PL185665B1 - Sposób wytwarzania obcego białka, wektor ekspresyjny i transformowany gospodarz - Google Patents
Sposób wytwarzania obcego białka, wektor ekspresyjny i transformowany gospodarzInfo
- Publication number
- PL185665B1 PL185665B1 PL96327188A PL32718896A PL185665B1 PL 185665 B1 PL185665 B1 PL 185665B1 PL 96327188 A PL96327188 A PL 96327188A PL 32718896 A PL32718896 A PL 32718896A PL 185665 B1 PL185665 B1 PL 185665B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- coli
- growth
- biotechnol
- sequence
- plasmid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 32
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title claims description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 64
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 26
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 23
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 20
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 claims description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 108091033454 Hok/sok system Proteins 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 9
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 7
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 claims description 6
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 6
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 6
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 5
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 5
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims 3
- 101100408912 Arabidopsis thaliana TOPP5 gene Proteins 0.000 claims 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 2
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 claims 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims 2
- 108010048816 AraC Transcription Factor Proteins 0.000 claims 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 claims 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims 1
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 claims 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 claims 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 claims 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 claims 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 claims 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 claims 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 claims 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 claims 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical class [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N ammonia nh3 Chemical compound N.N XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical class [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-propan-2-ylsulfanyloxane-3,4,5-triol Chemical compound CC(C)SC1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000387 ammonium dihydrogen phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 101150090396 aphA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000004883 computer application Methods 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 108010005808 hementin Proteins 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- 102000045108 human EGFR Human genes 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229910052718 tin Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011135 tin Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000002912 waste gas Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1 . Sposób wytwarzania obcego bialka w komórkach E. coli, transformowanych plazmidem przy uzyciu fermenta- cji o wysokiej gestosci komórkowej przez etapy wsadu i zasilanego wsadu bez jakiegokolwiek ograniczenia wzro- stu przez substraty lub metaboliczne produkty uboczne, oraz wyodrebnienia i oczyszczenia ekspresjonowanego bialka z pozywki hodowli, przy czym stezenie substratów w fazie zasilanego wsadu jest regulowane i/lub sterowane przez ciagly automatyczny lub pólautomatyczny uklad analizy i dozowania, znam ienny tym , ze w fazie zasilane- go wsadu (i) jest utrzymywane stale stezenie zródla wegla w pozywce w obszarze miedzy 0,1 g/l i 25 g/l przy za- chowaniu nieograniczonego wzrostu komórek (p = ( µ m ax), (ii) produkcja obcego bialka w obrebie wyzej wspomnia- nej fazy zasilanego wsadu przy gestosci komórkowej mie- dzy 10 i 80 g/l jest zapoczatkowywana przez indukowanie promotora, a (iii) po wykonanym indukowaniu syntezy produktu stosowany azot i fosforan oraz sole pierwiastków sladowych sa dostarczane w sposób ciagly, przy czym (iv) podczas calej fazy zasilanego wsadu wartosc pO2 utrzymy- wana jest przez odpowiednie wprowadzanie tlenu do brzeczki fermentacyjnej miedzy 5 i 25%, przy czym plazmid jest no- snikiem obcego genu i indukowalnego promotora. F ig . 2 PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania obcego białka w komórkach E. coli, transformowanych plazmidem przy użyciu fermentacji o wysokiej gęstości komórkowej przez etapy wsadu i zasilanego wsadu bez jakiegokolwiek ograniczenia wzrostu przez substraty lub metaboliczne produkty uboczne, oraz wyodrębnienia i oczyszczenia ekspresjonowanego białka z pożywki hodowli, przy czym stężenie substratów w fazie zasilanego wsadu jest regulowane i/lub sterowane przez ciągły automatyczny lub półautomatyczny układ analizy i dozowania, polegający na tym, że w fazie zasilanego wsadu (i) jest utrzymywane stałe stężenie źródła węgla w pożywce w obszarze między 0,1 g/1 i 25 g/1 przy zachowaniu nieograniczonego wzrostu komórek (μ = pmax), (ii) produkcja obcego białka w obrębie wyżej wspomnianej fazy zasilanego wsadu przy gęstości komórkowej między 10 i 80 g/1 jest zapoczątkowywana przez indukowanie promotora, a (iii) po wykonanym indukowaniu syntezy produktu stosowany azot i fosforan oraz sole pierwiastków śladowych są dostarczane w sposób ciągły, przy czym (iv) podczas całej fazy zasilanego wsadu wartość pO2 utrzymywana jest przez odpowiednie wprowadzanie tlenu do brzeczki fermentacyjnej między 5 i 25%, przy czym plazmid jest nośnikiem obcego genu i indukowalnego promotora.
Korzystnie stężenie źródła węgla podczas fazy zasilanego wsadu utrzymuje się w zakresie między 1 i 3 g/1.
Korzystnie azot, fosforan i pierwiastki śladowe dodaje się przy gęstości komórkowej między 50 i 80 g/1.
Korzystnie gęstość komórkowa według (ii) określonego wyżej wynosi 20 do 60 g/L
Korzystnie w fazie zasilanego wsadu mogą być osiągnięte gęstości komórkowe między 100 i 150 g/1.
Korzystnie jako plazmid stosuje się wektor ekspresji z kasetą ekspresji zawierającą gen obcy ograniczony przez dwie sekwencje terminatora.
Korzystniej użyty wektor ekspresji zawiera dodatkowo układ „samobójczy”, zwłaszcza układ „samobójczy” hok-sok.
Korzystniej stosuje się gen obcy, kodujący fragment przeciwciała, zwłaszcza miniprzeciwciało.
Korzystnie jako plazmid stosuje się wektor ekspresyjny dla E. coli do ekspresji obcych białek w warunkach fermentacji o wysokiej gęstości komórkowej posiadający następujące elementy:
(i) sekwencja terminatora „w górę” i „w dół”, (ii) układ promotor lac/operator, (iii) sekwencja T7gl0-Shine-Dalgamo, (iv) sekwencja sygnałowa pelB lub ompA,
185 665 (v) sekwencja genu obcego zawierająca sekwencję kodującą łańcuch VH i VL miniprzeciwciała.
Korzystniej stosuje się wektor zawierający dodatkowo układ „samobójczy”, zwłaszcza sekwencję układu „samobójczego” hok-sok. Korzystniej sekwencją terminatora „w górę” jest tHp, a sekwencją terminatora „w dół” jest ttpp.
Korzystnie stosuje się wektor oznaczony jako pHKK według schematu konstrukcji przedstawionej na rys. 2.
Korzystnie stosuje się szczep E. coli, który podczas fazy fermentacji nagromadza nie więcej niż 5 g/1 octanu w pożywce hodowli.
Korzystniej stosuje się szczep E. coli RV308 (ATCC 31608).
Przedmiot wynalazku stanowi również wektor ekspresyjny dla E. coli do ekspresji obcych białek w warunkach fermentacji o wysokiej gęstości komórkowej, charakteryzujący się tym, że posiada następujące elementy:
(i) sekwencja terminatora „w górę” i „w dół”, (ii) układ promotor lac/operator, (iii) sekwencja T7gl0-Shine-Dalgamo, (iv) sekwencja sygnałowa pelB lub ompA, (v) sekwencja genu obcego zawierająca sekwencję kodującą łańcuch VH i VL miniprzeciwciała.
Korzystnie wektor zawiera dodatkowo układ „samobójczy”, zwłaszcza sekwencję układu „samobójczego” hok-sok. Korzystnie sekwencją terminatora „w górę” jest Thp sekwencją terminatora „w dół jest ttpp.
Korzystnie wektor jest wektorem oznaczonym jako pHKK według schematu konstrukcji przedstawionej na rys. 2.
Przedmiotem wynalazku jest także transformowany gospodarz ekspresyjny E. coli RV308 charakteryzujący się tym, że zawiera wektor ekspresyjny oznaczony jako pHKK według schematu konstrukcji przedstawionej na rys. 2.
