WO1999007872A9 - PREPARATION D'INHIBITEURS DE LA HMG-CoA REDUCTASE - Google Patents

PREPARATION D'INHIBITEURS DE LA HMG-CoA REDUCTASE

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WO1999007872A9
WO1999007872A9 PCT/JP1998/003396 JP9803396W WO9907872A9 WO 1999007872 A9 WO1999007872 A9 WO 1999007872A9 JP 9803396 W JP9803396 W JP 9803396W WO 9907872 A9 WO9907872 A9 WO 9907872A9
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microorganism
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Yutaka Takano
Masaru Hasegawa
Hideo Mori
Katsuhiko Ando
Keiko Ochiai
Hiroaki Motoyama
Akio Ozaki
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Kyowa Hakko Kogyo Kk
Yutaka Takano
Masaru Hasegawa
Hideo Mori
Katsuhiko Ando
Keiko Ochiai
Hiroaki Motoyama
Akio Ozaki
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a compound that inhibits hydroxymethyldartharyl CoA reductase (hereinafter abbreviated as HMG-COA reductase) and has a serum cholesterol lowering effect and the like.
  • HMG-COA reductase hydroxymethyldartharyl CoA reductase
  • R 1 represents a hydrogen atom or an alkali metal [hereinafter, referred to as compound (Va)] or a general formula (Vb) ′
  • Abscidia is a microorganism capable of producing a compound (VI-a) or a compound (VI-b) from a closed lactone of the compound (Va) [hereinafter, referred to as the compound (Vb)]. Absidia, Genus Cunninghamella, Synephalasporum and Streptomyces
  • Microorganisms belonging to the genus (Streptomyces) (Japanese Patent Application Laid-open No. 57-89094), genus Actinomucor, genus Circinella, genus Gongronella, Mortierella (Mc ⁇ ) genus tierella, genus Mucor, genus Phycomyces, genus Lysopus, genus Synthephalastrum, genus Zygorhynchus, genus Pycnoporus , Microorganisms belonging to the genus Rhizoctonia and the genus Nocardia [The 'Journal of Antibiotics', 36, 887 (1983)], Amicola overnight
  • Genus (Amycolata), genus Saccharopolvspora, genus Amycolatopsis and genus Saccharothrix Microorganisms (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-184670) and Actinomadura
  • Microorganisms belonging to the genus (Actinomadura) (WO96 / 40863) are known.
  • the above microorganisms belong to actinomycetes or filamentous fungi.
  • no microorganism belonging to the bacterium and capable of producing the compound (VI-a) or the compound (VI-b) from the compound (V-a) or the compound (V-b), respectively, is known.
  • Actinomycetes and filamentous fungi have a disadvantage that they grow more slowly than bacteria, so it takes time to obtain the amount of cells required for the reaction.
  • actinomycetes and filamentous fungi also have a problem that it is difficult to control the culture in a fermenter.
  • actinomycetes and filamentous fungi have problems in culturing.Because bacteria do not form hyphae, the viscosity of the culture solution is hardly increased, and there is little chance of insufficient aeration and unevenness of the culture solution. The culture management is easy.
  • Genes are often expressed in bacteria such as Escherichia coli using gene recombination technology. It is generally difficult to express.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a compound that inhibits HMG-CoA reductase and has a serum cholesterol lowering effect and the like.
  • the present invention is based on a microorganism belonging to the genus Bacillus and having the general formula (I-a)
  • R 1 represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl or alkali metal, and R 2 represents substituted or unsubstituted alkyl or aryl
  • compound (Ia) represents substituted or unsubstituted alkyl or aryl
  • R 2 represents substituted or unsubstituted alkyl or aryl
  • an activity of forming a closed lactone of compound (Il-a) [hereinafter, referred to as compound (Il-b)]
  • the compound (Ia) or the compound (Ib) is allowed to act on the compound (Ia) or the compound (Ib) in the reaction solution to produce the compound ( ⁇ -a) or the compound (Il-b) in the reaction solution.
  • the present invention relates to a method for producing a compound (Il-a) or a compound (Il-b), which comprises collecting the compound (I-a) or the compound (Il-b).
  • the alkyl is a linear or branched alkyl having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butynole, pentyl, Neopentyl, hexyl, isohexyl, heptyl, 4,4-dimethylpentyl, octyl, 2,2,4-trimethylpentyl, nonyl, decyl, and these various branched-chain variants are listed.
  • aryl examples include phenyl and naphthyl.
  • substituent in the substituted alkyl include halogen, hydroxy, amino, alkoxy, aryl and the like.
  • substituent in the substituted aryl examples include halogen, hydroxy, amino, alkyl, and alkoxy.
  • the alkyl moiety in the alkoxy has the same meaning as the above-mentioned alkyl.
  • Alkali metals represent the elements lithium, sodium, potassium, rubidium, cesium, and francidium.
  • the enzyme source used in the present invention is derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus, and is derived from compound (Ia) or compound (Ib) from compound ( ⁇ -a) or compound (II- If the enzyme source has the activity of producing b), it belongs to the genus Bacillus and has an activity of producing the compound ( ⁇ -a) or the compound ( ⁇ -b) from the compound (I-a) or the compound (Ib). Any of microorganisms having the same, cultures or cells of the microorganisms or processed products thereof, enzymes extracted from the microorganisms, and the like can be used.
  • microorganisms that belong to the genus Bacillus and have the activity of producing compound ( ⁇ -a) or compound ( ⁇ -b) from compound (Ia) or compound (Ib) include, for example, Bacillus laterosporus. ) 'Chinoles Padius
  • Bacillus badius Bacillus brevis, Bacillus alvei 'Bacillus circulans> Bacillus macerans ⁇ Chinoles megaterium (Bacillus megaterium) ⁇ Puminoles (Bacillus pumilus) ⁇ 'Chinores ⁇ Satinores
  • Bacillus laterosporus ATCC4517 strain Bacillus badius ATCC14574 strain, Bacillus brevis NRRL B-8029 strain, Bacillus sp.
  • NCIB-9368 strain Bacillus megaterium ATCC10778 strain, Bacillus megaterium ATCC11562 strain, Bacillus megaterium ATCC13402 strain, Bacillus megaterium ATCC15177 strain, Bacillus megaterium ATCC13 Megacell ATCC15 Megacell, ATCC450 Megacellium ATCC15192 strain
  • Microorganisms such as IAM1032 strain, Bacillus pumilus FERM BP-2064 strain or Bacillus subtilis ATCC6051 strain.
  • subcultures, mutants or derivatives of these microorganisms, recombinants produced by gene recombination techniques, and the like are also used.
  • the Bacillus sp. Strains PV-6 and PV-7 are strains newly isolated from soil by the present inventors, and their bacteriological properties are as follows. PV-6 shares
  • This strain is a positive or negative gram-staining aerobic rod-shaped bacterium that forms endospores, has no motility, has a positive catalase activity, a negative oxidase activity, and a positive urease activity.
  • An acid was produced from glucose. It grew at 10 ° C but did not grow at 50 ° C or higher. Its major taxonomic properties are menaquinone-7 and its major fatty acid is Antiso C15 : . And iso C15 : .
  • the diamino acid composition of the cell wall peptidoglycan was mesodiaminobimelic acid, and the GC content of DNA was 39.1 mol%.
  • This strain is a positive or negative Gram-staining aerobic rod-shaped bacterium that forms endogenous spores, has no motility, has positive motidase activity, and has negative oxidase activity. Positive urease activity and produced acid from glucose. It grew at 11 ° C but did not grow above 47 ° C. The major quinone is menaquinone-7 and its major fatty acid is Antiso-C15 : And Antiso-C 17 : .
  • the diamino acid composition of the cell wall peptide glycol was mesodiaminopimelic acid, and the GC content of the DNA was 37.9 mol! 3 ⁇ 4.
  • this bacterium showed that Bacillus) group. Based on the above results, this strain was identified as a bacterium belonging to the genus Bacillus and named Bacillus sp. PV-7 (Bacillus sp. PV-7).
  • the medium used for culturing the microorganism used in the present invention contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the microorganism of the present invention, and can efficiently culture the microorganism of the present invention.
  • the medium is a natural medium or a synthetic medium, it can be used.
  • the carbon source in the medium include glucose, fructose, glycerol, maltose, starch, saccharose, organic acids such as acetic acid and citric acid, and molasses.
  • nitrogen source examples include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium nitrate, ammonium phosphate and other inorganic acids and ammonium salts of organic acids, peptone, meat extract, corn steep liquor, casey. Hydrolysates, soybean meal, pharma media, fish meal, various fermented cells and digests thereof.
  • the inorganic substance include phosphoric acid first lime, phosphoric acid second lime, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium salt, ferrous sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like.
  • vitamins such as thiamine and biotin, amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, and nucleic acid-related substances such as adenine and guanine may be added.
  • the cultivation of the microorganism used in the present invention is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture and aeration / agitation culture. In the case of aeration and stirring culture, it is preferable to add an appropriate amount of an antifoaming agent to prevent foaming.
  • the cultivation is usually performed at 20 to 40 ° C, preferably 28 to 34 ° C, for 8 to 120 hours.
  • the pH is maintained at 6.0 to: L0.0, preferably at pH 6.0 to 7.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • microorganism thus obtained, the culture or the cells of the microorganism, or a microorganism thereof And the enzyme extracted from the microorganism are used as the enzyme source of the present invention.
  • Processed products include dried bacterial cells, freeze-dried products, surfactant processed products, enzyme processed products, ultrasonic processed products, mechanically ground processed products, solvent processed products, etc. Examples include protein fractions, fixed cells of cells and processed cells, and the like.
  • the method for converting compound (Ia) or compound (Ib) to compound ( ⁇ -a) or compound ( ⁇ -b) is to add compound (Ia) or compound (Ib) to the medium for culturing microorganisms in advance.
  • a method of adding compound (I-a) or compound (Ib) during culture may be used.
  • a method may be used in which an enzyme source obtained by culturing a microorganism is allowed to act on compound (I-a) or compound (I-b) in a reaction solution.
