HU227945B1

HU227945B1 - Process for the preparation of recombinant proteins in e.coli by high cell density fermentation

Info

Publication number: HU227945B1
Application number: HU0000317A
Authority: HU
Inventors: Uwe Horn; Uwe Knuepfer; Anke Krebber; Marian Kujau; Siegfried Matzku; Andreas Plueckthun; Dieter Riesenberg; Wolfgang Dr Strittmatter; Rolf Wenderoth
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1995-12-11
Filing date: 1996-11-28
Publication date: 2012-06-28
Also published as: AU716612B2; ES2171752T3; EP0866876B1; AR005035A1; KR100444735B1; KR19990072037A; CZ165298A3; JP4102422B2; CZ291415B6; SK74098A3; PL327188A1; JP4101879B2; EP0866876A1; CA2240097A1; NO982672L; DK0866876T3; NO982672D0; UA61066C2; CN1117160C; AU1032597A

Description

Eljárás rekombináns fehérjék előállítására &„ coli-bán nagy sejtsűrűségű fermentálás útján

A találmány tárgyát egy szakaszos betáplálása fermentációs eljárás képezi, amellyel ~ speciális· E, coli gazdasejt/ vektor-rendszerek alkalmazásával - hatékonyan állíthatók elő rekombináns fehérjék, előnyösen rekombináns antitest-molekulák, előnyösen antitest-fragmensek, például míniantátestek...

A találmány szerinti eljárással térben és időben gazdaságosan, magas hozammal állíthatók elő natív, rekombináns fehérjék.

A találmány szerinti körülmények között az £. coli sejteket nagyon nagy sejtsürűségíg tenyészthetjük maximális specifikus sejttömegnövekedési sebességgel. Miután a termék rekombináns módon való keletkezését beindítjuk, csupán a keletkező termék gyakorol gátló hatást a növekedésre; szubsztrátok vagy anyagcsere-melléktermékek nem korlátozzák a növekedést. Ezen a módon az új, nagy stabilitású expresszié» vektorok segítségével, amelyeket speciálisan erre a célra tettünk alkalmassá, lehetséges rekombináns, ktaszámunk: S7S04-903/SG nagy biológiai aktivitású fehérjék/ előnyösen antitestfragmensek, térbeli és időbeli, értelemben véve magas hozamát elérni.

Az E, coli sejtek nagy sej ^sűrűségig történő tenyésztése lényegi előfeltétele rekombináns fehérjék hatékony termelésének. A technika állása szerint az alábbi tenyészetek felelnek meg ennek a célnak. Az első szakasznak megfelelő fázisban végbemenő· nem korlátozott növekedés (μ - μ®^) után az ezt követő ún. betáplálás! szakasznak megfelelő fázisban kimért mennyiségű szénforrást (glükózt vagy glicerint) adnak a tenyészethez szokványos módon, azonban olyan mértékben korlátozott mennyiségben, hogy a növekedést gátló melléktermékek, például az acetát keletkezését sikerüljék. Ennek az a következménye, hogy a növekedés csupán a •sznbsztrátmennyiség által korlátozott mértékben (μ < folytatódik', egészen, addig, amíg a tenyészet nagy sejt sűrűséget nem ér el [Riesenberg és mtsai., J. Biotechnoi., 2.0, 17-28, (1991); Strardberg és mtsai., FEMS Microbiol. Rév.,

14, 53-56 (1994); Kort és mtsai., J. Biotechnoi. 39, 53-65 (1995); EP-B-0 511 226 számú európai közzétételi irat]. A csökkent sejtszaporodás sebességgel végbemenő sejttömeg növekedés természetesen hosszú fermentációs időket és következésképpen térbeli és időbeli értelemben alacsonyabb hozamokat eredményez. Az azonnali, felhasználásnak köszönhetően a szénforrás koncentrációja a tápoldatban az ilyen fermentálások során gyakorlatilag nulla. A szübsztrátmennyiség által korlátozott körülmények nem változnak meg azáltal, hogy a rekombináns termék termelődését beindítják.

φ φ*

Már eddig is ismertek voltak .£,. coli sejtek felhasználásán alapuló tápanyag-betápláiásos szakaszos üzemű tenyészetek/ amelyekben a szénforrást szakaszosan pótolták, viszonylag- nagy időközönként és viszonylag nagy mennyiségben, általában a p0₃-érték emelkedését alkalmazva a szubsztrát-kimerülés indikátoraként a következő adag szénforrás hozzáadásának megindítása céljából, [például Sppstein és mtsai., Eiotechnol. 7, 1178-1181 (1989)1 . Ez az eljárás egyben azzal jár, hogy gyakran keli váltani a viszonylag hosszú távon, szubsztrátfelesieget biztosító körülmények és a szubsztrátmennyiség által korlátot jelentő .körülmények között, ami következésképpen az anyagoserefolyamatok kiegyensúlyozatlanságát foglalja magában.

Az alábbiakban olyan, tápanyagpőtlásos szakaszos üzemű tenyészeteket ismertetünk/ amelyekben a sejtek a specifikus sejtszaporodásí sebesség maximumával szaporodhatnék Φ ^::: fe) s tápanyagpőtlásos szakaszban. Azok a tápanyagpótlásos, szakaszos üzemű tenyészetek, amelyekben viszonylag hosszú időközönként nagy mennyiségű szénforrást adnak a tenyészethez - off-lína mérések alapján - a szubsztrátmennyiség által, felállított korlátozást elkerülendő·, kísérletileg munkaigényesek és meg van az a hátrányuk, hogy a szénforrás koncentrációja folyamatosan, változik a fermentálás egész ideje alatt [Pack és mtsai., Biotechnoi., 11, 1271-1277, (1993) ; Hahm és mtsai.., Appl. Microbiol. Biotechnol, 42, 100-107 (1994)1.

Olyan, tápanyagpőtlásos, szakaszos üzemű tenyészeteket

Is leírtak, amelyekben a szénforrás koncentrációját “online* mérik., és úgy szabályozzák, hogy a korlátozást elkerüljék. Ezeket a tenyészeteket azonban - különösen a nagy sejtsűrüségü szakaszban - az alábbiakban ismertetett hátrányok jellemzik. Legújabban leírtak egy autokiávozható giükóz-bioszenzort mikröbisiis fermentálásra való alkalmazásra kevertetett tartálya £ermentorokban [Phelps M.R. és rntsai., S-io technoi. Bioeng,48, 514-524 (1995)]. Ezt a bioszenzort alkalmazzák E. coli sejtek, tenyésztése során is. Ez az in siti; szenzor körülbelül 2 perces reakcióidővel a tenyészőIdát állapotát állandó értéken tartja. A glükózszenzor által adott jel azonban többek között a pH--tói és a pCá-től Is függ, A szenzort mindeddig nem vizsgálták a nagy sejtsűrüségü tartományban (x > 80 g/i) . Tapasztalatból tudható, hogy EL coli sejtek alkalmazása esetén az ín situ próbákkal követett sejtt-ö-megnöve kedés további hibás értékekhez vezethet nagyon nagy sejtsörűségeknél. Ezen kívül nem lehetséges a szenzort pontosan újrakalibráini az éppen folyó fermentáció közben. Más eljárások is léteznek, amelyek nem in situ szenzort alkalmazó elérésen alapulnak. Ilyen például a szánforrások mennyiségének meghatározására alkalmas áramlási injektálás-ős analízis (”flow injectíon analyser”, FIA), vagy az on line HPLC, amelyek alkalmazása során a fermentorban levő tápoidatből féliolyamatosan mintát vesznek és azt szűréssel vagy mikrocentrifügálá.ssa.1 sejtmentessé teszik (Kleman és rntsai., &ppl. Snviron, Microbícl. 57, 910-917 és 918-923(1991;; furnér és rntsai., Siotechnoi. Bioeng, 44, 819-829 (1994)1. A jóslás! és viszszacsatolással szabályozó algoritmusok csökkentették a glüközkoncentráció fluktuációit a sejttömegnovekedés során egészen x ~ 5(5 g/1 koncentrációig '(Kleman és. rntsai., Appl.