Szczegółowy opis wynalazku
Przedmiotem ujawnienia jest zatem sposób wytwarzania obcej proteiny w komórkach E.coli, transformowanych obcym genem i plazmidem będącym nośnikiem indukowalnego promotora, przy użyciu fermentacji o wysokiej gęstości komórkowej przez etapy wsadu i zasilanego wsadu bez jakiegokolwiek ograniczenia wzrostu przez substraty lub metaboliczne produkty uboczne, i wyodrębnienia i oczyszczenia ekspresjonowanej proteiny z pożywki do hodowli, przy czym stężenie substratów w fazie zasilanego wsadu jest sterowane przez ciągły automatyczny lub półautomatyczny układ analizy i dodawania, przy czym w fazie zasilanego wsadu (i) jest utrzymywane stałe stężenie źródła węgla w ośrodku w obszarze między 0,1 g/1 a 25 g/1 przy zachowaniu nieograniczonego wzrostu komórek (μ = pmax), (ii) produkcja obcej proteiny w obrębie wyżej wspomnianej fazy zasilanego wsadu jest zapoczątkowana przy gęstości komórkowej między 10 i 80 g/1 przez indukcję promotora, oraz (iii) po dokonanej indukcji syntezy produktu wykorzystywany azot oraz fosforan jak również sole pierwiastków śladowych są dostarczane w sposób ciągły, przy czym (iv) podczas całości fazy zasilanego wsadu wartość pO2 jest ustawiona między 5 i 25% przez odpowiednie doprowadzanie tlenu do brzeczki fermentacyjnej .
Zgodne z ujawnieniem wartości wymaganego stężenia źródła węgla podczas fazy zasilanego wsadu mieszczą się w zakresie miedzy 0,1 g do 25 g/1. Korzystny obszar jest między 0,5 a 15 g/1, zwłaszcza między 1,0 do 5 g/1, względnie między 1,0 do 3 g/1. Szczególnie korzystne stężenie wynosi 1,5 g/1. Jako źródło węgla należy korzystnie wymienić glukozę lub glicerynę lub ich mieszaniny. Dodawanie źródła węgla następuje przy użyciu automatycznego lub półautomatycznego układu dodawania i analizy w sposób ciągły (on-line). Korzystnie stosuje się układ analityczny przepływowej iniekcji wstrzykowej w trybie on-line.
Doprowadzanie stosowanego azotu, korzystnie azotu amonowego i fosforanu, np. wodorofosforanu diamonowego lub diwodoro-fosforanu amonowego, oraz pierwiastków śladowych, np. rozpuszczalnych w pożywce soli boru, manganu, miedzi, molibdenu i kobaltu żelaza lub cynku, odbywa się w fazie zasilanego wsadu następującej po fazie wsadu, korzystnie
185 665 po włączeniu syntezy proteiny przez regulowalny promotor przy gęstości komórkowej od 50 do 80 g/1 suchej biomasy), korzystnie przy około 70 g/1 przy całkowitej szybkości wzrostu od 100 do 150, zwłaszcza 140 g/1. Włączenie syntezy proteiny przez aktywowanie układu regulowalnego promotora następuje według wynalazku przy gęstości komórkowej od 10 do 80 g/1, korzystnie między 20 do 60 g/1, a zwłaszcza w obszarze od 40 do 60 g/1. Ciśnienie cząstkowe tlenu w fazie zasilanego wsadu wynosi między 5 i 25%, korzystnie między 15 i 25%, a zwłaszcza około 20%.
Wartość pH pożywki fermentacyjnej podczas całości wsadu ustawia się między 6,5 i 7,0, korzystnie między 6,7 i 6,9, a zwłaszcza około 6,8.
Ponadto przedmiotem ujawnienia jest odpowiedni sposób, w którym stosuje się wektor ekspresji z kasetą ekspresji zawierającą gen obcy ograniczony dwiema sekwencjami terminatora po bokach. Te sekwencje terminatora, zwłaszcza sekwencja umiejscowiona „w górę” skutecznie uniemożliwiają niepożądaną ekspresję proteiny przed włączeniem przez układ promotora. Szczególnie nadaje się terminator thP (Nohno i in., 1988, J. Bacteriol. 170, 40974102), lecz można zastosować także inne znane sekwencje terminatora.
Ponadto przedmiotem ujawnienia jest sposób, w którym stosowany wektor ekspresji zawiera dodatkowo układ „samobójczy”. Układ „samobójczy” wytwarza proteinę, która bez istnienia plazmidu w komórce jest dla niej toksyczna. Odpowiednie układy „samobójcze” są znane w literaturze. Układem „samobójczym” szczególnie odpowiednim jest układ hok-sok (np. Gerdes K., 1988, Biotechnol. 6, 1402-1405). W sposobie dla skutecznego tworzenia protein rekombinacyjnych, zwłaszcza cząsteczek przeciwciał jest mianowicie ważne, by układ wektora gospodarza w obszarze o wysokiej gęstości komórkowej charakteryzował się wysoką stabilnością plazmidu, nieznaczną rekombinacyjną ekspresją podstawową i znacznym tworzeniem produktu. Układy „samobójcze” w kombinacji z rekombinacyjnymi są przy tym specyficzne dla wektora przez kasety ekspresji otoczone przez terminatory.
Ponadto przedmiotem ujawnienia jest odpowiedni sposób, w którym stosuje się gen obcy, który koduje fragment przeciwciała, zwłaszcza miniprzeciwciała.
Ponadto przedmiotem ujawnienia jest sposób, w którym stosuje się wektory ekspresji o dodatkowych, niżej opisanych cechach. Zasadniczo stosowalna jest większość znanych szczepów E. coli, odpowiednich dla techniki rekombinacyjnej i dla produkcji w skali technicznej. Korzystnie stosuje się takie szczepy, które przy wzroście do dużych gęstości komórkowych nagromadzają stosunkowo mało octanu. Szczególnie odpowiednie są szczepy o nagromadzeniu octanu poniżej 5 g/1. Nieoczekiwanie okazało się, że przez dobrane warunki opisanego sposobu można utrzymywać nagromadzenie octanów na szczególnie niskim poziomie. Ze względu na to szczególnie odpowiedni jest ogólnie znany i dostępny handlowo szczep E. coli RV308 (ATCC 31608) oraz jego odmiany o jednakowym działaniu.
Przedmiotem ujawnienia jest w szczególności odpowiedni sposób, w którym stosuje się szczep E. coli o nagromadzeniu octanu poniżej 5 g/1 w pożywce hodowli podczas fermentacji. Przedmiotem ujawnienia jest ponadto wektor ekspresji E. coli odpowiedni dla ekspresji obcych protein w warunkach fermentacji o dużej gęstości komórkowej, który ma następujące cechy:
(i) sekwencja terminatora „w górę” i „w dół”, (ii) układ promotor lac/operator, (iii) sekwencja T7gl0-Shine-Delgamo, (iv) sekwencja sygnałowa pelB lub ompA, (v) sekwencja genu obcego, a w korzystnej formie wykonania dodatkowo, układ „samobójczy”, zwłaszcza układ „samobójczy” hok-sok.
Układ promotora można zastąpić także przez inne odpowiednie, np. wyżej wymienione układy. Również inne jednakowo działające sekwencje sterujące lub sygnałowe są objęte ujawnieniem. Jako szczególne formy wykonania, przedmiotem ujawnienia są wektor ekspresji pHKK (rys. 2) określony przez swoją konstrukcję, zawierający sekwencje dla miniprzeciwciała, wyprowadzonego z Mab 425, oraz szczególny rekombinacyjny gospodarz E. coli RV308[pHKK].
185 665
Objaśnienie rysunków
Rysunek 1: Eksperymentalna próbna budowa bioreaktora dla wytwarzania protein w warunkach wysokiej gęstości komórkowej. Układ wyposażono w urządzenie do pomiaru, wskazania, kontroli i dozowania.
Rysunek 2: Zoptymalizowany wektor ekspresji pHKK oraz części jego konstrukcji. Wektor zasadniczo składa się z elementów znanych wektorów pASK.40, pAKlOO i pKG1022. Rys. 3(a-d): Hodowla HCD rekombinacyjnego E. coli na przykładzie E. coli RV3O8[pHKK]: czasowy przebieg biomasy, glukozy, azotu amonowego, fosforanu, octanu, szybkości mieszadła, pOz, O2 i CO2 w gazach odlotowych, stabilność plazmidu (wyrażona w % kolonii βlaktamazo-dodatnich) i tworzenie proteiny (tu: scFv425dhlx). Fazy wsadu i zasilanego wsadu są podzielone na 5 podfaz. Strzałka IPTG podaje początek produkcji proteiny.
