTGTCCCTGACCGTGACACC comprimento TGGCGAGCCTGCCTCTATCTCCT completo de mAb2 GCAGATCCTCCCAGTCCCTGCT

GTACTCCAACGGCTACAACTACC

TGGACTGGTATCTGCAGAAGCC CGGCCAGTCCCCACAGGTGCTG ATCTCCCTGGGCTCCAACAGAG CCTCTGGCGTGCCCGACCGGTT CTCCGGCTCTGGCTCTGGCACC GACTTCACACTGAAGATCTCACG GGTGGAAGCCGAGGACGTGGG CGTGTACTACTGCATGCAGGCC CGGCAGACCCCCTTCACCTTCG GCCCTGGCACCAAGGTGGACAT CCGGCGTACGGTGGCCGCTCCC AGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAG CGACGAGCAGCTGAAGAGCGGC ACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGC TGAACAACTTCTACCCCCGGGA GGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGAGCGGCA ACAGCCAGGAGAGCGTCACCGA GCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGA CCCTGAGCAAGGCCGACTACGA GAAGCATAAGGTGTACGCCTGC GAGGTGACCCACCAGGGCCTGT CCAGCCCCGTGACCAAGAGCTT

CAACAGGGGCGAGTGC 19 Sequência de MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPP aminoácidos de TACREKQYLINSQCCSLCQPGQK CD40 humano LVSDCTEFTETECLPCGESEFLDT

WNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQ QKGTSETDTICTCEEGWHCTSEA CESCVLHRSCSPGFGVKQIATGV SDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCH PWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVV CGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVL VFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEI NFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQ PVTQEDGKESRISVQERQ

[0162] Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD40 é fornecido, em que o dito anticorpo compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

[0163] Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD40 é fornecido, em que o dito anticorpo compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

[0164] Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD40 é fornecido, em que o dito anticorpo compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 13.

[0165] Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD40 é fornecido, em que o dito anticorpo compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 14.

[0166] Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD40 é fornecido, em que o dito anticorpo compreende uma região de IgG1 de Fc silenciosa.

[0167] Em uma modalidade preferencial, um anticorpo anti-CD40 designado como mAb1 é fornecido. Especificamente, mAb1 compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 10; e mAb2 compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

1. Sistemas de expressão

[0168] Para a expressão das cadeias leve e pesada, o vetor de expressão (ou vetores de expressão) que codifica(m) as cadeias pesada e leve é (são) transfectado(s) em uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" são destinadas a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e semelhantes. É teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. A expressão de anticorpos em células eucarióticas, por exemplo, células hospedeiras de mamíferos, levedura ou fungos filamentosos, é discutida devido ao fato de que tais células eucarióticas, e em particular células de mamífero, são mais prováveis do que células procarióticas de montar e secretar um anticorpo imunologicamente ativo e apropriadamente dobrado.

[0169] Particularmente, uma clonagem ou vetor de expressão pode compreender pelo menos uma das sequências de codificação a seguir

(a) a (b), ligada de modo operacional a sequências promotoras adequadas:

[0170] (a) SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 que codifica respectivamente as cadeias leve e pesada de comprimento completo de mAb1; ou

[0171] (b) SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 que codifica respectivamente as cadeias leve e pesada de comprimento completo de mAb2.

[0172] As células hospedeiras de mamífero para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem Ovários de Hamster Chinês (células de CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4.216 a 4.220 usadas com um marcador selecionável DH FR, por exemplo, conforme descrito em R.J. Kaufman e P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601 a 621), linhagens celulares CHOK1 dhfr+, células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para uso com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão é o sistema de expressão de gene GS mostrado nas Publicações PCT nº WO 87/04462, WO 89/01036 e EP0338841.

[0173] Quando os vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura com o uso de métodos de purificação de proteína padrão (Consultar, por exemplo, Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848: 28- 37).

[0174] As células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão e a produção de mAb1 ou mAb2.

2. Composições Farmacêuticas

[0175] Os anticorpos terapêuticos são tipicamente formulados em forma aquosa pronta para administração ou como liofilizado para reconstituição com um diluente adequado antes da administração. Um anticorpo anti-CD40 pode ser formulado como um liofilizado, ou como uma composição aquosa, por exemplo, em seringas pré-carregadas. A formulação também é chamada de produto de fármaco (DP).

[0176] A formulação adequada pode fornecer uma composição farmacêutica aquosa ou um liofilizado que pode ser reconstituído para gerar uma solução com uma alta concentração do ingrediente ativo de anticorpo e um baixo nível de agregação de anticorpo para entrega a um paciente. As altas concentrações de anticorpo são úteis, visto que reduzem a quantidade de material que deve ser entregue a um paciente. Os volumes de dosagem reduzidos minimizam o tempo tomado para entregar uma dose fixada ao paciente. As composições aquosas da invenção com alta concentração de anticorpos anti-CD40 são particularmente adequadas para administração subcutânea.

[0177] Desse modo, a invenção fornece uma composição farmacêutica aquosa, adequada para administração em um indivíduo, por exemplo, para administração subcutânea, que compreende um anticorpo anti-CD40, como mAb1 ou mAb2.

[0178] O anticorpo anti-CD40 pode ser usado como uma composição farmacêutica quando combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal composição pode conter, além de um anticorpo anti-CD40, como mAb1 ou mAb2, veículos, vários diluentes, cargas, sais, tampões, estabilizadores, solubilizantes e outros materiais bem conhecidos na técnica. As características do transportador dependerão da via de administração. As composições farmacêuticas para uso nos métodos divulgados podem também conter agentes terapêuticos adicionais para tratamento da disfunção visada particular.

[0179] Em uma modalidade específica, a composição, também chamada de produto de fármaco (DP), é uma formulação liofilizada preparada a partir de uma formulação aquosa que tem um pH de 6,0 e que compreende:

[0180] (i) mAb1 ou mAb2 150 mg/ml

[0181] (ii) sacarose 270 mM como um estabilizador,

[0182] (iii) L-histidina 30 mM como um agente tamponante, e

[0183] (iv) Polissorbato 20 0,06% como um tensoativo.

[0184] Em outra modalidade específica, a composição farmacêutica, também chamada de produto de fármaco (DP), é uma composição farmacêutica aquosa que tem um pH de 6,0 e que compreende:

[0185] (i) mAb1 ou mAb2 150 mg/ml

[0186] (ii) sacarose 270 mM como um estabilizador,

[0187] (iii) L-histidina 30 mM como um agente tamponante, e

[0188] (iv) Polissorbato 20 0,06% como um tensoativo.

3. Via de Administração

[0189] Tipicamente, os anticorpos ou proteínas são administrados por injeção, por exemplo, de modo intravenoso, intraperitoneal ou subcutâneo. Os métodos para realizar essa administração são conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Também pode ser possível obter composições que podem ser administradas de modo tópico ou oral, ou que podem ter a capacidade para transmissão através de membranas mucosas. Conforme será observado por uma pessoa versada na técnica, quaisquer meios adequados para administração podem ser usados, conforme apropriado para uma rota selecionada particular de administração.

[0190] Exemplos de rotas possíveis de administração incluem administração parenteral, (por exemplo, intravenosa (I.V. ou IV),

intramuscular (IM), intradérmica, subcutânea (S.C. ou SC) ou infusão), oral e pulmonar (por exemplo, inalação), nasal, transdérmica (tópica), transmucosal e retal. As soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, como água para injeção, solução salina, óleos fixados, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes, como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, como ácido etilenodiaminatetra- acético; tampões, como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser contida em ampolas, seringas descartáveis, ou múltiplos frascos de dose feitos de vidro ou plástico.

[0191] Uma terapia anti-CD40 pode ser iniciada administrando-se um regime de carregamento ou dosagem de carregamento do anticorpo ou proteína da invenção ao indivíduo que necessita de terapia anti- CD40. Por "dose de carregamento (ou doses de carregamento)" pretende-se uma dosagem inicial do anticorpo anti-CD40 ou proteína da invenção que é administrada ao indivíduo uma ou diversas vezes, em que a dose do anticorpo ou proteína da invenção administrada está dentro da faixa de dosagem mais alta (isto é, de cerca de 10 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, tal como cerca de 30 mg/kg de modo intravenoso, ou cerca de 600 mg, ou cerca de 300 mg ou cerca de 150 mg semanalmente, quinzenalmente, por até 4 semanas). O "regime de carregamento" pode ser administrado como uma administração única ou múltiplas administrações, por exemplo, uma infusão intravenosa única ou múltiplas, ou como múltiplas administrações subcutâneas combinadas em um regime de "dosagem de carregamento" dependendo da severidade da doença). Após a administração do

"regime de carregamento", então, administra-se ao indivíduo uma ou mais doses terapeuticamente eficazes adicionais do anticorpo anti- CD40 ou proteína da invenção. As doses terapeuticamente eficazes subsequentes podem ser administradas, por exemplo, de acordo com uma programação de dosagem semanal, ou uma vez a cada duas semanas (quinzenalmente), uma vez a cada três semanas, ou uma vez a cada quatro semanas. Em tais modalidades, as doses terapeuticamente eficazes subsequentes estão geralmente na faixa de dosagem mais baixa (isto é, cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, como cerca de 10 mg/kg, por exemplo 10 mg/kg IV ou cerca de 150 mg, cerca de 300 mg ou cerca de 600 mg administrados semanalmente, quinzenalmente ou a cada 4 semanas de modo subcutâneo).

[0192] Alternativamente, em algumas modalidades, após o "regime de carregamento", as doses terapeuticamente efic, são administradas de acordo com uma "programação de manutenção", em que a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo ou proteína da invenção é administrada uma vez por mês, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada 10 semanas, uma vez a cada três meses, uma vez a cada 14 semanas, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada 18 semanas, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada 22 semanas, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada 7 meses, uma vez a cada 8 meses, uma vez a cada 9 meses, uma vez a cada 10 meses, uma vez a cada 11 meses, ou uma vez a cada 12 meses. Em tais modalidades, as doses terapeuticamente eficazes do anticorpo anti-CD40 ou proteína da invenção estão na faixa de dosagem mais baixa (isto é, cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, como cerca de 10 mg/kg, por exemplo 10 mg/kg), particularmente quando as doses subsequentes são administradas em intervalos mais frequentes, por exemplo, semanalmente, uma vez a cada duas semanas a uma vez a cada quatro semanas, ou na faixa de dosagem mais alta (isto é, de

10 mg/kg a 50 mg/kg, como 30 mg/kg), particularmente quando as doses subsequentes são administradas em intervalos menos frequentes, por exemplo, quando as doses subsequentes são administradas com um mês a 12 meses de intervalo.

[0193] A temporização da dosagem é geralmente medida a partir do dia da primeira dose do composto ativo (por exemplo, mAb1), que também é conhecido como "linha de base". Entretanto, fornecedores de assistência médica diferentes usam convenções de nomeação diferentes.

[0194] De modo notável, a semana zero pode ser denominada como semana 1 por alguns fornecedores de assistência médica, enquanto o dia zero pode ser denominado como dia um por alguns fornecedores de assistência médica. Desse modo, é possível que médicos diferentes designem, por exemplo, uma dose como sendo dada durante a semana 3/no dia 21, durante a semana 3/no dia 22, durante a semana 4/no dia 21, durante a semana 4/no dia 22, enquanto se refere à mesma programação de dosagem. Para consistência, a primeira semana de dosagem será denominada no presente documento como semana 0, enquanto o primeiro dia de dosagem será denominado como dia 1. Entretanto, será entendido por um técnico versado na técnica que essa convenção de nomeação é simplesmente usada para consistência e não deve ser interpretada como limitante, isto é, a dosagem semanalmente é a provisão de uma dose semanal do anticorpo anti- CD40, por exemplo, mAb1, independentemente de o médico se referir a uma semana particular como "semana 1" ou "semana 2". Os exemplos de regimes de dosagem, conforme observado no presente documento, são encontrados nas Figuras 1 e 2. Será entendido que uma dose não precisa ser fornecida em um ponto no tempo exato, por exemplo, uma dose aproximadamente no dia 29 pode ser fornecida, por exemplo, no dia 24 ao dia 34, por exemplo, dia 30, enquanto for fornecida na semana apropriada.

[0195] Conforme usado no presente documento, a expressão "recipiente que tem uma quantidade suficiente do anticorpo anti-CD40 para permitir a entrega de [uma dose designada]" é usada para significar que um dado recipiente (por exemplo, frasco, caneta, seringa) tem disposto no mesmo um volume de um anticorpo anti-CD40 (por exemplo, como parte de uma composição farmacêutica) que pode ser usado para fornecer uma dose desejável. Como exemplo, se uma dose desejável é 500 mg, então, um clínico pode usar 2 ml de um recipiente que contém uma formulação de anticorpo anti-CD40 com uma concentração de 250 mg/ml, 1 ml de um recipiente que contém uma formulação de anticorpo anti-CD40 com uma concentração de 500 mg/ml, 0,5 ml de um recipiente contém uma formulação de anticorpo anti-CD40 com uma concentração de 1.000 mg/ml, etc. Em cada tal caso, esses recipientes têm uma quantidade suficiente do anticorpo anti-CD40 para permitir a entrega da dose de 500 mg desejável.

[0196] Conforme usado no presente documento, a expressão "formulada em uma dosagem para permitir a entrega [rota de administração] de [uma dose designada]" é usada para se entender que uma dada composição farmacêutica pode ser usada para fornecer uma dose desejável de um anticorpo anti-CD40, por exemplo, mAb1, por meio de uma rota designada de administração (por exemplo, s.c. ou i.v.). Como um exemplo, se uma dose subcutânea desejável é 500 mg, então, um clínico pode use 2 ml de uma formulação de anticorpo anti- CD40 que tem uma concentração de 250 mg/ml, 1 ml de uma formulação de anticorpo anti-CD40 que tem uma concentração de 500 mg/ml, 0,5 ml de uma formulação de anticorpo anti-CD40 que tem uma concentração de 1.000 mg/ml, etc. Em cada tal caso, essas formulações de anticorpo anti-CD40 estão em uma concentração alta o suficiente para permitir a entrega subcutânea do anticorpo anti-CD40. A entrega subcutânea necessita tipicamente da entrega de volumes menores do que cerca de 2 ml, preferencialmente um volume de cerca de 1ml ou menos. Entretanto, volumes mais altos podem ser entregues ao longo do tempo com o uso de, por exemplo, um mecanismo de emplastro/bomba.

[0197] É revelado no presente documento o uso de um anticorpo anti-CD40 (por exemplo, mAb1) para a fabricação de um medicamento para o tratamento de síndrome de Sjögren em um paciente, em que o medicamento é formulado para compreender recipientes, em que cada recipiente tem uma quantidade suficiente do anticorpo anti-CD40 para permitir a entrega de pelo menos cerca de 75 mg, 150 mg, 300 mg ou 600 mg de anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1) por dose unitária.

[0198] É revelado no presente documento o uso de um anticorpo anti-CD40 (por exemplo, mAb1) para a fabricação de um medicamento para o tratamento de síndrome de Sjögren em um paciente, em que o medicamento é formulado em uma dosagem para permitir a entrega sistêmica (por exemplo, entrega i.v. ou s.c.) de 75 mg, 150 mg, 300 mg de 600 mg de anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, mAb1) por dose unitária.

4. Kits

[0199] A revelação também abrange kits para tratar um paciente com síndrome de Sjögren (conforme o caso) com um anticorpo anti- CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, mAb1. Tais kits compreendem um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, mAb1 (por exemplo, em forma líquida ou liofilizada) ou uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti-CD40 (descrito acima). Adicionalmente, tais kits podem compreender meios para administrar o anticorpo anti- CD40 (por exemplo, uma seringa e frasco, uma seringa pré-carregada,

uma caneta pré-carregada, um emplastro/bomba) e instruções para uso. As instruções podem revelar o fornecimento do anticorpo anti- CD40 (por exemplo, mAb1) ao paciente como parte de um regime de dosagem específico. Esses kits também podem conter agentes terapêuticos adicionais (descritos acima) para tratar psoríase, por exemplo, para entrega em combinação com o anticorpo anti-CD40 envolvido, por exemplo, mAb1.

[0200] A expressão "meios para administrar” é usada para indicar qualquer implantação disponível para administrar sistemicamente um fármaco a um paciente, incluindo, mas sem limitação, uma seringa pré- carregada, um frasco e seringa, uma caneta de injeção, um autoinjetor, uma bolsa de gotejamento i.v., uma bomba, uma bomba de emplastro, etc. Com tais itens, um paciente pode se autoadministrar o fármaco (isto é, administrar o fármaco por si próprio) ou um auxiliar de enfermagem ou um médico pode administrar o fármaco.

[0201] São revelados no presente documento os kits para o tratamento de um paciente que tem síndrome de Sjögren, que compreende: a) uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; b) meios para administrar o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao paciente; e c) instruções que fornecem de modo subcutâneo a administração de um anticorpo anti-CD40, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a um paciente que necessita do mesmo como uma dose de cerca de 3 a cerca de 30 mg de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano, três vezes, semana sim, semana não, seguido por dosagem mensal de cerca de 3 a cerca de 30 mg, como 10 mg, de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano, ou em cerca de 150 mg, cerca de 300 mg ou cerca de 600 mg, semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente durante um regime de manutenção.