*

Envíron. Microbiol. 57, 910-917 ¢1991)1. Nagyon nagy sejtsűrűségeknél ίkörülbelül 80 g/i-töl 150 g/i-igi egyre inkább nehézzé és időigényessé válik a sejtek elválasztása a tápoldat tői, így az időbeli késés {'reakcióidő) a fementorban levő pillanatnyi giükózkoncentráeíő Meghatározása tekintetében szintén nő biomassza-függő Módon, és Megnehezíti vagy lehetetlenné teszi az állandó glükőzszint fenntartását. Ezzel szemben a giükózkoncentráeíő mérhető egy olyan módszerrel is. amelynél a reakcióidő állandó és nem nagy, és ahol az alkalmazott berendezés nem teszi szükségessé a sejtek elválasztását [Pfa.ff és mtsai. Proceedings of the 6'’^fi International Conference and Computer Appl. in Biotechnol.. Garmisch-Partenkirchen, Németország, 8-11 (1995)1· Pfaff és munkatársainak módszere egy enzimatikus és amperometriás glükóz-szenzorral felszerelt FIA-készüléket alkalmaznak, ás a mérést a mintavevőhsly közvetlen közelében végzik, miután a tenyészetet meghígították sejtszaporodást gátló anyaggal.

Az aerőb tenyésztés során, amennyiben az F. coli sejteket az adagolást vezérlő rendszer nem kényszeríti arra, hogy a növekedést szubsztrátmennyiség által korlátozott módon végezzék- a sejtek, növekvő mértékben, anyagcsere melléktermékként rendszerint ecetsavat termelnek tRiesanberg: Curr. Opinion Biotechnol., 2, 380-384 {1921)] . Az ecetsav felhalmozódik a tápoldatban és - amennyiben viszonylag nagy mennyiségben van jelen - sejfszaporodást gátló hatást fejt ki [Pan és mtsai., Biotechnol, Lett., 2, 89-94 (1987)], Smmiatt csupán nem régen vált lehetségessé olyan - speciális Bt coli törzseket felhasználó - tápanyagpótiásos, sza♦ *'** *«» Φ * V ♦ * « φ « »

Φ* ΧΦΦ Φ» > ΦΦ kaszoss üzemű, nagy se j tsűrűségig szaporodó n. coli tenyészetek megvalósítása, -amely tenyészetekben az alkalmazott törzsek,- specifikus genetikai módosítások következtében, -csökkentett mértékben halmoznak, fel ecetsavat, miközben az •ezzel járó egyéb hátrányokat jobban tolerálják. Az £, coll K12 leszármazottai között van egy fo-sz-fotranszacetilázban 'hiányos mutáns (Bauer és mtsai., Appl. Environ, Microbiol. 56, 1236-1302 .(199-0; Hahm és mtsai.,- Appl. Miorobioi.

Biotechnoi. 42, 100-107 (1994}]. Ennek a mutánsnak a szaporodása .azonban glükózt és ásványi, sókat tartalmazó tápközegben -erősen lecsökkent mértékű. Phelps és munkatársai (lásd fent} az E\ coll TOPB5-törzset alkalmazták gazdatörzsként egy, nem a szufosztrstmennyisé-g által korlátozott tenyészet megvalósítására x - 85 g/1. koncentrációjú biomassza elérése mellett. Sz az £. coli törzs azonban,- amelyik egyértelműen és kimondottan nem halmoz föl ecet savat-, nem K12-eredetü törzs. Az coli Tö'PPS hemolizint termel, ebből kifolyólag patogén törzs, amely biztonsági okokból nem alkalmazható az Ipar területén, rekombináns DNStermékek termelésére szánt gazdasejtként való alkalmazásra.

A köztitermékek anyagcseréjének specifikus átalakítása útján az ecetsav felhalmozódásának csökkenését érték el azáltal, hogy £. coli sejteket egy, aoetolaktát-szintázt (ALS) kódoló gént tartalmazó plazmáddal transzformálták í-San és mtsai., Ann.h.Y.Arad.Sci., 721, 257-267 (1994)j. Ennek az eljárásnak azonban megvan az a hátránya, hogy a nagy sejtsűrűség körülményei közepette általában instabilitások lépnek fel, amikor egy ALS-t kódoló plazmid egy második, a. ”termelő gént hordozó plazmáddal kombinálva kerül alkalma♦ * ♦-»'♦*· »»«* «00Μ ♦ * * * 0 0 * * *· X * « « · 0 χ 0 * » · X 0 0 0

0 0 » X XX 0· 0 0 zásra. A rekombináns térnék keletkezésének hatékonysága gyakran csökken a plazmidinstabiiitás következtében, amely a nagyon nagy sejtsűrűségű tenyészetek esetében különösen Kiégne ve kedett mértékben megy végbe.

Antitestek és .antitestek fra-giaensei, például a Fan’, Fíab¹};·, miniantitestek vagy egyláncú Fv'-k egyre növekvő fontosságot nyernek az orvosi és a biotechnológiai területeken. Mini antitest alatt a leírás szerint i értelemben egy kétértékű és két spéciiitással .rendelkező egyláncú Ev~ fragmenst értünk, amelyek egy ál-csuklón ipsendonínge”) keresztül kapcsolódnak. Ebben az Összefüggésben fontos lehet - például a rákterápiában - hogy nagy mennyiségű antitesthez (körülbelül 1 g/adag) juthassunk hozzá. Ebben a tekintetben egyértékü antitast-fragmensek vagy ezen fragmensek fúziós fehérjéi, továbbá multimer vagy ©.ulti specifikus változatai különösen könnyen és minden igényt kielégítően áilithatók elő F, coii-ban, Ezek a fragmensek vagy variánsaik kis méretűek, amellett azonban nagymértékű specifikus kötődési képességgel rendelkeznek (például Plückthun A., Immunoi. Rév. 130151-183' {1992} ; Fach és mtsai. J. Mól. Bioi. 246, 28-34 (1.935):] . a fehérjéknek és antitesteknek azonban - biológiai és funkcionális aktivitásuk érdekében - mindenekelőtt megfelelően kell telte heredni ük ő'roldirg’ő . árikor a keletkezett antífestfragmensek sejtenként! hozamát tartjuk szem előtt, a sejtsürüséggel kapcsolatban erre a problémára is figyelmet kell fordítanunk. Továbbá, az antitest primer szekvenciájának is jelentősége van az in vitro hozam és az in vivő feltekeredés meghatározásában [Knappik A. és Plückthun A., ♦ **» Ο* φ* « « * φ*

Protein Engin, 8, 81 ---89 (.19-95) } . A vázolt probléma következtében sz Fab-fragmensek például oldhatatlan, a citoplazmában vagy a periplazmában található aggregátumokként expresszáiödnak, és űjrafelfeketedésük ( refoiding”) in vitro valósítható meg. így, alacsony sejtsürűségnél körülbelül 0,11 g/l hozamok érhetők el [Gondra és mtsai., J. Bioi.. Chem. 265, 2282-2295 (1290)), and. közepes sejt sűrűségnél körülbelül 1-2 g/l-ig növelhető, ekkor azonban az antitestek oldhatatlan formában vannak jelen [Shibui és· mtsai., App i . Mlorobiol. Biotechnoi. 38, 770-775 (1593)]. Biológiailag aktív formában kétértékű miniantitesteket is előállíthatunk E. cöüi-b-an körülbelül 0,2 g/l hozammal [Pack és mtsai.. Biotechnoi, 11, 1271-1277 (1993)). Átlagosan az ilyen hozamban keletkezett fehérjetermékek megfelelő térszerkezete (feltekert formája) 5-45%-ban állítható helyre.

