JP2015146805A - アミノ酸変異が導入されたIgG2を有する抗体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アゴニスト活性を有するヒトCD40に結合する特定のアミノ酸配列を持つモノクローナル抗体。該アミノ酸配列において、少なくとも234位のバリンがアラニン、237位のグリシンがアラニン、および331位のプロリンがセリンに置換(数字はKabatらによるEUインデックスに基づく)されているIgG2である重鎖定常領域を有するモノクローナル抗体。
【選択図】なし
Description
CD40は分子量50kDaの細胞膜表面に存在する抗原であり、B細胞、樹状細胞(DC)、ある種の癌細胞、胸腺上皮細胞などに発現している。CD40はB細胞やDCの増殖、分化に重要な働きをしていることが知られている。CD40は、ヒトB細胞表面に発現する抗原として同定され(非特許文献1、2)、アミノ酸配列の相同性から、CD40は、低親和性NGFレセプターやTNFレセプター、CD27、OX40、CD30などが属しているTNFレセプターファミリーの1つのメンバーとして考えられている。ヒトおよびマウスのCD40に対するリガンド(CD40L)は、活性化したCD4+T細胞に発現しているII型膜蛋白質であり、強力な活性化シグナルをヒトおよびマウスのB細胞に導入することも分かっている。
アゴニスト抗体の作用として、B細胞の活性化が知られている。たとえば、抗CD40抗体が細胞接着を誘導する(非特許文献5、6)、細胞の大きさを増進する(非特許文献6、7)、抗IgM抗体、抗CD20抗体またはphorbol esterのみで活性化されたB細胞の分裂を誘導する(非特許文献8−10)、IL4存在下でB細胞の分裂を誘導する(非特許文献7、11)、IL−4刺激、T細胞除去培養細胞のIgE(非特許文献12、13)、IgG、IgM(非特許文献13)の発現を誘導する、IL−4によるB細胞からの可溶性CD23/FceRIIの分泌と(非特許文献14、15)細胞上の発現増強(非特許文献16)をする、IL−6の生産を促進する(非特許文献17)ことが報告されている。
特許文献3には、アゴニスト活性を有する抗CD40抗体21.4.1が開示されている。
IgGのlower hinge領域233−239位(数字はKabatらによるEUインデックスに基づく)は、免疫グロブリンFcレセプターの一種であるFcγレセプターとの結合領域の1つであることが報告されている(非特許文献27)。免疫グロブリンFcレセプターは、抗体を介した免疫応答に重要な役割を果たしている。具体的には、ファゴサイトーシスやADCC活性である(非特許文献28、29)。Fcγレセプターは、白血球表面に発現しており、FcγRI(CD64),FcγRII(CD32),FcγRIII(CD16)の3つのクラスに分けられ、さらにFcγRIIはFcγRIIAおよびIIBに、FcγRIIIはIIIAおよびIIIBに分類される。
[1]少なくとも234位のバリンがアラニンに、237位のグリシンがアラニンに、および331位のプロリンがセリンに置換(数字はKabatらによるEUインデックスに基づく)されているIgG2である重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体。
[2]配列番号30で示される重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体。
[3]配列番号6で示されるCDR1、配列番号8で示されるCDR2、および配列番号10で示されるCDR3を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号16で示されるCDR1、配列番号18で示されるCDR2、および配列番号20で示されるCDR3を有する軽鎖可変領域を有する、[1]または[2]のモノクローナル抗体。
[4]配列番号4で示される重鎖可変領域、および配列番号14で示される軽鎖可変領域を有する、[1]または[2]のモノクローナル抗体。
[5]ハイブリドーマKM341−1−19(FERM BP−7759)が産生する抗体の重鎖可変領域およびハイブリドーマKM341−1−19(FERM BP−7759)が産生する抗体の軽鎖可変領域を有する、[1]または[2]のモノクローナル抗体。
[6]ハイブリドーマKM341−1−19(FERM BP−7759)が産生する抗体と競合する、[1]または[2]のモノクローナル抗体。
[7]ハイブリドーマKM341−1−19(FERM BP−7759)が産生する抗体のヒトCD40上のエピトープの一部または全部に結合する、[1]または[2]のモノクローナル抗体。
[8][1]〜[7]のいずれか1項のモノクローナル抗体をコードするDNA。
[9][8]のDNAを含有する組換えベクター。
[10][9]の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[11][10]の形質転換体を培地に培養し、培養物中に[1]〜[7]のいずれか1項のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養物から該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする[1]〜[7]のいずれか1項のモノクローナル抗体の製造方法。
[12]配列番号2で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドである重鎖定常領域、および配列番号12で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドである軽鎖定常領域を有する、モノクローナル抗体。
[13]配列番号2で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNAを有する組換ベクター。
[14]配列番号12で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNAを有する組換ベクター。
[15]配列番号2で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNA、および配列番号12で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNAを有する組換ベクター。
[16][13]または[14]の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[17][15]の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[18][16]または[17]の形質転換体を培地に培養し、培養物中に[12]のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養物から該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする[12]のモノクローナル抗体の製造方法。
[19][1]〜[7]および[12]のいずれか1項のモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
[20][1]〜[7]および[12]のいずれか1項のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、悪性腫瘍または感染症の治療剤。
[21]悪性腫瘍または感染症の治療剤の製造のための[1]〜[7]および[12]のいずれか1項のモノクローナル抗体の使用。
[22]悪性腫瘍または感染症の治療のための[1]〜[7]および[12]のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
[23][1]〜[7]および[12]のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を投与することを特徴とする、悪性腫瘍または感染症の治療方法。
本発明において遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型CDR移植抗体およびヒト抗体など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。CDRとは、ヒト型相補性決定領域(Complementarity Determining Region)の略称であり、以下CDRと表記することがある。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