Sposób według wynalazku stosuje transformowane komórki E. coli. Wybrane konstrukcje plazmidu są ukierunkowane na rodzaj ekspresjonowanej proteiny. Szczególnie korzystne cechy takich konstrukcji plazmidu opisano poniżej. Techniki i metody wymagane dla konstrukcji plazmidu i transformacji komórek gospodarza są wszystkie znane i wyczerpująco opisane w literaturze (np. Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor). Przedstawiono je na podstawie szczególnych form wykonania wynalazku w przykładach. Wyjściowe plazmidy są dostępne handlowo lub można jest łatwo skonstruować standardowymi metodami na podstawie znanych schematów konstrukcyjnych.
Wstępnie włączona faza wsadu typowej fermentacji według wynalazku transformowanych komórek E. coli jest podzielona na dwie podfazy. Po zaszczepieniu odpowiedniej hodowli wstępnej podfaza I cechuje się fazą Lag, w której komórki przystosowują się i szybkość wzrostu μ następnie wzrasta do p-max. Podczas podfazy II komórki wzrastają wykładniczo przy μ = pmax. Po spadku pO2 ze 100% nasycenia do poniżej 5-15%, wartość pO2 jest poprzez kontrolę szybkości mieszadła pO2 ustawiona korzystnie na wartości pO2 między 15 do 25%, zwłaszcza około 20% (Rys. 3b). To ustawienie (przez wprowadzenie powietrza wzbogaconego czystym tlenem) należy wykonać po około 6 do 12 h po rozpoczęciu fermentacji głównej hodowli. Stężenie glukozy, które początkowo wynosi między 20 a 35 g/1, obniża się do końca podfazy II, która oznacza też koniec fazy wsadu włączonej przez fazą zasilanego wsadu. Przy tym wartości 0,1 g/1 nie powinny w żadnym wypadku zmniejszyć się poniżej 0,1 g/1. Od tego momentu jest to uniemożliwione przez odpowiednie dostarczanie glukozy (Podfaza III, Rys. 3a, Początek fazy zasilanego wsadu). Zgodnie z wynalazkiem jest utrzymywana stała wartość glukozy między 0,1 i 25 g/1, korzystnie między 1 i 3 g/1. Stosuje się tu np. pożywkę zasilającą FS1 (Tab. 1). Ponieważ ten zakres stężenia glukozy jest dużo wyżej od wartości Ks dla glukozy (Bergter, 1983, „Wzrost mikroorganizmów”, str. 41, Gustav Fischer Verlag, Jena), komórki mogą dalej rosnąć przy pmax. Kontrola i regulacja stężenia glukozy następuje według wynalazku przy użyciu układu automatycznego lub półautomatycznego. Szczególnie odpowiednie są układy analizatora przepływowej iniekcji wstrzykowej działające w trybie on-line. Układy czysto manualne lub w znacznym stopniu manualne okazały się niekorzystne. Faza zasilanego wsadu rozpoczyna się między około 15 a 22 godziną co ostatecznie zależy od różnych indywidualnych czynników takich jak temperatura, skład i stężenie pożywek, wielkości reaktora itd., a zwłaszcza też od rodzaju użytego szczepu E. coli. Korzystniej około 4 do 8 godzin po rozpoczęciu fazy zasilanego wsadu następuje włączenie syntezy obcej proteiny. Dokładny moment czasowy jest ostatecznie ukierunkowany na gęstość komórkową osiągniętą do tego momentu. Szczególnie korzystne są gęstości komórkowe między 10 i 80 g/1, zwłaszcza między 20 i 60 g/1 w przypadku gdy mogą być osiągnięte końcowe gęstości komórkowe od 100 do 150 g/1. Dla rozpoczęcia syntezy proteiny jest korzystne, jeśli do momentu indukcji występuje około 10 do 60% maksymalnej osiąganej gęstości komórkowej. Na syntezę proteiny oddziaływa włączenie regulowalnego układu promotora. To włączenie następuje według zastosowanego układu z reguły przez dodanie substancji lub przez zmianę wielkości fizycznej. W przypadku korzystnego układu lac (promotor, operator, induktor) przez dodanie IPTG (izopropylotio-galaktopiranozyd). Dalszy wzrost komórek jest obecnie ograniczony jedynie przez nagromadzający się produkt. Dlatego według wynalazku jest ważne, by przed indukowaniem nie zachodziła żadna znaczna ekspresja podstawowa, która wpływałaby niekorzystnie
185 665 na całkowity wzrost i tym samym na całkowitą wydajność. Według wynalazku uzyskuje się to w ten sposób, że kaseta ekspresji w plazmidzie ma w sąsiedztwie aktywne sekwencje terminatora. Od momentu dostarczania glukozy pożywka fermentacyjna staje się uboższa w azot i fosforan (Rys. 3a, b). Aby uniknąć ograniczeń wszelkiego rodzaju, korzystnie azot i fosforan są również podawane w odpowiedniej metodzie ciągłej. Azot jest korzystnie doprowadzany w postaci soli amonowych, ponieważ dzięki temu można również wpływać na wartość pH (6,0 do 7,0, korzystnie 6,8). Przydatny jest np. roztwór FS2 (Tab. 1). Podfaza IV charakteryzuje się zgodnym z wynalazkiem dostarczaniem pierwiastków śladowych (np. boru, manganu, żelaza, kobaltu, molibdenu, cyny) w postaci rozpuszczalnych soli. Dodanie następuje z reguły w sposób ciągły ze stała prędkością. Podfaza V charakteryzuje się zmniejszonym wzrostem, w pierwszym rzędzie uwarunkowanym przez nagromadzenie produktu. Ponadto można zaobserwować nieznaczny wzrost stężenia octanu. Niemniej nagromadzenie względnie stężenie octanu w pożywce jest zaskakująco niskie. Wynika to ze szczególnych warunków sposobu. Szczepy E. coli o maksymalnym wzbogaceniu < 5 g/1 podczas fermentacji efekt ten jeszcze bardziej wzmacniają. Wydajności proteiny zmieniają się zależnie od rodzaju proteiny przeciętnie między 2 i 6 g/1. Z tej ilości, biologicznie czynnych jest między 50 i 95%, zależnie od rodzaju proteiny. W przypadku fragmentów przeciwciała uzyskuje się ponad 80% ponownie fałdowanej proteiny. Wartości te wyraźnie przewyższają porównywalny sposób dotąd opisany według stanu techniki.
W szczególności przy użyciu, przedstawionego sposobu można w odniesieniu do skontruowanych i dopasowanych specjalnie do tego celu plazmidów ekspresji wytwarzać skutecznie fragmenty przeciwciał, zwłaszcza miniprzeciwciała. Jest jednak również możliwe wytwarzanie wielu innych protein, protein fuzyjnych lub enzymów zgodnie ze sposobem według wynalazku w korzystny sposób. Przykładami takich odpowiednich protein są: hybrydostreptokinaza, glukozodehydrogenaza lub także proteiny, działające na krzepnięcie krwi, jak np. hirudyna, trombina, hementyna lub teromina.
