UA61066C2 - A METHOD FOR OBTAINING THE FOREIGN PROTEIN IN CELLS OF à.cÄLI, A PLASMID VECTOR AND TRANSFORMED STRAIN OF E. COLI FOR EXPRESSION OF THE FOREIGN PROTEIN - Google Patents

Description

Опис винаходу

Изобретение относится к способу порционной ферментации с подпиткой при использований специальньх 2 систем хозяинвектор ДНК для зффективного образования рекомбинантньх протейнов, в особенности рекомбинантньїх молекул антител, в частности, фрагментов антител, как, например, миниантитела.

В предлагаемьх согласно изобретению условиях клетки Е. соїї могут расти с максимальной удельной скоростью роста вплоть до очень вьісоких плотностей клеток. После начала образования рекомбинантного продукта только образовавшийся продукт действует ограничивающе на рост ограничения роста за счет 70 субстрата: или метаболических побочньїх продуктов не происходит. Таким образом и в связи со специально приспособленньми для зтой цели и обладающими вьісокой стабильностью новьми векторами зкспрессий можно достигать вьісоких вьїходов в единицу времени и на единицу обьема рекомбинантньїх протеинов, которьге, в частности, в случае фрагментов антител обладают вьісокой биологической активностью.

Существенной предпосьлкой для зффективного образования рекомбинантньїх протейнов является 72 культивирование клеток Е. соїї до вьісоких плотностей клеток. Для зтой цели существуют следующие, согласно уровню техники, способь! культивирования: после неограниченного роста (М - М тах) в порционной фазе (Ваїсн-Рпазе) в последующей фазе периодической подпитки (Ред-Ваїсп-Рпазе) источник углерода обьічно (глюкозу или глицерин) добавляют в таком ограниченном количестве, что избегают образования тормозящих рост побочньїх продуктов, как, например, ацетат, с тем последствием, чтобьі рост тогда мог продолжаться вплоть до достижения вьісоких плотностей клеток, лимитируємьй только субстратом (М « Мупах) (например,

Кіезепрегд и др., 9. ВіоФесппої., 20, 1728 (1991); Бігапарегда и др., РЕМ МісгобріоЇ. Кем., 14, 5356 (1994);

Каог2 и др., 9. Віоїесппої!., 39, 59-65 (1995); европейский патент В 0511226). Рост с пониженной нормой роста имеет следствием, естественно, длительнье времена ферментации и, таким образом, следовательно, также незначительнье вьіїхода в единицу времени на единицу обьема. В случае зтих ферментации на оснований с 22 немедленного потребления концентрация гисточника углерода в культуральном растворе равна почти нулю. Го)

После начала образования рекомбинантного продукта ничто не изменяется в лимитируемьх субстратом соотношениях.

Известньії также периодические культивирования с подпиткой с помощью Е. соїї, при которьїх источник углерода добавляют прерьвисто через гораздо большие промежутки времени и тогда в гораздо больших о 30 количествах, причем чаще всего используют повьішение рО2 значения (величина парциального давления Ге) кислорода) в качестве индикатора истощения субстрата для начала следующей дозировки источника углерода (например, Еррзіевїп и др., Віоїесппої., 7 1178-1181 (1989)). Зтот образ действий означаєт частое изменение о длительньїх по времени условий избьтка субстрата до условий лимитирования субстрата и таким образом «-- включает метаболические дисбалансь.

Зо В последующем, принимают во внимание периодичного культивирования с подпиткой, при которьїх клетки в о фазе порционной подпитки могут расти с максимальной удельной скоростью роста (М - Мулах) . Порционнье культивирования с подпиткой, при которьїх после вне линейньїх (оїй-Іїпе) определений добавляют гораздо большиє количества источника углерода через гораздо большиє промежутки времени процесса «ф культивирования с целью устранения лимитирования субстрата и которнше являются зкспериментально З 40 применимьми и имеют тот недостаток, что во время всего процесса ферментации постоянно изменяєтся с концентрация источника углерода (например, Раск и др., Віоіесппої., :11, 1271-1277 (1993); ЛНайпт и др., Арр! з» . Місгобріої. Віоїесппо)., 42, 100-107 (1994)).

Описьваются также порционнье культивирования с подпиткой, при которьїх концентрацию источника углерода замеряют и регулируют внутри линии (оп-іпе), так чтобьї изоежать лимитирования, хотя отим 45 культийированиям присуши нижеописьіваємьсе недостатки, в частности, в области вьісокой плотности клеток. б Недавно описано использование в микробиологических ферментациях, осуществляемьх в ферментерах типа - котла с мешалкой, автоклавируемого биосенсора глюкозь (М.К. РНеїрз и др.,

Віоїесппої. Віоепод., 46, 514524 (1995)). Его используют для культивирования культурь! Е. соїЇ. Зтот іп о зіш-сенсор поставляет с задержкой во времени примерно 2 минуть! действительное значение в культуральном б 20 растворе. Поставляємьй сенсором глюкозьі сигнал между прочим зависит от значения рН и парциального давления кислорода (ро 2). В области вьісокой плотности клеток Х » 80г/л сенсор не апробирован. Как с показьіваєт опьїт, обрастания іп зіш-зондов с помощью Е. соїї в условиях очень вьісоких плотностей клеток могут приводить в значительной степени к дальнейшим ошибочньїм значениям. Кроме того/ сенсор во время процесса протекания ферментации точно не рекалибруется. Другие способь! базируются не на измерениях с помощью іп вішсенсора, а основьіваются, например, на определений источников углерода с помощью анализаторов ввода в