[0202] Em uma modalidade específica, um uso é fornecido, de a) uma composição farmacêutica líquida que compreende um anticorpo anti-CD40, um tampão, um estabilizador e um solubilizante, e meios para administrar de modo subcutâneo o anticorpo anti-CD40 a um paciente que tem síndrome de Sjögren, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de síndrome de Sjögren, em que o anticorpo anti-CD40:

[0203] (i) deve ser administrado de modo intravenoso ao paciente com uma dose de cerca de 3 a cerca de 30 mg, como 10 mg, de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano, três vezes, semana sim, semana não; e

[0204] (ii) após isso, deve ser administrado de modo intravenoso ao paciente, como em doses mensais de cerca de 3 a cerca de 30 mg, como 10 mg, de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano, em que o dito anticorpo anti-CD40 é selecionado dentre o grupo que consiste em:

[0205] a) um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8;

[0206] b) um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;

[0207] c) um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ

ID NO: 13;

[0208] d) um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 14;

[0209] e) um anticorpo anti-CD40 que compreende uma região de IgG1 de Fc silenciosa: e

[0210] f) um anticorpo anti-CD40 que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 10; ou a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

[0211] Em outra modalidade específica, um uso é fornecido, de a) uma composição farmacêutica líquida que compreende um anticorpo anti-CD40, um tampão, um estabilizador e um solubilizante, e meios para administrar de modo subcutâneo o anticorpo anti-CD40 a um paciente que tem síndrome de Sjögren, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de síndrome de Sjögren, em que o anticorpo anti-CD40:

[0212] i) deve ser administrado de modo subcutâneo ao paciente com uma dose de cerca de 150 mg de substância ativa, cerca de 300 mg de substância ativa ou cerca de 600 mg de substância ativa (semanalmente ou quinzenalmente); e

[0213] ii) após isso, deve ser administrada de modo subcutâneo ao paciente como doses semanais, quinzenais ou mensais (a cada quatro semanas) de cerca de 150 mg de substância ativa, cerca de 300 mg de substância ativa ou cerca de 600 mg de substância ativa, em que o dito anticorpo anti-CD40 é selecionado dentre o grupo que consiste em:

[0214] a) um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8;

[0215] b) um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;

[0216] c) um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 13;

[0217] d) um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 14;

[0218] e) um anticorpo anti-CD40 que compreende uma região de IgG1 de Fc silenciosa: e

[0219] f) um anticorpo anti-CD40 que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 10; ou a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 12. Exemplo 2. Farmacologia

1. Farmacologia primária

[0220] mAb1 se liga a CD40 humano com alta afinidade (Kd de 0,3 nM). Entretanto, o mesmo não se liga a receptores de Fcγ (incluindo

CD16) ou media a citotoxicidade celular dependente de anticorpo ou citotoxicidade dependente de complemento. mAb1 inibe a ativação induzida por CD154 recombinante (rCD154) de leucócitos humanos, mas não induz à proliferação de PBMC ou produção de citocina por células dendríticas derivadas de monócito (DCs). mAb1 se liga a CD40 de primata não humano e humano com afinidades muito similares.

[0221] In vivo, mAb1 bloqueia as respostas de anticorpo dependentes de célula T primárias e secundárias (TDAR), e podem prolongar a sobrevivência de aloenxertos de rim em primatas não humanos (Cordoba et al 2015). Além disso, mAb1 pode romper centros germinais estabelecidos (GCs) in vivo.

[0222] A ocupação de receptor de CD40 e atividade funcional foram simultaneamente avaliadas in vitro com o uso de culturas sanguíneas totais humanas. A atividade funcional foi quantificada por meio de expressão induzida por CD154 de CD69 (o marcador de ativação) em células positivas CD20 (células B) e a ocupação de CD40 foi monitorada com o uso de mAb1 identificado fluorescente. A ocupação de CD40 quase completa por mAb1 foi necessária para inibição completa de expressão de CD69 induzida por rCD154.

2. Farmacologia secundária

[0223] Os efeitos de mAb1 na função de plaqueta e hemostase sanguínea foram investigados, indicando que mAb1 não induz respostas de agregação de plaqueta, em vez disso, exibe certos efeitos inibidores amenos em agregação de plaqueta em altas concentrações. Exemplo 3. Toxicologia não clínica e farmacologia de segurança

[0224] Os estudos de toxicologia com mAb1 não revelaram quaisquer toxicidades de órgão significantes, incluindo nenhuma evidência de eventos tromboembólicos, conforme relatado em testes clínicos com mAbs anti-CD154 (Kawai et al 2000). Em um estudo de macaco reso GLP de 13 semanas (dosagem semanal em 10, 50 e 150 mg/kg), a celularidade linfoide aumentada foi observada em 5/22 animais, o que foi considerado como devido à infecção contínua, uma observação consistente com a farmacologia de mAb1. Lesões inflamatórias nos rins e pulmões de 2 animais tratados com 50 mg/kg foram observadas, e em um dos dois animais, lesões nos olhos e traqueia também foram observadas. Embora um efeito direto de mAb1 no rim e no pulmão não possam ser excluídos, o peso de evidência incluindo confirmação de patógenos oportunísticos, sugere que estas constatações são provavelmente secundárias para imunossupressão mediada por mAb1 e de uma origem infecciosa. Em vista destas constatações inflamatórias, o Nível de Efeito Adverso Não Observado (NOAEL) para o estudo de toxicidade de 13 semanas foi definido em 10 mg/kg. Em um estudo de toxicidade crônica de 26 semanas em macacos cinomolgos, nenhuma constatação relacionada a mAb1 adversa foi constatada. Com base nesses dados, o NOAEL foi definido em 150 mg/kg (26 semanas). A Cmax,ss média (todos os animais) foi de 44, 3.235 e 9.690 μg/ml em 1, 50 e 150 (NOAEL) mg/kg S.C. em aplicações semanais, respectivamente. O NOAEL derivado do estudo de macaco cinomolgo de 26 semanas é considerado o mais relevante para sustentar o regime de dosagem clínica.

[0225] A avaliação histológica post mortem e imuno-histológica revelou uma diminuição em GCs em áreas de célula B cortical do baço e tecidos linfáticos. Os animais em recuperação mostraram alguns casos de celularidade de linfonodo com áreas de célula T normais e áreas de célula B aumentadas, o que é coerente com a reconstituição de GCs após a retirada do fármaco. Os animais em recuperação puderam montar um TDAR primário para hemocianina de lapa californiana (KLH) imediatamente após níveis sanguíneos de mAb1 terem caído abaixo do nível necessário para ocupação de receptor completa.

[0226] Devido à inibição completa de respostas de anticorpo dependentes de célula T (TDAR), KLH, a formação de anticorpos antifármaco (ADA) para mAb1 não é esperada e, portanto, os efeitos colaterais relacionados a ADA são considerados improváveis quando as concentrações de mAb1 são mantidas continuamente em níveis farmacológicos.

[0227] Os estudos de reatividade cruzada revelaram que CD40 não está apenas presente em células imunes, como também em vários tecidos. Isso é principalmente devido a sua expressão em células endoteliais e epiteliais, em que CD40 é envolvido na sinalização como em resposta a processos de cura de lesão, regulação crescente de defesa de vírus, e mediadores relacionados de modo inflamatório. Não se espera que um anticorpo monoclonal anti-CD40 antagonista, como mAb1, contribua para os processos inflamatórios, que foi confirmado por estudos in vitro com o uso de células endoteliais de veio umbilical humano (HUVEC).

[0228] Estudos de toxicidade reprodutiva em conformidade com diretrizes não foram conduzidos até então. Entretanto, um estudo de desenvolvimento embrião-fetal (EFD) de constatação de faixa de dose em coelhos foi conduzido a fim de confirmar o coelho como espécies de toxicologia reprodutiva relevante. Nenhum efeito no desenvolvimento embrião-fetal foi observado e não houve má formação externa fetal relacionada ao tratamento em qualquer grupo.

[0229] Em conclusão, os dados não clínicos suportam os primeiros estudos de múltiplas doses em pacientes com síndrome de Sjögren primária. Exemplo 4. Farmacocinética não clínica e farmacodinâmica

1. Farmacocinética (PK)

[0230] Típico para imunoglobulinas IgG, a rota primária de eliminação de mAb1 é provavelmente por meio de catabolismo proteolítico, que ocorre em sítios que estão em equilíbrio com plasma. Além disso, a ligação e a internalização de complexos mAb1-CD40 resultaram em rotas de depuração rápidas e saturáveis. Isso foi ilustrado por perfis de concentração-tempo de soro de mAb1 não linear que mostram um ponto de inflexão em cerca de 10 a 20 μg/ml. A contribuição da depuração mediada por CD40 para a depuração geral depende da concentração de mAb1, juntamente com os níveis de expressão de CD40, internalização e taxas de rotatividade de receptor. Para concentrações séricas de mAb1 >10 a 20 μg/ml, a cinética linear é esperada, enquanto uma cinética não linear emergiu em concentrações mais baixas.

2. Farmacodinâmica (PD)

[0231] Em um estudo PK/PD em macacos cinomolgos, o ponto de inflexão (cerca de 10 μg/ml) nos perfis PK foi associado a uma queda de saturação de CD40, conforme determinado em um ensaio de saturação alvo de linfócito independente. Como tal, esse ponto de inflexão é visto como um marcador para o nível de saturação de CD40, e uma evidência para engate alvo

[0232] O enlace entre a ocupação de CD40 e atividade farmacodinâmica foi adicionalmente demonstrado em macacos resos imunizados com KLH. Os macacos foram imunizados com KLH três vezes (o primeiro foi cerca de 3 semanas antes da dosagem, o segundo foi 2 semanas após a administração de mAb1 e o terceiro foi após a remoção completa de mAb1). A ocupação de CD40 por mAb1 em concentrações de plasma >40 μg/ml no momento da segunda vacinação de KLH impediu completamente as respostas de anticorpo de memória. Uma vez que o mAb1 foi limpo, todos os animais montaram uma resposta de anticorpo de memória completa com o terceiro KLH. Esses resultados sugerem que a função de células B de memória pré- existentes não foram afetadas. Após a eliminação completa de mAb1, a imunização com toxoide tetânico (TTx) levou a títulos de anti-TTx- IgG/IgM similares a animais não tratados e demonstrou que o TDAR completo foi recuperado novamente após a eliminação de mAb1.

3. Imunogenicidade

[0233] Conforme esperado a partir de um fármaco imunossupressor, os dados de imunogenicidade em macaco reso (dose única) estão em concordância com os resultados da experiência KLH- TDAR e confirmaram que nenhuma resposta imune contra mAb1 pode ser montada sob ocupação de CD40 completa por mAb1.

4. Regimes terapêuticos

[0234] Com base na farmacocinética e perfis farmacodinâmicos de mAb1, e o resultado de estudos clínicos e pré-clínicos de mAb1, os seguintes regimes terapêuticos podem ser usados.

[0235] Em uma modalidade (consultar a Figura 24A, 1), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em duas doses de 600 mg de mAb1, administradas com uma semana entre as duas doses, seguida por uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 600 mg de mAb1, administradas a cada 2 semanas (Q2W). A dose de 600 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto de fármaco (150 mg/ml).

[0236] Em outra modalidade (consultar Figura 24A, 2), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 300 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida por uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 600 mg de mAb1, administradas a cada 2 semanas (Q2W). A dose de 300 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto de fármaco (150 mg/ml). A dose de 600 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto de fármaco (150 mg/ml).

[0237] Em ainda outra modalidade (consultar Figura 24A, 3), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 150 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida por uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 600 mg de mAb1, administradas a cada 2 semanas (Q2W). A dose de 150 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 1 ml de produto de fármaco (150 mg/ml), alternativamente através de 1 injeção de 2 ml de produto de fármaco diluída em 0,5 vezes (75 mg/ml). A dose de 600 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto de fármaco (150 mg/ml).

[0238] Em uma modalidade (consultar a Figura 24B, 1), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em duas doses de 600 mg de mAb1, administradas com uma semana entre as duas doses, seguida por uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 300 mg de mAb1, administradas a cada 2 semanas (Q2W). A dose de 600 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto de fármaco (150 mg/ml). A dose de 300 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto de fármaco (150 mg/ml).

[0239] Em outra modalidade (consultar Figura 24B, 2), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 300 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida por uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 300 mg de mAb1, administradas a cada 2 semanas (Q2W). A dose de 300 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto de fármaco (150 mg/ml). A dose de 600 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto de fármaco (150 mg/ml).

[0240] Em ainda outra modalidade (consultar Figura 24B, 3), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 150 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida por uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 300 mg de mAb1, administradas a cada 2 semanas (Q2W). A dose de 150 mg é preferencialmente administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 1 ml de produto de fármaco (150 mg/ml), alternativamente através de 1 injeção de 2 ml de produto de fármaco diluída em 0,5 vezes (75 mg/ml). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml). A dose de 300 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml).

[0241] Em uma modalidade (cf. Figura 24C, 1), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em duas doses de 600 mg de mAb1, administradas com uma semana entre as duas doses, seguido de uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 150 mg de mAb1, administradas a cada 2 semanas (Q2W). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml). A dose de 150 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 1 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml),

alternativamente através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico diluído ½ vezes (75 mg/ml).

[0242] Em uma outra modalidade (cf. Figura 24C, 2), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 300 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida de uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 150 mg de mAb1, administradas a cada 2 semanas (Q2W). A dose de 300 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml). A dose de 150 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 1 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml), alternativamente através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico diluído ½ vezes (75 mg/ml).

[0243] Em ainda outra modalidade (cf. Figura 24C, 3), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 150 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida de uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 150 mg de mAb1, administradas a cada 2 semanas (Q2W). A dose de 150 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 1 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml), alternativamente através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico diluído ½ vezes (75 mg/ml). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml). A dose de 300 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml).

[0244] Em uma modalidade adicional, (cf. Figura 25A, 1), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em duas doses de 600 mg de mAb1, administradas com uma semana entre as duas doses, seguido de uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 600 mg de mAb1, administradas a cada 4 semanas (Q4W). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml).

[0245] Em uma outra modalidade (cf. Figura 25A, 2), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 300 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida de uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 600 mg de mAb1, administradas a cada 4 semanas (Q4W). A dose de 300 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml).

[0246] Em ainda outra modalidade (cf. Figura 25A, 3), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 150 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida de uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 600 mg de mAb1, administradas a cada 4 semanas (Q4W). A dose de 150 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 1 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml), alternativamente através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico diluído ½ vezes (75 mg/ml). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo;

através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml).

[0247] Em uma modalidade adicional, (cf. Figura 25B, 1), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em duas doses de 600 mg de mAb1, administradas com uma semana entre as duas doses, seguido de uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 300 mg de mAb1, administradas a cada semana (Q1W). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml). A dose de 300 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml).

[0248] Em uma outra modalidade (cf. Figura 25B, 2), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 300 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida de uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 300 mg de mAb1, administradas a cada semana (Q1W). A dose de 300 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml).

[0249] Em ainda outra modalidade (cf. Figura 25B, 3), o regime terapêutico de mAb1 consiste em uma dosagem de carregamento que consiste em uma primeira dose de 600 mg de mAb1, e uma segunda dose de 150 mg de mAb1, em que a segunda dose é administrada uma semana após a primeira dose, seguida de uma dosagem de manutenção que consiste em doses de 300 mg de mAb1, administradas a cada semana (Q1W). A dose de 150 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 1 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml), alternativamente através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico diluído ½ vezes (75 mg/ml). A dose de 300 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 1 injeção de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml). A dose de 600 mg é, de preferência, administrada de modo subcutâneo; através de 2 injeções de 2 ml de produto farmacêutico (150 mg/ml).

[0250] Uma vantagem de ter um regime terapêutico dividido em uma parte de dosagem de carregamento e uma parte de dosagem de manutenção é que isso permite o efeito terapêutico ideal.

[0251] Para todos os regimes terapêuticos descritos no presente documento, o propósito da dosagem de carregamento é alcançar a saturação alvo (concentrações plasmáticas próximas a 40 µg/ml) e, dessa forma, o início do efeito terapêutico, e o propósito da dosagem de manutenção é sustentar a eficácia. Exemplo 5. Dados de tolerabilidade e segurança humana

[0252] A segurança, tolerabilidade, atividade PK e PD de mAb1 estão sendo analisadas em um estudo de dose única ascendente, randomizado, duplo cego, controlado por placebo, em andamento de mAb1 em indivíduos saudáveis e pacientes com artrite reumatoide (RA). Um total de 48 indivíduos foram inscritos: 36 indivíduos saudáveis que receberam doses únicas de mAb1 até 3 mg/kg IV ou S.C., e 12 pacientes com RA, dos quais 6 receberam doses únicas de mAb1 a 10 mg/kg IV. Em geral, as doses únicas até 3 mg/kg de mAb1 em voluntários saudáveis e uma única de 10 mg/kg de mAb1 em pacientes de RA foram seguras e bem toleradas e nenhum evento adverso grave suspeito (SAE) ocorreu. Uma investigação da dose de 30 mg/kg IV está em andamento em pacientes de RA. À medida que esse estudo ainda está em andamento, todos os dados clínicos são de natureza preliminar e com base em análises interinas conduzidas até uma dose de 10 mg/kg em pacientes de RA.

Exemplo 6. Farmacodinâmica e farmacocinética humana (voluntários saudáveis e pacientes com artrite reumatoide)

[0253] Em indivíduos saudáveis, bem como em pacientes com artrite reumatoide, após uma administração única IV ou SC, os perfis PK de CFZ533 foram consistentes com a disposição mediada por alvo resultando em perfis PK não lineares e depuração mais rápida quando a ocupação de receptor de CD40 diminuiu abaixo de aproximadamente 90%.

[0254] Apesar de alguma variabilidade interindivíduo nos perfis PK a partir dos indivíduos chineses, a disposição de CFZ533 em indivíduos chineses foi geralmente similar a indivíduos não chineses, e o engajamento do alvo também foi similar (cerca de 4 semanas) após 3 mg/kg IV de CFZ533. Nesse nível de dose, perfis PK/PD similares foram demonstrados através de perfis de CFZ533 livres em plasma, ocupação de CD40 em células B periféricas que medem CD40 livre e CD40 total, e concentrações de sCD40 total em plasma.

[0255] Após a administração SC em indivíduos saudáveis, CFZ533 foi rapidamente absorvido e distribuído alinhado com o que é esperado para um anticorpo IgG1 típico em ser humano. Em 3 mg/kg SC, CFZ533, em geral, atingiu um pico em 3 dias pós-dose (7 dias para 2 indivíduos), e 1 semana após a dosagem as concentrações plasmáticas se situaram na mesma faixa que após a IV. Em 3 mg/kg SC, a duração do engajamento do alvo também foi de cerca de 4 semanas.

[0256] Em pacientes com artrite reumatoide em 10 mg/kg IV, conforme medido por CD40 livre em células B de sangue total em comparação com a pré-dose média, e perfis de sCD40 total em plasma, a ocupação de CD40 completa foi geralmente mantida durante 8 semanas. Em 30 mg/kg IV, os perfis PK e de sCD40 total em plasma são consistentes com a duração do engajamento do alvo de 16 semanas.