また、実施例で示される通り、本発明のモノクローナル抗体の一つであるIgG2−AAS(341)抗体は、IgG2−S(341)抗体に比べて、血中滞留時間が延長するという効果を見出した。また更に、IgG2−AAS(341)抗体は、IgG2−S(341)抗体に比べて、肝臓に対する毒性が低下しているという効果を見出した。
CD40リガンドは肝臓に対して毒性を示すことが知られている(Journal of Clinical Oncology,19(13),3280−3287(2001))が、同様にアゴニスト活性を示すCD40に結合するモノクローナル抗体も肝臓に対して毒性を示すことが知られている(American Journal of Pathology,168(3),786−795(2006))。本発明におけるIgG2−AAS抗体は、IgG2−S抗体に比べてアゴニスト活性が増強しているにも関わらず、IgG2−S抗体に比べて肝臓に対する毒性が低下している。前記低下は、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(以下、ASTと表記することがある)あるいはアラニンアミノトランスフェラーゼ(以下、ALTと表記することがある)の血中濃度の低下で確認することが出来る。
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
本発明のモノクローナル抗体は、CD40に結合するモノクローナル抗体に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、抗体などの蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
(1)抗原の調製
抗原となるCD40またはCD40を発現させた細胞は、CD40全長またはその部分長をコードするcDNAを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、CD40を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などからCD40を精製し、得ることが出来る。また、該腫瘍培養細胞、または該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Fmoc法、またはtBoc法などの化学合成法によりCD40の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
(2)動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターなどの動物に、(1)で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、CD40ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
(3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3−NS1/1−Ag41(NS−1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0−Ag14(SP−2)[Nature,276,269(1978)]、P3−X63−Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、またはP3−X63−Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]などが用いられる。
(4)細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
(2)で得られる融合用抗体産生細胞と(3)で得られる骨髄腫細胞をMinimum Essential Medium(MEM)培地またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−1000(PEG−1000)、MEM培地およびジメチルスルホキシドの混液を37℃で、攪拌しながら加える。さらに1〜2分間毎にMEM培地1〜2mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にHAT培地[ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地]中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を5%CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
(5)精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理[2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mlを腹腔内投与し、2週間飼育する]した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(4)で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、40〜50%硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgGあるいはIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
(6)モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイにより行う。
2.遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の作製方法を示す。
(1)遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
(2)ヒト以外の動物由来の抗体のV領域をコードするcDNAの取得およびアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のVH及びVLをコードするcDNAの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
(3)ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
(4)ヒト型CDR移植抗体のV領域をコードするcDNAの構築
ヒト型CDR移植抗体のVHまたはVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。
(5)ヒト型CDR移植抗体のV領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型CDR移植抗体は、非ヒト抗体のVHおよびVLのCDRのみをヒト抗体のVHおよびVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。ヒト型CDR移植抗体では、ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、CDRのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
(6)ヒト型CDR移植抗体発現ベクターの構築
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。
(7)遺伝子組換え抗体の一過性発現
(3)および(6)で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型CDR移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
(8)遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
(3)および(6)で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
3.モノクローナル抗体の精製
遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインA−カラムを用いて精製する[Monoclonal Antibodies−Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
4.精製モノクローナル抗体の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体の活性評価は、以下のように行うことができる。
4.抗体のエフェクター活性を制御する方法
本発明のモノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のFc領域の297番目のアスパラギン(Asn)に結合するN結合複合型糖鎖の還元末端に存在するN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)にα−1,6結合するフコース(コアフコースともいう)の量を制御する方法(国際公開第2005/035586号明細書、国際公開第2002/31140号明細書、国際公開第00/61739号明細書)や、抗体のFc領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。
5.本発明の抗CD40モノクローナル抗体を用いた疾患の治療方法
本発明のモノクローナル抗体は、悪性腫瘍または感染症の治療に使用することができる。
5.本発明の抗CD40モノクローナル抗体を用いた疾患の診断方法
本発明のモノクローナル抗体を用いて、CD40またはCD40が発現した細胞を検出または測定することにより、CD40が関連する疾患を診断することができる。
(1)重鎖のDNA配列(配列番号1)
ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT CTTCCTGCCC GTGCTGGGCC TCCCATGGGG TGTCCTGTCA CAGGTCCAAC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGA CTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTC ACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCT AGCAACAGTG CTACTTGGAA CTGGATCAGG CAGTCCCCAT CGAGAGACCT TGAGTGGCTG GGAAGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGTCGA ATAATCATCA ACCCAGACAC ATCCAACAAC CAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACT CCCGAGGACA CGGCTATATA TTACTGTACA AGAGCACAGT GGCTGGGAGG GGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGCTAGC ACCAAGGGCC CATCGGTCTT CCCCCTGGCG CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAACT TCGGCACCCA GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA CCTGCAGCAG CACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCCGAGGTC CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACGTT CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG CTGAACGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CTCCATCGAG AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACACCTCCCA TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AA
(i)分泌シグナル:1番目のA〜60番目のA
(ii)可変領域:61番目のC〜444番目のA
・CDR1: 151番目のA〜171番目のC
・CDR2: 214番目のA〜267番目のT
・CDR3: 364番目のG〜411番目のC
(iii)定常領域:445番目のG〜1422番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく234位:784番目のG〜786番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく237位:790番目のG〜792番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく331位:1072番目のT〜1074番目のC
MSVSFLIFLP VLGLPWGVLS QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSATWNWIR QSPSRDLEWL GRTYYRSKWY RDYVGSVKSR IIINPDTSNN QFSLQLNSVT PEDTAIYYCT RAQWLGGDYP YYYSMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSNFGTQTYT CNVDHKPSNT KVDKTVERKC CVECPPCPAP PAAAPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTFRVV SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPASIE KTISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
(i)分泌シグナル:1番目のM〜20番目のS
(ii)可変領域:21番目のQ〜148番目のS
・CDR1: 51番目のS〜57番目のN
・CDR2: 72番目のR〜89番目のS
・CDR3: 122番目のA〜137番目のV
(iii)定常領域:149番目のA〜474番目のK
・KabatらによるEUインデックスに基づく234位:262番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく237位:264番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく331位:358番目のS
ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACA CTTTCGGCCC TGGGACCAAA GTGGATATCA AACGTACGGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG
CCCGTCACAA AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGT
(i)分泌シグナル:1番目のA〜60番目のA
(ii)可変領域:61番目のG〜372番目のA
・CDR1: 130番目のA〜162番目のC
・CDR2: 208番目のG〜228番目のT
・CDR3: 325番目のC〜342番目のT
(iii)定常領域:373番目のC〜693番目のT
MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNTFGPGTK VDIKRTVAAP SVFIFPPSDE QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C*
(i)分泌シグナル:1番目のM〜20番目のG
(ii)可変領域:21番目のE〜124番目のK
・CDR1: 44番目のR〜54番目のA
・CDR2: 70番目のD〜76番目のT
・CDR3: 109番目のQ〜114番目のT
(iii)定常領域:125番目のR〜231番目のC
(1)重鎖のDNA配列(配列番号21)
ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC CCACTCCCAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC CTTCACCGGC TACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAgtGGAT GGGATGGATC AACCCTGACA GTGGTGGCAC AAACTATGCA CAGAAGTTTC AGGGCAGGGT CACCATGACC AGGGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG GAGCTGAACA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCAGCCC CTAGGATATT GTACTAATGG TGTATGCTCC TACTTTGACT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG GTCACCGTCT CCTCAGCTAG CACCAAGGGC CCATCGGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGCAGCA GCACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GGCCTCCCAG CCTCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAA
(i)分泌シグナル:1番目のA〜57番目のC
(ii)可変領域:58番目のC〜435番目のA
(iii)定常領域:436番目のG〜1413番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく234位:775番目のG〜777番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく237位:781番目のG〜783番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく331位:1063番目のT〜1065番目のC
MDWTWRILFL VAAATGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTG YYMHWVRQAP GQGLEWMGWI NPDSGGTNYA QKFQGRVTMT RDTSISTAYM ELNRLRSDDT AVYYCARDQP LGYCTNGVCS YFDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPAA APSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPASIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K*
(i)分泌シグナル:1番目のM〜19番目のS
(ii)可変領域:20番目のQ〜145番目のS
(iii)定常領域:146番目のA〜471番目のK
・KabatらによるEUインデックスに基づく234位:259番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく237位:261番目のA
・KabatらによるEUインデックスに基づく331位:355番目のS
ATGAGGCTCC CTGCTCAGCT CCTGGGGCTC CTGCTGCTCT GGTTCCCAGG TTCCAGATGC GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC GTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC ATCACTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATTTAC AGCTGGTTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAACCTCCT GATCTATACT GCATCCACTT TACAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAACCT GAAGATTTTG CAACTTACTA TTGTCAACAG GCTAACATTT TCCCGCTCAC TTTCGGCGGA GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT
(i)分泌シグナル:1番目のA〜60番目のC
(ii)可変領域:61番目のG〜384番目のT
(iii)定常領域:385番目のA〜702番目のT
MRLPAQLLGL LLLWFPGSRC DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIY SWLAWYQQKP GKAPNLLIYT ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANIFPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC*
(i)分泌シグナル:1番目のM〜20番目のC
(ii)可変領域:21番目のD〜128番目のR
(iii)定常領域:129番目のT〜234番目のC
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
発現ベクターの作製 国際公開第02/088186号明細書に記載の抗CD40抗体のうち、ハイブリドーマKM341−1−19(受託番号BP−7759)が産生する抗体(以下、341−1−19抗体)の重鎖可変領域のDNA(配列番号3)を含むDNA断片、および軽鎖可変領域のDNA(配列番号13)を含むDNA断片をそれぞれ作製した。
抗体の発現および精製
実施例1で作製した発現ベクターをEndoFree Plasmid Kit(キアゲン社)にて調製
し、FreeStyleTM293 Expression System(インビトロジェンライフテクノロジー社)を用いて、当該発現ベクターを浮遊性293細胞(インビトロジェンライフテクノロジー社)に導入して、一過性発現により各抗体を含む培養上清を得た。孔径0.22μmのメンブランフィルター(MILLIPORE製)で濾過した培養上清(IgGとして約500μg)を抗体精製用アフニティーカラムであるHiTrap rProtein A FF(カラム体積1mL)(アマシャムバイオサイエンス社)にチャージし、PBS(−)で洗浄後20mMクエン酸バッファー(pH3.4)により溶出し、200mMリン酸バッファー(pH7.0)を含むチューブに回収した。N5KG2/V234A/G237A/P331S−341ベクター、N5KG2/P331S−341ベクター、N5KG2/V234A/G237A/P331S−21.4.1ベクター、およびN5KG2/P331S−21.4.1ベクターを有する細胞から得られた抗体を、それぞれIgG2−AAS(341)抗体、IgG2−S(341)抗体、IgG2−AAS(21.4.1)抗体、およびIgG2−S(21.4.1)抗体と命名した。
抗体の結合活性
実施例2で作製したIgG2−AAS(341)抗体、IgG2−S(341)抗体、IgG2−AAS(21.4.1)抗体、およびIgG2−S(21.4.1)抗体がヒトCD40に結合するかどうか調べるために、ヒトCD40を発現するRamos細胞(ATCC CRL−1596)への結合活性を測定した。
その結果、何れの抗体もヒトCD40に結合することを確認した(図1Aおよび図1B)。
抗体のアゴニスト活性
KM341−1−19抗体および21.4.1抗体はいずれもアゴニスト抗体として知られている。そこで、重鎖定常領域の相違によるアゴニスト活性への影響を調べた。Ramos細胞において、CD40リガンドを添加することにより、CD95の発現上昇が観察される。そこで、CD40リガンドの代わりに抗体を添加することにより、当該抗体のCD95の発現を指標に、当該抗体のアゴニスト活性を評価した。
抗体の血中滞留時間
実施例2で作製したIgG2−AAS(341)抗体、およびIgG2−S(341)抗体の生体内での血中滞留時間を調べるために、カニクイザルへの静脈投与を行い、血清中の薬物濃度を経時的に測定した。
その結果、IgG2−AAS(341)抗体はIgG2−S(341)抗体よりも血中滞留時間が延長することを確認した(図3)。
抗体投与後の血液生化学パラメーター
実施例2で作製したIgG2−AAS(341)抗体、およびIgG2−S(341)抗体が、投与された個体の血液生化学パラメーターに与える影響を調べるために、ヒトCD40BACトランスジェニックマウスへの静脈投与を行い、血清中の抗体濃度を経時的に測定した。
まず、ヒトCD40BACトランスジェニックマウスを作製した。ヒトCD40遺伝子を含む環状BAC(bacterial artificial chromosome)クローンを陰イオン交換カラム(MACHEREY−NAGEL社;#740579)により精製し、そのDNA溶液をC57BL/6J Jclマウス(日本クレア)の受精卵前核にマイクロインジェクションした。DNAを注入した受精卵は偽妊娠状態にした雌マウスの卵管に移植することにより個体を作出した。得られた個体の尾先端部をプロテアーゼK/SDSで一晩消化した後、ゲノムDNAをフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿で調製した。得られたゲノムDNAを鋳型にヒトCD40遺伝子領域の一部をPCRで増幅させ、ヒトCD40遺伝子を持つ個体を選別した。本マウスの末梢血をヘパリンコートキャピラリーで50μL採取し、PE標識抗ヒトCD40抗体(Beckman Coulter;IM1936U)を10μL添加し氷温下15分間インキュベートした。その後FACS Lysing Solution(BD)で溶血・固定させ、FACS(FACScalibur、ベクトンディッキンソン社)で蛍光を測定した。その結果、通常CD40が発現することが知られているB細胞、単核球、血小板にヒトCD40が発現していることを確認した。
その結果、IgG2−AAS(341)抗体はIgG2−S(341)抗体よりも、ASTおよびALTの濃度が低下することを確認した(図4A、図4B)。
抗体の腫瘍細胞に対する増殖抑制活性
T24細胞株(ATCC #HTB−4)は、1.0×105個/mLとなるように10%ウシ胎児血清(Invitrogen Cat#10099−141)を含むRPMI1640培地(GIBCO Cat#31800105)で調整し、96ウエルプレートに50μL/wellで播種した。実施例2で作製したIgG2−AAS(341)抗体を希釈し、96ウエルプレートに50μL/well添加し、5%CO2,37℃で3日間培養した。CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega Cat#G7570)を100μL/well加え、室温で10分間静置した。SpectraMax M5で発光シグナルを測定し、抗体を添加しなかった場合の生存細胞数を100%としたときの各濃度での生存細胞数の割合を計算した。その結果、IgG2−AAS(341)抗体は濃度依存的にT24細胞の増殖を抑制することを確認した。
ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT CTTCCTGCCC GTGCTGGGCC TCCCATGGGG TGTCCTGTCA CAGGTCCAAC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGA CTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTC ACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCT AGCAACAGTG CTACTTGGAA CTGGATCAGG CAGTCCCCAT CGAGAGACCT TGAGTGGCTG GGAAGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGTCGA ATAATCATCA ACCCAGACAC ATCCAACAAC CAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACT CCCGAGGACA CGGCTATATA TTACTGTACA AGAGCACAGT GGCTGGGAGG GGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGCTAGC ACCAAGGGCC CATCGGTCTT CCCCCTGGCG CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAACT TCGGCACCCA GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA CCTGCAGCAG CACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCCGAGGTC CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACGTT CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG CTGAACGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CTCCATCGAG AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACACCTCCCA TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AA
MSVSFLIFLP VLGLPWGVLS QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSATWNWIR QSPSRDLEWL GRTYYRSKWY RDYVGSVKSR IIINPDTSNN QFSLQLNSVT PEDTAIYYCT RAQWLGGDYP YYYSMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSNFGTQTYT CNVDHKPSNT KVDKTVERKC CVECPPCPAP PAAAPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTFRVV SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPASIE KTISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
CAGGTCCAAC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGA CTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTC ACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCT AGCAACAGTG CTACTTGGAA CTGGATCAGG CAGTCCCCAT CGAGAGACCT TGAGTGGCTG GGAAGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGTCGA ATAATCATCA ACCCAGACAC ATCCAACAAC CAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACT CCCGAGGACA CGGCTATATA TTACTGTACA AGAGCACAGT GGCTGGGAGG GGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCA
QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSATWNWIR
QSPSRDLEWL GRTYYRSKWY RDYVGSVKSR IIINPDTSNN QFSLQLNSVT PEDTAIYYCT RAQWLGGDYP YYYSMDVWGQ GTTVTVSS
AGCAACAGTG CTACTTGGAA C
SNSATWN
AGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGT
RTYYRSKWY RDYVGSVKS
GCACAGT GGCTGGGAGG GGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT C