Az ismert, E. ooií-t alkalmazó rendszerekben az idegen fehérje termelődését - a megfelelő sejtsűrűségek elérése után- megfelelő módon beindítják az expresszíós rendszer szempontjából alkalmas szabályozható promőterrendszer segítségével, A leírásban példaképpen a kővetkező promöterrendszereket említjük meg: (1) az ara-BAD-promóter és az AraC-reptesszor (ez_: utóbbi arabinózzal indukálható) együttesét (például Better és mtsai., Proc, Natl. Acad. Bei. (USA), 90, 457-461 (1993)), (ii) a fosztátmennyíség csökkentésével indukálható phoA-promötert [például Carter és mtsai., Biotechnoi. 19, 163-167 (1992)) és az (Ili) IPTGvei indukálható lac-promóterrendszert [Paok és mtsai., mint fent (1993)) , Noha általános szabályként elmondhatjuk, hogy a iac-rendszer jó expressziét biztosit, kétségtelen, hátrányai azonban, hogy a promóter ináukálása előtt is nem kívánatos alapszintű expresszié .figyelhető meg, továbbá, hogy az IPTG-vel való indukálés után plazmádinstabiiitás jelentkezik .

A. találmány előnyös megvalósítási módja szerint, egy speciális vektort (pBKK.) tárunk fel, amely az egér eredetű vagy humanizált antitest, a Mab-425 fragmenseit kódoló szekvenciákat tartalmaz idegen génként. Az Hab-425 (A?CC KB •3629) egy egér eredetű monokionáiis antitest, amelyet az ismert emberi A432~ráksejtvonalbéi izoláltak (ATCC CRL 1555), és az emberi epidermálls növekedési faktor receptorának {SGFR, egy körülbelül 170 ko méretű giükoprotein) epitopjához kötődik, eközben gátolja a természetes ligandum, az EGF-kötodését. Kimutatták, hogy az Mah~4.25~nek citotoxikus hatása van a tumor-sejtekre, illetve képes gátolni ezen sejtek növekedését IRodeck és mtsai., Cancer Kés. 47, 3632 Í1287;J, A KO 92/I56S3 számú nemzetközi közzétételi irat az bab 425 antitest humanizált és kimére formáit tárja föl, továbbá azok könnyű és nehéz láncainak DNSés aminosav-szekvenciáit,

A találmány szerinti megoldás kidolgozásával célunk az volt, hogy megvalósítsunk egy, fehérjék - előnyösen antitest!ragmensek - előállítására szolgáló eljárást rekombináns F. coli sejtekben, nagy sejtsürűségű körülmények között ÓHCDC = ”high cell density culturs, nagy sejtsűrűségű tenyészet! térben és időben magas hozammal anélkül, hogy a szubsztrátok és a metabolitok jelentősen gátolnák a sejtek szaporodását, továbbá jelentős plazmád lustabili tás- és plazmidvesztés: nélkül, miközben az eljárással biztosítjuk, hogy az expresszáit fehérje nagy mértékben biológiailag aktív es hatásos legyen (kötődésre képes legyen és megfelelő legyen a térszerkezete).

A találmány szerinti eljárás egy többlépcsős, szakaszos üzemű eljárás, amelynek fő jelentősége abban rejlik, hogy a sejtek a teljes tenyésztési szakasz során, maximális sebességgel képesek növekedni (μ = μ^,ό , így, a találmány szerinti eljárás alkalmazásával a tenyésztés- végére 100-150 g/'l sejtsürüségek is elérhetők (a sejtek szárított tömegét adtak meg)„ Továbbá, az eeetsav felhalmozódása nem gátolja jelentős mértékben a növekedést, mivel, meglepő módon, a kiválasztott körülmények között ez a felhalmozódás nem kifejezetten jelentős mértékű, főként akkor nem, amikor előnyösen - olyan £. coli törzseket alkalmazunk, amelyek csupán csökkentett mennyiségű eeetsav termelésére hajlamosak a fermentáció során. Ezt - más intézkedések mellett mindenekelőtt azzal érjük el, hogy a betáplálásos (táp~ anyagpötlássa! jellemezhető} szakasznak megfelelő fázisban, amely az első szakasznak megfelelő fázis után következik, a szénforrás koncentrációját a tápközegben egy meghatározott tartományban állandó szinten tartjuk, miközben a sejtek korlátozás nélküli növekedését tartjuk fent. Az alkalmazott expressziős vektor megfelelő kialakításával, .a- fehérje nem kívánt, alapszintű expressziőja (amely a fehérjetermelés szabályozható promöterrendazerrel történő beindítása előtt szokott fellépni) gyakorlatilag szintén kiküszöbölhető, csakúgy, mint a néha szintén jelentőssé váló piazaíáveaztés, amely, mint azt mér fent jeleztük, szokványosán *««« Φ«χ« «Φ χχχχ ΦΦ * · X Φ * $ ♦ ΦΦ* ««» χ Φφφ * χ Φ Φ χ » «

ΦΦ X** ΦΦ Φ ** megfigyelhető lac-promőter'rendszert vagy más erős promótert alkalmazó expressziős rendszert használva a fehérjetermelést ez ,

Átlagosan 3-5 g/1 fehérjehozamok érhetők el körülbelül 25-35 órás tenyésztési idő után. Áz antitest-fragmensek esetében - előnyösen miniantitestekében, amelyek különösen érzékenyek a feltekeredés körülményeire - a .szintetizált anyagnak körülbelül 50%-a biológiailag aktív és helyesen feltekere.dett.

A találmány tárgyát képezi ennek megfelelően egy eljárás idegen fehérje előállítására az idegen gént és egy indukálható promotert hordozó plazmáddal transzformált £.. coli sejtekben, nagy sejt sűrűségű tenyésztés útján, első szakasznak megfelelő és betáplálásos szakasznak megfelelő fázisokat alkalmazva, anélkül, hogy a sejttömegnövekedést szuhsztrátük vagy anyagcsere-melléktermékek gátolnák, továbbá az expresszáit fehérje a tápközegből való izoláláséval és kitisztításával, és amely során a szubsztxátok koncentrációját a betáplálásos szakasznak megfelelő fázisban egy folyamatos, automata vagy félautomata elemző és hozzáadó rendszer alkalmazásával szabályozunk, amelyet az jellemez, hogy (i; a szénforrás koncentrációd át a tápközegben 0,1 g/i és 25 g/1 közötti koncemtrációtartamányban állandó szinten tartjuk, eközben a sejtek korlátozás nélküli szaporodását tartva fent (μ = μ«_;ώΧ) , iii? az idegen fehérje termelését a betáplálásos szakasznak megfelelő fázisban indítjuk he a promöter indukélásávul 10 g/i és 80 g/i közötti sejtsürüségnél, (iii) a termék szintézisének beindítása után folyamatosan - a sejtek számára hasznosítható - nitro•ϊ ϊ»”

- 12“ gént. és foszfátot, továbbá nyoméiemsőkat táplálunk vissza a rendszerbe, miközben (iv;· a pO^-érteket 5% ás 25% között tartjuk a teljes betápiálásos szakasznak megfelelő fázisban oxigént juttatva be a tápoldatba, alkalmas módon. A szénforrás koncentrációjának a találmány szerinti megoldás szerint megkívánt értékei - a betápiálásos szakasznak megfelelő fázisban - a 0,1 g/i és 25 g/i közötti tartományban vannak, előnyö-sen azonban a 0,5 g/1 és 15 g/1 közötti tartományban, előnyösebben az 1,0 és 5 g/i közötti, vagy az 1,0 g/i és 3 g/i közötti tartományban. A szénforrás koncentrációja különösen előnyösen 1,5· g/i. Előnyösen alkalmazható szénforrások a glükóz vagy a glicerin, vagy ezen két vegyület keverékei. A találmány szerinti megoldás során a szénforrást folyamatos módon P’on line) adtuk hozzá a tenyészethez, automata vagy félautomata elemző és hozzáadó rendszert alkalmazva. Előnyösen egy *on line' áramlási injektálásom analizáló rendszert FIA” alkalmazunk.

A sejtek számára hasznosítható nitrogén (előnyösen ammónia vagy ammóniumsö formájában), foszfát (például diammóniumhídrogénfoszfát vagy ammóniumdihídrogénfos2fát), és nyomelemek (például bőr-, mangán-, réz-, moiibdén-, kobalt-, vas- vagy olnksók, amelyeknek természetesen a tápközegben oldhatónak keli lenniük) tápanyagként való bejuttatását a betápiálásos szakasznak megfelelő fázisban végezzük, amely az 1, szakasznak megfelelő fázis után következik, előnyösen azután, hogy a fehérfeszíntézist a szabályozható promóter segítségével beindítottuk 50 g/i és 80 g/1 közötti sejtsürűségnél (száraz sejttömeggel számolva) , '♦**'* φφφ* φφ φφφ* *β * * φ * φ φ * »** «φφ « φφφ * * Φ X Φ Φ φ

XX φφ« φφ φ Φφ előnyösen 70 g/1 sejtsürüségnél, 100-150 g/1, előnyösen 14 0 g/I Összsejttömeg-növekedési sebességnél. ísic/i.

A találmány szerinti megoldás szerint a fehérjeszintézist a szabályozható promotérrendszer aktiválásával indítjuk be 10 g/1 és 80 g/1 közötti sejtsürüségnél, előnyösen 20 és 60 g/1 közötti sejtsűrűségnél, különösen előnyösen pedig 40 g/i és 60 g/l közötti sejtsűrűségnél.

A betáplálásos szakasznak xuegfelelö fázisban az oxigén parciális nyomását 5 és 251 között tartjuk, előnyösen 15% és 25% között, különösen előnyösen 20% értéken.

A találmány szerinti megoldás szerint a fermentációs tápközeg pH-jának a tenyésztés teljes ideje alatt pH - 6,5 és pH - 7,0 közé beállitottnak kell lennie, előnyösen pH ~ 6,7 és pH ~ 6,9 közé beáll Írottnak, különösen előnyösen pH ~ 6,8.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy, a fentinek megfelelő eljárás, amelyet zz jellemez, hogy egy olyan expressziós vektort alkalmazunk, amely egy, az idegen gént tartalmazó expressziős kazettát és azt szegélyező régióként két terminátor szekvenciát hordoz. Esek a terminátorszekvenciák, előnyösen a géntől S’-irányban elhelyezkedő, eredményesen megakadályozzák a fehérje expressziojának promótérrendszer által történő bekapcsolása előtti fehérjeexpressziét. A t^-tsrminátor előnyösen alkalmazható (Nohno HF és mtsai., 0. Bscferiol. 170, 4097-4102 /1088}) de más, ismert terminátorszekvenciákat is használhatunk.

A találmány tárgyát képezi továbbá olyan eljárás is, amely során egy öngyilkos rendszert is tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk. Az öngyilkos rendszer egy, ««X* X» ««♦* «X

X Φ « * » «

Χ· « *-♦·*

X « Φ Φ » * « *9 ίΧΦ «« V <« a sejt számára toxikus fehérjét termel, amennyiben a piazmrd nincs jelen a sejtben. Ilyen öngyilkos rendszerek ismertek. & technika állása szerint. Egy, a találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazható öngyilkos rendszer a hók •••sok-rendszer [például Gsrdes K., Biotechnoi, t, 14021405 (1988)J . Így tehát annak érdekében, hogy az eljárás során hatékonyan keletkezhessenek rekombínáns fehérjék (előnyösen antitest-molekulák), hogy a nagy sejtsűrűségű tartományban a gazdasejt/vektor-randszert nagy plasmidstsbiiitás, a rekombínáns termék alacsony alapexpresszíős szintje és nagy mennyiségű termék keletkezése jellemezzék. Ebben az összefüggésben az öngyilkos rendszerek, terminátor régiókkal szegélyezett rekombínáns expresszi-ős egységekkel kombina1va, ve kt or spéci f i kus ak.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy, a fentinek megfelelő eljárás, amelyet az jellemez., hogy egy, antitestfragmenst - előnyösen egy miniantitestet - kódoló idegen gént alkalmazunk.

A találmány tárgyát képszí továbbá egy eljárás, amely során a fentieken kívül az alábbiakban ismertetett tulajdonságokkal ís rendelkező- expressziős vektorokat alkalmazunk .

Elvileg, az ismert és a rekombináns technológia és ipari méretekben folyó termelés szempontjából megfelelő coli törzs alkalmazható a találmány szerinti megoldásban. Azok a törzsek alkalmazhatok azonban előnyösen, amelyek viszonylag kevés ecetsavat halmoznak föl szaporodásuk során, még akkor is·, amikor a sejtsürüség nagy. Azok a törzsek, amelyek kevesebb·, mint 5 g/1 éeétsavmennyiségei halmoznak föl, különösen előnyösek. Meglepő módon, az ecetsav .felhalmozödását különösen alacsony szinten lehet tartani a találmány szerinti eljárás során alkalmazott körülmények megfelelő megválasztásával. A jól ismert és kereskedelmi forgalomban hozzáférhető 1. coli törzs, az RV30S (ATCC 31608}, valamint -ugyanilyen hatású változatai különösen előnyösen alkalmazhatók abban a tekintetben.

A találmány tárgyát képezi tehát egy, megfelelő előnyös eljárás, amely során egy olyan E. coli törzset alkalmazunk., amely a fermentáció során a tápközegben kevesebb, mint 5 g/.l ec-etsav felhalmozódását eredményezi.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy £ coli expressziós vektor, amely alkalmas nagy sejtsürűségű fermentációs körülmények között is idegen fehérjék exprssszálására, és amelynek az alábbi jellemzői vannak:

íi) egy S'-végi terminátorszekvsncia és egy 3’-végi te rm i ná torsra k ve ne i a , (ii} lao-promóter- és operátorrendszer, _ iáUii) sgy T/glG Sh.íne Délgarno-szekvencia, íiv) pelB~ vagy orapA-szignáiszekvsncia, ív) az idegen gén szekvenciája, továbbá egy előnyös megvalósítási mód -szerint, egy -öngyilkos rendszer, előnyösebben a hók-sok öngyilkos rendszer.

A találmány szerinti megoldásban a promóterrendszert más, megfelelő rendszerekkel is helyettesíthetjük, például azokkal, amelyekre fent hivatkoztunk.. Hasonlóképpen, más szignálszekvenciák és szabályozószekvenciák is, amelyek hatása megegyezik a fentiekkel, a. találmány szerinti megoldás részét képezik.

:**«♦· ΦΦΦ* Φφ »»*«- ΦΦ * * « «.* Φ » »** Χ*Φ χ *♦« * ♦ » χ φ * Φ ** ΦΦΧ ν* φ Kfc

Végül, a találmány tárgyát képezi a pHKK expressziós vektor is (2. ábra}, amelyet megalkotásának folyamatával definiálunk- és amely egy,- az Kan~á2S~ből származó miniantitesfet kódoló szekvenciát tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá egy speciális, rekombináns £. coli gazdasejt, az RV308{pHKK.) is. A fenti plazmid és gazöatörzs a találmány előnyös megvalósítási módjai.

Az alábbiakban megadjuk az ábrák rövid leírását:

1. ábra: nagy sejtsűrüség körülményei kozott fehérjék előállítására alkalmas bioreaktor kísérleti elrendezése. A rendszer mérőkészülékkel, kijelzőkészülékkel, -szabálya zó készülékkel és egy adagolóberendezéssel van felszerelve.

2. ábra: az optimalizált expressziős vektor, a pHKKvektor és a megalkotása során felhasznált alkotórészei. A vektor lényegében az önmagukban ismert pASK40~, a pAKlOOés a pKG10£2-vektorok egyes alkotórészeiből van összeállítva Λ

3. (a-d; ábra: rekombináns £, roll RV3-0S[pHKX] sejtek HCD-tenyészete: a biomassza, az ammóniából vagy ammóniámsöból származó nitrogén, a foszfát, az ecetsav mennyiségének, illetve a keverési sebességnek, a pCy--nek, az Ct-nek és a CCb-nsk (az eltávozó gázban mérve), a plazmádstabil!fásnak (a B-iaktamáz-pozitiv telepek százalékos arányában kifejezve; és a fehérjetermelödésnek (ebben az esetben: az scFv_43Sdhlx)' az időbeli változása. Az első szakasznak megfelelő és a betápiálásos szakasznak megfelelő fázisokat 5 alfázzsra osztottuk fel. Az 'IPTG”-jelzésű nyilak a fehérjetermelés beindítását jelzik.

**** ff ff S ff «« fffffcff »* * ♦ ff ff * ff v ffffff ffffff φ »·**.

* ff ff * φ ff * #« ffffff ffff ff ff ff

A találmány szerinti eljárás során transzformált £. coli gazdasejteket alkalmazunk. A kiválasztott plazmidkonstrukciók az expresszáltatandó fehérje természetétől függnek. Az alább lakban ismertettük & plazmidkonstrukciók előnyös jellemzőit, A plazmídok megalkotásához és a gazdasejtek transzformálásához szükséges módszerek és eljárások mind ismertek, és szakember számára részletes kitanítást .nyújt a szakterület irodalma (például Samhrook és mtsai. ; ^W'A Láboratory Manual”, Cold S-p-ring Harbor (1989)}. Ezenfelül·,· az alkalmazott módszereket és eljárásokat a találmány egyes megvalósítási módjainak megfeleld példákban, is ismertetjük. A kiindulási plazmadók vagy azok részei vagy kereskedelmi forgalomban kaphatóak, vagy nehézség nélkül, standard módszerek alkalmazásával előállíthatcak ismert plazmád alkotási folyamatábrák alapján.

A transzformált E, roll sejtek találmány szerinti, tipikus fermentációja két. fázisa közül a korábbi, első szakasznak megfelelő fázis két alfáz.isra oszlik. Egy megfelelő előzetes tenyészettel való beoltást követően as I-aifázist egy késleltetési fázis Plag-phase’'; jellemzi, amelyben a sejtek alkalmazkodnak, ás szaporodási sebességük (μ) fokozatosan elérik a maxim.uti.o-t dr_;s;.J . A II-alfázis során a sejtek tömege exponenciálisan nő (u ~ sebességgel. Miután a pö; iOOb-os telítettségről 5-15%-ra csökken, egy pO_s szabályozó·· keverő készülék segítségévei a pO^-t beállítjuk, előnyösen 151 és 25% köze, előnyösen 20%-ra (3c ábra). Ezt a beállítást, 6-12 órával a fő tenyészet fermentációjának kezdete után célszerű elvégezni, oxigénben dúsított, levegő bejuttatásával. A giükő-zkoncentráció, amely kezdetben elő******* **** _φ** «

** <?* « XX nyösen 20 és 3-5 g/1 között volt, a Il-alfázis végére lecsökken, ami egyben a betápiálásos szakasznak megfelelő fázist megelőző első szakasznak megfelelő fázis végét jelenti, Ebben az összefüggésben a glükőzkoncentráelő értéke semmilyen körülmények között sem eshet le 0,1 g/1 alá. Innentől ezt a glükóz megfelelő betáplálásával biztosítjuk ílil-alfásís, 3-a ábra, a betápiálásos szakasznak megfelelő fázis kezdete) „ A találmány szerinti megoldásban a. glükóz értékét állandóan 0,1 g/i és 25 g/1 között tartjuk, előnyösen azonban 1 g/1 és 3 g/1 között. Erre a célra például, FSl-tápközeget (1. táblázat) alkalmazhatunk. Mivel ez a glükózkoncentrá.oió-tartomány elegendően távol esik a glükóz in-értékétől (Bergter, ’úáachstum von Mikroorganismen kiad. Gustav Fisoher Varian, Jena, 41, oldal (1983)], a sejtek sebességgel folytatják a szaporodást. & találmány szerinti megoldásban a glüközkoncentráciöt egy automata vagy félautomata rendszer alkalmazásával követjük és szabályozzuk. Áramlási injektálásos analizáló rendszerek on line üzemmódban különösen előnyösen alkalmazhatóak. A teljesen manuális vagy a nagymértékben manuális rendszerek nem megfelelőnknek bizonyultak. A betápiálásos szakasznak megfelelő fázis 15-22 óra elteltével kezdődik, ez azonban végső soron különböző egyedi faktorokon, például a hőmérsékleten, tápközeg összetételen, tápközeg koncentrácíóján, a reaktor méretén stb. múlik, leginkább azonban az alkalmazott E. colt törzs tulajdonságain. Előnyösen, az idegen fehérje szintézisét a betápiálásos szakasznak megfelelő fázis kezdetétől számítva körülbelül 4-8 óra múlva indítjuk be. A beindítás pontos ideje azonban végső soron a tenyészet sejtsü***$******* ******** *. *** * »«t«

X » «·.<»«'« 0 *♦ *«« -0» « 0*

- 19 rűségétöi függ, amelynek ekkorra el kell érnie egy bizonyos értéket, 10 és 80 g/1 közötti sejt.sűrűségek/ előnyösen 20 és 60 g/1 közötti sejtsürűségek különösen előnyösen alkalmazhatok, amennyiben 100 g/1 és 150 g/1 közötti végső sejtsűrűségeket érhetünk el. Következésképpen általában előnyös a fehérjeszintézist a maximális sejtsűrűség 10~60%~& elérésekor beindítani,

A fehérjeszintézis beindítása a szabályozható· promőterrendszer bekapcsolásával érhető el. Az alkalmazott rendszertől függően ez, a bekapcsolás általában valamilyen anyag hozzáadásával vagy egy fizikai mennyiség megváltoztatásával történik. Az előnyös iac-rendszer esetében (a rendszer elemei: prométer, operátor és indnkáiószer) a bekapcsolást 1PTG (izopropíi-tiogalakto-piranozld) hozzáadásával végezzük, A sejtek további növekedését most már csupán a felhalmozódó termék korlátozhatja. A találmány szerinti megoldás szempontjából fontos ezért, hogy az indukál.á.s előtt ne menjen végbe jelentős mértékű alapszintű expressziő, amelynek kedvezőtlen hatása lenne a teljes sejttömegnövekedésre és következésképpen a teljes hozamra, A találmány szerinti megoldás megvalósításakor ezt ügy érjük el, hogy hatékony terminátorszekvemciákkal szegélyezett expressziős egységet tartalmazd plazmidot tartalmazunk.

Attól a pillanattól kezdve, hogy glükózt kezdünk el betáplálni, a fermentációs tápközeg fokozatosan elszegényedik nitrogénban és foszfátban (3a és 3b ábrák), Annak érdekében, hogy minden típusú korlátozást elkerüljünk, előnyösen nitrogént és foszfátot is betáplálunk - a glükózhoz hasonlóan - egy megfelelő, folyamatos eljárással, A nitrogént y «« νχ.χ. v «?·<>

* * * » Φ * , V *»·,. ί*·„ ♦’ ♦»!

»* *»« »«· » χϊ előnyösen ammóninmsök formájában tápláljuk be, mivel ezen a módon egyidejűleg a pB-t is beállíthatjuk (6,5 és 7,0 közé, előnyösen ^,3-ras. Erre a célra megfelelő például az FS2oldat (1. táblázati. A IV. alfázist a találmány szerinti megoldásban nyomelemek (például bőr, mangán., vas, kobalt, moiibdén és cink) betáplálása jellemzi, oldható sók formájában. Ezek hozzáadását általában folyamatosan, állandó sebességgel végezzük. Az V. alfázíst lecsökkent sejttömegnövekedés jellemzi, főleg a termék felhalmozódásának következtében.. Ezen felül az ecetsav koncentrációjának kismértékű növekedését is megfigyelhetjük. Az ecetsav felhalmozódásának mértéke és az ecetsav koncentrációja azonban, meglepően alacsony a tápközegben. Ez szintén az eljárás speciális körülményeinek köszönhető. Olyan. (£. coli törzsek alkalmazása, amelyekre kevesebb, mint 5 g/1 maximális ecetsavfelhalmozódás a jellemző, számottevően tovább erősítik ezt.

a hatást.

A fehérje természetétől függően a fehérjehozam átlagosan 2 g/1 és 6 g/1 között változik. A fehérje természetétől függően ennek a mennyiségnek 50-95%-a biológiailag aktív fehérje. Antitest-fragiaensek esetében a fehérjemennyiség több itint SCd-át kaphatjuk meg újra fel feketedés kiváltásával ί rezeid) . Ezek az értékek j elentős xaértékben meghaladják azokat, amelyeket a technika állása szerint már eddig is ismert, összehasonlítható eljárások során kapunk.

A leírásban ismertetett eljárás antitest fragmensek, előnyösen mini.antite.stek, hatékony előállátására előnyösnek tekinthető, beleértve a speciálisan megalkotott, ss a találmány szerinti megoldás céljára kialakított expressziős plazmidokat is. Más fehérjéket is előállíthatunk azonban előnyösen a találmány szerinti megoldással, például fúziós fehérjéket vagy enzimeket. Ilyen, alkalmas fehérjék például a hibrid sztrepíokináz, a glukóz tíehidrogenáz, vagy véralvadásra ható fehérjék, például a hirudin, trombin, bementin vagy teromin.

1.- táblázat

A tápközeg összetétele; a tápközeget FS1-, FS2~ és PS3~oláatok alkotják, amelyeket a betsplálasos szakasznak megfelelő fázis különböző alfázisarban alkalmazunk.

	vegyület	Előzetes tenyésztés sétán a ik el íriszért táv- r e e ej	SS tenyésztés sétán alkalma- zott tápközeg	ESI rag/l	FS2 iag/I	FS3 X3/I
i	:öa_:H?Z_; x AOO	8fexlQ·'
z		üti	15.6x10“
3	s KAÜ -_:HZO₄		4x10⁵		227x10“
4	ίκιρηνο,				160.5x10“
5	Nád Cl	1x10“
6	HaCl	Sxi'h
7	oifcramxav		2 . 1x1 A
δ	- eitrát	60.0	7 S, 0			Sx 1 ÍI
	- hidrát
3	iíl	3.0	3. δ			250
10	'Mn Cl.ps 4'K₂O	IS. 0	18.S			125

1táblázat {folytatás)

11	ZO’ZÁxl H?O	8,4	10.5		700
12	ΟχΟΙΑΕ,Ο	1,5	1 .9		125
13	namvyxzmo	Λ C. /1. χ·'	3. 1		213
14	C o C1 :λ 6 Η10	2.5	3.1		213
IS	1;·. ( 02,000? ;;X2t;C	8, ö	10		668
1 ·&	glükóz	IQxIík	ZSxlík	670χΙ0³
17	UgSíyjtnyo	5öö'	i. óxiít	;19.8x10*
18	alapi cl 11 in	108	100

1. példa

A prototróf £. coli Kiz-törzset, az RV308~at (iádégairsil:oOPSOástrA) [Maurer és mtsai., J. Mól. Bioi, 159,

147-161 [1980? ; ATCC 31608) alkalmaztuk rekombináns E. coli gazdatörzs előállítására. Amennyiben az adott helyen nem. ismertetünk más eljárást, az sxpresszálásra alkalmas vektorral való transzformálást és minden más, szükséges DNSmunkát szokványos eljárások alkalmazásával végeztünk. Kontroliként plazmidmentes E. ocli 9V5C6-sejteket alkalmaztunk a nagy sejtsürOsegű fermentálás során.

A ρΗΚΚ-vektort a következőképp készítettük el üt ábra! : a pAKÍ'00-ből származó kisebbik Mlul-fragmenst [Krebber és Piückthan (1995)], amely egy erős transzkripciós § ^A terminátort - a t^-t - tartalmaz ÍNono és mtsai., lásd fent) a iac-promóter és operátor 5'-végi régiójában, a pASKlO-piazmidba ínszertáituk [Skerra és mtsai,, Broteehnol, 9, 273-278 (1991)]. A. hok-sok-DNS-t két további klónozási lépéssel ins-zertáltuk be: az aphA-gént kettős emésztéssel eltárol!tót tok a pKG1022-plazmádból t Gerd.es· (1983; , lásd fent] Ahol- el és E'coPl-el végzett kettős emésztéssel, a végeket feltöltettük DNS-pol.ímerá.z-1-el {'Klenow-fragme-nsi és üjraiigáitok. Egy második lépésben a pKGI022~hői származó- módosított BamHI-ffagmehst klónoztunk az első klónozási termék egyetlen Bambi-hasítási helyére. A miniantitest egy egyláncú antitest-fragmensből származott, amelyben a variábilis dóm-éneket - V_H-V·.-irányban agy flexibilis kepoícsrégiőhoz piinker”; (giy^serb csatlakoztattuk, amelyet a molekulában egy p-rol ínban gazdag csuklörégiö ű'hinge”) és sgy módosított hélix-kanyar-hélix-domén. íhelix-turn-helix-domaín”, dhlx) követ (Pack. és mtsai., Bioteehnol 11, 1271-1277 (1933)} . A BNS-sz-kvenciák, a iáncinditók, valamint a rágcsáló eredetű humanizált áíab-425 könnyű és nehéz láncának ampáitihálásai és klónozásai részletesen a WO92/IÖ683 számú nemzetközi közzétételi iratban vannak ismertetve. Annak érdekében, hogy biztosítsuk az sCFv425dhlx-fragmens pe-riplazmidba történő szekrécióját, a vk-domént N~terminális végén a p-elS-szignálszekvenciához fuzionálhattuk. A Tl'glO-ribos zómakötő helyet íShine Dalgarnoi PCA-eljárással klónoztuk a pEGl-plazmád Xbal- és Sfil-restrikciős helyeire (Strittaatter és mtsai., (1935;j. Az eredményképpen kapott scFv425dhlx~expressziös egységet az Xhai- és .RindlII-h&sitási helyekre klónoztuk. Ennek eredményeképpen kaptuk « pHKK expressziős vektort, amelyet a 2. ábrán mutatunk be·..

* »·#-χ

2. példa

Az 1. táblázat tartalmazza az Erlemeyer-lombikokban végzett előzetes tenyésztés során alkalmazott táp közegek összetételét, & keveröfoerendezéssel (Biostat FDlo, B. Braun, Bic-tech International, Heisungen, Németország; felszerelt tankreaktorban végzett főtenyésztés során alkalmazott tápközeg összetételét, és az FS1-, F52- és FS3~tápkozegek összetételét. A fő tápközeget (3 1} a Riesenberg és munkatársai -által alkalmazotthoz, képest módosítottuk [Riesenberg és mtsai. (1991; , lásd fent]. Annak érdekében, hogy megakadályozzuk a kicsapódást, ez összetevőket az 1. táblázatban feltüntetett módon adtuk hozzá a tápközeghez. A glükózt és a magnéziumszulfátot külön-külön autoklávozott oldatokként tápláltuk be. A reaktort 26 ^wC-on üzemeltettük, 0,15 mPa nyomással, pH 6,8-on és átlagosan 10 i/pere levegőztetés! sebességgel. A pH beállítására 25%-os vizes ammóniaoldatot használtunk. A fermentáció során ammóniát és óból cb-Nlio^-t {Fragoi Industrieschmlerstoffe GmbH, Mühlsim/Ruhr, Németország) adtunk a tenyészethez, szenzoros ellenőrzéssel, hogy szabályozzuk a pH-t és a habzásgétlő anyag mennyiségét (ebben a sorrendben;, Az FSl~t a következőképpen készítettük el; 750 g glükózt és 22,2 g magnézium-szulfát x 7 H_;;O-t oldottunk rendre, külön-külön 600 ml. HjO-ban és 50 mi Hűiben. Az oldatokat autoklávozás után összekevertük. Az FS2~t úgy készí tettük, hogy 227 g (AHA sHPíp-et és 169, 5 g (NHi) H/Flh-et oldottuk vízben, ugyanakkor 60 ml 25%-os ammóniát adva az oldathoz, annak érdekében, hogy a pH-t 6,8-ra állítsuk az autoklávozás előtt. Az FS3-t az alábbi törzseihatókból készítettük: 50 ml Fe(III; -cítrát-hídrát (6 g/1),

0, 5 ml	HjBCü	(30 g/ii , (	), 5 mi KnCi;. x 4H,Ó	(io g/iiu	0,5 ml
EDTA x	2X0	(84 g/ii, 0	,5 mi	Cuül- x 2HíO	(15 g/1),	0, 5	ml
KsXoO,	κ 2H;	0 (25 g/li,	0, 5 S	il CoCl.2 χ 2H;	?O (25 g/1)	és	10

ml Ón ÍCHsCOCJ 3 X 2H?0 (4 g/lj .

3, példa

LB-agarózon, 2€ X-on, petri csészében tenyésztett telepek közül jó néhányat használtunk fel. arra, hogy átoltsuk őket 2Ö ín! folyékony ib~tápkö zeg.be. öt óra rázstás után Í200 ford/pere, 2/ °C; s tenyészet 1 ml-ét vittük át 100 ml~be., előzetes tenyésztéshez készült tápközegbe, egy 000 ml-es edénybe, amit tovább inknbáitunk a fenti körülmények között. Ennek az előzetes tenyészetnek 10 ml-ét oltottuk ét egy új, előzetes tenyészethez készült tápközeg 100 ml-ébe. Ilyen módon 0 előzetes tenyészetet készítettünk, amelyeket együttesen 3 1, fő tenyésztéshez készült tápközegbe oltottunk be, a fermentorba, hogy ö'D_;.^ ~ 0,2 optikai sűrűségű kiindulási tenyészetet kapjunk.

i, példa

A 10 1-es bioreaktor elrendezése, kiegészítőkkel és szabályozó felszereléssel együtt, az 1. ábrán látható. A nagy sejtsűrűségű tenyésztést a fermentáció során egy digitális mérő- és szabályozóegység (’Mígital messuring and control unit, DCUi, egy több fermentor szabályozására alkalmas rendszer (multifermenter control system, MFCS5 és egy gázáram-szabályozó egység alkalmazásával valósítottuk meg. .Folyamatosan mértük a GO?- és az oxigénkibocsátást - A beoltást követően az Mk~3 biológiai mintagyűjtőt. (New Brunswick Scientific, VSatíord, Egyesült Királysági alkalmaztuk steril minták vételére, és az ^,:loff linX adatelemzés « X

- 26 megvalósítására [Webb és mtsai., Biotechnoi., 3, 926--923 (1990)1. A szabályozóegységek 10 1/perces belépő gásáramot tartottak fent, továbbá pH - 6, 8-at., 26 ‘^C-os hőmérsékletet és 0,15 mPa nyomást. Két szabályozó burok biztosította 32 aerób növekedési körülményeket .20%-os pOn-néi. A fermentáció teljes ideje alatt minden fontos fizikai mennyiséget mértünk és regisztráltunk.

A betápiáiásos szakasznak megfelelő fázisban a glükóz koncentrác lóját a tenyészetben 1,5 g/l-es szinten tartottuk, Erre a célra egy módosított áramlási injektál&sos analizáló berendezést (FlAstar 5020 analizáló berendezés fotométerrel és kimutatást végző szabályozó egységgel fölszerelve íTecator AB, Svédország;. A rendszer egyes részletei és működésének módja a technika állása szerint ismert [például Pfaff és mtsai., Computer Applications in Biotechnology'⁵ szerk. Munsch A. es Schageri K, kiad,

Elesvier Science Ltd., Oxford, 6-11 (19.95} 3 .

A sejtsűrűséget az optikai sűrűségből számítottuk, amelyet 550 nm-en mértünk. A plazxnidstabíütést Pack és munkatársai módszerével [1993, lásd fent; határoztuk meg.

5. példa

A szintetizált miniantitestek kvantitatív meghatározását Back és munkatársai (1993, lásd fent) módszerével végeztük. A működőképes mimiantítestek mennyiségét ELISA segítségévei határoztuk meg, az összmennyíségüket pedig SDSPAGE-vel 12 -os poliakrriamid-gélben, Laemmlí módszerével (1970)., a kapott gélt elemezve. Az ELI SA~ vizsgál átok során jí.urdkh..

mikrotiter-tálcákat burkoltunk emberi receptorral * , .

vyp,··-··' (például WO 92/15633 számú nemzetközi közzétételi irat), ától .is ti φ «ΦΦ ♦ φ « * *:* ♦-«.»

ΦΦΦ kötött miniantitesteket scFv425· elleni, nyúl ben készült szérummal és peroxiö&zhoz konjugált kecskeeredetű, nyűi XgG elleni ellenanyaggal (Jackson Immunoresearch Inc., USA} mutattuk ki. Az aktív miniantitestek hozamát a tisztított miniantitestekből késtűit hígítás! sor segítségével számítottuk ki. Agy kontroll-kísérletben kimutattuk, hogy az. scFv42.5 elleni nyúlszérum nem mutat semmilyen megfigyelhető keresztreakciót a plazmidmentes £. coli RV3Ö8-sejtek nyers kivonatának más összetevőivel. Továbbá, amikor ezt a nyers kivonatot hozzáadtuk az ugyanazon antitest tisztított formájából készített hígítás! sorhoz, ez semmilyen hatással nem. bírt az ELISA-jelekre. A miniantitestek teljes mennyiségének meghatározása érdekében a géleket Aromásaié rriiiiunt hlye festékkel festettük, fotometriásan elemeztük, és a miniantitastek koncentrációját «gy, a tisztított miniantitestektől készült hígítás! sor alapján számítottuk ki a higitási sornak megfelelő mintákat ugyanazon a gélen megfuttatva. Kön troli ként itt is az £. coli gazdasejtek analóg módon készített elegyét használtuk, amely gazdasejtek nem termeitek miniantítesteket.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás idegen fehérje előállítására idegen gént és indukálható promötert hordozó plazmáddal transzfermáit A, coli sejtekben, nagy sejtsürűségű tenyésztés útján, első szakasznak megfelelő és betáplálásos szakasznak megfelelő fázisokat alkalmazva·, anélkül, hogy a sejttömegnövekedést ssubsztrátok vagy anyagcsere-melléktermékek gátolnák, továbbá az expresszált fehérje a tápkdzegből való izolálásával. és kitisztításával, és amely tenyésztés során a ezubsztrátok koncentrációját a betáplálásos szakasznak megfelelő fázisban egy folyamatos, automata vagy félautomata elemző és hozzáadó rendszer alkalmazáséval szabályozzuk, arzal jellemezve, hogy (i) a szénforrás koncentrációját a tápközegben Ö,1 g/1 és 25 g/1 közötti konoentráciötartományban állandó szinten tartjuk és ezzel a sejtek korlátozás nélküli szaporodását tartjuk fent (μ - u^)·, (ii) az idegen fehérje termelését a betáplálásos szakasznak megfelelő fázisban indítjuk be a promőt-er indukálásával 10 g/1 és 80 g/1 közötti sejtsűrűségnél, iiiií a termék szintézisének beindítása után folyamatosan - a sejtek számára hasznosítható - nitrogént és foszfátot, továbbá nyomelemsókat táplálunk be a rendszerbe, miközben (ív) a teljes betáplálásom szakasznak megfelelő fázisban megfelelő módon oxigént juttatunk be a tápoldatba és ezáltal a pO_s-értéket 51 és:

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás,· azzal jellemezve, hogy a széniorrás koncentrációját a betápiáissos szakasznak megfelelő fázisban az 1 g/i és 3 g/1 közötti tartományban állandó értéken tartjuk.

2.5% között tartjuk.

»* «V

3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jelleme.sve, hogy az 50 g/1 és 80 g/1/sejtsürűségnéi nitrogént, foszfátot és nyomelemeket adunk a tenyészethez.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az I. igénypont szerinti iii) lépésben az idegen fehérje termelését 20 g/1. és 60 g/1 közötti sejtsűrűségnél indítjuk be.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a betáplálás-ős szakasznak megfelelő fázisban 100 g/1 és 150 g/1 közötti sejtsűrűséget érünk el.

6. Az 1-5, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmáddal transzformáit E. coli sejtként egy, két tsrminátorszekveneía által szegélyezett, idegen gént tartalmazó expressziös egységet hordozó expresszzős vektort tartalmazó coli sejtet alkalmazunk.

7. A 6, igénypont szerinti elzárás, azzal jellemezve, hogy expressziős vektort tartalmazó £. coli sejtként egy öngyilkos rendszert, előnyösen hok-sok öngyilkos rendszert is tartalmazó expressziős vektor hordozó £. coli sejtet alkalmazunk.

8. A 0. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy idegen gént tartalmazó expresszién vektor hordozó r. coli sejtként egy antitestfragmenst kódoló idegen gént, előnyösen egy miniantitestet kódoló idegen gént ’*** «χ 0 X 0 0 φχ*0 0« * * * 0 0 0 * *» *'*% *** * *** *♦ x*0 X* φ <0* *' - 30 * * tartalmazó expressziós vektort hordozó- £. coli sejtet alkalmazunk

9. Az 1-4, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy expressziós vektort hordozó fi coll sejtként a 12-16. igénypontok' bármelyike szerinti expressziós vektort hordozó zh roll sejtet alkalmazzuk.

ló.

Az 1-9. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy £, toll törzsként a fermentációs fázisban a tápközegben nem több mint 5 g/1 ecetsavat felhalmozó x. coli törzset alkalmazunk.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás., azzal jellemezve, hogy x, coli törzsként az RV3öS~törzset (ATCC 31608;

alkalmazzuk.

12. x. coll expressziós vektor, amely alkalmas nagy sejtsűrűségű fermentációs körülmények között is idegen fehérjék expresszáiására, és amely az alábbi jellemző részeket tartalmazza;

(i) egy 5‘-végi terminátorszekvencia és egy 3’-végi t e rminá törsz ekvsnc ia, i ii} lac-nrcmőter/cperátor-rendszer, g.

(ixi) egy Tiglö-Shine-Dáigarno-szekvencia, iiv; peis- vagy ompA-szignáiszekvenoia, ív) zdegen génszekvencia

13. A 12. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy egy öngyilkos rendszert, előnyösen hok-sok öngyilkos rendszernek megfelelő szekvenciát is tartalmaz.

14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy az S^!-végi terninácorszskveneia a és a 3'-végi terminátorszekvencia a **** φ V * « « « »

15. Α 12-14. igénypontclt bármelyike szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy «2 idegen gén egy miniantitest 7_Κlánoát és a. Ιό-láncát kódoló szekvenciát tartalmaz.

16. pHKK-jelü expressziős vektor, amelynek szerkezeti vázlata 2. ábrán látható.

17. Transzformált ő. coli BV308[pHKK) expressziós gazdasejt, amely az RV308 ÍATCC 31608) gazdasejt 14. igénypont szerinti expressziós vektorral való transzformálásával állítható elő.