HU227945B1 - Process for the preparation of recombinant proteins in e.coli by high cell density fermentation - Google Patents
Process for the preparation of recombinant proteins in e.coli by high cell density fermentation Download PDFInfo
- Publication number
- HU227945B1 HU227945B1 HU0000317A HUP0000317A HU227945B1 HU 227945 B1 HU227945 B1 HU 227945B1 HU 0000317 A HU0000317 A HU 0000317A HU P0000317 A HUP0000317 A HU P0000317A HU 227945 B1 HU227945 B1 HU 227945B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cell
- coli
- phase
- expression vector
- expression
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims description 19
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 9
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 claims 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 claims 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 claims 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 21
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 21
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 3
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- -1 isopropylthiogalactopyranosyl Chemical group 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001235572 Balantioides coli Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 108091033454 Hok/sok system Proteins 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000087826 Orapa Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000387 ammonium dihydrogen phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 101150090396 aphA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004883 computer application Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Chemical class 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 101150056961 linX gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000029305 taxis Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Eljárás rekombináns fehérjék előállítására &„ coli-bán nagy sejtsűrűségű fermentálás útján
A találmány tárgyát egy szakaszos betáplálása fermentációs eljárás képezi, amellyel ~ speciális· E, coli gazdasejt/ vektor-rendszerek alkalmazásával - hatékonyan állíthatók elő rekombináns fehérjék, előnyösen rekombináns antitest-molekulák, előnyösen antitest-fragmensek, például míniantátestek...
A találmány szerinti eljárással térben és időben gazdaságosan, magas hozammal állíthatók elő natív, rekombináns fehérjék.
A találmány szerinti körülmények között az £. coli sejteket nagyon nagy sejtsürűségíg tenyészthetjük maximális specifikus sejttömegnövekedési sebességgel. Miután a termék rekombináns módon való keletkezését beindítjuk, csupán a keletkező termék gyakorol gátló hatást a növekedésre; szubsztrátok vagy anyagcsere-melléktermékek nem korlátozzák a növekedést. Ezen a módon az új, nagy stabilitású expresszié» vektorok segítségével, amelyeket speciálisan erre a célra tettünk alkalmassá, lehetséges rekombináns, ktaszámunk: S7S04-903/SG nagy biológiai aktivitású fehérjék/ előnyösen antitestfragmensek, térbeli és időbeli, értelemben véve magas hozamát elérni.
Az E, coli sejtek nagy sej ^sűrűségig történő tenyésztése lényegi előfeltétele rekombináns fehérjék hatékony termelésének. A technika állása szerint az alábbi tenyészetek felelnek meg ennek a célnak. Az első szakasznak megfelelő fázisban végbemenő· nem korlátozott növekedés (μ - μ®^) után az ezt követő ún. betáplálás! szakasznak megfelelő fázisban kimért mennyiségű szénforrást (glükózt vagy glicerint) adnak a tenyészethez szokványos módon, azonban olyan mértékben korlátozott mennyiségben, hogy a növekedést gátló melléktermékek, például az acetát keletkezését sikerüljék. Ennek az a következménye, hogy a növekedés csupán a •sznbsztrátmennyiség által korlátozott mértékben (μ < folytatódik', egészen, addig, amíg a tenyészet nagy sejt sűrűséget nem ér el [Riesenberg és mtsai., J. Biotechnoi., 2.0, 17-28, (1991); Strardberg és mtsai., FEMS Microbiol. Rév.,
14, 53-56 (1994); Kort és mtsai., J. Biotechnoi. 39, 53-65 (1995); EP-B-0 511 226 számú európai közzétételi irat]. A csökkent sejtszaporodás sebességgel végbemenő sejttömeg növekedés természetesen hosszú fermentációs időket és következésképpen térbeli és időbeli értelemben alacsonyabb hozamokat eredményez. Az azonnali, felhasználásnak köszönhetően a szénforrás koncentrációja a tápoldatban az ilyen fermentálások során gyakorlatilag nulla. A szübsztrátmennyiség által korlátozott körülmények nem változnak meg azáltal, hogy a rekombináns termék termelődését beindítják.
φ φ*
Már eddig is ismertek voltak .£,. coli sejtek felhasználásán alapuló tápanyag-betápláiásos szakaszos üzemű tenyészetek/ amelyekben a szénforrást szakaszosan pótolták, viszonylag- nagy időközönként és viszonylag nagy mennyiségben, általában a p03-érték emelkedését alkalmazva a szubsztrát-kimerülés indikátoraként a következő adag szénforrás hozzáadásának megindítása céljából, [például Sppstein és mtsai., Eiotechnol. 7, 1178-1181 (1989)1 . Ez az eljárás egyben azzal jár, hogy gyakran keli váltani a viszonylag hosszú távon, szubsztrátfelesieget biztosító körülmények és a szubsztrátmennyiség által korlátot jelentő .körülmények között, ami következésképpen az anyagoserefolyamatok kiegyensúlyozatlanságát foglalja magában.
Az alábbiakban olyan, tápanyagpőtlásos szakaszos üzemű tenyészeteket ismertetünk/ amelyekben a sejtek a specifikus sejtszaporodásí sebesség maximumával szaporodhatnék Φ ::: fe) s tápanyagpőtlásos szakaszban. Azok a tápanyagpótlásos, szakaszos üzemű tenyészetek, amelyekben viszonylag hosszú időközönként nagy mennyiségű szénforrást adnak a tenyészethez - off-lína mérések alapján - a szubsztrátmennyiség által, felállított korlátozást elkerülendő·, kísérletileg munkaigényesek és meg van az a hátrányuk, hogy a szénforrás koncentrációja folyamatosan, változik a fermentálás egész ideje alatt [Pack és mtsai., Biotechnoi., 11, 1271-1277, (1993) ; Hahm és mtsai.., Appl. Microbiol. Biotechnol, 42, 100-107 (1994)1.
Olyan, tápanyagpőtlásos, szakaszos üzemű tenyészeteket
Is leírtak, amelyekben a szénforrás koncentrációját “online* mérik., és úgy szabályozzák, hogy a korlátozást elkerüljék. Ezeket a tenyészeteket azonban - különösen a nagy sejtsűrüségü szakaszban - az alábbiakban ismertetett hátrányok jellemzik. Legújabban leírtak egy autokiávozható giükóz-bioszenzort mikröbisiis fermentálásra való alkalmazásra kevertetett tartálya £ermentorokban [Phelps M.R. és rntsai., S-io technoi. Bioeng,48, 514-524 (1995)]. Ezt a bioszenzort alkalmazzák E. coli sejtek, tenyésztése során is. Ez az in siti; szenzor körülbelül 2 perces reakcióidővel a tenyészőIdát állapotát állandó értéken tartja. A glükózszenzor által adott jel azonban többek között a pH--tói és a pCá-től Is függ, A szenzort mindeddig nem vizsgálták a nagy sejtsűrüségü tartományban (x > 80 g/i) . Tapasztalatból tudható, hogy EL coli sejtek alkalmazása esetén az ín situ próbákkal követett sejtt-ö-megnöve kedés további hibás értékekhez vezethet nagyon nagy sejtsörűségeknél. Ezen kívül nem lehetséges a szenzort pontosan újrakalibráini az éppen folyó fermentáció közben. Más eljárások is léteznek, amelyek nem in situ szenzort alkalmazó elérésen alapulnak. Ilyen például a szánforrások mennyiségének meghatározására alkalmas áramlási injektálás-ős analízis (”flow injectíon analyser”, FIA), vagy az on line HPLC, amelyek alkalmazása során a fermentorban levő tápoidatből féliolyamatosan mintát vesznek és azt szűréssel vagy mikrocentrifügálá.ssa.1 sejtmentessé teszik (Kleman és rntsai., &ppl. Snviron, Microbícl. 57, 910-917 és 918-923(1991;; furnér és rntsai., Siotechnoi. Bioeng, 44, 819-829 (1994)1. A jóslás! és viszszacsatolással szabályozó algoritmusok csökkentették a glüközkoncentráció fluktuációit a sejttömegnovekedés során egészen x ~ 5(5 g/1 koncentrációig '(Kleman és. rntsai., Appl.