[0257] Em indivíduos saudáveis, o envolvimento de CD40 por CFZ533 geralmente levou a uma diminuição em CD40 total em células B periféricas em cerca de 50%, rastreando a ocupação de CD40 em células B conforme medido por CD40 livre em células B. Isso é provavelmente devido à internalização e/ou liberação do CD40 ligado à membrana mediante a ligação a CFZ533. Em pacientes com artrite reumatoide, a diminuição em CD40 total em células B periféricas não foi confirmada.

[0258] A relação entre CFZ533 em plasma e ocupação de CD40 em células B de sangue total (CD40 livre em células B) foi definida, e as concentrações de CFZ533 de 0,3 a 0,4 µg/ml foram associadas à ocupação completa (definida como ≥ 90%) de CD40 em células B de sangue total.

[0259] De modo mais genérico, vias de eliminação específicas e não específicas foram identificadas para CFZ533. A via de alta capacidade e não específica mediada por receptores FcRn é comumente compartilhada por IgGs endógenas. A disposição mediada por alvo específica de CFZ533 levou à formação de complexos CFZ533- CD40 que foram parcialmente internalizados (com degradação lisossômica subsequente) e/ou liberados da membrana. Os processos mediados por alvo resultaram em disposição saturável e não linear de CFZ533. A formação de complexos CFZ533-CD40 era dependente da dose/concentração, com a saturação ocorrendo em altas concentrações de CFZ533.

[0260] Em geral, a disposição de CFZ533 depende da contribuição relativa das vias de eliminação específicas (mediadas por alvo) e não específicas para a depuração geral de CFZ533. O comportamento PK não linear foi observado quando as concentrações de CFZ533 foram menores que aquelas do alvo, enquanto que em concentrações mais altas com receptores de CD40 sendo saturados, as vias não específicas predominam e a eliminação de CFZ533 foi linear.

[0261] Como esperado para um anticorpo IgG1 típico que alveja um receptor ligado à membrana e que demonstra disposição mediada por alvo, a extensão da exposição de CFZ533 (AUClast) aumentou mais do que o aumento em dose (hiperproporcionalidade). Consequentemente, espera-se que isso esteja associado a uma diminuição no volume de distribuição e depuração de CFZ533 em doses mais altas.

[0262] Um indivíduo em 1 mg / kg IV de CFZ533 (1 semana de ocupação de CD40 completa) desenvolveu anticorpos específicos para CFZ533 detectados 6 semanas após as concentrações plasmáticas de CFZ533 estarem abaixo do limite de quantificação e definitivamente baixas demais para bloquear quaisquer efeitos relevantes da via CD40 em tecido. A presença de anticorpos antifármacos (ADAs) nesse indivíduo não comprometeu a exposição e não foi associada a um sinal de segurança relacionado à imunidade. Isso corresponde a uma incidência de ADA de 2% neste estudo.

[0263] Uma dose única de 3 mg / kg (IV e SC) de CFZ533 suprimiu de modo transitório as respostas anti-KLH à primeira imunização com KLH, em concentrações de CFZ533 que correspondem à ocupação total (≥90%) de receptor (por cerca de 3 a 4 semanas). As respostas primárias anti-KLH foram detectadas em todos os indivíduos à medida que a concentração de CFZ533 e a ocupação de receptor acompanhante declinaram. Todos os indivíduos tiveram capacidade para montar respostas de memória a uma segunda imunização com KLH (administrada depois que a perda de ocupação de receptor foi antecipada).

[0264] Os dados sugerem que o envolvimento de CD40 por CFZ533 impediu a ativação de células B mediada por CD154 humano recombinante (rCD154) em sangue total humano. A expressão de CD69 induzida por rCD154 nas células B foi geralmente suprimida durante um período que corresponde à ocupação de CD40 completa em células B. Quando a ocupação de CD40 estava incompleta, a atividade funcional de rCD154 foi restaurada.

[0265] Não houve evidência de qualquer efeito de CFZ533 em dados de imunofenotipagem. Exemplo 7. Um estudo de grupo paralelo multicêntrico, randomizado, duplo cego, controlado por placebo para avaliar a segurança, tolerabilidade, farmacocinética e eficácia preliminar de CFZ533 em pacientes com síndrome de Sjögren primária

[0266] Para avaliar a adequação do uso de anticorpos monoclonais anti-CD40 humanos com atividade de ADCC silenciada no tratamento da síndrome de Sjögren, um estudo clínico foi projetado e conduzido com o uso do anticorpo CFZ533, também chamado no presente documento de mAb1.

[0267] A síndrome de Sjögren (SS) pode ser primária ou está muitas vezes associada a outras doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou artrite reumatoide (RA). Nesse caso, SS é chamada de secundária. Os pacientes com síndrome de Sjögren secundária foram excluídos dos ensaios clínicos de CFZ533 devido ao fato de que a doença primária (por exemplo, RA ou SLE) e seus tratamentos concomitantes iriam interferir significativamente na avaliação de SS primária. Por exemplo, o envolvimento/dano conjunto em RA tornaria o domínio de artralgia de ESSDAI não interpretável ou o tratamento anti- TNF não seria compatível com o uso de CFZ533. Entretanto, à medida que a patogênese de SS secundária é conduzida pelos mesmos eventos patobiológicos em pSS, como a formação de centro germinativo e a formação de autoanticorpo mediadas pela ativação anormal da via CD40-CD154, espera-se que o tratamento com CFZ533 seja benéfico em SS secundária, justificando ensaios clínicos dedicados.

[0268] A síndrome de Sjögren primária (pSS) é uma doença autoimune progressiva e sistêmica caracterizada pela formação de centros germinativos ectópicos em glândulas exócrinas e pela disfunção de glândulas secretoras. Um subconjunto de pacientes também desenvolve manifestações extraglandulares. CFZ533 é um anticorpo monoclonal inovador que bloqueia de maneira potente e seletiva CD40, um receptor da via coestimulatória essencial para reações de centro germinativo e outras funções mediadas por sistema imunológico implicadas na patogênese de pSS. Um estudo de prova de conceito (PoC) de fase IIa, randomizado, duplo cego, controlado por placebo, multicêntrico e cruzado parcial foi conduzido para avaliar a segurança, tolerabilidade e eficácia de CFZ533 em pacientes com pSS.

[0269] Várias linhas de evidência sugerem que a patologia da doença conduzida por, ou intimamente relacionada à, via CD40-CD154 é essencial em pSS. Os recursos de diagnóstico distintivos de pSS incluem hiper-reatividade de células B, como a formação de estruturas semelhantes ao centro germinativo em glândulas salivares (observadas em 18 a 59% dos pacientes) e autoanticorpos (Vossenkämper et al 2012). Em lesões de pSS, as células T ativadas predominam e têm capacidade para provocar a hiperatividade de células B, secreção de Ig e facilitar a destruição de glândulas (Manganelli e Fietta 2003). Além disso, os infiltrados de células T e B nas glândulas salivares desses pacientes mostram regulação ascendente de CD40 e CD154. A inflamação de tecido mediada por CD40-CD154 também pode contribuir para a patogênese de pSS.

[0270] Adicionalmente, a inflamação de tecido mediada por CD40- CD154 também pode contribuir para a patogênese de pSS. As linhagens de células epiteliais derivadas de pacientes com pSS têm CD40 superficial constitutivamente regulado de modo ascendente (Dimitriou et al 2002). Tem sido relatado níveis aumentados de micropartículas derivadas de plaquetas e também de leucócitos,

juntamente com concentrações elevadas de sCD154 (Sellam et al 2009).

[0271] 1. Projeto do estudo de prova de conceito CCFZ533X2203 em SS

[0272] Esse é um estudo duplo-cego seguido por um estudo aberto, não confirmatório, de grupo paralelo, placebo-controlado, randomizado, para avaliar a segurança, tolerabilidade, farmacocinética e eficácia clínica preliminar de doses múltiplas de CFZ533 nas seguintes Coortes 1 e 2:

[0273] • Coorte 1: 3 mg/kg de CFZ533 administrados de modo subcutâneo em pacientes com pSS, de uma maneira duplo cega e controlada por placebo, seguido de tratamento aberto;

[0274] • Coorte 2: 10 mg/kg de CFZ533 administrados por infusão intravenosa em pacientes com pSS, de uma maneira duplo cega e controlada por placebo, seguido de tratamento aberto;

[0275] Essas coortes foram seguidas de uma parte aberta, randomizada, de grupo paralelo, não confirmatória da Coorte 3:

[0276] • Coorte 3: No braço de tratamento 1, CFZ533 foi dado a 600 mg s.c. semanalmente em 4 ocasiões (regime de carregamento), seguido de 300 mg s.c. semanalmente em 9 ocasiões (regime de manutenção a partir do Dia 29 de estudo).

[0277] No braço de tratamento 2, o regime de carregamento foi uma dose única i.v. de 10 mg/kg de CFZ533 (no Dia 1 de estudo), seguido de 300 mg s.c. semanalmente em 12 ocasiões (regime de manutenção a partir do Dia 8 de estudo).

[0278] Nas Coortes 1 e 2, a randomização será estratificada pela ingestão de linha de base de corticoesteroides orais (sim/não). Não haverá estratificação na Coorte 3.

[0279] O estudo compreende três períodos para a Coorte 1 e a Coorte 2:

[0280] 1. período controlado por placebo (a partir do Dia 1, Semana 1, até a conclusão das avaliações pré-dose no Dia 85, Semana 13), durante o qual 4 doses de CFZ533 ou placebo foram administradas sobre a terapia de padrão de cuidados (por exemplo, corticosteroide em baixa dose) que é necessária para tratar pSS;

[0281] 2. período aberto (a partir da dosagem no Dia 85, Semana 13, até a conclusão das avaliações no Dia 169, Semana 25), quando todos os pacientes receberam 4 doses do tratamento com CFZ533 aberto, e

[0282] 3. período de acompanhamento (Semanas 25 a 32), quando os pacientes são acompanhados sem medicação de estudo.

[0283] A Figura 1 é uma representação esquemática do projeto de estudo das Coortes 1 e 2.

[0284] A Coorte 3 compreende dois períodos:

[0285] 1. período de tratamento aberto (a partir da dosagem no Dia 1, Semana 1 até a última dose e conclusão das avaliações no Dia 85, Semana 13),

[0286] 2. período de acompanhamento (a partir da Semana 13 após a conclusão da última dose ao Dia 141, Semana 21), quando os pacientes são acompanhados por 8 semanas sem medicação de estudo.

[0287] No período de tratamento aberto, a dosagem do braço de tratamento 1 começa com 600 mg s.c. de CFZ533 uma vez por semana durante 4 semanas; no braço de tratamento 2, a dosagem começa com 10 mg/kg i.v. de CFZ533 no Dia 1.

[0288] Depois disso, a dosagem continua com 300 mg s.c. de CFZ533 uma vez por semana durante 4 semanas (braço de tratamento 1) e durante 9 semanas (braço de tratamento 2), respectivamente.

[0289] A Figura 2 é uma representação esquemática do projeto de estudo da Coorte 3.

Coorte 1

[0290] Essa coorte randomizou aproximadamente 12 pacientes. Para cada paciente, houve um período de triagem a partir do Dia 28 ao Dia 2. Os pacientes que atenderam aos critérios de elegibilidade na triagem foram admitidos nas avaliações de linha de base. As avaliações de linha de base foram iniciadas a partir do Dia 6 para permitir a conclusão das avaliações no Dia 1 antes do tratamento no Dia 1.

[0291] Todos os resultados de avaliação de segurança de linha de base estavam disponíveis antes da dosagem e do atendimento aos critérios de elegibilidade. Os pacientes elegíveis entraram no período controlado por placebo no Dia 1 (Semana 1) e foram randomizados em uma razão de 2:1 para receber o tratamento com CFZ533 ou placebo. No dia 1, uma dose de 3 mg/kg de CFZ533 ou placebo foi administrada por injeção subcutânea (s.c.), seguida de avaliações de PK, farmacodinâmica (PD) e segurança por até 6 horas. Os pacientes foram dispensados no mesmo dia após a conclusão de todas as avaliações, desde que não houvesse preocupações com a segurança.

[0292] Os pacientes retornaram ao centro de estudo para receber três doses s.c. de CFZ533 ou placebo (as mesmas que receberam no Dia 1) no Dia 15 (Semana 3), Dia 29 (Semana 5) e Dia 57 (Semana 9), respectivamente. As avaliações de segurança e eficácia foram conduzidas nessas visitas, amostras de PK e biomarcador foram coletadas.

[0293] No Dia 85 (Semana 13), após as avaliações de segurança e outras avaliações para o final do período controlado por placebo, todos os pacientes entraram no período aberto e receberam uma dose s.c. em aberto de 3 mg/kg de CFZ533. Isso foi seguido de três doses s.c. em aberto de CFZ533 (3 mg/kg cada) no Dia 99 (Semana 15), Dia 113 (Semana 17) e Dia 141 (Semana 21), respectivamente. As avaliações de segurança e eficácia foram conduzidas nessas visitas, amostras de

PK e biomarcador foram coletadas. A ocultação do período controlado foi mantida para o investigador e o paciente até o final do estudo.

[0294] No Dia 169 (Semana 25), os pacientes fizeram avaliações durante o final do período aberto e entraram no período de acompanhamento sem nenhum medicamento de estudo administrado. Os pacientes retornaram ao centro de estudo para monitoramento de segurança durante esse período.

[0295] A visita de final de estudo ocorreu no Dia 225 (Semana 33), que incluiu avaliações de conclusão de estudo seguidas da dispensa do estudo. Coorte 2

[0296] Quando aproximadamente 12 indivíduos estavam inscritos na Coorte 1, a Coorte 2 começou a inscrição para randomizar aproximadamente 30 pacientes para ter aproximadamente 24 pacientes completando o tratamento de 12 semanas. O projeto de estudo para a Coorte 2 foi idêntico à Coorte 1, com a exceção do regime de dosagem que incluiu dosagem intravenosa múltipla de 10 mg/kg de CFZ533 seguida de avaliações PK, farmacodinâmica (PD) e de segurança por até 2 horas após o final da infusão. Adicionalmente, o peso corporal foi medido em cada visita de dosagem para calcular a dosagem de fármaco de acordo com o peso real do indivíduo (na Coorte 1, o peso de linha de base do indivíduo foi usado ao longo do estudo). Coorte 3

[0297] A Coorte 3 randomiza aproximadamente 24 pacientes para ter aproximadamente 20 pacientes (10 no braço de tratamento 1, 10 no braço de tratamento 2) completando um tratamento de 12 semanas.

[0298] Os pacientes podem permanecer em suas terapias de padrão de cuidados, desde que os tratamentos sejam mantidos em um nível constante durante o estudo.

[0299] As avaliações de segurança incluem exames físicos, ECGs,

sinais vitais, avaliações laboratoriais clínicas padrão (hematologia, química sanguínea, urinálise, teste de gravidez, coagulação sanguínea), monitoramento de eventos adversos e eventos adversos graves.

[0300] Todas as injeções s.c. e infusões i.v. ocorrem em uma instalação monitorada. Os pacientes são monitorados de perto durante pelo menos 6 horas após a injeção s.c. na Coorte 1, 2 horas após a conclusão da infusão i.v. na Coorte 2. Na Coorte 3, os pacientes são monitorados durante pelo menos 1 hora após a conclusão da infusão i.v. e 30 minutos após a injeção s.c., ou mais, a critério do investigador quanto a sinais vitais e sinais ou sintomas de eventos adversos, incluindo o desenvolvimento de uma reação à injeção. As avaliações farmacocinéticas, farmacodinâmicas e de segurança foram feitas em até 6 horas após a injeção s.c. na Coorte 1, 2 horas após a conclusão da infusão i.v. na Coorte 2, ou 1 hora após a conclusão da infusão i.v. e 30 minutos após a injeção s.c. na Coorte 3. Os indivíduos foram dispensados após essas avaliações, a critério do investigador, após análise satisfatória dos dados de segurança.

[0301] A avaliação PK inclui medições de CFZ533 livre em plasma.

[0302] Marcadores PD simultâneos: A saturação de CD40 em células B de sangue periférico (CD40 livre e CD40 total em células B, apenas nas Coortes 1 e 2), CD40 solúvel total e CD154 solúvel total (opcional, apenas nas Coortes 1 e 2) é medida em plasma de pacientes para permitir a modelagem PK/PD. Adicionalmente, os autoanticorpos são investigados, bem como alguns biomarcadores exploratórios. A imunogenicidade é avaliada através da análise quase-quantitativa de anticorpos anti-CFZ533.

[0303] Na Coorte 1 e na Coorte 2, a biópsia labial opcional é realizada em linha de base e no final do período controlado por placebo (Dia 85, Semana 13).

[0304] Uma análise interina (1ª IA) é realizada, incluindo aproximadamente 12 pacientes que completaram o período de tratamento de 12 semanas na Coorte 1. Para esses pacientes, são avaliados os dados principais de segurança e tolerabilidade e eficácia preliminar.

[0305] As análises interinas de segurança e eficácia adicionais são conduzidas para apoiar a tomada de decisão em relação ao estudo clínico atual, aos projetos de desenvolvimento clínico do patrocinador em geral ou no caso de qualquer preocupação de segurança.

2. Fundamentação da concepção do estudo Coortes 1 e 2

[0306] Duas doses diferentes (3 mg/kg s.c. e 10 mg/kg i.v.) de CFZ533 foram avaliadas em duas coortes separadas.

[0307] Uma abordagem randomizada, controlada por placebo e duplo cega foi usada para eliminar o desvio potencial no relato de dados de segurança e eficácia clínica nesse primeiro estudo exploratório em pacientes com pSS.

[0308] Os pacientes foram randomizados para CFZ533 ou placebo em uma razão de 2:1, a fim de minimizar a exposição ao placebo e reunir mais dados sobre CFZ533. A randomização estratificada foi feita a fim de limitar desequilíbrios entre os braços ativo e placebo na ingestão de linha de base de corticosteroides orais.

[0309] O período aberto administra CFZ533 a todos os pacientes, incluindo aqueles que foram administrados com placebo no período controlado por placebo. Isso fornece benefício de tratamento potencial para esses pacientes e coleta dados adicionais de segurança e eficácia para CFZ533 em pacientes com pSS. Após o período aberto, os pacientes entraram em um período de acompanhamento para qual foi escolhida uma duração de 8 semanas (12 semanas após a última dosagem com CFZ533) para permitir tempo suficiente para monitorar a segurança e explorar a duração de resposta.

