WO2001040450A1

WO2001040450A1 - Nouvelle carbonyl reductase, son gene et son procede d'utilisation

Info

Publication number: WO2001040450A1
Application number: PCT/JP2000/008321
Authority: WO
Inventors: Noriyuki Kizaki; Yukio Yamada; Yoshihiko Yasohara; Junzo Hasegawa
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2001-06-07
Also published as: KR100512080B1; CZ20012792A3; HUP0105331A2; KR20020008116A; CA2360376C; DE60018909T2; NO20013801L; DE60018909D1; HUP0105331A3; EP1152054A1; US6645746B1; EP1152054B1; AU1551701A; MXPA01007858A; EP1152054A4; JP4510351B2; ES2240205T3; CA2360376A1; SI20642A; NO20013801D0

Description

明細書

新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法技術分野

本発明は、新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリべプチドを発現するための発現べクタ一、該発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体、および該形質転換体を用いた医薬 ·農薬などの合成原料として有用な化合物の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、 (S) - 6—クロ口— 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R， 5 S) — 6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを生成する酵素活性を持つ微生物より単離された、該酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現べクタ一、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。

本発明はまた、（3R， 5 S) — 6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルの製造方法に関し、この方法は、該形質転換体またはその処理物を（S) - 6—クロ口— 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t— ブチルと反応させる工程、および生成する（3R， 5 S) —6—クロロー 3， 5 ージヒドロキシへキサン酸！； e r t一ブチルを採取する工程を包含する。

(3R, 5S) — 6—クロ口一 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルは医薬 ·農薬等、特に HMG— C o A還元酵素阻害剤の合成原料として有用な化合物である。背景技術

(S) 一 6—クロ口— 5—ヒドロキシ一 3—ォキソへキサン酸 t e r t—プチルを不斉的に還元し、（3R, 5 S) 一 6—クロ口— 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t 一ブチルを生成する方法としては、ジェチルメトキシポランと水素化ホウ素ナトリゥムを用いる方法が唯一報告されている（米国特許第 52, 783, 1 31号）。しかし、該技術には、 -78でという極低温反応容器を必要とすること、高価な試材を用いることなど課題が多く、実用的な反応処方の開発が望まれている。発明の開示

本発明者らは、（S ) —6—クロ口— 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t —ブチルを不斉的に還元し、（3 R， 5 S ) — 6—クロロー 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t 一ブチルを生成する微生物由来のポリペプチドを見出し、（3 R, 5 S ) — 6 -クロ口一 3 , 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルを効率良く製造することが可能であることを見出して本発明を完成するに至った。

本発明は，（S ) —6—クロ口— 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t一ブチルを不斉的に還元して、（3 R， 5 S ) —6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t 一ブチルを生成し得るポリペプチドを提供することを課題とする。さらに、本発明は、遺伝子組み換え技術を利用して該ポリべプチドを効率よく生産することを課題とする。また、本発明は、該ポリペプチドとグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドを同時に高生産する形質転換体を提供し、さらに、該形質転換体を用いた実用的な（3 R, 5 S ) —6—クロロー 3 , 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t —ブチルの製造方法を提供することを課題とする。

本発明は、（S ) — 6—クロロー 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R， 5 S ) —6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t 一ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドに関する。このポリペプチドは、配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列、または配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列中で少なくとも 1つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含む。

好ましくは、このポリペプチドは、キャンディダ（Cand i d a) 属に属する微生物に由来し得る。さらに好ましくは、上記微生物は、キャンディダ'マグノリエ（Cand i d a magno l i ae) I F O 0705株であり得る。本発明は、 1つの局面で、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。

本発明は、 1つの局面で、（S) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R， 5 S) 一 6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号 2に示したヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドに関する。

本発明はまた、 1つの局面で、上記ポリヌクレオチドを含む発現べクタ一に関する。好ましくは、この発現ベクターはプラスミド pNTCRであり得る。上記発現ベクターは、 1つの実施態様で、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。

好ましくは、上記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、バシラス ·メガテリゥム（Ba c i l l u s me g a t e r i um) 由来のダルコ一ス脱水素酵素であり得る。

好ましくは、上記発現ベクターは、プラスミド pNTCRGであり得る。本発明はまた、 1つの局面で、上記の発現ベクターにより形質転換された、形質転換体に関する。

好ましくは、上記形質転換体は大腸菌であって、より好ましくは、 E. c o i i HB 101 (pNTCR) または E. c o 1 i HB 101 (pNTCR G) であり得る。本発明はまた、 1つの局面で、（3R, 5 S) —6—クロ口— 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルの製造方法に関し、この方法は、上記の形質転換体および/またはそれらの処理物を、（S) —6—クロロー 5—ヒドロキシ一 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルと反応させる工程、および生成した（ 3 R, 5S) — 6—クロ口— 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを採取する工程を包含する。

好ましくは、上記反応させる工程は、補酵素再生系の存在下で行われる。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。