*
Envíron. Microbiol. 57, 910-917 ¢1991)1. Nagyon nagy sejtsűrűségeknél ίkörülbelül 80 g/i-töl 150 g/i-igi egyre inkább nehézzé és időigényessé válik a sejtek elválasztása a tápoldat tői, így az időbeli késés {'reakcióidő) a fementorban levő pillanatnyi giükózkoncentráeíő Meghatározása tekintetében szintén nő biomassza-függő Módon, és Megnehezíti vagy lehetetlenné teszi az állandó glükőzszint fenntartását. Ezzel szemben a giükózkoncentráeíő mérhető egy olyan módszerrel is. amelynél a reakcióidő állandó és nem nagy, és ahol az alkalmazott berendezés nem teszi szükségessé a sejtek elválasztását [Pfa.ff és mtsai. Proceedings of the 6'’fi International Conference and Computer Appl. in Biotechnol.. Garmisch-Partenkirchen, Németország, 8-11 (1995)1· Pfaff és munkatársainak módszere egy enzimatikus és amperometriás glükóz-szenzorral felszerelt FIA-készüléket alkalmaznak, ás a mérést a mintavevőhsly közvetlen közelében végzik, miután a tenyészetet meghígították sejtszaporodást gátló anyaggal.
Az aerőb tenyésztés során, amennyiben az F. coli sejteket az adagolást vezérlő rendszer nem kényszeríti arra, hogy a növekedést szubsztrátmennyiség által korlátozott módon végezzék- a sejtek, növekvő mértékben, anyagcsere melléktermékként rendszerint ecetsavat termelnek tRiesanberg: Curr. Opinion Biotechnol., 2, 380-384 {1921)] . Az ecetsav felhalmozódik a tápoldatban és - amennyiben viszonylag nagy mennyiségben van jelen - sejfszaporodást gátló hatást fejt ki [Pan és mtsai., Biotechnol, Lett., 2, 89-94 (1987)], Smmiatt csupán nem régen vált lehetségessé olyan - speciális Bt coli törzseket felhasználó - tápanyagpótiásos, sza♦ *'** *«» Φ * V ♦ * « φ « »
Φ* ΧΦΦ Φ» > ΦΦ kaszoss üzemű, nagy se j tsűrűségig szaporodó n. coli tenyészetek megvalósítása, -amely tenyészetekben az alkalmazott törzsek,- specifikus genetikai módosítások következtében, -csökkentett mértékben halmoznak, fel ecetsavat, miközben az •ezzel járó egyéb hátrányokat jobban tolerálják. Az £, coll K12 leszármazottai között van egy fo-sz-fotranszacetilázban 'hiányos mutáns (Bauer és mtsai., Appl. Environ, Microbiol. 56, 1236-1302 .(199-0; Hahm és mtsai.,- Appl. Miorobioi.
Biotechnoi. 42, 100-107 (1994}]. Ennek a mutánsnak a szaporodása .azonban glükózt és ásványi, sókat tartalmazó tápközegben -erősen lecsökkent mértékű. Phelps és munkatársai (lásd fent} az E\ coll TOPB5-törzset alkalmazták gazdatörzsként egy, nem a szufosztrstmennyisé-g által korlátozott tenyészet megvalósítására x - 85 g/1. koncentrációjú biomassza elérése mellett. Sz az £. coli törzs azonban,- amelyik egyértelműen és kimondottan nem halmoz föl ecet savat-, nem K12-eredetü törzs. Az coli Tö'PPS hemolizint termel, ebből kifolyólag patogén törzs, amely biztonsági okokból nem alkalmazható az Ipar területén, rekombináns DNStermékek termelésére szánt gazdasejtként való alkalmazásra.
A köztitermékek anyagcseréjének specifikus átalakítása útján az ecetsav felhalmozódásának csökkenését érték el azáltal, hogy £. coli sejteket egy, aoetolaktát-szintázt (ALS) kódoló gént tartalmazó plazmáddal transzformálták í-San és mtsai., Ann.h.Y.Arad.Sci., 721, 257-267 (1994)j. Ennek az eljárásnak azonban megvan az a hátránya, hogy a nagy sejtsűrűség körülményei közepette általában instabilitások lépnek fel, amikor egy ALS-t kódoló plazmid egy második, a. ”termelő gént hordozó plazmáddal kombinálva kerül alkalma♦ * ♦-»'♦*· »»«* «00Μ ♦ * * * 0 0 * * *· X * « « · 0 χ 0 * » · X 0 0 0
0 0 » X XX 0· 0 0 zásra. A rekombináns térnék keletkezésének hatékonysága gyakran csökken a plazmidinstabiiitás következtében, amely a nagyon nagy sejtsűrűségű tenyészetek esetében különösen Kiégne ve kedett mértékben megy végbe.
Antitestek és .antitestek fra-giaensei, például a Fan’, Fíab1};·, miniantitestek vagy egyláncú Fv'-k egyre növekvő fontosságot nyernek az orvosi és a biotechnológiai területeken. Mini antitest alatt a leírás szerint i értelemben egy kétértékű és két spéciiitással .rendelkező egyláncú Ev~ fragmenst értünk, amelyek egy ál-csuklón ipsendonínge”) keresztül kapcsolódnak. Ebben az Összefüggésben fontos lehet - például a rákterápiában - hogy nagy mennyiségű antitesthez (körülbelül 1 g/adag) juthassunk hozzá. Ebben a tekintetben egyértékü antitast-fragmensek vagy ezen fragmensek fúziós fehérjéi, továbbá multimer vagy ©.ulti specifikus változatai különösen könnyen és minden igényt kielégítően áilithatók elő F, coii-ban, Ezek a fragmensek vagy variánsaik kis méretűek, amellett azonban nagymértékű specifikus kötődési képességgel rendelkeznek (például Plückthun A., Immunoi. Rév. 130151-183' {1992} ; Fach és mtsai. J. Mól. Bioi. 246, 28-34 (1.935):] . a fehérjéknek és antitesteknek azonban - biológiai és funkcionális aktivitásuk érdekében - mindenekelőtt megfelelően kell telte heredni ük ő'roldirg’ő . árikor a keletkezett antífestfragmensek sejtenként! hozamát tartjuk szem előtt, a sejtsürüséggel kapcsolatban erre a problémára is figyelmet kell fordítanunk. Továbbá, az antitest primer szekvenciájának is jelentősége van az in vitro hozam és az in vivő feltekeredés meghatározásában [Knappik A. és Plückthun A., ♦ **» Ο* φ* « « * φ*
Protein Engin, 8, 81 ---89 (.19-95) } . A vázolt probléma következtében sz Fab-fragmensek például oldhatatlan, a citoplazmában vagy a periplazmában található aggregátumokként expresszáiödnak, és űjrafelfeketedésük ( refoiding”) in vitro valósítható meg. így, alacsony sejtsürűségnél körülbelül 0,11 g/l hozamok érhetők el [Gondra és mtsai., J. Bioi.. Chem. 265, 2282-2295 (1290)), and. közepes sejt sűrűségnél körülbelül 1-2 g/l-ig növelhető, ekkor azonban az antitestek oldhatatlan formában vannak jelen [Shibui és· mtsai., App i . Mlorobiol. Biotechnoi. 38, 770-775 (1593)]. Biológiailag aktív formában kétértékű miniantitesteket is előállíthatunk E. cöüi-b-an körülbelül 0,2 g/l hozammal [Pack és mtsai.. Biotechnoi, 11, 1271-1277 (1993)). Átlagosan az ilyen hozamban keletkezett fehérjetermékek megfelelő térszerkezete (feltekert formája) 5-45%-ban állítható helyre.
Az ismert, E. ooií-t alkalmazó rendszerekben az idegen fehérje termelődését - a megfelelő sejtsűrűségek elérése után- megfelelő módon beindítják az expresszíós rendszer szempontjából alkalmas szabályozható promőterrendszer segítségével, A leírásban példaképpen a kővetkező promöterrendszereket említjük meg: (1) az ara-BAD-promóter és az AraC-reptesszor (ez: utóbbi arabinózzal indukálható) együttesét (például Better és mtsai., Proc, Natl. Acad. Bei. (USA), 90, 457-461 (1993)), (ii) a fosztátmennyíség csökkentésével indukálható phoA-promötert [például Carter és mtsai., Biotechnoi. 19, 163-167 (1992)) és az (Ili) IPTGvei indukálható lac-promóterrendszert [Paok és mtsai., mint fent (1993)) , Noha általános szabályként elmondhatjuk, hogy a iac-rendszer jó expressziét biztosit, kétségtelen, hátrányai azonban, hogy a promóter ináukálása előtt is nem kívánatos alapszintű expresszié .figyelhető meg, továbbá, hogy az IPTG-vel való indukálés után plazmádinstabiiitás jelentkezik .