ГФ) потоке (РІА) или в процессе вьісокозффективной жидкостной хроматографии в освобожденном от клеток культуральном растворе, которьій полунепрерьівно отбирают из ферментера и подвергают фильтрации или о микроцентрифугированию (Кіетап и др., Аррі. ' Епмігоп. Місгобріо!., 57, 910-917 и 918-923 (1991); Тигпег и др.., Віоїесппої. Віоепд., 44, 819-829 (1994)). Предсказаннье и обратносвязаннье контрольнье алгоритмь 60 прогнозирования уменьшают колебания концентрации глюкозь! при росте вплоть до Х - 65 г/л (Кіетап и др.,

Аррі. Епмігоп. Місгобіо!., 57, 910-917 (1991)). В области очень вьісоких плотностей клеток (начиная примерно с 8Ог/л до 150г/л) разделение клеток и питательного раствора становится в возрастающей степени более затруднительньм и требующим больших затрат времени, так что также в зависимости от биомассь! в ферментере увеличиваеєтся задержка во времени определения действительного содержания глюкозь! и бо затрудняєтся, соответственно, становится невозможньм поддерживаниє постоянньм уровня глюкозь. В противоположность зтому, с постоянной и кратковременной задержкой по времени определяют концентрацию глюкозь! в аппаратуре, для использования которой не нужно осуществлять зтого отделения клеток (Ріай и др.,

Ргосеедіпуз ої (Ше бій Іпіегпайопа! Сопіегепсе оп Сотршіег Аррі. іп ВіоїФесппоїЇ. Сагтізсп-РагіепкКігспеп, ФРГ, 1995, с.6-11). Согласно Пфаффу и др., в непосредственной близости от места отбора проб после разбавления культурьі ингибитором роста используют РІА с ферментативноампериометрическим сенсором глюкозь.

При азробном культивирований образуются клетки Е. соїї, которьїх не принуждают к субстратлимитируемому росту путем режимов дозировки, обьічно усиливает зто метаболический побочньйй продукт ацетат (Кіезепрего,

Сигт. Оріпіоп Віоїеснпо)!., 2, 380-384 (1991)), которьій аккумулируется в питательном растворе и в повьішенньх 7/0 Количествах действует как ингибитор роста (Рап и др., Віобїесппої. І ей., 2, 89-94 (1987)). Позтому до сих пор зти порционнье культивирования с подпиткой до вьісоких плотностей клеток бьіли возможнь только при использованиий особьх штаммов ЕЕ. соїї, в случае которьх аккумуляция ацетата снижена за счет целенаправленньїх генетических изменений, при допустимости других, связанньх с зтим недостатков. К потомкам Е, соїї К1І2 относятся фосзфотрансацетилазаотрицательнье мутанть! (Вацег и др., Аррі. Епмігоп. 7/5 Місторіої., 56, 1296-1302 (1990), Найт и др., Аррі. Місгобіої. Віо(есипої., 42., 100-107 (1994)), рост которьїх, однако, в среде глюкозаминеральнье соли сильно уменьшен. РПеірз и др. (см. вьіше) в качестве хозяина использовали штамм Е. соїї ТОРРБ5 для не лимитируемого субстратом культивирования вплоть до получения биомассь! Х - 85г/л. Зтот штамм Е. соїї., которьій очевидно не сильно аккумулирует ацетат, однако, не является никаким штаммом К12. Е, сої ТОРРБ5 образует гемолизин и таким образом представляет собой го патогенньій штамм, которьій по соображениям безопасности не используют в промьішленном секторе в качестве хозяина для образования рекомбинантньїх ДНК-продуктов. Путем трансформации клеток Е. сої с помощью плазмидь, которая содержит ген для кодирования ацетолактатсинтазь (А! 5), благодаря достигнутой переориентации промежуточного обмена веществ можно достичь восстановления аккумуляции ацетата (Зап и др., Апп-М-М-Асад-5сі, 721, 257-267 (1994)) Зтому образу действий, однако, присущ недостаток, сч ов Заключающийся в том, что при использований АІ/З-кодирующей плазмидь в сочетаний со второй, несущей "производственньїйй" ген плазмидой в условиях вьісокой плотности клеток обьічно появляются нестабильности. і)

За счет нестабильностей плазмид, которье в особенности проявляются усиленно при культивированиий до очень вьісоких плотностей клеток, зачастую снижается зффективность образований рекомбинантньїх продуктов.

Антитела или фрагменть антител, как Раб", К(абр)2, миниантитела или одноцепочечньсе Гу, в возрастающей Ге зо степени приобретают значение в области медицинь! и биотехнологии. Под миниантителом нужно понимать, далее, согласно изобретению, бивалентньій или биспецифический, связанньій через псевдошарнирную область ісе) одноцепочечньій Емфрагмент. При зтом, как, например, в терапии раковьїх заболеваний, может оказаться о важной доступность иметь в распоряжениий большие количества антител (примерно 1г на дозу). В Е. сої в настоящее время можно особенно легко и успешно получать моновалентнье фрагменть! антител или слитье -- з5 Ппротеиньі из них, соответственно, их мультимернье или мультиспецифические варианть. Зти фрагменть, (9 соответственно, вариантьї, имеют маленький размер, связанньй с вьісокой специфической способностью связьівания (например, РіоскКійип А., Іттипої. Кем., 130, 151-188 (1992); РасК и др., у. Мої. Віої., 246, 28-34 (1995)). Протеиньй и, в частности, антитела, однако, должньії иметь соответствующую складчатую структуру, - чтобь! бьіть биологически и функционально зффективньми. Зту проблему нужно принимать во « 0 Внимание в случае рассмотрения вьіїхода образовавшегося фрагмента антитела на клетку в связи сплотностью 7) с клеток. Далее, первичная последовательность антитела играет важную роль при определений вьхода 1л міго и складчатости іп омімо (Кпаррік А. и РішскК(йип А., Ргоївіп Епдіп., 8, 81-89 (1995)) Так, например" ;» Еар-фрагменть! зкспрессируются в виде нерастворимьїх цитоплазматических или периплазматических агрегатов и іп міго возвращаются в складки. Так, сосообщается о вьїходах нерастворимьїх антител примерно от 0,14г/л в случаеє низкой плотности клеток (Сопага и др., у. Віої. Спет., 265, 2292-2295 (1990)) и вплоть до

Ге» примерно 12 г/л при средней плотности клеток (ЗПірці и др., Аррі. МісгобріоЇ. ВіоФесппої., 38, 770-775 (1993)). Также бивалентнье миниантитела (РаскК и др., Віоїесппої., 11, 1271-1277 (1993)) можно получать в Е. - соїї в биологическифункциональной форме с вьїходами примерно 0,2г/л. В случає зтих вьіїходов в среднем о надлежащим образом возвращаются в складки примерно 545905.