  • the compound (Ia) or the compound (I-b) When the compound (Ia) or the compound (I-b) is added to a medium for culturing a microorganism, the compound (I-a) or the compound (Ib) is added in an amount of 0.1 to 3 mg / ml, preferably 0 to 10 mg / ml of the medium. Add 2 to lmg at the beginning or during the culture.
  • Compound (I-a) or compound (I-b) is desirably dissolved in water or an organic solvent such as methyl alcohol or ethyl alcohol and then added to the medium.
  • the amount of the enzyme source used is determined by the ratio of the enzyme source. Depends on activity. For example, when a culture or a cell of a microorganism or a processed product thereof is used as an enzyme source, 5 to 1,000 mg, preferably 10 to 40 Omg per 1 mg of compound (Ia) or compound (Ib) is added. .
  • the reaction is preferably performed at 20 to 40 ° C in the reaction solution, particularly preferably at 28 to 34 ° C.
  • the reaction time varies depending on the amount of the enzyme source used, the specific activity and the like, but is usually 2 to 150 hours, preferably 72 to 120 hours.
  • reaction solution water or an aqueous medium, an organic solvent, or a mixture of water or an aqueous medium and an organic solvent is used.
  • aqueous medium examples include a buffer such as a phosphate buffer, a HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid) buffer, and a buffer such as a tris [(tris (hydroxymethyl) aminomethane] hydrochloric acid buffer.
  • Any organic solvent may be used as long as it does not hinder the reaction, for example, acetone, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, xylene, methyl alcohol , Ethyl alcohol, butanol and the like are used.
  • An organic solvent or a mixed solution of water or an aqueous medium and an organic solvent is preferably used, for example, when the compound (Ib) is used.
  • compound (I-a) or compound (I-b) When compound (I-a) or compound (I-b) is added to the reaction solution, water or an aqueous medium, an organic solvent, or water capable of dissolving compound (I-a) or compound (I-b) Alternatively, it is dissolved in a mixture of an aqueous medium and an organic solvent and added to the reaction solution.
  • Any organic solvent may be used as long as it does not hinder the reaction, and examples thereof include ethyl acetate, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, xylene, methyl alcohol, ethyl alcohol, and butanol.
  • Compound (I-b) and compound ( ⁇ -b) can be easily converted to compound (I-a) and compound ( ⁇ -a), respectively, by the lactone ring opening method exemplified below. Further, the compound (I-a) and the compound ( ⁇ ⁇ ⁇ -a) can be easily converted to the compound (I-b) and the compound ( ⁇ -b) by the lactone production method exemplified below.
  • a method for ring opening of lactone a method of dissolving compound (I-b) or compound ( ⁇ -b) in an aqueous medium and adding an acid or an alkali to open the ring is used.
  • the aqueous medium include aqueous solutions containing salts that do not inhibit the reaction, such as water, phosphate buffer, and Tris buffer.
  • the aqueous solution may contain an organic solvent such as methanol, ethanol, or ethyl acetate at a concentration that does not inhibit the reaction.
  • the acid include acids such as acetic acid, hydrochloric acid, and sulfuric acid, and examples of the acid include sodium hydroxide, potassium hydroxide, and ammonia.
  • a method for producing the lactone there is a method in which the compound (Ia) or the compound (II-a) is dissolved in a non-aqueous solvent, and an acid or a base catalyst is added to form a lactone.
  • a non-aqueous solvent any solvent can be used as long as it can dissolve the compound (I-a) or the compound ( ⁇ -a) in an organic solvent containing substantially no water.
  • the solvent include dichloromethane, chloroform, ethyl acetate and the like.
  • Any catalyst can be used as long as it catalyzes the lactonization reaction and has no effect other than lactonization on the substrate or reaction product. You. Examples of the catalyst include trifluoroacetic acid and p-toluenesulfonic acid.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably from 0 to 100 ° C, more preferably from 20 to 80 ° C.
  • the compound (II-a) can be obtained by reacting the compound (I-a) with the above-mentioned enzyme source, and the compound (Ib) is subjected to the above-described lactone ring-opening method to obtain the compound (I-a).
  • the compound (II-b) can be obtained by reacting the compound (I-b) with the enzyme source described above. ), And then reacted with the above-mentioned enzyme source.Also, the compound (Ia) is reacted with the above-mentioned enzyme source to produce the compound ( ⁇ -a), and then the above-described lactone is produced. It can also be obtained by performing a generation method.
  • the compound ( ⁇ -a) or compound ( ⁇ -b) can be collected from the reaction solution by the methods used in ordinary organic synthesis chemistry, such as extraction with organic solvents, crystallization, thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography. It can be performed by first class.
  • the method for confirming or quantifying the compound ( ⁇ -a) or the compound ( ⁇ -b) obtained by the present invention may be any method capable of confirming or quantifying the compound (II-a) or the compound (II-b).
  • the method can be used, for example, 13 C—NMR spectrum, —NMR spectrum, mass spectrum, high performance liquid chromatography (HPLC), or the like.
  • R 1 represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl or alkali metal, and R 2 represents substituted or unsubstituted alkyl or aryl
  • R 1 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl or an alkali metal [hereinafter, referred to as compound (Va)], and more preferably a compound represented by the general formula (VII-a):
  • R 1 represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl or alkali metal [hereinafter, referred to as compound (VII-a)].
  • R 2 represents a substituted or unsubstituted alkyl or aryl [hereinafter, referred to as a compound (III-b)].
  • compound (Vb) The compound represented by the following formula [hereinafter, referred to as compound (Vb)] is more preferable, and the compound represented by the general formula (VII-b)
  • R 1 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl or an aryl metal
  • compound (IV-a) is more preferable, and a compound represented by the general formula (VIII-a )
  • R 1 represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl or an alkali metal
  • compound (b-b) a compound represented by the general formula (IV-b)
  • R 2 represents a substituted or unsubstituted alkyl or aryl [hereinafter referred to as compound (IV-b)].
  • compound (VI-b) The compound represented by the following formula [hereinafter, referred to as compound (VI-b)] is more preferable, and has a general formula (VIII-b)
  • FIG. 1 shows a molecular phylogenetic analysis of the Bacillus sp. (Ba ⁇ llus sp.) PV-6 strain and the Bacillus sp. PV-7 strain based on the 16S rRNA base sequence by the neighborhood binding method.
  • Bacillus laterosporus ATCC4517 strain Bacillus badius ATCC14574 strain, Bacillus brevis NRRL B-8029 strain, Bacillus sp. PV-6 strain, Bacillus sp. (Bacillus sp.) PV-7 strain on an agar medium [peptone (Kokuto Pharmaceutical) 1%, meat extract (Kokuto Pharmaceutical) 0.7%, NaCl (Nacalai Tesque) 0.3%, Bactagar (made from Difcone earth) 2%, adjusted to pH 7.2 with 1N sodium hydroxide] and cultured at 30 ° C for 24 hours.
  • the reaction solution was adjusted to pH 4 with acetic acid (manufactured by Nacalai Tesque).
  • acetic acid manufactured by Nacalai Tesque
  • 2 ml of ethyl acetate manufactured by Nacalai Tesque was added and shaken for 1 hour. After shaking, the mixture was centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes using a centrifuge (Model 05P-21, manufactured by Hitachi, Ltd.) to recover the supernatant ethyl acetate layer. After removing the solvent with (type 101), the residue was dissolved in 1 ml of methanol.
  • the amount of the obtained compound (VIII-a-1) was 16.8 mg / l using Bacillus laterosporus ATCC4517 strain, Bacillus dius.
  • Bacillus sp. PV-7 strain was coated on the same agar medium as in Example 1, cultured at 30 ° C for 24 hours, and a strain of the strain grown on the agar medium was picked up.
  • the cells were inoculated into two 15 ml A-spit tubes (16.5 x 11 mm, Inuchi Seieido) containing 3 ml of the C medium adjusted to 7.5, and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours.
  • the culture solution 0:06 ml after the culture was inoculated into each of 60 15 ml A-spit tubes containing 3 ml of C medium adjusted to pH 7.5, and cultured at 30 ° C. with shaking.
  • Example 2 Twenty-four hours after the start of nutrition, add the compound (VII-a-1) obtained in the same manner as in Example 1 to a final concentration of 0.4 mg / ml. Glucose was added to a final concentration of 1% at each of eyes and 72 hours, and cultivation was performed for a total of 120 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C for 10 minutes, and the supernatant was collected. The pH of the supernatant was adjusted to 4.0 using acetic acid, 360 ml of ethyl acetate was added, and the mixture was shaken at 30 ° C for 1 hour.
  • the supernatant was recovered by standing still, and 90 ml of deionized water was added to the supernatant, and the supernatant was recovered by shaking at 30 ° C. for 30 minutes. 90 ml of a saturated saline solution was added to the supernatant, and the mixture was shaken at 30 ° C. for 30 minutes to collect the supernatant. Next, 4.5 g of anhydrous Na 2 SO 4 was added to the supernatant, left at room temperature for 15 minutes to dehydrate, and then dried under reduced pressure.
  • the obtained residue was dissolved in 5 ml of deionized water, the pH was adjusted to 9.0 with sodium hydroxide, and passed through a 100 ml HP-20 column (35 ⁇ 100 marauder, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation). After washing the column with 300 ml of deionized water, the column was eluted with 120 ml of 45% aqueous acetone solution.
  • the supernatant was collected by standing still, and 90 ml of deionized water was added to the supernatant, and the mixture was shaken at 30 ° C for 30 minutes to recover the supernatant again. 90 ml of a saturated saline solution was added to the supernatant, and the mixture was shaken at 30 ° C. for 30 minutes to recover the supernatant.
  • Bacillus alvei ATCC6344 strain Bacillus circulans NTCT-2610 strain, Bacillus macerans (Bacillus)
  • ATCC10778 strain Bacillus megaterium ATCC11562 strain, Bacillus megaterium ATCC13402 strain, Bacillus megaterium ATCC15177 strain, Bacillus megaterium ATacillium 450ac strain Megaterium
  • Bacillus megaterium ATCC19213
  • Bacillus pumilus acil_ ⁇ is pumilus
  • FERM BP-2064 Bacillus subtilis ATCC6051
  • the reaction solution was adjusted to pH 4 with acetic acid (manufactured by Nacalai Tesque).