A. találmány előnyös megvalósítási módja szerint, egy speciális vektort (pBKK.) tárunk fel, amely az egér eredetű vagy humanizált antitest, a Mab-425 fragmenseit kódoló szekvenciákat tartalmaz idegen génként. Az Hab-425 (A?CC KB •3629) egy egér eredetű monokionáiis antitest, amelyet az ismert emberi A432~ráksejtvonalbéi izoláltak (ATCC CRL 1555), és az emberi epidermálls növekedési faktor receptorának {SGFR, egy körülbelül 170 ko méretű giükoprotein) epitopjához kötődik, eközben gátolja a természetes ligandum, az EGF-kötodését. Kimutatták, hogy az Mah~4.25~nek citotoxikus hatása van a tumor-sejtekre, illetve képes gátolni ezen sejtek növekedését IRodeck és mtsai., Cancer Kés. 47, 3632 Í1287;J, A KO 92/I56S3 számú nemzetközi közzétételi irat az bab 425 antitest humanizált és kimére formáit tárja föl, továbbá azok könnyű és nehéz láncainak DNSés aminosav-szekvenciáit,
A találmány szerinti megoldás kidolgozásával célunk az volt, hogy megvalósítsunk egy, fehérjék - előnyösen antitest!ragmensek - előállítására szolgáló eljárást rekombináns F. coli sejtekben, nagy sejtsürűségű körülmények között ÓHCDC = ”high cell density culturs, nagy sejtsűrűségű tenyészet! térben és időben magas hozammal anélkül, hogy a szubsztrátok és a metabolitok jelentősen gátolnák a sejtek szaporodását, továbbá jelentős plazmád lustabili tás- és plazmidvesztés: nélkül, miközben az eljárással biztosítjuk, hogy az expresszáit fehérje nagy mértékben biológiailag aktív es hatásos legyen (kötődésre képes legyen és megfelelő legyen a térszerkezete).
A találmány szerinti eljárás egy többlépcsős, szakaszos üzemű eljárás, amelynek fő jelentősége abban rejlik, hogy a sejtek a teljes tenyésztési szakasz során, maximális sebességgel képesek növekedni (μ = μ^,ό , így, a találmány szerinti eljárás alkalmazásával a tenyésztés- végére 100-150 g/'l sejtsürüségek is elérhetők (a sejtek szárított tömegét adtak meg)„ Továbbá, az eeetsav felhalmozódása nem gátolja jelentős mértékben a növekedést, mivel, meglepő módon, a kiválasztott körülmények között ez a felhalmozódás nem kifejezetten jelentős mértékű, főként akkor nem, amikor előnyösen - olyan £. coli törzseket alkalmazunk, amelyek csupán csökkentett mennyiségű eeetsav termelésére hajlamosak a fermentáció során. Ezt - más intézkedések mellett mindenekelőtt azzal érjük el, hogy a betáplálásos (táp~ anyagpötlássa! jellemezhető} szakasznak megfelelő fázisban, amely az első szakasznak megfelelő fázis után következik, a szénforrás koncentrációját a tápközegben egy meghatározott tartományban állandó szinten tartjuk, miközben a sejtek korlátozás nélküli növekedését tartjuk fent. Az alkalmazott expressziős vektor megfelelő kialakításával, .a- fehérje nem kívánt, alapszintű expressziőja (amely a fehérjetermelés szabályozható promöterrendazerrel történő beindítása előtt szokott fellépni) gyakorlatilag szintén kiküszöbölhető, csakúgy, mint a néha szintén jelentőssé váló piazaíáveaztés, amely, mint azt mér fent jeleztük, szokványosán *««« Φ«χ« «Φ χχχχ ΦΦ * · X Φ * $ ♦ ΦΦ* ««» χ Φφφ * χ Φ Φ χ » «
ΦΦ X** ΦΦ Φ ** megfigyelhető lac-promőter'rendszert vagy más erős promótert alkalmazó expressziős rendszert használva a fehérjetermelést ez ,
Átlagosan 3-5 g/1 fehérjehozamok érhetők el körülbelül 25-35 órás tenyésztési idő után. Áz antitest-fragmensek esetében - előnyösen miniantitestekében, amelyek különösen érzékenyek a feltekeredés körülményeire - a .szintetizált anyagnak körülbelül 50%-a biológiailag aktív és helyesen feltekere.dett.
A találmány tárgyát képezi ennek megfelelően egy eljárás idegen fehérje előállítására az idegen gént és egy indukálható promotert hordozó plazmáddal transzformált £.. coli sejtekben, nagy sejt sűrűségű tenyésztés útján, első szakasznak megfelelő és betáplálásos szakasznak megfelelő fázisokat alkalmazva, anélkül, hogy a sejttömegnövekedést szuhsztrátük vagy anyagcsere-melléktermékek gátolnák, továbbá az expresszáit fehérje a tápközegből való izoláláséval és kitisztításával, és amely során a szubsztxátok koncentrációját a betáplálásos szakasznak megfelelő fázisban egy folyamatos, automata vagy félautomata elemző és hozzáadó rendszer alkalmazásával szabályozunk, amelyet az jellemez, hogy (i; a szénforrás koncentrációd át a tápközegben 0,1 g/i és 25 g/1 közötti koncemtrációtartamányban állandó szinten tartjuk, eközben a sejtek korlátozás nélküli szaporodását tartva fent (μ = μ«;ώΧ) , iii? az idegen fehérje termelését a betáplálásos szakasznak megfelelő fázisban indítjuk he a promöter indukélásávul 10 g/i és 80 g/i közötti sejtsürüségnél, (iii) a termék szintézisének beindítása után folyamatosan - a sejtek számára hasznosítható - nitro•ϊ ϊ»”
- 12“ gént. és foszfátot, továbbá nyoméiemsőkat táplálunk vissza a rendszerbe, miközben (iv;· a pO^-érteket 5% ás 25% között tartjuk a teljes betápiálásos szakasznak megfelelő fázisban oxigént juttatva be a tápoldatba, alkalmas módon. A szénforrás koncentrációjának a találmány szerinti megoldás szerint megkívánt értékei - a betápiálásos szakasznak megfelelő fázisban - a 0,1 g/i és 25 g/i közötti tartományban vannak, előnyö-sen azonban a 0,5 g/1 és 15 g/1 közötti tartományban, előnyösebben az 1,0 és 5 g/i közötti, vagy az 1,0 g/i és 3 g/i közötti tartományban. A szénforrás koncentrációja különösen előnyösen 1,5· g/i. Előnyösen alkalmazható szénforrások a glükóz vagy a glicerin, vagy ezen két vegyület keverékei. A találmány szerinti megoldás során a szénforrást folyamatos módon P’on line) adtuk hozzá a tenyészethez, automata vagy félautomata elemző és hozzáadó rendszert alkalmazva. Előnyösen egy *on line' áramlási injektálásom analizáló rendszert FIA” alkalmazunk.
A sejtek számára hasznosítható nitrogén (előnyösen ammónia vagy ammóniumsö formájában), foszfát (például diammóniumhídrogénfoszfát vagy ammóniumdihídrogénfos2fát), és nyomelemek (például bőr-, mangán-, réz-, moiibdén-, kobalt-, vas- vagy olnksók, amelyeknek természetesen a tápközegben oldhatónak keli lenniük) tápanyagként való bejuttatását a betápiálásos szakasznak megfelelő fázisban végezzük, amely az 1, szakasznak megfelelő fázis után következik, előnyösen azután, hogy a fehérfeszíntézist a szabályozható promóter segítségével beindítottuk 50 g/i és 80 g/1 közötti sejtsürűségnél (száraz sejttömeggel számolva) , '♦**'* φφφ* φφ φφφ* *β * * φ * φ φ * »** «φφ « φφφ * * Φ X Φ Φ φ
XX φφ« φφ φ Φφ előnyösen 70 g/1 sejtsürüségnél, 100-150 g/1, előnyösen 14 0 g/I Összsejttömeg-növekedési sebességnél. ísic/i.
A találmány szerinti megoldás szerint a fehérjeszintézist a szabályozható promotérrendszer aktiválásával indítjuk be 10 g/1 és 80 g/1 közötti sejtsürüségnél, előnyösen 20 és 60 g/1 közötti sejtsűrűségnél, különösen előnyösen pedig 40 g/i és 60 g/l közötti sejtsűrűségnél.
A betáplálásos szakasznak xuegfelelö fázisban az oxigén parciális nyomását 5 és 251 között tartjuk, előnyösen 15% és 25% között, különösen előnyösen 20% értéken.