[0310] Além da segurança, a eficácia estimada pelo Índice de Atividade de Doença da Síndrome de Sjögren (ESSDAI) da Liga Europeia Contra Reumatismo (EULAR) foi escolhida como um ponto final principal do estudo. A métrica ESSDAI é bem conhecida por um versado na técnica (consultar, por exemplo, Seror et al. 2011a). O ESSDAI demonstrou ser responsivo em uma análise retrospectiva de um ensaio controlado randomizado sobre rituximabe, e foi sugerido como sendo uma ferramenta sensível para avaliar a eficácia do tratamento com rituximabe (Moerman et al 2014). Os autores relataram um ESSDAI significativamente menor no grupo de rituximabe em comparação com o grupo de placebo na semana 12 e semana 24, demonstrando alguma eficácia na redução de atividade de doença nesse pequeno estudo.

[0311] De modo similar, o Índice Relatado de Paciente com Síndrome de Sjögren (ESSPRI) de EULAR é usado no estudo (consultar, por exemplo, Seror et al. 2011b) Coorte 3

[0312] Devido ao objetivo principal dessa coorte, nenhum controle de placebo é necessário e o tratamento aberto é justificado. Na Coorte 3, dois braços de tratamento são implantados para avaliar se dois regimes de carregamento (doses s.c. múltiplas no braço de tratamento 1 ou administração i.v. única no braço de tratamento 2), seguidos de um regime de manutenção (doses s.c. múltiplas, ambos os braços), definidos de 12 semanas (Dia 1 ao Dia 85) para estabelecer condições de estado estacionário para as concentrações de CFZ533 em plasma em um nível similar às concentrações mínimas observadas na Coorte 2 (regime de 10 mg/kg i.v.).

[0313] O período de acompanhamento é definido para 8 semanas (Dia 85 ao Dia 141),

[0314] (i) para seguir a eliminação de CFZ533 sob condições em que o alvo está totalmente saturado (eliminação lenta) e sob saturação incompleta de CD40 (eliminação rápida), e

[0315] (ii) para caracterizar a capacidade da via de eliminação mediada por alvo para CFZ533 após tratamento de 12 semanas.

3. Justificativa da dose/regime, duração do tratamento

[0316] Não existe experiência anterior com um agente de bloqueio anti-CD40 na síndrome de Sjögren primária humana. Entretanto, evidências apontam para o envolvimento de processos imunológicos dependentes de CD40 na fisiopatologia da doença, incluindo a presença de agregados linfoides e estruturas semelhantes a centros germinativos em glândulas salivares de indivíduos afetados, autoanticorpos específicos de doença e expressão glandular de CD40 e seu ligante. Os resultados de estudo pré-clínico e de primeira exposição no homem sugerem que a ocupação completa do receptor CD40 é necessária para a supressão total da função de células B dependente de células T, bem como o bloqueio das funções relacionadas a CD40 parenquimatoso, e seria necessária para alcançar o benefício terapêutico máximo. Por exemplo, os resultados do estudo de toxicidade de 26 semanas indicaram que, em 1 mg/kg de CFZ533 semanalmente, a ocupação de CD40 completa em células B periféricas foi medida, mas um efeito farmacológico incompleto foi observado em alguns animais (3/6), manifestando-se como redução parcial em centros germinativos.

[0317] Isto indicou que seriam necessárias doses maiores que 1 mg/kg (semanalmente) de CFZ533 para a supressão completa de interações CD40-CD154 e eventos de sinalização subsequentes em tecido.

[0318] Coorte 1 (subcutânea, 3 mg/kg)

[0319] A dose subcutânea mais alta de CFZ533 que foi testada em voluntários saudáveis atualmente é de 3 mg/kg, e provou ser segura e bem tolerada como uma dose única para voluntários saudáveis. Doses de 1 e 3 mg/kg i.v. foram associadas a 1 e 4 semanas de ocupação completa (definida como> 90%) de CD40 em células B de sangue periférico, respectivamente. Adicionalmente, a expressão de CD69 induzida por CD154 ex vivo foi suprimida por aproximadamente 4 semanas com o uso de PBMC de voluntários saudáveis que receberam 3 mg/kg de CFZ533 i.v. A ocupação de CD40 foi de 90% (média n = 6; faixa de 73 a 97%) em 4 semanas após uma dose subcutânea única de 3 mg/kg de CFZ533.

[0320] Tomados em conjunto, 3 mg/kg s.c. foi escolhido para a presente Coorte 1, à medida que essa dosagem foi segura e bem tolerada em voluntários saudáveis e poderia resultar no efeito farmacológico e farmacodinâmico desejado.

[0321] O intervalo de dosagem de 2 semanas no início foi destinado a assegurar a saturação de CD40 completa em células B periféricas, bem como a supressão completa da interação CD40-CD154 em tecidos após a administração subcutânea. No final do período de tratamento de 12 semanas, era esperado ocorrer alterações clinicamente significativas no ponto final primário e em outras leituras importantes de eficácia e biomarcador. Com base nos resultados publicados com um único ciclo de rituximabe, as respostas clínicas significativas em pacientes com pSS podem ser detectadas já na semana 5, com efeito máximo mostrado na semana 12 (Meijer et al 2010). Durante o período de extensão aberto de 12 semanas adicional, foram coletados dados adicionais relacionados à eficácia e segurança a longo prazo de CFZ533.

[0322] Coorte 2 (intravenosa, 10 mg/kg)

[0323] O regime de 10 mg/kg i.v. foi introduzido para oferecer exposições plasmáticas maiores durante todo o período de tratamento, a fim de assegurar o bloqueio completo e sustentado da via de CD40 em tecidos-alvo, em condições em que a expressão de CD40 maior é provável. Esse regime é suportado por dados de segurança em seres humanos, razões de segurança adequadas a partir de estudos toxicológicos pré-clínicos, efeitos PD relevantes em tecidos de primatas não humanos e dados recentemente publicados de ASKP1240.

[0324] Segurança e tolerabilidade confirmadas em seres humanos: Um estudo de Fase 1 (CCFZ533X2101), testando doses ascendentes únicas (0,03 a 30 mg/kg) de CFZ533 i.v. e 3 mg/kg s.c., foi concluído e não revelou grandes preocupações de segurança até a dose mais alta testada (10 mg/kg i.v.). Com base na experiência clínica até agora, o regime de dosagem de 10 mg/kg i.v. é antecipado como seguro e tolerável em pacientes com pSS.

[0325] Margem de segurança adequada de estudos toxicológicos pré-clínicos: Os estudos toxicológicos de GLP até o momento testaram CFZ533 em (i) dosagem s.c. semanal de 13 semanas de 10, 50 e 150 mg/kg (s.c. e i.v.) em macacos resos e (ii) dosagem s.c. semanal de 26 semanas de 1, 50 e 150 mg/kg em macacos cinomolgos. Esses estudos não revelaram qualquer descoberta importante que impediria o uso de CFZ533 no regime intravenoso proposto por 12 semanas ou 24 semanas. No estudo de toxicidade de 26 semanas em macaco cinomolgo, no estado estacionário, foi obtida uma concentração média de 8.300 μg/ml (Cav, ss) após a dosagem semanal de 150 mg/kg (NOAEL). A exposição sistêmica correspondente (AUC, condições de estado estacionário) durante um período de 1 mês seria de 232.400 dia * μg/ml, que é cerca de 57 vezes maior que a exposição plasmática sistêmica prevista durante o primeiro mês (AUC0-28 dias; Figura 3) No estudo toxicológico de 26 semanas, em NOAEL, Cmax,ss foi de 9.495 μg/ml, que é 24 vezes maior que a Cmax esperada (cerca de 400 μg/ml) para o regime intravenoso proposto em pacientes com pSS (Figura 3).

[0326] A Figura 3 mostra o perfil de concentração-tempo em plasma médio para CFZ533 dado intravenosamente em 10 mg/kg (Coorte 2). Os perfis PK médios foram simulados para 10 mg/kg i.v. CFZ533 dado no Dia de estudo 1, 15, 29 e 57 (período controlado por placebo) e Dia de estudo 85, 99, 113 e 141 (período aberto). Um modelo Michaelis- Menten foi aplicado com o uso de parâmetros obtidos a partir de uma análise populacional preliminar à base de modelo da Coorte 5 (3 mg/kg i.v.) de dados PK do estudo FIH CCFZ533X2101 em indivíduos saudáveis. Nenhuma experiência anterior com um agente de bloqueio anti-CD40 existiu em pSS humana, e qualquer diferença potencial na biologia de CD40 (expressão, renovação) entre indivíduos saudáveis e pacientes com pSS não foi conhecida. Era esperado que o regime i.v. proposto fornecesse, durante todo o período de tratamento, concentrações plasmáticas sustentadas acima de 40 μg/ml, para antecipar um aumento da expressão de CD40 em tecidos-alvo em pacientes com pSS. A linha pontilhada horizontal em 40 μg/ml representa a concentração plasmática acima da qual se espera bloqueio de via e ocupação completa de CD40 em tecidos-alvo (com base nos dados PD a partir do estudo toxicológico de 26 semanas em macaco cinomolgo - grupo de dose 1 mg/kg). A exposição sistêmica esperada para o primeiro mês (frequência de dosagem mais alta) é de 4.087 dias*μg/ml (57 vezes menor que a exposição plasmática sistêmica observada durante um mês no estado estacionário no estudo toxicológico de 26 semanas em cinomolgos - NOAEL em 150 mg/kg semanalmente), a Cmax esperada é de cerca de 400 μg/ml.

[0327] Efeitos PD relevantes em tecidos de primatas não humanos: No estudo toxicológico de 26 semanas (grupo de dose de 1 mg/kg), os animais com concentrações plasmáticas médias em estado estacionário ≥ 38 μg/ml tiveram uma supressão completa dos centros germinativos em áreas corticais de células B de linfonodos. Era esperado que o regime de 10 mg/kg i.v. fornecesse, durante todo o período de tratamento (controlado por placebo e aberto, consultar a Figura 3), concentrações plasmáticas sustentadas acima de 40 μg/ml, para antecipar a expressão de CD40 maior em pacientes com pSS e efeitos PD incompletos em tecido alvo devido à perda de saturação alvo.

[0328] Dados de ASKP1240, um anticorpo monoclonal que bloqueia CD40: Uma análise recente de dados de PK/eficácia revelados do anticorpo anti-CD40 de Astellas ASKP1240 no transplante de órgão sólido (Harland et al 2015) demonstrou que a depuração de anticorpo mediada por alvo eficaz em tecido poderia resultar em perda de bloqueio de CD40 e provavelmente perda de eficácia, como consequência de um aumento significativo da expressão alvo em tecidos-alvo. O regime intravenoso proposto tem por objetivo saturar, durante todo o período de tratamento, as vias de eliminação de CD40, em condições em que a expressão de CD40 maior é provável. Internamente, os dados sugerem a superexpressão de CD40 em tecidos obtidos de pacientes com síndrome de Sjögren primária (dados em arquivo), e o regime subcutâneo original pode não fornecer bloqueio de via CD40 completo e sustentado em tecidos-alvo nessas condições.

[0329] Coorte 3

[0330] Com base nos resultados a partir das Coortes 1 e 2, acredita- se que um regime de dosagem eficaz em pacientes com pSS exige um regime de carregamento (i.v. ou s.c.), fornecendo saturação de CD40 completa precoce e disposição mediada por alvo mínima (TMDD) seguido de um regime de manutenção s.c.

[0331] Na Coorte 3, a dose/regime no braço de tratamento 1 e no braço de tratamento 2 é definida(o) para avaliar se um regime de carregamento (i.v. ou s.c.), seguido de um regime de manutenção s.c., tem capacidade para entregar concentrações plasmáticas no estado estacionário similares ao regime i.v. testado na Coorte 2 e teve a capacidade de superar a disposição mediada por alvo de CFZ533 através da via s.c.

[0332] Braço de tratamento 1: CFZ533 é dado em 600 mg s.c. (4 injeções de 1 ml) semanalmente em 4 ocasiões (carregamento), seguido de 300 mg s.c. (2 injeções de 1 ml) semanalmente em 9 ocasiões (manutenção; começando no Dia 29 do estudo). Durante a fase de carregamento, a taxa de saturação do grupamento de CD40, bem como a biodisponibilidade das doses s.c., são desconhecidas. No entanto, espera-se que uma dose cumulativa de 2.700 mg durante o 1º mês (até o Dia 29) tenha tido capacidade de superar TMDD (a dose cumulativa foi de 630 e 2.100 mg no Dia 29 na Coorte 1 e na Coorte 2, respectivamente). Espera-se que o regime de carregamento semanal de 600 mg seguido de um regime de manutenção de 300 mg semanalmente entregue condições de estado estacionário no Dia 85, devido ao fato de que, quando a saturação alvo fosse atingida, a biodisponibilidade das doses subcutâneas esperada seja ≥ 75%, como para voluntários saudáveis. No braço de tratamento 1, a dose cumulativa até o Dia 85 (última dose) seria de 5.100 mg, em comparação com 1.050 e 3.500 mg, na Coorte 1 e na Coorte 2, respectivamente).

[0333] Braço de tratamento 2: o regime de carregamento consiste em uma dose única i.v. de 10 mg/kg de CFZ533 (no Dia 1 de estudo), seguido de 300 mg s.c. semanalmente em 12 ocasiões (regime de manutenção a partir do Dia 8 de estudo). No braço de tratamento 2 da Coorte 3, como já demonstrado na Coorte 2 i.v., espera-se que uma dose i.v. única de 10 mg/kg (Dia 1) forneça concentrações plasmáticas ≥ 100 μg/ml no Dia 8 de estudo (início do regime de manutenção) e condições de saturação de CD40 completa. No braço de tratamento 2, o regime de manutenção s.c. semanal é avaliado na ausência de uma disposição mediada por alvo significativa e efeito de primeira passagem

(via s.c.).

[0334] Na Coorte 3, todas as administrações subcutâneas (300 mg ou 600 mg semanalmente) são dadas em doses planas (não ajustadas ao peso corporal) para facilitar a administração e aprimorar a conveniência, à medida que cada frasco do produto farmacêutico é apresentado com 150 mg/ml de CFZ533.

[0335] Na Coorte 1 (regime s.c. de 3 mg/kg), na análise interina, o peso corporal médio é de 70,7 kg (faixa de 50,0 a 91,1 kg), que corresponde à dose plana de 212,2 mg (faixa de 150 a 273,3 mg). Na Coorte 2 (regime i.v. de 10 mg/kg), o peso corporal médio é de 72,6 kg (faixa de 50,0 a 107,2 kg), que corresponde à dose plana de 726 mg (faixa de 500 a 1.072 mg). Na Coorte 3, as doses subcutâneas de 300 mg ou 600 mg em cada ocasião estão dentro da faixa de doses já aplicadas na Coorte 1 e 2 e é improvável que tenham impacto na segurança e tolerabilidade. A maneira como o peso corporal influencia a disposição de CFZ533 não é totalmente caracterizada, mas para ambos os braços, durante todo o período de tratamento, espera-se que a concentração plasmática máxima média (Cmax) esteja abaixo de cerca de 300 μg/ml (presumindo que todas as doses subcutâneas são 100% biodisponíveis por uma questão de segurança e um peso corporal médio de 70 kg para pacientes com pSS), e não se espera que exceda a Cmax média observada na Coorte 2 (cerca de 386 μg/ml, quinta dose no Dia 85 do período controlado por placebo 1 da Coorte 2). Isso seria 32 vezes menor que os valores de Cmax (média de 9.495 μg/ml) no estudo toxicológico de 26 semanas em macaco cinomolgo, em NOAEL (150 mg/kg s.c. semanalmente).

[0336] Os pontos finais de PK/PD e imunogenicidade estão sendo avaliados durante os períodos de tratamento e acompanhamento. A Tabela 2 fornece uma sinopse de protocolo para o estudo. Tabela 2. Sinopse de protocolo

Propósito e base Esse estudo é projetado para avaliar a segurança, lógica tolerabilidade, farmacocinética, farmacodinâmica e eficácia terapêutica preliminar de doses múltiplas de anticorpo monoclonal CFZ533 em pacientes com síndrome de Sjögren primária (pSS), que fornecerá dados para o desenvolvimento adicional de CFZ533 no tratamento de pSS.

Objetivos Avaliar a segurança e tolerabilidade de múltiplas principais infusões intravenosas de CFZ533 em pacientes com síndrome de Sjögren primária, conforme medido por eventos adversos (AEs).  Comparar o efeito de múltiplas infusões intravenosas de CFZ533 versus placebo na atividade de doença clínica de pacientes com síndrome de Sjögren primária, conforme medido pela alteração do Índice de Atividade de Doença da Síndrome de Sjögren de EULAR (ESSDAI) após o tratamento de 12 semanas.

Objetivos Avaliar a segurança e tolerabilidade de múltiplas Secundários doses subcutâneas de CFZ533 em pacientes com síndrome de Sjögren primária, conforme medido por eventos adversos (AEs). Comparar o efeito de múltiplas doses subcutâneas de CFZ533 versus placebo na atividade de doença clínica de pacientes com síndrome de Sjögren primária, conforme medido pela alteração do Índice de Atividade de Doença da Síndrome de Sjögren de EULAR (ESSDAI) após o tratamento de 12 semanas. Avaliar a farmacocinética de múltiplas doses subcutâneas e múltiplas infusões intravenosas de

CFZ533 em pacientes com síndrome de Sjögren primária. Avaliar o efeito de múltiplas doses subcutâneas e múltiplas infusões intravenosas de CFZ533 versus placebo nos resultados autorrelatados em pacientes com síndrome de Sjögren primária após o tratamento de 12 semanas conforme medido pela Intensidade Relatada de Paciente com Síndrome de Sjögren de EULAR (ESSPRI), pelo questionário Short Form (36) Health Survey (SF-36) e Inventário Multidimensional de Fadiga (MFI). Avaliar as alterações na avaliação global do médico da atividade de doença geral do paciente, conforme registrado por uma escala analógica visual (VAS) após o tratamento de 12 semanas.  Avaliar as alterações na avaliação global dos pacientes de sua atividade de doença, conforme registrado por uma VAS após o tratamento de 12 semanas.