  • acetic acid manufactured by Nacalai Tesque
  • 2 ml of ethyl acetate manufactured by Nacalai Tesque was added and shaken for 1 hour. After shaking, the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes using a centrifuge (Model 05P-21, manufactured by Hitachi, Ltd.) to collect the supernatant ethyl acetate layer. After removing the solvent with (type 101), the residue was dissolved in 1 ml of methanol.
  • the amount of the obtained compound (VIII-a-1) was 0.18 mg / l when using Bacillus alvei ATCC6344 strain, and using Bacillus circulans NTCT-2610 strain. 0.18mg / l, Bacillus macerans
  • Bacillus macerans using NCIB-9368 strain 0.32 mg / l, using Bacillus megaterium ATCC10778 strain 8.4 mg / l, using Bacillus megaterium ATCC11562 strain Case 0.31mgAU Bacillus megaterium ATCC13402 strain 1.30mg / l, Bacillus megaterium ATCC15177 strain 1.60mg / l, Bacillus megaterium Using ATCC15450 strain 0.58 mg / l, Bacillus megaterium ATCC19213 strain 0.16 mg / l, Bacillus megaterium IAM1032 strain 9.20 mg / l, Bacillus pumilus ( (Bacillus pumilus) FERM BP-2064 strain 0.17 mg / l, Bacillus subtilis ATCC6051 strain 1. llmg / 1.
  • Bacillus laterosporus ATCC 4517 strain was applied to the same agar medium as in Example 1, cultured at 30 ° C for 24 hours, and the strain grown on the agar medium was picked up with a platinum loop and adjusted to pH 7.5.
  • Two 15 ml A-spit tubes (16.5 ⁇ 115 mm; manufactured by Inuchi Seieido) containing 3 ml of the prepared C medium were inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. 0.06 ml of the culture solution after the culture was inoculated into each of 60 15 ml A-spit tubes containing 3 ml of C medium adjusted to pH 7.5, and cultured at 30 ° C with shaking.
  • the compound (VII-a-1) obtained in the same manner as in Example 1 was added to a final concentration of 0.4 mg / ml.
  • glucose was added to each at a final concentration of 1%, and the cells were cultured with shaking for a total of 120 hours.
  • the culture was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • the pH of the supernatant was adjusted to 3.0 using IN hydrochloric acid, 360 ml of ethyl acetate was added, the mixture was shaken, and the mixture was allowed to stand still to collect the supernatant three times.
  • 90 ml of deionized water was added to the supernatant and the mixture was shaken, the supernatant was recovered.
  • the supernatant was recovered.
  • the fraction containing (VIII-a-1) was collected. After the fraction was removed by dividing the Asetonitoriru under reduced pressure, to adjust the P H to 3.0 with 1N hydrochloric acid and shaken with the addition of acetic acid Echiru of 360 ml. After shaking, the mixture was allowed to stand, and the supernatant was recovered. 90 ml of deionized water was added to the supernatant, and the supernatant was recovered by shaking. 90 ml of a saturated saline solution was added to the supernatant, and the supernatant was recovered by shaking.
  • the compound which inhibits HMG-CoA reductase and has a serum cholesterol lowering effect etc. can be manufactured efficiently.

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Description

明 細 書
HM G— C o Aレダククーゼ阻害剤の製造法 技術分野
本発明は、 ヒドロキシメチルダルタリル C o Aレダクターゼ （以下、 HMG— C 0 Aレダクターゼと略記する。 ） を阻害し、 血清コレステロールの低下作用等 を有する化合物の製造法に関する。
背景技術
一般式 （VI - a)
Figure imgf000003_0001
(式中、 R1は水素原子またはアルカリ金属を表す） で表される化合物 [以下、 化合物 (VI- a)という] または一般式 （VI- b)
Figure imgf000003_0002
で表される、 化合物 （VI-a) の閉鎖ラクトン体 [以下、 化合物 （VI-b)という] は、 HMG— C 0 Aレダクターゼを阻害し、 血清コレステロールの低下作用等を 示すこと力く知られている [ザ ' ジャーナル ·ォブ ·アンチピオチクス （The Journal of Antibiotics) 29, 1346(1976)] 。
一般式 （V- a)
Figure imgf000004_0001
(式中、 R 1は水素原子またはアルカリ金属を表す） で表される化合物 [以下、 化合物 （V-a) という] または一般式 （V-b) '
Figure imgf000004_0002
で表される、 化合物 （V-a) の閉鎖ラクトン体 [以下、 化合物 （V-b) とういう] から化合物 （VI-a) または化合物 （VI-b) を生成させる能力を有する微生物とし ては、 アブシディア (Absidia) 属、 力ニンガメラ (Cunninghamella) 属、 シン セフアラスポラム (Syncephalasporum) 属およびストレプトマイセス
(Streptomyces) 属に属する微生物 （特開昭 5 7 - 5 0 8 9 4号公報） 、 了クチ ノムコ一ノレ （Actinomucor) 属、 シルシネラ （Circinella) 属、 ゴングロネラ (Gongronella) 属、 モルティエレラ （Mc^tierella) 属、 ムコ一ノレ （Mucor) 属、 フィ コミセス (Phycomyces) 属、 リゾパス (Ehyzopus) 属、 シンセフアラストラ ム (Syncephalastrum) 属、 ザィゴフィンチュス （Zygorhynchus) 属、 ピクノポ ラス (Pycnoporus) 属、 リゾク トニア (Rhizoctonia) 属およびノカルディア (Nocardia) 属に属する微生物 [ザ'ジャーナル'ォブ 'アンチピオチクス (The Journal of Antibiotics) ， 36, 887 (1983)] 、 アミコラ一夕
(Amycolata) 属、 サッカロポリスポーラ （Saccharopolvspora) 属、 アミコラト プシス (Amycolatopsis) 属ぉよびサッカロスリックス (Saccharothrix) 属に属 する微生物 （特開平 7— 1 8 4 6 7 0号公報） 並びにァクチノマデュラ
(Actinomadura) 属に属する微生物 （WO 9 6 / 4 0 8 6 3 ) が知られている。 上記の微生物は放線菌または糸状菌に属している。 本発明のごとく、 細菌に属 し、 上記化合物 (V-a) または化合物 (V-b) からそれぞれ、 化合物 (VI- a)または 化合物 (VI-b) を生成する能力を有する微生物は知られていない。 放線菌ゃ糸状 菌は細菌に比べて増殖が遅 L、ため、 反応に必要な菌体量を取得するのに時間がか かるという欠点がある。 また、 放線菌ゃ糸状菌は発酵槽での培養管理が難しいと いう問題点もある。 放線菌ゃ糸状菌は菌糸を伸ば.して増殖するため、 発酵槽で増 殖させると培養液の粘度が上昇する。 このため酸素が不足しやすく、 培養液が不 均一になるため反応効率の低下を招きやすい。 この酸素不足を解消し、 培養液を 均一に保っためには、 発酵槽の攪拌速度を上げなければならないが、 攪拌速度を 上げると菌糸が剪断され、微生物の活性が低下しやすい [発酵工学の基礎、 P169 〜190， P. F. Stansbury, A. Whitakaer著、 学会出版センタ一 （ 1 9 8 8 ) ] 。 このように放線菌ゃ糸状菌は培養を行なう上で問題があるカ'、細菌は菌糸を形成 しないため、 培養液の粘度は上がりにくく、 通気不足や培養液が不均一になるこ とは少なく、 培養管理が容易である。
遺伝子組換え技術で、 遺伝子を大腸菌等の細菌で発現させることはよく行われ ているカ^ 放線菌ゃ糸状菌の遺伝子はアミノ酸を規定するコドンが大腸菌等の細 菌と大きく異なるため、効率よく発現することは一般に難い、。
放線菌で遺伝子を高発現するためのベクター、 プロモータ一等の材料は限られ ており、 遺伝子を高発現し、 より効率よく反応を行なうためにはべクタ一、 プロ モーター等が数多く利用できる細菌を用い ことが望ましい。 細菌の遺伝子であ れば容易に細菌で高発現することができる。
発明の開示
本発明の目的は、 HMG— C o Aレダクタ—ゼを阻害し、 血清コレステロール の低下作用等を有する化合物の製造法を提供することにある。
本発明は、 バチルス属に属する微生物由来でかつ、 一般式 （I - a)
Figure imgf000006_0001
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表される 化合物 [以下、 化合物 （I-a) という] または一般式 （I-b)
Figure imgf000006_0002
(式中、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表され る、 化合物 （I- a) の閉鎖ラク トン体 [以下、 化合物 （I-b) という] 力、ら、 一般 式 (II-a)
Figure imgf000006_0003
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表される 化合物 [以下、 化合物 (II - a) という] または一般式 (II-b)
Figure imgf000007_0001
(式中、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表され る、 化合物 (Il-a) の閉鎖ラク トン体 [以下、 化合物 （Il-b) という] を生成す る活性を有する酵素源を、 化合物 （I-a) または化合物 （I-b) に反応液中で作用 させ、 反応液中に化合物 (Π-a)または化合物 (Il-b) を生成させ、 該反応液から 化合物 (Π-a)または化合物 (Il-b) を採取することを特徴とする化合物 (Il-a)ま たは化合物 （Il-b) の製造法に関する。
アルキルとしては、 直鎖または分岐状の、 炭素数 1〜1 0、 好ましくは 1〜6 のアルキルであり、 例えばメチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 プチル、 イソブチル、 s e cーブチル、 t e r t—ブチノレ、 ペンチル、 ネオペンチル、 へ キシル、 イソへキシル、 ヘプチル、 4， 4 _ジメチルペンチル、 ォクチル、 2， 2， 4—トリメチルペンチル、 ノニル、 デシル、 これら各種分岐鎖異 体等があ げられる。
ァリールとしては、 フヱニル、 ナフチル等があげられる。
置換アルキルにおける置換基としては、 ハロゲン、 ヒドロキシ、 ァミノ、 アル コキシ、 ァリール等があげられる
置換ァリールにおける置換基としては、 ハロゲン、 ヒドロキシ、 ァミノ、 アル キル、 アルコキシ等があげられる。
アルコキシにおけるアルキル部分は上述のァルキルと同義である。
アルカリ金属とは、 リチウム、 ナトリウム、 カリウム、 ルビジウム、 セシウム、 フランシゥムの各元素を表す。
本発明で用いられる酵素源は、 バチルス属に属する微生物由来であって、 化合 物 (I-a) または化合物 (I-b) から、 それぞれ化合物 (Π-a)または化合物 (II- b) を生成する活性を有する酵素源であれば、 バチルス属に属し、 化合物 （I - a) または化合物 (I-b) から、 化合物 (Π-a)または化合物 (ΙΙ-b) を生成する活性 を有する微生物、 該微生物の培養物もしくは菌体またはそれらの処理物、 該微生 物から抽出した酵素等いずれでも用いられる。
バチルス属に属し、 化合物 (I-a) または化合物 (I-b) から、 化合物 (Π-a)ま たは化合物 (ΙΙ-b) を生成する活性を有する微生物としては、 例えば、 バチル ス · ラテロスポラス (Bacillus laterosporus) 'チノレス ·パディウス
(Bacillus badius) 、 バチルス · ブレビス (Bacillus brevis) パ、チルス ·アル (Bacillus alvei) 'チノレス ·サーキュランス（Bacillus circulans)> バ チノレス ·マセランス（Bacillus macerans)^ チノレス · メガテリゥム（Bacillus megaterium)> 'チノレス ·プミノレス（Bacillus pumilus)^ 'チノレス ·サチノレス
(Bacillus subtilis) に属する微生物等があげられる。
さらに具体的には、 バチルス · ラテロスポラス (Bacillus laterosporus) ATCC4517株、 バチルス ·パディウス (Bacillus badius) ATCC14574株、 バチル ス · ブレビス (Bacillus brevis) NRRL B- 8029株、 バチルス ·エスピー
(Bacillus sp. ) PV- 6株、 バチルス ·エスピー (Bacillus sp. ) PV- 7株、バチル ス ·アルべィ（Bacillus alvei) ATCC6344株、 バチルス ·サ一キュランス
(Bacillus circulans) NTCT- 2610株、 バチルス ·マセランス（Bacillus
macerans) NCIB- 9368株、 バチルス · メガテリゥム（Bacillus megaterium) ATCC10778株、 バチルス · メガテリゥム ATCC11562株、 バチルス · メガテリゥム ATCC13402株、 バチルス ·メガテリゥム ATCC15177株、 バチルス ' メガテリゥム ATCC15450株、 バチルス 'メガテリゥム ATCC19213株、 バチルス ' メガテリゥム IAM1032株、 バチルス · プミルス（Bacillus pumilus) FERM BP- 2064株またはバチ ルス ·サチルス (Bacillus subtilis) ATCC6051株等の微生物があげられる。 また、 これらの微生物の継代培養体、 突然変異体もしくは誘導体、 遺伝子組換 え技術により製造した組み換え体等も用いられる。 バチルス ·エスピー PV-6株 及び PV-7株は、 本発明者によって土壌より新たに分離された菌株であり、 それら の菌学的性質は以下の通りである。 PV-6株
(A) 形態的性質
1. 細胞の形；桿状、 大きさ ； 0. 8-1. 2 X 2. 0〜4. 0 m
2. 細胞の多形性の有無；無
3. 運動性の有無；無
4. 胞子の有無；観察されない
(B) 培養的性質
肉汁寒天平板培地及び肉汁液体培地における培養的性質を以下に示す。
1. 肉汁寒天平板培養 （1〜2日間培養）
1)生育の様相；良好
2)色；クリーム
3)光沢；有
4)拡散性色素；無
2. 肉汁液体培養 （1〜2日間培養）
1)表面生育；無
2)濁度；有
3. 肉汁ゼラチン穿刺培養
1)生育の状態；良好
2)ゼラチンの液化；有
4. リ トマス一ミルク反応
1)反応；アル力リ
2)凝固；無
3)液化；無
(0 生理学的性質
1. ダラム染色性；陽性ある L、は陰性
2. 硝酸塩の還元；陰性
3. 脱窒反応；陽性
4. MRテスト ；陰性 . V Pテスト ；陰性
. ィンドールの生成；陰性
. 硫化水素の生成；陽性
. デンプンの加水分解；陰性
. クェン酸の利用；陽性
0.無機窒素源の利用
1)硝酸塩；陰性
2)アンモニゥム塩；陽性
1.色素の生成；無
2.ゥレア一ゼ；陽性
3.ォキシダ一ゼ；陰性
4.カタラーゼ；陽性
5.生育の範囲
1)生育 P H範囲； pH 6〜PH 9 (最適生育 pH 7付近）
2)生育温度範囲； 6°C〜40°C (最適生育温度； 30°C付近）6.酸素に対する態度；好気性
7. 0— Fテスト ；酸ィ匕的
&酸の生成 （好気的条件）
+ は生成することを、 一 は生成しないことをそれぞれ示す。
(1) L—ァラビノース； -
(2) D—キシロース； -
(3) D—グルコース； +
(4) D—マンノース； -
(5) D _フラクトース； +
(6) D—ガラクトース； -
(7) マルト一ス； -
(8) シユークロース； -
(9) ラク ト一ス； - (10)卜レハロース； -
(11) D—ソルビトール； -
(12) D—マンニトール； +
(13)イノシトール； -
(14)グリセリン； +
(15)デンプン； - (D) 化学分類学的性質
1. DNAの塩基組成 (G+C mol¾)； 39. 1
2. 菌体脂質：
主要キノン； MK-7
±¾H^¾； anteiso-C15:0ヽ iso— C15:0
3. 細胞壁べプチドグリカン ジアミノ酸組成； meso-A2pm
本菌株は、 陽性あるいは陰性のグラム染色性を示す好気性桿伏細菌で、 内生胞 子を形成し、 運動性はなく、 カタラーゼ活性は陽性をォキシダーゼ活性は陰性を 示し、 ゥレアーゼ活性が陽性で、 グルコースから酸を生成した。 1 0 °Cで生育し たが 5 0 °C以上では生育しなかった。 化学分類学的性質として、 主要キノンはメ ナキノン- 7で、 主要脂肪酸はアンティソ C15:。とイソ C15:。であり、 細胞壁ペプチド グリカンのジアミノ酸組成はメソジアミノビメリン酸で、 DNAの GC含量は 39. 1 mol%であつた。
以上の微生物学的性質を有する菌株の分類学的位置について、 パージエイズ · マ二ユアノレ ·システマティック *ノくクテリオロジ一 （Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology) 、 vol. 2、 (1986) の記載と照合した結果、 本菌株 は、 バチルス (Bacillus) 属関連細菌と推定された。 さらに、 16S rRNAの塩基配 列を、 バチルス (Bacillus) 属とその関連属の塩基配列を対照にして近隣結合法 により分子系統解析を行なった結果、 本菌は図 1に示すように、 バチルス (Bacillus) 群にクラスタリングされた。 以上の結果より、 本菌株をバチルス (Bacillus) 属に属する細菌と同定し、 バチルス ·エスピー PV-6株 (Bacillus sp. PV-6) と命名した。 PV-7株
(A) 形態的性質
1. 細胞の形；桿状、 大きさ ； 1. 0 X 2. 0〜3. 0
2. 細胞の多形性の有無；無
3. 運動性の有無；無
4. 胞子の有無'；有
(B)培養的性質
肉汁寒天平板培地及び肉汁液体培地における培養的性質を以下に示す。
1. 肉汁寒天平板培養 （1〜2日間培養）
1)生育の様相；良好
2)色；アイボリ一
3)光沢；無
4)拡散性色素；無
2. 肉汁液体培養 （1〜2日間培養）
1)表面生育；有
2)濁度；有
3. 肉汁ゼラチン穿刺培養
1)生育の状態；良好
2)ゼラチンの液化；有
4. リ トマス—ミルク反応
1)反応；アル力リ
2)凝固；無
3)液化；無
(C)生理学的性質
1. グラム染色性；陽性あるいは陰性
2. 硝酸塩の還元；コハク酸培地で陽性
3. 脱窒反応；陰性
4. M Rテスト ；陰性 5. V Pテスト ；陰性
6. インド一ルの生成；陰性
7. 硫化水素の生成；疑わしい
8. デンプンの加水分解；陰性
9. クェン酸の利用；陽'性
10.無機窒素源の利用
1)硝酸塩；陽性
2)アンモニゥム塩；陽性
11.色素の生成；無
12.ゥレアーゼ；陽性
13.ォキシダ一ゼ；陰性
14.力タラ一ゼ；陽性
15.生育の範囲
1)生育 p H範囲； pH 6〜pH 10 (最適生育 pH 7付近）
2)生育温度範囲； 11°C〜47°C (最適生育温度； 30°C付近）
16.酸素に対する態度；好気性
17. 0— Fテスト ；酸ィ匕的
18.酸の生成 （好気的条件）
+ は生成することを、 - は生成しないことを、 W は弱く生成することをそれぞ れ示す。
(1) Lーァラビノース； +
(2) D—キシロース； w
(3) D—グルコース； +
(4) D—マンノース； w
(5) D—フラク 卜一ス； w
(6) D—ガラクトース； -
(7) マルトース； w
(8) シュ一クロース； + (9) ラク トース ； -
(10)トレハロース ； w
(11) D—ソルビトール； +
(12) D—マンニトール； +
(13)イノシトール； w
(14)グリセリン ； +
(15)デンプン ； w
(D)化学分類学的性質
1. DNA の塩基組成 （G+C mol%) ； 37. 9
2. 菌体脂質：
主要キノン； MK-7
主要月旨肪酸； anteiso-C15:0 anteiso— C17:0
3. 細胞壁べプチドグリカン ジァミノ酸組成； meso-A2pm
本菌株は、 陽性あるいは陰性のグラム染色性を示す好気性桿状細菌で、 内生 胞子を形成し、 運動性はなく、 力タラ一ゼ活性は陽性を、 ォキシダ一ゼ活性は陰 性を示し、 ウレァ一ゼ活性が陽性で、 グルコースから酸を生成した。 1 1 °Cで生 育したが 4 7 °C以上では生育しなかった。 化学分類学的性質として、 主要キノン はメナキノン- 7で、 主要脂肪酸はアンティソ- C15:。とアンティソ- C17:。であり、 細 胞壁ぺプチドグリ力ンのジァミノ酸組成はメソジァミノピメリン酸で、 DNAの GC 含量は 37. 9 mol!¾であった。 以上の微生物学的性質を有する菌株の分類学的位置 について、 バ一ジエイズ ·マニュアル ·システマティック ·バクテリオロジ一 (Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology) vol. 2、 （1986) の記載と照 合した結果、 本菌株は、 バチルス (Bacillus) 属関連細菌と推定された。
さらに、 16S rRNAの塩基配列を、 バチルス (Bacillus) 属とその関連属の塩基 配列を対照にして近隣結合法により分子系統解析を行った結果、 本菌は図 1に示 すように、 バチルス (Bacillus) 群にクラスタリングされた。 以上の結果より、 本菌株をバチルス (Bacillus) 属に属する細菌と同定し、 バチルス .エスピー PV-7株 (Bacillus sp. PV- 7)と命名した。 バチルス 'エスピー PV-6株および PV- 7株は、 平成 9年 7月 30日付けで日本国 茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5— 0 0 4 6 ) 通商産業省工業 技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ FEEM BP- 6029および FERM BP- 6030とし て寄託されている。
本発明に用いられる微生物の培養に用いられる培地は、 本発明の微生物が資化 することができる炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 本発明の微生物の培養 を効率的に行なえる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれでも用いられる。 培地中の炭素源の具体例としては、 グルコース、 フラクト一ス、 グリセロール、 マルト一ス、 スターチ、 サッカロ一ス、 酢酸、 クェン酸等の有機酸、 糖蜜等があ げられる。
窒素源の具体例としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の各種無機酸や有 機酸のアンモニゥム塩、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスティ一プリカ一、 カゼィ ン加水分解物、 大豆ミール、 ファーマメディア、 魚ミール、 各種発酵菌体および その消化物等があげられる。
無機物の具体例としては、 リン酸第一力リゥム、 リン酸第二力リゥム、 リン酸 マグネシゥム、 硫酸マグネシゥム、 塩ィ匕ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等があげられる。
また、 必要に応じてチアミン、 ピオチン等のビタミン類、 グルタミン酸、 ァス パラギン酸等のアミノ酸、 アデニン、 グァニン等の核酸関連物質等を添加しても よい。
本発明に用いられる微生物の培養は、 振盪培養、 通気撹拌培養等の好気的条件 下で行うことが好ましい。 通気撹拌培養の場合は、 発泡を防ぐため消泡剤を適量 添加するのが好ましい。 培養は通常 20〜40°C、 好ましくは 28〜34°Cで、 8〜： 120時 間行う。 培養中 p Hは 6. 0〜： L0. 0、 好ましくは pH 6. 0〜7. 0に保持する。 p Hの 調整は無機酸あるいは有機酸、 アルカリ溶液、尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニ ァ等を用いて行う。
このようにして得られる微生物、 該微生物の培養物もしくは菌体またはそれら の処理物、該微生物から抽出した酵素等を本発明の酵素源として用いる。 処理物 としては、 菌体の乾燥物、 凍結乾燥物、 界面活性剤処理物、 酵素処理物、 超音波 処理物、 機械的磨砕処理物、 溶媒処理物等の菌体処理物、 菌体の蛋白分画物、 菌 体及び菌体処理物の固定ィヒ物等があげられる。
化合物 (I-a) または化合物 (I-b) から化合物 (Π-a)または化合物 (ΙΙ-b) へ の変換方法は、 微生物を培養する培地に予め化合物 （I-a) または化合物 (I-b) を添加する方法を用いてもよいし、 培養中に化合物 （I- a) または化合物 （I-b) を添加する方法を用いてもよい。 また、 微生物を培養して得られた酵素源を、 化 合物 （I- a) または化合物 （I- b) に反応液中で作用させる方法を用いてもよい。 化合物 （I-a) または化合物 （I- b) を微生物を培養する培地中に添加する場合、 化合物 （I- a) または化合物 （I-b) は培地 lm l当たり 0. l〜3mg、 好まし くは 0. 2〜lmgを培養の初発または途中に添加する。 化合物 （I-a) または 化合物 （I-b) は、 水またはメチルアルコール、 エチルアルコール等の有機溶媒 に溶解したのち培地に添加することが望ましい。
微生物を培養して得られた酵素源を、 化合物 （I-a) または化合物 （I- b) に 反応液中で作用させる方法を用 L、る場合、 用いる酵素源の量は、 当該酵素源の比 活性等により異なる。 例えば、 酵素源として微生物の培養物もしくは菌体または それらの処理物を用いる場合は、 化合物 （I-a) または化合物 （I-b) lmg当た り 5〜： 1 000m g、 好ましくは 10〜 40 Omg添加する。 反応は、 反応液中 20〜40°Cで行うこと力好ましく、 とくに 28〜34 °Cで行うこと力好ましい。 反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、 通常 2〜1 50時 間、 好ましくは、 7 2〜： 12 0時間である。
反応液としては、 水もしくは水性媒体、 有機溶媒または、 水もしくは水性媒体 と有機溶媒との混合液が用いられる。 水性媒体としては、 例えばリン酸緩衝液、 HEPES(N- 2-ヒドロキシェチルピペラジン- N-エタンスルホン酸)緩衝液、 ト リス [ (トリス （ヒドロキシメチル） ァミノメタン] 塩酸緩衝液等の緩衝液が用 いられる。 有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、 例 えば、 アセトン、 酢酸ェチル、 ジメチルスルホキシド、 キシレン、 メチルアルコ ール、 エチルアルコール、 ブタノール等が用いられる。 有機溶媒または水もしく は水性媒体と有機溶媒との混合液は、 例えば化合物 （I-b) を用いる場合好まし く用いられる。
化合物 （I- a) または化合物 （I- b) を反応液に添加する場合、 化合物 （I - a) または化合物 （I- b) を溶解することができる水もしくは水性媒体、 有機溶媒、 または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液に溶解し、 反応液に添加する。 有機溶媒としては、 反応を阻害しないものであればいずれでもよく、 例えば、 了 セトン、 酢酸ェチル、 ジメチルスルホキシド、 キシレン、 メチルアルコール、 ェ チルアルコール、 ブタノール等が用いられる。
化合物 （I- b) および化合物 （Π-b) は下記に例示するラク トンの開環方法に より、 容易に化合物 （I- a) および化合物 （Π- a) にそれぞれ変換することがで きる。 また、 化合物 （I- a) および化合物 （Π-a) は下記に例示するラク トンの 生成方法により容易に化合物 （I-b) および化合物 （ΙΙ-b) に変換することがで きる。
ラク トンの開環方法としては、 化合物 （I- b) または化合物 （Π-b) を水性媒 体に溶解し、 酸またはアルカリを添加し開環する方法があげられる。 水性媒体と しては、 例えば水、 リン酸緩衝液、 トリス緩衝液など反応を阻害しない塩類を含 む水溶液があげられる。 該水溶液中には、 反応を阻害しない濃度のメタノール、 エタノール、 酢酸ェチルなどの有機溶媒を含んでいてもよい。 酸としては酢酸、 塩酸、 硫酸などの酸があげられ、 アル力リとしては、 水酸化ナトリゥム、 水酸化 カリウム、 アンモニアなどがあげられる。
ラクトンの生成方法としては、 化合物 （I-a) または化合物化合物 （Π-a) を 非水系の溶媒に溶解し、 酸または塩基触媒を添加しラク トンを形成せる方法があ げられる。 非水系の溶媒としては実質的に水を含まない有機溶媒で化合物 （I - a) または化合物 （Π-a) を溶解できるものならばいかなるものでも用いること ができる。 溶媒としては、 たとえばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 酢酸ェチル などがあげられる。 触媒としては、 ラクトン化反応を触媒し、 基質や反応産物に ラクトン化以外の作用をおよぼさないものならば、 どのようなものでも使用でき る。 該触媒としては、 トリフルォロ酢酸やパラトルエンスルホン酸などがあげら れる。 反応温度は特に制限はないが、 0〜1 0 0 °Cが好ましく、 2 0〜8 0 °Cが 特に好ましい。
本発明において化合物 （II- a) は、 化合物 （I- a) に上述の酵素源を作用させ て得ることができるが、 化合物 （I-b) を上述のラクトンの開環方法を行い化合 物 （I- a) に変換した後上述の酵素源を作用させて得ることもできるし、 また、 化合物 （I-b) に上述の酵素源を作用させて化合物 （Π-b) を生成させた後上述 のラクトンの開環方法を行うことで得ることもできる。
同様に、 化合物 （II- b) は、 化合物 （I- b) に上述の酵素源を作用させて得る ことができるが、 化合物 （I-a) を上述のラクトンの生成方法を行い化合物 （I- b) に変換した後上述の酵素源を作用させて得ることもできるし、 また、 化合物 (I-a) に上述の酵素源を作用させて化合物 （Π-a) を生成させた後上述のラク トンの生成方法を行うことで得ることもできる。
反応溶液からの化合物 (Π-a)または化合物 （Π-b) の採取は、 通常の有機合成 化学で用いられる方法、 例えば、 有機溶媒による抽出、 結晶化、 薄層クロマトグ ラフィ一、 高速液体クロマトグラフィ一等により行うことができる。
本発明により得られる化合物 （Π-a) または化合物 (ΙΙ-b) の確認または定量 方法は、 化合物 （II- a) または化合物 （II-b) を確認または定量できる方法であ れば、 いずれの方法でも用いられるが、 例えば、 13C—NM Rスぺクトル、 — NM Rスぺクトル、 マススぺクトル、 高速液体クロマトグラフィ一（H P L C )等 の方法により行うことができる。
本発明において、 化合物 (I-a) 、 化合物 (I- b)、 化合物 （II- a) および化合物 (II-b) の中には、 光学異性体等の立体異性体が存在し得るものもある力 本発 明は、 これらを含め、 全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。 化合物 (I-a) としては、 一般式 (Ill-a) 3396
17
Figure imgf000019_0001
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表される 化合物 [以下、 化合物 (Ill-a) という] が好ましく、 一般式 （V-a)
Figure imgf000019_0002
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表す） で表される化合物 [以下、 化合物 (V-a) という] がより好ましく、 一般式 (VII-a)
Figure imgf000019_0003
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表す） で表される化合物 [以下、 化合物 (VII-a) という] が特に好ましい。
化合物 (I-b) としては、 —般式 (ΙΠ-b ) 3396
18
Figure imgf000020_0001
(式中、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表され る化合物 [以下、 化合物 (III- b) という] が好ましく、 一般式 （V-b)
Figure imgf000020_0002
で表される化合物 [以下、 化合物 (V-b) という] がより好ましく、一般式 （VII- b)
Figure imgf000020_0003
で表される化合物 [以下、 化合物 (VII- b) という] が特に好ましい
化合物 （II- a) 'としては、 一般式 (IV - a)
Figure imgf000021_0001
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表される 化合物 [以下、 化合物 (IV - a) という] 力好ましく、 一般式 （VI - a)
Figure imgf000021_0002
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアル力リ金属を 表す） で表される化合物 [以下、 化合物 (IV-a) という] がより好ましく、 一般 式 （VIII-a)
Figure imgf000021_0003
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表す） で表される化合物 [以下、 化合物 (VIII-a) という] が特に好ましい。 化合物 (ΙΙ-b) としては、 一般式 (IV- b)
Figure imgf000022_0001
(式中、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表され る化合物 [以下、 化合物 (IV - b) という] カ<好ましく、 一般式 （VI- b )
Figure imgf000022_0002
で表される化合物 [以下、 化合物 (VI-b) という] がより好ましく、 一般式 (VIII-b)
Figure imgf000022_0003
で表される化合物 [以下、 化合物 (VIII - b) という] が特に好ましい。
図面の簡単な説明
図 1は、 16SrRNA塩基配列を元にしたバチルス ·エスピー （Ba^llus sp. ) PV - 6株およびバチルス ·エスピー (Bacillus sp. ) PV- 7菌株の近隣結合法による 分子系統解析を示す。
以下に本発明の実施例を示す。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1
化合物 （VII- b ) (シグマ社製） lOOmgを 9. 5mlのメタノールに溶解した後、 1N 水酸化ナトリゥム 0. 5mlを加えて室温で 1時間振とうした。 得られた反応液を乾 固し脱ィォン水 5mlを加えて溶解し 1N塩酸約 0. 1mlで pHを約 6. 5〜7. 5に調整し、 さ らに脱イオン水 4. 9mlを加えることにより最終濃度が 10mg/mlの化合物 （VII - a - 1 ) [式 （VII-a) 中、 R 1がナトリウムである化合物] を 10ml得た。
バチルス ·ラテロスポラス（Bacillus laterosporus) ATCC4517株、 バチルス · バディウス（Bacillus badius)ATCC14574株、 バチルス ·ブレビス（Bacillus brevis)NRRL B-8029株、 バチルス ·エスピー（Bacillus sp. )PV-6株、 バチル ス ·エスピー（Bacillus sp. )PV-7株をそれぞれ寒天培地 [ペプトン （極東製薬ェ 業製） 1%、 肉エキス （極東製薬工業製） 0. 7%、 NaCl (ナカライテスク社製） 0. 3%、 バクトァガー （ディフコネ土製） 2%、 1N水酸化ナトリゥムで pH 7. 2に調整] に塗布 し、 30°Cで 24時間培養した。 寒天培地上に生育した菌株各々一白金耳を pH 7. 5に 調整した C培地 [グルコース （ナカライテスク社製） 2¾、 肉エキス （極東製薬工 業製） 1%、 ィ一ストエキストラクト （オリエンタル酵母社製） 1¾, ペプトン （極 東製薬工業製） 0. 1%] 3mlを含む A-スピッチ管に植菌し、 30°Cで 24時間振とう培 養した。 培養後の培養液 0. 06mlを、 pH 7. 5に調整した C培地 3ml を含む 15ml A- スピッチ管 （16. 5 X 115皿、 井内盛栄堂製） に植菌し 30°Cで振とう培養した。 24 時間培養後、 上記で得られた化合物 （VII-a- 1 ) を最終濃度 0. 2mg/mlになるよう にそれぞれの A-スピッチ管に添加し、 添加後 24時間目と 72時間目にグルコースを それぞれ最終濃度 1%になるように添加して計 120時間反応を行なつた。
反応終了後、 反応液を酢酸 （ナカライテスク社製） で pH 4に調整した。 この反 応液 lmlに酢酸ェチル （ナカライテスク社製） 2mlを加え、 1時間振とうした。 振 とう後、 遠心分離機 （日立ェ機製 05P-21型） を用いて 3000rpm、 5分間遠心分離し て上清の酢酸ェチル層を回収し、 遠心エバポレー夕一 （トミ一精ェ社製 CC- 101 型） で溶媒を除去した後、 残渣をメタノール lmlに溶解した。 このメタノール溶 液の一部を用いて HPLC分析 [カラム； Inertsil 0DS-2(5 ^ m, 4 X 250匪， ジーエル サイエンス社製） 、 カラム温度； 60°C、 移動相； ァセトニトリル：水： リン酸- 55： 45： 0. 05、 流速： 0. 9ml/分、 検出波長; 237nm]を行った結果、 そのリテンシ ヨンタイムから化合物 （VIII-a- 1 ) [式 （VIII- a) 中、 R 1がナトリウムであ る化合物] の生成が確認された。 本条件において、 化合物 （VII-a- 1) のリテン シヨンタイムは 2 . 3 6分、 化合物 （VIII- a-1) のリテンションタイムは 6 . 5 1分である。 実験に用いた全ての菌株で化合物 （VIII-a-1) に相当するピークが 認められ、 例えばバチルス ·ブレビス (Bacillus brevis) NRRL B-8029株による 反応生成物は、 2 . 3 6分と 6 . 4 7分にピークを認めた。
得られた化合物 （VIII- a- 1 ) の量は、 バチルス 'ラテロスポラス (Bacillus laterosporus) ATCC4517株を用いた場合 16. 8mg/l、 バチルス · ディウス
(Bacillus badius) ATCC14574株を用いた場合 10. 3mg/l、 バチルス ·ブレビス (Bacillus brevis) NRRL B- 8029株を用いた場合 1. 4mg/l、 バチルス ·エスピー (Bacillus sp. ) PV-6株を用いた場合 7. 3mg/l、 バチルス ·エスピー (Bacillus sp. ) PV- 7株を用いた場合 42. Omg/1であつた。
実施例 2
バチルス .エスピー (Bacillus sp. ) PV-7株を実施例 1と同様の寒天培地に塗 布し、 30°Cで 24時間培養し、 寒天培地上に生育した菌株を一白金耳をとり、 pH 7. 5に調整した C培地 3mlを含む 15ml A-スピッチ管 （16. 5 x ll5mm、 井内盛栄堂 製） 2本に植菌して 30°Cで 24時間振とう培養した。 培養後の培養液 0: 06mlを、 pH 7. 5に調整した C培地 3mlを含む 15ml A-スピッチ管 60本各々に植菌し、 30°Cで振 とうしながら培養を行なった。 ±咅養開始後 24時間目に、 実施例 1と同様にして得 られた化合物 (VII-a-1) を最終濃度 0. 4mg/mlになるように添加し、 ±咅養開始後 24時間目と 72時間目にそれぞれグルコースを最終濃度 1%になるように添加し、 計. 120時間培養を行った。 培養終了後、 培養液を 3000rpm、 4°Cで 10分間遠心分離し 上清を分取した。 この上清の pHを酢酸を用いて 4. 0に調整し、 360mlの酢酸ェチル を添加して 30°Cで 1 時間振とうした。 振とう後、 静置して上清を回収し、 この上 清に脱イオン水 90mlを添加して 30°Cで 30分振とうして再度上清を回収した。 この 上清に飽和食塩水 90mlを添加し 30°Cで 30分振とうして上清を回収した。 次に、 この上清に無水 Na2S04を 4. 5g添加して室温で 15分間放置して脱水した後、 減圧下乾固した。 得られた残查を脱イオン水 5mlに溶解して水酸化ナトリゥムで pHを 9. 0に調整し、 100mlの HP- 20カラム （35 x 100匪、 三菱化学製） に通塔した。 力ラムは 300mlの脱ィォン水で洗浄した後、 45!¾のァセトン水溶液 120mlで溶出し た。 分取した画分は HPLC分析 [分析カラム； Inertsil ODS- 2(5 / m， 4 x 250mm, ジ 一エルサイエンス社製）、 カラム温度； 60°C、 移動相；ァセトニトリル：水： リン 酸 =55 ： 45 ： 0. 05、 流速： 0. 9ml/分、 検出波長； 237nm]を行い、 化合物 （VIII - a - 1) を含む画分を回収した。 この画分を減圧下でァセトニトリルを除去した後、 pHを酢酸を用いて 4. 0に調整し、 360mlの酢酸ェチルを添加して 30°Cで 1時間振と うした。 振とう後、 静置して上清を回収し、 この上清に脱イオン水 90mlを添加し て 30°Cで 30分振とうして再度上清を回収した。 この上清に飽和食塩水 90mlを添加 し 30°Cで 30分振とうして上清を回収した。
次にこの上清に無水 Na2S04 4. 5gを添加して室温で 15分保持して脱水して減圧 下乾固し、 得られた残查をジクロルメタンに溶解し、 1%のトリフルォロ酢酸を加 えてラクトンィ匕した後、 分取用 HPLC [カラム； Develosil ODS-HG - 5 (20 x 250mm、 野村化学製） 、 カラム温度； 40°C、 溶媒； 55% メタノール、 流量； 20ml/分、 検 出波長； 237nm] を用いて精製を行なった結果、 化合物 （VIII-b) 力 . lmg得られ た。
得られた化合物 (VIII-b)のマススぺクトルおよび1 H-NMRスぺクトル分析の結果 は以下の通りである。
マススぺクトル
日本電子製 JMS- HX/HX110A質量分析計を用い、 マトリックスに m-二トロべンジ ルアルコールを使用してポジティブモードで測定した。 その結果、 m/z 407に擬 似分子イオンピーク （Di+H]+) を与え、 化合物 （VIII- b ) の構造および分子量
(406)から期待される数値に一致した。
^-NMR スぺク トル
日本電子製 JNM- α 400型スぺクトロメータを用い、 重クロ口ホルム中、 内部標 準に TMSを使用し 400MHzで測定した。 その結果を以下に示す。 このスペク トルデ —夕は化合物 （Vlll-b ) の公知のデータ [三共研究所年報， ， 147(1985)]と 一致した。
<5 ppm(CDCl3)： 6. 01(1H, d, J=9. 5Hz), 5. 89(1H， dd， J=9. 5， 5. 9Hz), 5. 58(1H， m)， 5. 41 (1H, m)， 4. 60 (1H, dddd, J=10. 6, 7. 3， 5. 4， 2. 8Hz), 4. 40 (1H, m)， 4. 38 (1H, m), 2. 74(1H, dd，J=17. 6， 5. 1Hz), 2. 6K1H, ddd, J=17. 6， 3. 7， 1. 5Hz), 2. 59 (1H, dddd, J=13. 1， 6. 0， 4. 8, 1. 5Hz), 2. 40(1H, m), 2. 36(1H, m)， 2. 34(1H, m), 1. 95(1H， dddd, J=14. 4， 3. 7, 2. 9， 1. 7Hz), 1. 86(1H, dddd, J=12. 5, 12. 3, 7. 3， 4. 3Hz), 1. 69(1H, m)， 1. 68(1H, m), 1. 64 (1H, m)，
1. 57(1H, m), 1. 5~1. 4(2H, m), 1. 43(1H, m)， 1. 30(1H, m), 1. 12 (3H, d， J=6. 8Hz)， 0. 91 (3H, d， J=7. 1Hz), 0. 89 (3H, t, J=7. 4Hz)
実施例 3
実施例 1と同様にして、 化合物 （VII - a- 1 ) [式 （VII- a) 中、 R 1がナトリ ゥムである化合物] を得た。
バチルス ·アルべィ（Bacillus alvei)ATCC6344株、 バチルス ·サ一キュランス (Bacillus circulans)NTCT- 2610株、 バチルス ·マセランス（Bacillus
macerans)NCIB- 9368株、 バチルス ·メガテリゥム（Bacillus
megaterium)ATCC10778株、 バチルス 'メガテリゥム （Baci^jis megaterium) ATCC11562株、 バチルス 'メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC13402株、 バチルス ·メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC15177 株、 バチルス ·メ ガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC15450株、 バチルス 'メガテリゥム
(Bacillus megaterium) ATCC19213株、 バチルス ·メガテリゥム （Bacillus megaterium) IAM1032株、 バチルス ·プミルス（ acil_^is pumilus)FERM BP- 2064 株、 ノ<チルス 'サチルス (Bacillus subtilis) ATCC6051株をそれぞれ寒天培地
[ペプトン （極東製薬工業製） 1%、 肉エキス （極東製薬工業製） 0. 7%、 NaCl (ナ 力ライテスク社製） 0. 3¾. バクトァガー （ディフコ社製） 2%、 1N水酸化ナトリゥ ムで pH 7. 2に調整] に塗布し、 30°Cで 24時間培養した。 寒天培地上に生育した菌 株各々一白金耳を pH 7. 4に調整した LBG培地 [グルコース （ナカライテスク社 製） 2!¾、 パクトトリプトン （ディフコ社製） 1¾. ィーストエキストラクト （ディ フコ社製） 0. 5%、 NaCl (ナカライテスク社製） 0. 5%] 3mlを含む試験管（13 x 165薩）に植菌し、 30°Cで 24時間振とう培養した。 培養後の培養液 0. 2mlを、 pH 7. 4に調整した1 6 3培地 [グルコース （ナカライテスク社製） 2¾. パクトトリプ トン （ディフコ社製） 1¾、 ィ一ストエキストラク ト （ディフコ社製） 0. 5%、 NaCl
(ナカライテスク社製） 0. 5¾. 炭酸カルシウム （国産化学社製） 0. 5%] 10mlを含 む試験管 （21 X 200mm) に植菌し 30°Cで振とう培養した。 24時間培養後、 培養液
1 mlを 13ml容ポリプロピレンチューブ （SARSTEDT社製、 輸入元アシスト社、 No. 60 540S) にとり、 化合物 (Vll-a- 1 ) を最終濃度 0. 2mg/ml、 グルコースを最 終濃度 1%になるようにそれぞれ添加して 48時間反応を行なつた。
反応終了後、 反応液を酢酸 （ナカライテスク社製） で pH 4に調整した。 この反 応液 lmlに酢酸ェチル （ナカライテスク社製） 2mlを加え、 1時間振とうした。 振 とう後、 遠心分離機 （日立ェ機製 05P- 21型） を用いて 3000rpm、 5分間遠心分離し て上清の酢酸ェチル層を回収し、 遠心エバポレー夕一 （トミ一精ェ社製 CC- 101 型） で溶媒を除去した後、 残渣をメタノール lmlに溶解した。 このメタノール溶 液の一部を用いて HPLC分析 [カラム； Inertsil 0DS-2(5 m, 4 x 250難， ジーエル サイエンス社製） 、 カラム温度; 60°C、 移動相；ァセトニトリル：水： リン酸 = 55 ： 45 ： 0. 05、 流速： 0. 9ml/分、 検出波長; 237nm]を行った結果、 そのリテンシ ヨンタイムから化合物 （VIII- a- 1) [式 （VIII- a)中、 R 1がナトリウムである 化合物] の生成が確認された。
得られた化合物 （VIII- a-1) の量はバチルス .アルべィ (Bacillus alvei) ATCC6344株を用いた場合 0. 18mg/l、 バチルス ·サ一キュランス (Bacillus circulans) NTCT- 2610株を用いた場合 0. 18mg/l、 バチルス ·マセランス
(Bacillus macerans) NCIB- 9368株を用いた場合 0. 32mg/l 、 バチルス ·メガテ リウム (Bacillus megaterium) ATCC10778株を用いた場合 8. 4mg/l 、 バチルス . メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC11562株を用いた場合 0. 31mgAU バチ ルス ·メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC13402株を用いた場合 1. 30mg/l、 バチルス ·メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC15177株を用いた場合 1. 60mg/l、 バチルス ·メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC15450株を用い た場合 0. 58mg/l、 バチルス ·メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC19213株 を用いた場合 0. 16mg/l、 バチルス ·メガテリウム (Bacillus megaterium) IAM1032株を用いた場合 9. 20mg/l、 バチルス ·プミルス (Bacillus pumilus) FERM BP- 2064株を用いた場合 0. 17mg/l、 バチルス ·サチルス (Bacillus subtilis) ATCC6051株を用いた場合 1. llmg/1であった。
実施例 4
バチルス ·ラテロスポラス（Bacillus laterosporus)ATCC4517株を実施例 1と 同様の寒天培地に塗布し、 30°Cで 24時間培養し、 寒天培地上に生育した菌株を 一白金耳をとり、 pH 7. 5に調整した C培地 3mlを含む 15ml A-スピッチ管 （16. 5 X 115mm. 井内盛栄堂製） 2本に植菌して 30°Cで 24時間振とう培養した。 培養後 の培養液 0. 06mlを、 pH 7. 5に調整した C培地 3mlを含む 15ml A-スピッチ管 60本 各々に植菌し、 30°Cで振とうしながら培養を行なった。 培養開始後 24時間目に、 実施例 1と同様にして得られた化合物 （VII- a-1) を最終濃度 0. 4mg/mlになる ように添加し、 ±咅養開始後 24時間目と 72時間目にそれぞれグルコースを最終濃 度 1%になるように添加し、 計 120時間振とうしながら培養を行った。 培養終了 後、 培養液を 3000rpm、 4°Cで 10分間遠心分離し上清を分取した。 この上清の pH を IN塩酸を用いて 3. 0に調整し、 360mlの酢酸ェチルを添加して振とうした後、 静置して上清を回収する操作を 3回行つた。 この上清に脱ィォン水 90mlを添カロ して振とうした後、 上清を回収した。 この上清に飽和食塩水 90mlを添加して振 とうした後、 上清を回収した。
次に、 この上清に無水 Na2S04を 4. 5g添加して室温で 15分間放置して脱水した 後、 減圧下乾固した。 得られた残査を脱イオン水 5mlに溶解して水酸化ナトリ ゥムで pHを 9. 0に調整し、 50mlの HP-20カラム （25x l00mm、 三菱化学製） に通 塔した。 カラムは 150mlの脱イオン水で洗浄した後、 アセトン含量 20!¾、 30%、 40%のァセトン水溶液 100mlで段階的に溶出した。 分取した画分は HPLC分析 [分 析カラム； Inertsil ODS- 2(5 / m， 4 x 250mm，ジーエルサイエンス社製）、 カラム 温度; 60°C、 移動相；ァセトニトリノレ：水： リン酸 =55： 45： 0. 05、 流速： 0. 9ml/分、 b検出波長; 237nm]を行い、 リテンションタイムから化合物
(VIII-a-1) を含む画分を回収した。 この画分を減圧下でァセトニトリルを除 去した後、 PHを 1N塩酸を用いて 3. 0に調整し、 360mlの酢酸ェチルを添加して振 とうした。 振とう後、 静置して上清を回収し、 この上清に脱イオン水 90mlを添 加して振とうして再度上清を回収した。 この上清に飽和食塩水 90mlを添加し振 とうして上清を回収した。
次にこの上清に無水 Na2S04 4. 5gを添加して室温で 15分間保持して脱水して 減圧乾固し、 得られた残查をジクロルメタンに溶解し、 1¾のトリフルォロ酢酸 を加えてラクトンィ匕した後、 分取用 TLC [シリカゲル板； No. 1. 05744(200 X 200讓， 0. 5mm厚) MERCK社製、 展開溶媒;酢酸ェチル、 発色液； 12. 5%リンモリブ デン酸 · 1%硫酸セリウム/ 10%硫酸溶液] を用いて精製を行なった結果、 化合物 (VIII- b ) が 0. 8mg得られた。 得られた化合物 (VIII- b )のマススペクトルお よび1 H-匪 Rスぺクトノレ分析の結果は以下の通りである。
マススぺクトル
日本電子製 JMS- HX/HX110A質量分析計を用い、 マトリックスに m-二ト ジルアルコールを使用してポジティブモードで測定した。 その結果、 m/z 407 に擬似分子イオンピ一ク（[M+H]+)を与え、 化合物 （VIII-b) の構造および分子 量 (406)から期待される数値に一致した。
また、 高分解能 FAB MS測定の結果、 m/z 407. 2440に擬似分子イオンピーク ( [M+H] +)を与え、 化合物の分子式 (C23H3406)から期待される計算値 (m/z
407. 2434: C23H3506) に測定誤差範囲内で一致した。
¾-NMRスぺクトル
日本電子製 J匪- LA300型核磁気共鳴装置を用い、 重クロ口ホルム中、 内部標 準にクロ口ホルム（<5 7. 26ppm)を使用し、 300MHzで測定した。 その結果を以 下に示す。 このスぺクトルデータは化合物 （VIII-b) の公知のデータ [三共研 究所年報， ， 147(1985)]と一致した。
<5 pm(CDCl3)： 6. 00 (1H, d， J=9. 7Hz), 5. 90 (1H, dd， J=9. 7, 5. 7Hz), 5. 58(1H， m)， 5. 41(1H, m)， 4. 6K1H, dddd, J=10. 9, 7. 8， 5. 1， 2. 9Hz)， 4. 45-4. 35(1H, m)， 4. 38 (1H, dq, J=5. 0， 3. 9Hz)， 2. 73(1H, dd， J=17. 6，
5. 0Hz), 2. 62 (1H, ddd, J=17. 6, 3. 9, 1. 7Hz)， 2. 59 (1H, dddd, J=13. 5, 6. 6, 4. 8, 1. 6Hz), 2. 45-2. 35 (1H, m), 2. 36(1H, sex, J=6. 9Hz)， 2. 40-2. 30 (1H, m)， 1. 95(1H, dddd, J=14. 4, 3. 9， 2. 9， 1. 7Hz), 1. 90- 1. 80(1H, m)， 1. 75- 1. 60(1H, m)， 1. 68(1H, ddd, J=14. 4, 10. 9， 3. 9Hz), 1. 65(1H, dqu, J=13. 6， 7. 5Hz), 1. 65-1. 50 (1H, ), 1. 43(1H, dqu, J=13. 6， 7Hz), 1. 50- 1. 35(2H， m), 1. 35-1. 25(1H, m), 1. 12(3H, d， J=7. OHz), 0. 91(3H， d， J=7. OHz), 0. 89 (3H, t, J=7. 4Hz)
産業上の利用可能性
本発明により HM G— C o Aレダクターゼを阻害し、 血清コレステロールの低 下作用等を有する化合物を効率よく製造することができる。

Claims

請求の範囲
1 . ペチルス属に属する微生物由来でかつ、 -般式 (I- a)
Figure imgf000031_0001
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表される 化合物 [以下、 化合物 （I-a) という] または一般式 （I-b)
Figure imgf000031_0002
(式中、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表され る、 化合物 (I-a) の閉鎖ラクトン体 [以下、 化合物 （I- b) という] から、 一般 式 （II - a)
Figure imgf000031_0003
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表される 化合物 [以下、 化合物 (II- a) という] または一般式 (II-b)
Figure imgf000032_0001
(式中、 R 2は置換もしくは非置換のアルカリまたはァリールを表す） で表され る、 化合物 （Il-a) の閉鎖ラクトン体 [以下、 化合物 （Il-b) という] を生成す る活性を有する酵素源を、 化合物 （I-a) または化合物 （I-b) に反応液中で作用 させ、 反応液中に化合物 (Π-a)または化合物 （II- b) を生成させ、 該反応液から 化合物 (Il-a)または化合物 （II-b) を採取することを特徴とする化合物 (II- a)ま たは化合物 （Π-b) の製造法。
2 . 化合物 (I-a) が一般式 （III - a)
Figure imgf000032_0002
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表される 化合物 [以下、 化合物 (III- a) という] であり、 化合物 (I-b) が一般式 (III- b)
Figure imgf000033_0001
(式中、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表され る化合物 [以下、 化合物 （ΠΙ-b) という] であり、 化合物 （Π-a) 力一般式 (IV- a)
Figure imgf000033_0002
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表す） で表される化合物 [以下、 化合物 （IV- a) という] であり、 化合物 （Π- b) が一般式 (IV-b)
Figure imgf000033_0003
(式中、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す） で表され る化合物 [以下、 化合物 （IV-b) という] である請求の範囲 1記載の製造法。
3 . 化合物 （I-a) 力一般式 （V - a)
Figure imgf000034_0001
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表す） で表される化合物 [以下、 化合物 （V- a) という] であり、 化合物 （I - b) 力 <一般式 （V - b)
Figure imgf000034_0002
で表される化合物 [以下、 化合物 （V- b) という] であり、 化合物 （Π-a) が- 般式 （VI - a)
Figure imgf000034_0003
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表す） で表される化合物 [以下、 化合物 （VI- a) という] であり、 化合物 （II- b) が一般式 (VI-b)
Figure imgf000035_0001
で表される化合物 [以下、 化合物 （Vl-b) という] である請求の範囲 1記載の製 造法。
4 . 化合物 （I-a) が一般式 （Vll-a)
Figure imgf000035_0002
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表す） で表される化合物 [以下、 化合物 （Vll-a) という] であり、 化合物 （I - b) が一般式 (VII-b)
Figure imgf000035_0003
で表される化合物 [以下、 化合物 （VII- b) という] であり、 化合物 （II- a) が 一般式 （VIII- a)
Figure imgf000036_0001
(式中、 R1は水素原子、 置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を 表す） で表される化合物 [以下、 化合物 （VIII- a) という] であり、 化合物 (ΙΙ-b) が一般式 (VIII-b)
Figure imgf000036_0002
で表される化合物 [以下、 化合物 （VIII- b) という] である請求の範囲 1記載の 製造法。
5. 酵素源が、 化合物 (I - a) または化合物 (I-b) から、 化合物 (Π-a)または 化合物 （Π- b) を生成する活性を有する微生物、 該微生物の培養物もしくは菌体 またはそれらの処理物、 または該微生物から抽出した酵素である請求の範囲 1記 載の製造法。
6 . 酵素源が、 化合物 (III- a) または化合物 (ΙΙΙ-b) から、 化合物 (IV_a)ま たは化合物 (IV-b) を生成する活性を有する微生物、 該微生物の培養物もしくは 菌体またはそれらの処理物、 または該微生物から抽出した酵素である請求の範囲 2記載の製造法。
7 . 酵素源が、 化合物 (V - a) または化合物 (V-b) から、 化合物 (VI- a)または 化合物 （VI- b) を生成する活性を有する微生物、 該微生物の培養物もしくは菌体 またはそれらの処理物、 または該微生物から抽出した酵素である請求の範囲 3記 載の製造法。
8. 酵素源が、 化合物 （VII- a) または化合物 (VII-b) から、 化合物 (Vin-a) または化合物 （VIII- b) を生成する活性を有する微生物、 該微生物の培養物もし くは菌体またはそれらの処理物、 または該微生物から抽出した酵素である請求の 範囲 4記載の製造法。
9 . バチルス属に属する微生物がバチルス ·ラテロスポラス (Bacillus laterosporus) チノレス ·パディウス (Bacillus badius) く 'チノレス ·フ、'レ ビス (Bacillus brevis) 、 バチルス ·アルべィ (Bacillus alvei) くチル ス ·サ一キユランス（Bacillus circulans 'チノレス ·マセランス（Bacillus macerans) ナノレス · メ テリヮム (Bacillus megateriumリ、 ナノレス ·づ ノレ ス（Bacillus pumilus)またはバチルス ·サチルス (Bacillus subtilis) に属す る微生物である請求の範囲 1 2 3または 4記載の製造法。
1 0 . バチルス属に属する微生物が、 バチルス ·ラテロスポラス (Bacillus laterosporus) ATCC4517株、 バチルス ·バディウス （5 cil^is badius)
ATCC14574株、 バチルス ·ブレビス (Bacillus brevis) NRRL B-8029株、 バチル ス ·アルべィ（Bacillus alvei) ATCC6344株、 バチルス ·サ一キュランス
(Bacillus circulans) NTCT- 2610株、 バチルス ·マセランス（Bacillus
macerans) NCIB-9368株、 バチルス ·メガテリゥム（Ba_cillus_
megaterium)ATCC10778株、 バチルス ·メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC11562株、 バチルス 'メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC13402株、 バチルス 'メガテリゥム (Bacillus megaterium) ATCC15177株、 バチルス ·メガ テリゥム (Bacillus megaterium) ATCC15450株、 バチルス 'メガテリゥム
(Bacillus megaterium) ATCC19213株、 バチルス 'メガテリゥム (Bacillus megaterium) IAM1032株、 バチルス ·プミルス（Bacillus pumilus) FERM BP-2064 株またはバチルス ·サチルス (Bacillus subtilis) ATCC6051株である請求の範 囲 1 2 3または 4記載の製造法。
1 1 . バチルス属に属する微生物がバチルス ·エスピー（Bacillus sp. ) PV- 6 株 （FERM BP- 6029) またはバチルス ·エスピー（Bacillus sp. ) PV- 7株 (FERM BP-6030) である請求の範囲 1、 2、 3または 4記載の製造法。
1 2 . バチルス ·エスピ—（Bacillus sp. ) PV-6株 （FE BP-6029) 。
1 3 . バチルス ·エスピー（Bacillus sp. ) PV-7株 （FERM BP-6030) 。
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