A találmány szerinti megoldás szerint a fermentációs tápközeg pH-jának a tenyésztés teljes ideje alatt pH - 6,5 és pH - 7,0 közé beállitottnak kell lennie, előnyösen pH ~ 6,7 és pH ~ 6,9 közé beáll Írottnak, különösen előnyösen pH ~ 6,8.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy, a fentinek megfelelő eljárás, amelyet zz jellemez, hogy egy olyan expressziós vektort alkalmazunk, amely egy, az idegen gént tartalmazó expressziős kazettát és azt szegélyező régióként két terminátor szekvenciát hordoz. Esek a terminátorszekvenciák, előnyösen a géntől S’-irányban elhelyezkedő, eredményesen megakadályozzák a fehérje expressziojának promótérrendszer által történő bekapcsolása előtti fehérjeexpressziét. A t^-tsrminátor előnyösen alkalmazható (Nohno HF és mtsai., 0. Bscferiol. 170, 4097-4102 /1088}) de más, ismert terminátorszekvenciákat is használhatunk.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan eljárás is, amely során egy öngyilkos rendszert is tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk. Az öngyilkos rendszer egy, ««X* X» ««♦* «X
X Φ « * » «
Χ· « *-♦·*
X « Φ Φ » * « *9 ίΧΦ «« V <« a sejt számára toxikus fehérjét termel, amennyiben a piazmrd nincs jelen a sejtben. Ilyen öngyilkos rendszerek ismertek. & technika állása szerint. Egy, a találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazható öngyilkos rendszer a hók •••sok-rendszer [például Gsrdes K., Biotechnoi, t, 14021405 (1988)J . Így tehát annak érdekében, hogy az eljárás során hatékonyan keletkezhessenek rekombínáns fehérjék (előnyösen antitest-molekulák), hogy a nagy sejtsűrűségű tartományban a gazdasejt/vektor-randszert nagy plasmidstsbiiitás, a rekombínáns termék alacsony alapexpresszíős szintje és nagy mennyiségű termék keletkezése jellemezzék. Ebben az összefüggésben az öngyilkos rendszerek, terminátor régiókkal szegélyezett rekombínáns expresszi-ős egységekkel kombina1va, ve kt or spéci f i kus ak.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy, a fentinek megfelelő eljárás, amelyet az jellemez., hogy egy, antitestfragmenst - előnyösen egy miniantitestet - kódoló idegen gént alkalmazunk.
A találmány tárgyát képszí továbbá egy eljárás, amely során a fentieken kívül az alábbiakban ismertetett tulajdonságokkal ís rendelkező- expressziős vektorokat alkalmazunk .
Elvileg, az ismert és a rekombináns technológia és ipari méretekben folyó termelés szempontjából megfelelő coli törzs alkalmazható a találmány szerinti megoldásban. Azok a törzsek alkalmazhatok azonban előnyösen, amelyek viszonylag kevés ecetsavat halmoznak föl szaporodásuk során, még akkor is·, amikor a sejtsürüség nagy. Azok a törzsek, amelyek kevesebb·, mint 5 g/1 éeétsavmennyiségei halmoznak föl, különösen előnyösek. Meglepő módon, az ecetsav .felhalmozödását különösen alacsony szinten lehet tartani a találmány szerinti eljárás során alkalmazott körülmények megfelelő megválasztásával. A jól ismert és kereskedelmi forgalomban hozzáférhető 1. coli törzs, az RV30S (ATCC 31608}, valamint -ugyanilyen hatású változatai különösen előnyösen alkalmazhatók abban a tekintetben.
A találmány tárgyát képezi tehát egy, megfelelő előnyös eljárás, amely során egy olyan E. coli törzset alkalmazunk., amely a fermentáció során a tápközegben kevesebb, mint 5 g/.l ec-etsav felhalmozódását eredményezi.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy £ coli expressziós vektor, amely alkalmas nagy sejtsürűségű fermentációs körülmények között is idegen fehérjék exprssszálására, és amelynek az alábbi jellemzői vannak:
íi) egy S'-végi terminátorszekvsncia és egy 3’-végi te rm i ná torsra k ve ne i a , (ii} lao-promóter- és operátorrendszer, _ iáUii) sgy T/glG Sh.íne Délgarno-szekvencia, íiv) pelB~ vagy orapA-szignáiszekvsncia, ív) az idegen gén szekvenciája, továbbá egy előnyös megvalósítási mód -szerint, egy -öngyilkos rendszer, előnyösebben a hók-sok öngyilkos rendszer.
A találmány szerinti megoldásban a promóterrendszert más, megfelelő rendszerekkel is helyettesíthetjük, például azokkal, amelyekre fent hivatkoztunk.. Hasonlóképpen, más szignálszekvenciák és szabályozószekvenciák is, amelyek hatása megegyezik a fentiekkel, a. találmány szerinti megoldás részét képezik.
:**«♦· ΦΦΦ* Φφ »»*«- ΦΦ * * « «.* Φ » »** Χ*Φ χ *♦« * ♦ » χ φ * Φ ** ΦΦΧ ν* φ Kfc
Végül, a találmány tárgyát képezi a pHKK expressziós vektor is (2. ábra}, amelyet megalkotásának folyamatával definiálunk- és amely egy,- az Kan~á2S~ből származó miniantitesfet kódoló szekvenciát tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá egy speciális, rekombináns £. coli gazdasejt, az RV308{pHKK.) is. A fenti plazmid és gazöatörzs a találmány előnyös megvalósítási módjai.
Az alábbiakban megadjuk az ábrák rövid leírását:
1. ábra: nagy sejtsűrüség körülményei kozott fehérjék előállítására alkalmas bioreaktor kísérleti elrendezése. A rendszer mérőkészülékkel, kijelzőkészülékkel, -szabálya zó készülékkel és egy adagolóberendezéssel van felszerelve.
2. ábra: az optimalizált expressziős vektor, a pHKKvektor és a megalkotása során felhasznált alkotórészei. A vektor lényegében az önmagukban ismert pASK40~, a pAKlOOés a pKG10£2-vektorok egyes alkotórészeiből van összeállítva Λ
3. (a-d; ábra: rekombináns £, roll RV3-0S[pHKX] sejtek HCD-tenyészete: a biomassza, az ammóniából vagy ammóniámsöból származó nitrogén, a foszfát, az ecetsav mennyiségének, illetve a keverési sebességnek, a pCy--nek, az Ct-nek és a CCb-nsk (az eltávozó gázban mérve), a plazmádstabil!fásnak (a B-iaktamáz-pozitiv telepek százalékos arányában kifejezve; és a fehérjetermelödésnek (ebben az esetben: az scFv43Sdhlx)' az időbeli változása. Az első szakasznak megfelelő és a betápiálásos szakasznak megfelelő fázisokat 5 alfázzsra osztottuk fel. Az 'IPTG”-jelzésű nyilak a fehérjetermelés beindítását jelzik.
**** ff ff S ff «« fffffcff »* * ♦ ff ff * ff v ffffff ffffff φ »·**.
* ff ff * φ ff * #« ffffff ffff ff ff ff
A találmány szerinti eljárás során transzformált £. coli gazdasejteket alkalmazunk. A kiválasztott plazmidkonstrukciók az expresszáltatandó fehérje természetétől függnek. Az alább lakban ismertettük & plazmidkonstrukciók előnyös jellemzőit, A plazmídok megalkotásához és a gazdasejtek transzformálásához szükséges módszerek és eljárások mind ismertek, és szakember számára részletes kitanítást .nyújt a szakterület irodalma (például Samhrook és mtsai. ; W'A Láboratory Manual”, Cold S-p-ring Harbor (1989)}. Ezenfelül·,· az alkalmazott módszereket és eljárásokat a találmány egyes megvalósítási módjainak megfeleld példákban, is ismertetjük. A kiindulási plazmadók vagy azok részei vagy kereskedelmi forgalomban kaphatóak, vagy nehézség nélkül, standard módszerek alkalmazásával előállíthatcak ismert plazmád alkotási folyamatábrák alapján.