AQWLGGDYP YYYSMDV
ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACA CTTTCGGCCC TGGGACCAAA GTGGATATCA AACGTACGGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGT
MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNTFGPGTK VDIKRTVAAP SVFIFPPSDE QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C
GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACA CTTTCGGCCC TGGGACCAAA GTGGATATCA AA
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNTFGPGTK VDIK
A GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CC
RASQSVS SYLA
GAT GCATCCAACA GGGCCACT
D ASNRAT
CAGCAG CGTAGCAACA CT
QQ RSNT
ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC CCACTCCCAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC CTTCACCGGC TACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAgtGGAT GGGATGGATC AACCCTGACA GTGGTGGCAC AAACTATGCA CAGAAGTTTC AGGGCAGGGT CACCATGACC AGGGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG GAGCTGAACA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCAGCCC CTAGGATATT GTACTAATGG TGTATGCTCC TACTTTGACT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG GTCACCGTCT CCTCAGCTAG CACCAAGGGC CCATCGGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGCAGCA GCACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GGCCTCCCAG CCTCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAA
MDWTWRILFL VAAATGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTG YYMHWVRQAP GQGLEWMGWI NPDSGGTNYA QKFQGRVTMT RDTSISTAYM ELNRLRSDDT AVYYCARDQP LGYCTNGVCS YFDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPAA APSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPASIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
CAG
GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC CTTCACCGGC TACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAgtGGAT GGGATGGATC AACCCTGACA GTGGTGGCAC AAACTATGCA CAGAAGTTTC AGGGCAGGGT CACCATGACC AGGGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG GAGCTGAACA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCAGCCC CTAGGATATT GTACTAATGG TGTATGCTCC TACTTTGACT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG GTCACCGTCT CCTCA
Q VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTG YYMHWVRQAP
GQGLEWMGWI NPDSGGTNYA QKFQGRVTMT RDTSISTAYM ELNRLRSDDT AVYYCARDQP LGYCTNGVCS YFDYWGQGTL VTVSS
ATGAGGCTCC CTGCTCAGCT CCTGGGGCTC CTGCTGCTCT GGTTCCCAGG TTCCAGATGC GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC GTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC ATCACTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATTTAC AGCTGGTTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAACCTCCT GATCTATACT GCATCCACTT TACAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAACCT GAAGATTTTG CAACTTACTA TTGTCAACAG GCTAACATTT TCCCGCTCAC TTTCGGCGGA GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT
MRLPAQLLGL LLLWFPGSRC DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIY SWLAWYQQKP GKAPNLLIYT ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANIFPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
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本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。
配列番号2−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号3−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖可変領域のDNA配列
配列番号4−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号5−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR1のDNA配列
配列番号6−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR1のアミノ酸配列
配列番号7−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR2のDNA配列
配列番号8−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR2のアミノ酸配列
配列番号9−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR3のDNA配列
配列番号10−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR3のアミノ酸配列
配列番号11−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖のDNA配列
配列番号12−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号13−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖可変領域のDNA配列
配列番号14−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号15−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖CDR1のDNA配列
配列番号16−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号17−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖CDR2のDNA配列
配列番号18−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号19−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖CDR3のDNA配列
配列番号20−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号21−人工配列の説明:IgG2−AAS(21.4.1)抗体の重鎖のDNA配列
配列番号22−人工配列の説明:IgG2−AAS(21.4.1)抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号23−人工配列の説明:IgG2−AAS(21.4.1)抗体の重鎖可変領域のDNA配列
配列番号24−人工配列の説明:IgG2−AAS(21.4.1)抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号25−人工配列の説明:IgG2−AAS(21.4.1)抗体の軽鎖のDNA配列
配列番号26−人工配列の説明:IgG2−AAS(21.4.1)抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号27−人工配列の説明:IgG2−AAS(21.4.1)抗体の軽鎖可変領域のDNA配列
配列番号28−人工配列の説明:IgG2−AAS(21.4.1)抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号29−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖定常領域のDNA配列
配列番号30−人工配列の説明:IgG2−AAS(341)抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号31−人工配列の説明:IgG2−S(341)抗体の重鎖定常領域のDNA配列
配列番号32−人工配列の説明:IgG2−S(341)抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列
Claims (20)
- 少なくとも234位のバリンがアラニンに、237位のグリシンがアラニンに、および331位のプロリンがセリンに置換(数字はKabatらによるEUインデックスに基づく)されているIgG2である重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体。
- 配列番号30で示される重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体。
- 配列番号6で示されるCDR1、配列番号8で示されるCDR2、および配列番号10で示されるCDR3を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号16で示されるCDR1、配列番号18で示されるCDR2、および配列番号20で示されるCDR3を有する軽鎖可変領域を有する、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。
- 配列番号4で示される重鎖可変領域、および配列番号14で示される軽鎖可変領域を有する、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマKM341−1−19(FERM BP−7759)が産生する抗体の重鎖可変領域およびハイブリドーマKM341−1−19(FERM BP−7759)が産生する抗体の軽鎖可変領域を有する、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマKM341−1−19(FERM BP−7759)が産生する抗体と競合する、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマKM341−1−19(FERM BP−7759)が産生する抗体のヒトCD40上のエピトープの一部または全部に結合する、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体をコードするDNA。
- 請求項8に記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項9に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
- 請求項10に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項1〜7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養物から該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
- 配列番号2で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチド、および配列番号12で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドを有する、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。
- 配列番号2で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNA、および配列番号12で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNAを含有する組換ベクター。
- 請求項13に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
- 請求項14に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項12に記載のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養物から該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする請求項12に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
- 請求項1〜7および12のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
- 請求項1〜7および12のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、悪性腫瘍または感染症の治療剤。
- 悪性腫瘍または感染症の治療剤の製造のための請求項1〜7および12のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体の使用。
- 悪性腫瘍または感染症の治療のための請求項1〜7および12のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜7および12のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を投与することを特徴とする、悪性腫瘍または感染症の治療方法。
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