В известньїх Е, соїї системах образование чужеродного протеина начинается, как правило, пригодньім

Ме. образом после достижения соответствующих плотностей клеток согласно системе зкспрессии благодаря

Ф регулируемой промоторной системе. В зтом случає, например, нужно назвать (ї) агаваО-промотор в присутствиий АгаС-репрессора (индуцируемьй арабинозой) (например, Вецег и др., Ргос. Май). Асад. Зсі. (О5А), 90, 457-461 (1993)); (ії) рпоАпромотор (индуцируемьй за счет удаления фосфата) (например, Сагіег и др., дв Віоїесппої., 10, 163167 (1992)) и (ії) Іаспромоторную систему (индуцируемую с помощью изопропилтиогалактозида (ІРТОЇ) (Раск и др., 1993г., цитировано вьіше). І ас-Система, которая, как правило, (Ф, вьізьівает успешную зкспрессию, однако, обладает тем недостатком, что, с одной стороньі, может происходить ка нежелательная основная зкспрессия до индукции промотора и, с другой стороньії, может наблюдаться нестабильность плазмидь!ї после индукции с помощью изопропилтиогалактозида (ІРТО). во В особой форме вьіполнения изобретения описьівается специальньй вектор (рНКК), которьій в качестве чужеродного гена содержит последовательности, кодирующие фрагменть! мьішиного, соответственного, гуманизированного антитела МАБ 425. МАБ 425 (АТСС НВ 9629) представляет собой мьішиное моноклональное антитело, которое вьіделено из известной человеческой линии раковьїх клеток А432 (АТСС СК 1555) и связано с зпитопом человеческого рецептора зпидермального фактора роста (ЕСЕК, гликопротеин величиной примерно 65 170 килодальтонов) при ингибирований связи природного лиганда зпидермального фактора роста (ЕСЕ). Бьіло установлено, что МАБ 425 оказьвваєт цитотоксическое действие на опухолевье клетки, соответственно, может препятствовать их росту (КодескК и др., Сапсег Кез., 47, 3692 (1987)). Из международной заявки УМО 92/15683 известньї гуманизированнье, а также химернье формь МАБ 425, включая последовательности ДНК и аминокислотнье последовательности их легких и тяжельх цепей.

Целью изобретения, таким образом является разработка способа получения чужеродньїх протеинов, в частности, фрагментов антител, в рекомбинантньх клетках Е. соїї в условиях вьісокой плотности клеток (НСОС - культивирование в условиях вьісокой плотности клеток) с вбіІСоКИМИ вьІХОДами в единицу времени на единицу обьема и без существенного ухудшения роста за счет субстратов или метаболитов и без заметньїх потерь плазмид, соответственно, за счет нестабільностей плазмид, при обеспечении вьісокого процента зффективной 7/0 биологической активности (способность связьвания, корректная укладка) зкспрессированного протеина.

Предлагаеємьй согласно изобретению способ представляет собой многостадийньій порционньй способ, которьй, в первую очередь, характеризуется тем, что клетки в течение всей порции могут максимально расти (М - Мудах) - Так, с помощью описьіваемого способа в конце концов можно достигать плотности клеток 100150 г/л (в расчете на сухую биомассу). Рост также незначительно ингибируется путем аккумуляции ацетата, т.к. зта /5 аккумуляция при вьібранньх условиях неожиданно не особенно вьіражена, в частности, при использований штаммов Е. соїї, которье и без того склонньь только к уменьшенному образованию ацетата во время ферментации. Зто достигается также при ряде других дополнительньїх мер прежде всего благодаря тому, что в порционной фазе подпитки, заключающей порционную фазу, концентрация источника углерода в среде поддерживается постоянной в определенном диапазоне значений при сохранениий неограниченного роста го кпеток. Благодаря соответствующей форме соответствующего вектора зкспрессии таюке можно почти исключить нежелательную основную зкспрессию протеина до начала синтеза протеина за счет регулируемой промоторной системь), точно так же, как отчасти значительную потерю плазмидь!), которая, как уже бьло упомянуто вьіше, должна обьічно наблюдаться в системах зкспрессии при использований сильньїх промоторов, как, например, Іас-промоторная система. с

В среднем можно достигать вьіходов протеина от З до 5г/л спустя примерно от 25 до 35 часов протекания всего процесса культивирования. В случае особенно критических из-за их критериев складчатости фрагментов і) антител, в особенности миниантител, примерно 8095 синтезированного материала биологически активно и имеет корректную складчатую структуру.

Таким образом, предметом изобретения является способ получения чужеродного протейна в клетках Е. сої), «о зо Которне трансформируются с помощью чужеродного гена и несущей индуцируемьй промотор плазмидь, путем ферментации в условиях вьісокой плотности клеток через стадиий порций и порционной подпитки без всякого ікс, ограничения роста благодаря субстратам или метаболическим побочньмм продуктам, и вьіделения и очистки о зкспрессированного протейина из культуральной средьі, причем концентрацию .на субстратах в фазе порционной подпитки направляют с помощью непрерьівно действующей автоматической или полуавтоматической системь! (7 з5 анализа й добавления, причем в фазе порционной подпитки (їі) концентрация источника углерода в среде со поддерживается постоянной в диапазоне от 0,1г/л до 25г/л при сохранениий неограниченного роста клеток (М -

Мупах), (її) продуцирование чужеродного протеина начинаєется в указанной фазе порционной подпитки при плотности клеток от 10 до 80г/л за счет индукции промотора; и (ії) после осуществленной индукции синтеза продукта непрерьівно добавляют используемьсе азот и фосфат, а также соли микрозлементов, причем (ім) во « о время всей фазьії порционной подпитки путем соответствующего введения кислорода в ферментационньй в с бульон величину парциального давления кислорода ро» устанавливают равной 52590.

Предлагаемая согласно изобретению величина необходимой концентрации источника углерода в течение з порционной фазьї подпитки составляет от 0,1 до 25 г/л, предпочтительно от 0,5 до 15г/л, в особенности от 1,0 до 5г/л, соответственно, от 1,0 до Зг/л. Особенно предпочтительная концентрация составляет 1,5г/л. В качестве

Мсточника углерода нужно назвать предпочтительно глюкозу или глицерин или смеси обоих. Согласно б изобретению, добавление источника углерода осуществляют непрерьвно на входе (опіпе) с помощью автоматической или полуавтоматической системь! добавления и анализа. Предпочтительно используют - систему анализа иньекционного потока на входе (РІА). о Добавление используемого азота, предпочтительно аммонийного азота, и фосфата, например, 5о диаммониигидрофосфата или аммонийдигидрофосфата, а также микрозлементов, например, растворимьсх в

Ме. среде солей бора, марганца, меди, молибдена и кобальта, железа или цинка, осуществляют в порционной фазе

Ф подпитки, заключающей порционную фазу, предпочтительно после включения синтеза протеина за счет регулируемого промотора при плотности клеток 5080Ог/л (в расчете на сухую биомассу), предпочтительно примерно при 7Ог/л, при общей норме роста от 100 до 150, предпочтительно 140г/л. 5Б Включение синтеза протеина путем активации регулируемой промоторной системь! осуществляют согласно изобретению при плотности клеток 10-8Ог/л, предпочтительно 20-бОг/л, в вьсшей степени особенно (Ф) предпочтительно в диапазоне значений от 40 до 5Ог/л. ка Парциальное давление кислорода в течение порционной фазьі подпитки составляет 52595, предпочтительно 15-2595, в внісшей степени особенно предпочтительно 20905. во РН-Значение ферментационной средь!ї согласно изобретению во время всей подпитки устанавливают 6,57,0, предпочтительно 6,7-6,9, в особенности 6,8.

Предметом изобретения, далее, является соответствующий способ, при котором используют вектор зкспрессии, содержащий чужеродньій ген в виде полигенного зкспрессирующего кластера, фланкированного двумя терминаторньми последовательностями. Зти терминаторнье последовательности, в особенности 65 позиционированнье, в проксимальном положениий успешно предотвращают нежелательную зкспрессию протеина до начала за счет , промоторной системь). Особенно пригоден терминатор (р (Мойпо и др., 5.

Васіегіоії., 170, 4097-4102 (1988)) однако, также можно использовать другие известнье терминаторнье последовательности.

Далее, предметом изобретения является способ, при котором используемьй вектор зкспрессии дополнительно содержит суицидную систему. Суицидная система продуцирует протейин, которьій без наличия плазмидь в клетке токсичен для неве. Пригоднье суициднье системь! известньї из литературьі. Особенно пригодной, согласно изобретению, суийицидной системой является ПпоКзоКсистема (например, Сегдез К.,

Віоїесппої., 6, 1402-1405 (1988)). Для способа в целях зффективного образования рекомбинантньїх протеинов, в особенности молекул антител, особенно важньм является то, что система хозяинвектор ДНК в области вьісокой 7/0 плотности клеток характеризуєется вьісокой плазмидной стабильностью, незначительной рекомбинантной основной зкспрессией и вьісоким образованием продукта. Суицидньсе системь! в сочетании с рекомбинантньми, фланкированньіми с помощью терминаторов зкспрессирующими кластерами при зтом являются специфичньми для вектора.

Далее, предметом изобретения является соответствующий способ, при котором используют чужеродньй 7/5 Тен, которьій кодирует фрагмент антитела, в частности, миниантитело.

Далее, предметом изобретения является способ, при котором используют вектор зкспрессиий с дополнительньми, описьіваемьіми ниже признаками. В принципе можно использовать большинство известньх, пригодньїх для технологий рекомбинации и для продуцирования в промьішленном масштабе штаммь! Е. сої).

Более предпочтительно находят применение такие штаммь!, которье при росте до вьісокой плотности клеток го аккумулируют относительно немного ацетата. Особенно пригодньії штаммь!, обогащение ацетатом которьхх составляет величину ниже 5г/л. Неожиданно оказалось, что благодаря вьібранньмм условиям предлагаемого согласно изобретению способа можно поддерживать особенно низкой аккумуляцию ацетата. В зтом отношений особенно пригодньім является общеизвестньй и имеющийся в продаже штамм Е. соїї КМ308 (АТС 31608), а также его такие же по действию варианть. с

Предметом изобретения, таким образом, в особенности, является соответствующий способ, при котором используют штамм Е. соїї с аккумуляцией ацетата ниже 5г/л в культуральной среде во время ферментации. ОП і)

Предметом изобретения, кроме того, является вектор зкспрессии Е. соїї, пригодньій для зкспрессий чужеродньїх протеинов в условиях ферментации при вьісокой плотности клеток, которьій обладает следующими признаками: «о зо (Ї) терминаторная последовательность в проксимальном и дистальном направлений; (і) І(ас-промотор/оператор - система; ісе) (ії) последовательность Шайн-Дальгарно 1749 10; о (ім) реІВ или отрА сигнальная последовательность; . (М) последовательность чужеродного гена; -- и в предпочтительном варианте осуществления дополнительно включает суицидную систему, в частности, (3 покзоКсуицидную систему.

Согласно изобретению, промоторную систему также можно заменить другими пригодньіми, например, вьшеуказанньми системами. Точно также изобретение охватьшвает также другие, одинаково действующие сигнальнье и управляемье последовательности. «

В качестве специальньїхх форм вьіполнения, наконец, предметом изобретения являются определяемьй в с своей конструкцией вектор зкспрессии рНКК (фиг.2), которьій содержит последовательности для миниантитела, происходящего от МАБ 425, а также особьйй рекомбинантньй Е. Соїї-хозяпин КУЗ308 І|рНККІ. ;» Описание фигур

Фиг.1: Зкспериментальная опьітная конструкция биореактора для получения протеинов в условиях вьісокой плотностТи клеток. Система снабжена измерительньм устройством, индикаторньм приспособлением, б устройствами для контроля и дозировки.

Фиг.2: Оптимизированньй вектор зкспрессии рНКК, а также отдельнье участки его конструкции. Вектор - состоит в основном из отдельньїх участков известньїх векторов рАЗК40О, рАК100 и рко1022. о Фиг.3 (а-4): Культивирование при вьісокой плотности клеток (НСО) рекомбинантной Е. соїЇ, например, Е. 5о сої КМЗО8 |РНКК); розлив по времени биомассьї, глюкозьї, аммонийного азота, фосфата, ацетата; скорость

Ме. мешалки, парциальное давление кислорода; содержание Со и СО» в отходящем газе; стабильность плазмидь!

Ф (вніражено в 9о В-лактамазаположительньїх колоний) и образование протейна (здесь: зсЕму42овапіх). Порционная фаза и фаза порционной подпитки подразделень на 5 подфаз. ІРТо-Стрелка указьівает старт продуцирования протеина. 5Б В предлагаемом согласно изобретению способе используют трансформированньсе клеткихозяева Е. соїї. При вьіборе конструкций плазмид руководствуются родом зкспрессированного протеина. Особенно благоприятнье (Ф, признаки таких конструкций описьшвшвшаются ниже. Необходимье для конструкций плазмид и трансформации ка клетокхозяев технологии и методьі! общеизвестньі и подробно описьіваются в литературе (например, Затргоок и др./ Лабораторное руководство "Молекулярное клонирование", изд. СоЇд, Харбор (1989). К тому же они бо представлень! в примерах путем указания особьхх вариантов осуществления изобретения. Исходнье плазмидь или части плазмид либо имеются в продаже, либо их можно сразу конструировать по стандартньм способам на основе известньїх схем конструкции.

Предварительную порционную фазу /типичной согласно изобретению ферментации трансформированньх клеток Е. Соїї подразделяют на две подфазьі. После инокуляции с помощью соответствующей предкультурь! 65 подфаза | характеризуется Іас-фазой, в которой клетки адаптируются и норма роста (М) затем возрастаєт до Мулах. Во время подфазь ІІ клетки растут зкспоненциально при М - М дах. После падения парциального давления кислорода (ро 2) от 10095 насьщения до значения ниже 51595 величину парциального давления кислорода путем контролирования скорости ро о-мешалки устанавливают предпочтительно при значений ро» от 15 до 2596, в частности, около 2095 (фиг.Зс). Зто установление (путем пропускания обогащенного чисть!м

Кислородом воздуха) нужно осуществлять спустя примерно 6-12 часов после начала ферментации основной культурьі. Концентрация глюкозьі, которая первоначально составляет предпочтительно 2035г/л, снижается вплоть до конца подфазь ІІ, которая также представляет собой конец порционной фазьії, предшествующей порционной фазе подпитки. При зтом величиньі не должнь ни в коем случає бьть ниже 0,1г/л. Зто предотвращают теперь путем соответствующего добавления глюкозьі (подфаза І, фиг.За, начало фазь 7/0 подпиточной дозировки). Согласно изобретению, поддерживают постоянньмм содержание глюкозь! между 0,1 и 25г/л, предпочтительно, однако, при 1-Зг/л. Для зтой цели можно, например, использовать подпиточную питательную среду Е51 (таблица 1). Т.к. зта область концентрации глюкозьї находится в достаточной степени вьіше Ко-значения для глюкозь! (Вегодіег, "Рост микроорганизмов", с.41, 1983г., изд. Сивіам Різснег, Йена), клетки могут расти дальше при Мулах. Контроль и регулирование концентрации глюкозьі! согласно изобретению 7/5 осуществляют с помощью автоматической или полуавтоматической системні.

Особенно пригодньмми являются (оп-Іпе) системьї анализа иньекционного потока в непосредственном производстве на входе. Функционирующие за счет чисто ручного или в значительной степени ручного управления системьї оказьіваются неблагоприятньіми. Порционная фаза подпитки начинается примерно между 15--ьім и 22-вім часами, однако, в конце концов зависит от различньїх индивидуальньїх факторов, таких как го температура, состав и концентрация средь), размер реактора и т.д., в особенности, однако, также от рода используемого штамма Е. соїї. Предпочтительнее примерно спустя 4-8 часов после начала порционной фазь! подпитки начинают осуществлять синтез чужеродного протеина. Точньій момент времени, однако, в конечном счете вьібирают по достигнутой к зтому моменту плотности клеток культурьі. Плотности клеток от 10 до 80г/л, предпочтительно 20-б0г/л, являются особенно благоприятньіми, если можно достигать конечньїх плотностей с ов КЛлеток от 100 до 150г/л. Таким образом, вообще благоприятньїм для начала синтеза протеина является тот момент, когда ко времени индукции имеются примерно 10-6095 максимально достигаемой плотности клеток. і)

Синтез протеина вьізьівают за счет включения регулируемой промоторной системь». Зто включение в зависимости от используемой системьї, как правило, осуществляют путем добавления вещества или за счет изменения физической величиньі, например, в случае предпочтительной Іас-системь! (промотор, оператор, «о зо МНндуктор) - путем добавления изопропилтиогалактопиранозида (ІРТО). Дальнейший рост клеток теперь ограничиваєется только еще аккумулирующимся продуктом. Позтому, согласно изобретению, важнь!м является ікс, то, что перед индукцией не может происходить никакой заметной основной зкспрессии, которая оказьівала бьі су неблагоприятное влияние на общий рост и, таким образом, на общий вьїход. Зто происходит согласно изобретению благодаря тому, что полигенньій зкспрессирующий кластер в плазмиде фланкируется активньми -- з5 Терминаторньми последовательностями. со

Начиная с момента добавления глюкозьї ферментационная среда обедняется азотом и фосфатом (фиг.За,

Б).Для того, чтобьї избежать любьїх ограничений, таюже осуществляют подпитку азотом и фосфатом путем соответствующего непрерьвного способа добавления. Азот добавляют целесообразнее всего в форме аммониевьїх солей, т.к. таким образом одновременно также можно оказьвать влияние на значение рН (6,5-7,0; « предпочтительно 6,8). Например, пригоден раствор ЕЗ2 (таблица 1). Подфаза ІМ характеризуется з с предлагаемьм согласно изобретению подводом микрозлементов (как, например, бор, марганец, железо,

Й кобальт, молибден, олово) в виде их растворимьїх солей. Добавление осуществляют, как правило, непрерьівно а с постоянной скоростью. Подфаза М характеризуется уменьшенньм ростом, в первую очередь обусловленньім аккумуляцией продукта. Кроме того, должно наблюдаться незначительное повьішение концентрации ацетата. Однако, аккумуляция, соответственно, концентрация, ацетата в среде неожиданно оказьтвается низкой. Зто б также должно обьясняться особьіми условиями способа. Штаммь! Е. соїЇ с максимальньм накоплением ацетата « 5г/л во время ферментации еще более отчетливо усиливают зтот зффект. - Вьїхода протеина изменяются в зависимости от рода протейина в среднем от 2 до бг/л. Из зтого количества, о опять в зависимости от рода протеина, биологически активньмми являются 50-9595. В случае фрагментов антител получают свьіше 8095 возвращенного в складки протейна. Зти значения отчетливо превьішают

Ме. описанньсе до сих пор в уровне техники сравнимьсе способь.

Ф Предпочтительно, с помощью оописанного способа при )использований особо сконструированньх и применимьіїх для зтой цели плазмид зкспрессий можно зффективно получать фрагменть! антител, в особенности миниантитела. Однако, согласно предлагаемому в изобретений способу предпочтительньм в образом возможно таюкже получение многих других протеинов, слитьїх протеинов или ферментов. Примерами таких пригодньїх протеинов являются гибридстрептокиназа, глюкозодегидрогеназа или также протейнь!, которьіе (Ф, оказьівают воздействие на свертьівание крови, как, например, гирудин, тромбин, гементин или теромин. іме)

Таблица 1 7 подпитки, которне используют в различньмх подфазах порционной фазь подпитки опменвод ан 11111векоз111 а енеюю11кюв111лвехя11 бо 3 (МНОоНРОХ 4х103 2272103 са мнанї 1701100000010000веавкоя ме кю ма 15? ло длимюняяма 10100мхюю11 в отепочитетияє 00005006000000100000007850000000010000100000вк05, вв 000010000003000000100000003600000010001000000ю бю оможню 01000005600000100000000880000010056 о повааюню 10006405 з обюжню00100000015000000000008в зомамоаюню 10000005 яобювеню 00000005 зв анснооюєню 00080006 68 волею 000010000юкоб00001000000вкоз00000вюкю 0100 опомевотню 116ю110110000011лямюя1левмої 1 зво ддмпициллино1001вю1111

Пример 1

Для получения рекомбинантного Е. соїїхозяина используют прототрофньій Е. Соїі-К1І2-штамм КМУЗО8 (ТІТас74-да! ІБИ:ОРЗОВзгігА) (Машцгег и др., 9У. Мої. Вісі, 139, 147-161 (1980); АТСС 31608). Трансформацию с помощью пригодного для зкспрессии вектора, а также все другие необходимье манипуляции с ДНК осуществляют, если не указано ничего другого, по стандартньмм методам. Клетки Е. соїї КМ3О8 используют в качестве контроля при соответствующей ферментации в условиях вьісокой плотности клеток. с 29 Вектор рНКК конструируют (фиг. 2) следующим образом: маленький МішпІ-фрагмент из рАК1О0 (Кгеррег и ге)

Рінскійчп, 1995), которьій содержит "сильньй" транскрипционньій терминатор їнр (Мойпо и др., см. вьіше) на участке в проксимальном направлений Іас р/о, прикрепляют плазмиду рА5К4О (ЗКегта и др., Віобгесппої., 9, 273-278 (1991).

Инсерцию покК-зок-ДНК осуществляют путем двух дальнейших стадий клонирования: арпА-ген из рКо1022 ке, (Сегдев, 1988, см. вьиіше) удаляют путем двукратного переваривания с помощью Хпо! и ЕсоВі, дополняют с Ге) помощью ДНК-полимеразьї (фрагмент Кленова) и религируют. Во второй стадии модифицированньй

ВатнНі-фрагмент из рКО1022 клонируют в , единственном месте расщепления ВатНі первого продукта о клонирования. Миниантитело происходит от одноцепочечного фрагмента, в котором вариабельнье домень в - де

Миі-М- направлений связаньі с гибким (изменяемь/м) линкером (діу ззег)з, идущим за обогащенной пролином Шарнирной областью и измененньм доменом "спиральпетляспираль" (айпіх) (Раск и др., Віоїесппої., 11, ікс, 1271-1277 (1993)), ДНК-последовательности, праймерьії, амплификации и клонирования легкой и тяжелой цепи мьішиного/ гуманизированного МАБ 425 подробно описьваются в международной заявке 92/15683. Для секреции зсЕм425апІх-фрагмента в периплазме М-конец Мун.-домена подвергают слиянию с сигнальной « последовательностью реіЇВ. Связьвающий сайт Т7910-рибосом (Шайн-Дальгарно) с помощью методики полимеразноцепьсвой реакции (ПЦР) клонируют в Храї- и 5йІ- местах расщепления рЕСІ (Зіійтацег и др., но) с 1995). Готовьій полигенньій зкспрессирующий кластер зсЕм425апІх клонируют между местами расщепления Хпаї "» и Ніпаїї. В результате получают вектор зкспрессии рНКК согласно фиг.2. " Пример 2 Составьі сред для предварительньх культур в колбах Зрленмейера, основная культура в реакторе типа резервуара, снабженного мешалкой. (Віовіаї ЕЮО10; В. Вгацп; Віоїесі Іпіегпайопа!; Меїізипдеп,

ФРГ),О а также средь; для подпитки Е51, Е52 и Е53 представлень в таблице 1. Основная культуральная среда

Ме (вл) модифицирована по сравнению со средой, описанной Кіезепрега и др., 1991 (см. вьіше). Для того, чтобь - предотвратить осаждения, составнье части добавляют в указанной последовательности согласно таблице 1.

Глюкозу и сульфат магния добавляют в виде отдельно автоклавированньїх растворов. Реактор функционирует ші при температуре 26"С, давлений 0,15МПа, рН-значенимй 6,8 и средней скорости азрации ТОл/мин. Для б 20 установления рН-значения используют 2595-ньій водньій раствор аммиака. Аммиак и Осоїць М1159 (Егадої!

ІпдивіпезспттіегвіоПйе (трН, Міїйеіт/кКийг, ФРГ) добавляют с помощью сенсорного контроля во время ши ферментации для регулирования значения рН, соответственно, в качестве пеногасителя. Е51 получают следующим образом: 750г глюкозьї и 22,2г МазО4х7Н»О раздельно растворяют в бООмл, соответственно, 50мл водьі. Растворьіь смешивают друг с другом после осуществленного автоклавирования. ЕЗ2 готовят путем 22 растворения 227г (МН 4)2НРО; и 169,5г (МН.)Н»РО) в воде при добавлениий бОмл 2595-ного раствора аммиака,

Ф! чтобьї перед автоклавированием установить рН-значение - 6,8. Е5ЗЗ получают из маточньїх (иИсходньх) растворов в следующей последовательности: 50мл гидратированного цитрата трехвалентного, железа (бг/л); о О,5мл НзВО» (30 г/л); О,5мл МпСіох4НьЬО (10г/л); О,5мл дигидрата зтилендиаминтетрауксуснойи кислоть! (84г/л);

О,Бмл СисСіох2НьЬО (15г/л); О,5мл Ма»МоОух2Н.О (25г/л); О,5мл СоСіоьх2НьЬО (25г/л) и 10мл 2п(СНЗСОС)»х2НьО 60 (дл).

Пример З

Несколько колоний из чашки Петри, вьіращенньїх на агаре средьі Луриа при 26"С, служат для пересева в 20мл жидкой средьї Луриа. После встряхивания в течение 5 часов (200 оборотов в минуту, 26"С) Імл переносят в 100мл средьї для предкультивирования в колбе емкостью 500мл и инкубируют далее. 10мл зтой предкультурь бо используют для пересева в 100мл новой средьй для предкультивирования. Таким образом получают 9 предкультур, которье используют все вместе для пересева в вл средьії для основного культивирования в ферментере с первоначальной оптической плотностью, составляющей при 55О0нм примерно 0,2.

Пример 4

Конструкция биореактора емкостью 10л с оснасткой и контрольньіми устройствами представлена на фиг.1.

Культивирование в масштабе ферментации в условиях вьісокой плотности клеток осуществляют с помощью цифрового измерительного и контрольного узла (ОС), мультиферментерноий контрольной системь! (МЕС5) и контрольного устройства для газового потока. Постоянно измеряют вьіделение диоксида углерода и кислорода.

После пересева сборник биопроб МХ-3 (Мем Вгипем/іск Зсіепійіс, УМацога, ОК) служит для отбора асептических 70 проб и позволяет проводить анализ данньїх в режиме с разделением времени (Умерь и др., Віогеспгпої.; 8, 926928 (1990)).

Контрольнье устройства поддерживают норму входящего газового потока 1Ол/мин,, рНзначение равньїм 6,8, температуру 26"С и давление 0,15МПа. Две контрольнье петли гарантируют азробнье условия роста при ро"значении 2095. Все важнье физические величиньі измеряют и регистрируют во время всего процесса 7/5 ферментации.

Во время порционной фазь! подпитки концентрация глюкозь! в культуре поддерживается равной 1,5г/л. Для зтой цели используют модифицированньій анализатор иньекционного ввода потока (анализатор РіІАвіаг 5020 с фотометром и детектирующим контрольньм узлом, Тесаїог АВ, Швеция). Детали зтой системь! и способ ее функционирования описьіваются в уровне техники (например, Рай и др., в Руководстве под ред. МипаскК А., Зспидегі К. "Применения компьютера в биотехнологии", ЕІвеміег Зсіепсе Ца., Оксфорд, 1995Г., с.611).

Плотность клеток рассчитьвшвают из измерения оптической плотности при 55О0нм. Плазмидную стабильность определяют согласно Раск и др., 1993 (см. вьіше).