A transzformált E, roll sejtek találmány szerinti, tipikus fermentációja két. fázisa közül a korábbi, első szakasznak megfelelő fázis két alfáz.isra oszlik. Egy megfelelő előzetes tenyészettel való beoltást követően as I-aifázist egy késleltetési fázis Plag-phase’'; jellemzi, amelyben a sejtek alkalmazkodnak, ás szaporodási sebességük (μ) fokozatosan elérik a maxim.uti.o-t dr;s;.J . A II-alfázis során a sejtek tömege exponenciálisan nő (u ~ sebességgel. Miután a pö; iOOb-os telítettségről 5-15%-ra csökken, egy pOs szabályozó·· keverő készülék segítségévei a pO^-t beállítjuk, előnyösen 151 és 25% köze, előnyösen 20%-ra (3c ábra). Ezt a beállítást, 6-12 órával a fő tenyészet fermentációjának kezdete után célszerű elvégezni, oxigénben dúsított, levegő bejuttatásával. A giükő-zkoncentráció, amely kezdetben elő******* **** φ** «
** <?* « XX nyösen 20 és 3-5 g/1 között volt, a Il-alfázis végére lecsökken, ami egyben a betápiálásos szakasznak megfelelő fázist megelőző első szakasznak megfelelő fázis végét jelenti, Ebben az összefüggésben a glükőzkoncentráelő értéke semmilyen körülmények között sem eshet le 0,1 g/1 alá. Innentől ezt a glükóz megfelelő betáplálásával biztosítjuk ílil-alfásís, 3-a ábra, a betápiálásos szakasznak megfelelő fázis kezdete) „ A találmány szerinti megoldásban a. glükóz értékét állandóan 0,1 g/i és 25 g/1 között tartjuk, előnyösen azonban 1 g/1 és 3 g/1 között. Erre a célra például, FSl-tápközeget (1. táblázat) alkalmazhatunk. Mivel ez a glükózkoncentrá.oió-tartomány elegendően távol esik a glükóz in-értékétől (Bergter, ’úáachstum von Mikroorganismen kiad. Gustav Fisoher Varian, Jena, 41, oldal (1983)], a sejtek sebességgel folytatják a szaporodást. & találmány szerinti megoldásban a glüközkoncentráciöt egy automata vagy félautomata rendszer alkalmazásával követjük és szabályozzuk. Áramlási injektálásos analizáló rendszerek on line üzemmódban különösen előnyösen alkalmazhatóak. A teljesen manuális vagy a nagymértékben manuális rendszerek nem megfelelőnknek bizonyultak. A betápiálásos szakasznak megfelelő fázis 15-22 óra elteltével kezdődik, ez azonban végső soron különböző egyedi faktorokon, például a hőmérsékleten, tápközeg összetételen, tápközeg koncentrácíóján, a reaktor méretén stb. múlik, leginkább azonban az alkalmazott E. colt törzs tulajdonságain. Előnyösen, az idegen fehérje szintézisét a betápiálásos szakasznak megfelelő fázis kezdetétől számítva körülbelül 4-8 óra múlva indítjuk be. A beindítás pontos ideje azonban végső soron a tenyészet sejtsü***$******* ******** *. *** * »«t«
X » «·.<»«'« 0 *♦ *«« -0» « 0*
- 19 rűségétöi függ, amelynek ekkorra el kell érnie egy bizonyos értéket, 10 és 80 g/1 közötti sejt.sűrűségek/ előnyösen 20 és 60 g/1 közötti sejtsürűségek különösen előnyösen alkalmazhatok, amennyiben 100 g/1 és 150 g/1 közötti végső sejtsűrűségeket érhetünk el. Következésképpen általában előnyös a fehérjeszintézist a maximális sejtsűrűség 10~60%~& elérésekor beindítani,
A fehérjeszintézis beindítása a szabályozható· promőterrendszer bekapcsolásával érhető el. Az alkalmazott rendszertől függően ez, a bekapcsolás általában valamilyen anyag hozzáadásával vagy egy fizikai mennyiség megváltoztatásával történik. Az előnyös iac-rendszer esetében (a rendszer elemei: prométer, operátor és indnkáiószer) a bekapcsolást 1PTG (izopropíi-tiogalakto-piranozld) hozzáadásával végezzük, A sejtek további növekedését most már csupán a felhalmozódó termék korlátozhatja. A találmány szerinti megoldás szempontjából fontos ezért, hogy az indukál.á.s előtt ne menjen végbe jelentős mértékű alapszintű expressziő, amelynek kedvezőtlen hatása lenne a teljes sejttömegnövekedésre és következésképpen a teljes hozamra, A találmány szerinti megoldás megvalósításakor ezt ügy érjük el, hogy hatékony terminátorszekvemciákkal szegélyezett expressziős egységet tartalmazd plazmidot tartalmazunk.
Attól a pillanattól kezdve, hogy glükózt kezdünk el betáplálni, a fermentációs tápközeg fokozatosan elszegényedik nitrogénban és foszfátban (3a és 3b ábrák), Annak érdekében, hogy minden típusú korlátozást elkerüljünk, előnyösen nitrogént és foszfátot is betáplálunk - a glükózhoz hasonlóan - egy megfelelő, folyamatos eljárással, A nitrogént y «« νχ.χ. v «?·<>
* * * » Φ * , V *»·,. ί*·„ ♦’ ♦»!
»* *»« »«· » χϊ előnyösen ammóninmsök formájában tápláljuk be, mivel ezen a módon egyidejűleg a pB-t is beállíthatjuk (6,5 és 7,0 közé, előnyösen ^,3-ras. Erre a célra megfelelő például az FS2oldat (1. táblázati. A IV. alfázist a találmány szerinti megoldásban nyomelemek (például bőr, mangán., vas, kobalt, moiibdén és cink) betáplálása jellemzi, oldható sók formájában. Ezek hozzáadását általában folyamatosan, állandó sebességgel végezzük. Az V. alfázíst lecsökkent sejttömegnövekedés jellemzi, főleg a termék felhalmozódásának következtében.. Ezen felül az ecetsav koncentrációjának kismértékű növekedését is megfigyelhetjük. Az ecetsav felhalmozódásának mértéke és az ecetsav koncentrációja azonban, meglepően alacsony a tápközegben. Ez szintén az eljárás speciális körülményeinek köszönhető. Olyan. (£. coli törzsek alkalmazása, amelyekre kevesebb, mint 5 g/1 maximális ecetsavfelhalmozódás a jellemző, számottevően tovább erősítik ezt.
a hatást.
A fehérje természetétől függően a fehérjehozam átlagosan 2 g/1 és 6 g/1 között változik. A fehérje természetétől függően ennek a mennyiségnek 50-95%-a biológiailag aktív fehérje. Antitest-fragiaensek esetében a fehérjemennyiség több itint SCd-át kaphatjuk meg újra fel feketedés kiváltásával ί rezeid) . Ezek az értékek j elentős xaértékben meghaladják azokat, amelyeket a technika állása szerint már eddig is ismert, összehasonlítható eljárások során kapunk.
A leírásban ismertetett eljárás antitest fragmensek, előnyösen mini.antite.stek, hatékony előállátására előnyösnek tekinthető, beleértve a speciálisan megalkotott, ss a találmány szerinti megoldás céljára kialakított expressziős plazmidokat is. Más fehérjéket is előállíthatunk azonban előnyösen a találmány szerinti megoldással, például fúziós fehérjéket vagy enzimeket. Ilyen, alkalmas fehérjék például a hibrid sztrepíokináz, a glukóz tíehidrogenáz, vagy véralvadásra ható fehérjék, például a hirudin, trombin, bementin vagy teromin.
1.- táblázat
A tápközeg összetétele; a tápközeget FS1-, FS2~ és PS3~oláatok alkotják, amelyeket a betsplálasos szakasznak megfelelő fázis különböző alfázisarban alkalmazunk.
vegyület | Előzetes tenyésztés sétán a ik el íriszért táv- r e e ej | SS tenyésztés sétán alkalma- zott tápközeg | ESI rag/l | FS2 iag/I | FS3 X3/I | |
i | :öa:H?Z; x AOO | 8fexlQ·' | ||||
z | üti | 15.6x10“ | ||||
3 | s KAÜ -:HZO4 | 4x105 | 227x10“ | |||
4 | ίκιρηνο, | 160.5x10“ | ||||
5 | Nád Cl | 1x10“ | ||||
6 | HaCl | Sxi'h | ||||
7 | oifcramxav | 2 . 1x1 A | ||||
δ | - eitrát | 60.0 | 7 S, 0 | Sx 1 ÍI | ||
- hidrát | ||||||
3 | iíl | 3.0 | 3. δ | 250 | ||
10 | 'Mn Cl.ps 4'K2O | IS. 0 | 18.S | 125 |
1táblázat {folytatás)
11 | ZO’ZÁxl H?O | 8,4 | 10.5 | 700 | ||
12 | ΟχΟΙΑΕ,Ο | 1,5 | 1 .9 | 125 | ||
13 | namvyxzmo | Λ C. /1. χ·' | 3. 1 | 213 | ||
14 | C o C1 :λ 6 Η10 | 2.5 | 3.1 | 213 | ||
IS | 1;·. ( 02,000? ;;X2t;C | 8, ö | 10 | 668 | ||
1 ·& | glükóz | IQxIík | ZSxlík | 670χΙ03 | ||
17 | UgSíyjtnyo | 5öö' | i. óxiít | ;19.8x10* | ||
18 | alapi cl 11 in | 108 | 100 |
1. példa
A prototróf £. coli Kiz-törzset, az RV308~at (iádégairsil:oOPSOástrA) [Maurer és mtsai., J. Mól. Bioi, 159,
147-161 [1980? ; ATCC 31608) alkalmaztuk rekombináns E. coli gazdatörzs előállítására. Amennyiben az adott helyen nem. ismertetünk más eljárást, az sxpresszálásra alkalmas vektorral való transzformálást és minden más, szükséges DNSmunkát szokványos eljárások alkalmazásával végeztünk. Kontroliként plazmidmentes E. ocli 9V5C6-sejteket alkalmaztunk a nagy sejtsürOsegű fermentálás során.