図 2は、組換えプラスミド p NT CRGの作製方法を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、詳細に本発明を説明する。本発明に含まれるポリペプチドとしては、以下の式（I)で表される（S) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t _ブチルを不斉的に還元して、以下の式（Π)で表される（3R, 5 S) 一 6—クロ口— 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドであればいずれも用いることができる。

COOtBu (I) (S)— 6—クロロー 5—ヒドロキジ一 3—ォキソへキサン酸 tert—ブチル COOtBu (Π)

(3R,5S)— 6—ク□□ー3,5—ジヒドロキシへキン酸 tert—ブチルこのようなポリペプチドとして、例えば、配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列中で少なくとも 1つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列またはその一部を含み、かつ（S) —6—クロ口— 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R, 5S) — 6—クロ口 -3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをあげることができる。

本発明に含まれるポリペプチドは、（S) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシー 3 —ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3R, 5 S) - 6 - クロロー 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを生成する活性を有する微生物から取得することができる。従って、ポリペプチドの起源として用いられる微生物は特に限定されないが、例えばキャンディダ（Cand i da) 属酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはキャンディダ'マグノリエ（Can d i d a ma gn o 1 i a e) I FO 0705を挙げることができる。この株は、もとは、 Cen t r aa l bu r e au voo r Sch imme l c u 1 t u r e s (CBS ; Oo s t e r s t r aa t 1, P o s t b u s 273, NL - 3740 AG B a a r n, N e t h e r 1 a n d s ) に C B S 166の番号の下で寄託されていた微生物であり、その単離および性質は、「 The Ye a s t s, a Taxonomi c S t udy. 3 rd e d . 」 pp. 731 (1984)に記載されている。本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、細胞融合また

0 は遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物も用いられ得る。遺伝子操作された本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらの酵素を単離および/または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするヌクレォチド配列を得る工程、このヌクレオチド配列を他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、およびこの組換え微生物を培養して、本発明の酵素を得る工程を包含する方法により得られ得る。

本発明のポリペプチドを生産する微生物のための培養培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。

本明細書で用いられる用語「微生物の培養物」は、微生物の菌体または菌体を含む培養液を意味し、そして「その処理物」は、微生物の菌体または菌体を含む培養液から抽出または精製などの処理を行って得られた抽出物または精製物を意味する。

本発明に含まれるポリぺプチドを有する微生物からの該ポリぺプチドの精製は、常法により行い得る。例えば、該微生物の菌体を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離により菌体を集める。得られた菌体を例えば、ダイノミル（W i l l y A. B a c h o f e n社製）などで破枠し、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液に、例えば、塩析（硫酸アンモニゥム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、ポリべプチドが精製され得る。該酵素活性は、 1 0 O mMリン酸緩衝液（p H 6 . 5 ) に、基質（S ) — 6—クロロー 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t 一ブチル 5 mM、補酵素 NAD P H O . 3 3 mMおよび酵素を添加し、 3 0でで波長 340 nmの吸光度の減少を測定することにより行い得る。

本発明のポリペプチドは、例えば、配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列を含み得る。本発明の配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列中で少なくとも 1つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列またはその —部を含み、かつ（S) — 6—クロ口一 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R， 5 S) — 6—クロ口— 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルを生成する酵素活性を有するポリべプチドは、配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列をもつポリペプチドから、 Cu r r en t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o y (J ohn Wi l e y and Son s, I nc. , 1989) 等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、（S) — 6—クロロー 5—ヒドロキシ一 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R, 5 S) - 6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—プチルを生成する酵素活性を有する限り本発明のポリぺプチドに包含される。

本発明に含まれるポリヌクレオチドとしては、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれも用いることができるが、例えば、配列表の配列番号 2に示したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドをあげることができる。

配列表の配列番号 2に示したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドとは、配列表の配列番号 2に示したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー ·ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク ·ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、 0. 7~1. 0Mの NaC l存在下、 65ででハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度の S SC溶液の組成は、 15 OmM塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65での条件下でフィル夕一を洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。

ハイブリダイゼーション【ま、 Mo l e c u l a r C l on i ng, A l a bo r a t o ry manua l, s e c ond e d i t i on (Co l d Sp r i ng Ha r bo r Labo r a t o r y P r e s s, 1989) 等に記載されている方法に準じて行うことができる。八イブリダィズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号 2に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも 60 %の配列同一性、好ましくは少なくとも 80 %の配列同一性、より好ましくは少なくとも 90%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも 9 5%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも 99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。

本発明の（S) —6—クロ口— 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R， 5 S) — 6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコ ―ドするポリヌクレオチドは、コードされるポリぺプチドが上記酵素活性を有する限り、配列表の配列番号 2に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも 60% の配列同一性、好ましくは少なくとも 80%の配列同一性、より好ましくは少なくとも 90%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも 95%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも 99 %の配列同一性を有するポリヌクレオチドを包含する。用語「配列の同一性」は、対比される 2つのポリヌクレオチド配列が同一であることを意味し、対比される 2つのポリヌクレオチド配列間の配列同一性の割合（％)は、対比される 2つのポリヌクレオチド配列を最適に整列させた後、同一の核酸塩基 (例えば、 A、 T、 G、 ϋ、または I)が両方の配列で生じて適合した位置の数を得て適合位置数とし、適合した位置の数を比較ポリヌクレオチド総数で除し、そして、この結果に 100を乗じて計算される。配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る： Un i xベースの GCG W i s c on s i n Pa c k a e (P r og r am Manu a 1 f o r t h e Wi s c on s i n P a c k age, Ve r s i o n 8, 1994年 9月、 G ene t i c s Compu t e r Gr oup, 575 S c i e nc e D r i ve Mad i s on, Wi s c on s i n, USA53711 ; R i c e、 P. (1996) P r og r am Manu a l f o r EGCG P a c k age, P e t e r R i c e、 The S ange r Cen t r e, H i nx t on H a l l、 Camb r i d g e, CB 10 1 RQ、 Eng l and) および t h e ExPASy Wo r i d Wi d e We b分子生物学用サーバー（Gen e v a Un i v e r s i t y Ho s p i t a 1 and Un i v e r s i t y o f Ge neva, Genev a、 Swi t z e r l and) 。

本発明のポリヌクレオチドは、（S) -6—クロ口— 5—ヒドロキシ一 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R， 5 S) 一 6—クロロー 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを生成する酵素活性を有する微生物より取得することができる。該微生物として、例えばキャンディダ（ Cand i d a) 属酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはキャンディダ' マグノリエ（C a n d i d a magno l i a e) I FO0705を挙げることができる。

以下に、（S) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R， 5 S) — 6—クロロー 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルを生成する酵素活性を有する微生物より、本発明に含まれるポリヌクレオチドを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。

まず、精製した該ポリペプチド、および該ポリペプチドを適当なエンドべプチダーゼで消化することにより得られるぺプチド断片の部分アミノ酸配列を、ェドマン法により決定する。そして、このアミノ酸配列情報をもとにヌクレオチドプライマーを合成する。次に、該ポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のヌクレオチド単離法、例えば He r e f o r d法（C e 1 1， 18， 1261 (1979) ) により、該微生物の染色体 DNAを調製する。この染色体 DNA を铸型として、先述のヌクレオチドプライマーを用いて PCRを行い、該ポリべプチド遺伝子の一部を増幅する。さらに、ここで増幅された該ポリペプチド遺伝子の一部を通常用いられる方法、例えばランダムプライムラべリング法（Ana 1. B i o chem. , 132, 6 (1983) ) で標識し、ヌクレオチドプロ —ブを調製する。該微生物の染色体 DN Αを適当な制限酵素により切断し、該制限酵素切断断片をベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入することにより、該微生物染色体の DNAライブラリーを構築する。先述のヌクレオチドプローブを用いて、コロニー ·ハイブリダィゼ一シヨン法、プラークハイブリダィゼーシヨン法等により、この DNAライブラリ一のスクリーニングを行い、該ポリぺプチド遺伝子を含む D N Aを得ることができる。このようにして得られた該ポリペプチド遺伝子を含む DNA断片のヌクレオチド配列は、ジデォキシ *シークエンス法、ジデォキシ ·チェイン 'ターミネイシヨン法などにより決定することができる。例えば、 AB I PR I SM Dye Te rmi n a t o r Cyc l e S e qu e n c i ng Re ady Re a c t i on K i t ( Pe r k i n E 1 me r社製）および AB I 373 A DNA S e q e n c e r (Pe r k i n E 1 m e r社製）を用いて行われ得る。

本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターとしては、適当な宿主微生物内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクタ一、コスミドベクタ一、から選ばれたものが挙げられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよい。このようなベクターは、通常、 1 a c UV 5プロモーター、 t r pプロモータ一、 t r cプロモーター、 t a c プロモータ一、 l ppプロモーター、 t u f Bプロモー夕一、 r e cAプロモー夕一、 pLプロモーター等の制御因子を含み、本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。

本願明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、ェンハンサ一、 CCAATボックス、 TATAポックス、 SP I部位など）を有するヌクレオチド配列をいう。

本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ポリヌクレオチド力その発現を調節するプロモータ一、ェンハンサ一等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

本発明のヌクレオチドを有するベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などがあげられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のヌクレオチドは常法により宿主細胞に導入され得る。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のヌクレオチドを導入することができる。

本発明のポリペプチドを用いて（S) — 6—クロロー 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3R, 5 S) —6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを生産する場合、 NAD PH、 NADH等の補酵素が必要となる。しかし、酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質とともに、つまり補酵素再生系を本発明のポリぺプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース— 6—リン酸脱水素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。このような反応は、補酵素再生系を不斉反応系内に添加することによつても行われ得るが、本発明に含まれる、（S ) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元し（3 R， 5 S ) 一 6— クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両者により形質転換せしめられた形質転換体を触媒として用いた場合、補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加することなしに、該反応を効率良く実施し得る。このような形質転換体は、（S ) — 6—クロロー 5—ヒドロキシ一 3—ォキソへキサン酸 t e r t一ブチルを不斉的に還元し（3 R， 5 S ) —6—クロ口— 3 , 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを生成する酵素活性を有するポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、およびグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら 2種のポリヌクレオチドを不和合性グループの異なる 2種のベクターにそれぞれ組み込み、それらのポリヌクレオチドを同一の宿主細胞に導入することによつても得られ得る。

形質転換体中のグルコース脱水素酵素活性は、 1 Mトリス塩酸緩衝液（p H 8 . 0 ) に、基質グルコース 0 . 1 M、補酵素 NAD P 2 mMおよび酵素を添加し、 2 5でで波長 3 4 0 n mの吸光度の増加を測定することにより行い得る。

本発明に含まれる形質転換体を用いた（3 R， 5 S ) 一 6—クロ口— 3， 5— ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルの生産は以下のように実施され得る。まず最初に、適当な溶媒中に基質（S ) —6—クロロー 5—ヒドロキシー 3— ォキソへキサン酸 t e r t—ブチル、 NAD P等の補酵素、および該形質転換体の培養物またはその処理物等を添加し、 P H調整下、攪拌して反応させる。この反応は 1 0 ：〜 7 0での温度で行われ、反応中反応液の PHは 4〜 1 0に維持する。反応はバッチ方式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合、反応基質は 0. 1%から 70% (w/v) の仕込み濃度で添加される。ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。また、本反応を行う際、形質転換体として本発明のポリペプチドとグルコース脱水素酵素の両者を生産するものを用いる場合、反応系にさらにグルコースを添加することにより、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。

反応で生じた（3R， 5 S) 一 6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルは常法により精製され得る。例えば、必要に応じ遠心分離、濾過などの処理を施して菌体等の懸濁物を除去した後、酢酸ェチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、硫酸ナトリウム等の脱水剤で脱水後、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに晶析またはクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製され得る。

本反応において、基質となる（S) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t一ブチルは、例えば、本明細書に参考として援用される、米国特許第 52, 783, 131号に記載の方法で調製され得る。

(S) —6—クロ口— 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—プチル、 (3 R, 5 S) — 6—クロロー 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t— ブチルの定量、および（3 R， 5 S) —6—クロロー 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—プチルのジァステレオマー比の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク社製 COSMOS I L 5 CN-R ( I D4. 6 X 250mm) 、溶離液： 1 mMリン酸水溶液ァセトニトリル = 5 Z 1、流速： 0. 7m 1 /mi n、検出： 210 nm、カラム温度： 3 Ot) で行い得る。

以上のように、本発明に従えば、本発明に含まれるポリべフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、（3R, 5 S) 一 6—クロ口— 3, 5ージヒドロキシへキサン酸 t e r t—プチルの優れた製造法が提供される。以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。実施例

以下の実施例において用いた組み換え DNA技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている。

Mo l e c u l a r C l on i ng 2nd Ed i t i on (Co l d S p r i n g Ha r o r Labo r a t o ry P r e s s, 1989)

Cu r r en t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o gy (Gr e en e Pub l i s h i ng As s oc i a t e s and W i 1 ey— I n t e r s c i enc e) (実施例 1 ：不斉還元酵素活性を有するポリペプチドの精製）

以下の方法に従って、キャンディダ ·マグノリエ（Cand i d a ma g no l i a e) I FO0705より（S) — 6—クロ口一 5—ヒドロキシ一 3— ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3R， 5 S) 一 6—クロロ一 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルを生成する酵素活性を有するポリぺプチドを単一に精製した。

(キャンディダ 'マグノリエ（C and i d a ma gn o 1 i a e) I F OO 705株の培養）

3 OLジャーフアーメンター（丸菱バイオェンジ社製）に下記の組成からなる液体培地 18 Lを調製し、 120 で 20分間蒸気殺菌をおこなった。

培地組成：水道水中の、グルコース 4. 0%、イーストエキス 0. 5%、 KH ₂P〇₄ 0. 1 %、 (NH₄) ₂HP0₄ 0. 65%、 NaC l 0. 1 %、 Mg S0₄ - 7H₂0 0. 8%、 Z n S0₄ · 7H₂0 0. 06%, F e S0₄ - 7H 20 0. 09%、 CuS0₄ · 5H₂0 0. 005%、 MnS〇₄ * 4〜6H₂〇 0. 01%、アデ力ノール LG— 109 (日本油脂製） 0. 02%、 pH7. 0。

この培地に >予め同培地にて前培養しておいたキャンディダ ·マグノリエ I

FO 0705 (Cand i d a ma g n o 1 i a e I FO 0705) 株の培養液を 180m 1ずつ接種し、攪拌回転数 295 r pm、通気量 5. ONL/m i n、 33 :で、 30% (wZw) 水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより下限 PHを 6. 5に調整しながら培養した。培養開始から 22時間後と 25時間後に 55% (wZw) グルコース水溶液 655 gを添加し、 30時間培養を行つた。

(無細胞抽出液の調整）

上記の培養液 10しから遠心分離により菌体を集め、生理食塩水にて菌体を洗浄した。このようにして，該菌株の湿菌体 1350 gを得た。この湿菌体を 27 00mlの 10 OmMリン酸緩衝液（PH6. 7) に懸濁した後、 2—メルカプトェタノ一ルおよびフッ化フエ二ルメチルスルホニルをそれぞれ終濃度 5 mM、 0. ImMとなるよう添加し、菌体をダイノミル（ W i 1 1 y A. B a c ho f e n社製）で破砕した。この菌体破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液 2880mlを得た。

(硫酸アンモニゥム分画）

上記で得た無細胞抽出液に 60%飽和となるように硫酸アンモニゥムを添加して溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除去した（この際無細胞抽出液の pHをアンモニア水で PH6. 7に維持しながら行った）。先と同様 pH6. 7を維持しながら、この遠心上清に 75%飽和となるようさらに硫酸アンモニゥムを添加して溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を 2mMの 2—メルカプトエタノールを含む 1 OmMリン酸緩衝液（ρΗ7· 0) に溶解し、同一緩衝液で 1夜透析した。

(DEAE— TOYO PEARLカラムクロマトグラフィー）

上記で得られた粗酵素液を、 2 mMの 2—メルカプトエタノールを含む 10m Mリン酸緩衝液（pH7. 0) で予め平衡化した DEAE— TOYOPEARL 650M (東ソ一株式会社製）カラム（50 Oml) に供して酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 NaC l ( 01^から0. 5Mまで）のリニアグラジェントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め， 2 mMの 2—メルカプトエタノールを含む 1 OmMリン酸緩衝液 (pH7. 0) にて 1夜透析を行った。

(Pheny l s e p h a r o s eカラムクロマトグラフィー）

上記で得られた粗酵素液に終濃度 1Mとなるよう硫酸アンモニゥムを溶解し（この際粗酵素液の pHをアンモニア水で pH7. 0に維持しながら行った）、 2 mMの 2—メルカプトエタノ一ルおよび 1 Mの硫酸アンモニゥムを含む 10 mM リン酸緩衝液（ρΗ7. 0) で予め平衡化した Ph e ny 1 s e ph a r o s e CL-4B (Ph a rma c i a B i o t e c h社製）カラム（ 140 m 1) に供して酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニゥム（1Mから0Mまで）のリニアグラジェントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、 2mMの 2—メルカプトエタノールを含む 1 OmMリン酸緩衝液（pH7. 0) にて 1夜透析を行った。

(B l u e s e ph a r 0 s eカラムクロマトグラフィー）

上記で得られた粗酵素液を、 2mMの 2—メルカプトエタノールを含む 10m Mリン酸緩衝液（pH7. 0) で予め平衡化した B 1 u e s e ph a r o s e CL-6B (Ph a rma c i a B i o t e c h社製）カラム（40ml) に供して酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 NaC l (01^から 11^まで）のリニアグラジェントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集めた後、 2mMの 2—メルカプトエタノールを含む 1 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 0) にて 1夜透析を行った。

(Su e r <3—丁〇¥0?£八1 しカラムクロマトグラフィ一）

上記で得られた粗酵素液を、 2 mMの 2—メルカプトエタノールを含む 1 Om Mリン酸緩衝液（pH7. 0) で予め平衡化した S u p e r Q— TOYOPEA RL 65 O S (東ソ一株式会社製）カラム（12ml) に供し、酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 NaC l ( 0Mから 0. 4Mまで）のリニアグラジェントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め > 2 mMの 2—メルカプトエタノールを含む 1 OmMリン酸緩衝液 (pH7. 0) にて 1夜透析を行い、電気泳動的に単一な精製ポリペプチド標品を得た。以後、このポリペプチドを CR酵素と呼ぶことにする。

(実施例 2 ： CR酵素遺伝子のクローニング）

(合成オリゴヌクレオチドプローブの作成）

実施例 1で得られた精製 C R酵素を 8 M尿素存在下で変性した後、ァクロモバクタ一由来のリシルエンドべプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を AB I 492型プロテインシーケンサー (パーキンエルマ一社製）により決定した。このアミノ酸配列をもとに、配列番号 3および配列番号 4に示す 2種のヌクレオチドプライマ一を常法に従つて合成した。

(PCRによる CR酵素遺伝子の増幅）

キャンディダ 'マグノリエ（C a n d i d a ma g n o 1 i a e) I F〇 0705の培養菌体から He r e f o r d法（C e 1 1， 18， 1261 (19 79) ) に従って染色体 DNAを抽出した。次に、上記で調整したヌクレオチドプライマ一を用い、得られた染色体 D N Aを铸型として P C Rを行つたところ、 CR酵素遺伝子の一部と考えられる約 350 b pのヌクレオチド断片が増幅された。 (染色体 DNAライブラリーの作成）

キャンディダ ·マグノリエ（Cand i d a magno l i a e) I FO 0705の染色体 DNAを制限酵素 A p a Iで完全消化した後、ァガロースゲル電気泳動により分離した。次に、上記で得られた約 35 Obpの DNA断片をプローブとして用い、サザン法（J. Mo 1. B i o l. , 98， 503 (197 5) ) により該染色体 DNA消化物の解析を行った（ヌクレオチドプローブの標識およびその検出は Ge n e I m a g e sラベリング ·検出システム（アマシャム株式会社製）を用いて行った）。その結果、約 5. 5 kbのヌクレオチド断片が該ヌクレオチドプローブとハイプリダイズすることが判った。

そこで、該消化物をァガロースゲル電気泳動により分離した後、 4. 3 kb力ら 6. 2 kbのヌクレオチド断片を回収した。これらのヌクレオチド断片をべクタープラスミド pB 1 u e s c r i p t I I KS (—） (STRATAGEN E社製）の Ap a I部位に挿入した後、大腸菌 JM109株に導入し、同菌株の染色体 DNAライブラリーを作成した。

(染色体 DNAライブラリ一のスクリーニング）

上記で得られたヌクレオチド断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダィゼーション法により上記で作成した染色体 D N Aライブラリーのスクリ一ニングを行った（ヌクレオチドプローブの標識およびその検出は Ge n e I mag e sラベリング ·検出システム（アマシャム株式会社製）を用い、実験手順も同システムの取り扱い説明書に従った）。その結果、 1個の陽性コロニーが得られた。次に、この陽性コロニーから得られた約 5. 5 kbの DNAが挿入された組換えプラスミドを E c o R Iおよび S p h Iで二重消化し、先と同様にサザン法で解析した結果、両制限酵素で消化した際に生じる約 1. O kbのヌクレオチド断片がハイブリダィズした。そこで、この約 1. 0 kbのヌクレオチド断片をプラスミド pUC 19 (宝酒造株式会社製）の Ec oR I— Sph l部位に挿入した組み換えプラスミド pUC— ESを構築し、 CR酵素遺伝子を含む染色体 DN Aクローンとして選択した。

(ヌクレオチド配列の決定）

上記で得られた組換えプラスミド p U C— E Sについて、種々の制限酵素を作用させた際に生じる消化断片の解析を行い、制限酵素切断地図を作成した。次に、この解析の際に得られた各種ヌクレオチド断片を pUC 19のマルチクローニングサイトに揷入した組換えプラスミドを構築した。これらの組み換えプラスミドを用いて、各々の挿入断片のヌクレオチド配列分析を AB I PR I SM Dy e Te rmi n a t o r Cyc l e S e que nc i ng Re ady Re a c t i on K i t (P e r k i n E lme r社製）および AB I 3 73 A DNA S e qenc e r (P e r k i n E lme r社製）を用いて行い、目的遺伝子が含まれると予想される約 1. Okbのヌクレオチド断片の全ヌクレオチド配列を決定した。そのヌクレオチド配列を図 2に示した。また、このヌクレオチド配列中の構造遺伝子部分については、そのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列を図 1中でヌクレオチド配列の下段に示した。このアミノ酸配列と、精製 CR酵素のリジルエンドべプチダ一ゼ消化断片の部分アミノ酸配列を比較した結果、精製 CR酵素の部分アミノ酸配列は全て、ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、その部分で完全に一致した（図 1中のアミノ酸配列の下線部分）。このことから、本遺伝子が CR酵素遺伝子であると判断した。

(実施例 3 ： CR酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドの作製）

CR酵素の構造遺伝子の開始コドン部分に Nd e I部位を付加し、終始コドンの直後に新たな終止コドン（TAA) と E c oR I切断点を付加し、さらに、同遺伝子内に存在する S a 1 I切断点をアミノ酸コードを変更せずに破壊する目的で同遺伝子の 5' 末端から 6ヌクレオチド目の Gを Tに変換した二本鎖 DNAを以下の方法により取得した。実施例 2で決定されたヌクレオチド配列を基に、 C R酵素遺伝子の開始コドン部分に Nd e I部位を付加し、同遺伝子の 5' 末端から 6ヌクレオチド目の Gを Tに変換した N末端ヌクレオチドプライマーと、同遺伝子の終始コドンの直後に新たな終止コドン（TAA) と Ec oR I部位を付加した C末端ヌクレオチドプライマーを合成した。これら 2つのプライマーのヌクレオチド配列を配列番号 5および配列番号 6に示した。これら 2つの合成ヌクレオチドプライマーを用い、実施例 2で得たプラスミド p U C— E Sを铸型として PCRにより二本鎖 DNAを増幅した。得られた DNA断片を Nd e Iおよび E c oR Iで消化し、プラスミド pUCNT (WO 94/03613) の 1 a cプロモーターの下流の Nd e I、 E c oR I部位に挿入することにより、組換えプラスミド pNTCRを得た。

(実施例 4 ： CR酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を同時に含む組換えプラスミドの作製）

ノシラス 'メガテリゥム（B a c i 1 1 u s me ga t e r i um) I AM 1030株由来のグルコース脱水素酵素（以後、 GDHと呼ぶことにする）の遺伝子の開始コドンから 5ヌクレオチド上流に大腸菌の S ha i n e-Da 1 ga r no配列（9ヌクレオチド）を、さらにその直前に Ec oR I切断点を、また、終止コドンの直後に Sail切断点を付加した二本鎖 DN Aを、以下の方法により取得した。 GDH遺伝子のヌクレオチド配列情報を基に、 GDHの構造遺伝子の開始コドンから 5ヌクレオチド上流に大腸菌の Sh a i n e— Da l g a rno配列（9ヌクレオチド）を、さらにその直前に Ec oR I切断点を付加した N末端ヌクレオチドプライマーと、 GDHの構造遺伝子の終始コドンの直後に S a 1 I 部位を付加した C末端ヌクレオチドプライマーを常法に従って合成した。これら 2つのヌクレオチドプライマ一のヌクレオチド配列を配列番号 7および 12列番号 8に示した。これら 2つのヌクレオチドプライマーを用い、プラスミド pGDK 1 (Eu r. J. B i o c hem. 186， 389 (1989) ) を铸型として PCRにょりニ本鎖DNAを合成した。得られた DNA断片を E c o R Iおよび S a i lで消化し、実施例 3において構築した p NT CRの E c o R I、 S a l I部位（CR酵素遺伝子の下流に存在する）に挿入した組み換えプラスミド pN TCRGを得た。 p NT C R Gの作製法および構造を図 2に示す。

(実施例 5 ：組み換え大腸菌の作製）

実施例 3で得た組み換えプラスミド p NTC Rおよび実施例 4で得た組み換えプラスミド pNTCRGを用いて大腸菌 HB 101 (宝酒造株式会社製）を形質転換し、各々から組み換え大腸菌 HB 101 (pNTCR) および HB 101 ( pNTCRG) を得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌 HB 101 ( pNTCR) および HB 101 (pNTCRG) は、それぞれ、受託番号 FER M BP— 6897および FERM B P— 6898として 1 999年 9月 28 日付けで、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ夕ぺス卜条約に基づいて工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1一 3) に寄託されている。

(実施例 6 ：組み換え大腸菌における CR酵素の発現）

実施例 5で得た組み換え大腸菌 HB 1 01 (pNTCR) を 120 ^ g m 1 のアンピシリンを含む 2 XYT培地で培養し、集菌後、 l O OmMリン酸緩衝液 (pH6. 5) に懸濁し、超音波破碎により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の CR酵素活性を以下のように測定した。 CR酵素活性の測定は、 100m Mリン酸緩衝液（pH6. 5) に、基質（S) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシ— 3ーォキソへキサン酸 t e r t—ブチル 5mM、補酵素 NADPH 0. 333m Mおよび酵素を添加し、 30°Cで波長 340 nmの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、 1分間に 1 ^mo 1の NADPHを NA DPに酸化する酵素活性を 1 u n i tと定義した。この様に測定した無細胞抽出液中の CR酵素活性を比活性として表し、コントロールとしてベクタープラスミドを保持する形質転換体の値と比較した。また、実施例 1と同様の方法で調製したキャンディダ ·マグノリエ（C a n d i d a magno l i a e) I FO 0705の無細胞抽出液中の CR酵素活性についても同様に比較した。それらの結果を表 1に示す。

表 1. 組換え大腸菌における CR酵素の発現

表 1に示されるように、大腸菌 HB 101 (pNTCR) では、ベクターブラスミドのみの形質転換体である大腸菌 HB 101 (pUCNT) と比較して明らかな CR酵素活性の増加が見られ、キャンディダ 'マグノリエ（Cand i d a magno l i a e) I FO0705と比較して約 34倍の活性が得られた。

(実施例 7 ：組換え大腸菌における CR酵素および GDHの同時発現）

実施例 5で得た組み換え大腸菌 HB 101 (pNTCRG) を、実施例 6と同様に処理して得られる無細胞抽出液の GDH活性を、以下のように測定した。 G DH活性の測定は 1Mトリス塩酸緩衝液（pH8. 0) に、基質グルコース 0. 1M、補酵素 NAD P 2 mM及び酵素を添加し、 25 X：で波長 340 nmの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、 1分間に l m o 1の NADPを NADPHに還元する酵素活性を 1 un i tと定義した。また、 CR酵素活性についても実施例 5と同様に測定した。このように測定した無細胞抽出液中の CR酵素および GDH活性を比活性として表し、大腸菌 HB 101 (pNTCR) およびべクタ一のみの形質転換体 HB 101 (pUCNT) と比較した結果を表 2に示す。

(以下余白）表 2. 組換え大腸菌における CR酵素および GDHの同時発現

表 2に示されるように、大腸菌 HB 101 (pNTCRG) では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌 HB 101 (pUCNT) と比較して、明らかな C R酵素および G D H活性の増加が見られた。

(実施例 8 ： CR酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌による（S) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシ一 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルからの（3R， 5

S) —6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルの合成）実施例 5で得た組換え大腸菌 HB 101 (pNTCR) を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅菌した 50m lの 2 X YT培地（バクト ' トリプトン 1. 6% (wノ V) 、バクト ·イーストエキス 1. 0% (w/v) 、 NaC 1 0. 5 %

(w/v) 、 pH7. 0) に接種し、 37でで 16時間振とう培養した。得られた培溶液 25mlにグルコース脱水素酵素（天野製薬株式会社製） 680 u n i t、グルコース 5. 0 g、 NADP 3. 0mg、 (S) 一 6—クロ口一 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチル 4. 5 gを添加し、 5Mの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより PH 6. 5に調整しながら、 30 で 40時間撹拌した。反応終了後、反応液を酢酸ェチルで抽出し、脫溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、収率 96. 9%で（3R， 5 S) 一 6—クロロー

3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルが得られた。この際、生成した（3R， 5 S) —6—クロロー 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルのジァステレオマー過剰率は、 98. 2%d eであった。

(S) 一 6—クロ口— 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—プチル、 (3 R, 5 S) — 6—クロ口— 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t— ブチルの定量、および（3R， 5 S) 一 6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルのジァステレオマー比の測定は、高速液体クロマトダラフィ一（カラム：ナカライテスク社製 COSMOS I L 5 CN-R (I D4. 6X25 Omm) 、溶離液： 1 mMリン酸水溶液 Zァセトニトリル = 5ノ 1、流速： 0. 7m 1 Zm i n、検出： 210 nm、カラム温度： 30で）で行った。

(実施例 9 ： CR酵素およびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組み換え大腸菌による（S) —6—クロロー 5—ヒドロキシ一 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルからの（3 R， 5 S) — 6—クロロー 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルの合成）

実施例 4で得た組換え大腸菌 HB 101 (pNTCRG) を、 500ml容坂口フラスコ中で滅菌した 100mlの 2XYT培地（バクト · トリプトン 1. 6 % (w/v) 、バクト ·イーストエキス 1. 0% (w/v) 、 NaC l 0. 5% (w/v) 、 pH7. 0) に接種し、 37でで 16時間振とう培養した。得られた培養液 25m 1にグルコース 5. 0 g、 NADP 1. 5mg、 (S) 一 6—クロ口— 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチル 5. 0 g を添加し、 5 Mの水酸化ナトリウム水溶液で pH 6. 5に調製しつつ 30 で 2 4時間撹拌した。反応終了後、反応液を酢酸ェチルで抽出し、脱溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、収率 97. 2%で（3R， 5S) —6—クロロー 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルが得られた。この際、生成した (3 R, 5S) — 6—クロロー 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルのジァステレオマー過剰率は、 98. 5%d eであった。産業上の利用可能性

(S) - 6—クロ口一 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルを不斉的に還元して（3 R， 5 S) 一 6—クロロー 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチド遺伝子のクロ一二ング、およびそのヌクレオチド配列の解析により、該ポリペプチド産生能の高い形質転換体を得ることが可能になった。また、該ポリペプチドおよびダルコ —ス脱水素酵素を同時に高生産する能力を有する形質転換体をも得ることが可能になった。さらに、これらの形質転換体を用いることにより、（S ) —6—クロ口— 5—ヒドロキシー 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルからの（3 R， 5 S ) 一 6—クロロー 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルの合成を効率良く行うことが可能となった。

Claims

請求の範囲

1. (S) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシ一 3—ォキソへキサン酸 t e r t— ブチルを不斉的に還元して（3R, 5 S) 一 6—クロ口— 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドであって、配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列、または配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列中で少なくとも 1つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。

2. キャンディダ（C and i d a) 属に属する微生物に由来する、請求項 1 に記載のポリペプチド。

3. 前記微生物が、キャンディダ'マグノリエ（Cand i d a magno 1 i a e) I FO 0705株である、請求項 2に記載のポリペプチド。

4. 請求項 1ないし 3のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

5. (S) — 6—クロ口— 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t— ブチルを不斉的に還元して（3 R, 5 S) 一 6—クロロー 3， 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t一ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号 2に示したヌクレオチド配列とストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチド。

6. 請求項 4および 5に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

7. プラスミド pNTCRである、請求項 6記載の発現ベクター。

8. グルコース脱水素酵素活性を有するポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレォチドをさらに含む、請求項 6に記載の発現ベクター。

9. 前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス ·メガテリゥム（Ba c i l l u s me g a t e r i urn) 由来のグルコース脱水素酵素である、請求項 8に記載の発現ベクター。

10. プラスミド p NT CRGである、請求項 9に記載の発現ベクター。

1 1. 請求項 6から 10のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた、形質転換体。

12. 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項 1 1に記載の形質転換体。

13. E. c o l i HB 101 (pNTCR) である、請求項 12に記載の形質転換体。

14. E. c o l i HB 101 (pNTCRG) である請求項 12に記載の形質転換体。

15. 請求項 11から 14のいずれかに記載の形質転換体および/またはそれらの処理物を、（S) —6—クロロー 5—ヒドロキシ— 3—ォキソへキサン酸 t e r t—ブチルと反応させる工程、および生成した（3R， 5 S) — 6—クロ口 —3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルを採取する工程を包含する、

(3R， 5S) — 6—クロロー 3, 5—ジヒドロキシへキサン酸 t e r t—ブチルの製造方法。

16. 前記反応させる工程が、補酵素再生系の存在下で行われる、請求項 15 に記載の方法。