Tabela 1
Skład pożywek; FS1, FS2 i FS3 są pożywkami zasilającymi zastosowanymi w różnych podfazach fazy zasilanego wsadu.
| Związek | Pożywka hodowli wstępnej mg/1 | Pożywka hodowli głównej mg/1 | FS1 mg/1 | FS2 mg/1 | FS3 mg/1 | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 1. | Na2HPO4 x 2H2O | 8.6 χ1θ’ | ||||
| 2. | k2hpo4 | 3 xl03 | 16.6x10’ | |||
| 3. | (NH4)2HPO4 | 4x10’ | 227 x10’ | |||
| 4. | (NH4)2HPO4 | 169.5x10’ | ||||
| 5. | nh4ci | 1x10’ | ||||
| 6. | NaCl | 5 xl02 | ||||
| 7. | Kwas cytrynowy | 2.1 xl0’ | ||||
| 8. | Hydrat cytrynianu Fe(III) | 60.0 | 75.0 | 5x10’ | ||
| 9. | H,BO, | 3.0 | 3.8 | 250 | ||
| 10. | MnCl, x 4H2O | 15.0 | 18.8 | 125 | ||
| 11. | EDTA x 2H,O | 8.4 | 10.5 | 700 | ||
| 12. | CuCl2 x 2H2O | 1.5 | 1.9 | 125 |
185 665 ciąg dalszy tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 13. | Na2MO4 x 2H2O | 2.5 | 3.1 | 213 | ||
| 14. | CoC12 x 6H2O | 2.5 | 3.1 | 213 | ||
| 15. | Zn(CH3COO)2 x 2H2O | 8.0 | 10 | 668 | ||
| 16. | Glukoza | 10xl03 | 25 xl03 | 670x103 | ||
| 17. | MgSO4 x 7H2O | 600 | 1.5 xl03 | 19.8 xl03 | ||
| 18. | Ampicylina | 100 | 100 |
Przykład 1
Do wytwarzania rekombinacyjnego gospodarza E. coli zastosowano prototropowy szczep E. coli-ΥΛΊ RV308 (lac74-galISII: OP308strA) , (Maurer i in., 1980, J. Mol. Biol. 139, 147-161; ATCC 31608). Transformacja przy użyciu wektora odpowiedniego do ekspresji jak również wszystkie inne niezbędne manipulacje DNA wykonano, o ile nie podano inaczej, według metod standardowych. Do kontroli odpowiedniej fermentacji o wysokiej gęstości komórkowej użyto bezplazmidowe komórki E. coli RV308. Wektor pHKK skonstruowano jak następuje (Rys. 2): mały fragment z pAKlOO (Krebber i Pluckthun, 1995) zawierający silny terminator transkrypcyjny ϊηρ (Nohno i in., patrz wyżej) w obszarze „w górę” od lac p/o, wstawiono do plazmidu pASK40 (Skerra i in., 1991, Biotechnol. 9, 273-278). Wstawienie hok-sok DNA wykonano przez dwa dalsze etapy klonowania: gen aphA z pKG1022 (Gerdes, 1988, patrz wyżej) usunięto przez dwukrotne trawienie Xhol i EcoRI, uzupełniono polimerazą DNA I (fragment Klenowa) i ponownie ligowano. W drugim etapie zmodyfikowany fragment BamHI z pKG1022 klonowano w jedyne miejsce cięcia BamHI pierwszego produktu klonowania. Miniprzeciwciało pochodzi z jednołańcuchowego fragmentu, w którym zmienne domeny w kierunku VH-VL związano z giętkim linkerem (gly4ser)3, po czym następował bogaty wprolinę obszar Hinge oraz zmodyfikowana domena „helix-tum-helix” (dhlx) (Pack i in., 1993, Biotechnol. 11, 1271-1277). Sekwencje DNA, primer, wzmocnienia i klonowania lekkiego i ciężkiego łańcucha mysiego/humanizowanego Mab 425 wyczerpująco opisano w 92/15683. W celu wydzielenia fragmentu scFv425dhlx do periplazmy domenę VH N-końca poddano fuzji do sekwencji sygnałowej pelB. Miejsce wiązania rybosomów T7gl0 (Shine Dalgamo) sklonowane za pomocą metodyki PCR w miejsca cięcia Xbal i Sfil pEGl (Strittmatter i in., 1955). Gotową kasetę ekspresji sc-Fv425dhlx sklonowano między miejscami cięcia Xhal i Hindlll. Powstał z tego wektor ekspresji pHKK według rys. 2.
Przykład 2
Składy pożywek dla hodowli wstępnych w kolbie Erlenmayera, hodowli głównej w reaktorze zbiornikowym wyposażonym w mieszadło mechaniczne (Biostat EDI00, B. Braun, Biotech International, Melsungen, RFN) oraz pożywki zasilające FS1, FS2 i FS3 zestawiono w tabeli 1. Pożywkę hodowli głównej (8 1) zmodyfikowano w porównaniu do pożywki podanej w pracy: Riesenberg i in., 1991 (patrz powyżej). Aby zapobiec wytrącaniu, składniki dodano w porządku podanym w tabeli 1. Glukozę i siarczan magnezu dodano jako oddzielnie autoklawowane roztwory. Reaktor zastosowano w 26°C, przy ciśnieniu 0,15 Mpa, przy wartości pH 6, 8 i przeciętnej szybkości przewietrzania 10 1/min. Do nastawienia wartości pH użyto 25% wodny roztwór amoniaku. Podczas fermentacji dodano przy użyciu kontroli sensorowej amoniak iUcolub NI 15® (Fragol Industrieschmierstoffe GmbH, Miihlheim/Ruhr, RFN) dla regulacji pH i jako środek przeciwpieniący, odpowiednio. FS1 wytworzono jak następuje: 750 g glukozy i 22,2 g MgSO4 x 7H2O oddzielnie rozpuszczono w 600 ml wzgl. 50 ml wody. Po dokonanym autoklawowaniu roztwory wzajemnie zmieszano. FS2 wytworzono przez rozpuszczenie 227 g (NH4)2HPO4 i 169.5 g (NH4)H2PO4 w wodzie przy dodaniu 60 ml 25% NH3, aby przed autoklawowaniem nastawić wartość pH na 6,8. FS3 przyrządzono z roztworów macierzystych w następującym porządku: 50 ml Fe(III)-cytrynianhydrat ( 6 g/1). 0,5 ml H3BO3 (30 g/1), 0,5 ml MnCb x 4H2O (10 g/1), 0,5 ml EDTA x 2H2O
185 665 (84 g/1), 0,5 ml CuCl2 x 2H2O (15 g/1), 0,5 ml Na2MoO4 x 2H2O (25 g/1), 0,5 ml CoCl2 x 2H2O (25 g/1) i 10 ml Zn(CH3COO)2 x 2H2O (4 g/1).
Przyk ład 3
Szereg kolonii z szalki Petriego, wyrosłych na agarze LB w 26°C posłużyło do tego, by zaszczepić 20 ml płynnej pożywki LB. Po 5 godzinnym wytrząsaniu (200 obr/min, 26°C) wprowadzono 1 ml do 100 ml pożywki hodowli wstępnej w 500 ml kolbie i następnie inkubowano. 10 ml tej hodowli wstępnej użyto, aby zaszczepić 100 ml nowej pożywki hodowli wstępnej. W ten sposób wytworzono 9 hodowli wstępnych wykorzystanych do tego, by zaszczepić 8 1 pożywki hodowli głównej w fermentatorze z początkowym OD550 « 0,2.
Przyk ład 4
Budowę bioreaktora 10 1 z wyposażeniem i urządzeniami kontrolnymi przedstawiono na rys. 1. Hodowlę w skali fermentacji o wysokiej gęstości komórkowej wykonano przy użyciu cyfrowej jednostki pomiarowo-kontrolnej (DCU), układu kontrolnego multifermentatora (MFCS) i jednostki kontrolnej przepływu gazu. Wydzielanie CO2 i tlenu było stale mierzone. Po wszczepieniu kolektor biopróbek ΜΧ-3 (New Brunswick Scientific, Watford, UK) służył do tego, by pobrać aseptyczne próbki i umożliwić analizę danych w trybie on-line (Webb i in., 1990, Biotechnol. 8, 926-928). Jednostki kontrolne utrzymywały szybkość dopływu gazu 10 1/min, wartość pH 6,8, temperaturę 26°C oraz ciśnienie 0,15 MPa, Dwie pętle kontrolne gwarantowały tlenowe warunki wzrostu przy wartości pO2 20%. Wszystkie ważne wartości fizyczne podczas całej fermentacji wskazywano i zapisywano.
Podczas fazy zasilanego wsadu stężenie glukozy w hodowli utrzymywano przy 1,5 g\l. W tym celu zastosowano zmodyfikowany przyrząd do analizy przepływowej iniekcji wstrzykowej (analizator FIAstar 5020 z fotometrem i jednostką kontrolną detekcji, Tecator AB, Szwecja). Szczegóły tego układu i jego trybu pracy opisano według stanu techniki (z.B. Pfaff i in., 1995 w: Munack A., Schugerl K. (red.): Computer Applications in Biotechnology, Elsevier Science Ltd., Oxford, 6-11). Gęstość komórkową obliczono na podstawie pomiaru gęstości optycznej przy 550 nm. Stabilność plazmidu oznaczono według: Pack i in., 1993 (patrz wyżej).
Przyk ład 5
Ilościowe oznaczenie zsyntetyzowanych miniprzeciwciał wykonano według metody Packa i in., 1993 (patrz powyżej). Ilość zdolnych do funkcjonowania miniprzeciwciał oznaczono za pomocą ELISA, całkowitą ilość miniprzeciwciała za pomocą SDS-PAGE w 12% żelu poliakryloamidowym według Laemmli (1970), a następnie przez skanowanie żelu. Dla prób ELISA płytki do mikromiareczkowania pokryto ludzkim receptorem EGFR (np. z WO 92/1568-3). Związane miniprzeciwciała wykryto przy użyciu antysurowicy scFv425 królika i IgG przeciwkróliczego kozy sprzężonego z peroksydazą (Jackson Immunoresearch Inc, USA). Wydajność czynnych miniprzeciwciał obliczono z serii rozcieńczeń oczyszczonych miniprzeciwciał. Kontrola wykazała, że antysurowica królika scFv425 nie wykazuje dającej się ustalić reakcji krzyżowej z innymi składnikami pozbawionego plazmidu surowego ekstraktu E. coli RV308. Ponadto, dodatek tego ekstraktu do serii rozcieńczeń takiego samego przeciwciała w oczyszczonej formie nie miało wpływu na sygnały ELISA. Dla określenia całkowitej ilości miniprzeciwciał wykryto fotometrycznie żele zabarwione błękitem Brilliant Coomassie i stężenie miniprzeciwciał obliczono z serii rozcieńczeń oczyszczonego miniprzeciwciała, które zebrano na tym samym żelu. Do celów kontrolnych służyła analogiczna próba z zastosowaniem komórek gospodarza E. coli, które nie produkowały miniprzeciwciał.
185 665
Fig.3c
Wsad
Zasilany-wsad | III . IV । V | _ (g) pO 2 - mieszadło jdDpOz-GF, 1 © FIA - glukoza ,H*P , ślady
Czas hodowli (h)
185 665
Fig.3α
Fig.3b
Czas hodowli (h)
185 665
O U) Φ □ o μ ω g Φ m Φ O O o Λ > Ο C >ι Φ β 93
Φ m s 0) ι
Φ φ τη •Η ο C Φ Φ Ν Ν ·Η 93 rH Φ Φ Ν β Μ Ν Φ -Η Ν S c Φ 3 >1 3 O .C o. 0) N S4 Λ
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (19)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania obcego białka w komórkach E. coli, transformowanych plazmidem przy użyciu fermentacji o wysokiej gęstości komórkowej przez etapy wsadu i zasilanego wsadu bez jakiegokolwiek ograniczenia wzrostu przez substraty lub metaboliczne produkty uboczne, oraz wyodrębnienia i oczyszczenia ekspres jonowanego białka z pożywki hodowli, przy czym stężenie substratów w fazie zasilanego wsadu jest regulowane i/lub sterowane przez ciągły automatyczny lub półautomatyczny układ analizy i dozowania, znamienny tym, że w fazie zasilanego wsadu (i) jest utrzymywane stałe stężenie źródła węgla w pożywce w obszarze między 0,1 g/1 i 25 g/1 przy zachowaniu nieograniczonego wzrostu komórek (μ = pinax), (ii) produkcja obcego białka w obrębie wyżej wspomnianej fazy zasilanego wsadu przy gęstości komórkowej między 10 i 80 g/1 jest zapoczątkowywana przez indukowanie promotora, a (iii) po wykonanym indukowaniu syntezy produktu stosowany azot i fosforan oraz sole pierwiastków śladowych są dostarczane w sposób ciągły, przy czym (iv) podczas całej fazy zasilanego wsadu wartość pO2 utrzymywana jest przez odpowiednie wprowadzanie tlenu do brzeczki fermentacyjnej między 5 i 25%, przy czym plazmid jest nośnikiem obcego genu i indukowalnego promotora.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie źródła węgla podczas fazy zasilanego wsadu utrzymuje się w zakresie między 1 i 3 g/1.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że azot, fosforan i pierwiastki śladowe dodaje się przy gęstości komórkowej między 50 i 80 g/1.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gęstość komórkowa według (ii) z zastrz. 1 wynosi 20 do 60 g/1.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w fazie zasilanego wsadu mogą być osiągnięte gęstości komórkowe między 100 i 150 g/1.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako plazmid stosuje się wektor ekspresji z kasetą ekspresji zawierającą gen obcy ograniczony przez dwie sekwencje terminatora.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że użyty wektor ekspresji zawiera dodatkowo układ „samobójczy”, korzystnie układ „samobójczy” hok-sok.
- 8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się gen obcy, kodujący fragment przeciwciała, zwłaszcza miniprzeciwciało.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako plazmid stosuje się wektor ekspresyjny dla E. coli do ekspresji obcych białek w warunkach fermentacji o wysokiej gęstości komórkowej posiadający następujące elementy:(i) sekwencja terminatora „w górę” i „w dół”, (ii) układ promotor lac/operator, (iii) sekwencja T7gl0-Shine-Dalgamo, (iv) sekwencja sygnałowa pelB lub ompA, (v) sekwencja genu obcego zawierająca sekwencję kodującą łańcuch VH i VL miniprzeciwciała.
- 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający dodatkowo układ „samobójczy”, zwłaszcza sekwencję układu „samobójczego” hok-sok.
- 11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że sekwencją terminatora „w górę” jest ϊηρ , a sekwencją terminatora „w dół” jest ttpp.
- 12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się wektor oznaczony jako pHKK według schematu konstrukcji przedstawionej na rys. 2.
- 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się szczep E. coli, który podczas fazy fermentacji nagromadza nie więcej niż 5 g/1 octanu w pożywce hodowli.
- 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się szczep E. coli RV308 (ATCC 31608).185 665
- 15. Wektor ekspresyjny dla E. coli do ekspresji obcych białek w warunkach fermentacji o wysokiej gęstości komórkowej, znamienny tym, że posiada następujące elementy:(i) sekwencja terminatora „w górę” i „w dół”, (ii) układ promotor lac/operator, (iii) sekwencja T7gl0-Shine-Dalgamo, (iv) sekwencja sygnałowa pelB lub ompA, (v) sekwencja genu obcego zawierająca sekwencję kodującą łańcuch VH i VL miniprzeciwciała.
- 16. Wektor według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera dodatkowo układ „samobójczy”, zwłaszcza sekwencję układu „samobójczego hok-sok.
- 17. Wektor według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że sekwencją terminatora „w górę jest top, a sekwencją terminatora „w dół” jest tLpp.
- 18. Wektor według zastrz. 15, znamienny tym, że jest wektorem oznaczonym jako pHKK według schematu konstrukcji przedstawionej na rys. 2.
- 19. Transformowany gospodarz ekspresyjny E. coli RV308 znamienny tym, że zawiera wektor ekspresyjny oznaczony jako pHKK według schematu konstrukcji przedstawionej na rys. 2.* * *Wynalazek dotyczy sposobu fermentacji z zasilanym wsadem ze specjalnymi układami wektor-gospodarz E. coli w celu efektywnego tworzenia protein rekombinacyjnych, zwłaszcza rekombinacyjnych cząsteczek przeciwciał, w szczególności fragmentów przeciwciał, jak np. miniprzeciwciała.W warunkach według wynalazku komórki E. coli mogą rosnąć z maksymalną właściwą szybkością wzrostu aż do bardzo wysokich gęstości. Po włączeniu tworzenia produktu rekombinacyjnego, jedynie tworzony produkt działa ograniczająco na wzrost; nie następuje ograniczenie wzrostu przez substraty ani przez metaboliczne produkty uboczne. W ten sposób i w połączeniu ze specjalnie tu dopasowanymi i wykazującymi wysoką stabilność nowymi wektorami ekspresji można osiągnąć wysokie wydajności przestrzeń- czas protein rekombinacyjnych, które wykazują dużą aktywność biologiczną zwłaszcza w przypadku fragmentów przeciwciał.Zasadniczym warunkiem skutecznego tworzenia protein rekombinacyjnych jest hodowla komórek E. coli do dużej gęstości komórkowej. Następujące hodowle służące do tego celu należą do stanu techniki: Po nieograniczonym wzroście (μ = pmax) w fazie wsadu, w następującej po tym fazie zasilanego wsadu zwykle dozuje się źródło węgla (glukoza lub gliceryna), tak że unika się tworzenia inhibitujących wzrost produktów ubocznych jak np. octan, co ma tę konsekwencję, że następnie wzrost aż 5 do osiągnięcia wysokich gęstości komórkowych można kontynuować jedynie przy ograniczeniu substratu (μ < μπ13χ) (np. Riesenberg i in., 1991, J. BiotechnoL, tom 20, 17-28; Strandberg i in., 1994. FEMS Microbiol. Rev. tom 14, 53-56; Kórz i in., 1995. J. Biotechnol. 39, 59-65; EP-B-0 511 226). Wzrost przy zmniejszonej szybkości wzrostu daje oczywiście długie czasy fermentacji, i w następstwie także mniejsze wydajności przestrzeń-czas. W przypadku tych fermentacji wskutek natychmiastowego zużywania, stężenie źródła węgla w roztworze pożywki wynosi prawie zero. Po włączeniu tworzenia produktu rekombinacyjnego nic się nie zmienia w stosunkach ograniczonych przez substrat.Znane są także hodowle z zasilanym wsadem z E. coli, w przypadku których źródło węgla jest dodawane w sposób nieciągły w większych odstępach czasu, a następnie w większych ilościach, przy czym jako wskaźnik wyczerpania substratu dla zapoczątkowania następującego po tym dozowania źródła węgla przeważnie stosuje się wzrost wartości pO2 (np. Eppstein i in, 1989.BiotechnoL 7, 1178-1181). Ten sposób postępowania oznacza częstą zmianę długookresowych warunków nadmiaru substratu do warunków ograniczenia substratu i tym samym implikuje nierównowagi metaboliczne.Poniżej będą rozpatrywane hodowle z zasilanym wsadem, w których komórki w fazie zasilanego wsadu mogą rosnąć z maksymalną właściwą szybkością wzrostu (μ = pmax). Ho185 665 dowie z zasilanym wsadem, w których po oznaczeniach w trybie „off-line” dodaje się większe ilości źródła C w większych odstępach czasu w trakcie hodowli dla uniknięcia ograniczeń substratu, wymagają dużych nakładów eksperymentalnych i mają tę wadę, że podczas całej fermentacji stężenie źródła C stale ulega zmianie (np. Pack i in., 1993, Biotechnol., 11, 12711277, Hahm i in., 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 100-107). Opisano także hodowle z zasilanym wsadem, w których stężenie źródła C jest mierzone i regulowane w trybie on-line, tak że unika się ograniczeń, chociaż są one - zwłaszcza w obszarze dużej gęstości komórkowej obarczone niżej opisanymi wadami. Ostatnio opisano biosensor glukozowy możliwy do użycia w autoklawie zastosowany do fermentacji mikroorganizmów w fermentatorach z mieszalnikiem (M.R.Phelps i in., 1995. Biotechnol. Bioeng., tom 46, 514-524). Zastosowano go do hodowli E. coli. Ten sensor in situ dostarcza z opóźnieniem czasowym około 2 min aktualną wartość w roztworze, gdzie prowadzona jest hodowla. Sygnał dostarczony od sensora glukozy jest zależny m.in. od pH i pO2. W obszarze dużej gęstości komórkowej X > 80 g/1 sensor nie został przebadany. Zgodnie z doświadczeniem obrośnięcie sond in situ przez E. coli przy bardzo wysokich gęstościach komórkowych może prowadzić do błędnych wartości. Ponadto sensor podczas bieżącej fermentacji nie jest dokładnie rekalibrowalny. Inne metody nie opierają się na pomiarach sensorem in situ, lecz są oparte np. na oznaczeniu źródeł węgla za pomocą analizatorów przepływowej iniekcji wstrzykowej on-line (FIA) lub HPLC w trybie online w roztworze hodowli pozbawionym komórek, który pobrano w sposób pół-ciągły z fermentatora i poddano sączeniu lub mikrowirowaniu (Kleman i in., 1991. Appl. Environ. Microbiol. 57, 910-917 i 918-923; Turner i in., 1994. Biotechnol. Bioeng. 44, 819-829). Algorytmy kontrolne przewidywania i sprzężenia zwrotnego zmniejszają wahania stężenia glukozy przy wzroście do X = 65 g/1 (Kleman i in., 1991, Appl. Environ. Microbiol. tom 57, 910-917). W obszarze bardzo wysokich gęstości komórkowych (od około 80 g/1 do 150 g/1) rozdzielanie komórek i pożywki jest coraz trudniejsze i czasochłonne, tak że wzrasta także opóźnienie czasowe dla określenia aktualnych wartości glukozy w fermentatorze zależnie od biomasy i sprawia, że utrzymanie stałego poziomu glukozy jest bardzo trudne lub niemożliwe. Natomiast przy stałym i krótkim opóźnieniu czasowym stężenie glukozy jest mierzone za pomocą aparatury rezygnującej z tego rozdzielania komórek (Pfaff i in., 1995, s. 6-11 w: Proceedings of the 6th International Conference on Computer Appl. in Biotechnol. Garmisch-Partenkirchen, RFN). Według Pfaff i in. w bezpośredniej bliskości miejsca pobierania próbek po rozcieńczeniu hodowli inhibitorem wzrostu stosuje się FIA z enzymatyczno-amperometrycznym sensorem glukozowym. W przypadku hodowli tlenowcowej komórki E. coli, które nie zostały zmuszone przez tryb dozowania do wzrostu ograniczonego przez substrat, zwykle tworzą znacznie metaboliczny produkt uboczny octan (Riesenberg 1991. Curr. Opinion Biotechnol., tom 2, 380-384), który akumuluje się w pożywce i w większych ilościach działa inhibitująco na wzrost (Pan i in., 1987, Biotechnol. Lett, tom 2, 89-94). Dlatego dotychczas hodowle z zasilanym wsadem prowadzone do osiągnięcia dużych gęstości komórkowych są możliwe jedynie w przypadku szczególnych szczepów E. coli, w przypadku których nagromadzenie octanu zostało zredukowane przez ukierunkowane zmiany genetyczne przy tolerowaniu innych związanych z tym cech niekorzystnych. Do pochodnych E. coli K-12 należą mutanty fosfotransacetylazoujemne (Bauer i in., 1990. Appl. Environ. Microbiol, tom 56, 1296-1302; Hahm i in., 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol., tom 42, 100-107), które jednak są silnie zredukowane pod względem wzrastania w pożywkach glukoza - sól mineralna. Pheips i wsp. (patrz powyżej) zastosowali w charakterze gospodarza szczep TOPP5 E. coli dla hodowli nie ograniczonej przez substrat do biomasy X = 85 g/1. Ten szczep E. coli, który widocznie nie nagromadza silnie octanu, nie jest jednak szczepem K-12. E. coli TOPP5 tworzy hemolizynę i jest przez to szczepem patogennym, który ze względów bezpieczeństwa nie wchodzi w rachubę jako gospodarz dla tworzenia rekombinacyjnych produktów DNA w sektorze przemysłowym. Przez transformację komórek E. coli przy użyciu plazmidu, zawierającego gen kodujący syntazę acetolooctanową (ALS), można było przez ukierunkowaną reorientację pośredniej przemiany materii osiągnąć zmniejszenie nagromadzania octanu (San i in., 1994 w: Ann. N.Y. Acad.Sci., 721, 257-267). Ten sposób postępowania jest jednak obarczony wadą taką że przy użyciu plazmidu kodującego ALS w połączeniu z drugim plazmidem, będącym nośnikiem185 665 genu „produkcji”, w warunkach wysokiej gęstości komórkowej występują zwykle niestabilności. Wskutek niestabilności plazmidu, występujących w stopniu nasilonym zwłaszcza przy hodowli do zbyt wysokich gęstości komórkowych, skuteczność tworzenia rekombinacyjnych produktów często ulega obniżeniu.Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, takie jak Fab', F(ab')2, miniprzeciwciała lub Fv o pojedynczym łańcuchu uzyskują w coraz większym stopniu znaczenie w dziedzinie medycyny i biotechnologii. Przez miniprzeciwciała rozumie się poniżej według wynalazku dwuwartościowy lub dwuspecyficzny fragment Fv o pojedynczym łańcuchu związany przez obszar pseudo-Hinge. W tym przypadku może być ważne, jak np. przy leczeniu raka, by dysponować dużymi ilościami przeciwciał (około łg/dawkę) .W E. coli można szczególnie łatwo i dobrze wytwarzać jednowartościowe fragmenty przeciwciał lub ich proteiny fuzyjne, względnie ich odmiany multimerowe bądź multispecyficzne. Te fragmenty względnie odmiany cechuje mała wielkość w połączeniu z wysoką wiązalnością specyficzną (np. Pliickthun A., 1992, Immunol. Rev. 130, 151-188; Pack i in., 1995, J. Mol. Biol. 246, 28-34). Proteiny, a zwłaszcza przeciwciała muszą być jednak prawidłowo pofałdowane, aby być aktywnymi biologicznie i funkcjonalnie. Należy na to zwracać uwagę przy rozpatrywaniu wydajności utworzonego fragmentu przeciwciała na komórkę w związku z gęstością komórkową. Ponadto ważną rolę odgrywa pierwotna sekwencja przeciwciała przy określeniu wydajności in vitro i przy fałdowaniu in vivo (Knappik A. i Pliickthun A., 1995, Protein Engin. 8, 81-89). Tak np. fragmenty Fab są ekspresjonowane jako nierozpuszczalne agregaty cytoplazmatyczne lub periplazmatyczne i ponownie składane in vitro. Podawano wydajności około 0,14 g/1 przy niskiej gęstości komórkowej (Condra i in., 1990, J. Biol. chem. 265, 2292-2295) i do około 12 g/1 nierozpuszczalnych przeciwciał przy średniej gęstości komórkowej (Shibui i in., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 770-775). Można również otrzymać dwuwartościowe miniprzeciwciała (Pack i in., 1993, Biotechnol. 11, 1993, 1271-1277) w formę funkcjonalnej biologicznie z wydajnościami około 0,2 g/1 w E. coli. Przeciętnie przy tych wydajnościach około 5-45% jest ponownie pofałdowane stosownie, do uporządkowania.W znanych układach E. coli tworzenie obcej proteiny jest z reguły włączane w odpowiedni sposób po osiągnięciu właściwych gęstości komórkowych zgodnie z układem ekspresji przez regulowalny układ promotora. Należy tu np. wymienić (i) promotor araBAD w obecności represora AraC (indukowalny przez arabinozę) (np. Better i in., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90, 457-461), (ii) promotor phoA (indukowalny przez usunięcie fosforanu) (np. Carter i in, 1992, Biotechnol. 10, 163-167), i (iii) układ promotora lac (indukowalny przez IPTG) (Pack i in., 1993, 1 .c.). Układ lac, powodujący z reguły dobrą ekspresję, ma jednak tę wadę, że z jednej strony obserwuje się niepożądaną ekspresję podstawową przed indukcją promotora, a z drugiej strony niestabilność plazmidyny po indukcji za pomocą IPTG.W szczególnej formie wykonania wynalazku opisuje się specjalny wektor (pHKK), który jako gen obcy zawiera sekwencje kodujące fragmenty przeciwciała mysiego względnie humanizowanego Mab 425. Mab 425 (ATCC HB 9629) jest mysim przeciwciałem monoklonalnym, które wyodrębniono ze znanej ludzkiej linii komórkowej nowotworu A432 (ATCC CRL 1555) i wiąże się do epitopu ludzkiego epidermalnego receptora czynnika wzrostu (EGFR, glikoproteina około 170 kD), wiąże się przy inhibitowaniu wiązanie naturalnego ligandu EGF. Wykazano, że Mab 425 ma działanie cytotoksyczne na komórki nowotworu, względnie może zahamować ich wzrost (Rodeck iin., Cancer Res. 1987, 47; 3692) Z WO 92 92/15683 są znane humanizowane lub chimeryczne formy Mab 425, włączając w to sekwencje DNA i aminokwasów w ich lekkich i ciężkich łańcuchach. Celem wynalazku było zatem dostarczenie sposobu wytwarzania obcych protein, zwłaszcza fragmentów przeciwciał, w rekombinacyjnych komórkach E. coli w warunkach wysokiej gęstości komórkowej (HCDC = ang. High Celi Density Culture) z wysokimi wydajnościami przestrzeń-czas i bez zasadniczego ograniczania wzrostu przez substraty lub metabolity i bez znacznych strat plazmidu względnie niestabilności plazmidu przy zagwarantowaniu znacznego procentu aktywności biologicznej (zdolność wiązania,prawidłowe fałdowanie) ekspresjonowanej proteiny. Sposób według wynalazku jest wieloetapowym procesem wsadowym, cechującym się przede wszystkim tym, że komórki podczas całego wsadu mogą maksymalnie rosnąć (μ = pmax). Przy użyciu opisanego185 665 sposobu gęstości komórkowe mogą osiągnąć 100-150 g/1 (sucha biomasa). Wzrost nie jest też zasadniczo inhibowany przez nagromadzanie octanu, ponieważ nieoczekiwanie w wybranych warunkach nie jest ono szczególnie uwidocznione, zwłaszcza przy zastosowaniu szczepów E. coli, które w każdym przypadku mają tendencję do zmniejszonego tworzenia octanu podczas fermentacji. Przy szeregu innych dodatkowych posunięciach osiąga się to przede wszystkim w ten sposób, że w fazie zasilanego wsadu (następującej po fazie wsadu) jest utrzymywane stałe stężenie źródła węgla w pożywce w określonym zakresie przy zachowaniu nieograniczonego wzrostu komórek. Przez odpowiednie ukształtowanie odpowiedniego wektora ekspresyjnego można także niemal wykluczyć niepożądaną ekspresję podstawową proteiny przed włączeniem syntezy proteiny przez regulowalny układ promotora, jak również częściowo znaczną utratę plazmidu, który, jak wspomniano wyżej, w normalnych przypadkach w układach ekspresji można zaobserwować z silnymi promotorami jak np. układ promotora lac. Można osiągnąć przeciętnie wydajności protein od 3 do 5 g/1 po ok. 25 do 35 godzinach całkowitej hodowli. W przypadku fragmentów przeciwciał szczególnie krytycznych wskutek ich kryteriów fałdowania, w szczególności miniprzeciwciał, około 80% zsyntetyzowanego materiału jest biologicznie czynne i prawidłowo fałdowane.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95119478 | 1995-12-11 | ||
| PCT/EP1996/005260 WO1997021829A1 (de) | 1995-12-11 | 1996-11-28 | Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen in e. coli mittels hochzelldichte-fermentation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL327188A1 PL327188A1 (en) | 1998-11-23 |
| PL185665B1 true PL185665B1 (pl) | 2003-06-30 |
Family
ID=8219878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96327188A PL185665B1 (pl) | 1995-12-11 | 1996-11-28 | Sposób wytwarzania obcego białka, wektor ekspresyjny i transformowany gospodarz |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6410270B1 (pl) |
| EP (1) | EP0866876B1 (pl) |
| JP (2) | JP4101879B2 (pl) |
| KR (1) | KR100444735B1 (pl) |
| CN (1) | CN1117160C (pl) |
| AR (1) | AR005035A1 (pl) |
| AT (1) | ATE213271T1 (pl) |
| AU (1) | AU716612B2 (pl) |
| BR (1) | BR9611937A (pl) |
| CA (1) | CA2240097C (pl) |
| CZ (1) | CZ291415B6 (pl) |
| DE (1) | DE59608743D1 (pl) |
| DK (1) | DK0866876T3 (pl) |
| ES (1) | ES2171752T3 (pl) |
| HU (1) | HU227945B1 (pl) |
| NO (1) | NO319090B1 (pl) |
| PL (1) | PL185665B1 (pl) |
| PT (1) | PT866876E (pl) |
| RU (1) | RU2201455C2 (pl) |
| SI (1) | SI0866876T1 (pl) |
| SK (1) | SK283169B6 (pl) |
| UA (1) | UA61066C2 (pl) |
| WO (1) | WO1997021829A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA9610384B (pl) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9715895D0 (en) | 1997-07-29 | 1997-10-01 | Zeneca Ltd | Heterocyclic compounds |
| US7858339B1 (en) | 1998-10-28 | 2010-12-28 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| DE60138127D1 (de) | 2000-11-03 | 2009-05-07 | Genentech Inc | Stoffwechseländerungen in gärungen zur produktion rekombinanter proteine |
| DE60230147D1 (de) * | 2001-07-06 | 2009-01-15 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur überwachung und modulierung von proteinfaltung |
| AU2004314710A1 (en) * | 2003-12-12 | 2005-08-11 | Conjugon, Inc. | Systems for tightly regulated gene expression |
| DE60332667D1 (de) * | 2003-12-23 | 2010-07-01 | Council Scient Ind Res | Verfahren zur herstellung von streptokinase durch kultivierung von genetisch veränderten escherichia coli |
| WO2006069403A2 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Genentech, Inc. | Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins |
| EP3705579A1 (en) * | 2006-07-27 | 2020-09-09 | Wyeth LLC | High-cell density fed-batch fermentation process for producing recombinant protein |
| US8911964B2 (en) | 2006-09-13 | 2014-12-16 | Abbvie Inc. | Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody |
| BRPI0716762A2 (pt) * | 2006-09-13 | 2013-09-24 | Abbott Lab | melhorias da cultura celular |
| US20110269233A1 (en) | 2008-09-15 | 2011-11-03 | Laetitia Malphettes | Compositions and methods for regulating cell osmolarity |
| WO2011013721A1 (ja) * | 2009-07-28 | 2011-02-03 | 三井化学株式会社 | 乳酸製造方法 |
| RU2575598C9 (ru) * | 2010-02-01 | 2016-04-27 | Дигна Байотек, С.Л. | Способ получения белка альфа5-интерферона |
| WO2012028522A1 (en) | 2010-08-30 | 2012-03-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Alkaline feed |
| KR101252150B1 (ko) * | 2010-11-18 | 2013-04-08 | 한국과학기술원 | 재조합 ＤＮＡ 분자 클로닝을 위한 알데히드 환원효소 ＹｑｈＤ 유전자를 포함하는 자살 벡터 |
| RU2507736C2 (ru) * | 2011-01-11 | 2014-02-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | Способ создания трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии трансгенного белка |
| EP2702077A2 (en) | 2011-04-27 | 2014-03-05 | AbbVie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
| RU2496877C2 (ru) * | 2011-12-15 | 2013-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА |
| WO2013137622A1 (en) * | 2012-03-12 | 2013-09-19 | Hanmi Science Co., Ltd. | Method of culturing e. coli cells for high density |
| CN102604904B (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种葡萄糖脱氢酶的生产方法 |
| US9334319B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-05-10 | Abbvie Inc. | Low acidic species compositions |
| US9181572B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Methods to modulate lysine variant distribution |
| US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
| US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
| KR20150043523A (ko) | 2012-09-02 | 2015-04-22 | 애브비 인코포레이티드 | 단백질 불균일성의 제어 방법 |
| US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| RU2768003C2 (ru) | 2013-03-08 | 2022-03-22 | Джензим Корпорейшн | Интегрированное непрерывное производство терапевтических белковых лекарственных веществ |
| SG11201507230PA (en) | 2013-03-12 | 2015-10-29 | Abbvie Inc | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
| US9499614B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-22 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides |
| US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
| US8921526B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-12-30 | Abbvie, Inc. | Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use |
| US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
| US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
| US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
| US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| US20150139988A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
| TWI709569B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途 |
| TWI709570B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析法及製法 |
| WO2016057851A1 (en) * | 2014-10-08 | 2016-04-14 | Lewis Randolph V | Expression systems and associated methods |
| MA45489A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés |
| NZ758485A (en) | 2017-04-27 | 2024-02-23 | Juno Therapeutics Gmbh | Oligomeric particle reagents and methods of use thereof |
| JP2021536353A (ja) | 2018-08-31 | 2021-12-27 | ジェンザイム・コーポレーション | 無菌クロマトグラフィー樹脂および製造方法におけるその使用 |
| CN110684101A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-01-14 | 上海松皓生物科技有限公司 | 一种重组水蛭素的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ282603B6 (cs) | 1991-03-06 | 1997-08-13 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschränkter Haftun G | Humanizované a chimerické monoklonální protilátky |
-
1996
- 1996-11-12 AR ARP960105609A patent/AR005035A1/es unknown
- 1996-11-28 SK SK740-98A patent/SK283169B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 HU HU0000317A patent/HU227945B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 AT AT96941047T patent/ATE213271T1/de active
- 1996-11-28 EP EP96941047A patent/EP0866876B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-28 CZ CZ19981652A patent/CZ291415B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 WO PCT/EP1996/005260 patent/WO1997021829A1/de active IP Right Grant
- 1996-11-28 PT PT96941047T patent/PT866876E/pt unknown
- 1996-11-28 JP JP52166297A patent/JP4101879B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-28 ES ES96941047T patent/ES2171752T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-28 RU RU98113062/13A patent/RU2201455C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 AU AU10325/97A patent/AU716612B2/en not_active Ceased
- 1996-11-28 CN CN96198949A patent/CN1117160C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-28 DK DK96941047T patent/DK0866876T3/da active
- 1996-11-28 PL PL96327188A patent/PL185665B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-11-28 SI SI9630466T patent/SI0866876T1/xx unknown
- 1996-11-28 DE DE59608743T patent/DE59608743D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-28 UA UA98073658A patent/UA61066C2/uk unknown
- 1996-11-28 US US09/077,549 patent/US6410270B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-28 BR BR9611937A patent/BR9611937A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-11-28 CA CA002240097A patent/CA2240097C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-28 KR KR10-1998-0704331A patent/KR100444735B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-12-10 ZA ZA9610384A patent/ZA9610384B/xx unknown
-
1998
- 1998-06-10 NO NO19982672A patent/NO319090B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-04-18 JP JP2007109443A patent/JP4102422B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL185665B1 (pl) | Sposób wytwarzania obcego białka, wektor ekspresyjny i transformowany gospodarz | |
| Horn et al. | High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli, using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions | |
| EP3237432B1 (en) | Protein manufacture | |
| CN103649124B (zh) | 表达重组dsbc的细菌宿主菌株 | |
| JP4751374B2 (ja) | 異種タンパク質の製造方法並びにタンパク質の分泌方法 | |
| US8148494B2 (en) | Signal peptide for the production of recombinant proteins | |
| US8216573B2 (en) | Process for the fermentative production of antibodies | |
| JP5591445B2 (ja) | 異種タンパク質の製造方法、タンパク質の分泌方法並びに前記方法の実施のためのｅ．コリ菌株 | |
| CN112313336A (zh) | 一种用于优化抗体表达的方法 | |
| MXPA98004566A (en) | Procedure for preparing recombinant proteins in e. coli through fermentation with great concentration of celu | |
| KR20240005876A (ko) | 재조합 단백질의 생산 방법 | |
| KR101411788B1 (ko) | 기능성 단백질 생산용 미생물 숙주세포를 제조하는 방법 | |
| JPS63167789A (ja) | 形質転換体の培養法 | |
| EA042536B1 (ru) | Получение белка |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20121128 |