A ρΗΚΚ-vektort a következőképp készítettük el üt ábra! : a pAKÍ'00-ből származó kisebbik Mlul-fragmenst [Krebber és Piückthan (1995)], amely egy erős transzkripciós § A terminátort - a t^-t - tartalmaz ÍNono és mtsai., lásd fent) a iac-promóter és operátor 5'-végi régiójában, a pASKlO-piazmidba ínszertáituk [Skerra és mtsai,, Broteehnol, 9, 273-278 (1991)]. A. hok-sok-DNS-t két további klónozási lépéssel ins-zertáltuk be: az aphA-gént kettős emésztéssel eltárol!tót tok a pKG1022-plazmádból t Gerd.es· (1983; , lásd fent] Ahol- el és E'coPl-el végzett kettős emésztéssel, a végeket feltöltettük DNS-pol.ímerá.z-1-el {'Klenow-fragme-nsi és üjraiigáitok. Egy második lépésben a pKGI022~hői származó- módosított BamHI-ffagmehst klónoztunk az első klónozási termék egyetlen Bambi-hasítási helyére. A miniantitest egy egyláncú antitest-fragmensből származott, amelyben a variábilis dóm-éneket - VH-V·.-irányban agy flexibilis kepoícsrégiőhoz piinker”; (giy^serb csatlakoztattuk, amelyet a molekulában egy p-rol ínban gazdag csuklörégiö ű'hinge”) és sgy módosított hélix-kanyar-hélix-domén. íhelix-turn-helix-domaín”, dhlx) követ (Pack. és mtsai., Bioteehnol 11, 1271-1277 (1933)} . A BNS-sz-kvenciák, a iáncinditók, valamint a rágcsáló eredetű humanizált áíab-425 könnyű és nehéz láncának ampáitihálásai és klónozásai részletesen a WO92/IÖ683 számú nemzetközi közzétételi iratban vannak ismertetve. Annak érdekében, hogy biztosítsuk az sCFv425dhlx-fragmens pe-riplazmidba történő szekrécióját, a vk-domént N~terminális végén a p-elS-szignálszekvenciához fuzionálhattuk. A Tl'glO-ribos zómakötő helyet íShine Dalgarnoi PCA-eljárással klónoztuk a pEGl-plazmád Xbal- és Sfil-restrikciős helyeire (Strittaatter és mtsai., (1935;j. Az eredményképpen kapott scFv425dhlx~expressziös egységet az Xhai- és .RindlII-h&sitási helyekre klónoztuk. Ennek eredményeképpen kaptuk « pHKK expressziős vektort, amelyet a 2. ábrán mutatunk be·..
* »·#-χ
2. példa
Az 1. táblázat tartalmazza az Erlemeyer-lombikokban végzett előzetes tenyésztés során alkalmazott táp közegek összetételét, & keveröfoerendezéssel (Biostat FDlo, B. Braun, Bic-tech International, Heisungen, Németország; felszerelt tankreaktorban végzett főtenyésztés során alkalmazott tápközeg összetételét, és az FS1-, F52- és FS3~tápkozegek összetételét. A fő tápközeget (3 1} a Riesenberg és munkatársai -által alkalmazotthoz, képest módosítottuk [Riesenberg és mtsai. (1991; , lásd fent]. Annak érdekében, hogy megakadályozzuk a kicsapódást, ez összetevőket az 1. táblázatban feltüntetett módon adtuk hozzá a tápközeghez. A glükózt és a magnéziumszulfátot külön-külön autoklávozott oldatokként tápláltuk be. A reaktort 26 wC-on üzemeltettük, 0,15 mPa nyomással, pH 6,8-on és átlagosan 10 i/pere levegőztetés! sebességgel. A pH beállítására 25%-os vizes ammóniaoldatot használtunk. A fermentáció során ammóniát és óból cb-Nlio^-t {Fragoi Industrieschmlerstoffe GmbH, Mühlsim/Ruhr, Németország) adtunk a tenyészethez, szenzoros ellenőrzéssel, hogy szabályozzuk a pH-t és a habzásgétlő anyag mennyiségét (ebben a sorrendben;, Az FSl~t a következőképpen készítettük el; 750 g glükózt és 22,2 g magnézium-szulfát x 7 H;;O-t oldottunk rendre, külön-külön 600 ml. HjO-ban és 50 mi Hűiben. Az oldatokat autoklávozás után összekevertük. Az FS2~t úgy készí tettük, hogy 227 g (AHA sHPíp-et és 169, 5 g (NHi) H/Flh-et oldottuk vízben, ugyanakkor 60 ml 25%-os ammóniát adva az oldathoz, annak érdekében, hogy a pH-t 6,8-ra állítsuk az autoklávozás előtt. Az FS3-t az alábbi törzseihatókból készítettük: 50 ml Fe(III; -cítrát-hídrát (6 g/1),
0, 5 ml | HjBCü | (30 g/ii , ( | ), 5 mi KnCi;. x 4H,Ó | (io g/iiu | 0,5 ml | ||
EDTA x | 2X0 | (84 g/ii, 0 | ,5 mi | Cuül- x 2HíO | (15 g/1), | 0, 5 | ml |
KsXoO, | κ 2H; | 0 (25 g/li, | 0, 5 S | il CoCl.2 χ 2H; | ?O (25 g/1) | és | 10 |
ml Ón ÍCHsCOCJ 3 X 2H?0 (4 g/lj .
3, példa
LB-agarózon, 2€ X-on, petri csészében tenyésztett telepek közül jó néhányat használtunk fel. arra, hogy átoltsuk őket 2Ö ín! folyékony ib~tápkö zeg.be. öt óra rázstás után Í200 ford/pere, 2/ °C; s tenyészet 1 ml-ét vittük át 100 ml~be., előzetes tenyésztéshez készült tápközegbe, egy 000 ml-es edénybe, amit tovább inknbáitunk a fenti körülmények között. Ennek az előzetes tenyészetnek 10 ml-ét oltottuk ét egy új, előzetes tenyészethez készült tápközeg 100 ml-ébe. Ilyen módon 0 előzetes tenyészetet készítettünk, amelyeket együttesen 3 1, fő tenyésztéshez készült tápközegbe oltottunk be, a fermentorba, hogy ö'D;.^ ~ 0,2 optikai sűrűségű kiindulási tenyészetet kapjunk.
i, példa
A 10 1-es bioreaktor elrendezése, kiegészítőkkel és szabályozó felszereléssel együtt, az 1. ábrán látható. A nagy sejtsűrűségű tenyésztést a fermentáció során egy digitális mérő- és szabályozóegység (’Mígital messuring and control unit, DCUi, egy több fermentor szabályozására alkalmas rendszer (multifermenter control system, MFCS5 és egy gázáram-szabályozó egység alkalmazásával valósítottuk meg. .Folyamatosan mértük a GO?- és az oxigénkibocsátást - A beoltást követően az Mk~3 biológiai mintagyűjtőt. (New Brunswick Scientific, VSatíord, Egyesült Királysági alkalmaztuk steril minták vételére, és az ,:loff linX adatelemzés « X
- 26 megvalósítására [Webb és mtsai., Biotechnoi., 3, 926--923 (1990)1. A szabályozóegységek 10 1/perces belépő gásáramot tartottak fent, továbbá pH - 6, 8-at., 26 ‘^C-os hőmérsékletet és 0,15 mPa nyomást. Két szabályozó burok biztosította 32 aerób növekedési körülményeket .20%-os pOn-néi. A fermentáció teljes ideje alatt minden fontos fizikai mennyiséget mértünk és regisztráltunk.
A betápiáiásos szakasznak megfelelő fázisban a glükóz koncentrác lóját a tenyészetben 1,5 g/l-es szinten tartottuk, Erre a célra egy módosított áramlási injektál&sos analizáló berendezést (FlAstar 5020 analizáló berendezés fotométerrel és kimutatást végző szabályozó egységgel fölszerelve íTecator AB, Svédország;. A rendszer egyes részletei és működésének módja a technika állása szerint ismert [például Pfaff és mtsai., Computer Applications in Biotechnology'5 szerk. Munsch A. es Schageri K, kiad,
Elesvier Science Ltd., Oxford, 6-11 (19.95} 3 .