Projeto de Estudo randomizado, duplo cego, controlado por estudo placebo e não confirmatório em aproximadamente 12 pacientes na Coorte 1 e 30 pacientes na Coorte 2 e estudo randomizado aberto em aproximadamente 24 pacientes na Coorte 3. População Pacientes do sexo masculino e feminino com síndrome de Sjögren primária, com idade entre 18 e 75 anos (inclusive). Critérios de Diagnóstico da síndrome de Sjögren primária de inclusão acordo com os critérios revisados de consenso UE/EUA (Vitali et al 2002)

Atividade de doença moderada a grave com escore ESSDAI ≥ 6 Presença de autoanticorpos na triagem, conforme determinado por qualquer um dentre os seguintes: Títulos séricos elevados de ANA (≥ 1: 160) e fator reumatoide positivo (RF) ou Anti-SSA positivo Taxa de fluxo salivar total estimulado > 0 ml/min para as Coortes 1 e 2; e taxa de fluxo salivar total não estimulada > 0 ml/min para a Coorte 3. Se o paciente estiver em tratamento com glicocorticoide oral na triagem, a dose NÃO deve exceder 10 mg de prednisona ou equivalente por dia e precisa ser estável por pelo menos 2 semanas antes da randomização e pela duração do estudo; Se o paciente estiver usando cloroquina ou hidroxicloroquina na triagem, a dose precisa ser estável por pelo menos 4 semanas antes da randomização e pela duração do estudo; Se o paciente for tratado com metotrexato oral ou parenteral na triagem, a dose NÃO deve exceder 25 mg por semana por pelo menos três meses antes da randomização e precisa ser estável pela duração do estudo.  Se o paciente for tratado com azatioprina oral na triagem, a dose NÃO deve exceder 100 mg por dia por pelo menos três meses antes da randomização e deve ser estável pela duração do estudo.

Critérios de Síndrome de Sjögren secundária exclusão Uso de outros fármacos sob investigação no momento da inscrição ou estar dentro de cinco meia- vidas de uso de outros fármacos sob investigação ou mais, se exigido pelas regulamentações locais, no momento da inscrição Histórico de hipersensibilidade ao fármaco de estudo ou a fármacos de classes químicas similares Os pacientes receberam tratamento com: Ciclofosfamida dentro de 6 meses; Dose i.v. de bolo de corticoesteroide > 1 mg/kg dentro de 3 meses Rituximabe dentro de 12 meses Belimumabe dentro de 6 meses; Qualquer outro dado biológico dentro de 1 mês ou cinco vezes a meia-vida Qualquer outro imunossuppressivo como ciclosporina A ou micofenolato dentro de 3 meses Pacientes em que a causa primária de sintomas de sicca é atribuível a um medicamento usado regular ou intermitentemente, em vez de a síndrome de Sjögren primária Em risco significativo de eventos tromboembólicos Lesão pancreática ou pancreatite Histórico ou presença de condição cardíaca clinicamente significativa Infecção fúngica, bacteriana ou viral sistêmica clinicamente significativa dentro de 30 dias da randomização Condição que resultaria em um risco significativamente elevado de infecções Histórico ou evidência de tuberculose  Condição cirúrgica, médica, psiquiátrica ou física adicional significativa Terapia de Coorte 1: pesquisa e de CFZ533 150 mg Pó para Solução para Injeção e referência placebo compatível CFZ533: 3 mg/kg administrados de modo subcutâneo.

Controle: CFZ533 placebo Coorte 2: CFZ533 150 mg Pó para Solução para Injeção e placebo compatível CFZ533: 10 mg/kg administrados por infusão intravenosa.

Controle: CFZ533 placebo Coorte 3: CFZ533 150 mg Líquido em Frasco para injeção CFZ533 600 mg s.c. uma vez por semana durante 4 semanas, seguido de 300 mg s.c. uma vez por semana durante 9 semanas  CFZ533 10 mg/kg i.v. no Dia 1, seguido de 300 mg s.c., começando no Dia 8 uma vez por semana durante 12 semanas Avaliações de Índice de Atividade de Doença da Síndrome de eficácia e Sjögren de EULAR (ESSDAI) farmacodinâmica  CD40 solúvel total em plasma, CD154 solúvel total em plasma, ocupação de CD40 em células B de sangue periférico Avaliações de Todas as Coortes: segurança Exame físico Sinais vitais Avaliações laboratoriais: hematologia, química clínica, urinálise Eletrocardiograma (ECG) Teste de gravidez Evento Adverso Evento Adverso Grave  Imunogenicidade (anticorpos anti-CFZ533) Outras Todas as Coortes: avaliações Farmacocinética de CFZ533 Biomarcadores solúveis (por exemplo, CXCL13) Intensidade Relatada de Paciente com Síndrome de Sjögren de EULAR (ESSPRI) Avaliação do Médico e Paciente de atividade de doença global (VAS) de Coortes 1 e 2: Short Form (36) Health Survey (SF-36)  Questionário de Inventário Multidimensional de Fadiga (MFI) Análise de Coortes 1 e 2: dados Um modelo longitudinal que descreve a alteração de ESSDAI da linha de base ao longo do tempo será ajustado para a parte controlada do estudo (até a Semana 13) com as seguintes covariáveis: ESSDAI de linha de base, dose de prednisona de linha de base, tratamento (placebo, CFZ533 3 mg/kg s.c. ou

CFZ533 10 mg/kg i.v.), tempo como um fator contínuo e um efeito quadrático no tempo, bem como uma interceptação aleatória, coeficiente angular aleatório e efeito quadrático aleatório para indivíduo. A alteração da linha de base em ESSDAI na Semana 13 será estimada a partir do modelo para todos os tratamentos. A inferência será feita na estrutura frequentista. Os resultados da análise primária serão avaliados contra os seguintes critérios de eficácia para suportar a tomada de decisão interna: uma redução estatisticamente significativa em ESSDAI na Semana 13 no grupo CFZ533 em comparação com o placebo, no nível de significância unilateral de 10% e, uma redução média estimada em ESSDAI no grupo CFZ533 em 5 pontos ou mais que o placebo. Um sinal positivo de eficácia será considerado se ambos os critérios forem atendidos. Coorte 3: Estatísticas descritivas e exibições gráficas serão usadas para resumir as concentrações PK em cada braço de tratamento.

4. Resultados

[0337] Coorte 1 e 2

[0338] Quarenta e quatro pacientes foram inscritos: 8 pacientes receberam 3 mg/kg s.c. CFZ533 e 4 placebos nas Coortes 1 e 21 receberam 10 mg/kg i.v. CFZ533 e 11 placebos na Coorte 2. Embora a PK/PD fosse conforme esperado na coorte de 10 mg/kg i.v. de CFZ533 com base nos dados do ensaio de primeira exposição em ser humano, a exposição ao CFZ533 pareceu abaixo do esperado na coorte de

3 mg/kg s.c., provavelmente devido à disposição mediada por alvo eficaz (efeito de primeira passagem) em condições em que a expressão de CD40 provavelmente tenha sido intensificada. De modo geral, o CFZ533 foi seguro e bem tolerado, e a maioria dos AEs foram brandos ou moderados. Houve um único AE grave (conjuntivite bacteriana) na coorte de 3 mg/kg s.c. que não estava relacionado ao fármaco de estudo. Na Coorte 1, observou-se que ESSDAI melhorou em aproximadamente 2 pontos das pontuações de linha de base médias de aproximadamente 12 tanto no grupo de placebo como no de 3 mg/kg s.c., portanto, sem evidência de diferença de tratamento (ΔESSDAI = 0,68, 95% de IC = -4,71 a 6,46). Entretanto, na Coorte 2, a melhora em ESSDAI a partir das linhas de base médias de aproximadamente 11 foi observada como sendo de 6,35 no grupo de 10 mg/kg i.v. em comparação com 1,27 no grupo de placebo, com a diferença modelada entre os grupos de ΔESSDAI = 5,2 (95% de IC = 1,02 a 10,58), favorecendo fortemente o tratamento i.v. com CFZ533. Também foram observadas melhoras em outras medições, como ESSPRI, MFI, Avaliação Global do Médico e Avaliação Global do Paciente, e diminuições no biomarcador sérico relacionado ao centro germinativo CXCL13 no grupo de 10 mg/kg i.v. de CFZ533.

[0339] A Figura 4 é um gráfico que mostra a farmacocinética de CFZ533 - 10 mg/kg IV. O regime IV forneceu saturação alvo total e bloqueio de via CD40 completo em tecidos-alvo. Bloqueio de via CD40 em tecido esperado com concentração plasmática > 40 μg/ml (supressão do desenvolvimento de GC e resposta de antígeno dependente de T), linha pontilhada no gráfico. Após 12/24 semanas de tratamento, surgiram sinais de que a expressão de CD40 foi modulada de modo descendente em alguns pacientes com pSS.

[0340] A Figura 5 mostra a pontuação total de ESSDAI ajustada à linha de base - 10 mg/kg IV. A linha superior é Placebo iv e a linha inferior é CFZ533 10 mg/kg iv. Conforme pode ser visto, houve uma melhora evidente (média delta = 5,6 na semana 12) no grupo de CFZ533 versus placebo.

[0341] A Figura 6 mostra o CXCL13 ajustado à linha de base - 10 mg/kg IV. A linha superior é o placebo iv e a linha inferior é CFZ533 10 mg/kg iv.

[0342] A Figura 7 mostra a diferença de grupo de tratamento em vários pontos finais para 10 mg/kg de CFZ533 versus placebo na Semana 13 (após 12 semanas de tratamento - Período 1).

[0343] Pode-se concluir que existem melhoras evidentes em ESSDAI e na Avaliação Global do Médico (VAS). Além disso, as tendências na maioria dos pontos finais secundários favorecem CFZ533. As alterações de ESSDAI foram sustentadas no período aberto. Alguma melhora no grupo de Placebo quando comutado para 10 mg/kg IV de CFZ533, com diminuições significativas em níveis de CXCL13 seguindo o mesmo padrão.

[0344] Nesse estudo de prova de conceito, testando um anticorpo anti-CD40 de bloqueio e sem depleção pela primeira vez em síndrome de Sjögren primária, os resultados sugerem que CFZ533 pode oferecer uma nova modalidade de tratamento em pSS clinicamente ativo.

[0345] Além disso, a Figura 8 mostra farmacodinâmica/engajamento do alvo (10 mg/kg IV). Em CD40 solúvel total no plasma - engajamento do alvo sustentado durante o período de tratamento e acompanhamento. Após 12/24 semanas de tratamento, existiram sinais emergentes de que a expressão de CD40 foi modulada de modo descendente em alguns pacientes com pSS.

[0346] A Figura 9 mostra a plotagem de perfil da pontuação total de ESSDAI - Coorte 1: 3 mg/kg SC.

[0347] A Figura 10 mostra a farmacocinética: CFZ533 livre - Coorte 1: 3 mg/kg SC. Conforme pode ser visto, existe uma depuração mediada por alvo pré-sistêmica eficaz (efeito de primeira passagem; provavelmente devido à expressão elevada de CD40) - bloqueio de via CD40 em tecidos não alcançados (CFZ533 < 40 µg/ml).

[0348] A Figura 11 mostra a farmacodinâmica/engajamento do alvo: CD40 solúvel total em plasma – Coorte 1: 3 mg/kg SC. Conforme pode ser visto, o engajamento do alvo não foi sustentado devido à eliminação mediada por alvo em condições em que a expressão de CD40 provavelmente foi intensificada.

[0349] A Figura 12 mostra a plotagem de perfil da pontuação total de ESSPRI - Coorte 1: 3 mg/kg SC.

[0350] A Figura 13 mostra a plotagem de perfil da pontuação total de ESSPRI - Coorte 2: 10 mg/kg IV.

[0351] A Figura 14 mostra a plotagem de perfil de CXCL13 (pg/ml) - Coorte 2: 10 mg/kg IV.

[0352] A Figura 15 mostra a plotagem de perfil da pontuação total de ESSDAI na Coorte de 10 mg/kg de CFZ533.

[0353] A Figura 16 mostra a plotagem de perfil de ICAM + células B (%) - Coorte 2: 10 mg/kg IV.

[0354] A Figura 17 mostra a diferença de grupo de tratamento em vários pontos finais, CFZ533 versus placebo na Semana 13 (após 12 semanas de tratamento - Período 1).

[0355] A sinalização de CD40 tem sido associada à patogênese de doenças autoimunes (AD), e pacientes com ADs sistêmicas (incluindo pSS) geralmente apresentam expressão aumentada de CD40 e níveis elevados de sCD40 sérico/plasmático. Em biópsias de glândulas salivares de pacientes com síndrome de Sjögren primária, CD40 foi expresso constitutivamente por linfócitos, células epiteliais ductais e células endoteliais (Dimitriou et al, 2002), que está alinhado aos níveis plasmáticos elevados na linha de base observados no Estudo CCFZ533X2203.

[0356] CFZ533 é submetido à disposição mediada por alvo (TMD), um processo no qual uma proporção significativa de CFZ533 (em relação à dose) é ligada com alta afinidade a CD40, de modo que essa interação é refletida no perfil PK de CFZ533. Em tais circunstâncias, fatores adicionais a serem considerados para definir a posologia adequada para tratar pacientes com pSS incluem o nível de expressão de CD40 no corpo, síntese e degradação de CD40 (a biologia do alvo) e cinética de ligação de CFZ533-CD40.

[0357] A experiência clínica anterior com CFZ533 em voluntários saudáveis, pacientes com artrite reumatoide, síndrome de Sjögren primária, transplante de rim, doença de Grave e miastenia grave mostrou que a expressão elevada de CD40 está associada à alta taxa de eliminação (depuração) de CFZ533, perda de engajamento do alvo e perda bloqueio de via CD40 em tecidos-alvo, se CD40 não estiver totalmente saturado. Sob a ocupação total de CD40, a contribuição de CD40 para a depuração geral de CFZ533 é mínima, e a disposição de CFZ533 é principalmente a consequência da ligação de CFZ533 a receptores FcRn (um receptor de alta capacidade responsável pela homeostase de IgG por reciclagem/recuperação).

[0358] Conforme pode ser visto a partir dos dados de uma estratégia de descoberta de dose e perspectiva farmacocinética/farmacodinâmica, é provável que uma posologia adequada em pacientes com pSS incluiria um regime de carregamento seguido de regime de manutenção.

[0359] O regime de carregamento, provavelmente durante o primeiro mês, através da administração IV ou SC é justificado devido ao fato de que CFZ533 está sujeito à eliminação mediada por CD40. Se CD40 não estiver totalmente saturado no início do tratamento, em condições de expressão elevada de CD40, é provável que uma alta taxa de eliminação (depuração) de CFZ533 esteja associada à perda de engajamento do alvo e à perda de bloqueio de via CD40 em tecidos- alvo. Após o período de carregamento, e com base na modelagem preliminar com o uso de dados de PK a partir do estudo em andamento CCFZ533X2203 em pacientes com pSS, um regime de manutenção SC será selecionado para assegurar o bloqueio de via CD40 completo em tecidos-alvo.

[0360] Coorte 3

[0361] As diminuições em ESSDAI a partir da linha de base à semana 12 na Coorte 3 mostraram um padrão similar em ambos os braços de dosagem como na Coorte 2, apoiando assim a eficácia dos dois regimes de dosagem IV/SC ou SC/SC de CFZ533. Entretanto, à medida que a Coorte 3 foi aberta e sem controle de placebo, os dados de eficácia foram apenas exploratórios e devem ser interpretados com cautela. Exemplo 8. Bloqueio das interações de via CD40-CD154 suprime os centros germinativos ectópicos e inibe patologia no modelo de camundongo NOD/ShiLtJ da síndrome de Sjögren

[0362] A síndrome de Sjögren (SS) é uma doença crônica e autoimune caracterizada por sialadenite e disfunção da glândula exócrina. É uma das doenças autoimunes sistêmicas reumáticas mais comuns após a RA, com uma prevalência de população adulta de 0,3 a 0,5%. As manifestações clínicas incluem fadiga, ceratoconjuntivite seca, xerostomia, nariz seco, vagina seca, traqueia seca, pele seca, artralgia/artrite, Raynaud, linfadenopatia, pneumonite intersticial, vasculite (geralmente cutânea), nefrite e linfoma.

[0363] O índice de atividade de doença da síndrome de Sjögren de EULAR (ESSDAI) foi projetado para medir a atividade da doença em pacientes com SS primária. O ESSDAI é uma medição de resultado primário aceita pela HA para SS e projetada como complementar aos resultados relatados pelo paciente (ESSPRI).

[0364] As manifestações específicas da doença tanto em pacientes com SS primária como secundária incluem a presença de autoanticorpos anti-Ro e La, bem como infiltrados celulares mononucleares em glândulas salivares e lacrimais (Bombardieri et al., 2012). Em alguns casos, esses acúmulos de linfócitos T e B formam estruturas bem organizadas, denominadas estruturas linfoides ectópicas (ELS), que contêm similaridades morfológicas e funcionais com GCs (Voulgarelis et al., 2008). O trabalho anterior relatou evidência de ELS em glândulas salivares de pacientes com SS e de modelos pré- clínicos dessa doença e evidência de maturação por afinidade em andamento (Jacobi et al., 2002; Stott et al., 1998; Bombardieri et al., 2012), implicando essas estruturas na patologia da doença (Bombardieri et al., 2017).

[0365] Existem relativamente poucos dados publicados sobre o papel de várias vias coestimulatórias imunes na formação e função de ELS, apesar de dados inequívocos que apoiam o papel essencial de vias como CD40-CD154 (ligante CD40) na biologia de GC (Laman et al., 1996). Se tais interações desempenharem um papel na formação e função de ELS, então, seria previsto o bloqueio de via para eliminar estruturas estabelecidas em tecido afetado e potencialmente melhorar a função do órgão. Para testar essa hipótese, examinou-se o efeito da administração terapêutica de um anticorpo monoclonal anti-CD154 no modelo de camundongo diabético não obeso (NOD/ShiLtJ) de SS secundária (Humphreys-Beher et al., 1996) e monitorou-se ELS de glândula salivar, células secretoras de anticorpos e expressão de acquaporina-5 (AQP-5), uma proteína essencial para a função de células secretoras (Delporte et al., 2006).

1. Material e Métodos

[0366] Assinatura do gene de via CD40 em glândulas salivares

[0367] Criosseções de glândulas salivares de camundongos

NOD/ShiLtJ não tratados (Charles River, Alemanha) foram usadas para o perfil de expressão gênica por micromatriz. A microdisseção de captura a laser foi aplicada para enriquecer para ELS.

[0368] Modelo de camundongo NOD/ShiLtJ mouse de SS secundária

[0369] A cepa NOD/ShiLtJ desenvolve uma doença semelhante ao diabetes tipo 1, além de doença semelhante a SS, e pode, portanto, ser considerada como um modelo de SS secundária (Humphreys-Beher et al., 1994). NOD/ShiLtJ do sexo feminino com 12 semanas de idade foram randomizados em 2 grupos de tratamento (n = 15 por grupo, dois experimentos): MR1 (CD154 IgG anticamundongo de hamster armênio) e controle de isotipo (IC, IgG anticamundongo de hamster, BioXcell) a 15 mg/kg, intraperitonealmente (i.p.), 2x/semana durante 10 semanas. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a lei suíça de proteção animal e foram aprovados pelo Cantonal Veterinary Office in Basel, Suíça (Licença Animal nº BS-2482).

[0370] Histopatologia e imuno-histoquímica do baço e glândulas salivares de camundongos NOD/ShiLtJ

[0371] Seções de parafina com três μm de espessura das glândulas salivares esquerdas foram manchadas com hematoxilina e eosina (HE). As colorações imuno-histoquímicas automatizadas para CD3, CD45R, CD138, Iba-1, Ki-67 e AQP-5 foram realizadas no imunomarcador Ventana Discovery XT (Roche Diagnostics, Suíça). Os baços dos camundongos NOD foram manchados com Ki-67.

[0372] Ensaios ELISPOT para células secretoras de anticorpos (ASCs)

[0373] As suspensões de células únicas de glândulas salivares e baços foram preparadas (Arquivo Suplementar online) e células CD45+ frescas foram adicionadas a placas ELISPOT pré-revestidas e incubadas por 20 horas a 37 °C no escuro. A ligação de ASC às placas foi revelada mediante a adição de uma solução de substrato TMB, e a densidade das manchas foi medida com um leitor EliSpot “AID classic”.

[0374] ELISA Anti-Ro

[0375] O camundongo Anti-SSA/Ro60 foi avaliado em soro com o uso do kit ELISA n° de catálogo 5710 (Alpha Diagnostic International, Inc. EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

2. Resultados

[0376] Regulação ascendente de uma assinatura do gene CD40 de células B em glândulas salivares

[0377] As análises de micromatriz foram usadas para identificar genes a jusante de CD40 em células B após a estimulação com rCD154 de células B CD19pos humanas primárias, 43 das quais poderiam ser mapeadas para genes murinos. Foi então examinado se a expressão desses genes foi modulada em tecido de glândula salivar (SG) de camundongos NOD com 12 e 24 semanas de idade. Quatorze genes, incluindo Cd40, Cd80 e Aicda, foram significativamente regulados de modo ascendente em ELS microdissecado em comparação com o tecido de glândula salivar total (WS) em ambos os pontos no tempo, sugerindo a ativação de via crônica (Figura 26A). A Ingenuity Pathway Analysis também indicou que CD40 e CD154 (CD40LG) estavam entre os principais reguladores a montante na semana 12 e 24 (Figura 26B), e foi possível demonstrar sobreposição entre os genes de via CD40 regulados de modo ascendente em SGs de camundongos NOD/ShiLtJ e de pacientes com pSS (Horvath et al., 2012).

[0378] As interações CD40-CD154 são essenciais para a formação de ELS

[0379] Os camundongos NOD/ShiLtJ desenvolvem infiltrados celulares focais em SGs em 8 a 12 semanas de idade, com 100% de incidência que precede um declínio em função de SG (Jonsson et al. 2012). Os dados acima sugeriram sinalização de via CD40 crônica em tecido de SG de NOD, e isso foi apoiado pela evidência da expressão de CD40 por células mononucleares em focos inflamatórios (Roescher et al. 2012). Portanto, optou-se por testar os efeitos do bloqueio de CD40-CD154 terapêutico mediante a dosagem do mAb anti-CD154 MR1 a 15 mg/kg de modo quinzenal a partir de 12 semanas de idade durante dez semanas.

[0380] A Figura 26B mostra que a dosagem crônica de MR1 por 10 semanas em camundongos NOD/ShiLtJ levou a uma redução significativa em ELS em glândulas salivares, conforme definido por aglomerações de células positivas para Ki67. Além disso, houve uma redução forte na porcentagem de células B e T residentes em SG e macrófagos. As imagens histológicas indicaram que MR1 teve capacidade para suprimir ELS dez semanas após o início da dosagem (Figura 26C).

[0381] Bloqueio de interações CD40-CD154 inibe formação de ASC e produção de autoanticorpos

[0382] A administração de MR1 também resultou em uma redução em ASCs de IgG total (mas não IgM) em baço, SGs e medula óssea (Figura 26B), bem como na supressão completa de GCs esplênicos. Os camundongos tratados com anti-CD154 também exibiram uma redução significativa em níveis séricos de IgG anti-Ro, embora a frequência de ASCs específicas de Ro em glândulas salivares não parecesse ser significativamente afetada (Figura 26C).

[0383] Bloqueio de interações CD40-CD154 impede perda de células positivas para AQP-5

[0384] Embora seja possível avaliar o fluxo salivar estimulado em camundongos, a amostragem para tais análises exige jejum, anestesia e estimulação com pilocarpina (Jonsson et al. 2006); fatores que podem afetar o bem-estar animal e a interpretação da leitura. Portanto, optou- se por monitorar a expressão de AQP-5, uma proteína do canal de água envolvida na regulação da produção de saliva e lágrimas (Delporte et al., 2006) que foi sugerida como estando envolvida em função secretora em SS (Yoshimura et al., 2016). A avaliação da positividade para AQP- 5, conforme avaliado pela coloração com IHC (Figura 27), mostra uma porcentagem maior de células positivas para AQP-5 em animais tratados com MR1 em comparação com animais de controle, sugerindo que o bloqueio de CD40-CD154 pode impedir ou retardar a perda de função de célula secretória de glândula salivar.

3. Discussão

[0385] A evidência de maturação por afinidade e presença de células B autorreativas em ELS de glândula salivar sugerem um papel potencial dessas estruturas na patologia de SS (Stott et al., 1998). Dadas as similaridades funcionais entre ELS e GCs, foi levantada a hipótese de que as vias coestimulatórias imunológicas envolvidas na biologia de GC podem desempenhar um papel semelhante em ELS. A deficiência em CD40 ou CD154 impede a formação de GC e o bloqueio farmacológico de ligante ou receptor também interrompe GCs estabelecidos (Ristov et al., 2018; Kim et al. 2014). As interações CD40- CD154 também foram implicadas na biologia de ELS, à medida que a expressão de CD40 foi observada em células infiltrantes em glândulas SGs de pacientes com pSS, bem como em camundongos NOD (Roescher et al. 2012; Ohlsson et al. 2002). Acoplados à regulação ascendente persistente de genes a jusante de CD40 em ELS a partir de camundongos NOD, bem como em biópsias de SG a partir de pacientes com pSS, esses dados sugeriram que essa via coestimulatória foi ativa na infiltração de leucócitos de glândula salivar.

[0386] Adicionalmente, foi demonstrado que o bloqueio terapêutico de interações CD40-CD154 levou à eliminação de ELS, reduções profundas em leucócitos infiltrantes, bem como reduções em níveis séricos de autoanticorpos anti-Ro, o bloqueio de CD40-CD154 também pareceu impedir a perda de células que expressam AQP-5, uma proteína essencial para a função celular secretora (Delporte et al., 2006), embora a avaliação da produção de saliva seja uma medição mais direta da função de SG. Os dados anteriores indicam que a administração profilática de uma dose única de MR1 em camundongos NOD jovens (4 a 5 semanas de idade; 1 a 2 meses antes da evidência de sialadenite) pode impedir o desenvolvimento de sialadenite e reduzir níveis de autoanticorpos anti-Ro (Mahmoud et al., 2016), consistente com resultados de camundongos NOD deficientes em CD40. Entretanto, anteriormente não foi mostrado que o bloqueio terapêutico de interações CD40-CD154 pode abolir a inflamação de SG, ELS e reduzir níveis de autoanticorpos nesse modelo.

[0387] Os dados contrastam com trabalhos anteriores, em que a expressão viral adenoassociada de uma proteína de fusão CD40-Ig solúvel em SGs de camundongos NOD deixou de reduzir sialadenite (Roescher et al., 2012). À medida que os autores não relataram evidência de expressão de proteína de fusão em SGs, é provável que as concentrações do fármaco foram insuficientes para alcançar o bloqueio completo de via CD40-CD154. Em contrapartida, esse estudo poderia demonstrar claramente a revogação de GCs esplênicos, sugerindo que havia exposição suficiente ao MR1 para um efeito PD completo relevante para via em tecido. Coletivamente, os dados sugerem que o bloqueio terapêutico da via coestimulatória de CD40- CD154 com produtos biológicos, como o anticorpo anti-CD40 mAb, poderia fornecer um efeito terapêutico benéfico em pacientes com SS (Ristov et al., 2018). Exemplo 9. Caracterização das propriedades in vitro e in vivo de CFZ533, um anticorpo monoclonal anti-CD40 de bloqueio e sem depleção

1. Métodos

[0388] Análise de ressonância de plásmon de superfície da afinidade de CFZ533 para CD40

[0389] As análises de ligação de CFZ533 recombinante foram realizadas a 25 °C com HBS-EP+ como tampão de execução. Um ciclo de análise de ligação típico consistiu em três etapas: (i) captura do anticorpo através de ProteinA imobilizada na superfície do chip, (ii) ligação do antígeno de CD40 ao anticorpo anti-CD40 capturado e (iii) regeneração da superfície de ProteinA. Para determinar as constantes de taxa cinética das interações de ligação de antígeno-anticorpo, os dados de ligação foram processados, com dupla referência com respostas de injeções em branco. As curvas de ligação foram ajustadas localmente com o uso do modelo de interação de 1:1 do software Biacore T100 Evaluation para determinar constantes de taxa cinética. O valor para a constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculado como a razão entre as constantes de taxa kd/ka. Todas as medições de ligação foram realizadas em dois experimentos independentes.

[0390] Análise de ressonância de plásmon de superfície da afinidade de CFZ533 para FcγRIIIA

[0391] Os domínios extracelulares de FcγRIIIA humana marcados com uma etiqueta de purificação de 4 aminoácidos (4APP; Novartis) e uma etiqueta de biotinilação Avi (GLNDIFEAQKIEWHE; Avidity) foram sintetizados por Geneart: FcγRIIIA humano (CD16a) 158V (Uniprot: P08637, 17-199), FcγRIIIA 158F humano (Uniprot: P08637, 17-199), expressos em células HEK293 e purificados com cromatografia de afinidade anti-4APP. Os receptores foram biotinilados sítio-dirigidos com BirA (Avidity), ligados a chips sensores de estreptavidina (General Electric), e os níveis de ligação de equilíbrio dos Abs diferentes foram analisados por ressonância de plásmon de superfície (T100, General Electric), conforme descrito (Warncke et al. 2012). As constantes de dissociação de equilíbrio (KD) foram calculadas por um modelo de 1:1.

[0392] Culturas de leucócito humano

[0393] Os buffy coats de sangue total foram obtidos a partir de voluntários saudáveis (Blutspendezentrum, Basel, Suíça) ou sangue total coletado de voluntários saudáveis fornecidos sob consentimento informado, de acordo com a Swiss Human Research Act e aprovação do comitê de ética responsável (Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz; EKNZ). As amostras de amígdalas humanas foram obtidas tanto junto à Ergolz Klinik (Liestal, Suíça) (Protocolo de Estudo nº 1000244 v.03; aprovado por Ethikkommission beider Basel; EKBB) como junto à Kantonspital (Liestal, Suíça) (Protocolo de Estudo nº TRI0149 v.01; aprovado por EKNZ). Para experimentos de cultura in vitro, consulte o material suplementar para métodos detalhados. Resumidamente, sangue total, PBMCs isoladas, DCs de monócitos derivados in vitro ou células B de amígdalas humanas foram incubados com concentrações únicas ou uma titulação de dose de CFZ533 ou anticorpos de controle relevantes. Para experimentos de bloqueio de via, essas culturas incluíram também uma concentração de EC80 de CD154 humano recombinante (5 µg/ml) e IL-4 (75 ng/ml). As leituras para ensaios in vitro incluíram proliferação avaliada por incorporação de timidina (3H-TdR), avaliação baseada em citometria de fluxo da expressão da molécula de ativação CD69 em células B e secreção de citocinas avaliada por ELISA. Ensaios similares foram usados para sangue total de NHP e PBMCs. Em alguns experimentos com sangue total humano, a ocupação de receptor CD40 também foi examinada pelo uso de um CFZ533 marcado com fluorescência. Onde adequado, os valores de IC50 foram estimados com o uso de ajuste de curva com base em regressão linear no software GraphPad Prism®.

[0394] Ensaios de depleção celular in vitro

[0395] Consultar o material suplementar para métodos detalhados. Resumidamente, a capacidade de CFZ533 para a depleção mediada de células B CD20pos foi monitorada em sangue total humano durante um período de três dias em comparação com o anticorpo de depleção de células B Rituximabe. Para CDC, CFZ533 ou Rituximabe foram incubados com células B de RAJI na presença ou ausência de complemento de coelho e a lise celular foi avaliada por luminescência.

[0396] Internalização de CFZ533

[0397] A internalização de CFZ533 marcado com fluorescência e rCD154 foi avaliada in vitro com o uso da linhagem de células B humanas RI-1 (Th'ng et al, 1987). A dependência de CD40 da internalização de CFZ533 foi avaliada com o uso de uma linhagem de células RI-1 de knockout para CD40. A internalização foi avaliada com o uso de um citômetro de fluxo de imagem Amnis® (Merck KHaA, Darnstadt) de acordo com as instruções do fabricante e os dados analisados com o uso do software ImageStream®X.

[0398] Estudos in vivo

[0399] Os estudos farmacocinéticos/farmacodinâmicos de dose única (PK/PD) usaram macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) virgens para tratamento com agentes biológicos entre 7,5 e 8,5 anos de idade (6,5 ± 2,6 kg) e criados em cativeiro nas Filipinas (Siconbrec, Makati City, Filipinas). O manuseio, os cuidados, os tratamentos com fármaco e a amostragem de sangue de animal são realizados de acordo com a Lei Federal Suíça para proteção de animais (licenças de animais BS n° 1900, BS n° 1495). Para os experimentos de imunização por memória, foram usados animais a partir de um estudo de toxicologia conduzido no Covance Laboratories GmbH, Muenster, Alemanha (manuscrito em preparação). O estudo foi realizado de acordo com um protocolo de estudo autorizado e procedimentos operacionais padrão locais, em estrita conformidade com os regulamentos legais nacionais sobre leis de bem-estar animal e com os padrões de bem-estar animal aceitos.

[0400] No estudo PK, CFZ533 foi administrado a três animais em doses únicas calculadas únicas de 16,2 (5532), 18,5 (5531) e 20 (5530) mg/kg. O sangue foi amostrado para análise de concentrações séricas de CFZ533, número de linfócitos T e B periféricos e ocupação de CD40 em células B periféricas pelo CFZ533. Para experimentos de TDAR de memória, os animais foram imunizados com hemocianina de lapa californiana (KLH) em alúmen nos dias de estudo 8 (iniciação) e 43 (memória; durante o tratamento com CFZ533), respectivamente. O soro foi amostrado um dia antes e 7, 14 e 21 dias após as imunizações de iniciação e memória. Os títulos de IgM/IgG específicos de KLH foram determinados com ELISA sanduíche com o uso de soro de referência de IgM/IgG anti-KLH de macaco cinomolgo como padrão. A avaliação PK foi realizada conforme descrito acima. Consultar material complementar para detalhes adicionais sobre os experimentos PK e TDAR.

[0401] Análise histológica de centros germinativos

[0402] Seções de linfonodos e baço embutidas em cera de parafina e fixas com formalina (FFPE) (axilar, mandibular e mesentérico) manchadas com hematoxilina e eosina, bem como com um método indireto de imuno-peroxidase (HRP + DAB da Dako) com os seguintes marcadores: anticorpo anti-CD20 (M0755, Dako), anticorpo anti-CD8 (RM-9116-SO, Medac) e Ki67 (M7240, Dako). Todas as lâminas foram avaliadas e graduadas de acordo com a intensidade da coloração (negativa à intensa). Além disso, o padrão de coloração e a distribuição de quaisquer células com coloração imuno-histoquímica dentro do tecido também foram descritos.

2. Resultados

[0403] CFZ533 se liga a CD40 humano e inibe a ativação induzida por rCD154 de múltiplos tipos de células que expressam CD40

[0404] A Tabela 3 indica que a KD de CFZ533 para CD40 humano recombinante foi determinada por ressonância de plásmon de superfície como 0,3 nM, sendo assim muito similar ao seu anticorpo parental HCD122 (versão IgG1 de tipo selvagem de CFZ533). Tabela 3. Afinidades de ligação (KD) e cinética de HCD122 e CFZ533 a CD40 humano. HCD122 CFZ533 KD [M] 4,67 ± 1,00x10-10 3,05 ± 0,26x10-10 ka [1/Ms] 2,84 ± 0,67x105 3,13 ± 0,73x105 kd [1/s] 1,26 ± 0,03x10-4 0,93 ± 0,14x10-4 Chi2[RU2] 0,17 - 0,19 0,10 - 0,15

[0405] A Figura 18A mostra o efeito de CFZ533 na proliferação mediada por rCD154 e IL-4 (3H-TdR) de culturas em sangue total humano, PBMCs e células B de amígdala isoladas de múltiplos doadores (5, 32 e 6 doadores, respectivamente). Os dados são apresentados como cpm normalizado (rCD154 + IL-4 = 100; linhas pontilhadas). A Figura 18B mostra a produção de TNF-alfa inibida por CFZ533 por moDCs estimulados por rCD154 após a cultura de um dia para o outro. A Figura 18C mostra a adição retardada de CFZ533 que inibiu a proliferação de PBMC humana mediada por rCD154 + IL-4. CFZ533 foi adicionado a PBMCs humanas uma hora antes, simultaneamente, ou duas e seis horas após a estimulação com rCD154 + IL-4, e a proliferação (3H-TdR) foi avaliada após quatro dias de cultura subsequentes (linhas pontilhadas e tracejadas representam rCD154 + IL-4 e célula mais controles de meio). Para todos os dados, a média e SD de leituras da estimulação induzida por rCD154 foram representadas graficamente em função das concentrações de CFZ533 transformadas em log. Onde adequado, os valores de IC50 foram determinados com o uso de ajuste de curva com base em regressão linear. A Figura 18D mostra a relação entre a ocupação de CD40 e o bloqueio de via por CFZ533. O sangue total humano de 10 doadores foi cultivado de um dia para o outro com rCD154 na presença de uma titulação de dose de CFZ533. Foram avaliados o grau de ativação da via (% de CD69pos em células B) e o grau de ocupação do CD40 (coloração com CFZ533 marcado com AlexaFlour 488). Os círculos abertos e cheios indicam a porcentagem de CD40 ocupada por CFZ533 e a porcentagem de células que expressam CD69pos em células B CD20pos em função da concentração de CFZ533 transformada em log, respectivamente (Média e SD mostrados). As linhas tracejadas e pontilhadas representam a expressão de CD69 induzida por rCD154 e células mais culturas de controle de meio normalizadas em todos os doadores.

[0406] A Figura 18A indica que CFZ533 inibiu completamente a proliferação induzida por rCD154 de culturas de sangue total humano, PBMCs, bem como células B de amígdala purificadas a partir de múltiplos doadores com potências (valores de IC50) de 0,024 μg/ml (0,16 nM), 0,017 μg/ml (0,12 nM) e 0,071 µg / ml (0,47 nM), respectivamente. Além disso, poderia ser demonstrado que CFZ533 bloqueou completamente a produção de TNF induzida por rCD154 por células dendríticas derivadas de monócitos primários (moDCs) com uma IC50 de 0,04 μg/ml (0,27 nM) (Figura 18B).

[0407] Conforme publicado anteriormente, CFZ533 inibiu a proliferação induzida por rCD154 de PBMCs a partir de macacos cinomolgos (Cordoba et al., 2015). CFZ533 inibiu a proliferação induzida por rCD154 de PBMCs a partir de seres humanos, animais resos e cinomolgos com potência similar (IC50 de 0,02, 0,03 e 0,01 μg/ml, respectivamente) e também poderia ligar CD40 em células B a partir dessas espécies com valores de CE50 de aproximadamente 0,2 μg/ml, consultar Tabela 4. Tabela 4. Ligação celular e propriedades funcionais de CFZ533 em seres humanos e NHPs.

Inibição da proliferação Ocupação de CD40 por induzida por rCD154 CFZ533 (MFI EC50 em (IC50 PBMCs) células CD20+) Ser humano 0,017 + 0,012 μg/ml 0,22 + 0,042 μg/ml 0,12 + 0,08 μM 1,49 + 0,28 μM (n=32) (n=4) Resos 0,026 + 0,017 μg/ml 0,22 + 0,033 μg/ml 0,18 + 0,12 μM 1,49 + 0,22 μM (n=8) (n=6) Cinomolgos 0,010 + 0,003 μg/ml 0,20 + 0,068 μg/ml 0,07 + 0,02 μM 1,35 + 0,46 μM (n=4) (n=4)

[0408] Os dados celulares acima foram derivados a partir de experimentos em que CFZ533 foi adicionado antes de ou simultaneamente com o rCD154, indicando que o anticorpo poderia impedir a ligação do ligante endógeno. Também foi possível demonstrar que a adição de CFZ533 até 6 horas após a iniciação de culturas de leucócitos que contêm rCD154 resultou na inibição completa da ativação celular com perda mínima de potência, indicando que CFZ533 poderia deslocar o ligante endógeno do CD40 (Figura 18C).

[0409] Desejou-se também avaliar a relação entre o grau de ocupação de CD40 por CFZ533 e a extensão da inibição de via. Para fazer isso, avaliou-se simultaneamente a ocupação de receptor de CD40 por CFZ533 e CD69 induzido por rCD154 em sangue total a partir de múltiplos doadores. A Figura 18D indica que a ocupação de receptor de CD40 por CFZ533 de pelo menos 90% foi necessária para o bloqueio completo da ativação de via CD40. Uma relação similar entre a ocupação de receptor e a inibição de via também foi observada com o uso de CD23 e CD54 como leituras da ativação de via CD40 (dados não mostrados).

[0410] CFZ533 exibe potencial estimulatório mínimo in vitro

[0411] A capacidade de CFZ533 para estimular a ativação de leucócitos humanos foi avaliada com o uso de proliferação e regulação ascendente da molécula de ativação CD69 em células B no sangue total. A Figura 19A mostra os dados relacionados a i. Sangue total humano a partir de múltiplos doadores (n = 13) foi incubado com uma titulação de dose de CFZ533, e a proliferação (3H-TdR) foi avaliada após três dias de cultura ii. PBMCs humanas a partir de múltiplos doadores (n = 26) foram incubadas com uma titulação de dose de CFZ533, e a proliferação (3H-TdR) foi avaliada após três dias de cultura. Para ambos os gráficos, os dados são apresentados como média e SD de cpm normalizado em função da concentração de CFZ533 transformada em log (rCD154 + IL-4 = 100; linhas pontilhadas, células mais meio = 0; linhas tracejadas). A Figura 19B mostra que CFZ533 não induz a proliferação de PBMC humana na presença de estímulos adicionais. As PBMC humanas foram estimuladas por 3 dias com uma titulação de dose de CFZ533 na presença de IL-4 (i) ou anti-IgM F(ab')2. (ii). A média e SD de 3H-TdR (cpm) são mostrados em função da concentração de CFZ533 transformada em log. Na Figura 19C, é mostrado como o sangue total humano (41 doadores) foi cultivado de um dia para o outro sem estímulos, CFZ533, controle de isotipo ou expressão de rCD154 e CD69 em células B foi avaliada por FACS. Cada ponto representa dados de um único doador com valores de % de CD69 média indicados por uma linha vermelha horizontal.

[0412] A Figura 19A mostra que CFZ533 não pode induzir a incorporação de timidina por sangue total humano (diluição 1:10) ou PBMCs em contraste com rCD154. A incapacidade de CFZ533 para induzir a proliferação não foi afetada pela adição de coestímulos adicionais, como IL-4 ou anti-IgM (Figura 19B). Também foi possível demonstrar que o CFZ533 não pode induzir a regulação ascendente de

CD69 em células B no sangue total a partir de múltiplos doadores, novamente em contraste com rCD154 (Figura 19C). Finalmente, CFZ533 não pode induzir a produção de citocinas por CD40 derivadas de monócitos que expressam CD40 ou células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) (dados não mostrados).

[0413] CFZ533 não medeia a depleção celular

[0414] CFZ533 foi manipulado para conter uma mutação N297A, demonstrada anteriormente para anular a ligação de FcγR, resultando em uma incapacidade de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). CFZ533 não pode se ligar a FcγRIIIA em comparação com HCD122 (IgG1 do tipo selvagem) (Tabela 5), e desejou-se examinar como essa falta de ligação afetou a capacidade de CFZ533 de mediar a depleção celular. Tabela 5. Afinidades de ligação (ka[1/M]) de HCD122 e CFZ533 a FcγRIIIA humano Espécie FcγR HCD122 (IgG1 do CFZ533 (N297A tipo selvagem) IgG1) FcγRIIIA humano 1,72x106 n.d. 158V FcγRIIIA humano 6,99x105 n.d. 158F

[0415] n.d. não detectado

[0416] A Figura 20A mostra dados de culturas de sangue total humano incubadas por 72 horas na presença de uma titulação de dose de CFZ533 ou 50 µg/ml de Rituximabe. Os números de células B foram determinados com base nos eventos de CD45pos e CD19pos que se incluem na porta FSC/SSC de linfócitos. Os resultados para concentrações individuais de anticorpos foram calculados como porcentagem de células B restantes com referência a amostras não tratadas e representados graficamente em função da concentração de anticorpos transformados em log (ajustado para 100% e mostrado como uma linha pontilhada). Os dados representam a média e SD de oito doadores independentes. A Figura 20B mostra resultados a partir de células B Raji incubadas com concentrações diferentes de Rituximabe ou CFZ533 e uma concentração fixa de complemento de coelho. O extermínio dependente de concentração das células Raji foi analisado após 2 horas, em que a viabilidade das células foi medida por meio da determinação da concentração de ATP em cada poço com o uso de luciferase. Os resultados são apresentados como unidades de luciferase relativa normalizada de controle de isotipo (RLU) em função da concentração de anticorpos transformada em log.

[0417] A Figura 20A indica que, embora o anticorpo anti-CD20 de depleção, Rituximabe, tenha apresentado capacidade para eliminar aproximadamente 80% de células B em sangue total humano, CFZ533 deixou de mediar qualquer depleção celular. Além disso, CFZ533 não pode mediar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de células B Raji, em contraste com Rituximabe (Figura 20B).

[0418] CFZ533 é internalizado pelas células B de maneira dependente de CD40

[0419] Em seguida, deseja-se examinar se CFZ533 poderia ser internalizado pela linhagem de células B humanas que expressam CD40 RI-1. A Figura 21A indica que rCD154 foi internalizado sob condições permissivas (37 °C) em comparação com condições não permissivas (4 °C), em que uma coloração fraca de rCD154 poderia ser observada sobre a membrana plasmática. CFZ533 também foi internalizado, embora parecesse existir coloração de membrana residual a 37 °C. A Figura 21B indicou que a extensão da internalização de rCD154 pareceu ser maior do que aquela observada para CFZ533. Com o uso de uma linhagem de células B RI-1 com knockout de CD40, poderia ser demonstrado que a ligação e a internalização de CFZ533 (Figura 21C)

e rCD154 (dados não mostrados) foram dependentes de CD40.

[0420] A Figura 21A mostra imagens representativas de células B RI-1 individuais cultivadas com rCD154 ou CFZ533 marcado com AlexaFlour 488 por 3 horas a 37 °C ou 4 °C. A Figura 21B exibe a internalização relativa erodida de CFZ533 e rCD154 sob condições permissivas (valores de erosão não permissivos subtraídos). Cada ponto representa dados de um experimento individual e a média de população é indicada como uma linha vermelha horizontal. A Figura 21C mostra imagens representativas de células RI-1 com knockout de CD40 ou que expressam CD40, cultivadas com CFZ533 marcado com Alexa488 por 3 horas a 37 °C. Em todos os experimentos, as células foram comanchadas com CD45 marcado com AlexaFlour 647 para demarcar a membrana celular.

[0421] Propriedades farmacocinéticas de CFZ533 em primatas não humanos

[0422] A Figura 22A apresenta concentrações séricas de CFZ533 em três macacos cinomolgos após a administração de dose única a doses calculadas de 16,2 (5532), 18,5 (5531) e 20 (5530) mg/kg de modo intravenoso. A Figura 22B mostra a ocupação de CD40: porcentagem de CD40 disponível (i) e porcentagem de CD40 total (ii) C. Células B/T periféricas: porcentagem de células B de sangue periférico após dose única. O dia 0 é quando CFZ533 foi administrado.

[0423] Os dados acima indicaram que CFZ533 se ligou a NHP CD40 e poderia inibir a ativação induzida por rCD154 de células B NHP com potências similares. Isso sugeriu que macacos cinomolgos e resos seriam espécies adequadas para estudos in vivo que investigam a relação entre PK e PD de CFZ533. Os dados na Figura 22A mostram os perfis PK de três macacos cinomolgos após uma dose intravenosa única de CFZ533 (doses calculadas de 16,2, 18,5 e 20 mg/kg). Típico para um anticorpo monoclonal que alveja um antígeno ligado de membrana internalizante (Mager et al. 2006 e Ng et al. 2006), o curso no tempo de concentração de CFZ533 exibiu disposição mediada por alvo clara, resultando em perfis de PK não lineares e taxa de depuração dependente de concentração e meia-vida. O ponto de inflexão observado nos perfis de PK é um marcador de engajamento de alvo e é associado a uma contribuição aumentada de CD40 à depuração geral de CFZ533, e uma meia-vida mais curta. Adicionalmente, o ponto de inflexão nos perfis PK coincidiu com o tempo em que uma queda de saturação CD40 foi observada (Figura 22B, i). Isso ocorreu em aproximadamente 10 a 20 μg/ml, quando CFZ533 foi submetido à eliminação mais rápida. Em todos os animais, não houve perda de expressão de receptor de CD40 em células (Figura 22B, ii). Adicionalmente, CFZ533 não depletou células B de sangue periférico (Figura 22C) ou células T (dados não mostrados), apesar de algumas variações observadas ao longo do estudo.

[0424] CFZ533 inibe a produção de anticorpo dependente de célula T de memória

[0425] A Figura 23A mostra o esquema de projeto para avaliar o efeito de CFZ533 em TDARs de memória. As setas abaixo do eixo geométrico x destacam imunizações de KLH primárias e secundárias. A temporização de uma dose única de CFZ533 10 mg/kg é mostrada acima. Os asteriscos indicam pontos no tempo em que IgG anti-KLH e/ou níveis de CFZ533 foram medidos. A Figura 23B cada gráfico mostra IgG anti-KLH (símbolos fechados) e níveis de CFZ533 plasmáticos (escala de log; linha contínua) para um animal individual. Os níveis de IgG anti-KLH médios de animais de controle (símbolos abertos) são sobrepostos em cada gráfico com propósitos comparativos. A Figura 23C apresenta a análise histológica de centros germinais (coloração de Ki67) em mLNs de macacos resos de um estudo de 26 doses de múltiplas doses subcutâneas 1 mg/kg/semana com o uso de CFZ533. As seções de mLN representativas de seis animais são mostradas (i) juntamente com uma imagem de controle (ii). (iii) são as concentrações séricas de CFZ533 de estado estável médio por um intervalo de dosagem de animais individuais no fim do período de tratamento.

[0426] Um efeito de PD em alvo esperado de CD40 bloqueou a inibição de um TDAR (Kawabe et al. 1994). CFZ533 inibe TDARs primários em NHPs e seres humanos, e se desejou examinar os efeitos desse anticorpo em um TDAR de memória. O projeto experimental é resumido na Figura 23A. Brevemente, quatro macacos resos foram imunizados com KLH em Alum no dia de estudo -28 (iniciação), antes de uma dose intravenosa única de CFZ533 a 10 mg/kg no dia de estudo 1, seguido por uma segunda imunização de KLH no dia de estudo 15.

[0427] A Figura 23B ilustra os efeitos de CFZ533 em respostas de memória de IgG anti-KLH em quatro animais individuais em comparação com os dados de controles imunizados (nenhum CFZ533). Houve variabilidade entre animais em perfis de PK de CFZ533, com eliminação mais rápida de CFZ533 observada nos animais nº 1 e nº 3. As concentrações plasmáticas mais altas foram observadas por um período de tempo mais longo nos animais nº 2 e nº 4. De modo interessante, esses animais exibiram a supressão completa de uma resposta de memória de IgG anti-KLH (e IgM; dados não mostrados) no dia 15 do estudo (observa-se que todos os animais montaram um TDAR primário para KLH). Em contraste, as respostas de IgG anti-KLH foram observadas (embora com algum atraso) em animais com depuração mais rápida de CFZ533 (atraso mais alto para animal nº 3 em comparação com o animal nº 1), notavelmente, quando os níveis de CFZ533 séricos foram menores do que aproximadamente 40 μg/ml no momento da segunda imunização com KLH. Conforme foi observado em experimentos in vivo anteriores com CFZ533 em animais transplantados (Cordoba et al. 2015) e não transplantados (Figura 22B), nenhuma depleção de célula B periférica foi observada (dados não mostrados).

[0428] Os resultados acima indicaram que as concentrações séricas CFZ533 mais altas do que aproximadamente 40 μg/ml foram necessárias para supressão completa de uma memória TDAR em NHPs. Se desejou examinar a relação entre exposição de CFZ533 e efeitos farmacodinâmicos de tecido relevantes de tecido de CD40. Na terminação de um estudo de toxicologia de 26 semanas, em CFZ533 1 mg/kg/semana de modo subcutâneo, foi realizada a análise molecular e histológica de GCs em linfonodos mesentéricos (mLNs). A Figura 23C (i) indica que dos seis animais dosados, foi possível observar a supressão completa de GCs em três indivíduos, enquanto GCs ainda podem ser observados nos mLNs dos animais restantes. A Figura 23C (iii) indica que as concentrações séricas de pelo menos 38 μg/ml (concentração de estado estável médio sobre o intervalo de dosagem) foram associadas à supressão completa de desenvolvimento de GC em áreas de célula B corticais de linfonodos, enquanto a supressão incompleta (animal 26842) ou nenhuma supressão (animais 26772 e 26837) de GCs foi observada em concentrações de soro abaixo de 20 μg/ml, apesar da ocupação de CD40 completa em células B CD20pos de sangue total (animais 26842 e 26772; dados não mostrados). Não houve evidência de depleção de célula B periférica (dados não mostrados). Discussão

[0429] CFZ533 é desenvolvido como uma terapia potencial para transplante de órgão sólido e doenças autoimunes associadas à desregulação da via coestimulante de CD40-CD154. Aqui, se descreve a caracterização das propriedades funcionais de CFZ533 em sistemas de modelo in vitro e in vivo relevantes de via de CD40 assim como a investigação da relação entre a exposição de CFZ533 e efeitos de PD.

[0430] CFZ533 pôde se ligar a CD40 e impedir completamente a ativação de via induzida por rCD154 em tipos de célula imune humana diferentes incluindo células B e DCs. Além disso, parece que, em excesso, de 90% de ocupação de CD40, foi necessário que CFZ533 bloqueasse completamente a ativação de via em sangue total. Coletivamente, esses dados sugerem que CFZ533 tem o potencial de bloquear as funções efetoras dependentes de via de CD40 independentemente do tipo de célula, supondo que a ocupação de receptor suficiente seja alcançada. Os dados também indicaram que, em PBMCs, CFZ533 pôde deslocar rCD154 pré-ligado de CD40, o que sugere que os epitopos do mAb e ligante fisiológico podem se sobrepor; uma noção sob investigação em estudos estruturais.

[0431] In vivo, uma taxa de depuração dependente de concentração e uma meia-vida foram observadas para CFZ533 em estudos de PK de dose única. Esse perfil de PK sugeriu que a expressão de receptor de CD40 afetou a eliminação de CFZ533. Em baixas concentrações de CFZ533 (isto é, saturação de alvo incompleta), a contribuição de CD40 para a depuração geral de CFZ533 foi elevada e a meia-vida foi de algum modo mais curta do que o usualmente observado para anticorpos do tipo IgG1. Em concentrações mais altas correspondentes à saturação alvo completa (e inibição de via funcional completa), a contribuição do receptor para a depuração geral de CFZ533 foi limitada e a meia-vida foi aumentada. A depuração mediada por alvo de CFZ533 foi coerente com a internalização mediada por CD40 de CFZ533 observado in vitro, que é provavelmente seguida por degradação lisossômica do complexo.

[0432] Uma constatação adicional dos estudos PK/PD confirmou a incapacidade de CFZ533 de depletar células B periféricas in vivo (Cordoba et al. 2015). Conforme mencionado, a incapacidade de

CFZ533 para depletar células que expressam CD40 é devido à presença de uma mutação N297A no anticorpo que leva à ausência de glicosilação N-ligada na região de articulação, tornando o mesmo sem capacidade para ligar FcγRIIIA ou mediar ADCC ou CDC. O silenciamento de Fc de CFZ533 foi feito para impedir a depleção de tipos de célula que expressam CD40; de preocupação particular dada à distribuição de tecido ampla desse receptor em tipos de célula imunes ou não imunes, particularmente sob condições inflamatórias.

[0433] Além da eficácia em transplante renal de NHP (Cordoba et al. 2015), os resultados nesse papel indicaram que CFZ533 inibiu completamente os TDARs de memória. Esse resultado sugeriu que as respostas de célula B de memória para antígenos dependentes de célula T foram completamente dependentes de interações CD40- CD154. A extensão da inibição da resposta de memória pareceu ser relacionada à concentração de CFZ533, com níveis séricos em excesso de 30 a 40 μg/ml (por pelo menos uma semana após reforço) necessários para supressão completa de uma resposta de anticorpo específica de antígeno. Essa relação entre concentração sérica e uma leitura de PD de tecido relevante de via CD40 também se mantiveram durante o exame do efeito de CFZ533 em GCs de linfonodo mesentérico, em que um limiar mínimo de concentrações de CFZ533 de soro de estado estável médio foi necessário para supressão completa de GCs. Esses dados apontam para a importância de se estabelecer uma relação entre as exposições de fármaco periféricas e um efeito de PD relevante de alvo em tecido a fim de informar estratégias de dosagem. Diversos produtos biológicos que alvejam a via de coestímulo CD40-CD154 são desenvolvidos para várias doenças autoimunes. Além dos mAbs anti-CD40, tais como CFZ533, os mAbs anti-CD154 permanecem na clínica, apesar do risco potencial para eventos tromboembólicos (Boumpas et al., 2003). Os resultados recentes sugeriram que as abordagens de F(ab')2 peguilado e silenciador de Fc podem eliminar os riscos tromboembólicos de anticorpos que alvejam CD154, entretanto, há relatos de que mAbs anti-CD154 silenciando Fc podem ser menos eficazes. Até o presente, não há evidência de eventos tromboembólicos associados à administração de múltiplos anticorpos anti-CD40 em modelos pré-clínicos ou na clínica.

[0434] Em conclusão, os dados indicam que CFZ533 é um anticorpo anti-CD40 de não depleção de bloqueio de via com propriedades agonísticas mínimas. Em exposições relevantes, farmacologicamente relevantes e suficientes, CFZ533 pode inibir completamente TDARs de memória assim como suprimir centros germinais sem depletar os tipos de célula que expressam CD40. Esses dados, combinados com a eficácia pré-clínica em transplante de rim fornece justificativa científica para a utilidade clínica potencial de CFZ533 em doenças autoimunes selecionadas e transplante de órgão sólido.

REFERÊNCIAS

[0435] Bombardieri M, Pitzalis C. Ectopic lymphoid neogenesis and lymphoid chemokines in Sjogren's syndrome: at the interplay between chronic inflammation, autoimmunity and lymphomagenesis. Curr Pharm Biotechnol. Agosto de 2012; 13(10):1.989 a 1.996.

[0436] Bombardieri M, Barone F, Lucchesi D, Nayar S, van den Berg WB, Proctor G, et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 1 de outubro de 2012; 189(7):3.767 a 3.776.

[0437] Bombardieri M, Lewis M, Pitzalis C. Ectopic lymphoid neogenesis in rheumatic autoimmune diseases. Nat Rev Rheumatol. Março de 2017; 13(3):141 a 154.

[0438] Boumpas DT, Furie R, Manzi S, Illei GG, Wallace DJ, Balow

JE et al. A short course of BG9588 (anti-CD40 ligand antibody) improves serologic activity and decreases hematuria in patients with proliferative lupus glomerulonephritis. Arthritis Rheum 2003;48(3):719 a 727.

[0439] Cordoba F, Wieczorek G, Audet M, Roth L, Schneider MA, Kunkler A et al. A novel, blocking, Fcsilent anti-CD40 monoclonal antibody prolongs nonhuman primate renal allograft survival in the absence of B cell depletion. Am J Transplant 2015;15(11):2.825

[0440] Dimitriou ID, Kapsogeorgou EK, Moutsopoulos HM, et al (2002) CD40 on salivary gland epithelial cells: high constitutive expression by cultured cells from Sjögren's syndrome patients indicating their intrinsic activation. Clin Exp Immunol; 127(2):386 a 392.

[0441] Delporte C, Steinfeld S. Distribution and roles of aquaporins in salivary glands. Biochim Biophys Acta. Agosto de 2006; 1758(8):1.061 a 1.070. Harland R, Klintmalm G, Yang H, et al. (2015) ASKP1240 in De Novo Kidney Transplant Recipients. Am J Transplant;15(S3): Abstract #

3012.

[0442] Horvath S, Nazmul-Hossain AN, Pollard RP, Kroese FG, Vissink A, Kallenberg CG, et al. Systems analysis of primary Sjogren's syndrome pathogenesis in salivary glands identifies shared pathways in human and a mouse model. Arthritis Res Ther. 1 de novembro de 2012; 14(6):R238.

[0443] Jacobi AM, Hansen A, Kaufmann O, Pruss A, Burmester GR, Lipsky PE, et al. Analysis of immunoglobulin light chain rearrangements in the salivary gland and blood of a patient with Sjogren's syndrome. Arthritis Res. 2002; 4(4):R4.

[0444] Jonsson MV, Delaleu N, Brokstad KA, Berggreen E, Skarstein K. Impaired salivary gland function in NOD mice: association with changes in cytokine profile but not with histopathologic changes in the salivary gland. Arthritis Rheum. Julho de 2006; 54(7):2.300 a 2.305.

[0445] Kaufman I, Schwartz D, Caspi D, et al (1999) Sjögren's syndrome - not just Sicca: renal involvement in Sjögren's syndrome. Ann Rheum Dis.58:253 a 256.

[0446] Kawabe T, Naka T, Yoshida K, Tanaka T, Fujiwara H, Suematsu S et al. The immune responses in CD40-deficient mice: impaired immunoglobulin class switching and germinal center formation. Immunity 1994;1(3):167 a 178.

[0447] Kim EJ, Kwun J, Gibby AC, Hong JJ, Farris AB, 3rd, Iwakoshi NN, et al. Costimulation blockade alters germinal center responses and prevents antibody-mediated rejection. Am J Transplant. Janeiro de 2014; 14(1):59 a 69.

[0448] Komaroff AL, Fagioli LR, Doolittle TH, et al (1996) Health status in patients with chronic fatigue syndrome and in general population and disease comparison groups. Am J Med; 101:281 a 290.

[0449] Kuenstner S, Langelotz C, Budach V, et al (2002) The comparability of quality of life scores. A multitrait multimethod analysis of the EORTC QLQ-C30, SF-36 and FLIC questionnaires. Eur J Cancer; 38:339 a 348.

[0450] Laman JD, Claassen E, Noelle RJ. Functions of CD40 and its ligand, gp39 (CD40L). Crit Rev Immunol. 1996; 16(1):59 a 108.

[0451] Mager DE. Target-mediated drug disposition and dynamics. Biochem Pharmacol 2006;72(1):1 a 10.

[0452] Mahmoud TI, Wang J, Karnell JL, Wang Q, Wang S, Naiman B, et al. Autoimmune manifestations in aged mice arise from early-life immune dysregulation. Sci Transl Med. 19 de outubro de 2016; 8(361):361ra137.

[0453] Manganelli P e Fietta P (2003) Apoptosis and Sjögren syndrome. Semin Arthritis Rheum; 33(1):49 a 65.

[0454] Meijer JM, Meiners PM, Vissink A, et al (2010) Effectiveness of rituximab treatment in primary Sjögren's syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Arthritis Rheum; 62:960 a 968.

[0455] Moerman RV, Arends S, Meiners PM, et al (2014) EULAR Sjögren's Syndrome Disease Activity Index (ESSDAI) is sensitive to show efficacy of rituximab treatment in a randomized controlled trial. Ann Rheum Dis; 73:472 a 474.

[0456] Ng CM, Stefanich E, Anand BS, Fielder PJ, Vaickus L. Pharmacokinetics/pharmacodynamics of nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody (TRX1) in healthy human volunteers. Pharm Res 2006;23(1):95 a 103.

[0457] Ohlsson M, Szodoray P, Loro LL, Johannessen AC, Jonsson R. CD40, CD154, Bax and Bcl-2 expression in Sjogren's syndrome salivary glands: a putative anti-apoptotic role during its effector phases. Scand J Immunol. Dezembro de 2002; 56(6):561 a 571.

[0458] Ristov J, Espie P, Ulrich P, Sickert D, Flandre T, Dimitrova M, et al. Characterization of the in vitro and in vivo properties of CFZ533, a blocking and non-depleting anti-CD40 monoclonal antibody. Am J Transplant. 17 de abril de 2018.

[0459] Roescher N, Lodde BM, Vosters JL, Tak PP, Catalan MA, Illei GG, et al. Temporal changes in salivary glands of non-obese diabetic mice as a model for Sjogren's syndrome. Oral Dis. Janeiro de 2012; 18(1):96 a 106.

[0460] Roescher N, Vosters JL, Lai Z, Uede T, Tak PP, Chiorini JA. Local administration of soluble CD40:Fc to the salivary glands of non- obese diabetic mice does not ameliorate autoimmune inflammation. PLoS One. 2012; 7(12):e51375.

[0461] Segal B, Bowman SJ, Fox PC, et al (2009) Primary Sjögren's Syndrome: health experiences and predictors of health quality among patients in the United States. Health Qual Life Outcomes; 7:46.

[0462] Sellam J, Proulle V, Jüngel A, et al (2009) Increased levels of circulating microparticles in primary Sjögren's syndrome, systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis and relation with disease activity. Arthritis Res Ther; 11:R156.

[0463] Seror R, et al (2011a) EULAR Sjogren's syndrome disease activity index: development of a consensus systemic disease activity index for primary Sjogren's syndrome. Ann Rheum Dis.;69(6):1.103 a

1.109.

[0464] Seror R, et al (2011b) EULAR Sjogren's Syndrome Patient Reported Index (ESSPRI): development of a consensus patient index for primary Sjogren's syndrome. Ann Rheum Dis.;70(6):968 a 972.

[0465] Stott DI, Hiepe F, Hummel M, Steinhauser G, Berek C. Antigen-driven clonal proliferation of B cells within the target tissue of an autoimmune disease. The salivary glands of patients with Sjogren's syndrome. J Clin Invest. 1 de setembro de 1998; 102(5):938 a 946.

[0466] Tishler M, Yaron I, Shirazi I, et al (2008) Hydroxychloroquine treatment for primary Sjögren's syndrome: its effect on salivary and serum inflammatory markers. Scand J Rheumatol. 37:213 a 218.

[0467] Th'ng KH, Garewal G, Kearney L, Rassool F, Melo JV, White H et al. Establishment and characterization of three new malignant lymphoid cell lines. Int J Cancer 1987;39(1):89 a 93.

[0468] Vossenkämper A, Lutalo PM, Spencer J (2012) Translational mini-review series on B cell subsets in disease. Transitional B cells in systemic lupus erythematosus and Sjögren's syndrome: clinical implications and effects of B cell-targeted therapies. Clin Exp Immunol; 167:7 a 14.

[0469] Voulgarelis M, Moutsopoulos HM. Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma in Sjogren's syndrome: risks, management, and prognosis. Rheum Dis Clin North Am. Novembro de 2008; 34(4):921 a 933, viii.

[0470] Warncke M, Calzascia T, Coulot M, Balke N, Touil R, Kolbinger F et al. Different adaptations of IgG effector function in human and nonhuman primates and implications for therapeutic antibody treatment. J Immunol 2012;188(9):4.405 a 4.411.

[0471] Winzer M, Aringer M. (2010) Use of methotrexate in patients with systemic lupus erythematosus and primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 28 (5 Suppl 61):S156-9.

[0472] Yoshimura S, Nakamura H, Horai Y, Nakajima H, Shiraishi H, Hayashi T, et al. Abnormal distribution of AQP5 in labial salivary glands is associated with poor saliva secretion in patients with Sjogren's syndrome including neuromyelitis optica complicated patients. Mod Rheumatol. 2016; 26(3):384 a 390.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-CD40, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de síndrome de Sjögren.

2. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a síndrome de Sjögren é uma síndrome de Sjögren primária.

3. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado dentre o grupo que consiste em: a. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; b. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; c. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 13; d. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 14; e e. um anticorpo anti-CD40 que compreende uma região de IgG1 de Fc silenciosa.

4. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 10; ou a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo para uso, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

6. Anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a rota de administração é subcutânea ou intravenosa, ou uma combinação de subcutânea ou intravenosa.

7. Anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a dose é cerca de 3 mg a cerca de 30 mg de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano.

8. Composto de anticorpo para uso, como definido na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dose é cerca de 10 mg de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano.

9. Anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a dose é cerca de 150 mg a cerca de 600 mg de ingrediente ativo, como cerca de 300 mg de ingrediente ativo.

10. Composto de anticorpo para uso, como definido na reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dose é de 150 mg de ingrediente ativo, 300 mg de ingrediente ativo ou 600 mg de ingrediente ativo.

11. Anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado através de uma dosagem de carregamento e uma dosagem de manutenção.

12. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a dosagem de carregamento é administrada por meio de injeções subcutâneas de uma primeira dose e a dosagem de manutenção é administrada por meio de injeções subcutâneas de uma segunda dose.

13. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a primeira dose está entre cerca de 150 mg e cerca de 600 mg de ingrediente ativo, como cerca de 300 mg de ingrediente ativo e a segunda dose está entre cerca de 150 mg e cerca de 600 mg de ingrediente ativo, como cerca de 300 mg de ingrediente ativo.

14. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a primeira dose é de 150 mg, 300 mg ou 600 mg de ingrediente ativo e a segunda dose é de 150 mg, 300 mg ou 600 mg de ingrediente ativo.

15. Anticorpo para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que a dosagem de carregamento compreende pelo menos duas injeções subcutâneas e a dosagem de manutenção consiste em injeções subcutâneas semanalmente (Q1W), quinzenalmente (Q2W) ou mensalmente (Q4W).

16. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas injeções subcutâneas da dosagem de carregamento possuem doses diferentes.

17. Método para tratar síndrome de Sjögren em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo anti-CD40 ao dito indivíduo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a síndrome de Sjögren é uma síndrome de Sjögren primária.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado dentre o grupo que consiste em: a. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; b. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; c. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 13; d. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 14; e e. um anticorpo anti-CD40 que compreende uma região de IgG1 de Fc silenciosa.

20. Método para tratamento, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 10; ou a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado junto com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado de modo subcutâneo ou intravenoso, ou uma combinação de subcutâneo ou intravenoso.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado como uma dose de cerca de 3 mg a cerca de 30 mg de ingrediente ativo por quilograma de um indivíduo humano.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a dose é cerca de 10 mg de ingrediente ativo por quilograma do indivíduo humano.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado como uma dose de cerca de 150 mg a cerca de 600 mg de ingrediente ativo, tal como cerca de 300 mg de ingrediente ativo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a dose é de 150 mg de ingrediente ativo, de 300 mg de ingrediente ativo ou de 600 mg de ingrediente ativo.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado com uma dosagem de carregamento e uma dosagem de manutenção.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a dosagem de carregamento é administrada por meio de injeções subcutâneas de uma primeira dose e a dosagem de manutenção é administrada por meio de injeções subcutâneas de uma segunda dose.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a primeira dose está entre cerca de 150 mg e cerca de 600 mg de ingrediente ativo, como cerca de 300 mg de ingrediente ativo e a segunda dose está entre cerca de 150 mg e cerca de 600 mg de ingrediente ativo, como cerca de 300 mg de ingrediente ativo.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a primeira dose é de 150 mg, 300 mg ou 600 mg de ingrediente ativo e a segunda dose é de 150 mg, 300 mg ou 600 mg de ingrediente ativo.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a dosagem de carregamento compreende pelo menos duas injeções subcutâneas e a dosagem de manutenção consiste em injeções subcutâneas semanalmente (Q1W), quinzenalmente (Q2W) ou mensalmente (Q4W).

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas injeções subcutâneas da dosagem de carregamento possuem doses diferentes.

33. Uso de uma composição farmacêutica líquida que compreende um anticorpo anti-CD40, um tampão, um estabilizador e um solubilizante, e meios para administrar de modo subcutâneo o anticorpo anti-CD40 a um paciente que tem síndrome de Sjögren, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de síndrome de Sjögren, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD40:

a. deve ser administrado de modo subcutâneo com uma primeira dosagem de carregamento; e b. após isso, com uma segunda dosagem de manutenção, em que o dito anticorpo anti-CD40 é selecionado dentre o grupo que consiste em: i. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; ii. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende as regiões hipervariáveis apresentadas como a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; iii. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 13; iv. um anticorpo anti-CD40 que compreende um domínio VH de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VL de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma região Fc da SEQ ID NO: 14; v. um anticorpo anti-CD40 que compreende uma região de IgG1 de Fc silenciosa: e vi. um anticorpo anti-CD40 que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 10; ou a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a síndrome de Sjögren é síndrome de Sjögren primária.