Пример 5

Количественное определение синтезированньїх миниантител осуществляют по методу РаскК и др., 1993 (см. сч ов ВьіШше). Количество способньх ок функционированию о мипиантител определяют путем твердофазного иммуноферментного анализа, общее количество миниантител определяют путем злектрофореза в 1296-ном і) полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия по Лзммли (1970) путем сканирования геля і

Для твердофазного иммуноферментного анализа титрационнье микроплатьї покрьївают человеческим рецептором зпидермального фактора роста (например, известного из международной заявки 92/15683). Ге Связаннье миниантитела детектируют с помощью кроличьей сьіворотки против зсгм425 и коньюгированного с козьей пероксидазой противокроличьего иммуноглобулина (даскгоп Іттипогезеагсі Іпс., США). Вьїход активньх ісе) миниантител рассчитьвают из рядов разбавления очищенньїх миниантител. При контроле установлено, что о кроличья сьворотка против зсЕм425 не дает никакой фиксируемой перекрестной реакции с другими компонентами не содержащего плазмиду сьрого зкстракта Е. сої БЕМ308. Далее, добавление зтого сірого (787 з5 Зкстракта к ряду разбавления такого же антитела в очищенной форме не оказьівает никакого воздействия на «о сигнальі при твердофазном иммуноферментном анализе. Для определения общего количества миниантител фотометрически детектируют гели, окрашеннье кумасси-бриллиантовьім синим, и концентрацию миниантител рассчитьввают из ряда разбавления очищенного миниантитела, отделенного в том же самом геле. В качестве контроля служит аналогичная смесь, в которой используют клетки-хозяева Е. соїї, не продуцирующие никаких « мМиниантител. шщ с з»

Claims (20)

Формула винаходу

1. Способ получения чужеродного протеина в клетках Е. соїї, которне трансформированьї с помощью ФО плазмидьі, несущей чужеродньій ген с индуцируемьім промотором путем ферментации вьісокой плотности клеток через порционную стадию и стадию порционной подпитки без какого-либо ограничения роста за счет - субстратов или метаболических побочньїх продуктов, и вьіделения и очистки зкспрессируемого протеина из о культуральной средь, причем концентрацию субстратов в порционной фазе подпитки регулируют и/или Контролируют с помощью непрерьвно действующей автоматической или полуавтоматической системь! анализа (22) и добавления, отличающийся тем, что в порционной фазе подпитки (ї) концентрацию источника углерода в Ф среде поддерживают постоянной в диапазоне от 0,1 г/л до 25 г/л при сохранении нелимитированного роста клеток (д «діях ); (ії) продуцирование чужеродного протеина начинают в указанной порционной фазе подпитки при плотности клеток от 10 до 80 г/л путем индукции промотора; и (ії) после осуществленной индукции синтеза продукта непрерьвно добавляют источники азота и фосфата, а также соли микрозлементов, причем (ім) в о течение всей порционной фазьі подпитки путем соответствующего введения кислорода в ферментационньй бульон величину парциального давления кислорода рО»о устанавливают между 5 и 2596. їмо)

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию источника углерода во время порционной фазь! подпитки поддерживают постоянной в диапазоне от 1 до З г/л. 60

3. Способ по пп. 1 или 2, отличающийся тем, что азот, фосфат и микрозлементь! добавляют при плотности клеток 50-80 г/л.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что плотность клеток согласно фазе (ії) по п. 1 составляет 20-60 г/л.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отгличающийся тем, что в порционной фазе подпитки достигают плотностей 65 клеток между 100 и 150 г/л.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что используют вектор зкспрессии, включающий кассету зкспрессии, которая содержит чужеродньій ген, фланкированньй двумя терминаторньіми последовательностями.

7. Способ по п. б, отличающийся тем, что используемьій вектор зкспрессиий дополнительно содержит буицидную систему.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что используемьй вектор експрессиий дополнительно содержит покК-зоК-суицидную систему.

9. Способ по любому из пп. 6-8, отличающийся тем, что используют чужеродньй ген, кодирующий фрагмент антитела. 70

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что используют чужеродньй ген, кодирующий фрагмент мини-антитела.

11. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что используют вектор зкспрессии по одному из пп. 14-19,

12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что используют штамм Е. соїї, которьій в течение 7/5 фазьі ферментации аккумулирует не более чем 5 г/л ацетата в культуральной среде.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что используют Е. соїї штамм КУЗ308 (АТС 31608).

14. Вектор зкспрессии Е. соїї, пригодньій для зкспрессиий чужеродньїх протеинов в условиях ферментации вьісокой плотности клеток, отличающийся тем, что он обладает следующими признаками: () терминаторная последовательность в проксимальном положении (ирзігеат) и терминаторная 2о последовательность в дистальном положений (дом/пвігеат) ; (і) система Іас-промотор/оператор (ії) последовательность Шайн-Дальгарно 17910; (ім) сигнальная последовательность ре1В или отрА; (у) последовательность чужеродного гена. с

15. Вектор по п. 14, отличающийся тем, что он дополнительно содержит суицидную систему.

16. Вектор по п. 15, отличающийся тем, что он дополнительно содержит последовательность і) покК-зок-суицидной системьі.

17. Вектор по любому из пп. 14-46, отличающийся тем, что терминаторной последовательностью в проксимальном положений (ирзігеат) является Ї нр и терминаторной последовательностью в дистальном (о Зо положений (дом/пзігеат) является і, рр.

18. Вектор по любому из пп. 14-17, отличающийся тем, что чужеродньїй ген содержит последовательность, со кодирующую Му- и М, -цепь мини-антитела. о

19. Вектор зкспрессии, обозначаемьй как рНКК, согласно схеме конструкции фиг.2.

20. Трансформированньй Е. соїі-хозяин КМЗО8ІрРНКК) для зкспрессии, полученньій путем трансформации -- КМЗ308 (АТСС 31608) с помощью вектора зкспрессии по п. 17. «о

- . и? (о) - («в) (о) 4) іме) 60 б5