A sejtsűrűséget az optikai sűrűségből számítottuk, amelyet 550 nm-en mértünk. A plazxnidstabíütést Pack és munkatársai módszerével [1993, lásd fent; határoztuk meg.
5. példa
A szintetizált miniantitestek kvantitatív meghatározását Back és munkatársai (1993, lásd fent) módszerével végeztük. A működőképes mimiantítestek mennyiségét ELISA segítségévei határoztuk meg, az összmennyíségüket pedig SDSPAGE-vel 12 -os poliakrriamid-gélben, Laemmlí módszerével (1970)., a kapott gélt elemezve. Az ELI SA~ vizsgál átok során jí.urdkh..
mikrotiter-tálcákat burkoltunk emberi receptorral * , .
vyp,··-··' (például WO 92/15633 számú nemzetközi közzétételi irat), ától .is ti φ «ΦΦ ♦ φ « * *:* ♦-«.»
ΦΦΦ kötött miniantitesteket scFv425· elleni, nyúl ben készült szérummal és peroxiö&zhoz konjugált kecskeeredetű, nyűi XgG elleni ellenanyaggal (Jackson Immunoresearch Inc., USA} mutattuk ki. Az aktív miniantitestek hozamát a tisztított miniantitestekből késtűit hígítás! sor segítségével számítottuk ki. Agy kontroll-kísérletben kimutattuk, hogy az. scFv42.5 elleni nyúlszérum nem mutat semmilyen megfigyelhető keresztreakciót a plazmidmentes £. coli RV3Ö8-sejtek nyers kivonatának más összetevőivel. Továbbá, amikor ezt a nyers kivonatot hozzáadtuk az ugyanazon antitest tisztított formájából készített hígítás! sorhoz, ez semmilyen hatással nem. bírt az ELISA-jelekre. A miniantitestek teljes mennyiségének meghatározása érdekében a géleket Aromásaié rriiiiunt hlye festékkel festettük, fotometriásan elemeztük, és a miniantitastek koncentrációját «gy, a tisztított miniantitestektől készült hígítás! sor alapján számítottuk ki a higitási sornak megfelelő mintákat ugyanazon a gélen megfuttatva. Kön troli ként itt is az £. coli gazdasejtek analóg módon készített elegyét használtuk, amely gazdasejtek nem termeitek miniantítesteket.
Claims (17)
1. Eljárás idegen fehérje előállítására idegen gént és indukálható promötert hordozó plazmáddal transzfermáit A, coli sejtekben, nagy sejtsürűségű tenyésztés útján, első szakasznak megfelelő és betáplálásos szakasznak megfelelő fázisokat alkalmazva·, anélkül, hogy a sejttömegnövekedést ssubsztrátok vagy anyagcsere-melléktermékek gátolnák, továbbá az expresszált fehérje a tápkdzegből való izolálásával. és kitisztításával, és amely tenyésztés során a ezubsztrátok koncentrációját a betáplálásos szakasznak megfelelő fázisban egy folyamatos, automata vagy félautomata elemző és hozzáadó rendszer alkalmazáséval szabályozzuk, arzal jellemezve, hogy (i) a szénforrás koncentrációját a tápközegben Ö,1 g/1 és 25 g/1 közötti konoentráciötartományban állandó szinten tartjuk és ezzel a sejtek korlátozás nélküli szaporodását tartjuk fent (μ - u^)·, (ii) az idegen fehérje termelését a betáplálásos szakasznak megfelelő fázisban indítjuk be a promőt-er indukálásával 10 g/1 és 80 g/1 közötti sejtsűrűségnél, iiiií a termék szintézisének beindítása után folyamatosan - a sejtek számára hasznosítható - nitrogént és foszfátot, továbbá nyomelemsókat táplálunk be a rendszerbe, miközben (ív) a teljes betáplálásom szakasznak megfelelő fázisban megfelelő módon oxigént juttatunk be a tápoldatba és ezáltal a pOs-értéket 51 és:
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás,· azzal jellemezve, hogy a széniorrás koncentrációját a betápiáissos szakasznak megfelelő fázisban az 1 g/i és 3 g/1 közötti tartományban állandó értéken tartjuk.
2.5% között tartjuk.
»* «V
3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jelleme.sve, hogy az 50 g/1 és 80 g/1/sejtsürűségnéi nitrogént, foszfátot és nyomelemeket adunk a tenyészethez.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az I. igénypont szerinti iii) lépésben az idegen fehérje termelését 20 g/1. és 60 g/1 közötti sejtsűrűségnél indítjuk be.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a betáplálás-ős szakasznak megfelelő fázisban 100 g/1 és 150 g/1 közötti sejtsűrűséget érünk el.
6. Az 1-5, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmáddal transzformáit E. coli sejtként egy, két tsrminátorszekveneía által szegélyezett, idegen gént tartalmazó expressziös egységet hordozó expresszzős vektort tartalmazó coli sejtet alkalmazunk.
7. A 6, igénypont szerinti elzárás, azzal jellemezve, hogy expressziős vektort tartalmazó £. coli sejtként egy öngyilkos rendszert, előnyösen hok-sok öngyilkos rendszert is tartalmazó expressziős vektor hordozó £. coli sejtet alkalmazunk.
8. A 0. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy idegen gént tartalmazó expresszién vektor hordozó r. coli sejtként egy antitestfragmenst kódoló idegen gént, előnyösen egy miniantitestet kódoló idegen gént ’*** «χ 0 X 0 0 φχ*0 0« * * * 0 0 0 * *» *'*% *** * *** *♦ x*0 X* φ <0* *' - 30 * * tartalmazó expressziós vektort hordozó- £. coli sejtet alkalmazunk
9. Az 1-4, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy expressziós vektort hordozó fi coll sejtként a 12-16. igénypontok' bármelyike szerinti expressziós vektort hordozó zh roll sejtet alkalmazzuk.
ló.
Az 1-9. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy £, toll törzsként a fermentációs fázisban a tápközegben nem több mint 5 g/1 ecetsavat felhalmozó x. coli törzset alkalmazunk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás., azzal jellemezve, hogy x, coli törzsként az RV3öS~törzset (ATCC 31608;
alkalmazzuk.
12. x. coll expressziós vektor, amely alkalmas nagy sejtsűrűségű fermentációs körülmények között is idegen fehérjék expresszáiására, és amely az alábbi jellemző részeket tartalmazza;
(i) egy 5‘-végi terminátorszekvencia és egy 3’-végi t e rminá törsz ekvsnc ia, i ii} lac-nrcmőter/cperátor-rendszer, g.
(ixi) egy Tiglö-Shine-Dáigarno-szekvencia, iiv; peis- vagy ompA-szignáiszekvenoia, ív) zdegen génszekvencia
13. A 12. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy egy öngyilkos rendszert, előnyösen hok-sok öngyilkos rendszernek megfelelő szekvenciát is tartalmaz.
14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy az S!-végi terninácorszskveneia a és a 3'-végi terminátorszekvencia a **** φ V * « « « »
15. Α 12-14. igénypontclt bármelyike szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy «2 idegen gén egy miniantitest 7Κlánoát és a. Ιό-láncát kódoló szekvenciát tartalmaz.
16. pHKK-jelü expressziős vektor, amelynek szerkezeti vázlata 2. ábrán látható.
17. Transzformált ő. coli BV308[pHKK) expressziós gazdasejt, amely az RV308 ÍATCC 31608) gazdasejt 14. igénypont szerinti expressziós vektorral való transzformálásával állítható elő.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP95119478 | 1995-12-11 | ||
PCT/EP1996/005260 WO1997021829A1 (de) | 1995-12-11 | 1996-11-28 | Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen in e. coli mittels hochzelldichte-fermentation |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUP0000317A2 HUP0000317A2 (hu) | 2000-06-28 |
HUP0000317A3 HUP0000317A3 (en) | 2001-09-28 |
HU227945B1 true HU227945B1 (en) | 2012-06-28 |
Family
ID=8219878
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU0000317A HU227945B1 (en) | 1995-12-11 | 1996-11-28 | Process for the preparation of recombinant proteins in e.coli by high cell density fermentation |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6410270B1 (hu) |
EP (1) | EP0866876B1 (hu) |
JP (2) | JP4101879B2 (hu) |
KR (1) | KR100444735B1 (hu) |
CN (1) | CN1117160C (hu) |
AR (1) | AR005035A1 (hu) |
AT (1) | ATE213271T1 (hu) |
AU (1) | AU716612B2 (hu) |
BR (1) | BR9611937A (hu) |
CA (1) | CA2240097C (hu) |
CZ (1) | CZ291415B6 (hu) |
DE (1) | DE59608743D1 (hu) |
DK (1) | DK0866876T3 (hu) |
ES (1) | ES2171752T3 (hu) |
HU (1) | HU227945B1 (hu) |
NO (1) | NO319090B1 (hu) |
PL (1) | PL185665B1 (hu) |
PT (1) | PT866876E (hu) |
RU (1) | RU2201455C2 (hu) |
SI (1) | SI0866876T1 (hu) |
SK (1) | SK283169B6 (hu) |
UA (1) | UA61066C2 (hu) |
WO (1) | WO1997021829A1 (hu) |
ZA (1) | ZA9610384B (hu) |
Families Citing this family (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9715895D0 (en) | 1997-07-29 | 1997-10-01 | Zeneca Ltd | Heterocyclic compounds |
WO2000024769A2 (en) | 1998-10-28 | 2000-05-04 | Genentech, Inc. | Process for recovering heterologous polypeptide from bacterial refractile particles |
AU3944002A (en) | 2000-11-03 | 2002-05-27 | Genentech Inc | Metabolic rate shifts in fermentations expressing recombinant proteins |
EP1407052B1 (en) * | 2001-07-06 | 2008-12-03 | MERCK PATENT GmbH | Method for monitoring and modulating protein folding |
WO2005072092A2 (en) * | 2003-12-12 | 2005-08-11 | Conjugon, Inc. | Systems for tightly regulated gene expression |
AU2003295182B9 (en) * | 2003-12-23 | 2009-12-17 | Council Of Scientific And Industrial Research | Process for producing streptokinase using genetically modified Escherichia coli |
WO2006069403A2 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Genentech, Inc. | Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins |
WO2008013943A2 (en) * | 2006-07-27 | 2008-01-31 | Wyeth | High-cell density fed-batch fermentation process for producing recombinant protein |
CN101663390B (zh) | 2006-09-13 | 2013-10-23 | Abbvie公司 | 使用非动物源水解产物的分批补料细胞培养方法 |
US8911964B2 (en) | 2006-09-13 | 2014-12-16 | Abbvie Inc. | Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody |
MX347112B (es) | 2008-09-15 | 2017-04-12 | Genentech Inc | Composiciones y metodos para regular osmolaridad celular. |
CN102471787B (zh) * | 2009-07-28 | 2016-01-20 | 三井化学株式会社 | 乳酸制造方法 |
RU2575598C9 (ru) * | 2010-02-01 | 2016-04-27 | Дигна Байотек, С.Л. | Способ получения белка альфа5-интерферона |
MX339227B (es) * | 2010-08-30 | 2016-05-17 | Hoffmann La Roche | Alimentacion alcalina. |
KR101252150B1 (ko) * | 2010-11-18 | 2013-04-08 | 한국과학기술원 | 재조합 DNA 분자 클로닝을 위한 알데히드 환원효소 YqhD 유전자를 포함하는 자살 벡터 |
RU2507736C2 (ru) * | 2011-01-11 | 2014-02-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ создания трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии трансгенного белка |
EP2702077A2 (en) | 2011-04-27 | 2014-03-05 | AbbVie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
RU2496877C2 (ru) * | 2011-12-15 | 2013-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА |
JP6362543B2 (ja) | 2012-02-23 | 2018-07-25 | ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー | 細胞および他の複雑な生物学的材料のクロマトグラフィーによる単離 |
PT2825633T (pt) | 2012-03-12 | 2019-06-06 | Hanmi Science Co Ltd | Método para cultivar células de e. coli para alta densidade |
CN102604904B (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种葡萄糖脱氢酶的生产方法 |
US9505833B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-11-29 | Abbvie Inc. | Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same |
US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
WO2013158273A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution |
WO2013158279A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Protein purification methods to reduce acidic species |
US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
EP2890782A1 (en) | 2012-09-02 | 2015-07-08 | AbbVie Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
WO2014137903A2 (en) | 2013-03-08 | 2014-09-12 | Genzyme Corporation | Integrated continuous manufacturing of therapeutic protein drug substances |
US8921526B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-12-30 | Abbvie, Inc. | Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use |
US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
WO2014151878A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides |
US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
US20150139988A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
TWI709569B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途 |
TWI709570B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析法及製法 |
WO2016057851A1 (en) * | 2014-10-08 | 2016-04-14 | Lewis Randolph V | Expression systems and associated methods |
MA45489A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés |
AR111625A1 (es) | 2017-04-27 | 2019-07-31 | Juno Therapeutics Gmbh | Reactivos de partículas oligoméricas y métodos de uso de los mismos |
AU2019332764A1 (en) | 2018-08-31 | 2021-05-06 | Genzyme Corporation | Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes |
CN110684101A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-01-14 | 上海松皓生物科技有限公司 | 一种重组水蛭素的制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0531472T3 (da) | 1991-03-06 | 2003-12-01 | Merck Patent Gmbh | Humaniserede monoklonale antistoffer |
-
1996
- 1996-11-12 AR ARP960105609A patent/AR005035A1/es unknown
- 1996-11-28 JP JP52166297A patent/JP4101879B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-28 WO PCT/EP1996/005260 patent/WO1997021829A1/de active IP Right Grant
- 1996-11-28 CA CA002240097A patent/CA2240097C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-28 AU AU10325/97A patent/AU716612B2/en not_active Ceased
- 1996-11-28 ES ES96941047T patent/ES2171752T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-28 CZ CZ19981652A patent/CZ291415B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 RU RU98113062/13A patent/RU2201455C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 SK SK740-98A patent/SK283169B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 EP EP96941047A patent/EP0866876B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-28 KR KR10-1998-0704331A patent/KR100444735B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 DE DE59608743T patent/DE59608743D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-28 AT AT96941047T patent/ATE213271T1/de active
- 1996-11-28 US US09/077,549 patent/US6410270B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-28 HU HU0000317A patent/HU227945B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 DK DK96941047T patent/DK0866876T3/da active
- 1996-11-28 PT PT96941047T patent/PT866876E/pt unknown
- 1996-11-28 UA UA98073658A patent/UA61066C2/uk unknown
- 1996-11-28 BR BR9611937A patent/BR9611937A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-11-28 SI SI9630466T patent/SI0866876T1/xx unknown
- 1996-11-28 CN CN96198949A patent/CN1117160C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-28 PL PL96327188A patent/PL185665B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-12-10 ZA ZA9610384A patent/ZA9610384B/xx unknown
-
1998
- 1998-06-10 NO NO19982672A patent/NO319090B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-04-18 JP JP2007109443A patent/JP4102422B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU227945B1 (en) | Process for the preparation of recombinant proteins in e.coli by high cell density fermentation | |
Kim et al. | Down‐regulation of acetate pathway through antisense strategy in Escherichia coli: Improved foreign protein production | |
EP2489741B1 (en) | Method for production of glutathione or gamma-glutamylcysteine | |
EP3237432B1 (en) | Protein manufacture | |
JP2008073046A (ja) | 異種タンパク質の製造方法並びにタンパク質の分泌方法 | |
TW200920845A (en) | Method of producing heterogeneous protein | |
TW200806790A (en) | Taurine transporter gene | |
JP2008073047A (ja) | 異種タンパク質の製造方法、タンパク質の分泌方法並びに前記方法の実施のためのe.コリ菌株 | |
CN104662161A (zh) | 用于防止正亮氨酸错误地掺入蛋白质中的方法和组合物 | |
CN114277046B (zh) | 一种合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体及应用 | |
Pandi et al. | Microaerobic fermentation alters lactose metabolism in Escherichia coli | |
CN102911958B (zh) | 编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其应用 | |
US11788111B2 (en) | Compositions and methods for making selenocysteine containing polypeptides | |
FR2785291A1 (fr) | Procede de production in vivo de proteines chimiquement diversifiees par incorporation d'acides amines non conventionnels | |
WO2019071023A1 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING POLYPEPTIDES CONTAINING SELENOCYSTEINE | |
Huang et al. | Amino acid substitution in the lactose carrier protein with the use of amber suppressors | |
CN115838712A (zh) | 具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在l-肌肽合成中的应用 | |
WO2022238321A1 (en) | Process for the production of recombinant proteins | |
Shin et al. | Effects of Environmental Conditions on Expression of Bacillus subtilis $\alpha $-Amylase in Recombinant Escherichia coli | |
MXPA98004566A (en) | Procedure for preparing recombinant proteins in e. coli through fermentation with great concentration of celu | |
CN115850406A (zh) | L-酪氨酸产量相关蛋白yedZ及其生物材料和应用 | |
CN111961656A (zh) | 一种丝氨酸羟甲基转移酶的突变体及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |